▶ コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジーの特許一覧
特許7168151ナチュラルキラー細胞の大量生産方法及びその方法により得られたナチュラルキラー細胞の抗癌剤としての用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-31
(45)【発行日】2022-11-09
(54)【発明の名称】ナチュラルキラー細胞の大量生産方法及びその方法により得られたナチュラルキラー細胞の抗癌剤としての用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20221101BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221101BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221101BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221101BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221101BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20221101BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
A61K35/17 A
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K9/08
A61K9/10
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2019178623
(22)【出願日】2019-09-30
(62)【分割の表示】P 2017536867の分割
【原出願日】2016-01-15
(65)【公開番号】P2020022467
(43)【公開日】2020-02-13
【審査請求日】2019-10-30
(31)【優先権主張番号】PCT/KR2015/000854
(32)【優先日】2015-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】505448855
【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】チェ、 イン ピョ
(72)【発明者】
【氏名】ユン、 ソク ラン
(72)【発明者】
【氏名】イ、 スーヨン
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５３２４６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Choi, I., et al.，Donor-Derived Natural Killer Cells Infused after Human Leukocyte, Antigen-Haploidentical Hematopoiet，Biology of blood and marrow transplantation，2014年，Vol.20, No.5，pp.696-704
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，2003年，ｖｏｌ．２８０，ｐ．１３５－１３８
【文献】許 南浩 編，細胞培養なるほどＱ＆Ａ，第９刷，2013年05月15日，ｐ．６８－６９
【文献】医学のあゆみ，1985年04月13日，第１３３巻第２号，ｐ．１１２－１１３
【文献】黒木登志夫 監修，改訂 培養細胞実験ハンドブック，第２版第４刷，株式会社羊土社，2014年02月20日，ｐ．８４－８５
【文献】ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ．，ＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｒ） ＣＳ２、ＣＳ５ ａｎｄ ＣＳ１０ ＦＲＥＥＺＥ ＭＥＤＩＡ，2021年03月17日，インターネット、 ＜URL:https://www.biolifesolutions.com/wp-content/uploads/2014/11/6012_06-CryoStor-Product-Information-Sheet.pdf＞
【文献】Rham, C., et al.，The proinflammatory cytokines IL-2, IL-15 and IL-21 modulate the repertoire of mature human natural，Arthritis Research & Therapy，2007年，Vol.9, No.6，R125, pp.1-15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
１）ＣＤ３陽性のＴ細胞と赤血球とを交差結合させた後、遠心分離に際して、密度勾配を用いてＣＤ３陰性細胞を分離することにより、単核球から前記ＣＤ３陽性のＴ細胞を除去して前記ＣＤ３陰性細胞を収得するステップ；２）ステップ１）で収得した前記ＣＤ３陰性細胞を、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１からなるサイトカインと混合処理した後、１０乃至２４日間培養してＮＫ細胞へ分化させるステップ；並びに
３）ステップ２）で培養された前記ＮＫ細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、及び無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）及びさらに凍結保護剤を含む冷凍保存培地において冷凍して、２ヶ月以内の期間凍結保存するステップであって、前記冷凍保存培地はＣｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０であり、前記冷凍は－７０℃を経て－２００℃へと段階的に温度を下げることにより行われるステップ
を含む、冷凍保存ＮＫ細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ、以下、「ＮＫ細胞」という）の大量生産方法及びその方法により得られたＮＫ細胞の抗癌剤としての用途に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍治療のために手術、放射線治療、化学療法などの様々な治療法が発展してきたが、腫瘍の種類によっては頻繁な再発が深刻な問題となっている。これにより、患者の免疫機能を用いた細胞治療の可能性が提起された。
【0003】
腫瘍を除去する免疫反応は、様々な機能を持つ免疫細胞の複雑な相互作用を介して起こる。腫瘍細胞を直接削除する免疫細胞としては、ＮＫ細胞や細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）が挙げられ、これらのエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）に抗原を提示する抗原提示細胞としては、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）やＢ細胞が挙げられ、その他に、各種サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を分泌するヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）、調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）などがともに作用する。
【0004】
前記免疫システムを構成する細胞のうち、ＮＫ細胞は、リンパ球の一種であり、人体内骨髄、脾臓、末梢リンパ節及び末梢血に分布し、末梢血の場合、リンパ球の約１０％がＮＫ細胞であることが知られている（Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２５７－２８６，２００６）。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６に対して陽性であるが、ＣＤ３に対して陰性である。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞とは異なり、前に露出した刺激や主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に制限なく腫瘍細胞またはウイルスに感染した細胞を殺害し、細胞クローンによる受容体の再配列も示されていない（Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：６３３－６４０，２００１）。ＮＫ細胞が細胞を殺害する過程は、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）及びグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）を有する細胞質性顆粒の排出とＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びトレイル（ＴＲＡＩＬ）を含む過程と関連している。ＮＫ細胞は、様々なサイトカイン、特にＩＦＮ－γ、ＩＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－１０を分泌し、細胞表面に複数の受容体を発現し、これらの受容体は、細胞吸着、細胞殺害能力の活性化、または細胞殺害能力の抑制に関与する。また、ＮＫ細胞は、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ：Ｋｉｌｌｅｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ）によりＭＨＣクラスＩ分子を認識するが、この場合、大多数のＫＩＲは細胞殺害抑制受容体であり、このような抑制受容体によりＭＨＣクラスＩ分子が認識されなければ、細胞の殺害が行われる。
【0005】
このようなＮＫ細胞の殺害能力は、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ：ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）と共に、固形癌治療に用いられるか、あるいは供与者リンパ球注入（ｄｏｎｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を介した免疫治療法（Ｔｉｌｄｅｎ．ＡＢ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：３９１０－３９１５，１９８６；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉａ，８４：１１１０－１１４９，１９９９）を行うことにより、骨髄移植時や臓器移植時に発生する拒絶反応を防止するための新たな細胞治療法に応用されている。また、ＮＫ細胞の分化及び活性における欠陥は、乳癌（Ｋｏｎｊｅｖｉｃ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，６６：２５５－２６３，２００１）、黒色腫癌（Ｒｙｕｋｅ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．，１３：３４９－３５６，２００３）、肺癌（Ｖｉｌｌｅｇａｓ ＦＲ．，ｅｔ ａｌ．， Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，３５：２３－２８，２００２）など多様な癌疾患と関連していると報告されていて、そのような疾患を治療するためにＮＫ細胞治療法が注目されている。
【0006】
しかし、正常な状態で体内に存在する大部分のＮＫ細胞は、不活性化状態（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）で存在する。しかしながら、実際にＮＫ細胞を治療用途に用いるためには、活性化したＮＫ細胞が必要であるため、正常血液からまたは不活性化した患者血液からＮＫ細胞を活性化させる研究が活発に行われている。
【0007】
体外でＮＫ細胞を活性化させることで達成される、ＮＫ細胞の高い細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によるＮＫ細胞の免疫細胞治療の可能性が確認されている。体外で活性化されたＮＫ細胞を、様々な種類の癌、特に白血病などの血液癌を対象として、同種骨髄移植後に投与することで、その治療効果が確認されたという報告（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆Ｄｉｓｅａｓｅ，３３：２６１－２６６，２００４）はあるが、血液癌でなく固形癌に対しては、ＮＫ細胞に対して臨床的に確実な治療効果が未だに立証されていない。具体的に、ＮＫ細胞を腫瘍が生じる前から投与することで、腫瘍の生着を抑えることができるという報告があるが（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５６（１１）：１７３３－１７４２，２００７）、適した治療モデルとはいえず、腹腔内にＮＫ細胞を投与することで乳癌細胞の成長を阻害した動物実験結果もあるが、ＮＫ細胞による効果であるかが不明である（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，１０４（３）：２６７－２７５，２００７）。
【0008】
