▶ ジェイエル メディラブズ、インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-31
(45)【発行日】2022-11-09
(54)【発明の名称】ターゲット物質の検出方法及びキット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/542 20060101AFI20221101BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20221101BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221101BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20221101BHJP
C12Q 1/6818 20180101ALI20221101BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20221101BHJP
【ＦＩ】
G01N33/542 A
G01N33/543 501A
G01N33/53 M
G01N21/64 F
G01N21/64 G
C12Q1/6818 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
33
(21)【出願番号】P 2021514274
(86)(22)【出願日】2019-08-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-02
(86)【国際出願番号】 KR2019011003
(87)【国際公開番号】W WO2020045984
(87)【国際公開日】2020-03-05
【審査請求日】2020-11-13
(31)【優先権主張番号】10-2018-0101453
(32)【優先日】2018-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2018-0123312
(32)【優先日】2018-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2018-0123313
(32)【優先日】2018-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520447617
【氏名又は名称】ジェイエル メディラブズ、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジョン ジン
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５２８１２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５００５８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０７３８７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５２０４７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２０６４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特許第３６５７５５６（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２０１２－５０９０７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－０７３５２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－０００７７９５（ＫＲ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００１７７００（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Jongjin Lee et al.，Accelerated super-resolution imaging with FRET-PAINT，Molecular Brain，2017年，10(1)，Article number:63
【文献】Nina S，Correlative Single-Molecule FRET and DNA-PAINT Imaging，Nano Lett，2018年06月26日，Vol.18，Page.4626-4630
【文献】新野祐介，Dual FRETイメージング法による細胞内シグナルの同時可視化，生物物理，2010年，Vol.50 No.1，Page.028-029
【文献】Alexander Auer et al.，Fast, Background-Free DNA-PAINT Imaging Using FRET-Based Probes，Nano Letters，2017年，17(10)，6428-6434
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５４２
Ｇ０１Ｎ ３３／５４３
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
Ｃ１２Ｑ １／６８１８
Ｃ１２Ｑ １／６８７６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）ドッキングストランド(docking strand)と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記ドッキングストランドと相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されていること、並びに（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含み、前記ドッキングストランド又は少なくとも１つの前記別個のストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記別個のストランドが、１種以上の前記ドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランド及び１種以上の前記アクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含み、フレットペアを形成する２種類以上の蛍光物質で前記アクセプターストランド又は前記ドッキングストランドを標識する、
ターゲット物質の検出方法。
【請求項2】
前記ドナー蛍光物質のピーク吸収波が前記アクセプター蛍光物質のピーク吸収波長よりも短く、かつ、前記ドナー蛍光物質のピーク発光波長が前記アクセプター蛍光物質のピーク発光波長よりも短い、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項3】
前記ドナー蛍光物質を励起する光の波長において、前記ドナー蛍光物質の吸光係数(extinction coefficient)が前記アクセプター蛍光物質の吸光係数よりも３倍以上高い、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項4】
前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフェルスター(Forster)半径が０．２０８ｎｍ以上である、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項5】
前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質は、リンカーを介して、前記ドッキングストランド上又は前記別個のストランド上に標識される、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項6】
前記リンカーの長さが１０ｎｍ以下である、請求項５に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項7】
前記蛍光シグナルのシグナルノイズ比(signal-to-noise ratio)が２以上となるように光学フィルターの波長を調整することを更に含む、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項8】
前記ターゲット物質が２種以上であり、かつ、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドのうちの１種以上は、前記ターゲット物質の種類に応じて異なる配列を有するか、又は、種類若しくは結合位置が異なる蛍光物質で標識される、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項9】
前記ターゲット物質の検知後に前記ドナーストランド及び／又は前記アクセプターストランドを除去し、除去した前記ドナーストランド及び／又は前記アクセプターストランドとは異なるドナーストランド及び／又はアクセプターストランドを用いて前記（ｄ）を繰り返すことで、その他のターゲット物質を検知することを更に含む、請求項８に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項10】
前記ドナーストランド及び前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に又は順次結合するときに、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドとの間の間隔が、前記ドッキングストランドの持続長（presistance length）よりも短い、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項11】
前記蛍光シグナルのシグナルノイズ比（signal-to-noise ratio）を２以上に維持しながら、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドの前記ドッキングストランドへの結合にかかる時間が１０分以下であるように、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドの濃度を調整することを更に含む、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項12】
前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドの濃度が、１０ｎＭ～１０μＭである、請求項１１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項13】
前記ドッキングストランド又は前記アクセプターストランドが核酸であるときに、前記ドッキングストランドに対して相補的な前記アクセプターストランドの塩基数が８以上である、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項14】
前記ドッキングストランドに対して相補的な前記ドナーストランドの塩基数が６～１２である、請求項１３に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項15】
前記ドッキングストランド又は前記アクセプターストランドが核酸類縁体であるときに、前記ドッキングストランドに対して相補的な前記アクセプターストランドの塩基数が５以上である、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項16】
前記ドッキングストランドに対して相補的な前記ドナーストランドの塩基数が３～９である、請求項１５に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項17】
（ａ）ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）前記ターゲット物質のストランドに対して相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ターゲット物質のストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質により標識されていること、並びに（ｃ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含み、前記ターゲット物質のストランド又は少なくとも１つの前記別個のストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記別個のストランドは、１種以上の前記ドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランドと、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質により標識されているフレットストランドを含む、
ターゲット物質の検出方法。
【請求項18】
前記フレットペアから発生する蛍光シグナルから下記の式で規定されるＦＲＥＴ効率が測定される、請求項１に記載のターゲット物質の検出方法。ＦＲＥＴ効率＝（アクセプターから発せられた光の強度）／（ドナーから発せられた光の強度とアクセプターから発せられた光の強度との合計）
【請求項19】
ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）ドッキングストランド(docking strand)と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記ドッキングストランドと相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されていること、並びに（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含み、前記ドッキングストランド又は少なくとも１つの前記別個のストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記別個のストランドが１種以上のドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランドを含み、かつ、前記ドッキングストランドが１種以上のアクセプター蛍光物質を含む、
ターゲット物質の検出方法。
【請求項20】
ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）ドッキングストランド(docking strand)と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記ドッキングストランドと相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されていること、並びに（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含み、前記ドッキングストランド又は少なくとも１つの前記別個のストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記別個のストランドが１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含み、かつ、前記ドッキングストランドが１種以上のドナー蛍光物質を含む、
ターゲット物質の検出方法。
【請求項21】
（ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）タグストランド（tagged strand）と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記タグストランドが１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されること、並びに（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレットにより発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含み、少なくとも１つの前記タグストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記タグストランドが２組以上のフレットペアを含み、
前記フレットペアの間の間隔は、各フレットペアのＦＲＥＴ効率に影響を与えないように調整され、
前記フレットペアの間の間隔が５ｎｍ以上である、
ターゲット物質の検出方法。
【請求項22】
前記フレットにより発生した蛍光シグナルが、下記の式で規定されるＦＲＥＴ効率によって測定される、請求項２１に記載のターゲット物質の検出方法。ＦＲＥＴ効率＝（アクセプターから発せられた光の強度）／（ドナーから発せられた光の強度とアクセプターから発せられた光の強度との合計）
【請求項23】
前記ＦＲＥＴ効率の測定が、光退色の前及び後に、前記ドナー又は前記アクセプターから発せられた光の明度値を測定すること、を含む、請求項２２に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項24】
前記蛍光物質間の距離に応じて識別されるフレット（ＦＲＥＴ）効率の間の差を決定することにより、２種以上のターゲット物質が同時に検知される、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項25】
前記異なる種類の蛍光物質間のフレット（ＦＲＥＴ）による発光スペクトルの間の差を決定することにより、２種以上のターゲット物質が同時に検知される、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項26】
前記蛍光シグナルがイメージングされた領域の単位面積当たりの前記ターゲット物質の数から、前記試料中の前記ターゲット物質の濃度を決定することをさらに含む、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載のターゲット物質の検出方法。
【請求項27】
（ａ）ターゲット物質に特異的に結合し、かつ、ドッキングストランドと結合している１種以上の検出プローブ、及び（ｂ）前記ドッキングストランドに対して相補的に結合する１種以上の別個のストランドを含み、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方が、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されており、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質の間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットであり、前記ドッキングストランド又は少なくとも１つの前記別個のストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記別個のストランドが、１種以上の前記ドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランド及び１種以上の前記アクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含み、フレットペアを形成する２種類以上の蛍光物質で前記アクセプターストランド又は前記ドッキングストランドを標識するか、
前記別個のストランドが１種以上のドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランドを含み、かつ、前記ドッキングストランドが１種以上のアクセプター蛍光物質を含むか、又は、
前記別個のストランドが１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含み、かつ、前記ドッキングストランドが１種以上のドナー蛍光物質を含む、
ターゲット物質検出用キット。
【請求項28】
ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体のストランドに対して相補的に結合する１種以上の別個のストランドを含み、前記別個のストランドが少なくとも１種のドナー蛍光物質で標識されているドナーストランド及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されているアクセプターストランドを含み、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質の間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットであり、少なくとも１つの前記別個のストランドが２以上の蛍光物質で標識されており、
