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特許7166478ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０の変異体及び薬物を含む皮下投与用医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-27
(45)【発行日】2022-11-07
(54)【発明の名称】ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０の変異体及び薬物を含む皮下投与用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/47 20060101AFI20221028BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221028BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20221028BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20221028BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221028BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221028BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20221028BHJP
C12N 9/14 20060101ALN20221028BHJP
【ＦＩ】
A61K38/47 ZNA
A61K39/395 T
A61K47/18
A61K47/26
A61P35/00
A61P43/00 121
C12N15/56
C12N9/14
【請求項の数】
27
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022068166
(22)【出願日】2022-04-18
(62)【分割の表示】P 2020569741の分割
【原出願日】2020-03-24
(65)【公開番号】P2022095925
(43)【公開日】2022-06-28
【審査請求日】2022-04-25
(31)【優先権主張番号】10-2019-0033880
(32)【優先日】2019-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】517432732
【氏名又は名称】アルテオジェン・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】パク スンジェ
(72)【発明者】
【氏名】チョン ヘシン
(72)【発明者】
【氏名】イ スンジュ
(72)【発明者】
【氏名】キム ギュワン
(72)【発明者】
【氏名】ピョン ミンス
(72)【発明者】
【氏名】ナム キソク
【審査官】山村 祥子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２１８０６９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５０４６６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／００３１６７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ９／００
Ａ６１Ｋ ４７／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ ９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、及び（ｂ）ＰＨ２０変異体を含む組成物であって、前記ＰＨ２０変異体は、
（ｉ）配列番号１におけるＭ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換、及び配列番号１のＮ末端におけるアミノ酸残基Ｍ１～Ｔ３５、Ｍ１～Ｌ３６、Ｍ１～Ｎ３７、Ｍ１～Ｆ３８、Ｍ１～Ｒ３９、Ｍ１～Ａ４０、又はＭ１～Ｐ４１の欠失、又は
（ｉｉ）配列番号１におけるＭ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換、及び配列番号１のＮ末端におけるアミノ酸残基Ｍ１～Ｔ３５、Ｍ１～Ｌ３６、Ｍ１～Ｎ３７、Ｍ１～Ｆ３８、Ｍ１～Ｒ３９、Ｍ１～Ａ４０、又はＭ１～Ｐ４１の欠失、及び配列番号１のＣ末端のＩ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８又はＳ４９０の後のすべてのアミノ酸残基の欠失、
を含む、組成物。
【請求項2】
前記ＰＨ２０変異体は、配列番号１におけるＭ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換、及び配列番号１のＮ末端におけるアミノ酸残基Ｍ１～Ｔ３５、Ｍ１～Ｌ３６、Ｍ１～Ｎ３７、Ｍ１～Ｆ３８、Ｍ１～Ｒ３９、Ｍ１～Ａ４０、又はＭ１～Ｐ４１の欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＰＨ２０変異体は、配列番号１におけるＭ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換、及び配列番号１のＮ末端におけるアミノ酸残基Ｍ１～Ｔ３５、Ｍ１～Ｌ３６、Ｍ１～Ｎ３７、Ｍ１～Ｆ３８、Ｍ１～Ｒ３９、Ｍ１～Ａ４０、又はＭ１～Ｐ４１の欠失、及び配列番号１のＣ末端のＩ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８又はＳ４９０の後のすべてのアミノ酸残基の欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＰＨ２０変異体はさらに、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ及びＮ３６３Ｇからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＰＨ２０変異体はさらに、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ及びＮ３６３Ｇからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＰＨ２０変異体は、以下の群のいずれか一つに記載されたアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物：（ａ）Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｂ）Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｃ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｄ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、及びＮ３６３Ｇ。
【請求項7】
前記ＰＨ２０変異体は、以下の群のいずれか一つに記載されたアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物：（ａ）Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｂ）Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｃ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｄ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、及びＮ３６３Ｇ。
【請求項8】
前記ＰＨ２０変異体は、以下の群のいずれか一つに記載されたアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項２又は３に記載の組成物：（ａ）Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；及び
（ｂ）Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ。
【請求項9】
前記ＰＨ２０変異体が、配列番号５及び７～５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＰＨ２０変異体が、配列番号５、９、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２４、２７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＰＨ２０変異体が、配列番号５、９、１１、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２４、２７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記ＰＨ２０変異体が、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＰＨ２０変異体が、配列番号４４のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物は２５ｍｇ／ｍｌのペムブロリズマブ、及び２０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＰＨ２０変異体を含む、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記組成物は２５ｍｇ／ｍｌのペムブロリズマブ、２０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＰＨ２０変異体、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ ５．５）、７％のスクロース、及び１０ｍＭのメチオニンを含む、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物は、０．００５％又は０．０２％のポリソルベート８０を更に含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記組成物は、２５ｍｇ／ｍｌのペムブロリズマブ、２０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＰＨ２０変異体、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ ５．５）、２１０ｍＭのトレハロース、１０ｍＭのメチオニン及び０．０２％のポリソルベート８０を含む、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項18】
治療を必要とする対象における癌の治療に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
前記組成物は、対象への皮下注射用である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記癌は、皮膚癌、肝癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直膓癌、頭頸部癌、子宮頸癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、又は神経膠腫である、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記癌は、皮膚癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、食道癌、又は頭頸部癌である、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項22】
治療を必要とする対象における癌の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物はペムブロリズマブ及び薬学的に許容可能な添加剤を含み、そして、前記医薬組成物は対象に請求項１０に記載のＰＨ２０変異体との組み合わせで皮下に投与される、医薬組成物。
【請求項23】
治療を必要とする対象における癌の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物はペムブロリズマブ及び薬学的に許容可能な添加剤を含み、そして、前記医薬組成物は対象に請求項１１に記載のＰＨ２０変異体との組み合わせで皮下に投与される、医薬組成物。
【請求項24】
治療を必要とする対象における癌の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物はペムブロリズマブ及び薬学的に許容可能な添加剤を含み、そして、前記医薬組成物は対象に請求項１２に記載のＰＨ２０変異体との組み合わせで皮下に投与される、医薬組成物。
【請求項25】
治療を必要とする対象における癌の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物はペムブロリズマブ及び薬学的に許容可能な添加剤を含み、そして、前記医薬組成物は対象に請求項１３に記載のＰＨ２０変異体との組み合わせで皮下に投与される、医薬組成物。
【請求項26】
前記癌は、皮膚癌、肝癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直膓癌、頭頸部癌、子宮頸癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、又は神経膠腫である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項27】
前記癌は、皮膚癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、食道癌、又は頭頸部癌である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素活性及び熱安定性が向上したヒトヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ＰＨ２０の変異体及び１つ以上の薬物を含む医薬組成物及びこれを用いた疾病の治療方法に関する。
【0002】
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）用途に用いることができる。
【背景技術】
【0003】
高容量又は多量投与が必要な薬物、特に抗体医薬品などは静脈注射で投与されるのが一般であるが、注射だけに約９０分以上がかかり、静脈注射のための追加の調製作業が必要なため、患者も医療陣にとっても不便が大きく、追加の費用がかかるという問題点がある。一方、皮下注射は直接投与が可能であるという長所があるが、静脈注射に比べて吸収率が低く、吸収が遅いため、注射液量が３～５ｍＬ以上の場合は注射部位に膨潤及び疼痛を誘発することがある。このため、タンパク質治療剤の皮下注射は通常、２ｍＬ以内の少量の溶液注射に限って行われている。しかし、ヒアルロニダーゼを治療薬物と共に皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ又はｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）すれば、ヒアルロニダーゼの作用によって細胞外基質に分布するヒアルロン酸が加水分解されることにより、皮下部の粘性が減少し、物質透過性が増加するので、高容量及び多量の医薬品を体内に容易に伝達することができる。
【0004】
ヒトにはＨｙａｌ１、Ｈｙａｌ２、Ｈｙａｌ３、Ｈｙａｌ４、ＨｙａｌＰＳ１及びＰＨ２０／ＳＰＡＭ１のように６種類のヒアルロニダーゼ遺伝子がある。Ｈｙａｌ１とＨｙａｌ２は大部分の組織で発現し、ＰＨ２０／ＳＰＡＭ１（以下、ＰＨ２０）は精子の細胞膜と先体（ａｃｒｏｓｏｍｅ）膜に発現する。ＨｙａｌＰＳ１は偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）であって、発現しない。ＰＨ２０は、ヒアルロン酸の構成糖であるＮ－アセチルグルコサミンとグルクロン酸間のβ－１，４結合を切断する酵素（ＥＣ ３．２．１．３５）である。ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０は最適ｐＨが５．５であるが、ｐＨ７～８条件でも一部活性を示すのに対し、Ｈｙａｌ１を含めて他のヒトヒアルロニダーゼは最適ｐＨが３～４であり、ｐＨ７～８条件では活性が非常に弱い。ヒトの皮下部位は略ｐＨ７．４程度の中性であることから、種々のヒアルロニダーゼの中でもＰＨ２０が臨床で多く使用されている。ＰＨ２０が臨床で使用される例には、抗体治療剤の皮下注射、眼科手術時に眼球弛緩剤及び麻酔注射添加剤、腫瘍細胞の細胞外基質のヒアルロン酸を加水分解して抗癌治療剤の腫瘍細胞接近性を高めるための用途、及び組織内に過多存在する体液及び血液の再吸収を促進するための用途などがある。
【0005】
一方、現在商業的に多用されているＰＨ２０は、ウシやヒツジの皐丸から抽出した形態である。その例には、ＡｍｐｈａｄａｓｅTM（ウシヒアルロニダーゼ）とＶｉｔｒａｓｅTM（ヒツジヒアルロニダーゼ）などがある。
【0006】
ＢＴＨ（Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）は、ウシの野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ＰＨ２０から、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）及びＣ末端５６個のアミノ酸がタンパク質翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程で除去された形態である。ＢＴＨも糖タンパク質であり、アミノ酸を含む全成分においてマンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）が５％、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）が２．２％を占める（Ｂｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒａｆｔｅｒｙ，１９６８）。動物由来ヒアルロニダーゼを人体に高容量で反復投与する場合、中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が生成可能であり、ＰＨ２０とともに不純物として含まれた動物由来の他の生体物質がアレルギーを誘発することがある。特に、ウシから抽出したＰＨ２０は狂牛病の心配から利用に制限がある。このような問題点を改善するために、ヒトＰＨ２０の組換えタンパク質に対する研究が行われている。
【0007】
ヒトＰＨ２０の組換えタンパク質は、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ＤＳ－２昆虫細胞、動物細胞などから発現したものが報告されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｈｏｆｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。昆虫細胞と酵母から生産された組換えＰＨ２０タンパク質は、タンパク質翻訳後修飾過程でＮ－糖化の様相がヒトＰＨ２０と異なる。
【0008】
ヒアルロニダーゼのうち、Ｈｙａｌ１（ＰＤＢ ＩＤ：２ＰＥ４）（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）と蜂毒ヒアルロニダーゼ（ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＣＱ，１ＦＣＵ，１ＦＣＶ）のタンパク質構造が明らかにされている。Ｈｙａｌ１は触媒ドメインとＥＧＦ様ドメインの２個のドメインで構成されており、触媒ドメインはタンパク質の２次構造を特徴付けるアルファヘリックスとベータ－ストランドがそれぞれ８回ずつ反復される（β／α）８の形態をなす（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＥＧＦ様ドメインは、Ｈｙａｌ１のＣ末端が異なるようにスプライシングされた変異体において全て保存されている。Ｈｙａｌ１とＰＨ２０のアミノ酸配列は３５．１％一致し、まだＰＨ２０のタンパク質３次構造は明らかにされていない。
