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特許7166933プログラム細胞死を誘導するＣＤ４７のアゴニスト剤及びプログラム細胞死の欠陥と関連する疾患の治療におけるそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-28
(45)【発行日】2022-11-08
(54)【発明の名称】プログラム細胞死を誘導するＣＤ４７のアゴニスト剤及びプログラム細胞死の欠陥と関連する疾患の治療におけるそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/64 20060101AFI20221031BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20221031BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20221031BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20221031BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20221031BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221031BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221031BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221031BHJP
【ＦＩ】
C07K7/64 ZNA
C07K14/47
A61K38/08
A61K38/10
A61K38/16
A61P29/00
A61P37/04
A61P35/00
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2018559280
(86)(22)【出願日】2017-05-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-07-04
(86)【国際出願番号】 EP2017061233
(87)【国際公開番号】W WO2017194634
(87)【国際公開日】2017-11-16
【審査請求日】2020-03-03
(31)【優先権主張番号】16305543.7
(32)【優先日】2016-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】507416908
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
(73)【特許権者】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カロヤン フィリップ
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２０１７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】CHAN L Y; ET AL，CYCLIC THROMBOSPONDIN-1 MIMETICS: GRAFTING OF A THROMBOSPONDIN SEQUENCE INTO CIRCULAR DISULFIDE-RICH FRAMEWORKS TO INHIBIT ENDOTHELIAL CELL MIGRATION，BIOSCIENCE REPORTS，米国，SPRINGER，2015年10月13日，VOL:35, NR:6，PAGE(S):E00270-1/12，http://dx.doi.org/10.1042/BSR20150210
【文献】WANG S; ET AL，DEVELOPMENT OF A PROSAPOSIN-DERIVED THERAPEUTIC CYCLIC PEPTIDE THAT TARGETS OVARIAN CANCER VIA THE TUMOR MICROENVIRONMENT，SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE，AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENC，2016年03月09日，VOL:8, NR:329，PAGE(S):329RA34-1/11，http://dx.doi.org/10.1126/scitranslmed.aad5653
【文献】ANA-CAROLINA MARTINEZ-TORRES; ET AL，CD47 AGONIST PEPTIDES INDUCE PROGRAMMED CELL DEATH IN REFRACTORY CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA B CELLS VIA PLCγ1 ACTIVATION: EVIDENCE FROM MICE AND HUMANS，PLOS MEDICINE，2015年03月03日，VOL:12, NR:3，PAGE(S):E1001796-1/37，http://dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.1001796
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（Ｉａ）：Ｚ１は存在せず、
Ｂ２はペプチド配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（配列番号２）を表し、６個～１０個のアミノ酸を含み、ここで、
Ｘ１は存在しないか、又はセリンを指し、
Ｘ２は存在しないか、アルギニン又はＮ－メチルアルギニンを指し、
Ｘ３はフェニルアラニンを指し、
Ｘ４はチロシン又はフェニルアラニンを指し、
Ｘ５はバリンを指し、
Ｘ６はバリンを指し、
Ｘ７はメチオニン、リシン又はノルロイシンを指し、
Ｘ８はトリプトファンを指し、
Ｘ９は存在しないか、又はリシンを指し、
Ｘ１０は存在しないか、又はグルタミンを指し、
Ｚ２ はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
Ｂ３は以下の配列：－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｘ１６－Ｘ２２－Ｘ２３－Ｘ１７－Ｘ１８－（配列番号３６）を含む６個～１０個のアミノ酸のペプチド配列であり、ここで、
Ｘ１４は存在しないか、グリシン又はアラニンであり、
Ｘ１５はイソロイシン又はロイシンであり、
Ｘ１６はリシンであり、
Ｘ１７は存在しないか、アスパラギン又はリシンであり、
Ｘ１８は存在しないか、セリン又はグリシンであり、
Ｘ１９は存在しないか、又はセリンであり、
Ｘ２０はセリン又はアラニンであり、
Ｘ２１はバリン又はアラニンであり、
Ｘ２２はバリンであり、
Ｘ２３はバリンである）の単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩であって、該単離環状ペプチドが偶数のアミノ酸を含み、前記単離環状ペプチドが１４個～２２個のアミノ酸を含む、単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
【請求項2】
前記ペプチドがＰＫＴＤ１（配列番号９）、ＰＫＴＤ３（配列番号１０）、ＰＫＴＤ６（配列番号１３）、ＰＫＴＤ７（配列番号１４）、ＰＫＴＤ１０（配列番号１７）、ＰＫＴＤ１０－１（配列番号１８）、ＰＫＴＤ１０－３（配列番号２０）、ＰＫＴＤ１０－４（配列番号２１）、ＰＫＴＤ１１（配列番号２８）、ＰＫＴＤ１２（配列番号２９）、ＰＫＴＤ１５（配列番号３２）若しくはＰＫＴＤ１８（配列番号３５）、ＰＫＤ８（配列番号４１）、ＰＫＤ８ＦＦ（配列番号４２）、ＰＫＤ９（配列番号４３）、ＰＫＤ１０（配列番号４４）、ＰＫＤ１０ＦＦ（配列番号４５）、ＰＫＤ１１（配列番号４７）、ＰＫＤ１１ＲＮＭｅ（配列番号４８）、ＰＫＤ１２（配列番号４９）、ＰＫＤ１２ＲＮＭｅ（配列番号５０）、ＰＫＴＤ１０－ＲＮＭｅ（配列番号５４）、ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号５５）、ＰＫＴＤ１０－３－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号５６）、ＰＫＴＤ１１－ＲＮＭｅ（配列番号６０）、ＰＫＴＤ１１－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号６１）、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群において選択される、請求項１に記載の単離環状ペプチド。
【請求項3】
薬剤としての使用のための請求項１又は２に記載の単離環状ペプチド。
【請求項4】
ＣＤ４７アゴニスト、特にＰＣＤの欠陥と関連する疾患の治療におけるＣＤ４７アゴニストとしての使用のための請求項１又は２に記載の単離環状ペプチド。
【請求項5】
癌の治療における請求項４に記載の使用のための請求項１又は２に記載の単離環状ペプチド。
【請求項6】
慢性炎症を含む免疫障害と関連する疾患の治療における請求項４に記載の使用のための請求項１又は２に記載の単離環状ペプチド。
【請求項7】
請求項１又は２に記載の一般式（Ｉａ）の単離環状ペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインの環状ペプチド模倣体に関する。
【0002】
本発明は、ＣＤ４７のアゴニストとしてのこれらの環状ペプチドの使用及びプログラム細胞死（ＰＣＤ）を誘発するそれらの能力にも関する。
【0003】
本発明は、癌及び免疫障害（慢性炎症を含む）といったＰＣＤの欠陥と関連する疾患の治療に使用され、少なくとも１つの本発明による環状ペプチドを含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【0004】
１ － 疾患におけるＰＣＤの役割
プログラム細胞死（ＰＣＤ）は、構造の造形及び形態形成の推進、細胞数の調節、不要かつ潜在的に危険な細胞の排除といった、発生及び組織恒常性の調節において重要な役割を果たすｉ。
プログラム細胞死（ＰＣＤ）は、構造の造形及び形態形成の推進、細胞数の調節、不要かつ潜在的に危険な細胞の排除といった、発生及び組織恒常性の調節において重要な役割を果たすｉ。
【0005】
このプロセスの調節異常（すなわち、ＰＣＤの過剰又は欠陥）は、発育障害及び免疫障害、神経変性、並びに癌を含む広範なヒト疾患と関連する。
【0006】
異常細胞がＰＣＤを免れることができる機構を分子レベルで解明するために、ここ２０年間で目覚ましい進歩が遂げられている。２つの経路、すなわち内因性経路及び外因性経路が正常細胞においてＰＣＤを誘発し得る。どちらの経路も、多様なプログラム細胞死のタイプをもたらすタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）及び活性化のカスケードを伴う（図１及び図２を参照されたい）。抗細胞死タンパク質と細胞死促進タンパク質との相互作用の不均衡は細胞死恒常性の不全につながり、この不全により少なくとも癌及び免疫障害といったＰＣＤの過剰又は欠陥を有する多くの疾患が生じるｉｉ。
【0007】
２ － 癌及びＰＣＤの欠陥
癌は、細胞分裂と細胞死との間の不均衡を特徴とする疾患であるｉｉｉ。
癌は、細胞分裂と細胞死との間の不均衡を特徴とする疾患であるｉｉｉ。
【0008】
癌細胞では、ＰＣＤの阻止は主に、抗細胞死タンパク質の過剰発現又は細胞死促進タンパク質の下方調節のいずれかをもたらす細胞遺伝学的異常によって引き起こされる。これまでに５００００個を超える染色体異常（増加（gain）又は減少（loss））が報告されているｉｖ。カスパーゼ依存性アポトーシス死経路に焦点が合わせられているが、非アポトーシス性ＰＣＤも腫瘍の発生及び進行に対する重要な障壁を形成することが知られているｖ。自発的及び治療誘導性アポトーシスの制御要素としてのｐ５３、ｃ－Ｍｙｃ及びＢｃｌ－２のような主要癌関連タンパク質の同定につながる以前の画期的な発見と同様、腫瘍抑制因子の特性を有する多数のタンパク質及び腫瘍性タンパク質が、代替的な細胞死プログラムの主要調節因子として同定されている。非アポトーシス性ＰＣＤを調節する分子機構に関する新たなデータは、潜在的な治療結果を有するｖｉ。
【0009】
発癌は組織傷害に対する防御プロセスである炎症とも関連する（非特許文献１）。この自己防御戦略が開始すると、プロセスの効果的な収束（resolution）が大きく不必要な組織損傷を回避するために不可欠である。炎症を誘導する根本的事象が対処されず、恒常性が回復されない場合、炎症プロセスは慢性となり、血管新生、発癌及び例えば自己免疫疾患である多発性硬化症、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、関節炎及び喘息といった慢性炎症と関連する疾患につながるｖｉｉ。
【0010】
３ － 免疫障害、自己免疫疾患及びＰＣＤの欠陥
自己免疫疾患の共通の特徴は、自己抗原に対する免疫寛容の変化及び自己抗体の生成である。免疫恒常性及び免疫寛容の維持は、アポトーシスに強く依存する。多数の証拠が、免疫細胞のアポトーシスの欠損が自己免疫疾患につながるという考えを支持している。Ｆａｓシグナル伝達経路に欠損を有するＬｐｒ及びｇｌｄマウスは、リンパ節症及び脾腫を発症し、ヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に似た疾患を発症する多数の自己抗体を産生し、自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞の制御における外因性アポトーシス経路の重要な役割、またアポトーシスの変化が自己免疫疾患の病因に強く寄与し得るということが明らかに実証されるｖｉｉｉ。ヒトでは、Ｆａｓシグナル伝達経路の欠陥が非悪性リンパ球増殖及び自己免疫を特徴とする自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）につながり、悪性腫瘍の発生率が増大した。これらの患者の７０％が生殖細胞ヘテロ接合ＦＡＳ突然変異を保有し、残りが体細胞ＦＡＳ突然変異又はＦＡＳリガンド、カスパーゼ１０及びカスパーゼ８の突然変異を有する。大抵の場合、突然変異は、野生型タンパク質の機能も阻害するドミナントネガティブとして機能するｉｘ。
自己免疫疾患の共通の特徴は、自己抗原に対する免疫寛容の変化及び自己抗体の生成である。免疫恒常性及び免疫寛容の維持は、アポトーシスに強く依存する。多数の証拠が、免疫細胞のアポトーシスの欠損が自己免疫疾患につながるという考えを支持している。Ｆａｓシグナル伝達経路に欠損を有するＬｐｒ及びｇｌｄマウスは、リンパ節症及び脾腫を発症し、ヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に似た疾患を発症する多数の自己抗体を産生し、自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞の制御における外因性アポトーシス経路の重要な役割、またアポトーシスの変化が自己免疫疾患の病因に強く寄与し得るということが明らかに実証されるｖｉｉｉ。ヒトでは、Ｆａｓシグナル伝達経路の欠陥が非悪性リンパ球増殖及び自己免疫を特徴とする自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）につながり、悪性腫瘍の発生率が増大した。これらの患者の７０％が生殖細胞ヘテロ接合ＦＡＳ突然変異を保有し、残りが体細胞ＦＡＳ突然変異又はＦＡＳリガンド、カスパーゼ１０及びカスパーゼ８の突然変異を有する。大抵の場合、突然変異は、野生型タンパク質の機能も阻害するドミナントネガティブとして機能するｉｘ。
【0011】
外因性経路の欠陥は免疫系において大きな役割を果たすようであるが、内因性経路も関与し、その変化が自己免疫疾患の病因に寄与し得ることが明らかになりつつあるｘ。一例として、Ｂｉｍ ＫＯマウスはリンパ系細胞及び骨髄性細胞が蓄積し、自己免疫疾患を発症することが示されているｘｉ。自己免疫疾患を有する患者におけるＢＨ３ ｏｎｌｙタンパク質の突然変異は記載されていないが、Ｂｉｍレベルの低下がＡＬＰＳを有する患者において報告され、ｂｃｌ２ファミリーの生存促進性メンバーの過剰発現がＳＬＥにおいて報告されているｘｉｉ。