また、ＮＫ細胞を抗癌免疫細胞治療法に効果的に利用するためには、多数のＮＫ細胞の確保が必要である。しかし、ＮＫ細胞は、血液中のリンパ球の１０～１５％を占めており、癌患者においては、多くの場合、ＮＫ細胞の数、分化、及び機能が低下しているため、事実上、十分な細胞数の確保が難しいのが現状である。したがって、ＮＫ細胞の増殖または分化を通じて多量のＮＫ細胞を確保することが切実に求められている。
【0009】
ＮＫ細胞は、骨髄の造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＨＳＣ）から由来されると知られている。試験管内 （ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では、臍帯血から造血幹細胞を分離し、その分離された細胞を適切なサイトカインを処理して培養することにより、ＮＫ細胞に分化させる方法が報告されている（Ｇａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：４５９－４７３，１９９５；Ｍｒｏｚｅｋ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８７：２６３２－２６４０，１９９６； Ｓｉｖｏｒｉ， Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：３４３９－３４４７，２００３；Ｂ．Ｇｒｚｙｗａｃｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０８：３８２４－３８３３，２００６） 。すなわち、ＣＤ３４＋ＨＳＣにＦｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－７、ＳＣＦ及びＩＬ－１５を添加して５週間培養後、ＣＤ３－ＣＤ５６＋のＮＫ細胞に分化させることができる。しかし、このような分化方法は、治療に十分な量の細胞を得ることが難しく、分化させるのに多くの時間及びコストがかかるなど、実際臨床に適用するには困難が伴う。サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）受容体のγｃの発現を欠くマウスからＢ細胞とＴ細胞は発見できるが、ＮＫ細胞は発見できないという点で、γｃを有する受容体がＮＫ分化に重要な役割を果たすと知られている（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２，３７７－３８１，１９９５）。受容体のγｃ形状は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１の受容体であり、このうちＩＬ－２は、成熟したＮＫ細胞の増殖と活性化を増進させる機能を有していることが報告されている（Ｓｈｉｂｕｙａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８５，３５３８－３５４６，１９９５）。ＩＬ－２が欠乏した人間とマウスでは、ＮＫ細胞の数が大幅に減少するという報告があるが（ＤｉＳａｎｔｏ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１，１６９７－１７０４，１９９０）、一方では、ＩＬ－２及びＩＬ－２Ｒａ欠乏は、間接的にＮＫ細胞の数と活性化に影響を与えるという研究結果もある。さらに、ＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）鎖はＩＬ－１５の受容体を形成するのに関与すると知られている。
【0010】
ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の分化に関与する。これは、ＩＬ－１５の生成に必要とされる転写因子であるインターフェロン－調節因子１（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ－１，ＩＲＦ－１）が欠乏したマウスでは、ＮＫ細胞が欠乏しており（Ｋｏｕｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９１，７００－７０３，１９９８）、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａが欠乏したマウスでは、ＮＫ細胞が発見されていないということから知られていた。したがって、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞から発現されるＩＬ－１５受容体を介してＮＫ細胞の成長と分化を直接増進させるということが報告されている（ＭｒｏｚｅｋＥ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８７、２６３２－２６４０，１９９６）。
【0011】
ＩＬ－２１は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインであり（Ｎａｔｕｒｅ，５：６８８－６９７，２００５）、ＩＬ－２１の受容体（ＩＬ－２１Ｒ）は、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞などのリンパ球で発現されている（Ｒａｙｎａ ＴＡＫＡＫＩ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：２１６７－ ２１７３，２００５）。ＩＬ－２１は、構造的にＩＬ－２及びＩＬ－１５と非常に類似しており、ＩＬ－２１Ｒは、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１５、ＩＬ－７ＲとＩＬ－４Ｒなどの鎖を共有している（Ａｓａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７：１－５，２００１）。ＩＬ－２１は、骨髄からのＮＫ細胞前駆体の成熟を誘導するものと報告され（Ｐａｒｒｉｓｈ－Ｎｏｖａｋ，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０８：５７－６３，２０００）、特にＮＫ細胞のサイトカイン生成能及び細胞死滅能などのエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を増加させるものと報告されており（Ｍ．Ｓｔｒｅｎｇｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １７０：５４６４－５４６９，２００３； Ｊ．Ｂｒａｄｙ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７２：２０４８－２０５８，２００４）、ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能も増加させることにより、自然、獲得免疫系の抗癌反応を促進させるものと報告されている（Ｒａｙｎａ Ｔａｋａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：２１６７－２１７３，２００５； Ａ．Ｍｏｒｏｚ，ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７３：９００－９０９，２００４）。また、ＩＬ－２１は、人間の末梢血から分離したＮＫ細胞を活性化し（Ｐａｒｒｉｓｈ－Ｎｏｖａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：５７，２０００）、臍帯血から分離した造血幹細胞から成熟したＮＫ細胞を誘導するのに重要な役割を果たすものと報告されている（Ｊ．Ｂｒａｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７２：２０４８，２００４）。
【0012】
一方、上記のようなＮＫ細胞の癌治療剤としての可能性にもかかわらず、体内に存在するＮＫ細胞の数が少ないため、それを癌治療薬として使用するためには、体内で十分な効果を維持することができるほどにそれを大量に生産する技術が不可欠である。しかし、ＮＫ細胞は試験管内での大量増殖及び培養が正常に行われないという問題があり、このため、実際有用なレベルまでＮＫ細胞を増幅及び培養する技術の開発が求められており、そのために多くの研究が進められているが、まだ臨床に適用可能なレベルには達していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
そこで、本発明者らは、より効率的かつ経済的にＮＫ細胞を大量生産する方法を開発している間、単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去し、ＣＤ３陰性細胞を収得した後、前記ＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１などのサイトカインを混合処理した後に培養したとき、従来のＮＫ細胞の製造方法よりも短時間で高純度のＮＫ細胞を大量生産することができ、前記方法により製造された新鮮ＮＫ細胞が、大腸癌、肺癌、肝臓癌及び膵臓癌細胞株を異種移植したマウスモデルで、癌細胞の成長を抑制し、癌細胞の重量を減らし、白血病などの血液癌内においてもその治療効果を示すことを確認することにより、本発明の大量生産方法により生産されたＮＫ細胞が、癌の予防及び治療用薬学的組成物として使用することができるということを確認した。また、前記方法により生産されたＮＫ細胞を用いて実際の癌患者を治療するためのＮＫ細胞の投与量及び投与方法を明らかにした。
【0014】
また、本発明者らは、新鮮ＮＫ細胞を冷蔵保存または冷凍保存する条件によって、冷蔵保存ＮＫ細胞及び冷凍保存ＮＫ細胞が、新鮮ＮＫ細胞と同等のレベルの抗癌効果を示すことを明らかにし、冷蔵保存ＮＫ細胞を単独で使用する場合、冷凍保存ＮＫ細胞を単独で使用する場合、新鮮ＮＫ細胞と混合して使用する場合におけるそれぞれの投与量及び投与方法を明らかにした。
【0015】
また、本発明者らは、ＣＤ３陰性細胞を冷凍保存する条件下によって、冷凍保存されたＣＤ３陰性細胞を解凍させることで新鮮ＮＫ細胞を製造することができるということを確認した。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明は、
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；を含む、新鮮（ｆｒｅｓｈ）ＮＫ細胞の製造方法であって、
前記ステップ１）は、ＣＤ３陽性のＴ細胞と赤血球を交差結合させた後、遠心分離に際して、密度勾配を用いてＣＤ３陰性細胞を分離することにより行われる方法を提供する。
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；を含む、新鮮（ｆｒｅｓｈ）ＮＫ細胞の製造方法であって、
前記ステップ１）は、ＣＤ３陽性のＴ細胞と赤血球を交差結合させた後、遠心分離に際して、密度勾配を用いてＣＤ３陰性細胞を分離することにより行われる方法を提供する。
【0017】
本発明において、前記ステップ１）のＣＤ３陽性のＴ細胞と赤血球を交差結合させた後、遠心分離に際して、密度勾配を用いて行われるＣＤ３陰性細胞の分離は、ＣＤ３陰性細胞を用いる抗体を使用して行うことができ、たとえば、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が製造、販売しているＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌという製品を用いて行うことができる。前記製品は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、及びグリコフォリンＡ（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ）を認識する四量体抗体（ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のカクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）である。ＣＤ３陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ１９陽性細胞、ＣＤ３６陽性細胞、ＣＤ６６ｂ陽性細胞、ＣＤ１２３陽性細胞は、グリコフォリンＡを発現する赤血球と共に四量体抗体に結合して交差結合を形成する。その後、遠心分離を行うと、前記細胞は、密度勾配によってペレット状になり、上層部においてＣＤ３陰性のＮＫ細胞が高濃度で密集した培地を収得することができる。
【0018】
本発明の一具現例において、前記ステップ２）の培養は、細胞数を１×１０６個／ｍｌの濃度を維持して培養してもよいが、細胞の形状及び活性に異常を示さない限り、通常の当業者が任意に調節することができる。
【0019】
本発明の一具現例において、前記ステップ２）の培養は、１０乃至２４日間培養してもよいが、培養された細胞がＣＤ３－ＣＤ５６＋の特徴を示すことを確認することにより培養期間を決定することができる。
【0020】
本発明の一具現例において、前記ステップ２）の培養は、細胞数を１×１０６個／ｍｌの濃度を維持して培養してもよい。
【0021】
本発明の一具現例において、前記ステップ２）の培養は、１０乃至２４日間の培養であってもよい。
【0022】