前記別個のストランドは、１種以上の前記ドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランドと、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質により標識されているフレットストランドを含む、
ターゲット物質検出用キット。
【請求項29】
ターゲット物質に特異的に結合し、かつ、タグストランドと結合している１種以上の検出プローブを含み、前記タグストランドが１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質を含み、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質の間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットであり、少なくとも１つの前記タグストランドが２以上の蛍光物質で標識されている、ターゲット物質検出用キット。
【請求項30】
前記ターゲット物質を捕捉可能な基板をさらに含む、請求項２７又は請求項２８に記載のターゲット物質検出用キット。
【請求項31】
前記ターゲット物質を捕捉するために、前記基板上に１種以上の捕捉プローブが固定化されている、請求項３０に記載のターゲット物質検出用キット。
【請求項32】
前記ターゲット物質を捕捉可能な基板をさらに含み、前記ターゲット物質を捕捉するために、前記基板上に１種以上の捕捉プローブが固定化されており、
前記捕捉プローブが、前記検出プローブと結合した前記タグストランド以外の前記タグストランドと結合している、請求項２９に記載のターゲット物質検出用キット。
【請求項33】
前記検出プローブのタグ付きストランド及び前記捕捉プローブのタグ付きストランドと相補的に結合してフレットペアを形成するブリッジストランドをさらに含む、請求項３２に記載のターゲット物質検出用キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書に開示された技術は、一般的にターゲット物質の検出方法及びキットに関し、より詳細にはターゲット物質の多重検出のための非常に高い感度を有する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
バイオマーカーとは生物学的な状態又は状況を示すことが可能な生物学的指標、例えばタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、代謝物等のことである。生命体に由来する特定の試料中に存在するバイオマーカーの検出に基づくことで生命体の正常な状態又は病理学的状態の判定が可能であり、かつ、薬物に対する応答の客観的な評価が可能である。近年、バイオマーカーの検出は、癌や心疾患、卒中、及び認知症などの他の不治の疾患を診断するための効果的なアプローチとして医療界で注目を浴びている。
【0003】
バイオマーカー検出のための従来の技術は主にＥＬＩＳＡに基づいており、それらの感度に比例して数～数十ｐｇ／ｍｌの範囲で所定のレベルを超える量の生体試料を必要とする。
【0004】
これらのＥＬＩＳＡベースの技術の大半によると、腫瘍が成長するか否か判定するためにバイオマーカーを使用するとき、これらのバイオマーカーの１つ１つが１回の試験によって判別される。このため、試験が数回繰り返される。しかしながら、腫瘍が成長するときは１種類のみバイオマーカーのレベルが変化するのではなく、２種類以上のバイオマーカーのレベルが変化する。したがって、腫瘍が成長するか否か判定するために数種類のバイオマーカーの同時検出が必要になり、それにより疾患が存在するか否かの判定に正確性が増すことになる。
【0005】
現在の技術状況では多数のバイオマーカーの検出には、それらのバイオマーカーの数に比例して充分な量の血液と充分な数の検出キットが必要である。大量の血液の試料採取は精神的及び物理的負担を対象に課し、多数の検出キットの使用は経済的な負担になるばかりか疾患の早期診断を困難にする。このため、１種以上のバイオマーカーを同時に診断することが必要である。
【0006】
したがって、非常に少量の生体試料中の２種類以上のバイオマーカーを同時検出するために、感度が高く、かつ、多重化されている診断技術を開発する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】韓国特許第１４３１０６２号、「乳癌診断用の複数のバイオマーカーのセット、乳癌の検出方法、及び乳癌に対する抗体を使用する乳癌の診断キット」（２０１３年９月２３日公開）
【文献】韓国特許出願公開第２０１７００９６６１９号、「３次元タンパク質ナノ粒子プローブに基づく複数の疾患を同時検出するための方法及びキット」（２０１７年８月２４日公開）
【発明の概要】
【0008】
本開示の一態様によれば、（ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）ドッキングストランド（docking strand）と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記ドッキングストランドと相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されていること、並びに（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含む、ターゲット物質の検出方法が提供される。
【0009】
本開示の他の態様によれば、（ａ）ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）前記ターゲット物質のストランドに対して相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ターゲット物質のストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質により標識されていること、並びに（ｃ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含む、ターゲット物質の検出方法が提供される。
【0010】
本開示の別の態様によれば、（ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）タグストランド（tagged strand）と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記タグストランドが１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されること、並びに（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含む、ターゲット物質の検出方法が提供される。
【0011】
１つの実施形態において、前記ドナー蛍光物質のピーク吸収波長は前記アクセプター蛍光物質のピーク吸収波長よりも短くてよく、かつ、前記ドナー蛍光物質のピーク発光波長は前記アクセプター蛍光物質のピーク発光波長よりも短くてよい。
【0012】
１つの実施形態において、前記ドナー蛍光物質を励起する光の波長において、前記ドナー蛍光物質の吸光係数(extinction coefficient)は、前記アクセプター蛍光物質の吸光係数よりも３倍以上高くてよい。
【0013】
１つの実施形態において、前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフェルスター(Forster)半径は０．２０８ｎｍ以上である。
【0014】
１つの実施形態においては、前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質は、リンカーを介して、前記ドッキングストランド上又は前記別個のストランド上に標識されてよい。
【0015】
１つの実施形態において、前記リンカーの長さは１０ｎｍ以下であってよい。
【0016】
１つの実施形態において、前記方法は、前記蛍光シグナルのシグナルノイズ比(signal-to-noise ratio)が２以上になるように光学フィルターの波長を調整することをさらに含んでよい。
【0017】
１つの実施形態において、前記別個のストランドは１種以上のドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランド及び１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含んでよい。
【0018】
１つの実施形態において、前記ターゲット物質が２種以上であってよく、かつ、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドのうちの１種以上は、前記ターゲット物質の種類に応じて異なる配列を有するか、又は、種類若しくは結合位置が異なる蛍光物質で標識されてよい。
【0019】
１つの実施形態において、前記方法は、前記ターゲット物質の検知後に前記ドナーストランド及び／又は前記アクセプターストランドを除去し、除去した前記ドナーストランド及び／又は前記アクセプターストランドとは異なるドナーストランド及び／又はアクセプターストランドを用いて前記（ｄ）を繰り返すことで、その他のターゲット物質を検知することを更に含んでよい。
【0020】
１つの実施形態において、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時又は連続的に結合するときに、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドとの間の間隔は、前記ドッキングストランドの持続長（presistance length）よりも短くてよい。
【0021】
１つの実施形態において、前記方法は、前記蛍光シグナルのシグナルノイズ比（signal-to-noise ratio）を２以上に維持しながら、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドの前記ドッキングストランドへの結合にかかる時間が１０分以下であるように、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドの濃度を調整することを更に含んでよい。この実施形態では、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドの濃度は１０ｎＭ～１０μＭであってよい。
【0022】
１つの実施形態において、前記ドッキングストランド又は前記アクセプターストランドが核酸であるときに、前記ドッキングストランドに対して相補的な前記アクセプターストランドの塩基数は、８で以上あってよい。この実施形態では、前記ドッキングストランドに対して相補的な前記ドナーストランドの塩基数は６～１２であってよい。
【0023】
１つの実施形態において、前記ドッキングストランド又は前記アクセプターストランドが核酸類縁体であるときに前記ドッキングストランドに対して相補的な前記アクセプターストランドの塩基数は少なくとも５であってよい。この実施形態では、前記ドッキングストランドに対して相補的な前記ドナーストランドの塩基数は３～９であってよい。
【0024】
１つの実施形態において、前記アクセプターストランド又は前記ドッキングストランドは、フレットペアを形成する２種以上の蛍光物質で標識されてよい。
【0025】
１つの実施形態において、前記別個のストランドは１種以上のドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランドを含んでよく、かつ、前記ドッキングストランドは１種以上のアクセプター蛍光物質を含んでよい。
【0026】
１つの実施形態において、前記別個のストランドは１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含み、かつ、前記ドッキングストランドは１種以上のドナー蛍光物質を含む。
【0027】
１つの実施形態において、前記タグストランドは２組以上のフレットペアを含んでよい。
【0028】
１つの実施形態において、前記フレットにより発生した蛍光シグナルは、下記の式で規定されるＦＲＥＴ効率によって測定されてよい。
ＦＲＥＴ効率＝（アクセプターから発せられた光の強度）／（ドナーから発せられた光の強度とアクセプターから発せられた光の強度の合計）
ＦＲＥＴ効率＝（アクセプターから発せられた光の強度）／（ドナーから発せられた光の強度とアクセプターから発せられた光の強度の合計）
【0029】
１つの実施形態において、前記ＦＲＥＴ効率の測定は光退色の前と後に、前記ドナー又は前記アクセプターから発せられた光の明度値を測定することを含んでよい。
【0030】
１つの実施形態において、前記フレットペアの間の間隔は、各フレットペアのＦＲＥＴ効率に影響を与えないように調整されてよい。前記フレットペアの間の間隔は、５ｎｍ以上であってよい。
【0031】
１つの実施形態において、前記蛍光物質間の距離に応じて識別されるフレット（ＦＲＥＴ）効率の間の差を決定することにより２種以上のターゲット物質が同時に検知されてよい。
【0032】
１つの実施形態において、前記異なる種類の蛍光物質間のフレット（ＦＲＥＴ）による発光スペクトルの間の差を決定することにより２種以上のターゲット物質が同時に検知されてよい。
【0033】
１つの実施形態において、前記方法は、前記蛍光シグナルを観測する領域の単位面積当たりの前記ターゲット物質の数から、前記試料中の前記ターゲット物質の濃度を決定することをさらに含んでよい。
【0034】
本開示の別の態様によると、ターゲット物質に特異的に結合し、かつ、ドッキングストランドと結合している１種以上の検出プローブを含み、前記ドッキングストランドが１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質を含み、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットが提供される。
【0035】
１つの実施形態において、前記タグストランドは、前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間で隣接して形成されたフレットペアを２種以上含んでよい。
【0036】
本開示の別の態様によれば、（ａ）ターゲット物質に特異的に結合し、かつ、ドッキングストランドと結合している１種以上の検出プローブ、及び（ｂ）前記ドッキングストランドに対して相補的に結合する１種以上の別個のストランドを含み、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方が、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されており、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質の間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットが提供される。
【0037】
本開示の別の態様によれば、ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体のストランドに対して相補的に結合する１種以上の別個のストランドを含み、前記別個のストランドが少なくとも１種のドナー蛍光物質で標識されているドナーストランド及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されているアクセプターストランドを含み、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質の間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットが提供される。
【0038】
本開示のさらに別の態様によれば、ターゲット物質に特異的に結合し、かつ、タグストランドと結合している１種以上の検出プローブを含み、前記タグストランドが１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質を含み、かつ、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質及び前記アクセプター蛍光物質の間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる、ターゲット物質検出用キットが提供される。
【0039】
１つの実施形態において、前記ターゲット物質を捕捉可能な基板をさらに含んでよい。１種以上の捕捉プローブは、前記ターゲット物質を捕捉するために前記基板上に固定化されていてよい。前記捕捉プローブは、前記タグストランドと結合していてよい。
【0040】
１つの実施形態において、前記ターゲット物質検出用キットは、前記検出プローブのタグストランド及び前記捕捉プローブのタグストランドと相補的に結合してフレットペアを形成するブリッジストランドをさらに含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1a】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1b】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1c】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1d】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1e】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1f】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1g】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1h】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである
【図1i】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1j】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【図1k】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの原理及び特性を示したのである。
【0042】
【図2a】ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を比較した結果を示す。
【図2b】ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を比較した結果を示す。
【図2c】ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を比較した結果を示す。
【図2d】ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を比較した結果を示す。
【図2e】ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を比較した結果を示す。
【0043】
【図3a】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3b】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3c】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3d】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3e】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3f】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3g】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【図3h】ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化性能を示す。