【0012】
これらの要因を考慮すると、ＰＣＤの欠陥及び望ましくない細胞増殖とより特異的に関連する疾患においてプログラム細胞死を誘発することが可能な非常に効率的な成分を同定することが極めて重要である。
【0013】
４ － 現行の技術水準
ＰＣＤ調節に関与するタンパク質の結晶構造のＸ線解析（resolution）により、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）を標的とし、ＰＣＤを回復させる多くの小分子が設計された。幾つかの重要な例は、ｐ５３－ＭＤＭ２複合体を標的とするＮｕｔｌｉｎｘｉｉｉ、Ｎａｖｉｔｏｃｌａｘｘｉｖ、ＢＣｌ－２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質を標的とするＢＨ３模倣体、又はＳＭＡＣ／ＸＩＡＰ相互作用の阻害因子ｘｖである。ｐ５３－ＭＤＭ２複合体の場合、ＭＤＭ２と相互作用することが可能なｐ５３ ３Ｄ構造の多くのペプチド及びペプチド模倣体もＰＰＩの攪乱物質（disrupters）として設計され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで大きな成果を挙げている。しかしながら、ペプチド及び模倣体は通常低い細胞透過性を示すため、かかるペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで同様のｐ５３－ＭＤＭ２撹乱活性を示すか否かを見極めることに現在興味が持たれているｘｖｉ。注目すべきは、予後不良と関連する、よく見られる細胞遺伝学的変化であるＴＰ５３欠失の場合に、小分子及びペプチドアプローチがどちらも依然としてＰＣＤの誘発に効果がないことであるｘｖｉｉ。何よりも、ここ数年のヒトタンパク質間インタラクトームネットワークの解読が、必然的にＰＣＤ回避を可能にし、疾患の進行を戻す代償機構の活性化を生じる、単一経路と相互作用するように設計された治療剤の限界を浮き彫りにしているｘｖｉｉｉ。仮にそうだとしても、膜透過性の問題に対応するために細胞外標的を扱うことによるペプチドアプローチがより妥当である。さらに、代償機構を克服するために、シグナル伝達経路の上流に位置し、ＰＣＤを不可逆的に誘発することが可能な標的を扱うことがより効率的であり得る。
ＰＣＤ調節に関与するタンパク質の結晶構造のＸ線解析（resolution）により、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）を標的とし、ＰＣＤを回復させる多くの小分子が設計された。幾つかの重要な例は、ｐ５３－ＭＤＭ２複合体を標的とするＮｕｔｌｉｎｘｉｉｉ、Ｎａｖｉｔｏｃｌａｘｘｉｖ、ＢＣｌ－２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質を標的とするＢＨ３模倣体、又はＳＭＡＣ／ＸＩＡＰ相互作用の阻害因子ｘｖである。ｐ５３－ＭＤＭ２複合体の場合、ＭＤＭ２と相互作用することが可能なｐ５３ ３Ｄ構造の多くのペプチド及びペプチド模倣体もＰＰＩの攪乱物質（disrupters）として設計され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで大きな成果を挙げている。しかしながら、ペプチド及び模倣体は通常低い細胞透過性を示すため、かかるペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで同様のｐ５３－ＭＤＭ２撹乱活性を示すか否かを見極めることに現在興味が持たれているｘｖｉ。注目すべきは、予後不良と関連する、よく見られる細胞遺伝学的変化であるＴＰ５３欠失の場合に、小分子及びペプチドアプローチがどちらも依然としてＰＣＤの誘発に効果がないことであるｘｖｉｉ。何よりも、ここ数年のヒトタンパク質間インタラクトームネットワークの解読が、必然的にＰＣＤ回避を可能にし、疾患の進行を戻す代償機構の活性化を生じる、単一経路と相互作用するように設計された治療剤の限界を浮き彫りにしているｘｖｉｉｉ。仮にそうだとしても、膜透過性の問題に対応するために細胞外標的を扱うことによるペプチドアプローチがより妥当である。さらに、代償機構を克服するために、シグナル伝達経路の上流に位置し、ＰＣＤを不可逆的に誘発することが可能な標的を扱うことがより効率的であり得る。
【0014】
上述のように、ＰＣＤの欠陥及び望ましくない細胞増殖とより特異的に関連する疾患においてプログラム細胞死を誘発することが可能な非常に効率的な成分を同定することが極めて重要である。この目的は、本発明者らにより驚くべきことにＴＳＰ－１環状アゴニストペプチドが癌細胞のＰＣＤを高効率で誘発することが実証されたことから、本発明によって達成される。
【0015】
５ － トロンボスポンジン及びＴＳＰ－１
ＴＳＰ－１は、Lawler and alにより１９７８年に活性化血小板中で初めて単離され、糖タンパク質として説明された４５０ｋＤのマトリックス細胞タンパク質である。１９９４年及び１９９６年には、GaoらがＴＳＰ－１をＣＤ４７の内在性リガンドとして説明しているｘｘ、ｘｘｉ。ＴＳＰ－１は、５つの異なるメンバーから構成される多ドメインカルシウム結合糖タンパク質のファミリーに属する。
ＴＳＰ－１は、Lawler and alにより１９７８年に活性化血小板中で初めて単離され、糖タンパク質として説明された４５０ｋＤのマトリックス細胞タンパク質である。１９９４年及び１９９６年には、GaoらがＴＳＰ－１をＣＤ４７の内在性リガンドとして説明しているｘｘ、ｘｘｉ。ＴＳＰ－１は、５つの異なるメンバーから構成される多ドメインカルシウム結合糖タンパク質のファミリーに属する。
【0016】
ＴＳＰ－１は、細胞間及び細胞－細胞外マトリックス相互作用を媒介する、異なる細胞膜受容体又は細胞外マトリックスに結合する幾つかのドメインを有する。ＴＳＰ－１はＮ末端球状ドメイン、３つのジスルフィド連結鎖（タイプＩ（プロパージン様リピート）、タイプＩＩ（上皮成長因子様）及びタイプＩＩＩ（カルシウム結合）リピート）及びＣ末端球状ドメインを含有する。Ｎ末端ドメインは低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質、ヘパリン及び幾つかのインテグリンと相互作用する。タイプＩリピート又はトロンボスポンジン構造相同性リピート（ＴＳＲ）はＣＤ３６、Ｖ型コラーゲン、フィブロネクチン及びへパラン硫酸プロテオグリカンを結合する。タイプＩＩＩリピートは、ＴＳＰ－１ ４１１上のＲＧＤモチーフを介してβ３インテグリンに結合するカルシウム結合ドメインである。最後に、ＴＳＰ－１のＣ末端ドメインはＣＤ４７に結合する（Gao and Frazierを参照されたい）。
【0017】
ＴＳＰ－１のＣ末端細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）から合成された重複ペプチドを用いて、Gao and FrazierはＶＶＭモチーフを含有する２つの相同細胞結合配列を見出し、この部位がＴＳＰ－１／ＣＤ４７結合に不可欠であることを見出したｘｘｉｉ。この発見により、ペプチド７Ｎ３（１１０２－ＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ－１１１２）及び４Ｎ１（１０１６－ＲＦＹＶＶＭＷＫ－１０２４）中のものを含むＶＶＭモチーフを有するＴＳＰ－１の配列に対応する短ペプチドの開発がもたらされた。４Ｎ１Ｋペプチド（Ｋ－ＲＦＹＶＶＭＷＫ－Ｋ）が後に、ＣＤ４７結合に影響を与えることなく４Ｎ１の溶解性を改善するために開発された。
【0018】
６ － ＴＳＰ１／ＣＤ４７相互作用
ＣＤ４７へのＴＳＰ－１の結合は細胞の移動及び接着、細胞増殖又はアポトーシスを含む幾つかの基本的な細胞機能に影響を与え、血管新生及び炎症の調節において役割を果たすｘｘｉｉｉ。
ＣＤ４７へのＴＳＰ－１の結合は細胞の移動及び接着、細胞増殖又はアポトーシスを含む幾つかの基本的な細胞機能に影響を与え、血管新生及び炎症の調節において役割を果たすｘｘｉｉｉ。
【0019】
これまで、ＴＳＰ－１／ＣＤ４７複合体はＸ線構造によって解析されていない。分子モデリング研究は、Floquet et al.によって達成された（Floquet et al.の図面に従って描かれた図３を参照されたい）ｘｘｉｖ。この研究では、４Ｎ１配列はＴＳＰ１の疎水性ポケットに隠され、ＣＤ４７とのあらゆる相互作用が妨げられると説明される。しかしながら、４Ｎ１配列がＣＤ４７及びリン脂質二重層にごく接近する場合、疎水性クレフト（cleft）が開き、４Ｎ１認識が可能となる。
【0020】
ＣＤ４７／ＴＳＰ－１ライゲーションの生物学的影響は非常に膨大であり、細胞型、他の分子との会合、立体配座、細胞表面上での分布、会合様式及びこれらの項目が生じる特定の状況によって決まる。
【0021】
これらの役割は生物の恒常性の調節において重要であり、ＴＳＰ１／ＣＤ４７相互作用が広範な機能を果たす。これらの中でも、潜在的な治療利益の１つは細胞死を誘導する能力であり、本明細書では癌細胞により例証される。
【0022】
ＣＤ４７媒介プログラム細胞死
過去数年に行われた精力的な研究により、幾つかのＣＤ４７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びＴＳＰ－１のＣ末端ドメインが種々の細胞型においてＣＤ４７媒介ＰＣＤを誘導し得ることが実証されている。重要なことには、ＳＩＲＰ－α可溶性Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ４７依存性細胞死を誘導しないにも関わらずｘｘｖ、或る報告ではビーズの表面上に結合したＳＩＲＰ－α及びγが２つの腫瘍細胞株においてＣＤ４７媒介ＰＣＤを誘導し得ることが述べられているｘｘｖｉ。注目すべきことに、ＣＤ４７がその細胞外ＩｇＶドメインを介してＦａｓと会合し、Ｆａｓ媒介アポトーシスの増大が生じることも見出されているｘｘｖｉｉ。
過去数年に行われた精力的な研究により、幾つかのＣＤ４７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びＴＳＰ－１のＣ末端ドメインが種々の細胞型においてＣＤ４７媒介ＰＣＤを誘導し得ることが実証されている。重要なことには、ＳＩＲＰ－α可溶性Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ４７依存性細胞死を誘導しないにも関わらずｘｘｖ、或る報告ではビーズの表面上に結合したＳＩＲＰ－α及びγが２つの腫瘍細胞株においてＣＤ４７媒介ＰＣＤを誘導し得ることが述べられているｘｘｖｉ。注目すべきことに、ＣＤ４７がその細胞外ＩｇＶドメインを介してＦａｓと会合し、Ｆａｓ媒介アポトーシスの増大が生じることも見出されているｘｘｖｉｉ。
【0023】
ＣＤ４７媒介ＰＣＤを説明する最初の研究は１９９９年に行われ、ＣＤ４７会合が初代慢性リンパ球性白血病細胞ｘｘｖｉｉｉ、急性Ｔ細胞白血病由来細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）及び活性化Ｔ細胞ｘｘｉｘにおいて細胞死を誘導し得ることが見出された。しかしながら、このプロセスは、どちらのグループもＰＣＤ誘導をＣＤ４７の刺激によってではあるが、異なる誘導物質を用いて見出したことから非常に複雑であることが見出された。Mateoらが被覆Ｂ６Ｈ１２ ｍＡｂ、ＴＳＰ－１及び４Ｎ１ＫペプチドをＰＣＤの誘導に使用した一方で、Pettersenらは可溶性抗ＣＤ４７ ｍＡｂのみを使用し、Ａｄ２２及び１Ｆ７（Ｂ６Ｈ１２でも２Ｄ３でもない）ｍＡｂがＪｕｒｋａｔ細胞において細胞死を誘導することを見出した。さらに、どちらのグループも可溶性Ｂ６Ｈ１２が細胞死を誘導することができないことを見出した。このデータによりＣＤ４７会合様式と細胞死誘導との間の複合調節の重要性が示された。これらの結果に続いて、他の細胞型におけるＣＤ４７媒介ＰＣＤ誘導の評定が急速に行われた。これらの評定には、可溶性又は被覆形態で使用される種々の抗ＣＤ４７ ｍＡｂ、ＴＳＰ１、ＴＳＰ１ Ｃ末端由来ペプチド（４Ｎ１及び４Ｎ１Ｋ）及び組み換えタンパク質（Ｔ３Ｃ１）が含まれていた。
【0024】
癌細胞におけるＣＤ４７媒介ＰＣＤ
ＣＤ４７媒介細胞死誘導は急性リンパ芽球性白血病細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株）ｘｘｘ、乳房腫瘍細胞（ＭＣＦ－７細胞株）ｘｘｘｉ、多発性骨髄腫細胞（ＫＰＭＭ２細胞株）ｘｘｘｉｉ、急性前骨髄球性白血病細胞（ＮＢ４及びＡＴＲＡ－難治性ＮＢ４－ＬＲ１細胞株）ｘｘｘｉｉｉ、及び組織球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７細胞株）ｘｘｘｉｖといった多数の腫瘍細胞において観察された。さらに、急性Ｔ細胞白血病細胞（ｊｕｒｋａｔ）ｘｘｘｖ、ｘｘｘｖｉ、ｘｘｘｖｉｉ、及び初代ＣＬＬ細胞において行われた研究が強化されたｘｘｘｖｉｉｉ、ｘｘｘｉｘ、ｘｌ、ｘｌｉ。
ＣＤ４７媒介細胞死誘導は急性リンパ芽球性白血病細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株）ｘｘｘ、乳房腫瘍細胞（ＭＣＦ－７細胞株）ｘｘｘｉ、多発性骨髄腫細胞（ＫＰＭＭ２細胞株）ｘｘｘｉｉ、急性前骨髄球性白血病細胞（ＮＢ４及びＡＴＲＡ－難治性ＮＢ４－ＬＲ１細胞株）ｘｘｘｉｉｉ、及び組織球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７細胞株）ｘｘｘｉｖといった多数の腫瘍細胞において観察された。さらに、急性Ｔ細胞白血病細胞（ｊｕｒｋａｔ）ｘｘｘｖ、ｘｘｘｖｉ、ｘｘｘｖｉｉ、及び初代ＣＬＬ細胞において行われた研究が強化されたｘｘｘｖｉｉｉ、ｘｘｘｉｘ、ｘｌ、ｘｌｉ。
【0025】
ＣＤ４７媒介ＰＣＤに関する殆どの情報は癌細胞、主としてＪｕｒｋａｔ及びＣＬＬ細胞によるものである。癌細胞におけるＣＤ４７媒介ＰＣＤの主な特徴は、１）迅速なプロセス；２）カスパーゼ非依存性；３）アポトーシス促進性タンパク質（シトクロムＣ、ＡＩＦ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ／Ｈｔｒａ２、エンドヌクレアーゼＧ（ＥｎｄｏＧ））の放出を伴わないミトコンドリア膜脱分極；４）活性酸素種（ＲＯＳ）産生；５）ホスファチジルセリン曝露；６）原形質膜透過化；７）ＤＮＡ断片化及びクロマチン凝縮の非存在である。
【0026】
腫瘍細胞を排除するための標的としてのＣＤ４７
ＣＤ４７は、多数のタイプの癌において過剰発現されることが示されている。さらに、ＣＤ４７は免疫系回避、移動、接着、増殖及び細胞死において多数の役割を有するため、ＣＤ４７を図４に示されるような多数の形態：食作用、抗腫瘍適応免疫応答の刺激、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ＣＤ４７依存性細胞機能の阻害及びＣＤ４７媒介ＰＣＤ誘導における、癌療法の主要標的として利用することができる。
ＣＤ４７は、多数のタイプの癌において過剰発現されることが示されている。さらに、ＣＤ４７は免疫系回避、移動、接着、増殖及び細胞死において多数の役割を有するため、ＣＤ４７を図４に示されるような多数の形態：食作用、抗腫瘍適応免疫応答の刺激、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ＣＤ４７依存性細胞機能の阻害及びＣＤ４７媒介ＰＣＤ誘導における、癌療法の主要標的として利用することができる。
【0027】
７ － ＴＳＰ－１ ＣＢＤ模倣体、及びＰＣＤを誘導し、ＰＣＤの欠陥と関連する疾患を治療するためのそれらの使用