【0009】
ヒトＰＨ２０に対する構造／機能関係研究によると、ＰＨ２０のＣ末端部位はタンパク質発現及び酵素活性に重要であり、特に、Ｃ末端が４７７～４８３番アミノ酸で終結されることが酵素の発現及び活性度に重要であると報告されている（Ｆｒｏｓｔ，２００７）。全長（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ）ＰＨ２０（アミノ酸１～５０９）又はＣ末端が４６７番アミノ酸以降に切断されたＰＨ２０変異体の活性は、Ｃ末端が４７７～４８３番のいずれか１個所で切断されたＰＨ２０変異体酵素活性の１０％以下に過ぎなかった（Ｆｒｏｓｔ，２００７）。Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社では、成熟したＰＨ２０のＣ末端をＹ４８２で切断した形態の組換えタンパク質であるｒＨｕＰＨ２０（アミノ酸３６～４８２）を開発した（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｆｒｏｓｔ，２００７）。
【0010】
一方、ヒトＰＨ２０を用いて様々な治療用医薬品を皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）剤形の形態で開発しようとする研究が進行中であるが、ヒトＰＨ２０自体の安定性が低い問題は依然として解決すべき課題である。
【0011】
このような技術的背景下で、本発明の発明者らは、野生型ヒアルロニダーゼＰＨ２０のアミノ酸配列においてアルファヘリックス８部位（Ｓ３４７～Ｃ３８１）、そしてアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）に１つ以上のアミノ酸置換を含み、ＰＨ２０のＮ末端及び／又はＣ末端部分に位置しているアミノ酸の一部が切断されたヒトＰＨ２０変異体が非常に優れた酵素活性及び熱安定性を有することを確認し、特許出願したことがある（ＰＣＴ／ＫＲ２０１９／００９２１５号）。
【0012】
また、本出願の発明者らは、薬物、例えば抗体医薬品、具体的に高容量の抗ＨＥＲ２抗体又は免疫関門抗体を含む医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）又は剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に、本発明に係るＰＨ２０の変異体を適用することができ、これによって、本発明に係る抗ＨＥＲ２抗体又は免疫関門抗体などの薬物と共にＰＨ２０変異体を含む医薬組成物及び剤形を皮下投与のために使用できるだけでなく、抗体医薬品などの薬物及びＰＨ２０変異体の活性が非常に安定的で長持ちできることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、薬物と共に、酵素活性及び熱安定性が向上したＰＨ２０変異体を含み、薬物とＰＨ２０変異体の熱安定性及び活性が長期間持続可能な新しい医薬組成物、特に皮下投与用途に利用可能な医薬組成物を提供することを目的とする。
【0014】
本発明の他の目的は、本発明に係る医薬組成物を治療を必要とする対象に投与することを特徴とする疾病の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
上記課題を解決するために、本発明は、（ａ）薬物及び（ｂ）ＰＨ２０変異体を含む医薬組成物を提供する。
【0016】
本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ヒトＰＨ２０において、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ及びＩ３６１Ｔからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とし、さらにアルファヘリックス８配列（Ｓ３４７～Ｃ３８１）及び／又はアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）から選ばれる１つ以上の部位におけるアミノ酸置換を含み、選択的にＮ末端及び／又はＣ末端部分に位置しているアミノ酸残基の一部が切断されたことを特徴とする。
【0017】
また、本発明に係る医薬組成物には、薬学的に許容可能な添加剤、具体的に緩衝剤、安定化剤及び界面活性剤から選ばれる１つ以上がさらに含まれてもよい。
【0018】
本発明に係る医薬組成物は、皮下投与のための注射剤形の形態で用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１の（ａ）は、４５℃苛酷安定性試験においてトラスツズマブのサイズ排除クロマトグラフィークロマトグラム（Ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）、図１の（ｂ）は、剤形による４５℃苛酷安定性試験におけるトラスツズマブ単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）タンパク質の純度変化を示すものである。
【図3】図３の（ａ）は、４５℃苛酷安定性試験においてトラスツズマブに対するＷＣＸ（ｗｅａｋ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ）クロマトグラフィーのクロマトグラム、図３の（ｂ）は、各剤形に対する４５℃苛酷安定性試験における酸性変異体（ａｃｉｄｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）の相対含有量変化（％）、図３の（ｃ）は、各剤形に対する４５℃苛酷安定性試験におけるメインピーク（Ｍａｉｎ ｐｅａｋ）の相対含有量変化（％）、図３の（ｄ）は、各剤形に対する４５℃苛酷安定性試験における塩基性変異体（ｂａｓｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）の相対含有量変化（％）を示すものである。
【図5】図５の（ａ）は、剤形５～７による４５℃苛酷安定性試験における酸性変異体（ａｃｉｄｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）の相対含有量変化（％）、図５の（ｂ）は、剤形５、６、７による４５℃苛酷安定性試験におけるメインピーク（Ｍａｉｎ ｐｅａｋ）の相対含有量変化（％）、図５の（ｃ）は、剤形５、６、７による４５℃苛酷安定性試験における塩基性変異体（ｂａｓｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）の相対含有量変化（％）を示すものである。
【図6】図６の（ａ）は、４０℃苛酷安定性試験において０日と１日目にハーセプチン皮下注射剤形（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＳＣ）、トラスツズマブ＋野生型ＰＨ２０（ＨＷ２）、そしてトラスツズマブ＋ＰＨ２０変異体ＨＰ４６の残存酵素活性測定結果、図６の（ｂ）は、４５℃苛酷安定性試験において０日目と１日目にハーセプチン皮下注射剤形、トラスツズマブ＋野生型ＰＨ２０（ＨＷ２）、トラスツズマブ＋ＰＨ２０変異体ＨＰ４６の残存酵素活性測定結果を示すものである。
【図9】図９の（ａ）は、４０℃苛酷安定性試験において剤形８に対するＷＣＸ（ｗｅａｋ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ）クロマトグラフィーのクロマトグラム、図９の（ｂ）は、剤形８～１０に対する４０℃苛酷安定性試験における酸性変異体（ａｃｉｄｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）の相対含有量変化（％）、図９の（ｃ）は、剤形８～１０に対する４０℃苛酷安定性試験におけるメインピーク（Ｍａｉｎ ｐｅａｋ）の相対含有量変化（％）、図９の（ｄ）は剤形８～１０に対する４０℃苛酷安定性試験における塩基性変異体（ｂａｓｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）の相対含有量変化（％）を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
特に定義されない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われた命名法は本技術分野によく知られており、通常使用されるものである。
【0021】
一実施例において、本発明は、（ａ）薬物及び（ｂ）ＰＨ２０変異体を含む医薬組成物に関し、本発明に係る医薬組成物は、疾病の予防又は治療用途に利用可能であり、好ましくは皮下投与用途に用いられることを特徴とする。
【0022】
本発明に係る医薬組成物に含まれるヒトＰＨ２０の変異体は、野生型ＰＨ２０（配列番号１のアミノ酸配列を有する）、好ましくは、成熟した野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列のうち、Ｌ３６～Ｓ４９０からなる配列を有する。）のうち、アルファヘリックス部位及び／又はその連結部位に該当する部位、好ましくはアルファヘリックス８部位（Ｓ３４７～Ｃ３８１）及び／又は、アルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）、より好ましくは、Ｔ３４１～Ｎ３６３間のアミノ酸部位、最も好ましくはＴ３４１～Ｉ３６１、Ｌ３４２～Ｉ３６１、Ｓ３４３～Ｉ３６１、Ｉ３４４～Ｉ３６１、Ｍ３４５～Ｉ３６１又はＭ３４５～Ｎ３６３に該当するアミノ酸部位において一部のアミノ酸残基が置換されたことを特徴とする。
【0023】
本発明において、“成熟した野生型ＰＨ２０”は、配列番号１の野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、シグナルペプチドであるＭ１～Ｔ３５とＰＨ２０の実質的な機能とは関係ないＡ４９１～Ｌ５０９が欠失された、配列番号１のＬ３６～Ｓ４９０のアミノ酸残基からなるタンパク質を意味する。
【0024】
【表1】
【0025】
具体的に、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体又はその切片は、配列番号１の配列を有する野生型ＰＨ２０において、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ及びＩ３６１Ｔからなる群から選ばれる１つ以上の変異、好ましくはアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とし、最も好ましくは、Ｌ３５４Ｉ及びＮ３５６Ｅからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とする。
【0026】
本発明において、“ＰＨ２０変異体”は、野生型ヒトＰＨ２０の配列において一部のアミノ酸残基の変異、好ましくはアミノ酸残基の置換を含むものだけでなく、当該アミノ酸残基の置換と共に、Ｎ末端及び／又はＣ末端における一部のアミノ酸残基の欠失が起きたものを全て含む概念で使われ、“ＰＨ２０変異体又はその切片”という表現と実質的に同じ概念で使われる。
【0027】
本発明の発明者らは以前の研究から、ヒトＰＨ２０のアルファヘリックス８部位、及びアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位のアミノ酸配列を、親水性の大きいＨｙａｌ１のアルファヘリックス８部位、及びアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位のアミノ酸配列に部分的に置換すれば、中性ｐＨにおける酵素活性及びタンパク質凝集温度（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔａｇｇ．）が増加するという実験結果に基づき、野生型ＰＨ２０に比べて酵素活性及び熱安定性が増加した新しいＰＨ２０変異体又はその切片を提供できることを糾明したことがある。
【0028】
これによって、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、野生型ＰＨ２０（配列番号１のアミノ酸配列を有する。）、好ましくは成熟した野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列のうちＬ３６～Ｓ４９０からなる配列を有する。）において、Ｓ３４３Ｅ、Ｍ３４５Ｔ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｎ３５６Ｅ及びＩ３６１Ｔからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換、好ましくはＬ３５４Ｉ及びＮ３５６Ｅからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、
アルファヘリックス部位及び／又はその連結部位に該当する部位、好ましくはアルファヘリックス８部位（Ｓ３４７～Ｃ３８１）及び／又はアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）、より好ましくはＴ３４１～Ｎ３６３、Ｔ３４１～Ｉ３６１、Ｌ３４２～Ｉ３６１、Ｓ３４３～Ｉ３６１、Ｉ３４４～Ｉ３６１、Ｍ３４５～Ｉ３６１又はＭ３４５～Ｎ３６３に該当するアミノ酸部位において１つ以上のアミノ酸残基が置換されたことを特徴とする。
アルファヘリックス部位及び／又はその連結部位に該当する部位、好ましくはアルファヘリックス８部位（Ｓ３４７～Ｃ３８１）及び／又はアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）、より好ましくはＴ３４１～Ｎ３６３、Ｔ３４１～Ｉ３６１、Ｌ３４２～Ｉ３６１、Ｓ３４３～Ｉ３６１、Ｉ３４４～Ｉ３６１、Ｍ３４５～Ｉ３６１又はＭ３４５～Ｎ３６３に該当するアミノ酸部位において１つ以上のアミノ酸残基が置換されたことを特徴とする。
【0029】
特に、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、前記野生型ＰＨ２０、好ましくは成熟した野生型ＰＨ２０のアルファヘリックス８部位（Ｓ３４７～Ｃ３８１）及び／又は、アルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）が、配列番号５１の配列を有するＨｙａｌ１の対応する部位（表２及び表３参照）のアミノ酸配列中の一部のアミノ酸残基に置換され得るが、これに限定されない。
【0030】
【表2】
【0031】
【表3】
【0032】
より具体的に、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体又はその切片は、野生型ＰＨ２０、好ましくは成熟した野生型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、Ｌ３５４Ｉ及び／又はＮ３５６Ｅのアミノ酸残基の置換を含み、
さらにＴ３４１～Ｎ３６３における１つ以上の位置、特にＴ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４、Ｍ３４５、Ｓ３４７、Ｍ３４８、Ｋ３４９、Ｌ３５２、Ｌ３５３、Ｄ３５５、Ｅ３５９、Ｉ３６１及びＮ３６３からなる群から選ばれる１つ以上の位置におけるアミノ酸残基の置換を含むことが好ましいが、これに限定されず、
より好ましくは、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｄ３５５Ｋ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ及びＮ３６３Ｇからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換をさらに含むことを特徴とするが、これに限定されない。
さらにＴ３４１～Ｎ３６３における１つ以上の位置、特にＴ３４１、Ｌ３４２、Ｓ３４３、Ｉ３４４、Ｍ３４５、Ｓ３４７、Ｍ３４８、Ｋ３４９、Ｌ３５２、Ｌ３５３、Ｄ３５５、Ｅ３５９、Ｉ３６１及びＮ３６３からなる群から選ばれる１つ以上の位置におけるアミノ酸残基の置換を含むことが好ましいが、これに限定されず、
より好ましくは、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｄ３５５Ｋ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ及びＮ３６３Ｇからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換をさらに含むことを特徴とするが、これに限定されない。
【0033】
好ましくは、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体又はその切片は、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔのアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とし、
さらに、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ及びＮ３６３Ｇからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴としてもよいが、これに限定されない。
さらに、Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ及びＮ３６３Ｇからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴としてもよいが、これに限定されない。
【0034】
より好ましくは、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体又はその切片は、次に構成された群から選ばれるいずれか一つの置換を含んでもよいが、これに限定されない。
（ａ）Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｂ）Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｃ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｄ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、及びＮ３６３Ｇ；
（ｅ）Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；及び
（ｆ）Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ。
（ａ）Ｔ３４１Ｓ、Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｂ）Ｌ３４２Ｗ、Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｃ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；
（ｄ）Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ、Ｉ３６１Ｔ、及びＮ３６３Ｇ；
（ｅ）Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ；及び
（ｆ）Ｓ３４３Ｅ、Ｉ３４４Ｎ、Ｍ３４５Ｔ、Ｓ３４７Ｔ、Ｍ３４８Ｋ、Ｋ３４９Ｅ、Ｌ３５２Ｑ、Ｌ３５３Ａ、Ｌ３５４Ｉ、Ｄ３５５Ｋ、Ｎ３５６Ｅ、Ｅ３５９Ｄ及びＩ３６１Ｔ。
【0035】
本発明において、“Ｓ３４７”のように１文字（ｏｎｅ ｌｅｔｔｅｒ）のアミノ酸残基名と数字が共に記載された表現は、配列番号１によるアミノ酸配列の各位置におけるアミノ酸残基を意味する。
【0036】
例えば、“Ｓ３４７”は、配列番号１のアミノ酸配列において３４７番目位置のアミノ酸残基がセリンであることを意味する。また、“Ｓ３４７Ｔ”は、配列番号１の３４７番目セリンがトレオニンに置換されたものを意味する。
【0037】
本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、特定アミノ酸残基位置においてアミノ酸残基が保存的置換された変異体も含む意味で解釈される。
【0038】