【0044】
【0045】
【図5】ドナー及びアクセプターの各スペクトルの重複を示す。
【図6】ドッキングストランドに結合したドナーストランド及びアクセプターストランドを示す。
【図7】ドナー蛍光物質の発光スペクトル（実線）及びアクセプター蛍光物質の発光スペクトル（破線）を示す。
【図8a】カメラで撮影されたアクセプター蛍光シグナルを示す。
【図8b】シグナルの強度とノイズの強度とを比較したグラフである。
【図9】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【0046】
【図10】本開示の１つの実施形態に係るタグストランドに標識されたドナー及びアクセプターを模式的に示す。
【図11】本開示の１つの実施形態に係る単分子顕微鏡を使用してイメージングする過程を示す。
【図12】本開示の１つの実施形態に係るドナー及びアクセプターのＦＲＥＴ効率の測定を示す。
【図13】本開示の１つの実施形態に係る２以上のドナー－アクセプターＦＲＥＴペアで標識されているタグストランドを示す。
【図14a】本開示の１つの実施形態に係る２以上のドナー－アクセプターＦＲＥＴペアにおけるドナーとアクセプターの組合せを示す。
【図14b】本開示の１つの実施形態に係る２以上のドナー－アクセプターＦＲＥＴペアにおけるドナーとアクセプターの組合せを示す。
【図14c】本開示の１つの実施形態に係る２以上のドナー－アクセプターＦＲＥＴペアにおけるドナーとアクセプターの組合せを示す。
【図15】本開示の１つの実施形態に係る異なる種類のバイオマーカーの検出を模式的に示す。
【0047】
【図16】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図17】本開示の１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図18】本開示の１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図19】本開示の様々な実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図20】本開示の様々な実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図21】本開示の様々な実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【0048】
【図22】本開示の１つの実施形態に係るＮ種類のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図23】本開示の１つの実施形態に係るＮ種類のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図24】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図25】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【0049】
【図26】本開示の１つの実施形態に係るバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示す。
【図27】本開示の１つの実施形態に係るマイクロＲＮＡの検出のためのキットを模式的に示す。
【図28】本開示の１つの実施形態に係る吸収スペクトル及び発光スペクトルのデータを示す。
【図29】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出の原理を模式的に示す。
【0050】
【図30】本開示の１つの実施形態に係るドナーストランドが様々な濃度で記録された蛍光画像を示す。
【図31】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを例示的に示す。
【図32】ドナーとアクセプターとの間の距離に応じた発光スペクトルの違いを測定した結果を示す。
【図33】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを例示的に示す。
【0051】
【図34a】２種以上のアクセプターで標識されているドッキングストランドの発光スペクトルを測定した結果を示す。
【図34b】２種以上のアクセプターで標識されているドッキングストランドの発光スペクトルを測定した結果を示す・
【図34c】２種以上のアクセプターで標識されているドッキングストランドの発光スペクトルを測定した結果を示す
【図35a】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のための方法を例示する。
【図35b】本開示の１つの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のための方法を例示的に示す。
【図36a】本開示の幾つかの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを例示する。
【図36b】本開示の幾つかの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを例示する。
【0052】
【図38a】本開示の幾つかの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを例示する。
【図38b】本開示の幾つかの実施形態に係る複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを例示する。
【図39】本開示の１つの実施形態に係るマイクロＲＮＡの検出のためのキットを例示する。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本明細書において使用される用語を以下に簡単に説明する。
【0054】
本明細書において「バイオマーカー」は、生命体の正常な状態又は病気の状態を判定するために使用可能な全ての生体物質を含むものとする。
【0055】
本明細書において「フレット」は、隣接する2つの蛍光物質の共鳴によってエネルギーが伝達されるメカニズムを意味する。具体的には、光によって励起（excited）された蛍光物質のエネルギーが隣接する別の蛍光物質に伝達される現象を指す用語であり、当業者が認識する通常のフレットの意味を含むものとする。
【0056】
本明細書において「ＦＲＥＴ効率」は、光により励起（ｅｘｃｉｔｅｄ）された蛍光物質から別の隣接する蛍光物質へ移動したエネルギーの値を指す。ＦＲＥＴ効率はこれらの蛍光物質間の距離に応じて変化する。この用語は当業者が理解するＦＲＥＴ効率の一般的な意味を含み得る。
本明細書において「フレット効率」は、光によって励起（ｅｘｃｉｔｅｄ）された蛍光物質のエネルギーが隣接する別の蛍光物質に伝達される現象を利用して、蛍光物質との間の距離に応じて異なるエネルギー伝達効率を値として示したことを意味し、当業者が認識する一般的なフレット効率の意味を含み得る。
本明細書において「フレット効率」は、光によって励起（ｅｘｃｉｔｅｄ）された蛍光物質のエネルギーが隣接する別の蛍光物質に伝達される現象を利用して、蛍光物質との間の距離に応じて異なるエネルギー伝達効率を値として示したことを意味し、当業者が認識する一般的なフレット効率の意味を含み得る。
【0057】
本明細書において「ドナー」は、光により励起されるとエネルギーを移転させる蛍光物質を指す。２種類以上の蛍光物質がお互いに対して隣接しているとき、比較的に短波長の光を吸収又は発光する蛍光物質を意味する。
【0058】
本明細書において「アクセプター」は、励起されたドナーから移転されたエネルギーを受け取る蛍光物質を指す。２種類以上の蛍光物質がお互いに対して隣接しているとき、比較的に長波長の光を吸収又は発光する蛍光物質を意味する。
【0059】
本明細書において「ストランド」は、生体高分子の鎖、又は生体高分子に似ている高分子の鎖を指す。生体高分子は、一本鎖構造又は二本鎖構造を有してよく、かつ、核酸、核酸類縁体、ポリペプチド、及び炭水化物を含むものとする。核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸類縁体はペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。
【0060】
以下、添付図面を参照して、様々な実施形態を詳細に説明する。しかしながら、これらの実施形態を改変することができ、本出願の範囲はこれらの実施形態によって限定又は制限されない。全ての変更、等価物、及び代用物は、添付されている特許請求の範囲内に包含されることを理解されたい。
【0061】
本明細書において使用される用語は、単に説明を目的としており、限定として解釈されてはならない。本明細書において使用される場合、単数形の表現は、文脈から明確に別途指示されない限り複数形を同様に含むものとする。「含む」又は「有する」などの表現は、明細書に言及された特徴、数字、工程、動作、構成要素、成分、及び／又はそれらの組合せの存在を明示するが、１又は複数の他の特徴、数字、工程、動作、構成要素、成分、及び／又はそれらの組合せの存在又は付加を排除していないことをさらに理解されたい。
【0062】
別途定義されない限り、技術用語又は科学用語を含む本明細書において使用される全ての用語は、本技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書の中で定義されるこのような用語は、関連する技術分野での文脈上の意味と等しい意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書中で明確に定義されない限り、理想的的な意味又は過度に形式的な意味を有すると解釈されてはならない。
【0063】
別途言及されない限り、添付図面を参照しながら様々な実施形態を説明する中で同じ要素の説明の反復は省かれる。
【0064】
近年の単分子蛍光顕微鏡法の発展により個々の分子の観察が可能になってきた。単分子蛍光顕微鏡法は、バイオマーカー検出に適用されるとｆｇ／ｍｌ範囲の感度を有し、その感度は既存の蛍光イメージング法の感度よりも約１０００倍高い（Ｎａｔｕｒｅ誌、第４７３巻、４８４～４８８頁、２０１１年）。一般的な蛍光イメージング法によると、蛍光シグナルを用いて異なる種類のバイオマーカーが識別されるように、観察予定の分子に蛍光物質が固定化される。それらの蛍光物質の色の違いに基づいて異なる種類のバイオマーカーが識別されるが、わずかに３～４種類の蛍光物質が一般的なイメージセンサで識別及び観察可能である。その結果、既存の技術の感度の約１０００倍に相当するｆｇ／ｍｌ範囲の感度を有する単分子蛍光顕微鏡法を使用することでわずかに３～４種類のバイオマーカーの検出が可能になる。
【0065】
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１１巻、３１３～３１８頁、２０１４年）を単分子蛍光顕微鏡法に適用することにより、この単分子蛍光顕微鏡法の高い感度を維持したまま様々なバイオマーカーの同時分析が可能になる。この集合技術によれば、蛍光物質以外のドッキングストランドと結合している検出抗体を分析物バイオマーカーに結合させ、しばらくの間（数秒以内）これらのドッキングストランドに結合し、かつ、解離するイメージャーストランド上に蛍光物質を標識として導入し、そしてそれらのイメージャーストランドがこれらのドッキングストランドに結合すると発生する蛍光シグナルを検出する。この様にして高い感度を維持したまま単色の蛍光物質で多くの種類のバイオマーカーを検出できる。
【0066】
しかしながら、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ法を使用する場合、イメージャーストランドがドッキングストランドに結合しているか否かに関係なく、全てのイメージャーストランドが蛍光シグナルを発するため、高いバックグラウンドノイズが生成される。したがって、これらのイメージャーストランドの濃度は数ｎＭ～数十ｎＭに限定され、不都合なことに検出率が低くなる。
【0067】
そこで、本明細書に開示された一実施形態によると、単分子蛍光顕微鏡の高い感度を維持しながら、さまざまなターゲット物質を同時検出する方法であって、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）に基づいたＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ技術であるＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ技術が提供される。ＦＲＥＴは、最初に励起されたドナー(doner)のエネルギーがアクセプター（acceptor）に移転される現象である。一般的に、前記ドナー物質は前記アクセプター物質と比較して短波長の光を発光する。この発光波長のスペクトルは前記アクセプターの吸収波長のスペクトルと重複（spectral overlap）する。エネルギー移動速度と移動効率は、前記ドナーの発光波長と前記アクセプターの吸収波長との間の重複の程度、前記ドナーの量子効率、前記ドナー及び前記アクセプターの遷移双極子の相対的配置、及び前記ドナーと前記アクセプターとの間の距離に依存する。
【0068】
例えば、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ技術によると、前記ドッキングストランドは、２つのＤＮＡ結合部位を有しており、１つはドナーストランドのためのものであり、他方はアクセプターストランドのためのものである。単分子の位置特定（single-molecule localization）のためには、前記アクセプターのＦＲＥＴシグナルが使用される。前記アクセプターは直接的に励起されるのではなく、ＦＲＥＴにより励起されるため、数十倍～数百倍高いイメージャー（ドナー及びアクセプター）濃度の使用が可能であり、これによりＤＮＡ－ＰＡＩＮＴと比較して数十倍～数百倍速いＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度が実証される。
【0069】
本開示の１つの態様によれば、ターゲット物質の検出方法が提供される。このターゲット物質の検出方法は、（ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）ドッキングストランドと結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、（ｃ）前記ドッキングストランドと相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されていること、及び（ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を検知すること、を含む。
【0070】
この方法の個々の工程を、以下に説明する。
【0071】
先ず、工程（ａ）ではターゲット物質を含有する試料を基板上に導入する。この基板は前記ターゲット物質を捕捉及び観察するための領域を提供する。この基板の構造は限定されない。例えば、この基板は平面状、球状、又は棒状の構造であってよい。あるいは、この基板は不規則な形状であってよい。この基板の材料は例えばガラス、石英、又はプラスチックであってよい。この基板はスライドグラス又はカバースリップであってよい。この基板は１番又は１．５番のカバースリップであることが好ましい。
【0072】
前記試料は、ターゲット物質を含有している限り特定の種類に限定されない。前記試料は、疾患を有することが疑われている動物又はヒトの個体から単離され、前記試料は、特に限定されないが、組織、血液、血清、血漿、唾液、粘液、及び尿からなる群より選択可能である。
【0073】
前記ターゲット物質は、目的の検出対象であれば特に制限されず、例えば、前記ターゲット物質は金属（Ｃａ、Ｍｇ、Ｐｂ等）、金属イオン又は生体物質であってよい。これらの生体物質は、バイオマーカー、血液、血漿、血清、体液、タンパク質、ペプチド、核酸、細菌、ウイルス、小胞体、ｍｉＲＮＡ、エクソソーム、及び循環腫瘍細胞であってよい。前記ターゲット物質は、バイオマーカーであることが好ましい。
【0074】
本開示の技術は、細胞、組織、器官、及び他の生物試料の観察のために使用できる。特に、本開示の技術は、一回の検査で複数種の生体物質を検出し、迅速に病気を早期診断することができるという点で、バイオマーカー検出用に非常に有用に使用することができる。
【0075】
前記バイオマーカーは、特に限定されない。例えば、前記バイオマーカーは、生物学的処理過程、発病過程、及び治療用途のための薬理学的過程の測定又は評価を含む科学分野及び医療分野で通常使用されるバイオマーカーであってよい。
【0076】
前記バイオマーカーは、体液、例えば血液、唾液、及び尿から検出可能なポリペプチド、ペプチド、核酸、タンパク質、又は代謝物であってよく、具体的には、
ＡＦＰ（alpha fetoprotein）、ＣＡ１５－３、ＣＡ２７－２９、ＣＡ１９－９、ＣＡ－１２５、カルシトニン（calcitonin）、カルレチニン（calretinin）、ＣＥＡ（carcinoembryonic antigen）、ＣＤ３４、ＣＤ９９、ＭＩＣ－２、ＣＤ１１７、クラモグラニン（chromogranin）、サイトケラチン（cytokeratin、various types：ＴＰＡ、ＴＰＳ、Ｃｙｆｒａ２１－１）、デスミン（desmin）、ＥＭＡ（epithelial membrane antigen）、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、ＣＤ３１、ＦＬ１、ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）、ＧＣＤＦＰ－１５（gross cystic disease fluid protein）、ＨＭＢ－４５、ｈＣＧ（human chorionic gonadotropin）、免疫グロブリン（immunoglobulin）、インヒビン（inhibin）、ケラチン（keratin、various types of keratin）、白血球マーカー（lymphocyte marker）、ＭＡＲＴ－１（Melan-A）、 Ｍｙｏ Ｄ１、ＭＳＡ（muscle-specific actin）、ニューロフィラメント（neurofilament）、ＮＳＥ（neuron-specific enolase）、ＰＬＡＰ（placental alkaline phosphatase）、ＰＳＡ（prostate-specific antigen）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、Ｓ１００ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＭＡ（smooth muscle actin）、シナプトフィシン（synaptophysin）、ＴＫ（thymidine kinase）、Ｔｇ（thyroglobulin）、ＴＴＦ－１（thyroid transcription factor-1）、Ｍ２－ＰＫ、ビメンチン（vimentin）、インターロイキン（interleukin）、ＣＤ２４、ＣＤ４０、インテグリン（integrin）、シスタチン（cystatin）、インターフェロン（interferon）、ＴＮＦ（tumor necrosis factor）、ＭＣＰ、ＶＥＧＦ、ＧＬＰ、ＩＣＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ、ＢＲＡＦ、ＧＦＥＢ、ＦＲＳ、ＬＺＴＳ、ＣＣＮ、ムチン（mucin）、レクチン（lectin）、アポリポタンパク質、チロシン、神経細胞接着分子様タンパク質、ファイブロネクチン、ブドウ糖、尿酸、炭酸脱水酵素、又はコレステロールなどであってよい。