特許文献１では、ＴＳＰ－１のＣ末端ドメインを模倣する可溶性デカペプチドである４Ｎ１Ｋが、ＣＤ４７とのライゲーションによりＢ慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）初代細胞においてカスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導することが実証されている。ＰＣＤを誘導するために固定化する必要がある抗ＣＤ４７ ｍＡｂとは対照的に、カスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導するために可溶性４Ｎ１Ｋペプチドをプラスチック上にコーティングする必要がないことが更に実証された。陰性対照ペプチド４ＮＧＧ（２個のアミノ酸で突然変異した４Ｎ１Ｋ）がＰＣＤを誘導することができないことが見出され、４Ｎ１Ｋ ＰＣＤ誘導の特異性が示された。さらに、４Ｎ１Ｋ及びその誘導体ＰＫＨＢ１によるＣＤ４７ライゲーションにより、健常Ｂリンパ球又は静止正常Ｂ細胞ではなく白血病Ｂ細胞がＣＬＬ患者から特異的に排除され、これがカスパーゼ依存性ＰＣＤよりも良好な死を誘導する手段であることが発見された（この形態の死は、１７ｐ１３又はＩ １ｑ２２－ｑ２３上の欠失：ＡＴＭ／ＴＰ５３不活性化を有する薬物不応性の個体に由来するＣＬＬ細胞であっても効果的である）。ｉｎ ｖｉｖｏマウス研究から、白血病細胞でのＰＣＤの誘導におけるこのペプチド戦略の特異性が完全に確認された。したがって、本発明は、癌の治療に使用されるアミノ酸配列：ＫＲＦＹＶＶＭＷＫを含む可溶性ペプチド又はその機能保存的変異体に関する。
特許文献１では、ＴＳＰ－１のＣ末端ドメインを模倣する可溶性デカペプチドである４Ｎ１Ｋが、ＣＤ４７とのライゲーションによりＢ慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）初代細胞においてカスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導することが実証されている。ＰＣＤを誘導するために固定化する必要がある抗ＣＤ４７ ｍＡｂとは対照的に、カスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導するために可溶性４Ｎ１Ｋペプチドをプラスチック上にコーティングする必要がないことが更に実証された。陰性対照ペプチド４ＮＧＧ（２個のアミノ酸で突然変異した４Ｎ１Ｋ）がＰＣＤを誘導することができないことが見出され、４Ｎ１Ｋ ＰＣＤ誘導の特異性が示された。さらに、４Ｎ１Ｋ及びその誘導体ＰＫＨＢ１によるＣＤ４７ライゲーションにより、健常Ｂリンパ球又は静止正常Ｂ細胞ではなく白血病Ｂ細胞がＣＬＬ患者から特異的に排除され、これがカスパーゼ依存性ＰＣＤよりも良好な死を誘導する手段であることが発見された（この形態の死は、１７ｐ１３又はＩ １ｑ２２－ｑ２３上の欠失：ＡＴＭ／ＴＰ５３不活性化を有する薬物不応性の個体に由来するＣＬＬ細胞であっても効果的である）。ｉｎ ｖｉｖｏマウス研究から、白血病細胞でのＰＣＤの誘導におけるこのペプチド戦略の特異性が完全に確認された。したがって、本発明は、癌の治療に使用されるアミノ酸配列：ＫＲＦＹＶＶＭＷＫを含む可溶性ペプチド又はその機能保存的変異体に関する。
【0028】
しかしながら、特許文献１により癌の治療に使用されるペプチド配列を特異的に同定することが可能となったにも関わらず、特許文献１に記載されるペプチドは、それらの効力が非常に遅く、ＰＣＤを誘発するために高いペプチド濃度（特許文献１に記載の最も強力なペプチドについて２００μＭ前後）を必要とすることから、治療目的で使用することはできない。そのため、癌及び慢性炎症を含む免疫障害といったＰＣＤの欠陥と関連する疾患に特異的に、ＣＤ４７ライゲーション特性を高い親和性及び高いＰＣＤ誘発の効力で示す、より強力な化合物を同定することが依然として必要である。
【0029】
本発明は、高い親和性（ナノモーラー範囲内）及びＰＣＤ誘発の効力（マイクロＭ範囲内）を有するＴＳＰ－１ Ｃ末端結合ドメインの環状模倣体の設計によりこの最初の要求に応えるものである。驚くべきことに、本発明者らにより、これらの環状ペプチドが特許文献１に記載のペプチドよりも１００倍～１０００倍強力であることが観察された（図６及び図７を参照されたい）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0030】
【文献】国際公開第２０１３／１８２６５０号
【非特許文献】
【0031】
【文献】Zenaida Lopez-Dee, Kenneth Pidcock, and Linda S. Gutierrez in "Thrombospondin-1: Multiple Path to inflammation, Mediators of Inflammation, Volume 2011, Article ID 296069, 10 pages doi:l0.1155/2011/296069
【発明の概要】
【0032】
本発明者らは今回、β－シート番号７又はβ－シート番号７及び８又はβ－シート番号６及び７（β－シートのナンバリングはEMBO Journal (2004) 23, 1223-1233に従う）に関与する配列を含むＴＳＰ－１のＣ末端ドメインに由来する新たな環状ペプチドを調製した。
【0033】
驚くべきことに、これらの環状ペプチドは癌細胞株のアポトーシスを高効率で誘導することが可能である。
【0034】
ＣＤ４７を標的とする既知の直鎖ペプチドとは対照的に、これらの環状ペプチドは高い結合親和性を有し（これまでに記載されている最良の直鎖ペプチドであるＰＫＴ１６のマイクロモーラー範囲の親和性と比較してナノモーラー範囲のＫｄを有する；実施例の第３部を参照されたい）、より低濃度でアポトーシスの誘導に効率的である（最良の直鎖誘導体ＰＫＴ１６の１００マイクロＭと比較して１マイクロＭ；実施例の第２部を参照されたい）。
【0035】
このため、本発明は、ＴＳＰ－１のＣ末端ドメインに由来する単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体を提供する。本発明は、癌及び免疫障害といったＰＣＤの欠陥と関連する疾患を治療するＣＤ４７のアゴニストとしての該環状ペプチドの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1-2】ＰＣＤが複合ネットワークであり、高度に調節されたプロセスであることを示す、異なるタイプのＰＣＤをもたらす密接に関連する２つの経路を示す図である。
【図3A】ＴＳＰ－１が、生物学的機能に関与する各ドメイン：ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）、ヴォンヴィレブランドＣドメイン（ｖＷＣＤ）、３つのタイプ１プロパージンリピート、３つのタイプ２ＥＧＦ様リピート、７つのタイプ３カルシウム結合リピート及びＣ末端ＣＢＤを含む多ドメインタンパク質であることを示す図である。ドメインの一部は、細胞外マトリックスの構成要素又は膜受容体と相互作用する（矢印）。インテグリン（ＲＧＤ）及びＣＤ４７（ＲＦＹＶＶＭＷＫ）へのＴＳＰ－１ライゲーションに関与する重要なアミノ酸配列を示す。
【図3B】ＣＤ４７及び４Ｎ１の相互作用を示す図である。ＴＳＰ－１ Ｃ末端ドメインのオープン構造（ＭＲＭＳ＝２Å）を、ＣＤ４７受容体の細胞外部分の相同性モデルに対するタンパク質間ドッキング実験に用いた。２つの推定ＴＳＰ－１：ＣＤ４７相互作用領域（それぞれ（１）及び（２））が分子モデリングによって提案された（Floquet et al, 2008を参照されたい）ｘｌｉｉ。
【図4】ＣＤ４７が癌細胞を排除するために標的として使用されることを示す図である。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いたＣＤ４７の治療標的化は、複数の機構を介して癌細胞の排除を誘導することができる。１）マクロファージによる腫瘍細胞の食作用取込み：遮断抗ＣＤ４７ ｍＡｂ、遮断抗ＳＩＲＰα ｍＡｂ又は組み換えＳＩＲＰαタンパク質（二価Ｆｃ融合タンパク質として示す）を用いてＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用を阻害することによる。２）抗ＣＤ４７抗体は抗腫瘍適応免疫応答を刺激し、ＤＣによる腫瘍細胞の食作用取込み，並びにＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞へのその後の抗原提示をもたらすことができる。３）ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣ及びＣＤＣ誘導並びに腫瘍細胞排除：抗ＣＤ４７抗体は、抗体Ｆｃ依存性機構を介して腫瘍細胞を排除することができる。４）ＣＤ４７の機能遮断は、腫瘍細胞におけるその作用の幾つかを遮断することによって腫瘍減少を促進することもできる。５）最後に、ＣＤ４７刺激は、直接細胞死誘導を誘導することができる。ｘｌｉｉｉの修正。
【図5-6】ＭＳＴによって測定された結合曲線を示す図である。測定方法は、「熱拡散（thermophoresis）」と称される効果である温度勾配に沿った分子の有向運動に基づく。局所温度差ΔＴは、ソレー係数ＳＴ：ｃｈｏｔ／ｃｃｏｌｄ＝ｅｘｐ（－ＳＴΔＴ）によって定量化される分子濃度の局所変化（枯渇又は濃縮）をもたらす。Ｊｕｒｋａｔ又はＭｅｃ－１細胞膜調製物を、他の部分に記載されるＮａｎｏｔｅｍｐｅｒ ＮＴ－６４７標識化キットを用いて標識するｘｌｉｖ。標識した調製物をＰＢＳで溶出し、４℃で保管する。各ペプチドのストック溶液をＤＭＳＯ（５ｍＭ）中で調製した後、ＰＢＳで希釈する。ＭＳＴによって評価したペプチドについては、ＮＴ．１１５標識膜の濃度を一定に維持し、リガンド（ペプチド）の濃度を変化させた。短時間のインキュベーション後にサンプルをＭＳＴ ｐｒｅｍｉｕｍガラス毛細管に充填し、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５－ｐｉｃｏを用いてＭＳＴ分析を行った。図５：ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインに由来する直鎖ペプチドであるＰＫＴ１６（（Ｄ）Ｌｙｓ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｎｌｅ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ－（Ｄ）Ｌｙｓ）について観察されたＭＳＴ曲線。Ｋｄ＝１６００ｎＭ。図６Ａ～図６Ｈ：ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインのＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－１、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－４、ＰＫＴＤ１０－５、ＰＫＴＤ１０－８（表Ｉ中の構造及び配列を参照されたい）の環状ペプチド類似体について観察されたＭＳＴ曲線。Ｋｄ（それぞれ１．９ｎＭ及び４９ｎＭ）。例えば、ＰＫＴ１６とＰＫＴＤ１又はＰＫＴＤ１０とのＫｄ比は、これらの環状類似体（すなわち、ＰＫＴＤ１又はＰＫＴＤ１０）がＣＤ４７ライゲーションにおいてはるかに効率的であるという事実を強調する。これまでに開発された直鎖ペプチド類似体のかかる親和性は達成されたことがない。
【図7A-F】５つの細胞株（ＭＣＦ－７、ヒト乳癌細胞；ＨＣＴ－１１６、ヒト結腸癌細胞；ＢｘＰＣ３、ヒト膵癌細胞；Ａ５４９、ヒト肺癌細胞）について細胞毒性アッセイ及び細胞数の直接計数により評価した、幾つかの本発明の環状ペプチド（ＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ７、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１１、ＰＫＴＤ１６、ＰＫＤ１０及びＰＫＤ１０－ＦＦ）の直鎖類似体（ＰＫＴ１６）と比較した腫瘍細胞の生存能力に対する効果の結果を示す図である。注目すべきは、直鎖類似体ＰＫＴ１６がこれらの癌細胞株に対して１００マイクロＭで有効ではなく、ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインのβストランド６及び７、又は７及び８を伴うヘアピンを模倣するように設計された環状類似体（例えば、特にＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ７、ＰＫＴＤ９、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＮＭｅ、ＰＫＴＤ１１、ＰＫＴＤ１１－ＮＭｅ、ＰＫＴＤ１８、ＰＫＤ８及びＰＫＤ１０等）がこれらの癌細胞株に対する細胞死の誘導において効率的であることである。重要なことには、４Ｎ１配列（ペプチドＰＫＣ１）の環化が細胞死の誘導において効力を有しない環状類似体をもたらすため、βストランド番号７（ＴＳＰ－１の４Ｎ１結合エピトープ）の単純環化はペプチド有効性の改善に十分でない。
【発明を実施するための形態】
【0037】
単離環状ペプチド
本発明は、一般式（Ｉ）：
（式中、
Ｂ１は存在しない（nothing）か、又は配列ＹＡＧＦＶＦ（配列番号１）のＴＳＰ－１のβ－ストランド番号６に由来する６個～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であり、
Ｚ１は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される；ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan et al. ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643を参照されたい）、又はビアリールアミノ酸鋳型であるが、但し、Ｂ１が存在しない場合にＺ１は存在せず、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
Ｂ２はペプチド配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（配列番号２）を表し、（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号３）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号７に由来し、ここで、
Ｘ１は存在しないか、又はセリン、若しくはグリシン若しくはアラニン若しくはトレオニンといったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ２は存在しないか、又はアルギニン、若しくはホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体といったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、例えばアルギニンについては、誘導体はグアニド官能基及び／又は１つ若しくは２つ以上のアミン官能基を伴う任意の他の側鎖を含み、
Ｘ３はフェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸；チロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ４はチロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸、フェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ５はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ６はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ７はメチオニン若しくはリシン、又はバリン、メチオニン、ノルロイシン、ロイシン若しくはイソロイシン若しくはテルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ８はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、パラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン、パラ－ニトロ－フェニルアラニン、Ｄ－プロリノ－トリプトファン又はＤ－プロリノ－ホモトリプトファンを指し、
Ｘ９は存在しないか、又はリシン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体、若しくはヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１０は存在しないか、又はグルタミン若しくはアラニン、若しくはアスパラギンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｚ２は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan. et al ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643）、又はビアリールアミノ酸鋳型であるが、但し、Ｂ３が存在しない場合にＺ２は存在せず、好ましい実施形態では、Ｚ２はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