本明細書において“保存的置換”とは、１個以上のアミノ酸を当該ＰＨ２０変異体の生物学的又は生化学的機能の損失を誘発しない類似の生化学的特性を持つアミノ酸に置換することを含むＰＨ２０変異体の修飾を意味する。
【0039】
“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を持つアミノ酸残基に代替させる置換である。類似の側鎖を持つアミノ酸残基部類は、当該技術分野に規定されており、よく知られている。それらの部類は、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分枝された側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【0040】
本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は保存的アミノ酸置換を有しても相変らず活性を保有できることが予想される。
【0041】
また、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体又はその切片は、本発明に係るＰＨ２０変異体又はその切片と実質的に同じ機能及び／又は効果を有し、８０％又は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列相同性を有するＰＨ２０変異体又はその切片も含む意味で解釈される。
【0042】
本発明に係るＰＨ２０変異体は、成熟した野生型ＰＨ２０に比べて動物細胞で発現が増加し、タンパク質フォールディングの速度も増加して熱安定性が増加する効果を示し、さらには熱安定性が増加するにもかかわらず、それらの酵素活性は成熟した野生型ＰＨ２０に比べて増加又は類似であった。
【0043】
一方、成熟した野生型ＰＨ２０のＳ４９０などのＣ末端部アミノ酸の一部がさらに切断されると酵素活性が減少すると知られているが、本発明に係るＰＨ２０変異体は、成熟した野生型ＰＨ２０のＣ末端部がさらに切断された配列を有するにもかかわらず、成熟した野生型ＰＨ２０に比べて熱安定性が増加するとともに、酵素活性が増加又は類似であり、また、成熟した野生型ＰＨ２０のＮ末端アミノ酸が５個も切断された配列を有するにもかかわらず酵素活性を維持し、Ｎ末端のＰ４１残基からタンパク質発現及び酵素活性に重要な働きをすることを示した。
【0044】
これによって、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、野生型ＰＨ２０のアルファヘリックス８部位（Ｓ３４７～Ｃ３８１）及び／又は、アルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位（Ａ３３３～Ｒ３４６）における一部のアミノ酸残基の置換と共に、さらにＣ末端及び／又はＮ末端における一部のアミノ酸残基が欠失されたことを特徴とするが、これに限定されない。
【0045】
一側面において、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、配列番号１のアミノ酸配列Ｎ末端のＭ１～Ｐ４２からなる群から選ばれるアミノ酸残基の前、好ましくはＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１又はＰ４２のアミノ酸残基の前で切断が起きてＮ末端で一部のアミノ酸残基が欠失されたり、及び／又はＣ末端のＶ４５５～Ｗ５０９からなる群から選ばれるアミノ酸残基の次、好ましくはＶ４５５～Ｓ４９０からなる群から選ばれるアミノ酸残基、最も好ましくはＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８又はＳ４９０のアミノ酸残基の次で切断が起きてＣ末端で一部のアミノ酸残基が欠失されたことを特徴とし得る。
【0046】
前記Ｎ末端のＬ３６、Ｎ３７、Ｆ３８、Ｒ３９、Ａ４０、Ｐ４１又はＰ４２の前で切断が起きたという表現は、それぞれ配列番号１の配列においてＭ１～Ｌ３６の直前アミノ酸残基であるＴ３５まで、Ｍ１～Ｎ３７の直前アミノ酸残基であるＬ３６まで、Ｍ１～Ｆ３８の直前アミノ酸残基であるＮ３７まで、Ｍ１～Ｒ３９の直前アミノ酸残基であるＦ３８まで、Ｍ１～Ａ４０の直前アミノ酸残基であるＲ３９まで、Ｍ１～Ｐ４１の直前アミノ酸残基であるＡ４０まで、Ｍ１～Ｐ４２の直前アミノ酸残基であるＰ４１までが切断して除去されたということを意味する。ただし、前記配列番号１のＮ末端Ｍ１の前で切断が起きたという意味は、いかなるＮ末端における切断も起きなかったことを意味する。
【0047】
また、Ｃ末端のＶ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７１、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８又はＳ４９０の次で切断が起きたという表現は、それぞれ配列番号１の配列において前記Ｖ４５５、Ｃ４５８、Ｄ４６１、Ｃ４６４、Ｉ４６５、Ｄ４６６、Ａ４６７、Ｆ４６８、Ｋ４７０、Ｐ４７２、Ｍ４７３、Ｅ４７４、Ｔ４７５、Ｅ４７６、Ｐ４７８、Ｉ４８０、Ｙ４８２、Ａ４８４、Ｐ４８６、Ｔ４８８又はＳ４９０以降の次のアミノ酸残基から切断して除去されたことを意味する。例えば、Ｓ４９０の次で切断が起きたという意味は、Ｓ４９０とＡ４９１との間で切断が起きたことを意味する。
【0048】
好ましくは、本発明に係る医薬組成物に含まれるヒトＰＨ２０変異体は、配列番号５～配列番号５０のアミノ酸配列からなる群から選ばれてもよく、より好ましくは、配列番号４４のアミノ酸配列を有し得るが、これに限定されない。本発明に係る具体的実施例で作製したＰＨ２０変異体において置換又は切断されたアミノ酸の配列は、表４に記載の通りである。
【0049】
【表4】
【0050】
一方、先行研究において野生型ヒトＰＨ２０の場合、Ｃ末端に位置しているアミノ酸残基の切断位置にしたがって酵素活性が変わることが報告されたが、本発明では、ヒトＰＨ２０の２次構造をなす特定アルファヘリックスを他のヒトヒアルロニダーゼのアルファヘリックスに置換して野生型ヒトＰＨ２０に比べて安定性の高いヒトＰＨ２０変異体を作製し、これらの変異体は、置換されたアルファヘリックスドメインとＰＨ２０の他の２次構造がなす相互作用が野生型ＰＨ２０と異なる様相を示すことによって、Ｃ末端切断位置に関係なく一定レベル以上の酵素活性を有することを特徴とする。
【0051】
また、本発明では、ヒトＰＨ２０固有のシグナルペプチドではなく動物細胞で高いタンパク質発現量を示す他のタンパク質のシグナルペプチドを用いて組換えＰＨ２０タンパク質の発現を向上させようとした。
【0052】
これによって、他の側面において、本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体は、Ｍ１～Ｔ３５の野生型ＰＨ２０のシグナルペプチドに代えて、Ｎ末端にヒトヒアルロニダーゼ－１（Ｈｙａｌ１）、ヒト成長ホルモン又はヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチドを含むことを特徴とし、好ましくは、表５に記載のような配列番号２によるＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡのアミノ酸配列を持つヒト成長ホルモン由来のシグナルペプチド、配列番号３によるＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳのアミノ酸配列を持つヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド、又は配列番号４によるＭＡＡＨＬＬＰＩＣＡＬＦＬＴＬＬＤＭＡＱＧのアミノ酸配列を持つヒトＨｙａｌ１由来のシグナルペプチドを含むことを特徴とするが、これに限定されない。
【0053】
【表5】
【0054】
本発明に係る医薬組成物に含まれるＰＨ２０変異体のうち、Ｃ末端に６ｘＨｉｓ－ｔａｇが付着している変異体はＨＭと命名し、６ｘＨｉｓ－ｔａｇのない変異体はＨＰと命名した。また、Ｃ末端に６ｘＨｉｓ－ｔａｇが付着している成熟した野生型ＰＨ２０（Ｌ３６～Ｓ４９０）はＷＴと命名し、６ｘＨｉｓ－ｔａｇがないとともにＣ末端がＹ４８２の次で切断された成熟した野生型ＰＨ２０（Ｌ３６～Ｙ４８２）はＨＷ２と命名した。
【0055】
ＨＰ４６（配列番号４４）は、タンパク質３次構造が知られたヒトヒアルロニダーゼであるＨｙａｌ１（ＰＤＢ ＩＤ：２ＰＥ４）（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）を用いてタンパク質構造をモデリングした後、ヒトＰＨ２０のアルファヘリックス８のアミノ酸及びアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位のアミノ酸配列がＨｙａｌ１のアミノ酸配列に置換され、Ｎ末端がＦ３８で切断され、Ｃ末端がＦ４６８の次で切断されたヒトＰＨ２０の変異体である。特に、アルファヘリックス８はＰＨ２０のタンパク質３次構造において外側に位置しており、隣り合うアルファヘリックス又はベータ－ストランドとの相互作用が他のアルファヘリックスに比べて少ない。一般に、酵素の活性と熱安定性は交換（ｔｒａｄｅ－ｏｆｆ）の関係が成立し、タンパク質の熱安定性が増加するほど酵素活性が減少し、逆に、タンパク質構造の柔軟性向上によって酵素活性が増加すれば熱安定性は減少する傾向がある。しかし、ｐＨ７．０条件で比濁分析（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）方法で測定したＨＰ４６の非活性度は約４６ｕｎｉｔｓ／μｇであり、野生型ＰＨ２０の約２３ｕｎｉｔｓ／μｇよりも２倍程度高く評価された。
【0056】
タンパク質の熱安定性は、タンパク質３次構造の５０％が変性される温度である変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）とタンパク質間の凝集が起きる温度である凝集温度（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔａｇｇ）によって評価できる。一般に、タンパク質の凝集温度が変性温度よりも低い傾向を示す。Ｈｙａｌ１のアルファヘリックス８はＰＨ２０のアルファヘリックス８に比べて高い親水性を示す。置換されたＨｙａｌ１のアルファヘリックス８がＨＰ４６のタンパク質表面親水性を増加させることによって、疎水性相互作用によって起きるタンパク質間の凝集を遅延させる効果を誘発して凝集温度が５１℃となり、野生型ＰＨ２０の凝集温度４６．５℃よりも４．５℃増加したと評価される。
【0057】
ＨＰ４６は、ＰＨ２０のアルファヘリックス８、及びアルファヘリックス７とアルファヘリックス８との連結部位のアミノ酸を置換しながらＴ３４１をセリンに置換したものである。３４１番アミノ酸残基がトレオニンであるときは、酵素活性が野生型ＰＨ２０と類似するが、セリンに置換されると酵素活性が約２倍に増加する特徴を示し、またＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｇｅｌ ａｓｓａｙからも、ヒアルロン酸を野生型ＰＨ２０に比べて５～６倍多く加水分解することが確認された。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｇｅｌ ａｓｓａｙはタンパク質の変性及びリフォールディング（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ＆ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）過程を伴うので、ＨＰ４６のタンパク質３次構造リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）及び復原力が野生型ＰＨ２０に比べて増強していることを意味する。
【0058】
本発明に係る医薬組成物にＰＨ２０の変異体は最小で５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ含まれ、好ましくは１００～２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、より好ましくは約１５０～１８，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、より好ましくは１，０００～１６，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、最も好ましくは１，５００～１２，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ含まれる。
【0059】
本発明に係る医薬組成物に含まれる薬物としては、タンパク質医薬品（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ）、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）医薬品、低分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＲＮＡｉ、アンチセンス、ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）などの細胞治療剤などが挙げられるが、これに限定されず、現在商用化して使用されている薬物の他、臨床及び開発進行中の薬物も使用可能である。
【0060】
前記薬物には好ましくはタンパク質医薬品や抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）医薬品が用いられ得る。
【0061】
本発明に係る医薬組成物に含まれる“タンパク質医薬品”は、アミノ酸で構成され、タンパク質の活性によって疾病の治療又は予防効果を示す薬物であり、抗体医薬品以外のタンパク質からなる医薬品を意味し、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、治療用酵素（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）、ホルモン（ｈｏｒｍｏｎｅ）、可溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びその融合タンパク質、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）又はその類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）及び血漿由来タンパク質（ｓｅｒｕｍ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）などからなる群から選ばれ得るが、これに限定されない。
【0062】
本発明に係る医薬組成物に含まれるサイトカインは、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、ＣＳＦ（ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）及びＴＧＦ（ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などからなる群から選ばれ得るが、これに限定されない。
【0063】
治療用酵素は、ベータ－グルコセレブロシダーゼ（β－Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）及アガルシダーゼベータ（ａｇａｌｓｉｄａｓｅ β）などが挙げられるが、これに限定されない。
【0064】
本発明に係る医薬組成物に含まれる可溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、受容体の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を意味し、その融合タンパク質は、前記可溶性受容体に抗体のＦｃ領域などが融合されたタンパク質を意味する。前記可溶性受容体は、疾病と関連したリガンドが結合する受容体の水溶性形態であり、ＴＮＦ－α可溶性受容体にＦｃ領域が融合された形態（例えば、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）という成分名の製品及びこれと類似の形態）及びＶＥＧＦ可溶性受容体にＦｃ領域が融合された形態（アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）という成分名の製品及びこれと類似の形態）、ＣＴＬＡ－４にＦｃ領域が融合された形態（例えば、アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）又はベラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）という成分名の製品及びこれと類似の形態）、インターロイキン１可溶性受容体にＦｃ領域が融合された形態（例えば、リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）という成分名の製品及びこれと類似の形態）、ＬＦＡ３可溶性受容体にＦｃ領域が融合された形態（例えば、アレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）という成分名の製品及びこれと類似の形態）などが挙げられるが、これに限定されない。
【0065】
本発明に係る医薬組成物に含まれるホルモンは、ホルモン欠乏などによって発生する疾患の治療又は予防のために体外から注入するホルモン又はその類似体を意味し、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）、エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）、プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）などが挙げられるが、これに限定されない。
【0066】
本発明に係る医薬組成物に含まれる血漿由来タンパク質は血漿に存在するタンパク質であり、血漿から抽出したもの及び組換えで生産されたものを全て意味し、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）、フォンウィレブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ＦＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＩＩ）、ＦＶ（Ｆａｃｔｏｒ Ｖ）、ＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ
ＶＩＩ）、ＦＶＩＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）、ＦＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ）、ＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘ）及びＦＸＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ）などが挙げられるが、これに限定されない。
ＶＩＩ）、ＦＶＩＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）、ＦＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ）、ＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘ）及びＦＸＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＸＩ）などが挙げられるが、これに限定されない。
【0067】
本発明に係る医薬組成物に含まれる抗体医薬品は、単クローン抗体医薬品（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ）又は多クローン抗体医薬品（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ）であり得る。
【0068】
本発明に係る単クローン抗体医薬品は、特定疾病に関連した抗原に特異的に結合可能な単クローン抗体及び単クローン抗体断片を含むタンパク質を意味する。単クローン抗体には二重抗体も含まれ、単クローン抗体又はその断片を含むタンパク質はＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む意味で使われる。