前記方法において、前記ステップ２）の培養は、静置培養（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）または浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）の方法を用いてもよい。ここで、静置培養とは、培養器に攪拌（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）または振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）せずに放置した状態で培養することをいい、浮遊培養とは、通気（ａｅｒａｔｉｏｎ）や攪拌などにより細胞が反応器の下部または側面に付着されずに懸濁された状態で培養することをいう。また、静置培養用の反応器と浮遊培養用の反応器として、同一のものを用いてもよく、異なるものを用いてもよい。例えば、静置培養用の反応器及び浮遊培養用の反応器として同一のものを用いた場合では、同一の反応器で静置培養が完了した後、サイトカインなどの必要な栄養成分を含む培地をさらに供給して浮遊培養方法で培養することが可能であり、それとも異なるものを用いた場合では、静置培養が完了した後、培養物を浮遊培養用の反応器に移して浮遊培養してもよい。
【0023】
本発明において、前記新鮮ＮＫ細胞はＣＤ３－ＣＤ５６＋であってもよい。
【0024】
本発明において、前記ＮＫ細胞としては、臍帯血、骨髄または末梢血単核球から由来したものが望ましいが、ＣＤ３陰性細胞であれば、いずれの種類の細胞も前駆体として使用することができる。
【0025】
本発明では、前記方法により製造された新鮮ＮＫ細胞を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物を製造する。
【0026】
本発明において、前記薬学的組成物は、「細胞治療剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」を意味する。本発明の用語「細胞治療剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、個体から分離、培養及び特殊な操作により製造された細胞及び組織であって、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定）として、細胞や組織の機能を復元させるために生きている自家、同種、又は異種細胞を体外で増殖・選別、或いは他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を行い、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品のことをいう。
【0027】
本発明において、前記癌は、ＮＫ細胞によって治療可能な癌であれば制限はなく、例えば、肝臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、リンパ腫からなる群から選択されたいずれか一つの癌であってもよく、好ましくは、大腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌及び白血病からなる群から選択されたいずれか一つの癌であってもよい。
【0028】
本発明の一具現例において、前記組成物は、新鮮ＮＫ細胞を１×１０５個以上、３×１０５個以上、３×１０６個以上、１×１０６個以上、３×１０６個以上、 ６×１０６個以上、または１×１０７個以上含むことができる。
【0029】
本発明の一具現例において、前記組成物は、ＩＬ－２をさらに含むことができる。
【0030】
本発明において、前記組成物は、１４乃至４２日の間隔、好ましくは１４日乃至３５日の間隔、より好ましくは１４日乃至３０日の間隔で投与されてもよい。しかし、投与間隔は、これらに限定されるものではない。
【0031】
本発明の一具現例において、前記組成物は、週１回で４週間投与されるか、週２回で２週間投与されてもよい。
【0032】
本発明の一具現例において、前記組成物は、新鮮ＮＫ細胞を３×１０６個含み、週１回で４週間投与されてもよい。
【0033】
本発明の他の具現例において、前記組成物は、新鮮ＮＫ細胞を３×１０６個含み、週２回で２週間投与されてもよい。
【0034】
本発明のまた他の具現例において、前記組成物は、新鮮ＮＫ細胞を６×１０６個含み、週１回で２週間投与されてもよい。
【0035】
本発明は、
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；
３）前記ＣＤ３陰性細胞を１５時間以下の間、４℃で保存するステップと；を含む、冷蔵保存ＮＫ細胞の製造方法であって、
前記ステップ１）は、ＣＤ３陽性のＴ細胞と赤血球を交差結合させた後、遠心分離に際して、密度勾配を用いてＣＤ３陰性細胞を分離することにより行われる方法を提供する。
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；
３）前記ＣＤ３陰性細胞を１５時間以下の間、４℃で保存するステップと；を含む、冷蔵保存ＮＫ細胞の製造方法であって、
前記ステップ１）は、ＣＤ３陽性のＴ細胞と赤血球を交差結合させた後、遠心分離に際して、密度勾配を用いてＣＤ３陰性細胞を分離することにより行われる方法を提供する。
【0036】
本発明において、前記ステップ３）の保存時間は１５時間以下、例えば１２時間以下、例えば１０時間以下であってもよい。しかし、保存時間は、これらに限定されるものではない。
【0037】
本発明において、前記冷蔵保存ＮＫ細胞はＣＤ３－ＣＤ５６＋であってもよい。
【0038】
本発明は、前記方法により製造された冷蔵保存ＮＫ細胞を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物を製造する。
【0039】
本発明において、前記癌は、大腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、及び白血病からなる群から選択されたいずれか１つの癌であってもよい。しかし、癌の種類は、これらに限定されるものではなく、ＮＫ細胞によって予防、改善または治療できる癌であればいずれも含まれる。
【0040】
本発明の一具現例において、前記組成物は、冷蔵保存ＮＫ細胞を１×１０５個以上、３×１０５個以上、３×１０６個以上、１×１０６個以上、３×１０６個以上、６×１０６個以上、または１×１０７個以上含むことができる。
【0041】
本発明の一具現例において、前記組成物は、ＩＬ－２をさらに含むことができる。
【0042】
本発明において、前記組成物は、１４乃至４２日の間隔、好ましくは１４日乃至３５日の間隔、より好ましくは１４日乃至３０日の間隔で投与されてもよい。しかし、投与間隔は、これらに限定されるものではない。
【0043】
本発明の一具現例において、前記組成物は、週１回で４週間投与されるか、週２回で２週間投与されてもよい。
【0044】
本発明の一具現例において、前記組成物は、冷蔵保存ＮＫ細胞を３×１０６個含み、週１回で４週間投与されてもよい。
【0045】
本発明の他の具現例において、前記組成物は、冷蔵保存ＮＫ細胞を３×１０６個含み、週２回で２週間投与されてもよい。
【0046】
本発明のまた他の具現例において、前記組成物は、冷蔵保存ＮＫ細胞を６×１０６個含み、週１回で２週間投与されてもよい。
【0047】
本発明は、
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；
３）ステップ２）の培養されたＣＤ３陰性細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地において２ヶ月以内に冷凍するステップであって、前記冷凍は－７０℃から－２００℃に段階的に温度を下げることにより行われるステップと；を含む、冷凍保存ＮＫ細胞の製造方法を提供する。
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；
３）ステップ２）の培養されたＣＤ３陰性細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地において２ヶ月以内に冷凍するステップであって、前記冷凍は－７０℃から－２００℃に段階的に温度を下げることにより行われるステップと；を含む、冷凍保存ＮＫ細胞の製造方法を提供する。
【0048】
本発明の用語「冷凍」とは、本発明のＮＫ細胞を冷凍させる行為を意味する。冷凍に用いられる冷凍媒体としては様々なものがある。例えば、イソプロピルアルコール（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）が含まれている冷凍保存ボックスを用いて行うことができる。しかし、その他の手段を用いて冷凍することも可能である。また、冷凍に際して細胞の損傷を防止するために、凍結保護剤を含む溶液を用いることができる。「凍結保護剤」とは、生物細胞を凍結状態で生きたままで保存する場合、凍害を軽減する目的で媒液に添加させる物質のことであり、前記凍結保護剤は、特に限定されるものではないが、グリセロール、砂糖、グルコースなどを使用することができる。
【0049】
本発明の一具現例において、前記冷凍期間は、２カ月以内、好ましくは６週間以内、より好ましくは１ヶ月以内であってもよい。しかし、冷凍期間はこれらに限定されるものではなく、冷凍保存ＮＫ細胞の効果を維持する範囲内で適切に調整することができる。
【0050】
本発明の一具現例において、前記ステップ３）の冷凍に際して、ＣＤ３陰性細胞の濃度は、１．５×１０７個／ｍｌであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0051】
本発明は、
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；
３）ステップ２）の培養されたＣＤ３陰性細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、及び無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地において２ヶ月以内に冷凍するステップであって、前記冷凍は－７０℃から－２００℃に段階的に温度を下げることにより行われるステップと；
４）前記冷凍保存ＮＫ細胞を３７℃で急速解凍し、冷凍保存培地を洗浄して除去するステップと；を含む、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞の製造方法を提供する。
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）のＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；
３）ステップ２）の培養されたＣＤ３陰性細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、及び無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地において２ヶ月以内に冷凍するステップであって、前記冷凍は－７０℃から－２００℃に段階的に温度を下げることにより行われるステップと；
４）前記冷凍保存ＮＫ細胞を３７℃で急速解凍し、冷凍保存培地を洗浄して除去するステップと；を含む、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞の製造方法を提供する。
【0052】
本発明の用語「解凍」とは、前記冷凍保存されたＮＫ細胞を活用するために、常温に温度を上げて細胞が正常な生理活性を示すようにする行為を意味する。
【0053】
本発明において、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞はＣＤ３－ＣＤ５６＋であってもよい。
【0054】
本発明は、前記方法により製造された、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物を製造する。
【0055】
本発明において、前記癌は、大腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、及び白血病からなる群から選択されたいずれか一つの癌であってもよい。しかし、癌の種類は、これらに限定されるものではない。ＮＫ細胞によって予防、改善または治療することができる癌であればいずれも含まれる。
【0056】
本発明の一具現例において、前記組成物は、解凍された冷凍保存細胞を１×１０５個以上、３×１０５個以上、３×１０６個以上、１×１０６個以上、３×１０６個以上、６×１０６個以上、または１×１０７個以上含むことができる。
【0057】
本発明の一具現例において、前記組成物は、蒸留水または無血清培地をさらに含むことができる。
【0058】
本発明の一具現例において、前記組成物は、ＩＬ－２をさらに含むことができる。
【0059】
本発明において、前記組成物は、１４乃至４２日の間隔、好ましくは１４日から３５日の間隔、より好ましくは１４日乃至３０日の間隔で投与されてもよい。しかし、投与間隔は、これらに限定されるものではない。
【0060】
本発明の一具現例において、前記組成物は、週１回で４週間投与されるか、週２回で２週間投与されるか、週２回で４週間投与されてもよい。
【0061】
本発明の一具現例において、前記組成物は、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞を３×１０６個含み、週１回で４週間投与されてもよい。
【0062】
本発明の他の具現例において、前記組成物は、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞を３×１０６個含み、週２回で２週間投与されてもよい。
【0063】
本発明のまた他の実施例において、前記組成物は、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞を６×１０６個含み、週１回で２週間投与されてもよい。
【0064】
また、本発明は、