ＢｎはＢ２又はＢ３を表し、
Ｂ３は存在しないか、又は（配列ＧＬＳＶＫＶＶＮＳ（配列番号４）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号８に由来する６個～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であるが、
但し、Ｂ１がＴＳＰ－１のβ－ストランド番号６に由来する６個～１０個のアミノ酸残基を含むペプチド配列である場合にＢｎは存在せず、ＢｎがＢ２又はＢ３（すなわち、ペプチド配列）である場合にＢ１は存在しない）の単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体であって、該単離環状ペプチドが８個～２６個のアミノ酸、好ましくは１４個～２２個のアミノ酸を含み、他の実施形態によると、単離環状ペプチドが１８個～２２個のアミノ酸を含む、単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体に関する。
本発明は、一般式（Ｉ）：
【化1】
Ｂ１は存在しない（nothing）か、又は配列ＹＡＧＦＶＦ（配列番号１）のＴＳＰ－１のβ－ストランド番号６に由来する６個～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であり、
Ｚ１は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される；ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan et al. ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643を参照されたい）、又はビアリールアミノ酸鋳型であるが、但し、Ｂ１が存在しない場合にＺ１は存在せず、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
Ｂ２はペプチド配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（配列番号２）を表し、（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号３）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号７に由来し、ここで、
Ｘ１は存在しないか、又はセリン、若しくはグリシン若しくはアラニン若しくはトレオニンといったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ２は存在しないか、又はアルギニン、若しくはホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体といったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、例えばアルギニンについては、誘導体はグアニド官能基及び／又は１つ若しくは２つ以上のアミン官能基を伴う任意の他の側鎖を含み、
Ｘ３はフェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸；チロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ４はチロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸、フェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ５はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ６はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ７はメチオニン若しくはリシン、又はバリン、メチオニン、ノルロイシン、ロイシン若しくはイソロイシン若しくはテルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ８はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、パラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン、パラ－ニトロ－フェニルアラニン、Ｄ－プロリノ－トリプトファン又はＤ－プロリノ－ホモトリプトファンを指し、
Ｘ９は存在しないか、又はリシン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体、若しくはヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１０は存在しないか、又はグルタミン若しくはアラニン、若しくはアスパラギンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｚ２は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan. et al ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643）、又はビアリールアミノ酸鋳型であるが、但し、Ｂ３が存在しない場合にＺ２は存在せず、好ましい実施形態では、Ｚ２はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
ＢｎはＢ２又はＢ３を表し、
Ｂ３は存在しないか、又は（配列ＧＬＳＶＫＶＶＮＳ（配列番号４）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号８に由来する６個～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であるが、
但し、Ｂ１がＴＳＰ－１のβ－ストランド番号６に由来する６個～１０個のアミノ酸残基を含むペプチド配列である場合にＢｎは存在せず、ＢｎがＢ２又はＢ３（すなわち、ペプチド配列）である場合にＢ１は存在しない）の単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体であって、該単離環状ペプチドが８個～２６個のアミノ酸、好ましくは１４個～２２個のアミノ酸を含み、他の実施形態によると、単離環状ペプチドが１８個～２２個のアミノ酸を含む、単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体に関する。
【0038】
明示的に言及される場合を除き、全てのアミノ酸は、区別なく（indifferently）（Ｄ）配置又は（Ｌ）配置である。
【0039】
このため、本発明は式Ｂ１－Ｚ１－Ｂ２、Ｂ１－Ｂ２、Ｂ２－Ｚ２－Ｂ３、Ｂ２－Ｂ３、Ｂ２－Ｂ２（各々のＢ２は同一又は異なる）、Ｂ２－Ｚ２－Ｂ２（各々のＢ２は同一又は異なる）及びＢ２の環状ペプチドを包含する。
【0040】
一実施形態では、Ｂ１は以下の配列：ＹＡＧＦＶＦＧ（配列番号５）を含む。
【0041】
別の実施形態では、Ｂ１は以下の配列：－Ｘ１１－Ｙ－Ａ－Ｇ－Ｆ－Ｖ－Ｆ－Ｇ－Ｘ１２－Ｘ１３－（配列番号６）を含み、ここで、
Ｘ１１は存在しないか、又はアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１２は存在しないか、又はチロシン、若しくは芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１３は存在しないか、又はセリン、若しくはグリシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸である。
Ｘ１１は存在しないか、又はアスパラギン酸、若しくはグルタミン酸を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１２は存在しないか、又はチロシン、若しくは芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１３は存在しないか、又はセリン、若しくはグリシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸である。
【0042】
一実施形態では、Ｂ３は以下の配列：－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｘ１６－Ｘ２２－Ｘ２３－Ｘ１７－Ｘ１８－（配列番号３６）を含み、好ましくは、Ｂ３は以下の配列－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｓ－Ｖ－Ｘ１６－Ｖ－Ｖ－Ｘ１７－Ｘ１８－を含み、ここで、
Ｘ１４は存在しないか、又はグリシン若しくはアラニン、若しくはセリンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はイソロイシン若しくはロイシン若しくはアラニン、又はテルロイシン、バリン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１６はリシン若しくはアラニン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はメチオニン、若しくはリン、ロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１７は存在しないか、又はアスパラギン若しくはアラニン、若しくはグルタミン若しくはリシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はアルギニン、ホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は存在しないか、セリン若しくはグリシン、又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１９は存在しないか、又はセリン又はアラニン又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２０はセリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２１はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２２はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２３はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸である。
Ｘ１４は存在しないか、又はグリシン若しくはアラニン、若しくはセリンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はイソロイシン若しくはロイシン若しくはアラニン、又はテルロイシン、バリン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１６はリシン若しくはアラニン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はメチオニン、若しくはリン、ロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１７は存在しないか、又はアスパラギン若しくはアラニン、若しくはグルタミン若しくはリシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はアルギニン、ホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は存在しないか、セリン若しくはグリシン、又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１９は存在しないか、又はセリン又はアラニン又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２０はセリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２１はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２２はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２３はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸である。
【0043】
本発明の一般式（Ｉ）の単離環状ペプチドは、ＴＳＰ－１のＣ末端ドメインのβ－シート番号７の少なくとも一部、β－シート番号７及び８の少なくとも一部、又はβ－シート番号６及び７の少なくとも一部を更に含むが、このドメインが本発明の環状ペプチドと同じ生物活性を有しないことから、ＴＳＰ－１のＣ末端ドメインの完全配列とすることはできない（Kosfeld MD, Frazier WA (1993) Identification of a new cell adhesion motif in two homologous peptides from the COOH-terminal cell binding domain of human thrombospondin. J Biol Chem 268: 8806-8814に記載される）。
【0044】
具体的な実施形態によると、本発明は、一般式（Ｉａ）：
（式中、
Ｚ１は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される；ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan et al. ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643を参照されたい）、又はビアリールアミノ酸鋳型であり、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
Ｂ２はペプチド配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（配列番号２）を表し、（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号３）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号７に由来し、６個～１０個のアミノ酸を含み、ここで、
Ｘ１は存在しないか、又はセリン、若しくはグリシン若しくはアラニン若しくはトレオニンといったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ２は存在しないか、又はアルギニン、若しくはホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＲＮＭｅ）若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体といったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、例えばアルギニンについては、誘導体はグアニド官能基及び／又は１つ若しくは２つ以上のアミン官能基を伴う任意の他の側鎖を含み、
