特許 7167576 分析用試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-31

(45)【発行日】2022-11-09

(54)【発明の名称】分析用試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20221101BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20221101BHJP

   G01N 1/10 20060101ALI20221101BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

C12Q1/04

G01N1/10 B

G01N1/10 H

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2018172860

(22)【出願日】2018-09-14

(65)【公開番号】P2020045298

(43)【公開日】2020-03-26

【審査請求日】2020-12-10

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100102037

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 裕之

(74)【代理人】

【識別番号】100149962

【弁理士】

【氏名又は名称】阿久津 好二

(74)【代理人】

【識別番号】100170988

【弁理士】

【氏名又は名称】妹尾 明展

(74)【代理人】

【識別番号】100189566

【弁理士】

【氏名又は名称】岸本 雅之

(72)【発明者】

【氏名】寺本 華奈江

【審査官】木原 啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】特開平０１－１２４３９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－３１６０６３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ １／１０

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ３３／４８

Ｃ１２Ｑ

Ｃ０７Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物のリボソームタンパク質の複合体であるリボソーム、及び該リボソームを構成するサブユニットから選択される少なくとも１つを含む試料を取得することと、
前記試料を、リボソームタンパク質を透過させるが、前記リボソームタンパク質の複合体の少なくとも一つを透過させない膜を用いて限外ろ過することと、
前記限外ろ過において前記膜を透過しなかった成分を用いて分析用試料を調製することと、
前記分析用試料を質量分析することと、
前記分析用試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、前記限外ろ過において前記膜を透過しなかった成分に含まれる前記リボソームタンパク質の複合体から分離された複数のリボソームタンパク質のそれぞれに対応するピークの有無または前記ピークの大きさに基づいて、前記微生物の種類を識別することとを有し、
前記質量分析では、前記複合体から分離されたリボソームタンパク質が検出される、
微生物の識別方法。

【請求項2】

請求項１に記載の微生物の識別方法において、
前記膜は、分画分子量が３ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である微生物の識別方法。

【請求項3】

請求項２に記載の微生物の識別方法において、
前記膜は、分画分子量が１０ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である微生物の識別方法。

【請求項4】

請求項１から３までのいずれか一項に記載の微生物の識別方法において、
前記膜は、前記リボソーム、前記リボソームの２つのサブユニットのうち大きい方のサブユニット、および、前記２つのサブユニットのうち小さい方のサブユニットの少なくとも一つを透過させない微生物の識別方法。

【請求項5】

請求項１から４までのいずれか一項に記載の微生物の識別方法において、
細胞からタンパク質を抽出した後、遠心分離を行ってリボソームを含む分画を取り出すことにより前記微生物から抽出されたリボソームを含む試料を取得する微生物の識別方法。

【請求項6】

請求項１から５までのいずれか一項に記載の微生物の識別方法において、
前記質量分析では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化により前記分析用試料がイオン化される微生物の識別方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分析用試料の調製方法、分析方法および微生物の識別方法に関する。

【背景技術】

【0002】

リボソームは細胞内に存在し、タンパク質の生成という機能を有する構造体である。リボソームは、大サブユニット（ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）および小サブユニット（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）からなり、各サブユニットは複数のリボソームタンパク質の複合体である。リボソームはその機能が重要である点に加え、生物に普遍的に存在する構造であるため重要な分析対象である。質量分析においては、微生物がどのようなリボソームタンパク質を含むかに基づいて当該微生物の菌種等を識別することが行われている（非特許文献１参照）。

【0003】

微生物を含む試料を遠心分離等の精製処理を行わずに質量分析に供すると、夾雑物によるイオン化抑制等の悪影響が生じる。従って、精度よくリボソームタンパク質の分析を行うためには、夾雑物の除去やリボソームタンパク質の濃縮等の適切な前処理が行われる必要がある。従来の方法では、超遠心分離や高速遠心分離によりこのような前処理を行っていた。しかし、超遠心分離や高速遠心分離のための装置は高価であり、さらに前処理に数日を要する場合もあった。

【0004】

一方、限外ろ過は、タンパク質の濃縮、緩衝液の交換、または脱塩等の目的のため、質量分析の前処理において行われている（非特許文献２および３参照）。しかし、微生物の識別等を目的としたリボソームタンパク質の濃縮等には用いられていなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Sedo O, Sedlacek I, Zdrahal Z. "Sample preparation methods for MALDI-MS profiling of bacteria" Mass Spectrometry Reviews,（米国）, John Wiley & Sons, 2011年5月、Volume 30, Issue 3, pp.417-434

【文献】Christner M, Trusch M, Rohde H, Kwiatkowski M, Schluter H, Wolters M, Aepfelbacher M, Hentschke M. "Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli" Plos One,（米国）, Public Library of Science, 2014年7月8日、Volume 9, Issue 7, e101924

【文献】Kawahara T, Iida A, Toyama Y, Fukuda K. "Characterization of the Bacteriocinogenic Lactic Acid Bacteria Lactobacillus curvatus Strain Y108 Isolated from Nozawana-Zuke Pickles" Food Science and Technology Research,（日本）,日本食品科学工学会, 2010年、Volume 16, Issue 3, pp.253-262