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）で得られたＣＤ３陰性細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地において２ヶ月以内に冷凍するステップであって、前記冷凍は－７０℃から－２００℃に段階的に温度を下げることにより行われるステップと；
３）ステップ２で冷凍されたＣＤ３陰性細胞を解凍するステップと；
４）ステップ３）の解凍されたＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；を含む、冷凍されたＣＤ３陰性細胞からＮＫ細胞を製造する方法を提供する。
１）単核球からＣＤ３陽性のＴ細胞を除去してＣＤ３陰性細胞を収得するステップと；
２）ステップ１）で得られたＣＤ３陰性細胞を、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地において２ヶ月以内に冷凍するステップであって、前記冷凍は－７０℃から－２００℃に段階的に温度を下げることにより行われるステップと；
３）ステップ２で冷凍されたＣＤ３陰性細胞を解凍するステップと；
４）ステップ３）の解凍されたＣＤ３陰性細胞にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を混合処理した後、培養するステップと；を含む、冷凍されたＣＤ３陰性細胞からＮＫ細胞を製造する方法を提供する。
【0065】
本発明において、前記方法によって冷凍されたＣＤ３陰性細胞から製造されたＮＫ細胞は、新鮮ＮＫ細胞と同等の性質及び効果を有する。したがって、新鮮ＮＫ細胞と同様に、癌の予防及び治療用組成物の有効成分として使用することができる。
【0066】
本発明は、前記説明した本発明の方法により製造された新鮮ＮＫ細胞及び解凍されたＮＫ細胞を有効成分として含む癌の予防及び治療用組成物を提供する。
【0067】
本発明の一具現例において、前記新鮮ＮＫ細胞及び前記解凍されたＮＫ細胞は、１回の投与量にそれぞれ１×１０５個以上、３×１０５個以上、３×１０６個以上、１×１０６以上、３×１０６個以上、６×１０６個以上、または１×１０７個含まれることができる。
【0068】
本発明の一具現例において、前記新鮮ＮＫ細胞及び前記解凍された冷凍保存ＮＫ細胞は、それぞれ週１回で４週間投与されるか、週２回で２週間投与されるか、週２回で４週間投与されてもよい。好ましくは、前記新鮮ＮＫ細胞は、週１回で１週間投与され、前記解凍された冷凍保存ＮＫ細胞は、週２回で３週間投与されてもよい。しかし、投与方法は、適切に調整することができる。
【0069】
本発明の薬学的組成物は、有効成分に加えて、薬剤学的に適合して生理学的に許容される補助剤を使用して製造することができ、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被複剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などを使用することができる。
【0070】
本発明による組成物は、投与のために、前記記載した有効成分に加えて、薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含む薬学的組成物として製剤化することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、靜菌劑などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑油を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するできるように標的器官特異的抗体またはその他のリガンドを前記担体と結合させて使用することができる。さらに、当該技術分野の適正な方法、またはレミントンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じてまたは成分によって好適に製剤化することができている。
【0071】
本発明の薬学的組成物は、液剤、懸濁剤、分散液、乳剤、ゲル剤、注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤などであってもよく、好ましくは、注射剤であってもよい。
【0072】
本発明の薬学的組成物を注射剤として製剤化する場合、注射剤の処方の流通による製品の安定性を確保するために注射剤として使用可能な酸水溶液またはリン酸塩などの緩衝溶液を用いてｐＨを調節することにより、物理的にも化学的にも非常に安定した注射剤として製造することができる。
【0073】
より具体的には、前記注射剤は、安定化剤または溶解補助剤とともに注射用水に溶解させた後、滅菌処理、特に高温減圧滅菌法または無菌ろ過法によって滅菌処理して製造することができる。前記注射用水としては、注射用蒸留水または注射用緩衝溶液、例えば、ｐＨ３．５乃至７．５の範囲のリン酸塩緩衝溶液またはリン酸水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）－クエン酸緩衝溶液を使用することができる。使用されるリン酸塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩の形態であるか、無水物または水和物の形態であってもよく、クエン酸または無水物または水和物の形態であってもよい。
【0074】
また、本発明に用いられる安定化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム （ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｓｕｌｆｉｔｅ）、 重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）またはエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含み、溶解補助剤は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、炭酸ナトリウム（ＮａＣＯ３）または水酸化カリウム（ＫＯＨ）などの塩基、または塩酸（ＨＣＬ）または酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）などの酸を含む。
【0075】
本発明に係る注射剤は、生体吸収性、生体分解性、生体適合性によって剤形化することができる。生体吸収性とは、注射剤が体内で、分散された注射剤の分解または分解せずに、初期の適用から消えることを意味する。生体分解性とは、加水分解または酵素分解により注射剤が体内で破砕または分解され得ることを意味する。生体適合性とは、成分のすべてが体内で無毒性であることを意味する。
【0076】
本発明に係る注射剤は、通常の充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤などを使用して製造することができる。
【0077】
本発明の組成物または有効成分は、目的に応じて静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔内、皮下、子宮内硬膜、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路などを通して通常の方法で投与することができ、好ましくは、静脈内に投与することができる。本発明の組成物または有効成分は、注射またはカテーテルを用いて投与することができる。
【0078】
本発明の組成物において、有効成分の投与量は、体重６０ｋｇ成人基準で１×１０１－ １×１０５０個／ｋｇ、好ましくは１×１０１－１×１０３０個／ｋｇ、より好ましくは１×１０５－１×１０２０個／ｋｇ、最も好ましくは１×１０７－１×１０９個／ｋｇの範囲内で調節することができる。ただし、投与される最適の投与量は、当業者によって容易に決定されることができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他成分の含有量、剤形の種類、及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物を含む多様な因子によって調節されることができる。
【0079】
本発明の組成物において、有効成分は、組成物の総重量に対して０．００１乃至５０重量％で含有されることができる。しかし、含有量は、これらに限定されるものではない。
【0080】
本発明の組成物は、１以上の抗癌剤をさらに含むことができる。
【0081】
本発明は、新鮮ＮＫ細胞を、癌治療が必要な対象体に対して治療学的に有効な量で投与して癌を予防または治療する方法を提供する。
【0082】
本発明において、癌治療が必要な対象体としては、人間を含む哺乳類であり得る。例えば、人間、犬、猫、馬などであり得る。
【0083】
本発明は、冷蔵保存ＮＫ細胞を、癌治療が必要な対象体に対して治療学的に有効な量で投与して癌を予防または治療する方法を提供する。
【0084】
本発明は、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞を、癌治療が必要な対象体に対して治療学的に有効な量で投与して癌を予防または治療する方法を提供する。
【0085】
本発明の用語「治療学的に有効な量」とは、研究者、獣医師、医師または他の臨床医によって考えられる動物またはヒトからの生物学的または医学的反応を誘導する活性成分または薬学的組成物の量を意味するものであり、これは治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上の有効な投与量及び投与回数は、所望の効果に応じて変化するものであることは、当業者にとって自明である。
【0086】
本発明は、癌治療のための医薬を製造するための新鮮ＮＫ細胞の用途を提供する。
【0087】
本発明は、癌治療のための医薬を製造するための冷蔵保存ＮＫ細胞の用途を提供する。
【0088】
本発明は、癌治療のための医薬を製造するための解凍された冷凍保存ＮＫ細胞の用途を提供する。
【発明の効果】
【0089】
本発明の方法を用いれば、新鮮ＮＫ細胞を、従来の方法よりも短時間で高純度で得ることができ、また、新鮮ＮＫ細胞と同等の効能を有する冷蔵保存ＮＫ細胞、冷凍保存ＮＫ細胞を製造することができる。さらに、冷凍保存されたＣＤ３陰性細胞から新鮮ＮＫ細胞と同等の効能を持つＮＫ細胞を製造することができる。
【0090】
本発明の方法により製造された新鮮ＮＫ細胞、冷蔵保存ＮＫ細胞、及び冷凍保存ＮＫ細胞は、大腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌及び白血病を含む様々な癌に対して治療効果を示し、細胞治療剤として有用に使用されることができる。
【0091】
また、本発明では、本発明の新鮮ＮＫ細胞、冷蔵保存ＮＫ細胞、及び冷凍保存ＮＫ細胞を細胞治療剤の薬学的組成物として使用する場合、優れた効果を示す用法及び用量を確立した。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図2a】培養１０日目に新鮮ＮＫ細胞（Ｆｒｅｓｈ ＮＫ細胞、１０日目）を冷凍保存した後、再度解凍させた、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞の解凍直後の生存率を示した図である。
【図2b】分化度を示した図である。
【図2c】ＮＫ細胞受容体を示した図である。
【図2d】殺傷能を確認した図である。
【図2e】冷凍後に解凍させたＣＤ３陰性細胞を分化させて製造したＮＫ細胞の解凍直後の細胞回収率を確認した図である。
【図2f】解凍後、培養時の細胞数の増加率を確認した図である。
【図2g】生存率を確認した図である。
【図2h】分化度及びＮＫ細胞受容体を確認した図である。
【図3a】ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ：ナチュラルキラー細胞）の濃度別の検出限界を測定するために、マウス体内でのＮＫ細胞の検出を確認した図である。Ｖ．Ｃ（５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））：溶媒対照群。
【図3b】ＮＫ細胞の濃度別の検出限界を測定するために、マウスの腹部内の主要な臓器を摘出して、ＮＫ細胞の検出を確認した図である。Ｖ．Ｃ（５％ＨＳＡ）：溶媒対照群。
【図3c】ＮＫ細胞の組織内分布を確認するために、マウスの腹部内の主要な臓器を摘出して、ＮＫ細胞の分布を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群。
【図3d】時間に応じたＮＫ細胞のマウス体内分布を確認した図である。
【図4a】ＮＫ細胞の投与による大腸癌に対する抗癌効果を確認するための投与スケジュールを示す図である。
【図4b】ＮＫ細胞単独またはＩＬ－２との併用処理時に、ＮＫ細胞数に応じた大腸癌に対する腫瘍サイズの抑制効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、及びＡＤＲ：アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）処理群。
【図4c】ＮＫ細胞単独またはＩＬ－２との併用処理時に、ＮＫ細胞の数に応じた大腸癌に対する腫瘍重量の減少効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、及びＡＤＲ：アドリアマイシン処理群。
【図5a】ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる抗癌効果を確認するための投与スケジュールを示した図である。