【0069】
特定疾病に関連した抗原は、４－１ＢＢ、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ）、アンジオポエチン（アンジオポエチン１又は２）、アンジオポエチン類似物質３、Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）、Ｂ７－Ｈ３、補体５（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ５）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ６２、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＧＲＰ、クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）、補体要素Ｄ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｄ）、ＣＴＬＡ４、ＤＬＬ３、ＥＧＦ受容体、血友病因子、Ｆｃ受容体、ＦＧＦ２３、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）受容体、ＧＤ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インターフェロン受容体、インターフェロンガンマ、ＩｇＥ、ＩＧＦ－１受容体、インターロイキン１、インターロイキン２受容体、インターロイキン４受容体、インターロイキン５、インターロイキン５受容体、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、インターロイキン７、インターロイキン１２／２３、インターロイキン１３、インターロイキン１７Ａ、インターロイキン１７受容体Ａ、インターロイキン３１受容体、インターロイキン３６受容体、ＬＡＧ３、ＬＦＡ３、ＮＧＦ、ＰＶＳＫ９、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＮＫ－Ｌ、ＳＬＡＭＦ７、組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体及びＶＷＦ（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）であり、これに限定するものではない。
【0070】
次は、上記の特定疾病に関連した抗原に対する単クローン抗体及び単クローン抗体断片を含むタンパク質であり、これに限定するものではない；
４－１ＢＢに対する抗体は、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）；
インテグリンに対する抗体は、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）；
アミロイドベータに対する抗体は、バピネオズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、アデュカヌマブ（Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）；
アンジオポエチンに対する抗体は、アンジオポエチン１及び２に対するＡＭＧ ７８０、アンジオポエチン２に対するＭＥＤＩ ３６１７、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）とアンジオポエチン２とＶＥＧＦの二重抗体であるバヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）；
アンジオポエチン類似物質３に対する抗体は、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）；
Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）に対する抗体は、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、ラナルマブ（Ｌａｎａｌｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）；
Ｂ７－Ｈ３に対する抗体は、オムブルタマブ（ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）；
補体５（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ５）に対する抗体は、ラブリズマブ（Ｒａｖｕｌｉｚｕｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＣＲ４に対する抗体は、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ３に対する抗体は、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）、ＧＰ１００とＣＤ３に対する二重抗体であるテベンタフスプ（Ｔｅｂｅｎｔａｆｕｓｐ）、ＣＤ１９とＣＤ３に対する二重抗体であるブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、及びＣＤ２０とＣＤ３に対する二重抗体であるＲＥＧＮ１９７９；
ＣＤ４に対する抗体は、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）；
ＣＤ６に対する抗体は、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１１ａに対する抗体は、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１９に対する抗体は、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、タファシタマブ（Ｔａｆａｓｉｔａｍａｂ）、及びＡＤＣであるロカツキシマブテシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＣＤ２０に対する抗体は、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、及びＡＤＣであるイブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）；
ＣＤ２２に対する抗体は、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、ＡＤＣであるイノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、及びモキセツモマブパスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）；
ＣＤ３０に対するＡＤＣは、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ３３に対するＡＤＣは、バダスツキシマブタリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）；
ＣＤ３８に対する抗体は、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）；
ＣＤ５２に対する抗体は、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｘｕｍａｂ）；
ＣＤ６２に対する抗体は、クリザンリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ７９ｂに対するＡＤＣは、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ８０に対する抗体は、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）；
ＣＧＲＰに対する抗体は、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ）、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）；
クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）に対する抗体は、ゾルベツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）；
補体要素Ｄ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｄ）に対する抗体は、ランパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＴＬＡ４に対する抗体は、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ザリフレリマブ（Ｚａｌｉｆｒｅｌｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）；
ＤＬＬ３に対するＡＤＣは、ロバルピツズマブテシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＥＧＦ受容体に対する抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；
血友病因子であるｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ及びＦａｃｔｏｒ Ｘに対する二重抗体は、エミシズマブ（Ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ）；
Ｆｃ受容体に対する抗体は、ニポカリマブ（Ｎｉｐｏｃａｌｉｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）；
ＦＧＦ２３に対する抗体は、ブロスマブ（Ｂｕｒｏｓｕｍａｂ）；
フォレート（ｆｏｌａｔｅ）受容体に対する抗体は、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、及びＡＤＣであるミルベツキシマブソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）；
ＧＤ２に対する抗体は、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）；
ＧＭ－ＣＳＦに対する抗体は、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）；
ＨＥＲ２に対する抗体は、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とＡＤＣはトラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、トラスツズマブデュオカルマジン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｕｏｃａｒｍａｚｉｎｅ）；
ＨＥＲ３に対する抗体は、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）；
インターフェロン受容体に対する抗体は、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）；
インターフェロンガンマに対する抗体は、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）；
ＩｇＥに対する抗体は、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＩＧＦ－１受容体に対する抗体は、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）；
インターロイキン１に対する抗体は、ゲボキズマブ（Ｇｅｂｏｋｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン２受容体に対する抗体は、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）；
インターロイキン４受容体に対する抗体は、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）；
インターロイキン５に対する抗体は、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン５受容体に対する抗体は、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン６に対する抗体は、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）；
インターロイキン６受容体に対する抗体は、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サトラリズマブ（Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＲＥＧＮ８８；
インターロイキン７に対する抗体は、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１２／２３に対する抗体は、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１３に対する抗体は、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１７Ａに対する抗体は、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン１７受容体Ａに対する抗体は、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）；
インターロイキン２３に対する抗体は、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、ティルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３１受容体に対する抗体は、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３６受容体に対する抗体は、スペソリマブ（Ｓｐｅｓｏｌｉｍａｂ）；
ＬＡＧ３に対する抗体は、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）；
ＮＡＳＰ２に対する抗体は、ナルソプリマブ（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ）；
ＮＧＦに対する抗体は、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）；
ＰＶＳＫ９に対する抗体は、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ボコシズマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ）；
ＰＤ－１に対する抗体は、ランブロリズマブ（Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、バルスチリマブ（Ｂａｌｓｔｉｌｉｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、ドスタリマブ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａｂ）、プロゴリマブ（Ｐｒｏｌｇｏｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；
ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、エンバホリマブ（Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）とＴＧＦ ｂｅｔｅとＰＤ－Ｌ１の二重抗体であるビントラフスアルファ（Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｐｈａ）；
ＲＡＮＫ－Ｌに対する抗体は、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）；
ＳＬＡＭＦ７に対する抗体は、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）；
組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）に対する抗体は、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、マルスタシマブ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａｂ）；
ＴＮＦ、特にＴＮＦαに対する抗体は、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）と抗体断片であるセルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ＴＮＦとアルブミンに対する二重抗体であるオゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＶＥＧＦに対する抗体は、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とＶＥＧＦとＡｎｇ２の二重抗体であるファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）；
ＶＥＧＦ受容体に対する抗体は、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）；及び
ｖＷＦに対する抗体は、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）
４－１ＢＢに対する抗体は、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）；
インテグリンに対する抗体は、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）；
アミロイドベータに対する抗体は、バピネオズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、アデュカヌマブ（Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）；
アンジオポエチンに対する抗体は、アンジオポエチン１及び２に対するＡＭＧ ７８０、アンジオポエチン２に対するＭＥＤＩ ３６１７、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）とアンジオポエチン２とＶＥＧＦの二重抗体であるバヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）；
アンジオポエチン類似物質３に対する抗体は、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）；
Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）に対する抗体は、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、ラナルマブ（Ｌａｎａｌｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）；
Ｂ７－Ｈ３に対する抗体は、オムブルタマブ（ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）；
補体５（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ５）に対する抗体は、ラブリズマブ（Ｒａｖｕｌｉｚｕｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＣＲ４に対する抗体は、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ３に対する抗体は、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）、ＧＰ１００とＣＤ３に対する二重抗体であるテベンタフスプ（Ｔｅｂｅｎｔａｆｕｓｐ）、ＣＤ１９とＣＤ３に対する二重抗体であるブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、及びＣＤ２０とＣＤ３に対する二重抗体であるＲＥＧＮ１９７９；