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来のリボソームタンパク質の濃縮等では、高価な装置を必要とし、時間や手間がかかりすぎていた。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の好ましい実施形態による分析用試料の調製方法は、リボソームを含む試料を取得することと、前記試料を、リボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させるが、前記リボソームタンパク質の複合体の少なくとも一つを透過させない膜を用いてろ過することと、前記ろ過において前記膜を透過しなかった成分を用いて分析用試料を調製することとを備える。
さらに好ましい実施形態では、前記膜は、分画分子量が３ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である。
さらに好ましい実施形態では、前記膜は、前記リボソーム、前記リボソームの２つのサブユニットのうち大きい方のサブユニット、および、前記２つのサブユニットのうち小さい方のサブユニットの少なくとも一つを透過させない。
さらに好ましい実施形態では、前記膜を透過しなかった成分に、水中での酸解離定数が５以下の酸を加えてタンパク質を分離することをさらに備える。
さらに好ましい実施形態では、細胞からタンパク質を抽出した後、遠心分離を行ってリボソームを含む分画を取り出すことにより前記リボソームを含む試料を取得することをさらに備える。
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、上述の分析用試料の調製方法により調製された分析用試料の分析を行う。
さらに好ましい実施形態では、前記分析では、前記複合体から分離されたリボソームタンパク質が検出される。
さらに好ましい実施形態では、前記分析は、質量分析である。
さらに好ましい実施形態では、前記質量分析では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化により前記分析用試料がイオン化される。
本発明の好ましい実施形態による微生物の識別方法は、上述の分析方法により、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、複数のリボソームタンパク質のそれぞれに対応するピークの有無または前記ピークの大きさに基づいて、前記微生物の種類を識別する。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、迅速にまたはより簡素化された方法でリボソームタンパク質の濃縮等を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、一実施形態の分析用試料の調製方法を模式的に示す概念図である。

【図2】図２は、一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。

【図3】図３は、実施例１の分析方法の流れを示す概念図である。

【図4】図４は、アクネ菌を試料とし、限外ろ過前（ａ）、限外ろ過後（ｂ）および酸による濃縮後（ｃ）の分析用試料をそれぞれ質量分析して得られたマススペクトルを示す図である。

【図5】図５は、実施例２の分析方法の流れを示す概念図である。

【図6】図６は、出芽酵母を試料とし、限外ろ過前（ａ）および限外ろ過後（ｂ）の分析用試料をそれぞれ質量分析して得られたマススペクトルを示す図である。

【図7】図７は、図６のマススペクトルの一部の拡大図である。

【図8】図８は、大腸菌を試料とし、限外ろ過前（ａ）および限外ろ過後（ｂ）の分析用試料をそれぞれ質量分析して得られたマススペクトルを示す図である。

【図9】図９は、図８のマススペクトルにおいて、基準ピークに対する各ピークの相対強度をプロットした散布図である。

【図10】図１０は、アクネ菌を試料とし、限外ろ過前（ａ）、ならびに、限外ろ過において、公称分画分子量が１０ｋＤａ（ｂ）、３０ｋＤａ（ｃ）、５０ｋＤａ（ｄ）および１００ｋＤａ（ｅ）の各フィルターに捕捉された試料をそれぞれ質量分析して得られたマススペクトルを示す図である。

【図11】図１１は、アクネ菌を試料とし、公称分画分子量が１０ｋＤａ（ｂ）、３０ｋＤａ（ｃ）、５０ｋＤａ（ｄ）および１００ｋＤａ（ｅ）のフィルターをそれぞれ用いて限外ろ過を行った際のろ液をそれぞれ質量分析して得られたマススペクトルを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。

【0011】

図１は、本実施形態の分析用試料の調製方法を模式的に示す概念図である。図１の例では、微生物であるバクテリアＢａを試料Ｓとし、質量分析により微生物の識別を行うための分析用試料を調製する例を用いて説明する。

【0012】

試料Ｓが用意されると、バクテリアＢａの菌体から破砕等によりタンパク質の抽出が行われる（矢印Ａ１）。菌体からの抽出液には、リボソームＲｂを含む細胞質成分Ｃｐ、核様体Ｎｕおよび細胞膜Ｃｍが含まれる。この抽出液に対して遠心分離が行われる（矢印Ａ２）。この遠心分離では、核様体Ｎｕおよび細胞膜Ｃｍが沈殿し（矢印Ａ２２）、上清の菌体破砕液にはリボソームＲｂを含む細胞質成分Ｃｐが残る（矢印Ａ２１）。

【0013】

この菌体破砕液が限外ろ過ユニット１００を用いてろ過される。限外ろ過ユニット１００は、試料リザーバー１０と、ろ液レシーバー２０とを備える。試料リザーバー１０はフィルター１１を備える。フィルター１１は、限外ろ過膜であり、リボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させるが、リボソームタンパク質の複合体の少なくとも一つを透過させない。試料リザーバー１０に菌体破砕液が導入され（矢印Ａ３）、適宜遠心等を用いて限外ろ過が行われる（矢印Ａ４）。これにより、リボソームＲｂがフィルター１１を透過せず試料リザーバー１０に残り、フィルター１１の分画分子量に基づいて一部の細胞質成分Ｃｐがフィルター１１を透過してろ液レシーバー２０に保持される。
なお、限外ろ過ユニット１００は、図１に示した種類のものに限定されず、適宜様々な種類のものを用いることができる。