Ｘ３はフェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸；チロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ４はチロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸、フェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ５はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ６はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ７はメチオニン若しくはリシン、又はバリン、メチオニン、ノルロイシン、ロイシン若しくはイソロイシン若しくはテルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ８はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、パラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン、パラ－ニトロ－フェニルアラニン、Ｄ－プロリノ－トリプトファン又はＤ－プロリノ－ホモトリプトファンを指し、
Ｘ９は存在しないか、又はリシン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体、若しくはヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１０は存在しないか、又はグルタミン、若しくはアスパラギンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、Ｘ１０はアラニンを指していてもよく、
好ましくは、Ｘ２が存在しない場合にＸ１は存在せず、及び／又はＸ９が存在しない場合にＸ１０は存在せず、
好ましくは、Ｂ２は少なくとも６アミノ酸－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－を含み、より好ましくは、Ｂ２は少なくともペプチドフラグメント－Ｆ－Ｙ－Ｖ－Ｖ－Ｍ－Ｗ－（配列番号３７）を含み、
Ｚ２は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される；ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan et al. ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643を参照されたい）、又はビアリールアミノ酸鋳型であり、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
ＢｎはＢ２又はＢ３を表し、
Ｂ３は（配列ＧＬＳＶＫＶＶＮＳ（配列番号４）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号８に由来する６個～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であり、Ｂ３は以下の配列：－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｘ１６－Ｘ２２－Ｘ２３－Ｘ１７－Ｘ１８－（配列番号３６）を含み、好ましくは、Ｂ３は以下の配列：－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｓ－Ｖ－Ｘ１６－Ｖ－Ｖ－Ｘ１７－Ｘ１８－を含み、ここで、
Ｘ１４は存在しないか、又はグリシン若しくはアラニン、若しくはセリンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はイソロイシン若しくはロイシン若しくはアラニン、又はテルロイシン、バリン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１６はリシン若しくはアラニン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、ホモリシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＲＮＭｅ）若しくはホモフェニルアラニン、又は任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はメチオニン、若しくはバリン、ロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１７は存在しないか、アスパラギン若しくはアラニン、若しくはグルタミン若しくはリシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はアルギニン、ホモアルギニン、ホモリシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＲＮＭｅ）若しくはホモフェニルアラニン、若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は存在しないか、セリン若しくはグリシン、又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１９は存在しないか、セリン若しくはアラニン、又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２０はセリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２１はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２２はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２３はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
好ましくは、Ｘ１４が存在しない場合にＸ１９は存在せず、及び／又はＸ１７が存在しない場合にＸ１８は存在せず、
好ましくは、Ｂ３は少なくとも６アミノ酸－Ｘ１５－Ｓ－Ｖ－Ｘ１６－Ｖ－Ｖ－を含み、より好ましくは、Ｂ３は少なくともペプチドフラグメント－Ｌ－Ｓ－Ｖ－Ｋ－Ｖ－Ｖ（配列番号３８）を含む）の単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体であって、該単離環状ペプチドが偶数のアミノ酸を含み（すなわち、Ｂ２及びＢｎが同数のアミノ酸を有し、どちらも６、７、８、９又は１０アミノ酸のフラグメントからなる）、該単離環状ペプチドが８個～２６個のアミノ酸、好ましくは１２個～２２個のアミノ酸を含み、より好ましくは、本発明の単離環状ペプチドが１２、１４、１６、１８、２０又は２２アミノ酸からなる、単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体に関する。
【化2】
Ｚ１は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される；ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan et al. ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643を参照されたい）、又はビアリールアミノ酸鋳型であり、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
Ｂ２はペプチド配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０（配列番号２）を表し、（配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（配列番号３）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号７に由来し、６個～１０個のアミノ酸を含み、ここで、
Ｘ１は存在しないか、又はセリン、若しくはグリシン若しくはアラニン若しくはトレオニンといったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ２は存在しないか、又はアルギニン、若しくはホモアルギニン、リシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＲＮＭｅ）若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体といったアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、例えばアルギニンについては、誘導体はグアニド官能基及び／又は１つ若しくは２つ以上のアミン官能基を伴う任意の他の側鎖を含み、
Ｘ３はフェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸；チロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ４はチロシン、又は芳香族側鎖を有する任意のアミノ酸、フェニルアラニン、又はナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、若しくはパラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン若しくはパラ－ニトロ－フェニルアラニンといったオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体を含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ５はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ６はバリン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ７はメチオニン若しくはリシン、又はバリン、メチオニン、ノルロイシン、ロイシン若しくはイソロイシン若しくはテルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ８はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、パラ－フルオロ－フェニルアラニン、パラ－アミノ－フェニルアラニン、パラ－ニトロ－フェニルアラニン、Ｄ－プロリノ－トリプトファン又はＤ－プロリノ－ホモトリプトファンを指し、
Ｘ９は存在しないか、又はリシン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン若しくはホモフェニルアラニン、若しくはオルト位、メタ位若しくはパラ位の任意の他の環置換類似体、若しくはヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、
Ｘ１０は存在しないか、又はグルタミン、若しくはアスパラギンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸を指し、Ｘ１０はアラニンを指していてもよく、
好ましくは、Ｘ２が存在しない場合にＸ１は存在せず、及び／又はＸ９が存在しない場合にＸ１０は存在せず、
好ましくは、Ｂ２は少なくとも６アミノ酸－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－を含み、より好ましくは、Ｂ２は少なくともペプチドフラグメント－Ｆ－Ｙ－Ｖ－Ｖ－Ｍ－Ｗ－（配列番号３７）を含み、
Ｚ２は存在しないか、又はヘテロキラル配列Ｄ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏ（ｐ－Ｐとも表記される；ｐはＤ－プロリンであり、ＰはＬ－プロリンである）、若しくは該ヘテロキラル配列を模倣するか若しくはβターンを模倣することが可能な２個のアミノ酸若しくはアミノ酸の類似体の任意の配列であり、該配列のアミノ酸又はアミノ酸の類似体の例はニペコチン酸、イソニペコチン酸、ピペリジンカルボン酸、シラプロリン、チオプロリン及びその任意の他の置換誘導体（フルオロ、メチル、ブロモ等）、シュードプロリン、置換プロリン、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸（Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004、及びKaroyan et al. ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042、及びLarregola et al. Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643を参照されたい）、又はビアリールアミノ酸鋳型であり、好ましい実施形態では、Ｚ１はＤ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｒｏであり、
ＢｎはＢ２又はＢ３を表し、
Ｂ３は（配列ＧＬＳＶＫＶＶＮＳ（配列番号４）の）ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号８に由来する６個～１０個のアミノ酸を含むペプチド配列であり、Ｂ３は以下の配列：－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｘ１６－Ｘ２２－Ｘ２３－Ｘ１７－Ｘ１８－（配列番号３６）を含み、好ましくは、Ｂ３は以下の配列：－Ｘ１９－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｓ－Ｖ－Ｘ１６－Ｖ－Ｖ－Ｘ１７－Ｘ１８－を含み、ここで、
Ｘ１４は存在しないか、又はグリシン若しくはアラニン、若しくはセリンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はイソロイシン若しくはロイシン若しくはアラニン、又はテルロイシン、バリン、メチオニンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１６はリシン若しくはアラニン、若しくはアルギニン、ホモアルギニン、ホモリシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＲＮＭｅ）若しくはホモフェニルアラニン、又は任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はメチオニン、若しくはバリン、ロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１７は存在しないか、アスパラギン若しくはアラニン、若しくはグルタミン若しくはリシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸、又はアルギニン、ホモアルギニン、ホモリシン、オルニチン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＲＮＭｅ）若しくはホモフェニルアラニン、若しくは任意の他の環置換類似体（オルト、メタ、パラ）、ヒスチジンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は存在しないか、セリン若しくはグリシン、又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ１９は存在しないか、セリン若しくはアラニン、又は同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２０はセリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２１はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２２はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
Ｘ２３はバリン若しくはアラニン、又はロイシン、イソロイシン、テルロイシンを含むアミノ酸と同様の特性を有する任意のアミノ酸であり、
好ましくは、Ｘ１４が存在しない場合にＸ１９は存在せず、及び／又はＸ１７が存在しない場合にＸ１８は存在せず、
好ましくは、Ｂ３は少なくとも６アミノ酸－Ｘ１５－Ｓ－Ｖ－Ｘ１６－Ｖ－Ｖ－を含み、より好ましくは、Ｂ３は少なくともペプチドフラグメント－Ｌ－Ｓ－Ｖ－Ｋ－Ｖ－Ｖ（配列番号３８）を含む）の単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体であって、該単離環状ペプチドが偶数のアミノ酸を含み（すなわち、Ｂ２及びＢｎが同数のアミノ酸を有し、どちらも６、７、８、９又は１０アミノ酸のフラグメントからなる）、該単離環状ペプチドが８個～２６個のアミノ酸、好ましくは１２個～２２個のアミノ酸を含み、より好ましくは、本発明の単離環状ペプチドが１２、１４、１６、１８、２０又は２２アミノ酸からなる、単離環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくは生物学的に活性な誘導体に関する。