ＣＤ４に対する抗体は、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）；
ＣＤ６に対する抗体は、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１１ａに対する抗体は、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１９に対する抗体は、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、タファシタマブ（Ｔａｆａｓｉｔａｍａｂ）、及びＡＤＣであるロカツキシマブテシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＣＤ２０に対する抗体は、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、及びＡＤＣであるイブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）；
ＣＤ２２に対する抗体は、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、ＡＤＣであるイノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、及びモキセツモマブパスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）；
ＣＤ３０に対するＡＤＣは、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ３３に対するＡＤＣは、バダスツキシマブタリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）；
ＣＤ３８に対する抗体は、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）；
ＣＤ５２に対する抗体は、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｘｕｍａｂ）；
ＣＤ６２に対する抗体は、クリザンリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ７９ｂに対するＡＤＣは、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ８０に対する抗体は、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）；
ＣＧＲＰに対する抗体は、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ）、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）；
クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）に対する抗体は、ゾルベツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）；
補体要素Ｄ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｄ）に対する抗体は、ランパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＴＬＡ４に対する抗体は、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ザリフレリマブ（Ｚａｌｉｆｒｅｌｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）；
ＤＬＬ３に対するＡＤＣは、ロバルピツズマブテシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＥＧＦ受容体に対する抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；
血友病因子であるｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ及びＦａｃｔｏｒ Ｘに対する二重抗体は、エミシズマブ（Ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ）；
Ｆｃ受容体に対する抗体は、ニポカリマブ（Ｎｉｐｏｃａｌｉｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）；
ＦＧＦ２３に対する抗体は、ブロスマブ（Ｂｕｒｏｓｕｍａｂ）；
フォレート（ｆｏｌａｔｅ）受容体に対する抗体は、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、及びＡＤＣであるミルベツキシマブソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）；
ＧＤ２に対する抗体は、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）；
ＧＭ－ＣＳＦに対する抗体は、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）；
ＨＥＲ２に対する抗体は、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とＡＤＣはトラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、トラスツズマブデュオカルマジン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｕｏｃａｒｍａｚｉｎｅ）；
ＨＥＲ３に対する抗体は、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）；
インターフェロン受容体に対する抗体は、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）；
インターフェロンガンマに対する抗体は、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）；
ＩｇＥに対する抗体は、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＩＧＦ－１受容体に対する抗体は、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）；
インターロイキン１に対する抗体は、ゲボキズマブ（Ｇｅｂｏｋｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン２受容体に対する抗体は、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）；
インターロイキン４受容体に対する抗体は、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）；
インターロイキン５に対する抗体は、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン５受容体に対する抗体は、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン６に対する抗体は、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）；
インターロイキン６受容体に対する抗体は、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サトラリズマブ（Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＲＥＧＮ８８；
インターロイキン７に対する抗体は、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１２／２３に対する抗体は、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１３に対する抗体は、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１７Ａに対する抗体は、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン１７受容体Ａに対する抗体は、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）；
インターロイキン２３に対する抗体は、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、ティルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３１受容体に対する抗体は、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３６受容体に対する抗体は、スペソリマブ（Ｓｐｅｓｏｌｉｍａｂ）；
ＬＡＧ３に対する抗体は、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）；
ＮＡＳＰ２に対する抗体は、ナルソプリマブ（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ）；
ＮＧＦに対する抗体は、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）；
ＰＶＳＫ９に対する抗体は、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ボコシズマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ）；
ＰＤ－１に対する抗体は、ランブロリズマブ（Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、バルスチリマブ（Ｂａｌｓｔｉｌｉｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、ドスタリマブ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａｂ）、プロゴリマブ（Ｐｒｏｌｇｏｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；
ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、エンバホリマブ（Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）とＴＧＦ ｂｅｔｅとＰＤ－Ｌ１の二重抗体であるビントラフスアルファ（Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｐｈａ）；
ＲＡＮＫ－Ｌに対する抗体は、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）；
ＳＬＡＭＦ７に対する抗体は、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）；
組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）に対する抗体は、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、マルスタシマブ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａｂ）；
ＴＮＦ、特にＴＮＦαに対する抗体は、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）と抗体断片であるセルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ＴＮＦとアルブミンに対する二重抗体であるオゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＶＥＧＦに対する抗体は、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）とＶＥＧＦとＡｎｇ２の二重抗体であるファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）；
ＶＥＧＦ受容体に対する抗体は、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）；及び
ｖＷＦに対する抗体は、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）
【0071】
一方、乳癌患者の約２０～２５％では細胞分裂を促進するＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の過発現が観察され、ＨＥＲ２が過発現した乳癌は、そうでない乳癌に比べて進行が速く、攻撃的であり、抗癌化学療法への反応が低いため、予後がよくない。トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、ＨＥＲ２を標的にする単クローン抗体医薬品であり、ＨＥＲ２過発現癌細胞表面のＨＥＲ２に特異的に結合して細胞複製及び増殖の信号伝達を抑制することによって腫瘍の進行を遅らせる。トラスツズマブは、米国で１９９８年に乳癌治療剤として米国食薬庁（ＦＤＡ）の承認を受け、韓国では２００３年食品医薬品安全処（ＫＦＤＡ）の承認を受けた。その後、ＨＥＲ２過発現胃癌でも効能が認められて胃癌治療剤にも用いられている。
【0072】
Ｒｏｃｈｅ社のハーセプチン静脈注射剤形（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、４４０ｍｇのトラスツズマブが主成分であり、凍結乾燥させたトラスツズマブを生理食塩水と混合して静脈に注射する。一方、トラスツズマブの皮下注射剤形（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＳＣ）は、５ｍＬ液状剤形であって、トラスツズマブ６００ｍｇ（１２０ｍｇ／ｍＬ）が主成分であり、添加剤として２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、０．０４％ポリソルベート２０、１０，０００ＵｎｉｔｓのｒＨｕＰＨ２０（２，０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、０．００４％、４０（ｇ／ｍＬ））を含む。
【0073】
ハーセプチン皮下注射剤形の有効期間は２１ヶ月である。トラスツズマブの静脈注射剤形は凍結乾燥形態であり、有効期間が３０ケ月であるが、トラスツズマブの皮下注射剤形は液状であり、有効期間が２１ヶ月と短い。その理由としては、液状剤形においてトラスツズマブと組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０のうち１つ以上の安定性が制限されることが推定できる。
【0074】
これを考慮して、本発明では、本発明に係るＰＨ２０変異体がヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０野生型及びＨａｌｏｚｙｍｅ社の組換えヒトＰＨ２０に比べて酵素活性が高いだけでなく、測定されたタンパク質凝集温度が高くて熱安定性が改善された特性を持つという点に着目して、皮下注射剤形の有効期間を長期間、好ましくは２１ヶ月以上に設定することを目的とする。
【0075】
本発明に係る医薬組成物において抗体医薬品の含有量は、５～５００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０～２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１００～１５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１２０±１８ｍｇ／ｍＬであり得、例えば、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ又は約１３０ｍｇ／ｍＬであり得る。
【0076】
本発明に係る医薬組成物に含まれる多クローン抗体は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｅ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ）などの血漿などから抽出した血漿抗体（ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などが好ましいが、これに限定されない。
ｇｌｏｂｕｌｉｎ）などの血漿などから抽出した血漿抗体（ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などが好ましいが、これに限定されない。
【0077】
低分子化合物の場合には、予防や治療の目的で速い効果が要求される薬物であればいずれも使用可能である。例えば、モルヒネ（Ｍｏｒｐｈｉｎｅ）系列の抗鎮痛剤を用いることができる（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。また、抗癌剤による組織壊死の治療剤として使用する場合、単独で使用したり、或いは解毒（Ａｎｔｉｄｏｔｅ）薬物であるビンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａ Ａｌｋａｌｏｉｄ）系統、タキサン系統の薬物と共に使用できる（Ｋｒｅｉｄｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0078】
本発明に係る医薬組成物には緩衝剤、安定化剤及び界面活性剤からなる群から選ばれる１つ以上がさらに含まれ得る。
【0079】
本発明に係る組成物に含まれる前記緩衝剤は、４～８、好ましくは５～７のｐＨを提供するものであればいずれも使用可能であり、前記緩衝剤はリンゴ塩酸（ｍａｌａｔｅ）、ぎ酸塩（ｆｏｒｍａｔｅ）、クエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ピペラジン（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、カコジル酸塩（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）、コハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＥＳ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビス－トリス（ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、炭酸塩（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、２－エタンスルホン酸（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ）、イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、ビス－トリスプロパン（ＢＩＳ－ＴＲＩＳ ｐｒｏｐａｎｅ）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ Ｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ピロリン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及びトリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれる１種以上が好ましく、ヒスチジン緩衝剤、例えばＬ－ヒスチジン／ＨＣｌがより好ましいが、これに限定されない。
【0080】
緩衝剤の濃度は０．００１～２００ｍＭ、好ましくは１～５０ｍＭ、より好ましくは５～４０ｍＭ、最も好ましくは１０～３０ｍＭであり得る。