ＡＦＰ（alpha fetoprotein）、ＣＡ１５－３、ＣＡ２７－２９、ＣＡ１９－９、ＣＡ－１２５、カルシトニン（calcitonin）、カルレチニン（calretinin）、ＣＥＡ（carcinoembryonic antigen）、ＣＤ３４、ＣＤ９９、ＭＩＣ－２、ＣＤ１１７、クラモグラニン（chromogranin）、サイトケラチン（cytokeratin、various types：ＴＰＡ、ＴＰＳ、Ｃｙｆｒａ２１－１）、デスミン（desmin）、ＥＭＡ（epithelial membrane antigen）、Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、ＣＤ３１、ＦＬ１、ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）、ＧＣＤＦＰ－１５（gross cystic disease fluid protein）、ＨＭＢ－４５、ｈＣＧ（human chorionic gonadotropin）、免疫グロブリン（immunoglobulin）、インヒビン（inhibin）、ケラチン（keratin、various types of keratin）、白血球マーカー（lymphocyte marker）、ＭＡＲＴ－１（Melan-A）、 Ｍｙｏ Ｄ１、ＭＳＡ（muscle-specific actin）、ニューロフィラメント（neurofilament）、ＮＳＥ（neuron-specific enolase）、ＰＬＡＰ（placental alkaline phosphatase）、ＰＳＡ（prostate-specific antigen）、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、Ｓ１００ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＭＡ（smooth muscle actin）、シナプトフィシン（synaptophysin）、ＴＫ（thymidine kinase）、Ｔｇ（thyroglobulin）、ＴＴＦ－１（thyroid transcription factor-1）、Ｍ２－ＰＫ、ビメンチン（vimentin）、インターロイキン（interleukin）、ＣＤ２４、ＣＤ４０、インテグリン（integrin）、シスタチン（cystatin）、インターフェロン（interferon）、ＴＮＦ（tumor necrosis factor）、ＭＣＰ、ＶＥＧＦ、ＧＬＰ、ＩＣＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ、ＢＲＡＦ、ＧＦＥＢ、ＦＲＳ、ＬＺＴＳ、ＣＣＮ、ムチン（mucin）、レクチン（lectin）、アポリポタンパク質、チロシン、神経細胞接着分子様タンパク質、ファイブロネクチン、ブドウ糖、尿酸、炭酸脱水酵素、又はコレステロールなどであってよい。
【0077】
前記試料は、バイオマーカー非含有溶液で希釈されてよい。前記試料中の前記バイオマーカーの濃度はバイオマーカーの種類に応じてｆｇ／ｍｌからｍｇ／ｍｌまで大きく変化してよい。正確な数のバイオマーカー分子がイメージセンサによって検出されるように様々な比率で前記試料を希釈することが好ましい。同試料を様々な比率で希釈することが好ましく、１：１０～１０００の重量比率で希釈することが最も好ましい。
【0078】
前記ターゲット物質を前記基板に直接的に付着させてよい。あるいは、前記基板に付着している捕捉プローブを介して前記ターゲット物質を前記基板上に導入してもよい。この基板は抗原、抗体、及び蛍光物質などの望ましくない物質が基板表面に付着しないように適切な重合体で被覆されてよい。この重合体は例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はアクリルアミドであってよい。
【0079】
前記捕捉プローブは、前記ターゲット物質に特異的に結合して前記ターゲット物質を前記基板上に固定化する。前記捕捉プローブは、抗体又はアプタマーであってよい。例えば、前記捕捉プローブはバイオマーカーに特異的に結合可能である前記バイオマーカーの捕捉用の捕捉抗体であってよい。これらの捕捉抗体の表面にビオチン（biotin）を導入し、かつ、ビオチンに結合可能なアビジン（avidin）、ニュートラアビジン（neutravidin）又はストレプトアビジン（strepavidin）を前記基板上に導入することにより、これらの捕捉抗体を前記基板に付着させることができる。
【0080】
例えば、短時間で簡便な測定のために、捕捉抗体の使用を必要とせずに、前記検出対象のバイオマーカーを基板表面に直接的に付着させてよい。あるいは、測定結果の正確性をさらに高めるために、基板表面上に固定化された捕捉抗体に抗原抗体反応を介して前記バイオマーカー分子を付着させてもよい。
【0081】
前記バイオマーカーを基板表面に直接的に付着させる場合、例えば、カバースリップにビーズ溶液を塗布し、かつ、前記試料に相当する細胞をその基板の表面上で培養及び固定化する。捕捉抗体をｐＨ９．５で０．０６Ｍの炭酸緩衝溶液又は重炭酸緩衝溶液で希釈し、かつ、この希釈物を前記基板と所定の温度、所定の時間にわたって接触させることによりこれらの捕捉抗体を前記基板に付着させてよい。その後、前記基板を生試料又は処理済み試料で処理する。前記基板に吸着した捕捉抗体は前記試料中の前記バイオマーカーと複合体を形成する。これらの複合体をツイーン２０などの緩衝液又は蒸留水などの洗浄剤で洗浄して非特異的に結合した抗体又は混入汚染物質を除去する。
【0082】
工程（ｂ）では、ドッキングストランド（docking strand）と結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させる。これらの検出プローブは、抗体又はアプタマーであってよい。例えば、前記分析物バイオマーカーに特異的に結合可能な検出抗体に前記ドッキングストランドをタグ付けしてよい。
【0083】
特に、前記捕捉抗体及び前記検出抗体について言及するために、本明細書において使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二特異性抗体）、及び抗体断片（例えば所望の生物活性を示す抗体の可変領域及び他の領域）を含み得る。これらの抗体は両方のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を含むものとされる。これらの抗体はＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ディアボディ（diabody）、ナノボディ（nanobody）、及びｓｃＦｖを含むことが好ましい。これらの抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ナノボディ、又は免疫グロブリン分子であることがより好ましい。
【0084】
タンパク質分子を核酸分子に結合させるための当技術分野において知られている一般的な方法、例えば２つの異なる反応基を有する化合物、例えばＮＨＳエステル基がアミン（amin）と反応し、かつ、マレイミド（maleimide）基がチオールと反応するＳＭＣＣ（succinimidyl 4-（N-maleimidomethyl）cyclohexane-1-carboxylate）を使用する核酸分子とタンパク質分子との間の結合反応に基づく方法によって前記ドッキングストランドを前記検出プローブとしての抗体又はアプタマーに結合させることができる。チオール基含有ドッキングストランドをＳＭＣＣと反応させ、かつ、生じた産物を前記検出抗体のＮ末端アミン基又はリシンのアミン基と反応させることにより前記ドッキングストランドを前記検出抗体に結合させることができる。
【0085】
測定の精度面では、前記検出抗体は一次抗体であることができ、前記ドッキングストランドがこれらの一次抗体に結合することができる。一方、測定速度の迅速性の面では、前記検出抗体は、一次抗体と二次抗体との組合せであることができ、前記ドッキングストランドがこれらの二次抗体に結合することができる。
【0086】
前記一次抗体は、バイオマーカーに特異的に結合する免疫グロブリン分子であってよく、それらの種類は限定されない。以下の実施例では、抗チューブリン（anti-tubulin）抗体、抗－Ｔｏｍ２０（anti-Tom20）又は抗－Ｔｈ２０（anti-Th20）抗体を前記一次抗体として使用した。
【0087】
前記二次抗体は、バイオマーカーに結合した前記一次抗体に結合する抗体のことであり、それらの種類は限定されない。以下の実施例では、ロバ抗ウサギＩｇＧ（Donkey anti-rabbit IgG）抗体又はロバ抗ラットＩｇＧ（donkey anti-rat IgG）抗体を前記二次抗体として使用した。
【0088】
工程（ｃ）では前記ドッキングストランドに対して相補的に結合可能な少なくとも１つの別個のストランドを前記ドッキングストランドに導入する。
【0089】
前記ドッキングストランドか前記別個のストランドのどちらか、又は両方を、少なくとも１種類のドナー蛍光物質及び少なくとも１種類のアクセプター蛍光物質で標識する。
【0090】
前記別個のストランドは、前記ドッキングストランドに対して相補的に結合可能であり、かつ、それらのストランドに結合している蛍光物質の種類に応じて、ドナーストランド、アクセプターストランド（acceptor strand）、及びフレットストランド（fret strand)
に分類可能である。前記ドナーストランドは、ドナーとして作用する少なくとも１種類の蛍光物質で標識されてよく、前記アクセプターストランドは前記ドナー蛍光物質から移転されたエネルギーによって励起され得るアクセプターとして作用する少なくとも１種類の蛍光物質で標識されてよい。前記フレットストランドはフレットペアを形成するドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の両方を含んでよい。
に分類可能である。前記ドナーストランドは、ドナーとして作用する少なくとも１種類の蛍光物質で標識されてよく、前記アクセプターストランドは前記ドナー蛍光物質から移転されたエネルギーによって励起され得るアクセプターとして作用する少なくとも１種類の蛍光物質で標識されてよい。前記フレットストランドはフレットペアを形成するドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の両方を含んでよい。
【0091】
１つの実施形態において、前記別個のストランドは１種以上のドナー蛍光物質で標識されている１種以上のドナーストランド及び１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含んでよい。
【0092】
ＦＲＥＴは、２種類の異なる蛍光物質がお互いに対して非常に近い位置にあるときに一方の蛍光物質（ドナー）のエネルギーが他方の蛍光物質（アクセプター）に移転される現象である。この現象に基づいてターゲット物質を効果的に検出することが可能である。前記アクセプターが発光するためには前記アクセプターは前記ドナーから移転されたエネルギーを受け取る必要がある。このエネルギー移動は前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合しているときにだけ起こる。したがって、前記アクセプター由来の蛍光シグナルは前記ターゲット物質の位置を反映する。
【0093】
図１ｂは図１ａに示されるドナーストランドとアクセプターストランドを使用するＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ技術に基づくターゲット物質検出の原理を示している。フレット（ＦＲＥＴ）が起こるとエネルギーが前記ドナーから前記アクセプターに移転され、その結果として前記アクセプターが発光して明るく見える一方で前記ドナーが暗くなる。
【0094】
この技法によると、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴのイメージャーストランドは、ドナーストランドとアクセプターストランドに分けられる。前記ドナーストランド上に標識として導入されている蛍光物質がλｅｘの光により励起（excitation）されると観察される前記ドナー由来の蛍光シグナルは光学フィルターによって除去され、結果として前記アクセプター由来の蛍光シグナルが観察可能になる。すなわち、全てのドナー蛍光物質が光を発光し、その光が光学フィルターによって除去され、そしてアクセプター蛍光物質が直接的にλｅｘの光により励起されるのではないことでバックグラウンドノイズが非常に低くなる。前記ドナーが原因のバックグラウンドノイズは無視できるほど低いのでＤＮＡ－ＰＡＩＮＴと異なり前記ドナーストランドの濃度を数百ｎＭもの高い濃度にまで上昇させることができ、数百倍速く測定が達成される。
【0095】
１つの実施形態において、前記別個のストランドは１種以上のアクセプター蛍光物質で標識されている１種以上のアクセプターストランドを含み、前記ドッキングストランドは１種以上のドナー蛍光物質を含んでよい。蛍光物質としての量子ドットが前記ドッキングストランド内に導入されることが好ましい。この場合、蛍光タンパク質（fluorescent protein）、有機フルオロフォア（organic fluorophore）等が導入されたときと違って光退色（photobleaching）が起こらない。したがって、ドナー蛍光物質が原因の光退色の問題を解決するためにドナーストランドを導入する必要が無く、ドナーストランドの使用が原因のバックグラウンドノイズが低減し、結果としてシグナルノイズ比が高くなる。さらに、構成が簡単になり、これは経済的な視点から利点であり、分析過程を簡単にすることができる。
【0096】
前記ドッキングストランド（docking strand）及び前記別個のストランドを含むこれらの鎖は核酸、ポリペプチド、又は炭水化物であってよい。これらの鎖は前記ドッキングストランドが前記別個のストランドに対して相補的に結合し得る核酸であり、容易に合成され、高価格ではなく、かつ、蛍光物質の取り付けが容易な所望の部位を提供することが好ましい。これらの核酸は前記別個のストランドに対して相補的に結合可能なＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＭＮＡ、ＧＮＡ、及びＴＮＡからなる群より選択可能である。これらの核酸は一本鎖（single strand）でも二本鎖（double strand）でもよい。
【0097】
前記ドッキングストランドは、前記検出プローブに結合しており、前記イメージャーストランド、前記ドナーストランド、及び前記アクセプターストランドは、前記ドッキングストランドに対して相補的に結合できる。ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ技術が用いられるときに、前記イメージャーストランドが使用される。ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ法が用いられるときに、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが使用される。
【0098】
前記イメージャーストランドは、バイオマーカーの種類に応じて異なる配列を有することができる。例えば、２本のイメージャーストランドが２種類の異なるバイオマーカーに結合する場合、それらの鎖の配列は少なくとも１つの塩基について異なっており、これはそれらの異なる種類のバイオマーカーに結合したイメージャーストランドの配列がそれらのバイオマーカーの種類の数と無関係に異なっていることを意味している。
【0099】
１つの実施形態において、前記ドナーストランド及び前記アクセプターストランドはバイオマーカーの種類に応じて異なる配列を有する。例えば、異なる配列を有するＮ本のドナーストランドとＮ本のアクセプターストランドを使用することが、Ｎ種類の異なるバイオマーカーの検出に必要である。すなわち、前記ドナーストランドの配列は少なくとも１つの塩基について異なっており、前記異なる種類のバイオマーカーに結合する前記アクセプターストランドの配列も少なくとも１つの塩基について異なっており、そして全てのドナーストランドとアクセプターストランドが異なる配列を有している。
【0100】
１つの実施形態において、前記アクセプターストランドは前記バイオマーカーの一部又は全てと同じ配列を有していてよく、前記ドナーストランドの配列は前記アクセプターストランドの配列と異なっていてよく、かつ、バイオマーカーの種類に応じて互いに異なっていてよい。例えば、２種類の異なるバイオマーカーを検出しようとするとき、それらの異なるバイオマーカーに結合するドナーストランドの配列は少なくとも１つの塩基について異なっていてよく、それらのバイオマーカーの検出に同じ配列を有するアクセプターストランドを使用してよい。
【0101】
１つの実施形態において、前記ドナーストランドは前記バイオマーカーの一部又は全てと同じ配列を有していてよく、前記アクセプターストランドの配列は前記ドナーストランドの配列と異なっていてよく、かつ、バイオマーカーの種類に応じて互いに異なっていてよい。例えば、２種類の異なるバイオマーカーを検出しようとするとき、それらの異なるバイオマーカーに結合するアクセプターストランドの配列は少なくとも１つの塩基について異なっていてよく、それらのバイオマーカーの検出に同じ配列を有するドナーストランドを使用してよい。
【0102】
前記ドッキングストランドは前記ドナーストランドの配列と前記アクセプターストランドの配列に対して相補的な配列を含んでよい。
【0103】
これらのストランドは、様々な構造を有してよい。例えば、これらのストランドは、当技術分野において知られている構造を有してよい。あるいは、これらのストランドに前記蛍光物質を取り付けられるように官能基が導入されてもよい。これらのストランドに前記蛍光物質を前もって付着させてもよい。これらのストランドに官能基が導入されると、これらのストランドの所望の部位に所望の蛍光物質を付着させることが可能になる。それぞれのストランドに同じ官能基でも異なる官能基でも結合させてよい。前記ドナーと前記アクセプターとの間の距離及びＦＲＥＴ効率は、前記ドナーと前記アクセプターが結合するこれらの鎖の部位に応じて変化し得る。これらの性質から前記ターゲット物質の多重検出が可能になる。
【0104】
前記蛍光物質はＵＶ、可視又は赤外光、電気エネルギー、又は熱エネルギーなどの外部エネルギーによって励起され、そのエネルギーが光に変換される。前記蛍光物質の例には有機及び無機フルオロフォアが挙げられる。これらの有機フルオロフォアの例にはローダミン（Rhodamine）、アレクサ（Alexa）フルオロ色素、フルオレセイン（fluorescein）、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、ＦＡＭ（5-carboxy fluorescein）、ＡＴＴＯ色素、ＢＯＤＩＰＹ、ＣＦ色素、シアニン（Ｃｙ）色素、ＤｙＬｉｇｈｔフルオロ、及びテキサスレッド（Texas Red）が挙げられる。前記無機フルオロフォアは、例えば量子ドットであってよい。
【0105】
前記ドナーストランド（donor strand）に結合されている前記蛍光物質の発光スペクトルのピーク波長は、前記アクセプターストランド（acceptor strand）に結合されている前記蛍光物質の吸収スペクトルのピーク波長よりも短い。
【0106】
ドナーアクセプター間の関係における２種類の蛍光物質間のＦＲＥＴシグナルの強度はそれらの２種類の蛍光物質間の距離と相関する。例えば、各ＤＮＡ鎖は、各々がＡ、Ｔ、Ｇ、及びＣを含む４種類の異なる塩基のうちの１つ、１つの糖、及び１つのリン酸から構成されているヌクレオチドが直鎖状に配置されたものである。２本の鎖の塩基はお互いに対して相補的に結合する。各ヌクレオチドの塩基、糖、及びリン酸のうちのいずれか１つに所望の官能基又は蛍光物質を結合させてよい。ＤＮＡ二重鎖中のこれらの２つの隣接する塩基の間の距離は０．３４ｎｍであるので、フレットペアの距離は非所に精密に制御可能である。間にＭ塩基が存在する２種類の異なる蛍光物質で一本鎖ＤＮＡを標識することが望ましいとき、特定の塩基上にアミン基がタグ付けされ、その特定の塩基からＭ塩基離れている位置にある塩基上にチオール（sulfhydryl；ＳＨ）基がタグ付けされる。その後、前記アミン基と反応するＮＨＳエステル基が付いた蛍光物質Ａ及び前記チオール基と反応するマレイミド基が付いた蛍光物質ＢとそのＤＮＡを反応させてそのフレットペアを標識する。異なる反応基の使用により３種類以上の蛍光物質を用いる標識が可能になる。例えば、ＤＮＡの特定の位置にアルデヒド基が取り付けられ、そのアルデヒド基と反応するヒドラジド基が付いた蛍光物質ＣがそのＤＮＡに取り付けられる。
【0107】
前記ターゲット物質と前記検出又は捕捉プローブとの間の特異的な結合反応は、サンドイッチＥＬＩＳＡ又は特異的アプタマー（aptamer）結合などの免疫反応に基づく結合により進行し得る。
【0108】