【図5b】ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる大腸癌に対する腫瘍サイズの抑制効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、ＮＫ－Ｆ：新鮮（ｆｒｅｓｈ）ＮＫ細胞処理群、ＮＫ－Ｗ／ｏＲ－Ｆ：新鮮ＮＫ細胞（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ無し、すなわちｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）処理群、ＮＫ－４℃：４℃冷蔵保存されたＮＫ細胞処理群、ＮＫ－Ｗ／ｏＲ－４℃：４℃冷蔵保存されたＮＫ細胞（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ無し）処理群、及びＡＤＲ：アドリアマイシン処理群。
【図5c】ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる大腸癌に対する腫瘍重量の減少効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、ＮＫ－Ｆ：新鮮（Ｆｒｅｓｈ）ＮＫ細胞処理群、ＮＫ－Ｗ／ｏＲ、Ｆ：新鮮ＮＫ細胞（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ無し）処理群、ＮＫ－４℃に保存：４℃冷蔵保存されたＮＫ細胞処理群、ＮＫ－Ｗ／ｏＲ、４℃保存：４℃冷蔵保存されたＮＫ細胞（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ無し）処理群、及びＡＤＲ：アドリアマイシン処理群。
【図6a】ＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果を確認するための投与スケジュールを示した図である。
【図6b】ＮＫ細胞の冷凍有無による大腸癌に対する腫瘍サイズの抑制効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、ＮＫ細胞－生（Ｌｉｖｅ）（４）：新鮮ＮＫ細胞株を４回投与した投与群、ＮＫ細胞－生（Ｌｉｖｅ）（１）＋（３）凍結：新鮮ＮＫ細胞株を１回及び解凍された冷凍保存細胞株を３回混合投与した投与群、Ｖ．Ｃ（無血清培地）：無血清培地対照群、ＮＫ細胞－凍結（４）：解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を４回投与した投与群、ＮＫ細胞－凍結（８）：解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を８回投与した投与群、及びＡＤＲ：アドリアマイシン処理群。
【図6c】ＮＫ細胞の冷凍有無による大腸癌に対する腫瘍重量の減少効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、ＮＫ生（Ｌｉｖｅ）（４）：新鮮ＮＫ細胞株を４回投与した投与群、ＮＫ生（Ｌｉｖｅ）（１）＋（３）凍結：新鮮ＮＫ細胞株を１回及び解凍された冷凍保存細胞株を３回混合投与した投与群、Ｖ．Ｃ（無血清培地）：無血清培地対照群、ＮＫ凍結（４）細胞：解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を４回投与した投与群、ＮＫ凍結（８）細胞：解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を８回投与した投与群、及びＡＤＲ ２ｍｐｋ：アドリアマイシン処理群。
【図7a】ＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果を確認するための投与スケジュールを示した図である。
【図7b】ＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた大腸癌に対する腫瘍サイズの抑制効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ（５％ＨＳＡ）：溶媒対照群、ＮＫ新鮮（４）細胞：新鮮ＮＫ細胞株を４週間に４回投与した投与群、ＮＫ新鮮（２）細胞：新鮮ＮＫ細胞株を４週間に２回投与した投与群、ＮＫ新鮮（１）＋（６）凍結細胞：新鮮ＮＫ細胞株を１回投与した後、解凍された冷凍保存細胞株を６回混合投与した投与群、ドキソルビシン．ＨＣＬ、Ｖ．Ｃ（無血清培地）：無血清培地対照群、ＮＫ凍結（８）細胞（無血清培地）：無血清培地に解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を８回投与した投与群、Ｖ．Ｃ（蒸留水）：滅菌蒸留水対照群、ＮＫ凍結（８）細胞（蒸留水）：滅菌蒸留水に解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を８回投与した投与群。
【図7c】ＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた大腸癌に対する腫瘍重量の減少効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ（５％ＨＳＡ）：溶媒対照群、ＮＫ新鮮（４）細胞：新鮮ＮＫ細胞株を４週間に４回投与した投与群、ＮＫ新鮮（２）細胞：新鮮ＮＫ細胞株を４週間に２回投与した投与群、ＮＫ新鮮（１）＋（６）凍結細胞：新鮮ＮＫ細胞株を１回投与した後、解凍された冷凍保存細胞株を６回混合投与した投与群、ドキソルビシン．ＨＣＬ、Ｖ．Ｃ（無血清培地）：無血清培地対照群、ＮＫ凍結（８）細胞：無血清培地に解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を８回投与した投与群、Ｖ．Ｃ（蒸留水）：滅菌蒸留水対照群、ＮＫ凍結（８）細胞：滅菌蒸留水に解凍された冷凍保存ＮＫ細胞株を８回投与した投与群。
【図8a】ＮＫ細胞の細胞数に応じた肺癌に対する抗癌効果を確認するための投与スケジュールを示した図である。
【図8b】ＮＫ細胞の細胞数に応じた肺癌に対する腫瘍サイズの抑制効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、及びＤｏｘ．ｈｃｌ：ドキソルビシン．ＨＣＬ。
【図8c】ＮＫ細胞の細胞数に応じた肺癌に対する腫瘍重量の減少効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、及びＤｏｘ．ｈｃｌ：ドキソルビシン．ＨＣＬ。
【図8d】ＮＫ細胞が腫瘍部位に浸潤することを確認するために、Ｈ－Ｅ染色を行った図である。Ｖ．Ｏ：無血清培地対照群、矢印：死んだ癌細胞、及びＣＡ：癌細胞。
【図8e】ＮＫ細胞が腫瘍部位に浸潤することを確認するために、ＣＤ５６を確認した図である。Ｖ．Ｏ：無血清培地対照群、矢印：ＣＤ５６陽性細胞、及びＣＡ：癌細胞。
【図9a】ＮＫ細胞の肺癌、肝臓癌、及び膵臓癌に対する抗癌効果を確認するための投与スケジュールを示した図である。ＣＢ ＮＫ細胞：臍帯血由来ＮＫ細胞、及びＰＢＬ ＮＫ細胞：末梢血由来ＮＫ細胞。
【図9b】ＮＫ細胞の肺癌（Ａ５４９）、肝臓癌（ＳＮＵ－７０９）及び膵臓癌（ＭＩＡ－ＰａＣａ－２）に対する腫瘍サイズの抑制効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、ＣＢ ＮＫ細胞：臍帯血由来ＮＫ細胞、及びＰＢＬ ＮＫ細胞：末梢血由来ＮＫ細胞。
【図9c】ＮＫ細胞の肺癌（Ａ５４９）、肝臓癌（ＳＮＵ－７０９）及び膵臓癌（ＭＩＡ－ＰａＣａ－２）に対する腫瘍重量の減少効果を確認した図である。Ｖ．Ｃ：溶媒対照群、ＣＢ ＮＫ細胞：臍帯血由来ＮＫ細胞、及びＰＢＬ ＮＫ細胞：末梢血由来ＮＫ細胞。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0093】
以下、本発明を実施例及び実験例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例及び実験例は本発明を例示するものであり、本発明の内容は実施例により限定されるものではない。
但し、下記の実施例及び実験例は本発明を例示するものであり、本発明の内容は実施例により限定されるものではない。
【0094】
＜実施例１＞ＮＫ細胞の製造
病院から研究用として提供された臍帯血、末梢血液（韓国の建陽大学病院産婦人科及び忠南大学病院産婦人科から提供された。各病院ＩＲＢ審査通過）を、ＲＰＭＩ １６４０を用いて２：１に希釈して準備した後、フィコール・パック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）上層部で前記用意された血液を慎重に置いた後、２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して単核球細胞層（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ、ＭＮＣ ｌａｙｅｒ）を得た。前記単核球細胞層から慎重に取った細胞から赤血球を除去し、単核球を収得した。前記収得した単核球にＣＤ３マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加して標識した後、それをＣＳカラム（ｃｏｌｕｍｎ）及びバリオマックス（Ｖａｒｉｏ ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ３陽性細胞を除去し、ＣＤ３陰性細胞を得た。これは、具体的にＣＤ３マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）がＣＤ３ε鎖（ｃｈａｉｎ）を認識し、単核球からＣＤ３陽性細胞を捕捉して磁性を持たせた後、単核球のうち前記マイクロビーズが取り付けられたＣＤ３陽性細胞をして、磁石と反応するＭＡＣＳカラムを通過させることにより、ＣＤ３陽性細胞はカラムに残存し、ＣＤ３陰性細胞のみがカラムを抜け出して分離された。
病院から研究用として提供された臍帯血、末梢血液（韓国の建陽大学病院産婦人科及び忠南大学病院産婦人科から提供された。各病院ＩＲＢ審査通過）を、ＲＰＭＩ １６４０を用いて２：１に希釈して準備した後、フィコール・パック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）上層部で前記用意された血液を慎重に置いた後、２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して単核球細胞層（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ、ＭＮＣ ｌａｙｅｒ）を得た。前記単核球細胞層から慎重に取った細胞から赤血球を除去し、単核球を収得した。前記収得した単核球にＣＤ３マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加して標識した後、それをＣＳカラム（ｃｏｌｕｍｎ）及びバリオマックス（Ｖａｒｉｏ ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ３陽性細胞を除去し、ＣＤ３陰性細胞を得た。これは、具体的にＣＤ３マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）がＣＤ３ε鎖（ｃｈａｉｎ）を認識し、単核球からＣＤ３陽性細胞を捕捉して磁性を持たせた後、単核球のうち前記マイクロビーズが取り付けられたＣＤ３陽性細胞をして、磁石と反応するＭＡＣＳカラムを通過させることにより、ＣＤ３陽性細胞はカラムに残存し、ＣＤ３陰性細胞のみがカラムを抜け出して分離された。
【0095】
生理食塩水で希釈し、細胞数を測定して、数に応じてＣＤ３陽性細胞に交差結合が可能なＲｏｓｅｔｔｅｓｅＴＭを適正量処理し、室温で２０分間混合した。反応が終わった血液を再び２倍に希釈した後、フィコール・パック（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）溶液に層が混ざらないように重畳し、その後、２，０００ｒｐｍで室温にてブレークオフ（ｂｒｅａｋ ｏｆｆ）で２０分乃至３０分間遠心分離した。
【0096】
上層液を除去した後、分離された単核球層を採取して洗浄することでＣＤ３陰性細胞を得た。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ成分は、マウスとラットから由来されたモノクローナル抗体とグリコフォリン（ｇｌｙｃｏｐｏｒｉｎ）Ａ抗体と支持体の役割をするＰ９抗体またはＰ９Ｆ（ａｂ’）抗体が四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成した複合体である。ＣＤ３陰性細胞が分離される過程では、血液に投入されたＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐの四量複合体は、血液内のＣＤ３陽性細胞と交差結合しながらイムノロゼット（ｉｍｍｕｎｏｒｏｓｅｔｔｅ）を形成し、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）よりも密度が大きくなったイムノロゼットは、フィコールを用いた密度勾配遠心分離に際してフィコールの下部に配置され、上部には四量複合体と結合していないＣＤ３陰性細胞が集積して分離される。
【0097】
前記分離されたＣＤ３陰性細胞をＴ７５フラスコに１×１０６細胞／ｍｌの濃度で接種し、α－ＭＥＭ完全培地にＩＬ－１５及びＩＬ－２１を共に処理し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１０日乃至２１日間培養した。培養中の細胞の濃度が２×１０６細胞／ｍｌを超えないようにし、初期使用した条件の培地を使用して、細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度に調節した。４、８、１４、１８及び２１日にそれぞれの細胞数を確認し、４、８、１４、及び２１日順にＣＤ３及びＣＤ５６抗体で染色し、ＣＤ３－ＣＤ５６＋であるＮＫ細胞群の割合を公知の方法でＦＡＣＳ分析した。
【0098】