【0081】
本発明に係る組成物に安定化剤としてはタンパク質の安定化目的で当業界で通常用いられる物質であればいずれも使用可能であり、好ましい例としては、炭水化物、糖類又はそれらの水和物、糖アルコール類又はそれらの水和物及びアミノ酸からなる群から選ばれる１種以上が用いられ得る。
【0082】
前記安定化剤として用いられる炭水化物、糖類又は糖アルコール類は、トレハロース又はその水和物、スクロース、サッカリン、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、キシリトール、アラビトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルトール、マルチトール、ポリグリシトール、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ Ｂｅｔａ－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）及びグルコースからなる群から選ばれる１種以上を挙げることができるが、これに限定するものではない。
【0083】
前記アミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、リシン、リシルリシン（ｌｙｓｉｌｙｓｉｎｅ）、ロイシン、メチオニン、バリン、セリン、セレノメチオニン、シトルリン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、オルニチン、イソロイシン、タウリン、テアニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、ピロールリシン、ヒスチジン及びアラニンからなる群から選ばれる１種以上を挙げることができるが、これに限定するものではない。
【0084】
本発明に係る医薬組成物に安定化剤として用いられる前記糖類又は糖アルコール類の濃度は０．００１～５００ｍＭ、好ましくは１００～３００ｍＭ、より好ましくは１５０～２５０ｍＭ、最も好ましくは１８０～２３０ｍＭであり、具体的には約２１０ｍＭであり得る。
【0085】
また、本発明に係る医薬組成物に安定化剤として用いられるアミノ酸の濃度は１～１００ｍＭ、好ましくは３～３０ｍＭ、より好ましくは５～２５ｍＭ、最も好ましくは７～２０ｍＭであり、具体的には約８～１５ｍＭであってもよい。
【0086】
本発明に係る組成物にはさらに界面活性剤が含まれてもよい。
【0087】
好ましくは、前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン－ソルビタン脂肪酸エステル［ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）又はツイン（Ｔｗｅｅｎ）］、ポリエチレン－ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン－ステアレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル［トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）－Ｘ］、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体［ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）］及びナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）などの非イオン性界面活性剤が好ましいが、これに限定されない。
【0088】
より好ましくは、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）が用いれ得る。前記ポリソルベートはポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり得るが、これに限定されない。
【0089】
本発明に係る医薬組成物内の非イオン性界面活性剤の濃度は、０．００００００１％～０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００００１％～０．４％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００００１％～０．３％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは０．００１％～０．２％（ｗ／ｖ）であり得る。
【0090】
一具体例において本発明に係る医薬組成物は、５０～３５０ｍｇ／ｍＬの抗体、例えば抗ＨＥＲ２抗体又は免疫関門抗体、ｐＨ５．５±２．０を提供するヒスチジン緩衝液、１０～４００ｍＭのα，α－トレハロース、１～５０ｍＭのメチオニン及び０．００００００１％～０．５％（ｗ／ｖ）ポリソルベートを含むことができる。
【0091】
より具体的な実施例において、本発明に係る医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍＬの抗ＨＥＲ２抗体又は免疫関門抗体、ｐＨ５．５±２．０を提供する２０ｍＭヒスチジン緩衝液、２１０ｍＭのα，α－トレハロース、１０ｍＭメチオニン及び２，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＰＨ２０変異体を含み、さらに０．００５～０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベートを含んでもよい。
【0092】
本発明に係る医薬組成物は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与でき、皮下注入で皮下投与されることが好ましく、皮下注射投与のための注射剤形の形態で用いられることがより好ましい。
【0093】
これによって、本発明は他の側面において、本発明に係る医薬組成物を含む剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、好ましくは皮下投与用注射剤形を提供する。
【0094】
前記皮下投与用注射剤形は追加の希釈過程無しで直ちに投与可能な形態（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）として提供可能であり、プレフィルドシリンジ（ｐｒｅ－ｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）又はガラスアンプルやプラスチック容器に含まれて提供され得る。
【0095】
また、本発明は、本発明に係る医薬組成物又は剤形を用いた疾病の治療方法に関する。
【0096】
本発明に係る医薬組成物又は剤形で治療可能な疾病には特に制限はなく、本発明に係るＰＨ２０変異体と併用する薬物で治療可能な疾患であれば何ら制限もない。
【0097】
本発明に係る医薬組成物又は剤形で治療可能な疾患は、癌、自己免疫疾患などが挙げられるが、これに限定されない。
【0098】
本発明に係る医薬組成物又は剤形で治療可能な癌又は癌腫は特に制限されず、固形癌及び血液癌のいずれも含む。このような癌の例には、黒色腫などの皮膚癌、肝癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、腎臓癌、食道癌、胆道癌、精巣癌、直膓癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫からなる群から選ばれ得るが、これに限定されない。好ましくは、本発明の医薬組成物又は剤形で治療可能な癌は、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌及び腎臓癌からなる群から選ばれ得るが、これに限定されない。
【0099】
本発明に係る医薬組成物又は剤形で治療可能な自己免疫疾患は、リウマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大膓炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、全身性紅斑性ループス、第１型糖尿病（ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）及びアトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）からなる群から選ばれ得るが、これに限定されない。
【0100】
また、本発明は、本発明に係る医薬組成物又は剤形を、治療を必要とする対象に投与することを特徴とする疾病の治療方法を提供し、さらに、本発明に係る医薬組成物又は剤形を疾病の治療のための薬剤を製造するための用途に提供する。
【0101】
本発明で使われる技術用語及び科学用語において特に定義がないと、この発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が通常理解する意味を有する。また、従来と同じ技術的構成及び作用に関する反復説明は省略するものとする。
【0102】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例によって制限されると解釈されないことが当該技術分野における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0103】
実施例
実施例１．剤形開発
実施例１．剤形開発
【0104】
表６に記載のように４種類のトラスツズマブ皮下注射剤形を製造した。剤形１～剤形４はいずれも、１２０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブを含み、２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、ＰＨ２０変異体で構成する。剤形１～４における差異は非イオン性界面活性剤の濃度であり、剤形１：０％ポリソルベート２０、剤形２：０．００５％ポリソルベート２０、剤形３：０．０４％ポリソルベート２０、剤形４：０．１％ポリソルベート２０を含む。
【0105】
【表6】
【0106】
実施例２．分光光度計を用いた測定
【0107】
４５℃で１４日間剤形１～剤形４の剤形を放置し、タンパク質濃度変化をＢｅｃｋｍａｎ社の分光光度計で分析した。試料の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で希釈した後、分光光度計で２８０ｎｍでタンパク質の吸光度を測定した。１４日間の４５℃苛酷安定性試験において剤形１～剤形４で有意のタンパク質濃度の変化はなかった。しかし、ヒアルロニダーゼの活性が４５℃で急に減少する現象を示し、本実施例では酵素活性を測定しなかった（図６参照）。
【0108】
実施例３．サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた各剤形におけるトラスツズマブの単量体比率調査
【0109】
サイズ排除クロマトグラフィー分析のためにＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムとＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、５μｍ）及びＴＳＫガードカラム（６．０×４．０ｍｍ、７μｍ）を使用した。移動相としては、０．２５Ｍ塩化カリウムが含まれた０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．２）を使用した。流速０．５ｍＬ／ｍｉｎの等速（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）分離モードを適用して３５分間分析を行った。試料は分析溶媒で希釈して最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、２０μＬをＨＰＬＣカラムに注入した後、２８０ｎｍでカラム溶出液の吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0110】
１４日間の４５℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ったとき、剤形１～４は類似の変化様相を示した。主な変化は、高分子量（Ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ）及び低分子量（Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＬＭＷ）分解産物の増加及び単量体の減少（約１．５％）であり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に、４５℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、ポリソルベート２０の濃度（０～０．１％（ｗ／ｖ））による剤形間安定性プロファイルに有意の差はなかった（図１）。
【0111】
実施例４．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対するタンパク質の凝集温度測定
【0112】
動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）は、熱によるタンパク質の変性特性を分析するのに用いられる。この試験では温度変化に従うタンパク質分子のサイズ変化を測定してタンパク質凝集温度を算出するための目的に使用した。ＤＬＳ分析のためにＭａｌｖｅｒｎ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ－ｎａｎｏ－ＺＳ機器と石英製キュベット（ｑｕａｒｔｚ ｃｕｖｅｔｔｅ）（ＺＥＮ２１１２）を使用した。分析過程において温度は１℃間隔で２５℃から８５℃まで増加させ、各剤形バッファーを用いて試料を１ｍｇ／ｍＬに希釈後、１５０μＬの試料をキュベットに入れて分析した。
【0113】
ポリソルベート２０が含まれていない剤形１では凝集温度が７４℃であり、剤形２～剤形４における凝集温度は７６℃であった（図２）。
【0114】
実施例５．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対するＷＣＸクロマトグラフィー測定
【0115】
ＷＣＸクロマトグラフィー分析のために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムと、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－ＳＴＡＴ（４．６×１００ｍｍ、７μｍ）、ＴＳＫｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｇｅｌ ＣＭＳＴＡＴ（３．２ｍｍ ｌ．Ｄ．×１．５ｃｍ）などを使用した。移動相Ａは１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）であり、移動相Ｂは０．１ＭのＮａＣｌが含まれた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）である。流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで０～３０％移動相Ｂ線形濃度勾配を期しつつ５５分間分析を行った。試料は移動相Ａで希釈して最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、８０μＬの試料をＨＰＬＣに注入した後、２８０ｎｍでカラム溶出液の吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0116】
１４日間の４５℃苛酷安定性試験でＷＣＸ分析を行ったとき、剤形１～剤形４は類似の変化推移を示した。特定変化としては酸性変異体相対含有量の増加（１４日間約３０％変化）、メインピーク相対含有量の減少（１４日間約４４％変化）、塩基性変異体相対含有量の増加（１４日間約１５％変化）があり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に、４５℃苛酷安定性試験におけるＷＣＸ分析ではポリソルベート２０（０～０．１％）によるタンパク質の安定性は類似していた（図３）。
【0117】
実施例６．剤形開発
【0118】
表７に記載のように３種類のトラスツズマブ皮下注射剤形を製造した。剤形５～剤形７はいずれも、１２０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、ＨＰ４６を含む。剤形５～７における差異は安定化剤３（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）の成分であり、剤形５：０．０４％ポリソルベート２０、剤形６：５０ｍｍのＬｙｓ－Ｌｙｓ、剤形３：グリシンを含む。
【0119】
【表7】
【0120】
実施例７．分光光度計を用いた測定
【0121】
４５℃で１４日間剤形５～剤形７の剤形を放置し、タンパク質濃度変化をＢｅｃｋｍａｎ社の分光光度計で分析した。蒸留水で試料の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した後、分光光度計で２８０ｎｍでタンパク質の吸光度を測定した。１４日間の４５℃苛酷安定性試験において剤形５～剤形７で有意のタンパク質濃度の変化はなかった。しかし、ヒアルロニダーゼの活性が４５℃で急に減少する現象を示し、本実施例では酵素活性を測定しなかった（図６参照）。
【0122】
実施例８．サイズ排除クロマトグラフィーを用いて各剤形でトラスツズマブの単量体比率調査
【0123】
サイズ排除クロマトグラフィー分析のためにＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムと、カラムとしてＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、５μｍ）、ＴＳＫガードカラム（６．０×４．０ｍｍ、７μｍ）を使用した。移動相は、０．２５Ｍ塩化カリウムが含まれた０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．２）である。０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で無勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）分離モードを３５分間適用した。試料は分析溶媒で希釈して最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、２０μＬの試料をＨＰＬＣに注入し、２８０ｎｍで吸光度を測定した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体の比率を計算し、グラフで示した。
【0124】
１４日間の４５℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ったとき、剤形５～７の剤形は類似の変化推移を示した。主な変化は、高分子量（Ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ）及び低分子量（Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＬＭＷ）不純物の増加と単量体の減少（約１．５％）であり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に、４５℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析によるタンパク質安定性は、０．０４％ポリソルベート２０と５０ｍＭのＬｙｓ－Ｌｙｓ、５０ｍＭグリシン剤形が類似していた（図４）。
【0125】
実施例９．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対するＷＣＸクロマトグラフィー分析
【0126】