後続の工程（ｄ）では、前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定することで前記ターゲット物質を検知する。フレット（ＦＲＥＴ）による前記蛍光シグナルの測定は、発光スペクトルの全体又は一部を測定する方法であることができる。例えば、前記ターゲット物質がＦＲＥＴ効率によって識別されるときには、各蛍光物質のスペクトルの一部（主にピーク）だけが測定される。前記ターゲット物質がスペクトル形状によって識別されるときにはスペクトルの全体が測定されてよい。
【0109】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）において発生した前記蛍光シグナルを検出することを含む。前記蛍光シグナルは前記イメージャーストランドが前記ドッキングストランドに結合したとき、又は前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合したときに発生し得る。具体的には、前記蛍光シグナルは前記イメージャーストランドが所定の時間にわたって前記ドッキングストランドに結合したままであるとき、又は前記ドッキングストランドのために前記アクセプターストランドに結合されている前記アクセプター蛍光物質に対して前記ドナーストランドに結合されている前記ドナー蛍光物質が所定の時間にわたって非常に近い位置にあるときに発生し得る。前記蛍光シグナルは高感度イメージセンサ（例えばＥＭＣＣＤ、ｓＣＭＯＳ、又はｉＣＭＯＳ）を使用して検出され得る。
【0110】
１つの実施形態において、ターゲット物質の検出方法は、前記ターゲット物質の検知後に前記ドナーストランド及び／又は前記アクセプターストランドを取り除き、取り除かれた前記ドナーストランド及び／又は前記アクセプターストランドとは異なるドナーストランド及び／又はアクセプターストランドを使用して工程（ｄ）を繰り返すことで、その他のターゲット物質を検知することをさらに含んでよい。前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドとを完全に取り除いた後に、異なるストランドの組合せを使用してよい。あるいは、前記ドナーストランドか前記アクセプターストランドのどちらかが安定的に前記ドッキングストランドに結合し、除去されずに残っていてもよい。それらの除去されていないドナーストランド又はアクセプターストランドは、共通のストランドとして使用され、他方の不安定に結合しているストランドは取り除かれる。
【0111】
前記方法は、多重検出用に異なる配列のストランドの使用に基づいている。したがって、ドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド（又はアクセプターストランド又はドナーストランドとアクセプターストランドの両方）をＮ回付加し、続いて反復洗浄することによりＮ種類の標的が検出可能である。例えば、前記複数のバイオマーカーは、それらのバイオマーカーの種類の数と同じ回数だけ工程（ｃ）と工程（ｄ）とを繰り返すことにより検出され得る。蛍光物質が結合しているドナーストランド（donor strand）とアクセプターストランド(acceptor strand)がドッキングストランドに結合すると発生する前記蛍光シグナルを検出する。その後、結合したストランドを除去し、異なるストランドを使用して同じ手順を繰り返し、それにより生じた蛍光シグナルを検出する。この手順を数回、好ましくはバイオマーカーの種類の数と同じ回数だけ繰り返す。例えば、９塩基からなるドナーストランドは４９（＝２６２１４４）通りの配列を有し得る。これは、人体内のすべてのタンパク質の数よりも多いため、すべてのバイオマーカーの異なる塩基配列のドッキングストランドとアクセプターストランドとを割り当てることにより、すべてのバイオマーカーを順次測定することができる。
【0112】
ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間のＦＲＥＴ反応は様々な技術によって測定可能である。
【0113】
蛍光シグナルが発生するとその蛍光シグナルは回折現象のために実際の大きさよりもずっと大きく見える。したがって、２つのターゲット物質が基板上でお互いに対して非常に近い位置にあり、かつ、蛍光シグナルを同時に発光するとき、点状の発光領域が重なり合い、蛍光シグナルの正確な測定が不可能になる。
【0114】
１つの実施形態において、前記ドッキングストランドは前記アクセプター蛍光物質で標識されても前記アクセプターストランドと結合してもよい。この実施形態では、前記バイオマーカーは、前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合したときに発生した前記蛍光シグナルのＦＲＥＴ効率又は発光スペクトルを測定することにより検出され得る。前記ドナーストランドは全てのドッキングストランドに１回又は複数回結合する。したがって、前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合するときはいつでもＦＲＥＴ効率又は発光スペクトルが測定される必要がある。したがって、比較的に全てのバイオマーカーを検出するために長い時間（数十秒～数分）が必要になるが、２種類のバイオマーカーはお互いに対して非常に近くに存在するにも関わらず識別可能である。お互いに対して非常に近い位置にある２種類の蛍光物質が同時に発光するとき、輝点が二重になっている１つの光点だけがカメラで観察され、前記蛍光物質のＦＲＥＴ効率の識別が不可能になる。対照的に、２種類の蛍光物質が時間的に間隔を空けて連続的に発光するとき、各光点の正確な位置及びＦＲＥＴ効率を測定することが可能であり、その結果として２種類のバイオマーカーが検知可能である。さらに、１本のドッキングストランドにおいて幾つかのＦＲＥＴ効率が測定可能であり、このことは多重検出にとって有利である。幾つかのＦＲＥＴ効率を有する蛍光物質が同時に発光する場合、それらのＦＲＥＴ効率を個々に決定することはできない。
【0115】
１つの実施形態において、前記ドッキングストランド上に前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質を標識として導入している状態、又は前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの両方が前記ドッキングストランドに結合している状態で、前記ドナーストランドが励起された後に蛍光シグナルを測定してよい。前記ドナーが励起されるとすぐに全てのフルオロフォアが発光するため、短い時間で蛍光シグナルを測定することが可能である。しかしながら、前記バイオマーカーの濃度が上昇すると共に前記フルオロフォア間の距離が減少するときに点状の発光領域が重なり合い、蛍光シグナルを正確に測定することが困難になる。さらに、１種類のバイオマーカーについて幾つかのＦＲＥＴ効率を測定することはできず、検出され得る前記バイオマーカーの数が減少する。しかしながら、前記バイオマーカーは発光スペクトルの形状によって識別されるため、前記バイオマーカーの多重検出には問題が無い場合がある。
【0116】
本開示のその他の態様は、（ａ）ターゲット物質に特異的に結合し、かつ、ドッキングストランドと結合している１種以上の検出プローブ、及び（ｂ）前記ドッキングストランドに対して相補的に結合する１種以上の別の巣津ランドを含むターゲット物質検出用キットを提供する。前記ドッキングストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方が、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質で標識されており、前記ドナー蛍光物質が励起されると前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる。
【0117】
１つの実施形態において、前記キットは、前記ターゲット物質を捕捉できる基板をさらに含んでよい。前記ターゲット物質以外の物質の前記基板への非特異的結合を防止するため、又は前記基板上への前記ターゲット物質の付着を促進するために適切な被覆層を前記基板上に導入してもよいし、前記基板の表面を改変してもよい。前記ターゲット物質を前記基板上に直接的に付着させてよい。あるいは、前記基板に前もって付着させた捕捉プローブを用いた捕捉により前記ターゲット物質を導入してもよい。
【0118】
１つの実施形態において、前記キットは、（ａ）１種以上のドッキングストランドと結合している検出抗体、及び（ｂ）１種以上の蛍光物質標識ドナーストランドと蛍光物質標識アクセプターストランドを含む。前記キットは、これらのドッキングストランドと結合している検出抗体がバイオマーカーに結合し、かつ、これらのドッキングストランドがこれらのドナーストランドとアクセプターストランドに結合すると発生するシグナルを検出する。
【0119】
前記キットは、（ｉ）基板、（ｉｉ）捕捉抗体、（ｉｉｉ）ドッキングストランドと結合している、又は結合していない一次検出抗体、及びドッキングストランドと結合している二次検出抗体、並びに（ｉｖ）ドナーストランド及びアクセプターストランドを含んでよい。前記キットは、基板、捕捉抗体、ドッキングストランドと結合している一次検出抗体、ドナーストランド、及びアクセプターストランドから構成されることが好ましい。
【0120】
前記キットはバイオマーカー検出用のインビトロ診断用製品であってよい。例えば、前記キットは学術研究使用限定（ＲＵＯ）キット、臨床研究使用限定（ＩＵＯ）キット、又はインビトロ診断用（ＩＶＤ）キットであってよい。
【0121】
本開示の別の態様は、試料中の前記ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体を検出するための方法を提供する。この方法は（ａ）ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体を含有する試料を基板上に導入すること、（ｂ）前記ターゲット物質のストランドに対して相補的に結合可能な１種以上の別個のストランドを導入し、前記ターゲット物質のストランド若しくは前記別個のストランドのいずれか又は両方は、少なくとも１種のドナー蛍光物質及び少なくとも１種のアクセプター蛍光物質により標識されていること、及び（ｃ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して、前記ターゲット物質を検知することを含む。
【0122】
この態様では、ターゲット物質として核酸又は核酸類縁体を使用することにより、上述の態様と異なり、ドッキングストランドの必要性が回避されている。これらのターゲット物質は、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、無細胞性ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）若しくは循環性遊離ＤＮＡ、又は循環性腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）であることが好ましく、これらのターゲット物質は生物の正常な状態又は病気の状態を判定するために使用可能である。
【0123】
１つの実施形態において、ターゲット物質の検出方法は、（ａ）対象由来の試料中に存在する１種以上の核酸を基板表面に付着させること、（ｂ）前記核酸をドナーストランド及びアクセプターストランドに結合させること、及び（ｃ）工程（ｂ）において発生した蛍光シグナルを検出することを含んでよい。
【0124】
１つの実施形態において、蛍光シグナルの検出後に、結合されたドナーストランド及びアクセプターストランドが取り除かれ、異なるイメージャーストランド又は異なる組合せのドナーストランドとアクセプターストランドを、核酸に結合させて、そして検出しようとする核酸の種類数と同じ回数だけ工程（ｂ）と工程（ｃ）が繰り返される。
【0125】
前記各工程を具体的に説明する。
工程ａ）では、対象から採取された試料中に存在する１種以上の核酸を基板表面に付着させる。前記核酸は、バイオマーカーとして機能することができ、検出対象となり得る核酸を示す。これらの核酸は、ノンコーディングＲＮＡ（Non-cording RNA）であることが好ましい。ノンコーディングＲＮＡは、特定のタンパク質のアミノ酸をコードしていない種類のＲＮＡである。遺伝子配列の翻訳に関わるｍＲＮＡと異なり、ノンコーディングＲＮＡは様々な形態で存在し、ｍＲＮＡの副産物若しくは分解産物から、又は別個の転写過程を介して産生され得る。ノンコーディングＲＮＡは染色体の活性又はタンパク質の発現の制御に役割を果たすことが知られている。これらの検出対象となるＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、及びｓｃａＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを含み、マイクロＲＮＡであることが好ましい。
工程ａ）では、対象から採取された試料中に存在する１種以上の核酸を基板表面に付着させる。前記核酸は、バイオマーカーとして機能することができ、検出対象となり得る核酸を示す。これらの核酸は、ノンコーディングＲＮＡ（Non-cording RNA）であることが好ましい。ノンコーディングＲＮＡは、特定のタンパク質のアミノ酸をコードしていない種類のＲＮＡである。遺伝子配列の翻訳に関わるｍＲＮＡと異なり、ノンコーディングＲＮＡは様々な形態で存在し、ｍＲＮＡの副産物若しくは分解産物から、又は別個の転写過程を介して産生され得る。ノンコーディングＲＮＡは染色体の活性又はタンパク質の発現の制御に役割を果たすことが知られている。これらの検出対象となるＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、及びｓｃａＲＮＡなどの低分子ＲＮＡを含み、マイクロＲＮＡであることが好ましい。
【0126】
マイクロＲＮＡ（Micro RNA, miRNA）は、約２２塩基から成る非発現性小ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡはＲＮＡサイレンシング及び転写の後の遺伝子発現の制御に関与している。ｍｉＲＮＡは血液及び尿などの多くの体液中に見られ、それらのレベルは様々な疾患によって変化する。これらの理由のため、ｍｉＲＮＡはバイオマーカーとして注目を浴びている。
【0127】
ターゲット物質が核酸である場合、核酸は抗原抗体反応による捕捉が不可能であるため、本開示では、これらの検出しようとする核酸の一部分に対して相補的な配列を有する捕捉プローブを基板上に固定化し、そしてこれらの捕捉プローブに対して前記核酸を相補的に結合させることにより、これらの検出しようとする核酸を基板表面に付着させる。前記試料は核酸が含まれていない溶液で希釈されてよい。前記試料中の前記核酸の濃度は前記核酸の種類に応じて大きく変化してよい。したがって、前記試料はイメージセンサによって適切な数の前記核酸分子が検出されるように様々な比率で希釈されてよい。
【0128】
次の工程ｂ）では、前記核酸にドナーストランド（donor strand）及びアクセプターストランド(acceptor strand)を結合させる。前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドは、前記捕捉プローブに対して相補的に結合していない前記核酸の一本鎖部分に対して相補的に結合できるようにデザインされている。前記捕捉プローブ、前記ドナーストランド、及び前記アクセプターストランドは、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、ＰＮＡ鎖、及びＬＮＡ鎖からなる群より各々選択される。
【0129】
次の工程（ｃ）では、工程（ｂ）において発生した蛍光シグナルを検出する。前記蛍光シグナルは、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが、前記捕捉プローブに対して相補的に結合していない前記核酸の一本鎖部分に対して同時に結合すると発生する。より具体的には、前記蛍光シグナルは前記イメージャーストランドが所定の時間にわたって前記捕捉プローブに対して相補的に結合していない前記核酸の一本鎖部分に結合したままであるとき、又は前記核酸のために前記アクセプターストランド上に標識として導入されている前記アクセプター蛍光物質に対して前記ドナーストランド上に標識として導入されている前記ドナー蛍光物質が所定の時間にわたって非常に近い位置にあるときに発生し得る。前記蛍光シグナルは、高感度イメージセンサ（例えばＥＭＣＣＤ、ｓＣＭＯＳ、又はｉＣＭＯＳ）を使用して検出され得る。
【0130】
本開示の別の態様は、試料中のターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体を検出するためのターゲット物質検出用キットを提供する。このターゲット物質検出用キットは、ターゲット物質としての核酸又は核酸類縁体のストランドに対して相補的に結合する１種以上の別個のストランドを含む。これらの別個のストランドは、少なくとも１種類のドナー蛍光物質で標識されているドナーストランド及び少なくとも１種類のアクセプター蛍光物質で標識されているアクセプターストランドを含む。このドナー蛍光物質が励起されるとこれらのドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる。
【0131】
１つの実施形態において、ターゲット物質検出用キットは、蛍光物質が結合されている、ドナーストランド及びアクセプターストランドを１種以上含み、かつ、前記イメージャーストランド、又は前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドがターゲット物質に結合すると発生するシグナルを検出する。
【0132】
１つの実施形態において、前記キットは板上で前記核酸を捕捉できる基板をさらに含んでよい。
【0133】
１つの実施形態において、検出対象核酸の一部分に対して相補的な配列を有する捕捉プローブが基板上に固定化されてよい。あるいは、捕捉プローブを基板表面に取り付けられるように基板を表面修飾してよい。
【0134】
以下の実施例では、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴが、従来のＤＮＡ－ＰＡＩＮＴよりも有利であることが分かった。
【0135】
ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの顕微鏡観察が可能かを確認するために、石英の表面にドッキングストランドを固定した後、蛍光物質が結合されたドナーストランドとアクセプターストランドを注入し、その後で単分子像を記録し、その結果として明確な蛍光強度を確認した（実施例１－１及び図１ｃ参照）。
【0136】
また、２組のＦＲＥＴペア（Ｃｙ３－Ｃｙ５とＡｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５）を使用して同じ実験を実施した。その結果、Ａｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５のＦＲＥＴペア（FRET pair）はドナーストランドとアクセプターストランドとの間の間隔が２ヌクレオチドであるときに、Ｃｙ３－Ｃｙ５のＦＲＥＴペアはドナーストランドとアクセプターストランドとの間の間隔が６ヌクレオチドであるときに、蛍光シグナルが最も高いことを確認した（実施例１－１及び図１ｄ参照）。
【0137】
以下の実施例では、超高解像度蛍光像を評価し、様々なＤＮＡ濃度でのＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのシグナルノイズ比（ＳＮＲ）を比較した。その結果、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴについてはＤＮＡ濃度が５ｎＭ以上のとき、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについてはＤＮＡ濃度が１００ｎＭ以上のときにノイズが単分子像に発生し、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについてはＤＮＡ－ＰＡＩＮＴと比較してより高いイメージャー濃度で同じＳＮＲが得られることを確認した（実施例１－１及び図１ｅ～図１ｋ参照）。
【0138】