【0045】
このため、本発明は式Ｂ２－Ｂ３、Ｚ１－Ｂ２－Ｂ３、Ｂ２－Ｚ２－Ｂ３、Ｂ２－Ｂ２（各々のＢ２は同一又は異なる）及びＢ２－Ｚ２－Ｂ２（各々のＢ２は同一又は異なる）の環状ペプチドを包含する。
【0046】
好ましい実施形態では、Ｂ２及びＢ３は、下記に示すようにＢ２のＸ５がＢ３のＸ１６に面し、Ｂ２のＸ８がＢ３のＸ１５に面するように配置される：
【化3】
【0047】
特定の実施形態によると、Ｚ１及びＺ２はどちらも存在しなくてもよく、Ｚ１が２アミノ酸からなる場合にＺ２は存在せず、Ｚ２が２アミノ酸からなる場合にＺ１は存在しない。
【0048】
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての本発明の環状ペプチドの溶液を調製することができる。
【0049】
本発明によるそのペプチドは、中性形態又は塩形態の組成物に配合することができる。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）、及び例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸といた有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄といった無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来していてもよい。
【0050】
本発明による単離環状ペプチドの例は、表Ｉに記載される通りである。
【0051】
【表1】
【0052】
本発明の環状ペプチドの合成
本発明の環状ペプチドは、実験の部に記載のように調製される。
本発明の環状ペプチドは、実験の部に記載のように調製される。
【0053】
簡潔に述べると、本発明の環状ペプチドは、直鎖ペプチドをもたらし、これを次いで環化する混合固相／溶液相手順を用いて合成される。環化としては、Ｓ－Ｓ架橋、チオエーテル架橋、Ｃ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ、エステル結合、炭素－ヘテロ原子結合、Ｏ－Ｏ、Ｎ－Ｎ、スキャフォールドを用いた環化等が挙げられる。
【0054】
本発明の環状ペプチドの生物学的に活性な誘導体
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な誘導体」という用語は、それが指すペプチドの機能変異体を含む。より具体的には、本発明において、誘導体は「一般式（Ｉ）の環状ペプチドの生物学的に活性な誘導体」を指し、親ペプチドの生物活性及び特異性を保持する変異体である。このため、本発明においては、上記「生物学的に活性な誘導体」はＣＤ４７のアゴニストであり、ＰＣＤを誘発し、癌及び免疫障害といったＰＣＤの欠陥と関連する疾患を治療することが可能である。
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な誘導体」という用語は、それが指すペプチドの機能変異体を含む。より具体的には、本発明において、誘導体は「一般式（Ｉ）の環状ペプチドの生物学的に活性な誘導体」を指し、親ペプチドの生物活性及び特異性を保持する変異体である。このため、本発明においては、上記「生物学的に活性な誘導体」はＣＤ４７のアゴニストであり、ＰＣＤを誘発し、癌及び免疫障害といったＰＣＤの欠陥と関連する疾患を治療することが可能である。
【0055】
好ましくは、所与の一般式（Ｉ）の環状ペプチドの或る生物学的に活性な誘導体のＰＣＤを誘発する能力及び抗増殖効果は、従来の増殖法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで評定される該所与の一般式（Ｉ）の環状ペプチドの、特に細胞増殖を阻害する抗増殖効果の少なくとも約７０％、好ましくは８０％～９０％、より好ましくは９０％～９９％、更により好ましくは１００％である必要がある。
【0056】
また、生物学的に活性な誘導体は、従来の細胞実験によりｉｎ ｖｉｔｒｏで評定される、細胞増殖に対して一般式（Ｉ）の環状ペプチドと同じ特異性を有するのが好ましい。
【0057】
上記生物学的に活性な誘導体はペプチドの対立遺伝子変異体、又はペプチドのペプチド模倣変異体のいずれかであり得る。
【0058】
「ペプチドの対立遺伝子変異体」は、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられている又は抑制されていることを除いて、或る一般式（Ｉ）の環状ペプチドと同じアミノ酸配列を有し、最終ペプチドは一般式（Ｉ）の親環状ペプチドの生物活性及び特異性を保持する。好ましくは、かかる対立遺伝子変異体は、一般式（Ｉ）の親環状ペプチドと比較して少なくとも５０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％の同一性を有する。
【0059】
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間の「同一性のパーセンテージ」は、最良アラインメント（最適アラインメント）後に得られる比較対象の２つの配列間で同一のアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、２つの配列間の差はそれらの長さ全体にわたって無作為に分布している。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、例えばウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用可能なＢＬＡＳＴプログラムを用いて行うことができ、使用されるパラメーターはデフォルトで与えられるものである（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティ（open gap penalty）」：５及び「伸長ギャップペナルティ（extension gap penalty）」：２について、選択されるマトリックスは、例えばプログラムにより提案される「ＢＬＯＳＵＭ ６２」マトリックスであり、比較対象の２つの配列間のパーセンテージ同一性はプログラムにより直接算出される）。
【0060】
保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンといった或る非極性（疎水性）残基の別の非極性（疎水性）残基への置換、例えばアルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間の或る極性（親水性）残基の別の極性（親水性）残基への置換、リシン、アルギニン又はヒスチジンといった或る塩基性残基の別の塩基性残基への置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸といった或る酸性残基の別の酸性残基への置換が挙げられる。
【0061】
一般式（Ｉ）の環状ペプチドの生物学的に活性な誘導体は、好ましくはその生物活性である、少なくとも１つ以上の対象の特性を含む親ペプチドの幾つかの特性を模倣する有機分子であるペプチド模倣変異体であってもよい。
【0062】
好ましいペプチド模倣体は、好ましくは非天然アミノ酸、Ｌアミノ酸の代わりのＤアミノ酸、立体配座的拘束（conformational restraints）、等配電子置換（isosteric replacement）又は他の修飾を用いた本発明による環状ペプチドの構造修飾によって得られる。
【0063】
他の好ましい修飾としては、限定されるものではないが、１つ以上のアミド結合が非アミド結合に置き換えられるもの、及び／又は１つ以上のアミノ酸側鎖が異なる化学部分に置き換えられるもの、又は１つ以上の側鎖が保護基によって保護されるもの、及び／又は剛性及び／又は結合親和性を増大するために二重結合及び／又は環化及び／又は立体特異性をアミノ鎖に導入するものが挙げられる。
【0064】
更に他の好ましい修飾としては、一般式（Ｉ）の親環状ペプチドと比較した酵素分解に対する耐性の強化、バイオアベイラビリティ、より一般には薬物動態特性の改善を意図したものが挙げられる。
【0065】
かかるペプチド模倣体の例としては、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するように誘導体化された分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル若しくはヒドラジドを形成するように誘導体化することができる。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ－アシル又はＯ－アルキル誘導体を形成するように誘導体化することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ－ｉｍ－ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化することができる。化学誘導体には、２０個の標準アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、プロリンを４－ヒドロキシプロリンで置換することができ、リシンを５－ヒドロキシリシンで置換することができ、ヒスチジンを３－メチルヒスチジンで置換することができ、セリンをホモセリンで置換することができ、リシンをオルニチンで置換することができる。「保存的置換」という用語には、ペプチド又はタンパク質の二次構造を制御及び安定化することを目的とした非天然アミノ酸の使用も含まれる。これらの非天然アミノ酸は、本明細書で下記に説明するようなプロリノアミノ酸、β－アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、α，α－置換アミノ酸といった化学修飾アミノ酸である。これらの非天然アミノ酸はフッ素化、塩素化、臭素化又はヨウ素化された修飾アミノ酸も含み得る。
【0066】
修飾の他の例としては、例えば脂質又は炭水化物とのコンジュゲーションが挙げられる。
【0067】
これらの変更の全てが当該技術分野で既知である。このため、一般式（Ｉ）の環状ペプチドのペプチド配列を考慮して、当業者は、かかるペプチドと同様の又はそれより優れた生物学的特徴を有するペプチド模倣体を設計及び作製することが可能である。
【0068】
一般式（Ｉ）の環状ペプチドの好ましいペプチド模倣変異体は、少なくとも該一般式（Ｉ）の環状ペプチドの生物活性及び特異性を保持する。
【0069】
一般式（Ｉ）の環状ペプチドの生物学的に活性な誘導体は、当該技術分野で認識されている技法を用いて好都合に合成することができる。
【0070】
本発明の環状ペプチド及び／又はその生物学的に活性な誘導体の治療的使用
本発明は、薬剤としてのその使用のための一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体を提供する。
本発明は、薬剤としてのその使用のための一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体を提供する。
【0071】
本発明は、プログラム細胞死（ＰＣＤ）を誘発するアゴニスト剤、ＣＤ４７を活性化する作用物質及びＣＤ４７のアゴニスト剤として使用される一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体も提供する。より具体的には、一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体は、ＴＳＰ１とＣＤ４７との相互作用が関与する疾患の治療、特にＰＣＤの欠陥と関連する疾患の治療に有用である。アポトーシスが関与する疾患の例は、Favoloro et al (Role of apoptosis in disease, AGING, May 2012, vol.4, NO.5, pp.330-349)に記載されており、疾患における細胞死の重要性は、RA Knight and G Melino (Cell death in disease: from 2010 onwards, Cell Death and Disease (2011) 2, e202; doi:10.1038/cddis.2011.89)にも記載されている。発癌は組織傷害に対する防御プロセスである炎症とも関連し、炎症プロセスの変調におけるＴＳＰ－１の役割の例及びその収束は、非特許文献１に与えられる。この自己防御戦略が開始すると、プロセスの効果的な収束が大きく不必要な組織損傷を回避するために不可欠である。炎症を誘導する根本的事象が対処されず、恒常性が回復されない場合、炎症プロセスは慢性となり、血管新生、発癌及び例えば多発性硬化症、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、関節炎及び喘息といった慢性炎症（非特許文献１を参照されたい）を含む免疫障害と関連する疾患（Favoloro et al.を参照されたい）につながる。
【0072】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体は副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系の癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭及び下咽頭の癌、白血病、肝癌、肺癌、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭の癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、黒色腫、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、膣癌、外陰癌及び子宮癌からなる群から選択される癌の治療に有用であり得る。
【0073】
別の特定の実施形態では、一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体は多発性硬化症、クローン病、乾癬、潰瘍性大腸炎、関節炎及び喘息からなる群から選択される免疫疾患を含む慢性炎症と関連する疾患の治療に有用であり得る。
【0074】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に有効量投与することによって癌及び慢性炎症と関連する疾患を治療処置する方法に関する。
【0075】
本発明の環状ペプチド及び／又はその生物学的に活性な誘導体を含む医薬組成物
本発明は、一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物にも関する。
本発明は、一般式（Ｉ）の単離環状ペプチド又はその生物学的に活性な誘導体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物にも関する。
【0076】
本発明の特定の実施形態では、本発明の医薬組成物に組み込まれる一般式（Ｉ）の単離環状ペプチドは、ＰＫＴＤ１（配列番号９）、ＰＫＴＤ３（配列番号１０）、ＰＫＴＤ４（配列番号１１）、ＰＫＴＤ５（配列番号１２）、ＰＫＴＤ６（配列番号１３）、ＰＫＴＤ７（配列番号１４）、ＰＫＴＤ８（配列番号１５）、ＰＫＴＤ９（配列番号１６）、ＰＫＴＤ１０（配列番号１７）、ＰＫＴＤ１０－１（配列番号１８）、ＰＫＴＤ１０－２（配列番号１９）、ＰＫＴＤ１０－３（配列番号２０）、ＰＫＴＤ１０－４（配列番号２１）、ＰＫＴＤ１０－５（配列番号２２）、ＰＫＴＤ１０－６（配列番号２３）、ＰＫＴＤ１０－７（配列番号２４）、ＰＫＴＤ１０－８（配列番号２５）、ＰＫＴＤ１０－９（配列番号２６）、ＰＫＴＤ１１（配列番号２８）、ＰＫＴＤ１２（配列番号２９）、ＰＫＴＤ１４（配列番号３１）、ＰＫＴＤ１５（配列番号３２）、ＰＫＴＤ１６（配列番号３３）、ＰＫＴＤ１７（配列番号３４）及びＰＫＴＤ１８（配列番号３５）、ＰＫＰＨ１２（配列番号３９）、ＰＫＰＨ１２Ｐ（配列番号４０）、ＰＫＤ８（配列番号４１）、ＰＫＤ８ＦＦ（配列番号４２）、ＰＫＤ９（配列番号４３）、ＰＫＤ１０（配列番号４４）、ＰＫＤ１０ＦＦ（配列番号４５）、ＰＫＴＤｉ４（配列番号４６）、ＰＫＤ１１（配列番号４７）、ＰＫＤ１１ＲＮＭｅ（配列番号４８）、ＰＫＤ１２（配列番号４９）、ＰＫＤ１２ＲＮＭｅ（配列番号５０）、ＰＫＴＤｉ３（配列番号５１）、ＰＫＴＤｉ５（配列番号５２）、ＰＫＴＤｉ２（配列番号５３）、ＰＫＴＤ１０－ＲＮＭｅ（配列番号５４）、ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号５５）、ＰＫＴＤ１０－３－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号５６）、ＰＫＴＤｉ１（配列番号５７）、ＰＫＴＤ１１Ｑ（配列番号５８）、ＰＫＴＤ１１Ｓ（配列番号５９）、ＰＫＴＤ１１－ＲＮＭｅ（配列番号６０）、ＰＫＴＤ１１－Ｘ－ＲＮＭｅ（配列番号６１）、又はその薬理学的に許容可能な塩若しくはその生物学的に活性な誘導体からなる群において選択される。