ＷＣＸクロマトグラフィー分析のために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムと、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－ＳＴＡＴ（４．６×１００ｍｍ、７μｍ）、ＴＳＫｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｇｅｌ ＣＭ－ＳＴＡＴ（３．２ｍｍ ｌ．Ｄ．×１．５ｃｍ）を使用した。移動相Ａは１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）であり、移動相Ｂは０．１Ｍ ＮａＣｌが含まれた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）である。流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで０～３０％線形濃度勾配の分離モードを５５分間適用して分析した。試料は移動相Ａで希釈して最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、８０μＬの試料をＨＰＬＣに注入し、２８０ｎｍで吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0127】
１４日間の４５℃苛酷安定性試験でＷＣＸ分析を行ったとき、剤形５～剤形７で類似の変化推移を示した。特定変化としては、酸性変異体相対含有量の増加（１４日間約３０％変化）、メインピーク相対含有量の減少（１４日間約４４％変化）、塩基性変異体相対含有量の増加（１４日間約１５％変化）があり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に、４５℃苛酷安定性試験におけるＷＣＸ分析によるタンパク質安定性は、０．０４％ポリソルベート２０、５０ｍＭリシルリシン（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）、そして５０ｍＭグリシン剤形で類似していた（図５）。
【0128】
実施例１０．トラスツズマブとＨＰ４６の皮下注射剤形において４０℃及び４５℃温度によるＨＰ４６の安定性評価
【0129】
トラスツズマブの皮下注射剤形においてＨＰ４６の安定性を評価するために、トラスツズマブ（１２０ｍｇ／ｍＬ）とＰＨ２０（２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を混合した。ここで使用した緩衝液は２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、０．０４％ポリソルベート２０であった。対照試料は、０日目に酵素活性を測定し、試験試料は、４０℃又は４５℃で１日間放置後に酵素活性を測定した。
【0130】
ハーセプチン皮下注射剤形、トラスツズマブ＋ＨＷ２、及びトラスツズマブ＋ＨＰ４６を４０℃で１日間放置後にヒアルロニダーゼの活性を測定したとき、それぞれ５１％、４７％、９４％の活性を示し、ＨＰ４６が４０℃で熱安定性が高いことを示した（図６）。また、ハーセプチン皮下注射剤形、トラスツズマブ＋ＨＷ２及びトラスツズマブ＋ＨＰ４６を４５℃で１日間放置後にヒアルロニダーゼの活性を測定したとき、ハーセプチン皮下注射剤形とトラスツズマブ＋ＨＷ２は酵素活性が消滅したが、トラスツズマブ＋ＨＰ４６は２２％の酵素活性が残存した（図６）。
【0131】
実施例１１．剤形開発
【0132】
表８に記載のように３種類のトラスツズマブ皮下注射剤形を製造した。剤形８～剤形１０はいずれも、１２０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン及びＰＨ２０変異体を含む。剤形８～１０における差異は、非イオン性界面活性剤の濃度であり、剤形８：０％ポリソルベート２０、剤形９：０．００５％ポリソルベート２０、剤形１０：０．０４％ポリソルベート２０を含む。
【0133】
【表8】
【0134】
実施例１２．分光光度計を用いた測定
【0135】
４０℃で１４日間剤形８～剤形１０の剤形を放置し、タンパク質濃度変化をＢｅｃｋｍａｎ社の分光光度計で分析した。試料の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で希釈した後、分光光度計で２８０ｎｍでタンパク質の吸光度を測定した。１４日間の４０℃苛酷安定性試験において剤形８～剤形１０で有意のタンパク質濃度の差はなかった。
【0136】
実施例１３．サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた各剤形におけるトラスツズマブの単量体比率調査
【0137】
サイズ排除クロマトグラフィー分析のために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムとＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、５μｍ）及びＴＳＫガードカラム（６．０×４．０ｍｍ、７μｍ）を使用した。移動相としては、０．２５Ｍ塩化カリウムが含まれた０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．２）を使用した。流速０．５ｍＬ／ｍｉｎの等速（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）分離モードを適用して３５分間分析を行った。試料は分析溶媒で希釈して最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、２０μＬの試料をＨＰＬＣカラムに注入した後、２８０ｎｍでカラム溶出液の吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0138】
１４日間の４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ったとき、剤形８～１０は類似の変化様相を示した。主な変化は、高分子量（Ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ）及び低分子量（Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＬＭＷ）分解産物の増加及び単量体の減少（約１．０％未満）であり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に、４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、ポリソルベート２０の濃度（０～０．０４％）による剤形間安定性プロファイルに有意の差異はなかった（図７）。
【0139】
実施例１４．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対するタンパク質の凝集温度測定
【0140】
動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）はタンパク質医薬品分野で熱によるタンパク質の変性特性を分析するのに用いられる。この試験では温度変化に従うタンパク質分子のサイズ変化を測定してタンパク質凝集温度を算出するための目的で用いた。ＤＬＳ分析のために、Ｍａｌｖｅｒｎ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ－ｎａｎｏ－ＺＳ機器と石英製キュベット（ＺＥＮ２１１２）を使用した。分析過程において温度は１℃間隔で２５℃から８５℃まで増加させ、試料は各剤形緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈後、キュベットに１５０μＬの試料を入れて分析した。
【0141】
ポリソルベート２０が含まれていない剤形８における凝集温度は７８．３℃であり、剤形９における凝集温度は７７．３℃、剤形１０における凝集温度は７７．７℃であった。実施例１３では、ポリソルベート２０が含まれなくてもタンパク質単量体比率には変化がないことを示し、ポリソルベート２０が含まれていない場合とポリソルベート２０が含まれた場合を比較した結果、タンパク質間の凝集において差異がないことを確認した。この結果は、トラスツズマブの皮下注射剤形に最小限のポリソルベート２０が必須要素でないことを意味する（図８参照）。
【0142】
実施例１５．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対するＷＣＸクロマトグラフィー分析
【0143】
ＷＣＸクロマトグラフィー分析のために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムと、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－ＳＴＡＴ（４．６×１００ｍｍ、７μｍ）、ＴＳＫｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｇｅｌ ＣＭＳＴＡＴ（３．２ｍｍ ｌ．Ｄ．×１．５ｃｍ）などを使用した。移動相Ａは１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）であり、移動相Ｂは０．１Ｍ ＮａＣｌが含まれた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）である。流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで０～３０％移動相Ｂ線形濃度勾配を期しつつ５５分間分析を行った。試料は移動相Ａで希釈して最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、８０μＬの試料をＨＰＬＣに注入した後、２８０ｎｍでカラム溶出液の吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0144】
１４日間の４０℃苛酷安定性試験でＷＣＸ分析を行ったとき、剤形８～剤形１０で類似の変化推移を示した。特定変化としては酸性変異体相対含有量の増加（１４日間約１０％変化）、メインピーク相対含有量の減少（１４日間約４０％変化）、塩基性変異体相対含有量の増加（１４日間約３００％変化）があり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に４０℃苛酷安定性試験におけるＷＣＸ分析ではポリソルベート２０（０～０．０４％）によるタンパク質の安定性は類似していた（図９）。
【0145】
実施例１６．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対する酵素活性測定
【0146】
酵素活性を測定する比濁分析方法は、反応溶液に残存するヒアルロン酸が酸性化したアルブミン（ＢＳＡ）と結合して凝集体を形成する程度を吸光度で測定する方法であり、ＰＨ２０によってヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンと結合する量が減少して吸光度が減少する。標準品としてＢＴＨ（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈して各チューブに用意する。精製されたＰＨ２０変異体試料を酵素希釈バッファー（ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．０、７７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘとなるように希釈して各チューブに用意する。新しいチューブに３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液を濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように１０倍希釈して各チューブの体積が１８０μＬとなるようにする。希釈したヒアルロン酸溶液にヒアルロニダーゼが含まれた試料を６０μＬ入れて混合し、３７℃で４５分間反応させる。反応が終わると、９６ウェルプレートに反応させた酵素５０μＬと酸性アルブミン溶液（ａｃｉｄｉｃ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２５０μＬを各ウェルに入れて１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計で吸光度を測定する。
【0147】
１４日間の４０℃苛酷安定性試験で活性分析を行ったとき、ポリソルベート２０の濃度が高いほど経時的に活性減少幅がより大きくなることを確認した（図１０）。
【0148】
実施例１７．剤形開発
【0149】
表９に記載のように３種類のトラスツズマブ皮下注射剤形を製造した。剤形１１～剤形１３はいずれも、１２０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、ＰＨ２０変異体を含む。剤形１１～１３における差異は非イオン性界面活性剤の濃度であり、剤形１１：０％ポリソルベート８０、剤形１２：０．００５％ポリソルベート８０、剤形１３：０．０４％ポリソルベート８０を含む。
【0150】
【表9】
【0151】
１４日間の４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ったとき、剤形１１～１３は類似の変化様相を示した。主な変化は、高分子量（Ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ）及び低分子量（Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＬＭＷ）分解産物の増加及び単量体の減少（約１．０％未満）であり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、ポリソルベート８０濃度（０～０．０４％）による剤形間安定性プロファイルに有意の差異はなかった（図１１）。
【0152】
実施例１８．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対するＷＣＸクロマトグラフィー分析
【0153】
ＷＣＸクロマトグラフィー分析のために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムと、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－ＳＴＡＴ（４．６×１００ｍｍ、７μｍ）、ＴＳＫｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｇｅｌ ＣＭＳＴＡＴ（３．２ｍｍ ｌ．Ｄ．×１．５ｃｍ）などを使用した。移動相Ａは１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）であり、移動相Ｂは０．１Ｍ ＮａＣｌが含まれた１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）である。流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで０～３０％移動相Ｂ線形濃度勾配を期しつつ５５分間分析を行った。試料は移動相Ａで希釈して最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、８０μＬの試料をＨＰＬＣに注入した後、２８０ｎｍでカラム溶出液の吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでトラスツズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0154】
１４日間の４０℃苛酷安定性試験でＷＣＸ分析を行ったとき、剤形１１～剤形１３で類似の変化推移を示した。特定変化としては酸性変異体相対含有量の増加（１４日間約１０％変化）、メインピーク相対含有量の減少（１４日間約４０％変化）、塩基性変異体相対含有量の増加（１４日間約３００％変化）があり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に４０℃苛酷安定性試験におけるＷＣＸ分析ではポリソルベート８０（０～０．０４％）によるタンパク質の安定性は類似していた（図１２）。
【0155】
実施例１９．トラスツズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対する酵素活性測定
【0156】
酵素活性を測定する比濁分析方法は、反応溶液に残存するヒアルロン酸が酸性化したアルブミン（ＢＳＡ）と結合して凝集体を形成する程度を吸光度で測定する方法であり、ＰＨ２０によってヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンと結合する量が減少して吸光度が減少する。標準品としてＢＴＨ（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈して各チューブに用意する。精製されたタンパク質サンプルを酵素希釈バッファー（２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．０、７７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘとなるように希釈して各チューブに用意する。新しいチューブに３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液を濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように１０倍希釈して各チューブの体積が１８０μＬとなるようにする。希釈したヒアルロン酸溶液にヒアルロニダーゼが含まれた試料を６０μＬ入れて混合し、３７℃で４５分間反応させる。反応が終わると、９６ウェルプレートに反応させた酵素５０μＬと酸性アルブミン溶液２５０μＬを各ウェルに入れて１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計で吸光度を測定する。
【0157】
１４日間の４０℃苛酷安定性試験で活性分析を行ったとき、ポリソルベート８０の濃度が高いほど経時的に活性減少幅がより大きくなることを確認した（図１３）。
【0158】
実施例２０．剤形開発
【0159】
表１０に記載のように３種類のリツキシマブ剤形を製造した。剤形１４～剤形１６はいずれも、１２０ｍｇ／ｍＬのリツキシマブ、２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、ＰＨ２０変異体を含む。剤形１４～１６における差異は非イオン性界面活性剤の濃度であり、剤形１：０％ポリソルベート８０、剤形２：０．００５％ポリソルベート８０、剤形３：０．０６％ポリソルベート８０を含む。
【0160】
【表10】
【0161】
７日間の４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ったとき、剤形１４～１６は類似の変化様相を示した。主な変化は、高分子量（Ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ）及び低分子量（Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＬＭＷ）分解産物の増加及び単量体の減少（約１．０％未満）であり、剤形による差異は有意でなかった。結論的に４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、ポリソルベート８０濃度（０～０．０６％）による剤形間安定性プロファイルに有意の差異はなかった（図１４）。
【0162】
実施例２１．リツキシマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対する酵素活性測定
【0163】
酵素活性を測定する比濁分析方法は、反応溶液に残存するヒアルロン酸が酸性化したアルブミン（ＢＳＡ）と結合して凝集体を形成する程度を吸光度で測定する方法であり、ＰＨ２０によってヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンと結合する量が減少して吸光度が減少する。標準品としてＢＴＨ（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈して各チューブに用意する。精製されたタンパク質サンプルを酵素希釈バッファー（２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．０、７７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘとなるように希釈して各チューブに用意する。新しいチューブに３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液を濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように１０倍希釈して各チューブの体積が１８０μＬとなるようにする。希釈したヒアルロン酸溶液にヒアルロニダーゼが含まれた試料を６０μＬ入れて混合し、３７℃で４５分間反応させる。反応が終わると、９６ウェルプレートに反応させた酵素５０μＬと酸性アルブミン溶液２５０μＬを各ウェルに入れて１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計で吸光度を測定する。