ドッキングストランドと結合している抗チューブリン抗体を用いて細胞を免疫染色し、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴを用いて微小管を観察し、そしてＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴを用いて同じ領域中の微小管を画像撮影した。また、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を定量及び比較し、その結果としてＤＮＡ－ＰＡＩＮＴについては合計３０分のイメージング時間の間に１０Ｈｚの速度で画像が記録され、かつ、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについては合計６０秒のイメージング時間の間に１０Ｈｚの速度で画像が記録され、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度がＤＮＡ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度よりも速いことが確認された（実施例１－２及び図２ａ～図２ｅ参照）。
【0139】
一方、ドッキングストランドと結合している抗チューブリン抗体及び抗Ｔｏｍ２０抗体を用いて細胞を免疫染色し、ドナーストランドとアクセプターストランドを用いて連続的又は同時にそれらの細胞を処理し、そして画像を記録し、その結果として前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドを用いる連続処理が多重イメージングにより効果的であることを確認した（実施例１－３及び図３ａ～図３ｈ参照）。
【0140】
様々なバイオマーカー濃度で画像中に見られる分子の数を測定した。その結果、それらの個々の分子は１０ｐｇ／ｍｇ～４００ｐｇ／ｍｌの範囲内ではよく識別され、これによりバイオマーカー濃度の測定が可能になった。対照的に、それらの分子は１０００ｐｇ／ｍｌを超える濃度では重なり合い始め、それにより正確な濃度の測定が不可能になった。濃度が約１００ｐｇ／ｍｌになるように、試料を適切な比率で希釈した後にそれらの分子の数を測定し、その希釈率で除算して元のバイオマーカー濃度と正確に一致するバイオマーカー濃度を計算した。現在広範に使用されているバイオマーカーの濃度範囲（数ｐｇ／ｍｌ～数十ｎｇ／ｍｌ）では正確な測定が可能であることを確認した（実施例１－４及び図４ａ～図４ｃ参照）。
【0141】
上記のように、単分子蛍光顕微鏡及びＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴシステムの使用は、従来の方法よりも１０００倍高い感度で、非常に少量の体液からの様々なバイオマーカーの検出を可能にするため、バイオマーカーを使用する従来の診断方法の課題を解決し、癌を含む様々な疾患の早期診断に有用である。
【0142】
本開示の方法とキットによるターゲット物質の効率的な検出のために、ドナーとアクセプターとの間のＦＲＥＴ効果を最大にする必要がある。この目的のため、前記ドナーのスペクトルと前記アクセプターのスペクトルが効果的に重複して最適なエネルギー移動を誘発するように適切なドナー及びアクセプターを選択することが好ましい。
【0143】
図５は、ドナー及びアクセプターのスペクトルの重複を示している。
【0144】
１つの実施形態において、前記ドナーのピーク吸収波長が前記アクセプターのピーク吸収波長よりも短く、かつ、前記ドナーのピーク発光波長が前記アクセプターのピーク発光波長よりも短いように前記ドナーと前記アクセプターを選択してよい。その結果、前記ドナーから前記アクセプターへエネルギーが移転可能であり、前記ドナーのピーク吸収波長が前記アクセプターのピーク吸収波長よりも短いので特定の波長の励起光によって前記ドナーだけが選択的に励起可能である。前記ドナー由来の蛍光シグナルはダイクロイックミラー、プリズム、又は回折格子などの適切なツールで除去可能であり、前記アクセプター由来の蛍光シグナルは前記ドナーのピーク発光波長が前記アクセプターのピーク発光波長よりも短いので選択的に検出可能である。
【0145】
前記ドナーと前記アクセプターとの間のＦＲＥＴ効率（ＥＦＲＥＴ）は式１によって計算される。
【0146】
【数1】
【0147】
式１中、Ｒはドナーアクセプター間の距離であり、Ｒ０（Forster radius：フェルスター半径）はＦＲＥＴ効率が０．５であるドナーアクセプター間の距離であって、下記の式２によって定義される。
【0148】
【数2】
【0149】
式２中、κは双極子配向（dipole orientation）の影響を表す定数であり、ｎは媒体の屈折率（reflective index）を表す定数であり、ΦＤは前記ドナー蛍光物質の量子収量(quantum yeild)であって、前記ドナー蛍光物質の種類に応じて変化し、ＪＤＡはスペクトル重なり積分（spectral overlap integral）であって、下記の式３によって定義される。
【0150】
【数3】
【0151】
式３中、εＡは前記アクセプター蛍光物質の吸光係数であり、そしてＦＤは前記ドナー蛍光分子の蛍光発光強度（fluorescence emission intensity）である。ＪＤＡは前記ドナー蛍光物質の発光スペクトルと前記アクセプター蛍光物質の吸収スペクトルとの間のスペクトルの重なりに応じて変化し、したがってΦＤと共にＲ０の決定に重要な因子である。
【0152】
例えば、励起光波長での前記ドナーの吸光係数（extinction coefficient）が前記アクセプターの吸光係数（extinction coefficient）よりも３倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上高くなるように前記ドナー及び前記アクセプターを選択してよい。この場合、励起光（excitation light）よりもむしろフレットによってエネルギーが前記ドナーから移転されると前記アクセプターの大半が励起し得る。前記アクセプターが励起光よりもむしろフレットによって励起されるので、前記アクセプターの吸光係数に対する前記ドナーの吸光係数の比率が上昇するにつれてシグナルノイズ比も上昇する。したがって、前記アクセプターの吸光係数に対する前記ドナーの吸光係数の比率が高いほどより好ましい。
【0153】
ターゲット物質の検出を容易するため、前記ドナーと前記アクセプターとの間のＦＲＥＴ効率は、蛍光シグナルがバックグラウンドノイズから識別可能であるように０．０５以上であることが好ましい。
【0154】
そのため、ターゲット物質検出のためのこれまでの方法のように前記アクセプターのシグナルを観察するときには、前記ドナーと前記アクセプターのフェルスター半径（又は、Forster distance：フェルスター距離）が、例えば０．２０８ｎｍ以上であるように、前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質を選択することが好ましい。別例として、ターゲット物質の多重検出のためにＦＲＥＴ効率を測定するときには、以下で説明するように、前記ドナーと前記アクセプターのフェルスター半径が、例えば０．８３ｎｍ以上であるように、前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質を選択することが好ましい。核酸を使用してドナーアクセプター間距離を調節する場合、それらの２種類の蛍光物質の間の最短の距離は１ｂｐ（base pair）、すなわち０．３４ｎｍである。したがって、フェルスター半径が０．２０８ｎｍ以上であるとき、ＦＲＥＴ効率は０．３４ｎｍの距離では０．０５以上であってよい。フェルスター半径が０．２０８ｎｍ未満である場合、ＦＲＥＴ効率は１ｂｐの距離では０に近づき、それにより前記アクセプターシグナルの観察が困難になる。フェルスター半径が大きくなるほど同じ距離ではＦＲＥＴ効率が高くなり、これにより前記アクセプターがより明るくなる。したがって、フェルスター半径が大きいほどより好ましい。
【0155】
別例として、多重検出のためにＦＲＥＴ効率を測定するときには０．８３ｎｍ未満のフェルスター半径によって距離依存的なＦＲＥＴ効率の著しい低下が引き起こされる。ドナーアクセプター間距離がわずかに３ｂｐになったときでもＦＲＥＴ効率が０．０５未満にまで低下し、これにより前記アクセプターシグナルの観察及びＦＲＥＴ効率の測定が困難になる。したがって、０．８３ｎｍ以上のフェルスター半径が３種類以上の異なるターゲット物質の検出に好ましい。フェルスター半径が大きいほど大きな距離範囲でＦＲＥＴ効率の差分検出が可能になる。
【0156】
最適なエネルギー移動の誘発のためには、前記ドナーアクセプター間相互作用を考慮して適切なドナーアクセプター間距離を決定することが必要である。
【0157】
図６はドッキングストランドに結合したドナーストランド及びアクセプターストランドを示している。図６を参照すると、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間の実際の間隔は例えばこれらの蛍光物質で標識されている鎖の塩基と塩基の間の距離に相当してよく、かつ、その間隔はこのドナー蛍光物質とこのアクセプター蛍光物質が標識として導入されているこれらの鎖の位置、又はこのドッキングストランドに結合したこれらのドナーストランドとアクセプターストランドとの間の間隔に応じて変化してよい。
【0158】
１つの実施形態において、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合するときに前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドとの間の間隔（一本鎖部分）は、前記ドッキングストランドの持続長(persistence length)よりも短い。
【0159】
例えば、二本鎖（double strand）ＤＮＡの塩基間距離が０．３４ｎｍであり、かつ、持続長が５０ｎｍである一方で一本鎖（single strand）の塩基間距離は０．５ｎｍ以上であり、かつ、持続長はわずかに数ｎｍである。本明細書において使用される「持続長（(persistence length)）」という用語は、ＤＮＡなどの高分子鎖がその直線性を維持しているときの距離を意味し、持続長はその高分子鎖の構造及び荷電、並びに緩衝液の塩濃度などの様々な因子に応じて変化し得る。前記一本鎖ドッキングストランドの持続長が前記間隔（gap）よりも長い場合、前記ドッキングストランドはその間隔のどこかで折り曲げられる可能性がある。この場合、ドナーアクセプター間距離は意図した距離よりもずっと短い可能性があり、結果として所望の蛍光シグナルを得られず、問題となる場合がある。したがって、前記ドッキングストランドがその直線性を維持するように前記間隔は前記ドッキングストランドの持続長よりも短いことが好ましい。
【0160】
１つの実施形態において、蛍光物質をストランド上に付着するときに、可撓性リンカーをこれらのストランドと蛍光物質との間に挿入してよい。これらのリンカーによってフルオロフォアは自由に回転するようになるので観察者が見る方向と無関係に明度が一定に維持され得る。これらのリンカーの各々は－ＣＨ２－及び－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－などの１以上の可撓性又は回転可能反復単位を含んでよい。これらのリンカーは０．１ｎｍ～最大で１０ｎｍの長さであってよい。これらのリンカーの長さが大きいとき、前記フルオロフォアの観察される位置は大きく変化する。これらのリンカーが過度に長い場合、前記ターゲット物質を識別することが困難であり得る。したがって、これらのリンカーの長さを１０ｎｍ以下に限定することが好ましい。
【0161】
前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質はアレクサ及びＣＦなどの親水性蛍光物質、並びにＣｙ及び量子ドットなどの疎水性蛍光物質であってよい。しかしながら、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが相互に作用するほど充分に近くに存在する場合、親水性蛍光物質のみ、又は親水性蛍光物質と疎水性蛍光物質の組合せとすることが好ましい。お互いに対して非常に近くに存在する２種類の疎水性蛍光物質の間での疎水性相互作用が蛍光シグナルを不安定にする場合がある（図１（ｄ）のＣｙ３－Ｃｙ５）。
【0162】
１つの実施形態において、前記蛍光シグナルを安定化するために、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、ニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）、又はトロロックスなどの安定化剤を、蛍光物質又は蛍光物質の近傍に付着してよく、又はそのような安定化剤が緩衝液中に存在してよい。
【0163】
１つの実施形態において、酸素によって前記蛍光物質が光退色（hotobleachimg）することを防止するために酸素捕集剤（例えば、グルコース＋グルコースオキシダーゼ＋カタラーゼ又はＰＣＡ＋ＰＣＤ）が緩衝液中に存在してよい。
【0164】
ターゲット物質の検出の正確性を向上させるために前記蛍光シグナルのノイズを最小にする必要がある。この必要性を満たすため、前記ドナーに由来する前記蛍光シグナルを最小にするための光学フィルターを使用して前記ドナーの発光波長を適切に除去できる。
【0165】
１つの実施形態において、前記光学フィルターの波長は、前記蛍光シグナルのシグナルノイズ比（ＳＮＲ）が２以上であるように調整されてよい。例えば、ロングパス(long-pas)フィルターのカットオン波長、ショートパス(short-pass)フィルターのカットオフ波長、又はバンドパス(band-pass)若しくはバンドリジェクション(band-rejection)フィルターの開始波長は前記アクセプターの発光スペクトルが０．０１であるときの波長以上であってよく、かつ、前記ドナーの発光スペクトルが０．０１のときの波長以下であってよい。
【0166】
図７は、前記ドナー蛍光物質の発光スペクトル（実線）及び前記アクセプター蛍光物質の発光スペクトル（破線）を示している。λｍｉｎは前記アクセプターの発光スペクトルが０．０１であるときの波長を表し、λｍａｘは前記ドナーの発光スペクトルが０．０１であるときの波長を表す。
【0167】
所定の波長より上の波長を通過させるロングパスダイクロイックミラー（long-pass dichroic mirror）若しくはロングパスダイロイックフィルター（long-pass dichroic filter）、所定の波長より下の波長を通過させるショートパスダイクロイックミラー(short-pass dichroic mirror)若しくはショートパスダイロイックフィルター(short-pass dichroic filter)、又は所定の波長帯を透過／反射させるバンドパスダイクロイックミラー(band-pass dichroic mirror)若しくはバンドパスダイロイックフィルター(band-pass dichroic filter)を使用して前記ドナーシグナルを除去でき、かつ、前記アクセプターシグナルを検出できる。
【0168】
カットオン（cut on）波長よりも長い波長を通過させるロングパスダイロイックフィルター（以下、単純に「フィルター」と呼ぶ）について、そのフィルターのカットオン波長がλｍｉｎよりも短いときにドナーシグナルが増加しても光学フィルターを通過するアクセプターシグナルは同じままであり、結果としてシグナルノイズ比が低くなる。したがって、前記カットオン波長はλｍｉｎ以上であることが好ましい。一方、前記カットオン波長がλｍａｘ以上であるときにアクセプターシグナルが減少してもダイクロイックミラーを通過するドナーシグナルは同じままであり、結果としてシグナルノイズ比が低くなる。したがって、前記カットオン波長はλｍａｘ以下であることが好ましい。
【0169】
本明細書においてシグナルノイズ比を以下のように定義できる。図８ａはカメラで撮影されたアクセプター蛍光シグナルを示している。シグナルの強度をノイズの強度と比較するために白い破線に沿って断面情報が得られている。この断面情報は図８ｂに示されている。このグラフはガウス関数によって近似されている。このガウス関数の振幅(amplitude)が「シグナル」として定義される。アクセプター蛍光シグナルを含まないその他の画素の値は正規分布のヒストグラムとして表現されている。この正規分布の半値全幅（full width at half maximum:ＦＷＨＭ）が「ノイズ」として定義される。このノイズに対するこのシグナルの比率がシグナルノイズ比（signal-to-noise ratio: ＳＮＲ）として定義される。
【0170】
他方、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの濃度の上昇はノイズ発生の原因になる。したがって、ノイズを低減させて前記アクセプターシグナルを正確に決定することが好ましい。前記ＳＮＲを考慮して、標的シグナルが最もよく検出される前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの濃度が選択可能である。
【0171】
１つの実施形態において、所定の組合せの前記ドナー／アクセプター蛍光物質と光学フィルターを使用するときに前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合するために必要な時間が平均で５０～１００秒であるように前記ドナーストランドの濃度を１０ｎＭ以上に調節してよく、又は前記シグナルノイズ(signal-to-noise ratio)比が２以上であるように１０μＭ以下に調節してよい。
【0172】
前記ドッキングストランドへの前記ドナーストランドの結合は前記アクセプターからシグナルが発生するための前提条件である。前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合するために必要な平均時間は、式４によって提示されるように前記ドッキングストランドの周囲にある前記ドナーストランドの濃度に反比例する。
【0173】
（式４）
ドナーストランドがドッキングストランドに結合するために必要な平均時間＝（５００～１０００秒×ｎＭ）／［ドナーストランド濃度（ｎＭ）］
ドナーストランドがドッキングストランドに結合するために必要な平均時間＝（５００～１０００秒×ｎＭ）／［ドナーストランド濃度（ｎＭ）］
【0174】
この平均時間はこの濃度が１ｎＭであるときに５００～１０００秒であり、この濃度が１０ｎＭであるときに５０～１００秒であり、そしてこの濃度が１００ｎＭであるときに５～１０秒である。ターゲット物質の正確な検出のために前記ドナーストランドは対応するドッキングストランドに対して５倍以上結合する必要がある。全測定を１０秒以内に完了させるために前記ドナーストランドの濃度は１０ｎＭ以上であることが好ましく、これは経済効率の点で好ましい。
【0175】
前記ドナーストランドの濃度が上昇するとノイズの強度が上昇しても前記アクセプターシグナルの強度は同じままであり、結果としてシグナルノイズ比が低くなる。前記ドナーストランドの濃度が１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下であるときに前記シグナルノイズ比は２以上である。前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドへの結合後に長い時間にわたって維持されるので、１μＭ以下の濃度は前記ドナーストランドと異なり前記アクセプターストランドには充分である。
【0176】
他方、前記ドッキングストランドに結合した前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの維持時間は、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの長さに応じて調節可能である。前記ドッキングストランドに対して安定的に結合している前記アクセプターストランドが長期に維持されることで前記ドナーストランドの導入後に短時間でのイメージングが可能になり、このことが検出時間の減少に寄与している。バイオマーカーは前記ドナーストランドが低濃度で使用されるときでも同じイメージング時間で容易に検出可能である。
【0177】