【0099】
＜実施例２＞冷凍保存ＮＫ細胞の製造
＜２－１＞分化したＮＫ細胞からの冷凍保存ＮＫ細胞の製造
＜実施例１＞の方法で誘導されたＮＫ細胞（培養後１０日）を冷凍保存して冷凍保存ＮＫ細胞を製造した。冷凍保存に際しては、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０）を使用し、分化されたＮＫ細胞を２．２５×１０７細胞／１．５ｍｌ（１．５×１０７細胞／ｍｌ）の濃度で冷凍した。イソプロピルアルコール（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）が含まれている冷凍保存ボックスを用いて冷凍を行い、段階的に－７０℃（Ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）を経て最終的に－２００℃（ＬＮ２）で保存された。
＜２－１＞分化したＮＫ細胞からの冷凍保存ＮＫ細胞の製造
＜実施例１＞の方法で誘導されたＮＫ細胞（培養後１０日）を冷凍保存して冷凍保存ＮＫ細胞を製造した。冷凍保存に際しては、無血清（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ）、無タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ）、無動物性要素（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ）の条件下で１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれている冷凍保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０）を使用し、分化されたＮＫ細胞を２．２５×１０７細胞／１．５ｍｌ（１．５×１０７細胞／ｍｌ）の濃度で冷凍した。イソプロピルアルコール（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）が含まれている冷凍保存ボックスを用いて冷凍を行い、段階的に－７０℃（Ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）を経て最終的に－２００℃（ＬＮ２）で保存された。
【0100】
冷凍保存は平均１ヶ月行われ、使用する直前に、冷凍保存されているＮＫ細胞を３７℃で急速に解凍し、生理食塩水を用いて洗浄して冷凍保存培地を除去する方法により解凍を行った。解凍された冷凍保存ＮＫ細胞は、ＦＡＣＳ分析により、ＣＤ３－ＣＤ５６＋のＮＫ細胞群の割合とＮＫ受容体の割合及び細胞生存率を確認し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ：Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）細胞株に対する殺傷能を確認し、同じ起源を有する新鮮ＮＫ細胞（冷凍保存されていない新鮮ＮＫ細胞）とその特徴を比較した。
【0101】
その結果を、図２ａ（１．生存率）、図２ｂ（２．分化度）、図２ｃ（３．受容体）、図２ｄ（４．殺傷能）に示した。図２ａ乃至図２ｄから、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞は、新鮮ＮＫ細胞と類似の特徴を有することが確認された。
【0102】
＜２－２＞冷凍保存されたＣＤ３陰性細胞からのＮＫ細胞の製造
＜実施例１＞が提示したＣＤ３陰性細胞を収得する方法と同様の方法でＣＤ３陰性細胞を臍帯血から収得し、＜実施例２－１＞が提示した同じ冷凍保存培地を用いて、ＣＤ３陰性細胞を冷凍保存した。ＣＤ３陰性細胞の冷凍保存濃度は２．２５×１０７細胞／１．５ｍｌ（１．５×１０７細胞／ｍｌ）であり、凍結期間は約１ヶ月間であった。
＜実施例１＞が提示したＣＤ３陰性細胞を収得する方法と同様の方法でＣＤ３陰性細胞を臍帯血から収得し、＜実施例２－１＞が提示した同じ冷凍保存培地を用いて、ＣＤ３陰性細胞を冷凍保存した。ＣＤ３陰性細胞の冷凍保存濃度は２．２５×１０７細胞／１．５ｍｌ（１．５×１０７細胞／ｍｌ）であり、凍結期間は約１ヶ月間であった。
【0103】
冷凍保存されたＣＤ３陰性細胞から分化されたＮＫ細胞を得るために凍結細胞を解凍し、＜実施例１＞が提示した方法と同様の方法で細胞を培養した。解凍後０、２、４、７、９、１２日順で細胞数と生存率を確認し、０日、７日、９日順でＣＤ３－ＣＤ５６＋のＮＫ細胞群の割合をＦＡＣＳにより分析した。
【0104】
その結果、冷凍保存されたＣＤ３陰性細胞から得られたＮＫ細胞は、解凍後に得られた細胞の回収率（図２ｅ）、細胞数（図２ｆ）、細胞生存率（図２ｇ）、及び分化度（図２ｈ）の全部分で新鮮ＮＫ細胞と類似の特徴を示すことが確認された。
【0105】
＜実施例３＞ マウスからＮＫ細胞の体内分布度を確認
前記＜実施例１＞で製造された新鮮ＮＫ細胞の組織内分布度を確認するために、次のような実験を行った。
前記＜実施例１＞で製造された新鮮ＮＫ細胞の組織内分布度を確認するために、次のような実験を行った。
【0106】
先ず、ＮＫ細胞の分布度を確認するために、ＮＫ細胞をＤｉＲで標識した。具体的には、３．５μｇ／ｍｌのＤｉＲ（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’、３’－テトラメチルインドトリカルボシアニン、シグマ、米国：１，１’－ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’、３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｔｒｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｕ．Ｓ．Ａ）染料と０．５％エタノールが含まれている１×リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）１０ｍｌに、細胞１×１０７個を浮遊し、３７℃で１時間反応させた。反応が終わった後、その細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、トリパンブルー （ｔｒｙｐｈａｎ ｂｌｕｅ）で染色してＮＫ細胞の体内分布度を確認した。
【0107】
前記ＤｉＲで標識したＮＫ細胞の時間別、日付別の組織内分布度を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウスの静脈に、５％ＨＳＡまたはＤｉＲで標識されたＮＫ細胞を、それぞれ１×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６及び５×１０６細胞の濃度に至るまで注射し、所定時間後、製造社のプロトコルに基づいてライブ動物イメージングシステム （Ｌｉｖｅ ａｎｉｍａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＨＯＴＯＮＥ ＩＭＡＧＥＲ、Ｂｉｏｓｐａｃｅ）を用いて、マウスの全部または剖検により摘出した主要な臓器（肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓）からＮＫ細胞の分布度を確認した。
【0108】
ＤｉＲ標識のＮＫ細胞に対する濃度別検出限界を測定するために、ＤｉＲ標識のＮＫ細胞を注入してから２４時間後にマウス体内での分布度を確認した結果、図３ａに示すように、５×１０４細胞以下の濃度群では、ＤｉＲ標識のＮＫ細胞の分布形態が明らかに示されてなかった。１×１０５細胞以上の濃度群では、マウスの腹部を中心に映像信号が濃度依存的に強く検出された（図３ａ）。また、腹部内の主要な臓器（肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺）を摘出して映像を測定した結果、５×１０４細胞以下の濃度群では、肺でのみＤｉＲ標識のＮＫ細胞の弱い分布が確認されたが、１×１０５細胞以上の濃度群では、肝臓、脾臓、肺で映像信号が濃度依存的に強く検出された（図３ｂ）。
【0109】
次に、ＤｉＲ標識のＮＫ細胞の組織内分布度を確認するために、１×１０７細胞を静脈内に投与してから３０分及び２時間後にそれを測定した結果、図３ｃに示すように、測定開始から腹部を中心にＤｉＲ標識のＮＫ細胞の分布が強く検出され、３０分及び２時間後には溶媒対照群と比較して、それぞれ４倍及び３．８倍高い映像信号が測定された。また、腹部を中心とする主要な臓器である肝臓、脾臓、腎臓、心臓及び肺を摘出して映像を測定した結果、肝臓、脾臓及び肺からＤｉＲ標識のＮＫ細胞の分布が強く検出された（図３ｃ）。特に肝臓では、３０分及び２時間目に溶媒対照群と比較して、それぞれ約９．５倍及び５．１倍高い映像信号が測定された。
【0110】
その後、ＤｉＲ標識のＮＫ細胞を静脈内に投与した１日後からＤｉＲ標識のＮＫ細胞が検出されなくなるまで、１週間に３回測定した結果、図３ｄに示すように、投与後１４日まではＤｉＲ標識のＮＫ細胞が強く検出され、その後は映像信号が弱くなりはじめ、投与後４２日目に測定した映像では、ＤｉＲ標識のＮＫ細胞が検出されなかった（図３ｄ）。前記結果は、本発明の体内に投与されたＮＫ細胞が、生体内で少なくとも３０日まで生存し、肺、肝臓、脾臓などに多く分布することを示す。
【0111】
＜実験例１＞新鮮ＮＫ細胞の投与による大腸癌に対する抗癌効果の確認
＜１－１＞ＮＫ細胞の投与数、ＩＬ－２との併用による腫瘍サイズの抑制の確認
前記＜実施例１＞の方法により製造されたＮＫ細胞の抗癌効果を確認するために、ヒト由来大腸癌細胞株であるＳＷ６２０（韓国生命工学研究院、大韓民国）を異種移植したマウスモデルを用いた。
＜１－１＞ＮＫ細胞の投与数、ＩＬ－２との併用による腫瘍サイズの抑制の確認
前記＜実施例１＞の方法により製造されたＮＫ細胞の抗癌効果を確認するために、ヒト由来大腸癌細胞株であるＳＷ６２０（韓国生命工学研究院、大韓民国）を異種移植したマウスモデルを用いた。
【0112】
具体的には、ＳＷ６２０細胞株を２×１０７細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁した後、 マウス１匹当たり０．３ｍｌずつを右肩甲部と胸壁との間の腋窩部の皮下に注入した。癌細胞株を移植し、２時間後にＮＫ細胞株を３×１０５、１×１０６、３×１０６及び１×１０７細胞／マウスの濃度で注射し始め、この時、ＩＬ－２は、ＰＢＳで希釈して１０，０００μ／マウスの濃度で処理した。実験期間中、週１回の投与スケジュールで合計４回（０日、７日、１４日及び２１日）にわたってマウス当たり０．２ｍｌずつを尾静脈に注射した。その後、腫瘍サイズの変化を測定するために、腫瘍の３方向を、副尺付きノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて薬物投与開始日から剖検日まで合計７回にわたって測定した後、下記の数式１で計算して確認した。
【0113】
【数1】
【0114】
その結果、図４ｂに示すように、溶媒対照群と比較して、ＮＫ細胞を３×１０５、１×１０６、３×１０６及び１×１０７細胞／マウスの濃度で注射した群では、それぞれ２３．８％、５３．４％（ｐ＜０．００１）、５９．４％（ｐ＜０．００１）及び７６．８％（ｐ＜０．００１）の腫瘍の成長抑制効果が確認され、陽性対照群であるアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）を投与した投与群では、５８．３％（ｐ＜０．００１）の腫瘍の成長抑制効果が確認された。また、ＩＬ－２を併用処理したときは、ＮＫ細胞を３×１０５、１×１０６、３×１０６及び１×１０７細胞／マウスの濃度で注射した群では、それぞれ１７．０％、３３．８％（ｐ＜０．０１）、４９．８％（ｐ＜０．０１）及び７３．５％（ｐ＜０．００１）の腫瘍の成長抑制効果が確認された（図４ｂ）。
【0115】
＜１－２＞ＮＫ細胞の投与数、ＩＬ－２との併用による腫瘍重量減少の確認
ＮＫ細胞の投与数、ＩＬ－２との併用による抗癌効果を確認するために薬物を処理したマウスにおける腫瘍の重量を測定した。
ＮＫ細胞の投与数、ＩＬ－２との併用による抗癌効果を確認するために薬物を処理したマウスにおける腫瘍の重量を測定した。
【0116】
前記実験例＜１－１＞と同様の方法でＮＫ細胞単独、またはＮＫ細胞及びＩＬ－２を併用処理した後、２３日目にＣＯ２ガスを用いてマウスを犠牲にして腫瘍を分離し、その重量を化学はかり（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｌａｎｃｅ）を用いて測定し、写真撮影した後、液体窒素で固定した。溶媒対照群と投与群とを比較してその間の統計的有意性を検査するために、全ての測定項目値をｔ－ＴＥＳＴ統計法によって分析した。
【0117】
その結果、図４ｃに示すように、溶媒対照群と比較して、ＮＫ細胞を３×１０５、１×１０６、３×１０６及び１×１０７細胞／マウスの濃度で注射した群では、それぞれ２３．４％、５４．０％、５９．１％（ｐ＜０．０５）及び７８．８％（ｐ＜０．０１）の腫瘍重量の減少効果が確認された（図４ｃ）。また、ＩＬ－２を併用処理したとき、ＮＫ細胞を３×１０５、１×１０６、３×１０６及び１×１０７細胞／マウスの濃度で注射した群では、それぞれ１７．０％、３４．３％、４７．０％及び７５．６％（ｐ＜０．０１）の腫瘍重量の減少が確認され、陽性対照群であるアドリアマイシンを投与した投与群では、５８．２％（ｐ＜０．０５）の腫瘍重量が減少することが確認された（図４ｃ）。
【0118】
＜１－３＞ＮＫ細胞の投与数、ＩＬ－２との併用による毒性の確認
前記＜実験例１－１＞のマウスからＮＫ細胞単独またはＩＬ－２との併用投与による毒性を確認するために、マウスの体重変化及び一般的な症状を観察した。
前記＜実験例１－１＞のマウスからＮＫ細胞単独またはＩＬ－２との併用投与による毒性を確認するために、マウスの体重変化及び一般的な症状を観察した。