【0077】
本発明の目的上、好適な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース又はデンプンといった炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドン、限定されるものではないが、リン脂質、スフィンゴ脂質、グリセロール－脂肪酸エステル等のような脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
本発明の医薬組成物は滅菌し、必要に応じて、活性化合物と有害に反応しない助剤、例えば潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色物質、香味物質及び／又は芳香物質等と混合することができる。本発明の医薬組成物は、必要に応じて少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有していてもよい。
【0079】
本発明の医薬組成物は溶液、懸濁液、エマルション、滅菌凍結乾燥配合物を含む錠剤、丸薬、カプセル、持続放出配合物又は粉末とすることができる。経口配合物は医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準担体を含み得る。幾つかの適切な精密配合物が、例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Mack Publishing Companyに記載されている。
【0080】
本発明の医薬組成物は、個体への静脈内投与に適した組成物として日常手順に従って配合することができる。通例、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液又は注射前に再構成される滅菌凍結乾燥配合物であり、かかる注射は静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内とすることができ、かかる医薬組成物は、鼻送達及び／又は肺送達により吸入してもよい。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は注射、例えば腫瘍内注射による投与に特化した液体組成物である。該腫瘍内注射は、例えば定位脳手術を用いることによって達成することができる。この投与は、腫瘍を除去することを意図した外科手術の前又は後に行うことができる。第１の場合では、組成物は腫瘍の成長を阻害し、腫瘍細胞の播種及び被験体に対する劇的な症状の発生を回避することを可能とし、第２の場合では、外科手術中に除去されなかった全ての腫瘍細胞を破壊するために組成物を使用することができる。
【0081】
一般式（Ｉ）の単離環状ペプチドの効果的な用量は、例えば選ばれる投与方法、治療対象の個体の体重、年齢、性別及び感受性といった多数のパラメーターに応じて（in function of）変化する。その結果として、最適な用量が専門医により適切なパラメーターに応じて個別に決定される必要がある。本明細書で以下に提示する初回動物研究からヒトにおける予想活性用量を予測するために、Rocchetti et al (2007)に記載されるｆｃ２及びＣＴ値を用いることもできる。
【0082】
以下の実施例では、一般式（Ｉ）の環状ペプチドの高い特異性及び治療効率を説明する。しかしながら、実施例は、特に本発明のアミノ酸配列の性質及びそれを使用する実験条件に関して限定的なものではない。
【実施例】
【0083】
１． 本発明の環状ペプチドの合成及び特性化
一般的方法：
全ての市販の化学物質及び溶媒は試薬グレードであり、他に規定のない限り更に精製することなく使用した。水性媒体中での反応を除く全ての反応を、防湿のための標準技法を用いて行った。全ての反応を、炉乾ガラス製品内においてアルゴン又は窒素下で無水溶媒及び標準シリンジ法を用いて行った。保護アミノ酸誘導体、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＦＩＰ、シュードプロリンジペプチド及び２－ＣＴＣ樹脂は、Iris Biotech（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）から購入した。ＤＩＰＥＡ、ＮＭＰ、ピペリジン溶液、ＤＭＦ、ＩＰＡ、ＴＦＡ、ＰｙＢＯＰはSigma-Aldrichから入手した。プレロード２－ＣＴＣ樹脂、Ｄｍｂ－アミノ酸、ＰｙＯｘｉｍ及びＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅは、Merck Novabiochemからのものとした。
一般的方法：
全ての市販の化学物質及び溶媒は試薬グレードであり、他に規定のない限り更に精製することなく使用した。水性媒体中での反応を除く全ての反応を、防湿のための標準技法を用いて行った。全ての反応を、炉乾ガラス製品内においてアルゴン又は窒素下で無水溶媒及び標準シリンジ法を用いて行った。保護アミノ酸誘導体、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＦＩＰ、シュードプロリンジペプチド及び２－ＣＴＣ樹脂は、Iris Biotech（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）から購入した。ＤＩＰＥＡ、ＮＭＰ、ピペリジン溶液、ＤＭＦ、ＩＰＡ、ＴＦＡ、ＰｙＢＯＰはSigma-Aldrichから入手した。プレロード２－ＣＴＣ樹脂、Ｄｍｂ－アミノ酸、ＰｙＯｘｉｍ及びＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅは、Merck Novabiochemからのものとした。
【0084】
固相ペプチド合成を、ポリエチレン多孔性ディスクを底部に装着し、適切なピストンで閉じたポリプロピレンＴｏｒｖｉｑシリンジ内で行った。溶媒及び可溶性試薬を往復運動により除去した。Ｆｍｏｃ基の除去を、ピペリジン／ＤＭＦ（２０％、ｖ／ｖ）（１×１分、１×１０分）を用いて行った。脱保護工程、カップリング工程及び最終脱保護工程の間の洗浄はＮＭＰ（３×１分）、ＩＰＡ（３×１分）及びＮＭＰ（３×１分）を用いて行った。ペプチド合成変換及び洗浄を２０℃で行った。支持カップリング反応を、古典的カイザーテスト（Sigma-Aldrichからの直接調製された溶液キット）によってモニタリングした。化合物の分子量を、ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ（商標） Ｕｌｔｒａ １２を用いて算出した。全ての最終生成物が、他に指示のない限り９５％を超える純度であった（分析用逆相ＬＣＭＳによって決定される）。分析データを表ＩＩに与える。
【0085】
以下の５つの方法をＬＣ－ＭＳ分析のために行った：
方法Ａ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～３．２０分：５％→１００％のＢ、３．２０分～４分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｂ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～１０分：４０％→１００％のＢ、１０分～１１分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｃ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～３．２０分：０％→５０％のＢ、３．２０分～４分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｄ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～６分：０％→５０％のＢ、６分～７分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｅ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～３分：５％→１００％のＢ、３分～４分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。高分解能質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＬＣＴ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋ｖｅ）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－ｖｅ）モードを用いて記録した。
方法Ａ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～３．２０分：５％→１００％のＢ、３．２０分～４分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｂ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～１０分：４０％→１００％のＢ、１０分～１１分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｃ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～３．２０分：０％→５０％のＢ、３．２０分～４分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｄ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～６分：０％→５０％のＢ、６分～７分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＺＱ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－）モードを用いて記録した。コーン電圧は２０Ｖとした。
方法Ｅ：分析用ＨＰＬＣを、Ｘ－Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰカラム（２．５μｍ ３０×４．６ｍｍ ｉｄ）で、水中の０．１％ギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：０分～３分：５％→１００％のＢ、３分～４分１００％のＢを１．８ｍｌ／分の流量、４０℃で用いて溶出させて行った。高分解能質量スペクトル（ＭＳ）を、WatersのＬＣＴ質量分析計でエレクトロスプレー陽イオン化（ＭＨ＋分子イオンをもたらすＥＳ＋ｖｅ）又はエレクトロスプレー陰イオン化（（Ｍ－Ｈ）－分子イオンをもたらすＥＳ－ｖｅ）モードを用いて記録した。
【0086】
精製をＢｒｅｅｚｅソフトウェアに接続したWatersの半分取ＨＰＬＣシステム又はＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアに接続したDionexの半分取ＨＰＬＣシステムのいずれかで、AITによるＣ１８半分取カラムを用い、溶離液Ａとして０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ及び溶離液Ｂとして０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ３ＣＮを５ｍＬ／分の流量で用いて逆相ＨＰＬＣによって行った。ＵＶ検出を２２０ｎｍ及び２８０ｎｍで行った。精製勾配は、関心領域において１分当たりおよそ１％の溶液Ｂの傾斜が得られるように選んだ。
【0087】
環状ペプチド合成：
環状ペプチドは混合固相／溶液相手順を用いて合成した。典型的な支持合成は、先に記載されるように報告される（Peptidomimetic Antibiotics Target Outer-Membrane Biogenesis in Pseudomonas aeruginosa, Nityakalyani Srinivas et al. published 19 February 2010, Science 327, 1010 (2010)を参照されたい）。２－クロロトリチルクロリド樹脂を予め無水ＣＨ２Ｃｌ２中で２時間膨潤させた。Ｆｍｏｃ－Ａａ－ＯＨ（０．３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、４当量）の存在下で２－ＣＴＣ樹脂（４００ｍｇ、充填＝１．６ｍｍｏｌ／ｇ）にカップリングした。樹脂上の未反応の部位をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（７：２：１）の混合物、続いてＭｅＯＨで洗浄することによってキャッピングした。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去した後、鎖伸長を標準Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Bachem、スイス）により、Ｆｍｏｃ脱保護のために２０％ピペリジン／ＤＭＦ、活性化のために２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、塩基としてＤＩＰＥＡ及び溶媒としてＮ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）を用いて行った。直鎖ペプチド鎖の集合が完了した後、付加的なＭｅＯＨ洗浄を、樹脂を収縮させる最終洗浄工程（１×１分、１×１５分）のために行った。
環状ペプチドは混合固相／溶液相手順を用いて合成した。典型的な支持合成は、先に記載されるように報告される（Peptidomimetic Antibiotics Target Outer-Membrane Biogenesis in Pseudomonas aeruginosa, Nityakalyani Srinivas et al. published 19 February 2010, Science 327, 1010 (2010)を参照されたい）。２－クロロトリチルクロリド樹脂を予め無水ＣＨ２Ｃｌ２中で２時間膨潤させた。Ｆｍｏｃ－Ａａ－ＯＨ（０．３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、４当量）の存在下で２－ＣＴＣ樹脂（４００ｍｇ、充填＝１．６ｍｍｏｌ／ｇ）にカップリングした。樹脂上の未反応の部位をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（７：２：１）の混合物、続いてＭｅＯＨで洗浄することによってキャッピングした。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去した後、鎖伸長を標準Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Bachem、スイス）により、Ｆｍｏｃ脱保護のために２０％ピペリジン／ＤＭＦ、活性化のために２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、塩基としてＤＩＰＥＡ及び溶媒としてＮ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）を用いて行った。直鎖ペプチド鎖の集合が完了した後、付加的なＭｅＯＨ洗浄を、樹脂を収縮させる最終洗浄工程（１×１分、１×１５分）のために行った。
【0088】