【0014】

リボソームＲｂを含む、フィルター１１を透過しなかった成分を、再溶解させて得られた溶液に対し、適宜酸によるタンパク質の濃縮等を行った後、マトリックスを加え乾燥させる等して質量分析用試料が調製される。上述の分析用試料の調製方法では、フィルター１１により透過されるリボソームタンパク質の分子量よりも小さい分子量の分子は、フィルター１１を透過してしまうため分析用試料には含まれない。一方、リボソームＲｂに含まれていたリボソームタンパク質は分析用試料に含まれる。

【0015】

従来の、超遠心分離または高速遠心分離によりリボソームタンパク質を濃縮等する方法では、一定の分子量以上の成分を原則的にすべて沈殿させてしまう。従って、リボソームタンパク質の含有率を高めた試料を得ることができるが、リボソームタンパク質と同程度の分子量の物質を分離することはできない。そのため、これらの物質によりイオン抑制が起きたり、これらの物質に対応するピークがリボソームタンパク質に対応するピークと重なったりする悪影響があったが、本実施形態の分析用試料の調製方法では、このような悪影響は低減される。

【0016】

（試料について）
試料は、リボソームタンパク質の複合体を含む試料であれば特に限定されない。試料は、当該複合体として、リボソーム、またはリボソームを構成する大サブユニット若しくは小サブユニットを含むことが好ましい。これらの分子を捕捉するためにこれらの分子量に基づいて分画分子量が設定されたフィルター１１を用いると、リボソームタンパク質と同程度の分子量の分子を除いて、分析用試料を調製することができる。試料は、リボソームを含むことが特に好ましい。リボソームは上記複合体のうちで最も分子量が大きいため、リボソームの分子量に基づいて分画分子量が設定されたフィルター１１を用いると、最も広い範囲の分子量に対応する分子を試料から除くことができる。上記複合体としては、任意の２以上のリボソームタンパク質が結合した複合体を含むことができる。

【0017】

リボソームタンパク質の複合体を含む試料としては、細胞を含む試料が好ましい。質量分析により微生物の識別を行う場合は、微生物を含む試料または微生物が存在し得る環境から採取された試料が好ましい。微生物の種類は特に限定されず、大腸菌等の真正細菌、古細菌または、酵母等の菌類を含む真核生物を含むことができる。微生物は、培養されて得られた単一種からなるコロニーから採取されたものを用いることが、より正確に微生物を同定するために好ましい。

【0018】

（タンパク質の抽出）
細胞を含む試料からのタンパク質の抽出方法は特に限定されず、質量分析においてリボソームタンパク質を検出可能な程度に、細胞に含まれるリボソームタンパク質の複合体が個々のリボソームタンパク質まで分離されずに残っていればよい。できるだけリボソーム、大サブユニットまたは小サブユニットのように大きな複合体が分解されないように抽出を行うこと好ましい。これにより、より大きな分画分子量のフィルター１１を用いてより広い範囲の分子量に対応する分子を試料から除くことができる。

【0019】

タンパク質の抽出の具体的な方法としては、試料に有機酸や有機溶媒を加えて抽出する方法若しくは酵素消化法、またはビーズ破砕、超音波処理若しくは凍結破砕等の物理的な破砕法等を用いることができる。有機酸等を試料に加える場合には、抽出液がフィルター１１に悪影響を及ぼすことのないように組成を選択する必要があるが、物理的な破砕法ではそのような選択のための手間が省けるため好ましい。

【0020】

破砕等を行った後は、遠心分離等によりリボソームおよび細胞質成分を含む上清を分離することが好ましい。遠心分離の条件は特に限定されないが、例えば５０００～２００００ｇで１～２０分行うことが好ましく、１２０００～１８０００ｇで５～１０分行うことがより好ましい。得られた上清は任意選択的に精密ろ過に供された後、限外ろ過に供される。

【0021】

（精密ろ過）
試料からリボソームよりも大きい分子を除くため、破砕後の遠心分離で得られた上清を精密ろ過することが好ましい。これにより、夾雑物を除けるほか、限外ろ過での目詰まり等を防ぐことができる。精密ろ過に用いられる精密ろ過膜の孔径は、０．５μｍ以下が好ましく、０．４５μｍ以下がより好ましい。この孔径が小さいほど、より広い範囲の分子量に対応する分子を試料から除くことができる。また、精密ろ過膜の孔径があまり小さすぎるとリボソームが試料から除かれてしまうため、この孔径は、０．１μｍ以上が好ましく、０．２μｍ以上がより好ましい。精密ろ過の方法は特に限定されないが、例えば遠心分離を用いてろ過を促進することがより効率的に行う上で好ましい。孔径の大きな精密ろ過膜は、遠心分離等を用いて精密ろ過した場合に短い時間で効率よく分離できる点でも好ましい。精密ろ過膜を透過した溶液が限外ろ過に供される。
なお、精密ろ過以外の方法で、試料からリボソームよりも大きい分子を除いてもよい。

【0022】

（限外ろ過）
限外ろ過では、多孔質の限外ろ過膜における細孔により、水中に溶存するタンパク質等の高分子および微粒子を分離することができる。細孔径のばらつきや測定の難しさを理由として、細孔径ではなく分画分子量が、膜の分離性能を表す指標として用いられる。限外ろ過膜の各メーカーはそれぞれ異なった基準で公称分画分子量（Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｌｉｍｉｔ：ＮＭＷＬ）を定義している。分画分子量と同程度の分子量の分子は、限外ろ過膜を透過する場合もあれば、透過しない場合もある。以下では、分子量の異なる複数の標準物質を、限外ろ過膜に導入して得られた分画曲線において、阻止率が９０％となる分子量を分画分子量とする。