【0119】
その結果、溶媒対照群と比較して、ＮＫ細胞単独またはＩＬ－２との併用投与群では、実験期間中に一般症状なしで通常の体重増加が観察されたが、陽性対照群であるアドリアマイシンを投与した投与群では、２１．８％（ｐ＜０．０１）の統計的に有意な体重減少が示された。
【0120】
結論として、本発明のＮＫ細胞は、単独またはＩＬ－２との併用投与に際して、一般的な症状及び体重減少などの毒性を示しておらず、抗癌効果に関しては、ＮＫ細胞単独投与群では、最高７０％以上の優れた腫瘍成長抑制効果を示し、ＩＬ－２との併用投与群では、ＮＫ細胞単独投与群と比較して添加または上昇の効果を示さないことが確認された。
【0121】
＜実験例２＞ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる抗癌効果の確認
＜２－１＞ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる腫瘍サイズの抑制を確認
本発明のＮＫ細胞の培養方法（ＣＤ３陽性のＴ細胞をＲｏｓｅｔｔｅｓｅｐにより除去するか、または除去過程を省略する。）、保存条件（新鮮細胞または冷蔵保存細胞）及び投与スケジュール（週１回×４週間、週２回×２週間）による抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの減少を確認した。
＜２－１＞ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる腫瘍サイズの抑制を確認
本発明のＮＫ細胞の培養方法（ＣＤ３陽性のＴ細胞をＲｏｓｅｔｔｅｓｅｐにより除去するか、または除去過程を省略する。）、保存条件（新鮮細胞または冷蔵保存細胞）及び投与スケジュール（週１回×４週間、週２回×２週間）による抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの減少を確認した。
【0122】
具体的には、ＮＫ細胞を培養条件に応じて新鮮（ｆｒｅｓｈ）ＮＫ、新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）、４℃冷蔵保存したＮＫ及び４℃冷蔵保存したＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）に分け、新鮮ＮＫ細胞を前記＜実施例１＞と同様の方法により製造した。新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）細胞は、＜実施例１＞と同様の方法により製造されたが、その過程中にＣＤ３陽性細胞を除去するステップが省略された。また、４℃冷蔵保存したＮＫ細胞は、新鮮ＮＫ細胞を４℃で１２時間保存することにより得られた。また、４℃冷蔵保存したＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）細胞は、ＣＤ３陽性細胞を除去するステップを省略した上、ＮＫ細胞を製造し、その製造された細胞を４℃で１２時間保存することにより得られた。前記製造されたＮＫ細胞をマウスモデルに投与するにあたっては、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、平均腫瘍サイズが約５０．０ｍｍ３に到達したとき、ＮＫ細胞を３×１０６細胞／マウスの濃度で投与し、マウス当たり０．２ｍｌずつ尾静脈に注射した。この時、投与スケジュールは、週１回×４週間、週２回×２週間にした（図５ａ）。
【0123】
実験期間中に毒性を確認するためにマウスの体重変化及び一般的な症状を観察した結果、溶媒対照群と比較して、ＮＫ細胞を週１回×４週間［新鮮ＮＫ、新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）］及び週２回×２週間［新鮮ＮＫ、新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）、４℃冷蔵保存したＮＫ、４℃冷蔵保存したＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）］群では、実験期間中に一般症状なしで通常の体重増加が観察されたが、陽性対照群であるアドリアマイシンを投与した投与群では、２頭の死亡動物及び３１．５％（ｐ＜０．００１）の統計的に有意な体重減少が示された。
【0124】
また、ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの変化を確認した結果、図５ｂに示すように、週１回×４週間のスケジュールで新鮮ＮＫ及び新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）を３×１０６細胞／マウスの濃度で投与したとき、溶媒対照群と比較して、それぞれ５０．８％（ｐ＜０．００１）及び３２．７％（ｐ＜０．０５）の腫瘍成長抑制効果が示され、週２回×２週間のスケジュールで新鮮ＮＫ、新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）及び４℃冷蔵保存したＮＫ細胞を投与したとき、それぞれ３５．４％、１０．８％及び３３．０％の腫瘍成長抑制効果が示された。陽性対照群であるアドリアマイシンを投与した投与群では、７１．７％（ｐ＜０．０１）の腫瘍成長抑制効果が示された。しかし、４℃冷蔵保存したＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）細胞を投与した投与群では、腫瘍成長抑制効果が示されてなかった。このことから、ＣＤ３陽性のＴ細胞の除去過程を行わない場合、ＮＫ細胞の割合が低いため、抗癌効果が低下することが分かり、したがって、抗癌効果を高めるためにはＣＤ３陽性のＴ細胞の除去過程が必要となることが分かる。
【0125】
＜２－２＞ＮＫ細胞の培養、保存条件、投与スケジュールによる腫瘍重量の減少を確認
本発明のＮＫ細胞の培養方法、保存条件及び投与スケジュールによる抗癌効果を確認するために、腫瘍重量の減少を確認した。
本発明のＮＫ細胞の培養方法、保存条件及び投与スケジュールによる抗癌効果を確認するために、腫瘍重量の減少を確認した。
【0126】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、前記実験例＜２－１＞と同様の条件下でＮＫ細胞を投与した後、薬物投与後２７日目に腫瘍を切除して重量を測定した。
【0127】
その結果、図５ｃに示すように、週１回×４週間のスケジュールで新鮮ＮＫ及び新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）を３×１０６個／マウスの濃度で投与したとき、溶媒対照群と比較して、それぞれ４９．０％（ｐ＜０．００１）及び３３．１％（ｐ＜０．０５）の腫瘍重量の減少効果が示された。また、週２回×２週間のスケジュールで新鮮ＮＫ、新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）及び４℃冷蔵保存したＮＫ細胞を投与したとき、それぞれ３０．３％、７．２％及び２９．０％の腫瘍重量の減少効果が示され、陽性対照群であるアドリアマイシンを投与した投与群では、７０．２％（ｐ＜０．０５）の腫瘍成長抑制効果が示された（図５ｃ）。
【0128】
結論として、前記結果から、新鮮ＮＫ培養条件下で培養したＮＫ細胞を３×１０６個／マウスの濃度で週１回×４週間のスケジュールで投与したときは、優れた抗癌効果を示し、さらに、前記ＮＫ細胞を週２回×２週間のスケジュールで投与したときは、新鮮ＮＫ及び４℃冷蔵保存したＮＫ細胞株は、新鮮ＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）及び４℃冷蔵保存したＮＫ（ｗ／ｏ Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐ）細胞株よりも高い抗癌活性を示すことが確認された。
【0129】
＜実験例３＞ＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果の確認
＜３－１＞ＮＫ細胞の冷凍有無による腫瘍サイズの抑制を確認
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの減少を確認した。
＜３－１＞ＮＫ細胞の冷凍有無による腫瘍サイズの抑制を確認
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの減少を確認した。
【0130】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、２時間後にＮＫ細胞を３×１０６細胞／マウスの濃度で投与し、マウス当たり０．２ｍｌずつ尾静脈に注射し、この時、新鮮ＮＫ細胞（週１回×４週間；計４回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（週１回×４週間；計４回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（週２回×４週；計８回）、及び新鮮ＮＫ細胞（週１回×１週間）＋解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（週１回×３週間；計３回）の条件下で投与した。溶媒対照群としては５％ＨＳＡと無血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）を投与し、陽性対照群としてはアドリアマイシンを２ｍｇ／ｋｇの容量で一日おきに腹腔内に投与した（図６ａ）。
【0131】
実験期間中に毒性を確認するためにマウスの体重変化及び一般的な症状を観察した結果、溶媒対照群と比較して、すべてのＮＫ細胞投与群では、実験期間中に一般症状なしで通常の体重増加が観察されたが、陽性対照群であるアドリアマイシンを投与した投与群では、２頭の死亡動物及び３２．１％（ｐ＜０．００１）の統計的に有意な体重減少が示された。
【0132】
また、ＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果を確認するために、２７日目の腫瘍のサイズ変化を確認した結果、図６ｂに示すように、新鮮ＮＫ細胞（合計４回）、解凍された冷凍保存細胞（合計８回）、及び新鮮ＮＫ細胞（合計１回）＋解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（合計３回）を投与した投与群では、それぞれ５８．８％（ｐ＜０．００１）、４５．２％（ｐ＜０．００１）及び１９．２％の腫瘍成長抑制効果が確認され、陽性対照群では、６０．１％（ｐ＜０．０１）の腫瘍の成長抑制効果が示された（図６ｂ）。
【0133】
＜３－２＞ＮＫ細胞の冷凍有無による腫瘍重量の減少の確認
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果を確認するために、腫瘍重量の減少を確認した。
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無による抗癌効果を確認するために、腫瘍重量の減少を確認した。
【0134】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、前記実験例＜４－１＞と同様の条件下でＮＫ細胞を投与した後、薬物投与後２７日目の腫瘍を切除して重量を測定した。
【0135】
その結果、図６ｃに示すように、新鮮ＮＫ細胞（計４回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（計８回）、及び新鮮ＮＫ細胞（計１回）＋解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（計３回）を投与した投与群では、それぞれ５８．５％（ｐ＜０．００１）、４６．２％（ｐ＜０．０１）及び１９．５％の腫瘍重量の減少効果が確認され、陽性対照群では、６０．５％（ｐ＜０．０５）の腫瘍重量の減少効果が示された（図６ｃ）。
【0136】
結論として、前記結果から、新鮮ＮＫ細胞（週１回×４週間；計４回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（週２回×４週間；計８回）を３×１０６個／マウスの濃度で投与した場合、一般症状及び体重減少などの毒性症状なしで顕著な抗癌効果を示すことが確認された。
【0137】
＜実験例４＞ＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果の確認
＜４－１＞細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた腫瘍サイズの抑制を確認
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの減少を確認した。
＜４－１＞細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた腫瘍サイズの抑制を確認
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果を確認するために、腫瘍サイズの減少を確認した。