直鎖ペプチドをＨＦＩＰ／ＣＨ２Ｃｌ２カクテル（１：４、ｖ／ｖ）で各１５分間、２回処理することによって樹脂から切断した。反応混合物を濾過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２及びＭｅＯＨで順次すすいだ。濾液をプールし、溶媒を続いて減圧下で蒸発させた。最後に、粗直鎖ペプチドを、乾燥氷冷ＥｔＯ２を用いて３回沈殿させ、遠心分離（３×５分、７８００ｒｐｍ）後に回収し、乾燥させた（窒素流下）。後者の系が、切断工程中のカルボン酸の使用が不要となるために、溶液中で環化される完全に保護されたフラグメントの切断に特に好適である。
【0089】
環化のために、得られる直鎖ペプチド（１当量）をＤＭＦ（１ｍｇ／ｍＬ濃度）に溶解し、ＰｙＢＯＰ（２当量）及びＨＯＢｔ（２当量）を溶液に添加した。ＤＩＰＥＡ（１％（ｖ／ｖ））を添加することによってｐＨを８に調整し、混合物をＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示されるまで（２時間～２０時間）撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。過剰なカップリング剤を除去するために、粗ペプチドをＣＨ２Ｃｌ２又はＭｅ－ＴＨＦ（５０ｍＬ）に再溶解し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（２×２０ｍＬ）及びブライン（２×２０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、真空下で蒸発させた。蒸発後にＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ最終脱保護カクテル（９５／２．５／２．５、２０ｍＬ）を円滑に添加した。得られる混合物を３時間撹拌した後、乾燥氷冷ＥｔＯ２（３×３０ｍＬ）を用いて３回沈殿させ、遠心分離（３×５分、７８００ｒｐｍ）後に回収し、乾燥させた（窒素流下）。
【0090】
得られる粗環状ペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液に溶解した。精製を逆相ＨＰＬＣ Ｐｒｅｐ Ｃ１８カラムで、水中の０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）により、以下の溶出勾配：３０分で１５％→３５％のＢを１４ｍｌ／分の流量、２０℃で用いて溶出させて行った。精製によるペプチド画分を分析用ＬＣ－ＭＳ（方法Ｃ又はＤ）によって分析し、それらの純度に応じてプールし、Bioblock ScientificによるＡｌｐｈａ ２／４凍結乾燥機で凍結乾燥して、予想される大環状ペプチド（ｍｇ、μｍｏｌ）を白色の粉末として全収率７％で得た。
【0091】
【表2】
【0092】
２． 本発明による環状ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
腫瘍細胞の増殖に対する幾つかの本発明の環状ペプチドの効果を、５つの細胞株（ＭＣＦ－７、ヒト乳癌細胞；ＨＣＴ－１１６、ヒト結腸癌細胞；ＢｘＰＣ３、ヒト膵癌細胞及びＡ５４９；ヒト肺癌細胞）に対して細胞毒性アッセイ、及び細胞数を直接計数することによって評価した。
腫瘍細胞の増殖に対する幾つかの本発明の環状ペプチドの効果を、５つの細胞株（ＭＣＦ－７、ヒト乳癌細胞；ＨＣＴ－１１６、ヒト結腸癌細胞；ＢｘＰＣ３、ヒト膵癌細胞及びＡ５４９；ヒト肺癌細胞）に対して細胞毒性アッセイ、及び細胞数を直接計数することによって評価した。
【0093】
２．１． 材料
一般式（Ｉ）の環状ペプチド、ＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ７、ＰＫＴＤ９、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１０－４、ＰＫＴＤ１１、ＰＫＴＤ１１ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１２、ＰＫＴＤ１６、ＰＫＴＤ１８、ＰＫＤ８、ＰＫＤ１０及びＰＫＤ１０－ＦＦを実験の部に記載のように合成した。
一般式（Ｉ）の環状ペプチド、ＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ７、ＰＫＴＤ９、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１０－４、ＰＫＴＤ１１、ＰＫＴＤ１１ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１２、ＰＫＴＤ１６、ＰＫＴＤ１８、ＰＫＤ８、ＰＫＤ１０及びＰＫＤ１０－ＦＦを実験の部に記載のように合成した。
【0094】
これらの環状ペプチドをＤＭＳＯに以下の濃度：０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭで溶解した。
【0095】
ＰＫＣ１は、ＴＳＰ－１のβ－ストランド番号７（配列番号８）のフラグメントのみを含む環状ペプチドであり、その構造は以下の通りである：
【化4】
【0096】
直鎖ＰＫＴ１６ペプチド（（Ｄ）Ｌｙｓ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｎｌｅ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ－（Ｄ）Ｌｙｓ）を陽性対照として使用した。
【0097】
化合物ＣＴＧＧ（４ＮＧＧとも呼ばれる、配列ＫＲＦＹＧＧＭＷＫＫの直鎖ペプチド）を陰性対照として使用した。
【0098】
これらのアッセイに使用される培養培地は以下の通りである：ＥＭＥＭ＝ＭＣＦ－７及びＷｉ３８については１０％ＳＶＦ；ＲＰＭＩ １６４０＝ＨＣＴ－１１６及びＢｘＰＣ３については１０％ＳＶＦ、及びＦ－１２Ｋ＝Ａ５４９については１０％ＳＶＦ。
【0099】
２．２． 方法
２．２．１． 細胞生存能力及び増殖の分析
５００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートし、異なる濃度の環状ペプチド及び対照によって２時間処理した。
２．２．１． 細胞生存能力及び増殖の分析
５００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートし、異なる濃度の環状ペプチド及び対照によって２時間処理した。
【0100】
２．２．２． フローサイトメトリーによる細胞死分析
起こり得るアポトーシスプロセスを検出するために、細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、各試験環状ペプチドを含有する培地中で２時間、手順Ａ又はＢに従って培養した。
起こり得るアポトーシスプロセスを検出するために、細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、各試験環状ペプチドを含有する培地中で２時間、手順Ａ又はＢに従って培養した。
【0101】
手順Ａ：エトポシド（４０ｎＭ）を、アポトーシスを誘導する陽性対照として使用した。次いで、細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳで洗浄し、アネキシンバッファー中のアネキシンＶ－ＦｒｒＣ（BD Pharmingen）により室温で１５分間染色した。最後に、細胞を５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Sigma）で対比染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析した。各細胞型についての実験を３回繰り返した。１サンプル当たり２００００イベントを各実験で分析した。
【0102】
手順Ｂ：ペプチドをＨＣＴ－１１６細胞上で２時間インキュベートした。Ｓｕｐｅｒｋｉｌｌｅｒ Ｔｒａｉｌ（ＡＬＸ－２０１－１１５－Ｃ０１０）を陽性アポトーシス促進性対照として使用した。細胞を、BIOLEGENDによる７－ＡＡＤ（ＢＬＥ６４０９２２）を用いるＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キットを用いて細胞蛍光測定法によって分析した。
【0103】
【0104】
【表3】
【0105】
【表4】
【0106】
【表5】
【0107】
【表6】
【0108】
試験した全ての環状ペプチドＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ７、ＰＫＴＤ９、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１０－Ｘ－ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１０－４、ＰＫＴＤ１１、ＰＫＴＤ１１ＲＮＭｅ、ＰＫＴＤ１２、ＰＫＴＤ１６、ＰＫＴＤ１８、ＰＫＤ１０及びＰＫＤ１０－ＦＦが、全ての細胞株において用量依存的な生存能力の減少（１０μＭから５０μＭのペプチド濃度において２時間で２０％から８０％のＰＣＤ誘導）を示す。この活性は、今回試験した濃度では有効でない（ＰＣＤを誘導する有効性は１００μＭで観察されない）陽性対照（ＰＫＴ１６）よりも有意に高い。
【0109】
環状ペプチドＰＫＣ１は、使用したいずれの濃度でもＰＣＤの誘発において有効性を示さない（１２．５μＭ～５０μＭ、同じ結果が観察される）。この結果から、ＴＳＰ－１のβストランド６及び７又は７及び８を伴う環状ヘアピン構造の重要性が実証され、ＴＳＰ－１の４Ｎ１ ＣＤ４７結合エピトープの単純な環化がその効力の改善に十分でないという事実が強調される。
【0110】
環状ペプチドＰＫＤ１０は、低用量（２５μＭ）で２時間のインキュベーション後に極めて顕著な細胞生存能力の減少を誘導する（図７Ｆ）。
【0111】
このため、これらの結果により、動物又はヒトのいずれかにおける本発明の環状ペプチドを腫瘍及び免疫疾患（慢性炎症と関連する疾患を含む）といったＰＣＤの欠陥と関連する疾患の治療に対して非常に有望なツールとみなすことが可能となる。腫瘍サイズの低減におけるその治療効率に加えて、これらの環状ペプチドは、通常は細胞毒性薬と関連する強い毒性を示さない。したがって、腫瘍を患う患者の治療のための将来の治療剤として具体化される。
【0112】
３． 結合実験
結合親和性測定。Ｊｕｒｋａｔ及び／又はＭＥＣ－１細胞からの膜調製物に対するペプチド、ここではＰＫＴ１６、ＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－１、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－５、ＰＫＤＴ１０－７及びＰＫＴＤ１０－８の結合親和性を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ１１５－ｐｉｃｏシステム（Nanotemper Technologies、ミュンヘン、ドイツ）でのマイクロスケール熱泳動（Microscale Thermophoresis）ｘｌｖによって測定した。
結合親和性測定。Ｊｕｒｋａｔ及び／又はＭＥＣ－１細胞からの膜調製物に対するペプチド、ここではＰＫＴ１６、ＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－１、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－５、ＰＫＤＴ１０－７及びＰＫＴＤ１０－８の結合親和性を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ１１５－ｐｉｃｏシステム（Nanotemper Technologies、ミュンヘン、ドイツ）でのマイクロスケール熱泳動（Microscale Thermophoresis）ｘｌｖによって測定した。
【0113】
ＭＳＴによって測定された結合曲線。測定方法は、「熱拡散」と称される効果である温度勾配に沿った分子の有向運動に基づく。局所温度差ΔＴは、ソレー係数ＳＴ：ｃｈｏｔ／ｃｃｏｌｄ＝ｅｘｐ（－ＳＴΔＴ）によって定量化される分子濃度の局所変化（枯渇又は濃縮）をもたらす。ＭＥＣ－１又はＪｕｒｋａｔ膜調製物を、他の部分に記載されるＮａｎｏｔｅｍｐｅｒ ＮＴ－６４７標識化キットを用いて標識するｘｌｖｉ。標識した調製物をＰＢＳで溶出し、４℃で保管する。各ペプチドのストック溶液をＤＭＳＯ（５ｍＭ）中で調製した後、ＰＢＳで希釈する。ＭＳＴによって評価したペプチドについては、ＮＴ．１１５標識膜の濃度を一定に維持し、リガンド（ペプチド）の濃度を変化させた。短時間のインキュベーション後にサンプルをＭＳＴ ｐｒｅｍｉｕｍガラス毛細管に充填し、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５－ｐｉｃｏを用いてＭＳＴ分析を行った。図５：ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインに由来する直鎖ペプチドであるＰＫＴ１６（（Ｄ）Ｌｙｓ－（Ｎ－Ｍｅ）Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｎｌｅ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ－（Ｄ）Ｌｙｓ）について観察されたＭＳＴ曲線。Ｋｄ＝１６００ｎＭ。図６Ａ～図６Ｈ：ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインのＰＫＴＤ１、ＰＫＴＤ１０、ＰＫＴＤ１０－１、ＰＫＴＤ１０－３、ＰＫＴＤ１０－４、ＰＫＴＤ１０－５、ＰＫＴＤ１０－７、ＰＫＴＤ１０－８（表ＩＩ中を参照されたい）の全ての環状ペプチド類似体について観察されたＭＳＴ曲線。Ｋｄ（０．１ｎＭ～５０５ｎＭ）。Ｋｄ比は、これらの環状類似体が全て、ＣＤ４７ライゲーションにおいてβ－ストランド７から設計した直鎖類似体よりもはるかに効率的であるという事実を強調する。これらの環状ペプチドのＫｄは、２．８ｎＭ～５０ｎＭに含まれる。この値は、腫瘍細胞及びそれらの調製物に応じて非常に多様である。
【0114】
４． 安定性アッセイ
タンパク質分解安定性研究を、先に記載されるようなプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン及びプロテイナーゼＫ等）との又はヒト血清中でのペプチドインキュベーションによって行った（Karoyan et al. J. Med. Chem. 2016を参照されたい）。これらの条件では、ＰＫＤ８、ＰＫＤ９又はＰＫＤ１０といったペプチドは、プロテアーゼに対して完全に安定しているようであり、ＰＫＣ１はＰＫＤ１０の直鎖類似体、すなわちＬ－ＰＫＤ１０のように２時間足らずでトリプシンによって分解される。環化は代謝安定性（ＰＫＣ１）の改善にも薬理学的プロファイル（ＰＫＣ１）の改善にも十分ではないが、ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインの安定したヘアピン模倣体の開発は、薬理学的特性及びプログラム細胞死を誘導する能力が改善された（少なくともＰＫＤ８、ＰＫＤ１０、ＰＫＤ１０－ＦＦ）安定した（少なくともＰＫＤ８、ＰＫＤ９及びＰＫＤ１０）類似体をもたらした。
タンパク質分解安定性研究を、先に記載されるようなプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン及びプロテイナーゼＫ等）との又はヒト血清中でのペプチドインキュベーションによって行った（Karoyan et al. J. Med. Chem. 2016を参照されたい）。これらの条件では、ＰＫＤ８、ＰＫＤ９又はＰＫＤ１０といったペプチドは、プロテアーゼに対して完全に安定しているようであり、ＰＫＣ１はＰＫＤ１０の直鎖類似体、すなわちＬ－ＰＫＤ１０のように２時間足らずでトリプシンによって分解される。環化は代謝安定性（ＰＫＣ１）の改善にも薬理学的プロファイル（ＰＫＣ１）の改善にも十分ではないが、ＴＳＰ－１のＣ末端結合ドメインの安定したヘアピン模倣体の開発は、薬理学的特性及びプログラム細胞死を誘導する能力が改善された（少なくともＰＫＤ８、ＰＫＤ１０、ＰＫＤ１０－ＦＦ）安定した（少なくともＰＫＤ８、ＰＫＤ９及びＰＫＤ１０）類似体をもたらした。
【0115】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A1】
【図7A2】
【図7B1】
【図7B2】
【図7C1】
【図7C2】
【図7D1】
【図7D2】
【図7E1】
【図7E2】
【図7F】
【配列表】