【0023】

本実施形態における限外ろ過膜（フィルター１１）は、リボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させるが、リボソームタンパク質の複合体の少なくとも一つを透過させない。ここで、限外ろ過膜が物質を「透過させる」とは、限外ろ過膜の分画分子量が当該物質の分子量よりも大きいことを指し、限外ろ過膜が物質を「透過させない」とは、限外ろ過膜の分画分子量が当該物質の分子量以下であることを指すものとする。

【0024】

フィルター１１が透過させることのできるリボソームタンパク質は、特に限定されない。フィルター１１は大腸菌または酵母に含まれるリボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させることが好ましい。例えば、フィルター１１は大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２株または出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に含まれるリボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させることが好ましい。フィルター１１は、試料に含まれ得る微生物の種類に応じて、当該微生物に含まれるリボソームタンパク質の少なくとも一つが透過されるように、分画分子量が設定される。例えば、フィルター１１は、大腸菌Ｋ１２株のリボソームタンパク質Ｓ２２（分子量５０９６．８）を透過させることが好ましい。あるいは、フィルター１１は、出芽酵母のリボソームタンパク質Ｌ４１－ＡまたはＬ４１－Ｂ（分子量３３３７．２）を透過させることが好ましい。

【0025】

フィルター１１は、小サブユニットおよび、小サブユニットより大きい分子量を有する分子を透過させないことが好ましい。これにより、リボソームタンパク質と同程度の分子量の分子を試料から除くことができる。フィルター１１は、小サブユニットを透過させるが、大サブユニットおよび、大サブユニットより分子量の大きい分子を透過させないことがより好ましい。これにより、小サブユニットと同程度およびそれ以下の分子量の分子を試料から除くことができる。フィルター１１は、大サブユニットを透過させるが、リボソームおよび、リボソームより分子量の大きい分子を透過させないことがさらに好ましい。これにより、大サブユニットと同程度およびそれ以下の分子量の分子を試料から除くことができる。例えば、フィルター１１は、試料の種類に応じて、大腸菌Ｋ１２株または出芽酵母のリボソームを透過させないように分画分子量が設定される。

【0026】

前処理後の試料においてリボソーム、大サブユニットおよび小サブユニットが分解され、より小さな複合体が主に存在すると考えられる場合は、フィルター１１の分画分子量を小サブユニットの分子量よりも適宜低く設定する。これにより、十分な量のリボソームタンパク質が質量分析において検出されるようにしつつ、少なくとも一部のリボソームタンパク質と同程度の分子量の分子を試料から除くことができる。

【0027】

フィルター１１の分画分子量は、リボソームタンパク質の複合体の分子量に基づいて設定することができる。ここで、当該分画分子量は、小サブユニットの分子量に基づいて設定されることが好ましく、大サブユニットの分子量に基づいて設定されることがより好ましく、リボソームの分子量に基づいて設定されることがさらに好ましい。より大きな分子量の分子に基づいて分画分子量を設定する程、より広い範囲の分子量に対応する分子を試料から除くことができる。但し、十分な量のリボソームタンパク質が質量分析において検出されない場合は、分画分子量を適宜低めに設定することで、検出されるリボソームタンパク質の量を確保することが好ましい。

【0028】

フィルター１１の分画分子量は、３ｋＤａより大きいことが好ましく、１０ｋＤａより大きいことがより好ましく、３０ｋＤａより大きいことがさらに好ましい。分画分子量が大きい程、より広い範囲の分子量に対応する分子を試料から除くことができるため好ましい。フィルター１１の分画分子量は、１００ｋＤａより小さいことが好ましい。これにより、リボソームの少なくとも一部を、フィルター１１を透過させずに残すことで、分析用試料におけるリボソームタンパク質の量を確保することができる。

【0029】

限外ろ過の方法は特に限定されないが、例えば遠心分離を用いてろ過を促進することが調製をより効率的に行う上で好ましい。分画分子量の大きなフィルター１１は、遠心分離を用いて限外ろ過した場合に短い時間で効率よく分離できることからも好ましい。限外ろ過に供した試料は、酸による濃縮が任意選択的になされた後、マトリックス等が添加されて質量分析用試料が調製される。

【0030】

（酸による濃縮）
限外ろ過により得られたリボソームを含む画分（以下、リボソーム画分と呼ぶ）に、酸を添加してリボソームを凝集させ、濃縮することが好ましい。十分に精製されていないリボソームを含む試料に酸を加えると、リボソームタンパク質以外の成分も濃縮されてしまうため、脱塩程度の効果しか期待できない。しかし、本実施形態で得られたリボソーム画分であれば、酸を添加する簡素な方法で迅速に凝集させて、リボソームを効率的に濃縮・精製できる。酸の添加により凝集したタンパク質は、遠心分離により容易に沈殿物として回収できる。

【0031】

本実施形態における濃縮に用いられる酸は、酢酸等の水中での酸解離定数が５以下の酸が好ましく、トリフルオロ酢酸等の酸解離定数が１以下の酸がより好ましい。用いる酸の酸解離定数が低い程、より確実に試料に含まれるタンパク質を凝集させることができる。用いる酸の濃度は特に限定されず適宜数％等にすることができ、例えば２％酢酸等を用いることができる。凝集したタンパク質は、上清を除いてから再溶解される。