１つの実施形態において、これらの鎖がＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖であるときに前記ドッキングストランドに対して相補的なヌクレオチドの数は前記ドナーストランドについては６～１２であることが好ましく、前記アクセプターストランドについては８以上であることが好ましい。以下の実施例ではドッキングストランドに対して相補的に結合する７～９ヌクレオチド長のドナーストランドを普通に使用した。しかしながら、前記ドナーストランドの長さは緩衝液中の陽イオンの濃度が高いときには短くされてよく、緩衝液中の陽イオンの濃度が低いときには長くされてよい。前記ドッキングストランドに対して相補的な前記ドナーストランドの実際の長さが７ヌクレオチドであるとき、前記ドッキングストランドに対して相補的ではないミスマッチ（mismatch）配列を組み込むことにより前記ドナーストランドの全長が望み通りの長さにまで増加することになる。したがって、全長よりもむしろ相補的なヌクレオチドの数によって前記ドナーストランドを表すほうが好ましい。
【0178】
１つの実施形態において、これらのストランドがＤＮＡ又はＲＮＡよりもむしろＰＮＡ、ＬＮＡ、又はＧＮＡであってよいときに、前記ドッキングストランドに対して相補的なヌクレオチドの数は前記ドナーストランドについては３～９であることが好ましく、前記アクセプターストランドについては５以上であることが好ましい。ＸＮＡは前記ドッキングストランドに対する結合親和性がＤＮＡ又はＲＮＡよりも高いので前記ドッキングストランドに対して相補的なヌクレオチドの数が少なくてよい。
【0179】
前記ドッキングストランドの長さは意図されている前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの相補的結合にとっての最小レベルよりも上であることが好ましい。ミスマッチ配列又は間隔（一本鎖ＤＮＡ断片）を組み込むことにより上で説明したように望み通りの長さにまで前記ドッキングストランドの長さを増加させることができ、このことが前記ドッキングストランドをそれらの最小の長さによって表す理由である。
【0180】
前記アクセプターストランドは長い時間にわたって前記ドッキングストランドに結合したままでいるように、又は前記ドッキングストランドから解離しないように長い形状を有してよい。前記アクセプター蛍光物質も前記ドッキングストランドに対して直接的に結合してよい。励起光によってのみ励起されて発光する前記ドナーと異なり、前記アクセプターは前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合したときにのみ発光し、結果として光退色のリスクが低下する。
【0181】
前記アクセプターストランドは前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合する前に既に前記ドッキングストランドに結合していてよい。この場合、前記アクセプターストランドは比較的に長くてよく、前記ドナーストランドは前記アクセプターがＦＲＥＴによって発光する確率を上昇させるために短い長さであってよい。
【0182】
前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに結合したままでいる時間を「ａ」として定義し、かつ、前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに結合するためにかかる時間を「ｂ」として定義するとき、前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに結合したままでいる確率は「ａ／（ａ＋ｂ）」によって表される。前記アクセプターストランドの長さの増加と塩の濃度の上昇によってａは増加し、一方で前記アクセプターストランドの濃度の上昇によってｂが減少する。１という確率は前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合するときは常に前記アクセプターがシグナルを発することを意味している。０．５という確率は前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合するときに０．５の確率で前記アクセプターがシグナルを発することを意味する。すなわち、前記ドッキングストランドに結合する前記ドナーストランドの数が二倍になったときに同じアクセプターシグナルを得られる。まとめると、この確率が高くなる（すなわち、ａが高くなる、又はｂが低くなる）ことで検出時間が短くなる。
【0183】
既存の細胞イメージングアプローチにはアクセプターの光退色の懸念があるが、バイオマーカー検出では光退色の可能性は低い。好ましい実施形態では前記アクセプターストランドの長さを増加させるか、又は前記アクセプター蛍光物質を前記ドッキングストランド上に直接的に標識として導入することでａを増加させる。前記アクセプターストランドの濃度が上昇するとｂが減少することがあり、これはシグナルノイズ比の点で望ましくない。
【0184】
ＤＮＡ鎖は負に帯電しており、互いに反発する傾向がある。したがって、負に帯電しているＤＮＡ鎖を中和するために緩衝液に正の荷電を導入することが好ましい。ＤＮＡ鎖がお互いに対して相補的に結合するとき、２本又は３本の水素結合（引力）が塩基毎に形成される。したがって、配列が長くなるほど結合が安定する。Ｎａ＋の濃度が５００ｍＭであり、かつ、前記アクセプターストランドの長さが１０ヌクレオチドであるときに平均で４０秒間にわたって結合が維持される。長いアクセプターストランドの方が長い時間にわたって結合が維持される。
【0185】
例えば、ＰＮＡ鎖は負に帯電していないのでＤＮＡ鎖と異なりＰＮＡ－ＰＮＡ間結合とＰＮＡ－ＤＮＡ間結合はＤＮＡ－ＤＮＡ間結合よりもずっと安定している。したがって、ＰＮＡ鎖又はＬＮＡ鎖を前記アクセプターストランドとして使用でき、かつ、ＤＮＡ鎖を前記ドッキングストランド及びドナーストランドとして使用できる。
【0186】
他方、検出時に試料中のターゲット物質の濃度が過度に高いことがシグナルの重複の原因になる場合があり、これにより前記ターゲット物質を正確に定量することが困難になる。
【0187】
大半のターゲット物質の血液中濃度が知られているが、対象の状態に応じて大きく変化する場合がある。それらの濃度は前記ターゲット物質の種類に応じて１０－１５ｇ／ｍｌから１０－３ｇ／ｍｌまで約１０１２倍の範囲で変化することがある。
【0188】
したがって、例えば以下の手法によって検出画像中に正確な数の前記ターゲット物質が表示されるように前記試料を希釈する必要がある。先ず、ウェル１、ウェル２、ウェル３などを備えるウェルプレート（well plate）又はラブテック（Lab-Tek）を用意する。濃度が低いことが予期されるターゲット物質に対する捕捉抗体と検出抗体をウェル１とウェル２に添加する。濃度が高いことが予期されるターゲット物質に対する捕捉抗体と検出抗体をウェル２とウェル３に添加する。
【0189】
血液を標準的な濃度にまで希釈し、ウェル１に添加する。この標準希釈液をさらに希釈し、ウェル２に添加する。結果生じた溶液をさらに希釈し、ウェル３に添加する。ターゲット物質を基板上に固定化する。濃度が低いことが予期されるターゲット物質はウェル１において検出される。正確な数の前記ターゲット物質が観察されるまで測定を続ける。前記ターゲット物質の数が測定するには少なすぎる場合、ウェル１を幾つかの領域に分割し、それらの分割された領域中の前記ターゲット物質の数を合計する。一方、前記ターゲット物質の数が分析するには多すぎる場合、前記ターゲット物質を検出する試みはウェル２においてなされる。
【0190】
濃度が高いことが予期されるターゲット物質はウェル２において検出される。正確な数の前記ターゲット物質が観察されるまで測定を続ける。前記ターゲット物質の数が測定するには少なすぎる場合、ウェル２を幾つかの領域に分割し、それらの分割された領域中の前記ターゲット物質の数を合計する。一方、前記ターゲット物質の数が分析するには多すぎる場合、前記ターゲット物質を検出する試みはウェル３においてなされてよい。過剰に多数の前記ターゲット物質が見られるときでは分子間の重複が問題である。この問題は、前記ドナーストランドの濃度を低下させること、緩衝液中の塩の濃度を低下させること、又は多数のミスマッチを有するか、若しくは長さがより短い代わりのドナーストランドであって、元のドナーストランドよりも前記ドッキングストランドとの相補的結合の数が少ないことを意味する前記ドナーストランドを組み込むことによって解決可能である。
【0191】
以上説明したように、本開示に記載のターゲット物質の検出方法とキットの使用は、従来の方法とキットよりも１０００倍高い感度により非常に少量の体液からの様々なバイオマーカーの検出を可能にする。したがって、本開示の方法とキットは癌を含む様々な疾患の早期診断に有用である。
【0192】
アクセプター蛍光シグナルを観察するための上記の方法に加え、本開示は様々なフレットペアがターゲット物質の種類に応じて導入されている鎖を使用してＦＲＥＴ効率を測定することにより複数のターゲット物質を多重検出するための方法を提供する。
【0193】
本開示の別の態様は、蛍光物質で標識されているタグストランド（tagged strand）と結合している検出プローブを使用するターゲット物質検出のためのキットを提供する。このキットはターゲット物質に特異的に結合し、かつ、タグストランドと結合している１種以上の検出プローブを含む。これらのタグストランドは１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質を含む。これらのドナー蛍光物質が励起されるとこれらのドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）によって発光が起こる。
【0194】
１つの実施形態において、前記タグストランドは２組以上のフレットペアを有してよい。
【0195】
１つの実施形態において、前記キットは基板、蛍光物質で標識されている２種類以上のタグストランド、及びこれらのタグストランドと結合している２種類以上の検出抗体を含んでよく、このキットはそれらの蛍光物質によるＦＲＥＴ効率を利用して２種類以上のバイオマーカーを同時に検知する。前記蛍光物質は前記タグストランドの特定の塩基（base）、３’末端若しくは５’末端（end）、又は基本骨格（backbone）の上でドナー又はアクセプターとして作用してよい。前記タグストランド上に標識として導入されている前記ドナーと前記アクセプターとの間の距離に応じて測定された異なるＦＲＥＴ効率を利用して２種類以上のバイオマーカーを同時に検出できる。
【0196】
前記検出抗体は、抗原抗体反応を介するバイオマーカー検出用の検出プローブである。前記検出抗体の種類の数は標的バイオマーカーの種類の数と同じであることが好ましい。検出時にＦＲＥＴ効率を測定するためには前記蛍光物質で標識されている前記タグストランドと結合している前記検出抗体を使用することが好ましい。本開示の１つの実施形態において、前記タグストランドはＤＮＡ鎖であることが典型的であるが、必ずしもＤＮＡ鎖に限定されない。前記タグストランドは核酸又は核酸類縁体又は生体高分子であることが好ましい。これらの核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＭＮＡ、ＧＮＡ、及びＴＮＡからなる群より選択可能である。これらの生体高分子はポリペプチド及び炭水化物からなる群より選択可能である。
【0197】
本明細書において使用される「ＦＲＥＴ効率」という用語は、光により励起された蛍光物質から別の隣接する蛍光物質へ移動したエネルギーの値を指す。ＦＲＥＴ効率はこれらの蛍光物質間の距離に応じて変化する。具体的にはＦＲＥＴ効率は、下記の式５によって計算される値を意味する。
（式５）
ＦＲＥＴ効率＝（アクセプターから発せられた光の強度）／（ドナーから発せられた光の強度とアクセプターから発せられた光の強度の合計）
（式５）
ＦＲＥＴ効率＝（アクセプターから発せられた光の強度）／（ドナーから発せられた光の強度とアクセプターから発せられた光の強度の合計）
【0198】
前記ドナー又はアクセプターから発せられた光の強度は、ドナーアクセプター間距離の影響を受けることがあるが、ＦＲＥＴ効率は、特定の塩基、３’末端若しくは５’末端、又は骨格上に前記ドナー又はアクセプターを標識し、かつ、ドナーアクセプター間の距離を変えることにより制御可能である。
【0199】
ここでＦＲＥＴ効率は、前記ドナーの励起用の光により励起された前記アクセプターから発せられた光、光学要素（例えば、ダイクロイックミラー：dichroic mirror）によって完全には分離されない前記ドナー及び前記アクセプター由来の一部の光、又は前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の波長の差から生じるイメージセンサの検出効率の差を補正することにより取得可能である。
【0200】
以下の手法によって、ＦＲＥＴ効率を利用してターゲット物質を検出することが可能である。ドナーとアクセプターとの間に１塩基が存在するとき、このドナーとこのアクセプターとの間の間隔を「１」として定義する。ドナーとアクセプターを１、２、３、．．．ｎの間隔によってお互いから分離する２種類以上のタグストランドを構築する。データベースの構築のためにこれらの異なる間隔についてＦＲＥＴ効率を測定する。同じ種類のタグストランドは同じ種類の検出抗体に結合しており、異なる種類のタグストランドは異なる種類の検出抗体に結合している。その後、前記バイオマーカーを含有する試料との反応を進行させると前記バイオマーカーは特定の検出抗体と結合する。この時点で前記ドナーと前記アクセプターから発せられた光の強度を測定してＦＲＥＴ効率を計算する。この計算されたＦＲＥＴ効率を前記データベースに保存されている値と比較することにより前記検出抗体の種類を決定でき、かつ、前記バイオマーカーの種類を最終的に検知できる。
【0201】
例えば、これまでの説明に基づいて、ＦＲＥＴ効率を区別できる前記間隔が４～２０までの整数であると仮定すると１種類のドナーと１種類のアクセプターを使用して１７種類のタグストランドを構築することが可能である。２組のドナーアクセプターペアが存在する場合、同じ条件下で２８９種類のタグストランドを構築することが可能である。３組のドナーアクセプターペアが存在する場合、同じ条件下で４９１３種類のタグストランドを構築することが可能である。したがって、様々な種類のバイオマーカーの検出に必要な前記蛍光物質の種類の数を最小限にすることができる。
【0202】
１つの実施形態において、前記タグストランドを２種類以上の異なる蛍光物質で標識してもよい。図９は本開示の１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示している。図９に示されているようにバイオマーカーは基板上に固定化されており、タグストランド（検出抗体タグ）と結合している検出抗体が前記バイオマーカーに結合している。図９に示されているキットはＮ種類のバイオマーカーに対して特異的に結合するＮ種類の検出抗体、及び前記検出抗体に結合しているＮ種類のタグストランドを含む。
【0203】
前記異なるバイオマーカーに結合した前記異なる検出抗体に結合している前記異なるタグストランドから同じＦＲＥＴ効率が測定されるときにはこれらの検出されたバイオマーカーの種類を特定できないことがこの構成にする理由である。したがって、前記標的バイオマーカーの数と同じ数の異なるタグストランドを使用して区別できるＦＲＥＴ効率を取得することが好ましい。
【0204】
具体的には、前記２種類以上のタグストランド上に標識として導入されているドナーとアクセプターとの間に異なる数の塩基が存在してよい。より具体的には、前記タグストランド上に標識として導入されているドナー及びアクセプターの位置に応じて異なるＦＲＥＴ効率が得られてよい。前記タグストランドは複数のドナー又はアクセプターで標識されてよい。この場合、これらの２種類以上のドナーは前記アクセプターと異なる蛍光物質であってよく、かつ、様々な種類のものであってよい。あるいは、これらの２種類以上のアクセプターは前記ドナーと異なる蛍光物質であってよく、かつ、様々な種類のものであってよい。例えば、前記タグストランドは、図１０に示されているように、１つのアクセプターと複数のドナーによって標識されてよい。ここで、前記ドナーは、前記アクセプターと異なる蛍光物質であることが好ましく、かつ、様々な種類のものであることが好ましい。例えば、これまでの説明に基づいてＦＲＥＴ効率を区別できる前記間隔が４～２０までの整数であると仮定すると理論的には１組のＦＲＥＴ効率を有する１７種類のタグストランドを構築することが可能である。すなわち、理論的にはドナー１ドナー２の間、ドナー２ドナー３の間、ドナー３ドナー４の間、及びドナー４アクセプターの間の合計４組のＦＲＥＴ効率を有する４種類のドナーと１種類のアクセプターで標識されている８３５２１（１７×１７×１７×１７）種類のタグストランドを構築することが可能である。
【0205】
図１１は図１０に示されているタグストランド上に標識として導入されている蛍光物質からＦＲＥＴ効率を測定するための方法を示しており、かつ、単分子顕微鏡を使用する蛍光物質のイメージングの原理を模式的に示している。
【0206】
先ず、蛍光物質で標識されているタグストランドを基板上に固定化する。次に図１１に示されている単分子蛍光顕微鏡を用いて各蛍光物質の明度を観察する。光の回折に基づくと、約３００ｎｍ以内でお互いに対して近く存在する分子は識別されず、１つの光点として観察される。したがって、１本のタグストランド上に標識として導入されており、かつ、３００ｎｍ以下の距離で配置されている蛍光物質は１つの光点として現れる。対照的に、異なる蛍光物質が異なる波長の光線を発光するので特定の波長帯の光を反射／透過させる光学要素（例えば、ダイクロイックミラー：dichroic mirror）を使用して波長に応じてそれらの発光した光線を分離して特定の蛍光物質から発せられた光の明度を測定できる。
【0207】
図１１の左側の図は１つの画像の中の４種類の蛍光物質（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ７）から発せられた光をカメラで出力するための処理を模式的に示している。図１１の右側の図は蛍光物質の種類に応じた異なるカメラによる画像処理を模式的に示している。上記の処理を用いてドナーとアクセプターとの間のＦＲＥＴ効率を計算できるが、特に限定せずに他の処理を用いてもよい。具体的には、それぞれドナーカメラ及びアクセプターカメラを介してドナー及びアクセプターから発せられた光の強度をイメージングするための処理が分析時間の点で好ましい。
【0208】
図１２はドナーとしてのＣｙ３とＣｙ５及びアクセプターとしてのＣｙ７で標識されているタグストランドを使用する上記の方法によるイメージングの結果を示している。図１２を参照すると、図１１の左側の図に示されている方法によって明度値を測定したときに１つのモニター上で左から右に向かってＣｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ７の順序でこれらのイメージングの結果が提示された。前記タグストランド上に赤色レーザーを照射すると最初にＣｙ５が励起され、エネルギーがＦＲＥＴによってＣｙ７に移転され、そして光がＣｙ７から発光した。その結果、Ｃｙ３領域では何も観察されず、Ｃｙ５領域とＣｙ７領域でのみ明るい光点が観察された。ここでこれらの光点の明度比からＣｙ５とＣｙ７との間のＦＲＥＴ効率を測定してそれらの間の距離を決定した。さらに、緑色レーザーを照射するとＣｙ３が励起され、エネルギーがＦＲＥＴによってＣｙ５とＣｙ７に移転され、そして光がＣｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ７から発光した。この場合、前記の測定されたＣｙ５とＣｙ７との間のＦＲＥＴ効率に基づいてＣｙ３とＣｙ５との間の距離を決定した。
【0209】
【0210】
この実施形態では、これらのＦＲＥＴペアは隣接するＦＲＥＴペアのＦＲＥＴ効率に対する各ＦＲＥＴペアの影響を最小限にするために、お互いに距離が空いていることが好ましい。具体的には、これらの標識されているＦＲＥＴペアは、お互いに５ｎｍ以上離れていることがより好ましい。
【0211】
前記タグストランドの各々は異なる間隔でドナーとアクセプターがお互いに離れている２組以上のドナーアクセプターＦＲＥＴペアを含んでよい。測定時に生じる可能性がある誤差の範囲とノイズを考慮すると、測定されたＦＲＥＴ効率が充分に識別可能であるようにこれらの間隔は異なることが好ましい。
【0212】
別例として、前記２組以上のＦＲＥＴペアに同じ種類のドナーが使用される。この場合、標識されているアクセプターは同じ種類でも異なる種類でもよいが、前記アクセプターの種類は前記ドナーの種類とは異なることが好ましい。
【0213】
別例として、前記２組以上のＦＲＥＴペアに同じ種類のアクセプターが使用される。この場合、標識されているドナーは同じ種類でも異なる種類でもよいが、前記ドナーの種類は前記アクセプターの種類とは異なることが好ましい。