【0138】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、２時間後に新鮮ＮＫ細胞と解凍された冷凍保存ＮＫ細胞を３×１０６個／マウス及び６×１０６個／マウスの濃度で投与し、マウス当たり０．２ｍｌずつ尾静脈に注射した。この時、３×１０６個／マウスの濃度の新鮮ＮＫ細胞（１回／週×４週間；計４回）、６×１０６個／マウスの濃度の新鮮ＮＫ細胞（１回／２週×４週間；計２回）、及び新鮮ＮＫ細胞（３×１０６個／マウス、１回／週×１週間）＋解凍された冷凍保存細胞（３×１０６個／マウス、２回／週×３週間；計６回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ、２回／週×４週間；計８回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ、２回／週×４週間；計８回）の条件下で投与した。溶媒対照群として５％ＨＳＡと無血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）及び滅菌蒸留水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）を前記と同じ量で尾静脈に注射し、陽性対照群としてドキソルビシン．ＨＣＬ（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．ＨＣＬ）を２ｍｇ／ｋｇの容量で一日おきに腹腔内に投与した（図７ａ）。
【0139】
実験期間中に毒性の程度を調べるために、動物の体重変化及び一般的な症状を観察した結果、溶媒対照群と比較して、すべてのＮＫ細胞の注射群では、一般症状なしで通常の体重増加が観察されたが、陽性対照物質であるドキソルビシン．ＨＣＬを投与した投与群では、投与期間中に２頭の死亡動物及び最終日２５．０％（ｐ＜０．０１）の統計的に有意な体重減少が示された。
【0140】
また、ＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果を確認するために、２６日目の腫瘍のサイズの変化を確認した結果、図７ｂに示すように、３×１０６個／マウスの濃度の新鮮ＮＫ細胞（計４回）、６×１０６個／マウスの濃度の生細胞（計２回）、新鮮ＮＫ細胞（３×１０６個／マウス；計１回）＋解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（３×１０６個／マウス；計６回）、解凍された凍結保存ＮＫ細胞（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ；計８回）、解凍された凍結保存ＮＫ細胞（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ；計８回）を投与した投与群では、それぞれ６８．３％（ｐ＜０．００１）、６１．５％（ｐ＜０．００１）、６３．７％（ｐ＜０．００１）、５５．１％（ｐ＜０．０１）及び３８．８％の腫瘍の成長抑制効果が観察された。陽性対照物質（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．ＨＣＬ）の投与群では、最終日７２．９％（ｐ＜０．０１）の腫瘍成長抑制効果が示された（図７ｂ）。
【0141】
＜４－２＞細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた腫瘍重量の減少の確認
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果を確認するために、腫瘍重量の減少を確認した。
本発明のＮＫ細胞の冷凍有無及び細胞数と投与回数に応じた抗癌効果を確認するために、腫瘍重量の減少を確認した。
【0142】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、前記実験例＜４－１＞と同様の条件でＮＫ細胞を投与した後、薬物投与後２６日目の腫瘍を切除してその重量を測定した。その結果、図７ｃに示すように、３×１０６個／マウスの濃度の新鮮ＮＫ細胞（計４回）、６×１０６個／マウスの濃度の新鮮ＮＫ細胞（計２回）、新鮮ＮＫ細胞（３×１０６個／マウス；計１回）＋解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（３×１０６個／マウス；計６回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ；計８回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ；計８回）を投与した投与群では、それぞれ６８．６％（ｐ＜０．００１）、６１．８％（ｐ＜０．０１）、５９．１％（ｐ＜０．０１）、５０．２％（ｐ＜０．０５）及び４０．８％（ｐ＜０．０５）の腫瘍重量減少が観察された。陽性対照物質（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．ＨＣＬ）の投与群では、７０．４％（ｐ＜０．０１）の腫瘍重量の減少が示された（図７ｃ）。
【0143】
結論として、前記結果から、新鮮ＮＫ細胞（週１回×４週間；計４回、１回／２週×４週間；計２回）、解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ、週２回×４週間；計８回）及び新鮮ＮＫ細胞（週１回×１週間）＋解凍された冷凍保存ＮＫ細胞（週２回×３週間；計６回）を、前記濃度でマウス尾静脈に注射した場合、一般症状及び体重減少などの毒性症状なしで統計的に有意な優れた腫瘍成長抑制効果を示すことが確認された。
【0144】
＜実験例５＞ＮＫ細胞数に応じた肺癌に対する抗癌効果の確認
＜５－１＞ＮＫ細胞数に応じた腫瘍成長抑制及び腫瘍重量減少効果を確認
本発明のＮＫ細胞数に応じてヒト由来の肺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ４６０（韓国生命工学研究院、大韓民国）を異種移植したマウスモデルを用いて、ＮＫ細胞株の容量別の繰り返し静脈注射を介して抗癌効果を確認した。
＜５－１＞ＮＫ細胞数に応じた腫瘍成長抑制及び腫瘍重量減少効果を確認
本発明のＮＫ細胞数に応じてヒト由来の肺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ４６０（韓国生命工学研究院、大韓民国）を異種移植したマウスモデルを用いて、ＮＫ細胞株の容量別の繰り返し静脈注射を介して抗癌効果を確認した。
【0145】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、平均腫瘍サイズが約５０．０ｍｍ３に到達したとき、ＮＫ細胞を３×１０５、１×１０６、３×１０６及び１×１０７個／マウスの濃度で注射し始め、実験期間中に週１回の投与スケジュールで合計４回（週１回）にわたってマウス当たり０．２ｍｌずつ尾静脈に注射した。溶媒対照群としては５％ＨＳＡを投与し、陽性対照群としてはドキソルビシン．ＨＣＬ（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．ＨＣＬ）を２ｍｇ／ｋｇの容量で一日おきに腹腔内に投与した（図８ａ）。
【0146】
実験期間中に毒性を確認するために、マウスの体重変化及び一般的な症状を観察した結果、溶媒対照群と比較して、すべての容量のＮＫ細胞群では、実験期間中に一般症状なしで通常の体重増加が観察されたが、陽性対照群であるドキソルビシン．ＨＣＬを投与した投与群では、４３．３％（ｐ＜０．００１）の統計的に有意な体重減少が認められた。
【0147】
抗癌効果を確認するために、前記＜実験例１＞の方法で開始日から剖検日まで合計１１回にわたって腫瘍サイズを確認し、最終日（２６日）にマウスを犠牲にして腫瘍を分離した後、それを測定して腫瘍成長抑制効果を確認した結果、図８ｂに示すように、ＮＫ細胞を１×１０７個／マウスの濃度で投与した投与群では、溶媒対照群と比較して、４７．９％（ｐ＜０．００１）の有意な腫瘍成長抑制効果が確認され、３×１０５、１×１０６及び３×１０６個／マウスの濃度で投与した投与群では、投与後１０日まで腫瘍の成長を抑制することが確認されたが、それ以降は抑制率が減少するにつれて腫瘍の成長が増加する傾向を示し、陽性対照群では、５３．８％（ｐ＜０．００１）の腫瘍成長抑制効果が示された（図８ｂ）。
【0148】
また、腫瘍重量減少効果を確認した結果、図８ｃに示すように、ＮＫ細胞を１×１０７個／マウスの濃度で投与した投与群では、溶媒対照群と比較して、４６．５％（ｐ＜０．００１）の有意な腫瘍重量減少効果を確認し、陽性対照群では、５２．４％（ｐ＜０．００１）の腫瘍重量減少効果が示された（図８ｃ）。
【0149】
＜５－２＞腫瘍部位へのＮＫ細胞の浸潤効果を確認
前記実験例＜５－１＞の条件下でＮＫ細胞を投与したとき、どれくらいのＮＫ細胞が浸潤するかを確認するために下記のような実験を行った。
前記実験例＜５－１＞の条件下でＮＫ細胞を投与したとき、どれくらいのＮＫ細胞が浸潤するかを確認するために下記のような実験を行った。
【0150】
具体的には、マウスの癌組織を１０％ホルマリン溶液に入れ、４℃で１２時間固定した。前記固定された組織をもって薄い切片を作成してＰＢＳ溶液に浸した後、ＮＫ細胞の免疫組織化学染色のために、前記組織切片を３０分間３％過酸化水素溶液に浸した。その後、前記切片を、再度０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トリトンＸ－１００（ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）及びＣＤ５６抗体（１：５００、ＰｈａｒＭｉｇｅｎ、米国）が含まれている溶液に入れ、４℃で１２時間培養した。そして、前記切片を、常温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１時間、蛍光標識抗マウスＩｇＧ（１：２００、ＰｈａｒＭｉｇｅｎ、米国）が含まれている溶液に入れて培養した後、顕微鏡で観察した。または、前記固定された組織に直接ヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ：Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ）染色を行い、それを顕微鏡で観察した。
【0151】
その結果、図８ｄ及び図８ｅに示すように、ＮＫ細胞株を３×１０５、１×１０６と３×１０６個／マウスの濃度で１次投与したとき、死んだ癌細胞の数（矢印）は、注入されたＮＫ細胞の数に依存して増加し（図８ｄ）、ＮＫ細胞マーカーであるＣＤ５６陽性細胞の数（矢印）は、溶媒を１次投与した正常対照群と比較して著しく増加し、ＣＤ５６陽性細胞は、主に癌組織周辺に浸潤することが確認された（図８ｅ）。
【0152】
結論として、ＮＫ細胞を１×１０７個／マウスの濃度で週１回ずつ４週間マウスの尾静脈に注射するとき、一般症状及び体重減少などの毒性症状なしでヒト由来の肺癌に対して顕著な腫瘍抑制効果を示すことが確認された。
【0153】
＜実験例６＞肺癌、肝臓癌及び膵臓癌に対するＮＫ細胞の抗癌効果の確認
様々な癌種に対する本発明のＮＫ細胞の抗癌効果を確認するために、ヒト由来の肺癌細胞であるＡ５４９（韓国生命工学研究院、大韓民国）、肝臓癌細胞であるＳＮＵ－７０９（韓国生命工学研究院、大韓民国）及び膵臓癌細胞であるＭＩＡ－Ｐａｃａ－２（韓国生命工学研究院、大韓民国）細胞株を異種移植したマウスモデルを用いて、ＮＫ細胞株の繰り返し静脈注射を介して抗癌効果を確認した。
様々な癌種に対する本発明のＮＫ細胞の抗癌効果を確認するために、ヒト由来の肺癌細胞であるＡ５４９（韓国生命工学研究院、大韓民国）、肝臓癌細胞であるＳＮＵ－７０９（韓国生命工学研究院、大韓民国）及び膵臓癌細胞であるＭＩＡ－Ｐａｃａ－２（韓国生命工学研究院、大韓民国）細胞株を異種移植したマウスモデルを用いて、ＮＫ細胞株の繰り返し静脈注射を介して抗癌効果を確認した。
【0154】
具体的には、前記実験例＜１－１＞と同様の方法で癌細胞を移植した後、平均腫瘍サイズが約５０．０ｍｍ３に到達したとき、ＮＫ細胞を６×１０６個／マウスの濃度で注射し始め、実験期間中に週１回の投与スケジュールで合計４回（週１回）にわたってマウス当たり０．２ｍｌずつ尾静脈に注射し、溶媒対照群としては５％ＨＳＡを投与した（図９ａ）。
【0155】
実験期間中に毒性を確認するために、マウスの体重変化及び一般的な症状を観察した結果、溶媒対照群と比較して、すべての容量のＮＫ細胞群では、実験期間中に一般症状なしで通常の体重増加が観察された。
【0156】
抗癌効果を確認するために、前記＜実験例１＞の方法により開始日から剖検日まで合計１１回にわたって腫瘍サイズを確認し、最終日（２５日）にマウスを犠牲にして腫瘍を分離した後、それを測定して腫瘍成長抑制効果を確認した結果、図９ｂに示すように、溶媒対照群と比較して、肺癌マウスモデルでは、臍帯血由来ＮＫ細胞株及び末梢血由来ＮＫ細胞株を投与した場合、それぞれ２４．７％（ｐ＜０．０５）及び９．０％の腫瘍成長抑制効果を示し、肝臓癌マウスモデルでは、臍帯血由来のＮＫ細胞株を投与した場合、３７．７％（ｐ＜０．０１）の腫瘍成長抑制効果を示し、さらに膵臓癌マウスモデルでは、臍帯血由来ＮＫ細胞株を投与した場合、２８．２％（ｐ＜０．０１）の有意な腫瘍成長抑制効果が示された（図９ｂ）。
【0157】
また、ＮＫ細胞投与後２５日目の腫瘍重量減少効果を確認した結果、図９ｃに示すように、溶媒対照群と比較して、肺癌マウスモデルでは、臍帯血由来ＮＫ細胞株及び末梢血由来ＮＫ細胞株を投与した場合、それぞれ２０．４％（ｐ＜０．０１）及び１０．８％の腫瘍重量減少効果を示し、肝臓癌マウスモデルでは、臍帯血由来のＮＫ細胞株を投与した場合、３７．６％（ｐ＜０．０１）の腫瘍重量減少効果を示し、さらに膵臓癌マウスモデルでは、臍帯血由来ＮＫ細胞株を投与した場合、２３．９％（ｐ＜０．０１）の有意な腫瘍重量減少効果が示された（図９ｃ）。
【0158】
結論として、本発明のＮＫ細胞は、６×１０６個／マウスの濃度で週１回ずつ４週間マウスの尾静脈に注射したとき、一般症状及び体重減少などの毒性症状なしでヒト由来の肺癌、肝臓癌及び膵臓癌に対して顕著な腫瘍抑制効果を示すことが確認された。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図2g】
【図2h】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