【0032】

（分析用試料の調製）
リボソーム画分を任意選択的に酸による濃縮に供した後、行う分析に合わせて分析用試料が調製される。以下では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（以下、ＭＡＬＤＩと呼ぶ）を用いた質量分析のための分析用試料を調製する場合を説明する。限外ろ過後または酸による濃縮後のリボソームを含む試料に、マトリックス調製用の溶媒等を加えて再溶解させる。再溶解された溶液にマトリックス溶液を加え、混合した後、得られた溶液をＭＡＬＤＩ用試料プレートに滴下して乾燥させ、質量分析用試料が得られる。

【0033】

マトリックス調製用の溶媒は有機溶媒か、有機溶媒と水系溶媒とを混合して得られた溶媒が好ましく、有機溶媒や水系溶媒の種類は特に限定されない。一例を挙げると、当該溶媒は０％以上１％以下等の所定の体積パーセント濃度で調製されたトリフルオロ酢酸（TFA）と任意の体積パーセント濃度のアセトニトリル（ACN）とを含む水溶液で構成される。アセトニトリルの濃度は、数十％、特に５０％等に適宜設定することができる。マトリックス溶液は、マトリックス調製用の溶媒にマトリックスが加えられた溶液であり、質量分析の精度を上げるための添加剤を含んでもよい。マトリックスの種類は、イオン化が適切に行われれば特に限定されず、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、２，５－ジヒドロキシ安息香酸または１，５－ジアミノナフタレン等を適宜用いることができる。

【0034】

（質量分析）
質量分析では、複合体から分離された個々のリボソームタンパク質が検出される。質量分析の方法は、所望の質量分解能でリボソームタンパク質に対応するピークを含むマススペクトルが得られれば特に限定されないが、数ｋＤａ以上の高質量のリボソームタンパク質を精度よく測定する観点から、飛行時間型質量分析が好ましい。リボソームタンパク質等の同定のために多段階で質量分析を行ってもよい。この場合、例えばイオントラップでプリカーサーイオンの分離と解離を行った後、解離したイオンを飛行時間型質量分析に供してもよい。質量分析においてイオンを検出して得られた測定データから、マススペクトル（以下、測定されたマススペクトルと呼ぶ）が構築される。

【0035】

（微生物の識別）
測定されたマススペクトルと、データベース上の既知の複数の生物種のマススペクトルとが比較される。ここで比較対象とされる既知の生物種のデータは、マススペクトルに限らず、少なくとも当該生物種に存在するリボソームタンパク質に対応するピークのｍ／ｚ（質量電荷比に対応）を示すものであればどのようなデータでもよい。

【0036】

測定されたマススペクトルにおけるリボソームタンパク質に対応するピークと、データベース上に示されたリボソームタンパク質に対応するピークの分布との類似度が算出される。この類似度は対応するピークの有無に基づいて算出される。データベース上のリボソームタンパク質に対応するピークについて、測定されたマススペクトルに対応するピークが存在する場合、存在しない場合に比べて類似度を高くする。データベース上のリボソームタンパク質の各ピークは、例えば当該ピークが、対応する菌種の微生物においてどの程度の頻度で観察されるかに応じて、重み付けされている。データベース上の一部または全部のリボソームタンパク質に対応するピークについて、測定されたマススペクトルにも当該ピークが存在するか否かが判定され、上記重み付けに基づいて類似度が算出される。

【0037】

データベース上の複数の菌種（属名および種形容語）の微生物のマススペクトルと、測定されたマススペクトルとの類似度を算出し、類似度の最も高い菌種を、試料に含まれていた微生物の属する菌種として同定する。類似度の最も高い菌種の類似度が、所定の閾値未満の場合、データベース上のいずれの菌種にも該当しないとすることもできる。当該所定の閾値は、例えば、互いに異なる菌種に属するものの、ＤＮＡの相同性が比較的高い複数の微生物のマススペクトルを比較した結果に基づいて設定することができる。
なお、微生物の識別の方法は、測定されたマススペクトルにおけるリボソームタンパク質に対応するピークの分布とデータベース上のリボソームタンパク質のピークの分布がどの程度類似しているかを定量し、定量した数値等に基づいて微生物の分類についての判定を行うものであれば特に限定されない。例えば、リボソームタンパク質のピークの大きさ（ピーク強度）に基づいて類似度を算出してもよい。識別される分類は、属名および種形容語が好ましいが、特に限定されない。

【0038】

図２は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。図２の例では、試料に含まれる微生物の識別を行う分析方法を説明する。ステップＳ１００１において、微生物を含む試料が用意される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、当該微生物からタンパク質の抽出が行われる。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。

【0039】

ステップＳ１００５において、遠心分離により細胞質成分を含む上清が試料として取得される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、試料が精密ろ過され、リボソームより大きな分子の少なくとも一部が取り除かれる。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。

【0040】

ステップＳ１００９において、リボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させるが、リボソームタンパク質の複合体の少なくとも一つを透過させないフィルター１１を用いて試料がろ過される。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、ステップＳ１００９で分離された複合体を含む試料に酸が添加され、試料が濃縮される。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。