【0164】
７日間の４０℃苛酷安定性試験で活性分析を行ったとき、ポリソルベート８０の濃度が高いほど経時的に活性減少幅がより大きくなることを確認した（図１５）。
【0165】
実施例２２．ポリソルベートを含まない商用製品の剤形で酵素活性測定
【0166】
表１１に記載のように２種類の商用リツキシマブ剤形を製造した。剤形１７は商用皮下注射剤形バッファーであり、剤形１８は商用静脈注射剤形バッファーである。それぞれ１２０、１００ｍｇ／ｍＬのリツキシマブとＰＨ２０変異体を含むが、商用製品の剤形と違い、ポリソルベート８０を含まない。
【0167】
【表11】
【0168】
酵素活性を測定する比濁分析方法は、反応溶液に残存するヒアルロン酸が酸性化したアルブミン（ＢＳＡ）と結合して凝集体を形成する程度を吸光度で測定する方法であり、ＰＨ２０によってヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンと結合する量が減少して吸光度が減少する。標準品としてＢＴＨ（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように希釈して各チューブに用意する。精製されたタンパク質サンプルを酵素希釈バッファー（２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．０、７７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘとなるように希釈して各チューブに用意する。新しいチューブに３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液を濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように１０倍希釈して各チューブの体積が１８０μＬとなるようにする。希釈したヒアルロニダーゼ溶液に酵素を６０μＬ入れて混合し、３７℃で４５分間反応させる。反応が終わると、９６ウェルプレートに反応させた酵素５０μＬと酸性アルブミン溶液２５０μＬを各ウェルに入れて１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計で吸光度を測定する。
【0169】
６日間の４０℃苛酷安定性試験で活性分析を行ったとき、ポリソルベート８０を含まない剤形でも活性が高く維持され、特に剤形１８で高く維持されたことが確認できた（図１６）。
【0170】
実施例２３．剤形開発
【0171】
表１２に記載のように４種類のペムブロリズマブ皮下注射剤形を製造した。剤形１９、２０、２１はいずれも、２５ｍｇ／ｍＬのペムブロリズマブを含み、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５．５）、７％スクロース、１０ｍＭメチオニン、ＰＨ２０変異体で構成する。剤形１９、２０、２１における差異は、非イオン性界面活性剤の濃度であり、剤形１９：０％ポリソルベート８０、剤形２０：０．００５％ポリソルベート８０、剤形２１：０．０２％ポリソルベート８０を含む。剤形２２の場合、２５ｍｇ／ｍＬのペムブロリズマブを含み、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５．５）、２１０ｍＭトレハロース、１０ｍＭメチオニン、０．０２％ポリソルベート８０、ＰＨ２０変異体で構成する。
【0172】
【表12】
【0173】
実施例２４．分光光度計を用いた測定
【0174】
４０℃で７日間剤形１９、２０、２１、２２の剤形を放置し、タンパク質濃度変化をＢｅｃｋｍａｎ社の分光光度計で分析した。試料の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で希釈した後、分光光度計で２８０ｎｍでタンパク質の吸光度を測定した。
【0175】
７日間の４０℃苛酷安定性試験において剤形１９～剤形２２で有意のタンパク質濃度の差はなかった。
【0176】
実施例２５．サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた各剤形におけるペムブロリズマブの単量体比率調査
【0177】
サイズ排除クロマトグラフィー分析のために、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ社のＨＰＬＣシステムとＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、５μｍ）及びＴＳＫガードカラム（６．０×４．０ｍｍ、７μｍ）を使用した。移動相としては０．２５Ｍ塩化カリウムが含まれた０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．２）を使用した。流速０．５ｍＬ／ｍｉｎの等速（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）分離モードを適用して３５分間分析を行った。試料は分析溶媒で希釈して最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにし、２０μＬの試料をＨＰＬＣカラムに注入した後、２８０ｎｍでカラム溶出液の吸光度を記録した。ＨＰＬＣクロマトグラムでペムブロリズマブの単量体比率を計算し、グラフで示した。
【0178】
７日間の４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行ったとき、剤形１９、２０、２１、２２は類似の変化様相を示した。高分子量（Ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ）及び低分子量（Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ＬＭＷ）分解産物の変化様相において剤形による差異は有意でなかった。結論的に、４０℃苛酷安定性試験においてサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、剤形１９、２０、２１、２２で有意の差異はなく、糖の種類による差異もなかった（図１７）。この結果は、上の実施例のトラスツズマブ及びリツキシマブの結果と一致した。
【0179】
実施例２６．ペムブロリズマブとＨＰ４６が含まれた剤形に対する酵素活性測定
【0180】
酵素活性を測定する比濁分析方法は、反応溶液に残存するヒアルロン酸が酸性化したアルブミン（ＢＳＡ）と結合して凝集体を形成する程度を吸光度で測定する方法であり、ＰＨ２０によってヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンと結合する量が減少して吸光度が減少する。標準品としてＢＴＨ（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように希釈して各チューブに用意する。精製されたタンパク質サンプルを酵素希釈バッファー（２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．０、７７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘとなるように希釈して各チューブに用意する。新しいチューブに３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸溶液を濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように１０倍希釈して各チューブの体積が１８０μＬとなるようにする。希釈したヒアルロニダーゼ溶液に酵素を６０μＬ入れて混合し、３７℃で４５分間反応させる。反応が終わると、９６ウェルプレートに反応させた酵素５０μＬと酸性アルブミン溶液２５０μＬを各ウェルに入れて１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計で吸光度を測定する。
【0181】
７日間の４０℃苛酷安定性試験で活性分析を行ったとき、ポリソルベート８０の濃度が高いほど経時的に活性減少幅が若干大きくなることを確認した。同じポリソルベート８０が含まれたとき、スクロースが含まれた剤形に比べてトレハロースが含まれた剤形において活性減少幅がより小さいことを確認した。（図１８）
【0182】
実施例２７．ＨＰ４６と野生型ＨＷ２のｐＨ活性プロファイル
【0183】
ＨＰ４６と野生型ＨＷ２のｐＨ活性プロファイルを確認する実験のために、マイクロ比濁分析（Ｍｉｃｒｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）方法を用いた。基質であるヒアルロン酸を溶解するヒアルロン酸緩衝液と酵素を希釈する酵素緩衝液をｐＨ別に用意した。
【0184】
酵素と基質の反応のために総３個の９６ウェルプレートを用意し、Ａ、Ｂ、Ｃと定めて試験を行った。
【0185】
ヒアルロン酸緩衝液でｐＨ４．０、４．５、５．０の範囲は２０ｍＭ酢酸、７０ｍＭ ＮａＣｌを用いて調製し、ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、８．０の範囲は２０ｍＭリン酸ナトリウム、７０ｍＭ ＮａＣｌを用いて調製した。用意したそれぞれのヒアルロン酸緩衝液１０ｍＬに２０ｍｇのヒアルロン酸を溶解させて最終ヒアルロン酸基質溶液を用意し、ｐＨ別に用意したヒアルロン酸緩衝液でそれぞれを希釈して０．１、０．２５、０．４５、０．７ｍｇ／ｍＬ濃度となるように５００μＬずつ用意し、Ａ番の９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。希釈して濃度別に用意したヒアルロン酸緩衝液は、ヒアルロン酸濃度を測定するための検量曲線に用いられた。
【0186】
酵素緩衝液においてｐＨ４．０、４．５、５．０の範囲は、２０ｍＭ酢酸、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、７０ｍＭ ＮａＣｌを用いて調製し、ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、８．０の範囲は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、７０ｍＭ ＮａＣｌを用いて調製した。
【0187】
ＨＰ４６と野生型ＨＷ２酵素を各ｐＨ別に用意した酵素緩衝液で１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように希釈してＢ番の９６ウェルプレートに５０μＬずつ分注した。
【0188】
Ａ番の９６ウェルプレートからＢ番の９６ウェルプレートに５０μＬずつ移し込め、３７℃振盪培養器で４５分間反応させた。反応の終了する１５分前に酸性アルブミン溶液を２００μＬずつＣ番の９６ウェルプレートに分注して用意し、酵素基質反応が終了するとＢ番の９６ウェルプレートから４０μＬずつＣ番の９６ウェルプレートに移して２０分間反応させた。２０分が経過すると、６００ｎｍで吸光度を測定し、酵素基質反応後に残っているヒアルロン酸の量を計算してｐＨ別酵素の活性プロファイルを完成した（図１９）。
【0189】
実施例２８．Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットでハーセプチン皮下注射剤形及びトラスツズマブとＨＰ４６を用いた薬物動態学試験
【0190】
トラスツズマブとＨＰ４６の皮下注射剤形がハーセプチンの皮下注射剤形と同等な薬物動態学特性を示すかを調べるために、９週齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用いて試験をした。投与したハーセプチンとトラスツズマブの量はラット体重対比１８ｍｇ／ｋｇであり、ハーセプチン皮下注射剤形に含まれたｒＨｕＰＨ２０は１００Ｕであり、ＨＰ４６も同様に１００Ｕである。薬物動態学試験においてトラスツズマブとＨＰ４６はハーセプチン皮下注射剤形と同じ曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）を示した（図２０）。
【産業上の利用可能性】
【0191】
本発明に係る医薬組成物は、皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のために使用可能であるとともに非常に安定なため、薬物、好ましくは抗体医薬品など、及びＰＨ２０変異体の活性を長期間維持させることができ、よって、皮下注射剤形の生産費用の他に医療費用の節減にも寄与でき、患者の便宜性面でも非常に有利である。
【0192】
参考文献
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Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｓａｂｒｉｎａ，Ｓ．，Ｅｌ－Ｓａｆｏｒｙ，Ｎ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｃ．Ｋ．（２０１６） Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ＰＨ２０ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．１２２，６７３－６７８
Ｆｒｏｓｔ，Ｇ．Ｉ．（２００７）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｒＨｕＰＨ２０）： ａｎ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｆｌｕｉｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ４，４２７－４４０
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Ｋｒｅｉｄｉｅｈ，Ｆ．Ｙ．，Ｍｏｕｋａｄｅｍ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ Ｓａｇｈｉｒ，Ｎ．Ｓ．Ｅ．（２０１６） Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ７，８７－９７．
Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｙｏｃｕｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｈａｌｌｅｒ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｌａｍｅｎｔ Ｊ．（２００９） Ｔｈｅ ＩＮＦＵＳＥ－Ｍｏｒｐｈｉｎｅ ＩＩＢ Ｓｔｕｄｙ： Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｒＨｕＰＨ２０） ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｏｒｐｈｉｎｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｊ Ｐａｉｎ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｍａｎａｇ ３８，６７３－６８２
Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｈｏｆｅｒ，Ａ．，Ｈａｌｌｅｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｚｅｐｅｄａ，Ｍ．Ｌ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｌｉｍ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．，Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｆｒｏｓｔ，Ｇ．Ｉ．（２００６）．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １１４，２３０－２４１．
Ｂｏｒｄｅｒｓ ｊｒ．，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ Ｒａｆｔｅｒｙ，Ａ．（１９６８） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４３，３７５６－３７６２
Ｃｈａｏ，Ｋ．Ｌ．，Ｍｕｔｈｕｋｕｍａｒ，Ｌ．，ａｎｄ Ｈｅｒｚｂｅｒｇ，Ｏ．（２００７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ－１，ａ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６，６９１１－６９２０．
Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｓａｂｒｉｎａ，Ｓ．，Ｅｌ－Ｓａｆｏｒｙ，Ｎ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｃ．Ｋ．（２０１６） Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ＰＨ２０ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．１２２，６７３－６７８
Ｆｒｏｓｔ，Ｇ．Ｉ．（２００７）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｒＨｕＰＨ２０）： ａｎ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｆｌｕｉｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ４，４２７－４４０
Ｈｏｆｉｎｇｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ，Ｇ．，ａｎｄ Ｂｕｓｃｈａｕｅｒ，Ａ．（２００７） Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｈｙａｌ－１ ａｎｄ ＰＨ－２０ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７，９６３－９７１
Ｋｒｅｉｄｉｅｈ，Ｆ．Ｙ．，Ｍｏｕｋａｄｅｍ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ Ｓａｇｈｉｒ，Ｎ．Ｓ．Ｅ．（２０１６） Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ７，８７－９７．
Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｙｏｃｕｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｈａｌｌｅｒ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ Ｆｌａｍｅｎｔ Ｊ．（２００９） Ｔｈｅ ＩＮＦＵＳＥ－Ｍｏｒｐｈｉｎｅ ＩＩＢ Ｓｔｕｄｙ： Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｒＨｕＰＨ２０） ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｏｒｐｈｉｎｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｊ Ｐａｉｎ Ｓｙｍｐｔｏｍ Ｍａｎａｇ ３８，６７３－６８２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a-9b】
【図9c-9d】
【図10】
【図11】
【図12a-12b】
【図12c-12d】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】