【0041】

ステップＳ１０１３において、試料にマトリックスが加えられ、質量分析用試料が調製される。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される。ステップＳ１０１５において、質量分析用試料にレーザーが照射され、イオン化が行われる。ＭＡＬＤＩでは赤外～紫外等の領域の波長のレーザーが質量分析用試料に照射され、質量分析用試料がイオン化される。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７が開始される。

【0042】

ステップＳ１０１７において、イオン化された質量分析用試料が質量分析に供され、マススペクトルが作成される。ステップＳ１０１７が終了したら、ステップＳ１０１９が開始される。ステップＳ１０１９において、測定されたマススペクトルにおけるピークと、データベースに記憶された複数の微生物に含まれるリボソームタンパク質に対応するピークとの比較が行われる。ステップＳ１０１９が終了したら、ステップＳ１０２１が開始される。

【0043】

ステップＳ１０２１において、ステップＳ１０１９での比較に基づいて、試料に用いた微生物がいずれの菌種であるかが識別される。ステップＳ１０２１が終了したら、処理が終了される。

【0044】

上述の実施形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の分析用試料の調製方法は、試料を、リボソームタンパク質の少なくとも一つを透過させるが、リボソームタンパク質の複合体の少なくとも一つを透過させないフィルター１１を用いてろ過することと、このろ過においてフィルター１１を透過しなかった成分を用いて分析用試料を調製することとを備える。これにより、迅速にまたは簡素化された方法でリボソームタンパク質をの濃縮等を行うことができ、精度よくリボソームタンパク質を含む分析用試料の分析を行うことができる。

【0045】

（２）本実施形態の分析用試料の調製方法において、フィルター１１は、分画分子量が３ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である。これにより、リボソームタンパク質と同程度の分子を試料から除くことができる。

【0046】

（３）本実施形態の分析用試料の調製方法において、フィルター１１は、リボソーム、大サブユニット、および、小サブユニットの少なくとも一つを透過させない。これにより、これらの複合体よりも小さい分子量の分子を試料から除くことができる。

【0047】

（４）本実施形態の分析用試料の調製方法において、限外ろ過においてフィルター１１を透過しなかった成分に、水中での酸解離定数が５以下の酸を加えてタンパク質を分離することをさらに備える。これにより、リボソームタンパク質を効率よく濃縮することができる。

【0048】

（５）本実施形態の分析用試料の調製方法は、細胞からタンパク質を抽出した後、遠心分離を行ってリボソームを含む分画を取り出すことにより、リボソームを含む試料を取得することをさらに備える。これにより、リボソームおよび細胞質成分を含む試料を効率よく用意することができる。

【0049】

（６）本実施形態に係る分析方法は、本実施形態の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した分析用試料を分析することとを備える。これにより、迅速にまたは簡素化された方法でリボソームタンパク質の濃縮等を行うことができ、精度よくリボソームタンパク質を含む分析用試料の分析を行うことができる。

【0050】

（７）本実施形態に係る分析方法において、上記分析では、複合体から分離されたリボソームタンパク質が検出される。これにより、各リボソームタンパク質についての情報を得ることができる。

【0051】

（８）本実施形態に係る分析方法は、上述の調製方法により調製された分析用試料に対し質量分析を行う。これにより、ｍ／ｚに基づいて、リボソームタンパク質を分離して解析することができる。

【0052】

（９）本実施形態に係る分析方法において、質量分析では、ＭＡＬＤＩにより分析用試料がイオン化される。これにより、リボソームタンパク質等の高分子を好適にイオン化することができる。また、ＭＡＬＤＩでは一価のイオンが生成されやすいため、解析しやすいマススペクトルを取得することができる。

【0053】

（１０）本実施形態に係る微生物の識別方法は、上述の分析方法により、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける、複数のリボソームタンパク質のそれぞれに対応するピークの有無または当該ピークの大きさに基づいて、微生物の種類を識別する。これにより、精度よく迅速に微生物の同定を行うことができる。

【0054】

本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。

【実施例】

【0055】

以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に言及が無い限り体積％を示す。

【0056】

（実施例１）
実施例１では、バクテリアのリボソームタンパク質を含む分析用試料を調製し、調製後の分析用試料を質量分析により分析した。

【0057】

図３は、実施例１の分析方法の流れを示す概念図である。皮膚の常在菌であるアクネ菌（Cutibacterium acnes）を37℃で培養し、蒸留水を用いてOD₆₀₀＝１となるように菌量を調整し菌体分散液を得た。菌体分散液 200μＬをスクリューキャップ容器に分注し、同量のジルコニアビーズ（直径0.5 mm）を加えて、冷却しながら3分間破砕処理を行った（矢印Ａ１１０）。ビーズ破砕後、上記スクリューキャップ容器に200μＬの蒸留水を加えて、攪拌した後、15000gで5分間遠心分離した（矢印Ａ１２０）。遠心分離により、上清として菌体破砕液が得られ（矢印Ａ１２１）、沈殿として核様体や細胞膜を含むデブリが得られた（矢印Ａ１２２）。

【0058】

上清（菌体破砕液）400μＬを遠心式ろ過フィルターを用いて限外ろ過した（矢印Ａ１３０）。ここでは、公称分画分子量NMWLが10kDaのフィルターを使って、14000gで10分間遠心分離した。ろ過されず捕捉された高分子量画分（リボソーム精製画分）を回収した。具体的には、遠心用のチューブを新しいものに交換し、フィルターを限外ろ過のときとは逆向きに取り付けて、1000g、2分間の条件で遠心分離によりフィルターからリボソーム精製画分を分離した。

【0059】

遠心チューブに得られたリボソーム精製画分50μＬに、同量の2% 酢酸水溶液を加えて、タンパク質を凝集させた（矢印Ａ１４０）。凝集したタンパク質を含む溶液を遠心分離（10000g, 2分）に供した（矢印Ａ１５０）。この遠心分離により、上清（矢印Ａ１５１）および濃縮されたリボソーム精製画分を含む沈殿が得られた（矢印１５２）。

【0060】

上清を除去してから、濃縮されたリボソーム精製画分に10μＬの1% TFAを含む50% ACN水溶液を加えて再溶解させた。試料とは別に、10 mg/mLの濃度となるように、1% TFAを含む50% ACN水溶液を溶媒としてシナピン酸溶液を調製した。10μＬのシナピン酸溶液に1μＬの濃縮した上記濃縮されたリボソーム精製画分を加えてよく混合して、1μＬをMALDI質量分析計（MALDI-MS）のステンレス製試料プレートに滴下して試料－マトリックス混合結晶を質量分析用試料として調製した。調製された質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化し、m/z 3000-30000の範囲をMALDI-飛行時間型質量分析により測定した。

【0061】

図４は、実施例１の質量分析で得られたマススペクトルを示す図である。図中、上段が限外ろ過前の菌体破砕液(a)、中段がリボソーム精製画分(b)、下段が濃縮されたリボソーム精製画分(c)のマススペクトルである。同定されたリボソームタンパク質に対応するピークには、そのリボソームタンパク質の名称を付した。限外ろ過を行った後の試料を質量分析して得られたマススペクトル(b),(c)では、より多くのリボソームタンパク質が同定された。なお、バーＢｒで示されたｍ／ｚの範囲は、相対強度を５倍に拡大して示している（特に断りがない限り、以下の図でも同様である）。

【0062】

実施例１では、限外ろ過により夾雑物を除去することで、リボソームタンパク質と夾雑物とのピークが重複することを抑制でき、結果的により多くのリボソームタンパク質を同定することができた。さらに、図４における(a),(b)および(c)のマススペクトルを比較すると、限外ろ過や、限外ろ過された試料への酸の添加により、アクネ菌における10000Da以上等の高分子量のリボソームタンパク質をより明瞭に検出できることが分かる。また、酸の添加により一旦タンパク質を凝集させても、問題なくリボソームタンパク質のピークを観測できることも確認できた(c)。

【0063】

（実施例２）
実施例２では、酵母のリボソームタンパク質を含む分析用試料を調製し、調製後の分析用試料を質量分析により分析した。

【0064】

図５は、実施例２の分析方法の流れを示す概念図である。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）を28℃で培養し、菌体をOD ₆₀₀=1となるように蒸留水に分散させて菌体分散液を得た。この菌体分散液200μＬをスクリューキャップ容器に分注し、同量のジルコニアビーズ（直径0.5 mm）を加えて、冷却しながら2分間破砕処理を行った（矢印Ａ２１０）。ビーズ破砕後、上記スクリューキャップ容器に200μＬの蒸留水を加えて、良く攪拌した後、15000gで5分間遠心分離した（矢印Ａ２２０）。遠心分離により、上清として菌体破砕液が得られ（矢印Ａ２２１）、沈殿として核様体や細胞膜を含むデブリが得られた（矢印Ａ２２２）。

【0065】

遠心分離により得た上清400μＬを遠心式ろ過フィルターを用いて限外ろ過した（矢印２３０）。この限外ろ過では、NMWLが30kDaのフィルターを使って、14000g、10分間の条件で遠心分離し、捕捉画分（リボソーム精製画分）を回収した。具体的には、遠心用のチューブを新しいものに交換し、フィルターを限外ろ過のときとは逆向きに取り付けて、1000g、2分間の条件で遠心分離によりフィルターからリボソーム精製画分を分離した。

【0066】

遠心チューブに得られたリボソーム精製画分50μＬに、同量の2% 酢酸水溶液を加えて、タンパク質を凝集させた（矢印Ａ２４０）。凝集したタンパク質を遠心分離により沈殿させて、上清を除去し、濃縮されたリボソーム精製画分を得た。

【0067】

濃縮されたリボソーム精製画分を含む沈殿に、1% TFAを含む50% ACN水溶液を10μＬ加えて再溶解させた。試料とは別に、10mg/mLとなるように、1% TFAを含む50% ACN水溶液を溶媒としてシナピン酸溶液を調製した。10μＬのシナピン酸溶液に1μＬの濃縮されたリボソーム精製画分を加えてよく混合した。得られた混合溶液1μＬをMALDI-MSのステンレス製試料プレートに滴下して試料－マトリックス混合結晶を質量分析用試料として調製した。調製された質量分析用試料にレーザーを照射してイオン化し、m/z 5000-25000の範囲をMALDI-飛行時間型質量分析により測定した。

【0068】

図６および図７は、実施例２の質量分析で得られたマススペクトルを示す図である。図中、上段が限外ろ過前の菌体破砕液(a)、下段が濃縮されたリボソーム精製画分(b)のマススペクトルである。図７は、図６において矢印Ｒ１で示されたｍ／ｚの範囲のマススペクトルを含む拡大図である。同定されたリボソームタンパク質に対応するピークには、そのリボソームタンパク質の名称を付した。限外ろ過を行った後の試料を質量分析して得られたマススペクトル(b)では、より多くのリボソームタンパク質が同定された。酵母でも限外ろ過によりイオン化抑制を低減させ、高分子量のリボソームタンパク質をより明瞭に検出することができた。

【0069】

（実施例３）
実施例３では、大腸菌のリボソームタンパク質を含む試料を調製し、調製後の分析用試料を質量分析により分析した。

【0070】

大腸菌（Escherichia coli） K12をジルコニア製ビーズ（φ0.5 mm）で2分間破砕処理し、破砕後の液体を15000gで5分間遠心分離して上清を菌体破砕液として得た。この菌体破砕液に対し、NMWL 100kDaの遠心式ろ過フィルターを用いて限外ろ過処理を行った（14000g, 10分間）。限外ろ過処理前の試料（菌体破砕液）と、フィルターに捕捉されたリボソーム精製画分に対し、実施例１と同様の方法で質量分析を行った。

【0071】

図８は、実施例３の質量分析で得られたマススペクトルを示す図である。図中、上段が限外ろ過前の菌体破砕液(a)、下段がリボソーム精製画分(b)のマススペクトルである。各マススペクトルにおいて、帰属されたリボソームタンパク質の数をマススペクトル中に示した（(a)が38、(b)が42）。なお、バーＢｒで示されたｍ／ｚの範囲（１１０００以上）は、相対強度を１０倍に拡大して示している。リボソーム精製画分(b)のマススぺクトルの方が帰属されたリボソームタンパク質の数が1割程度多かった。さらに、高分子量側のピーク強度も菌体破砕液(a)のマススペクトルと比べて強いことが分かる。実施例３の調製方法では、検出が難しい高分子量側のピークをより大きい強度で観測できることが示された。

【0072】

図９は、図８のマススペクトルにおける、リボソームタンパク質に対応する各ピークの相対的なピーク強度（以下、相対ピーク強度と呼ぶ）を示すグラフである。相対ピーク強度は、(a)および(b)で観測されているm/z 8300近辺のピーク（図８中「＊」、以下、基準ピークと呼ぶ）の強度が100%となるように、各マススペクトルにおけるリボソームタンパク質に対応するピークの相対ピーク強度を求めたものである。なお、基準ピークは、リボソームタンパク質に対応するピークではない。実施例３の質量分析では、限外ろ過により得た分析用試料ではリボソームタンパク質が圧倒的に大きな強度で観測されていることが分かる。

【0073】

（実施例４）
実施例４では、異なる分画分子量のフィルターを用いてアクネ菌のリボソームタンパク質を含む分析用試料をそれぞれ調製し、調製後の分析用試料を質量分析により分析した。

【0074】

アクネ菌をジルコニア製ビーズ（φ0.5 mm）で3分間破砕処理し、破砕後の液体を15000gで5分間遠心分離し上清を菌体破砕液として得た。この菌体破砕液を分け、NMWL 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, および100 kDaのフィルターをそれぞれ用いて限外ろ過処理を行った（14000g, 10分間）。限外ろ過処理前の試料（菌体破砕液）と、各フィルターに捕捉されたリボソーム精製画分と、各フィルターを通過したろ液とに対し、実施例１と同様の方法で質量分析を行った。

【0075】

図１０は、菌体破砕液(a)と、NMWL 10 kDa(b), 30 kDa(c), 50 kDa(d), および100 kDa(e)のフィルターにそれぞれ捕捉されたリボソーム精製画分のマススぺクトルを示す図である。例えば、矢印Ａ９１により示したm/z 7040付近における各マススペクトルのピーク、および、矢印Ａ９２により示したm/z 10500付近における各マススペクトルのピークの強度は、NMWLが大きいフィルターほど小さくなっている。これらは、リボソームタンパク質として帰属されていないピークである。よって、限外ろ過により、リボソームを構成していない成分がろ過され、リボソームタンパク質が明瞭に観測されたと考えられる。

【0076】

図１１は、NMWL 10 kDa(b), 30 kDa(c), 50 kDa(d), および100 kDa(e)のフィルターでそれぞれろ過されたろ液を質量分析して得られたマススぺクトルを示す図である。NMWLが大きいフィルターほど、観測ピークが増加していることが分かる。例えば、各マススペクトルにおける、m/z 7040付近のピーク（矢印Ａ９１）やm/z 10500付近のピーク（矢印Ａ９２）など、図１０でフィルターのNMWLが大きいほど小さい強度で検出されていたピークが、ろ過画分ではNMWLが大きい程大きい強度で検出されていることが分かる。ろ過画分で観測されたタンパク質は、酵素の他、同定されていないものもあるが、少なくともリボソームタンパク質としては帰属されていない。従って、少なくとも実施例４の条件では、リボソームタンパク質を効率よく測定するには、NMWLが大きい方が好ましいことが分かる。

【符号の説明】

【0077】

１０…試料リザーバー、１１…フィルター、２０…ろ液レシーバー、１００…限外ろ過ユニット、Ｂａ…バクテリア、Ｃｍ…細胞膜、Ｃｐ…細胞質成分、Ｎｕ…核様体、Ｒｂ…リボソーム、Ｓ…試料。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】