【0214】
具体的には、前記タグストランドの各々を２組のＦＲＥＴペアで標識するときに以下の４通りの組合せでそれらのＦＲＥＴペアのドナーとアクセプターを使用できる。
ｉ）前記ドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記アクセプターも同じ蛍光物質であってよい。
ｉｉ）前記ドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記アクセプターは同じ蛍光物質であってよい。
ｉｉｉ）前記ドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記アクセプターは異なる蛍光物質であってよい。
ｉｖ）前記ドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記アクセプターも異なる蛍光物質であってよい。
ｉ）前記ドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記アクセプターも同じ蛍光物質であってよい。
ｉｉ）前記ドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記アクセプターは同じ蛍光物質であってよい。
ｉｉｉ）前記ドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記アクセプターは異なる蛍光物質であってよい。
ｉｖ）前記ドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記アクセプターも異なる蛍光物質であってよい。
【0215】
組合せｉ）は、図１３に例示されている。図１３を参照すると、ドナー１とドナー２が蛍光物質Ａで標識されており、アクセプター１とアクセプター２が蛍光物質Ｂで標識されている。この同じ蛍光物質で標識されているこれらの２種類のドナーとこの同じ蛍光物質で標識されているこれらの２種類のアクセプターがお互いに対して隣接している場合、これらのドナーとアクセプターはこれらのドナーアクセプターＦＲＥＴペアのＦＲＥＴ効率に影響する。したがって、１本のタグストランドが図１３に示されているようにこの同じ蛍光物質で標識されている２種類以上のドナーとこの同じ蛍光物質で標識されている２種類以上のアクセプターで標識されるとき、これらのＦＲＥＴペアはお互いに５ｎｍ以上離れていることが好ましい。
【0216】
【0217】
図１４ａは組合せｉｉ）を示している。図１４ａに示されているようにドナー１は蛍光物質Ａで標識されており、ドナー２は蛍光物質Ｂで標識されており、及びアクセプター１とアクセプター２は同じ蛍光物質Ｃで標識されている。すなわち、１本のタグストランド上に標識として導入されているこれらの２組のＦＲＥＴペアは同じ種類のアクセプターで標識されている。
【0218】
図１４ｂは組合せｉｉｉ）を示している。図１４ｂに示されているようにドナー１とドナー２は同じ蛍光物質Ａで標識されており、アクセプター１は蛍光物質Ｂで標識されており、そしてアクセプター２は蛍光物質Ｃで標識されている。図１４ｃは組合せｉｖ）を示している。図１４ｃに示されているようにドナー１は蛍光物質Ａで標識されており、ドナー２は蛍光物質Ｂで標識されており、アクセプター１は蛍光物質Ｃで標識されており、そしてアクセプター２は蛍光物質Ｄで標識されている。すなわち、１本のタグストランドが異なる種類の蛍光物質で標識されている。
【0219】
図１４ａ～図１４ｃに示されているように第１のドナー１アクセプター１ＦＲＥＴペアと第２のドナー２アクセプター２ＦＲＥＴペアはお互いに距離を空けている。これにより図１３において説明したようにお互いに対する隣接するＦＲＥＴペアの影響が最小になる。これらの第１と第２のＦＲＥＴペアにおけるドナーとアクセプターとの間の間隔はお互いに同じでも異なっていてもよい。第１と第２のＦＲＥＴペアに同じ種類のドナー及び同じ種類のアクセプターを使用する場合、ｉ）ＦＲＥＴ効率がａ及びｂであるこれらの第１と第２のＦＲＥＴペアで標識されているタグストランドは、ｉｉ）ＦＲＥＴ効率がａ及びｂであるこれらの第１と第２のＦＲＥＴペアで標識されているタグストランドと識別できない。したがって、前記タグストランドｉ）及びｉｉ）のうちの１本だけが使用可能である。
【0220】
１つの実施形態において、前記タグストランドの各々は２組以上のＦＲＥＴペアを含んでよい。前記タグストランドの構造は上記の構造と同じものであってよい。すなわち、前記タグストランドは図１３に示されるタグストランドと類似していてよく、又は図１４ａ、図１４ｂ、又は図１４ｃに示される構造と同じものを有してよい。
【0221】
前記キットを使用するＦＲＥＴ効率の測定のため、前記ドナーが最初に励起される。励起から所定の時間の後では、前記蛍光物質はそれ以上発光せず、これを「光退色」と呼ぶ。一旦光退色が起こると光の強度が変化する。また、この場合に光退色の前後の光の強度を測定及び比較して各ドナーアクセプターペアのＦＲＥＴ効率を決定する。
【0222】
光退色の前後の光の明度値の比較によるＦＲＥＴ効率の測定は以下の基本原理に基づいている。光退色が起こると前記ドナーはそれ以上発光しないか、又はエネルギーを前記アクセプターに移転しない。前記アクセプターは前記ドナーからエネルギーを受け取れず、結果として前記ドナーと前記アクセプターから発せられた光の強度が低下する。対照的に、前記アクセプターに光退色が起こると前記ドナーはエネルギーを前記アクセプターに移転せず、かつ、全てのエネルギーを発光に使用し、結果として前記ドナーから発せられた光の明度が上昇し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度が低下する。実施例２－３を参照してさらに詳細にこの原理を説明する。
【0223】
１つの実施形態において、前記キットは捕捉抗体をさらに含んでよい。
【0224】
図１６は本開示の１つの実施形態による捕捉抗体を含むキットを模式的に示している。これらの捕捉抗体を前もって基板に付着させても検出時に基板に付着させてもよい。これらの捕捉抗体はタグストランドと結合していてよい。
【0225】
前記捕捉抗体に結合している前記タグストランド（以下、「捕捉抗体タグ」と呼ぶ）は前記検出抗体に結合している前記タグストランド（以下、「検出抗体タグ」と呼ぶ）と同一又は類似の骨格を有してよい。具体的には、前記タグストランドはＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、ＰＮＡ鎖、ＬＮＡ鎖、ＭＮＡ鎖、ＧＮＡ鎖、若しくはＴＮＡ鎖などの核酸又は核酸の類縁体、又はポリペプチド若しくは炭水化物などの生体高分子であってよい。前記タグストランドは図１７に示される構造を有してよいが、その構造に特に限定されない。
【0226】
１つの実施形態において、前記キットはブリッジストランドをさらに含んでよい。
【0227】
これらのブリッジストランドは前記検出抗体タグ及び前記捕捉抗体タグと同一又は類似の基本骨格を有することが好ましい。これらのブリッジストランドは特定の配列を有する一本鎖核酸であることがより好ましい。１つの実施形態において、これらのブリッジストランドは前記検出抗体タグ及び前記捕捉抗体タグに対して相補的に結合してよい。
【0228】
前記ブリッジストランドが一本鎖核酸であるとき、前記ブリッジストランドの配列の一部分は前記捕捉抗体タグの配列の一部分に対して相補的であり、前記ブリッジストランドのその他の配列は前記検出抗体タグの配列の一部分に対して相補的である。すなわち、前記ブリッジストランドの一部分が前記検出抗体タグ及び前記捕捉抗体タグに相補的に結合して２種類の異なる二本鎖核酸を形成する。この構造が図１８に示されている。
【0229】
バイオマーカーを識別するために必要な前記ＦＲＥＴペアの一部分は、前記検出抗体タグが前記ブリッジストランドに対して相補的に結合したときにのみ形成される。その他のＦＲＥＴペアは前記捕捉抗体タグが前記ブリッジストランドに対して相補的に結合したときにのみ形成される。バイオマーカー検出時の全てのＦＲＥＴペアの観察は前記ブリッジストランドが相補的に前記検出抗体タグ及び前記捕捉抗体タグに結合していることを示す。この観察は前記バイオマーカーが捕捉抗体及び前記検出抗体と結合していることも示す。対照的に、前記複数のＦＲＥＴペアの一部分だけの観察はバイオマーカーよりもむしろ基板への前記検出抗体の非特異的（non-specific）結合を示す。この非特異的結合は偽陽性（false-positive）シグナルを生成し、測定誤差の原因になる。すなわち、前記検出抗体タグ及び前記捕捉抗体タグに対して相補的に結合する前記ブリッジストランドを使用することがこの偽陽性シグナルの排除を可能にし、これにより分析結果の正確性の改善が達成される。
【0230】
１つの実施形態において、各ブリッジストランドの特定の塩基（base）、３’末端若しくは５’末端（end）、又は基本骨格（backbone）の上にドナー又はアクセプターを標識として導入してよい。前記ブリッジストランドの特定の塩基上にドナー又はアクセプターとして作用する蛍光物質を標識として導入することによりＦＲＥＴ効率を測定することが好ましい。
【0231】
前記捕捉抗体タグ、前記検出抗体タグ、及び前記ブリッジストランドの結合と以下のようなドナー又はアクセプターによる標識の後にＦＲＥＴ効率を測定できる。
【0232】
１）前記検出抗体タグが前記ブリッジストランドに対して相補的に結合して１又は複数の組のＦＲＥＴペアを形成する。
ａ）ドナーだけを前記検出抗体タグ上に標識として導入し、アクセプターを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ｂ）アクセプターだけを前記検出抗体タグ上に標識として導入し、ドナーを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ｃ）ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記検出抗体タグ上に標識として導入し、ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ａ）ドナーだけを前記検出抗体タグ上に標識として導入し、アクセプターを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ｂ）アクセプターだけを前記検出抗体タグ上に標識として導入し、ドナーを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ｃ）ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記検出抗体タグ上に標識として導入し、ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
【0233】
２）前記捕捉抗体タグが前記ブリッジストランドに対して相補的に結合して１又は複数の組のＦＲＥＴペアを形成する。
ａ）ドナーだけを前記捕捉抗体タグ上に標識として導入し、アクセプターを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ｂ）アクセプターだけを前記捕捉抗体タグ上に標識として導入し、ドナーを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
（ｃ）ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記捕捉抗体タグ上に標識として導入し、ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ａ）ドナーだけを前記捕捉抗体タグ上に標識として導入し、アクセプターを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
ｂ）アクセプターだけを前記捕捉抗体タグ上に標識として導入し、ドナーを前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
（ｃ）ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記捕捉抗体タグ上に標識として導入し、ドナーかアクセプターのどちらか、又は両方を前記ブリッジストランド上に標識として導入する。
【0234】
上記の原理を１）及び２）に適用してもよい。同じ種類のドナーと同じ種類のアクセプターで標識されているＦＲＥＴペアについて、ｉ）ＦＲＥＴ効率がａ及びｂである第１と第２のＦＲＥＴペアは、ｉｉ）ＦＲＥＴ効率がｂ及びａである第１と第２のＦＲＥＴペアと識別できない。したがって、ｉ）及びｉｉ）のどちらかのみが使用可能であるように前記捕捉抗体タグ、前記検出抗体タグ、及び前記ブリッジストランドを構築することが好ましい。測定されたＦＲＥＴ効率が識別可能であるような間隔で前記捕捉抗体タグ、前記検出抗体タグ、及び前記ブリッジストランドにドナー及びアクセプターを標識として導入することが好ましい。
【0235】
１）及び２）について、ドナー及びアクセプターは異なる蛍光物質で標識されていることが好ましい。複数のドナー又は複数のアクセプターを使用するとき、前記捕捉抗体タグ、前記検出抗体タグ、又は前記ブリッジストランド上に同じ種類又は異なる種類のドナーを標識として導入してよく、かつ、前記捕捉抗体タグ、前記検出抗体タグ、又は前記ブリッジストランド上に同じ種類又は異なる種類のアクセプターを標識として導入してよい。
【0236】
例えば、前記キットを使用してバイオマーカー１を検出するとき、捕捉抗体１、検出抗体１、及びブリッジストランド１が使用され、捕捉抗体タグ１及び検出抗体タグ１がブリッジストランド１に結合する。この場合、ドナー１が捕捉抗体タグ１の塩基のうちの１塩基の上に標識として導入されているとき、所望のＦＲＥＴ効率が得られるように捕捉抗体タグ１と結合しているブリッジストランド１の複数の部位の塩基のうちの１塩基の上にアクセプター１を標識として導入する。同時に、所望のＦＲＥＴ効率が得られるように検出抗体タグ１、及び検出抗体タグ１と結合しているブリッジストランド１の複数の部位を異なる蛍光物質としてのドナー１とアクセプター１又はドナー２とアクセプター２で標識してよい。あるいは、ドナー１とアクセプター２又はドナー２とアクセプター１を標識として導入してよい。ここでドナー１とアクセプター１は異なる蛍光物質であるほうがよく、ドナー２とアクセプター２も異なる蛍光物質であるほうがよい。
【0237】
本開示の別の態様は蛍光物質で標識されているタグストランド（tagged strand）と結合している検出プローブを使用するターゲット物質の検出方法を提供する。この方法は、ａ）ターゲット物質を含有する試料を基板上に導入すること、ｂ）タグストランドと結合している検出プローブを前記ターゲット物質に特異的に結合させること、ｃ）前記タグストランドを１種以上のドナー蛍光物質及び１種以上のアクセプター蛍光物質で標識すること、及び、ｄ）前記ドナー蛍光物質と前記アクセプター蛍光物質との間のフレット（ＦＲＥＴ）により発生した蛍光シグナルを測定して前記ターゲット物質を特定することを含む。
【0238】
１つの実施形態において、前記タグストランドは２組フレットペアを有してよい。
【0239】
ＦＲＥＴによって発生する前記蛍光シグナルは前記ＦＲＥＴ効率の決定によって評価され得る。これらのＦＲＥＴ効率は前記ドナー又はアクセプターの光退色の前後の光の明度値を測定することにより決定されてよい。
【0240】
前記ＦＲＥＴペアのＦＲＥＴ効率に影響を及ぼさないように前記フレットペアの間の間隔が制御される。前記フレットペアの間の間隔は５ｎｍ以上であることが好ましい。
【0241】
１つの実施形態において、複数のバイオマーカーの同時検出のための方法が提供される。この方法は２種類以上のバイオマーカーを基板に付着させること、蛍光物質で標識されているタグストランド（検出抗体タグ）と結合している２種類以上の検出抗体を前記２種類以上のバイオマーカーに結合させること、及びこの結合により発生した蛍光シグナルを測定してＦＲＥＴ効率を決定することを含む。この方法によると、前記蛍光物質のＦＲＥＴ効率を利用して前記バイオマーカーの種類を同時に検知し、かつ、単位面積当たりの前記バイオマーカーの数から試料中の前記バイオマーカーの濃度を決定することが可能である。
【0242】
前記蛍光物質は前記タグストランドの特定の塩基、３’末端（base）若しくは５’末端（end）、又は基本骨格（backbone）の上でドナー又はアクセプターとして作用してよい。ドナー又はアクセプターとして作用する前記蛍光物質はＦＲＥＴ効率を測定するために前記タグストランドの特定の塩基の上に標識として導入されることが好ましい。
【0243】
以下の手法によって、複数のバイオマーカーの同時検出のための前記キットを使用して前記方法を実施できる。
【0244】
前記方法を実施する前にＦＲＥＴ効率についてのデータベースを構築してよい。以下にこのデータベース構築を説明する。例えば、識別可能なＦＲＥＴ効率の基準値を前もって測定してデータベースを構築し、かつ、反応後に測定されたＦＲＥＴ効率と比較してバイオマーカーの種類を特定する。
【0245】
以下の手法によってＦＲＥＴ効率についてのデータベースを構築することが可能である。
【0246】
先ず、異なる蛍光物質Ａ及びＢをそれぞれドナー及びアクセプターとして使用し、かつ、ＤＮＡ骨格の特定の塩基の上に標識として導入して必要なだけ多くの種類の異なるＤＮＡ鎖を構築する。例えば、データベースに５０種類が必要なときに様々な距離でＡ及びＢによって標識されている５０種類のＤＮＡ鎖を調製する。ある物質を基板に塗布し、その塗布された物質に対する結合親和性を有する物質を各ＤＮＡ鎖の一方の末端に付着させ、かつ、固定化する。あるいは、前記ＤＮＡ鎖を直接的に構築する必要はなく、ドナー及びアクセプターとしての蛍光物質で標識されている市販のＤＮＡ鎖を使用してもよい。前記ドナー及び前記アクセプターとしての前記蛍光物質の決定では前記ドナー蛍光物質のピーク発光波長が前記アクセプター蛍光物質のピーク発光波長よりも短いことが好ましい。
【0247】
２種類以上のＤＮＡ鎖の調製後、距離１においてＡ及びＢで標識されているＤＮＡ鎖を基板上に固定化し、ＦＲＥＴ効率を測定する。その後、距離２においてＡ及びＢで標識されているＤＮＡ鎖から始めてそれらの標識されているＤＮＡ鎖に対して同じ手順を繰り返してＦＲＥＴ効率の基準値を取得し、それらの基準値をデータベースに構築する。
【0248】
その後、バイオマーカー検出時に測定されたＦＲＥＴ効率をこれらのＦＲＥＴ効率の基準値と比較する。この比較から検出に使用されるタグストランドのドナーとアクセプターとの間の距離を決定でき、結果としてこれらの検出されたバイオマーカーの種類を直接的に特定できる。
【0249】
しかしながら、ＦＲＥＴ効率の測定においてノイズが誤差の原因になる可能性がある。この可能性のため、異なる距離における全てのＦＲＥＴ効率が識別可能であるわけではない。例えば、距離１におけるＦＲＥＴ効率が０．９５（平均値）±０．０５（偏差）であり、かつ、距離２におけるＦＲＥＴ効率が０．９４±０．０５であるときにそれらの距離１及び２はこれらのＦＲＥＴ効率によって識別可能ではない。したがって、実際のバイオマーカー検出のために前記データベースに保存されている値の中でもＦＲＥＴ効率が明確に識別される値に相当する距離だけを使用することが好ましい。
【0250】
ＦＲＥＴ効率の基準値を得た後に、標的バイオマーカーを含有する試料を基板上に導入し、前記バイオマーカーを基板上に付着させる。
【0251】
１つの実施形態において、前記検出方法は、捕捉抗体を前記基板に付着させることをさらに含んでよい。これらの捕捉抗体はタグストランド（捕捉抗体タグ）と結合していてよい。
【0252】
例えば、捕捉抗体をｐＨ９．５で０．０６Ｍの炭酸緩衝溶液又は重炭酸緩衝溶液で希釈し、かつ、この希釈物を前記基板と所定の温度、所定の時間にわたって接触させることによりこれらの捕捉抗体を前記基板に吸着させてよい。あるいは、前記基板の表面をビオチン（biotin）化ＰＥＧ（polyethylene glycol）又はＢＳＡ（bovine serum albumin）で被覆し、この被覆基板にストレプトアビジン（streptavidi）を結合し、そしてこのストレプトアビジン結合基板にビオチン化捕捉抗体を結合することにより捕捉抗体を前記基板に吸着させてもよい。その後、前記基板を生試料又は処理済み試料で処理する。前記基板に吸着した捕捉抗体は前記試料中の前記バイオマーカーと複合体を形成する。さらに、非特異的に結合した抗体又は混入汚染物質の除去のためにツイーン２０又はトリトンＸ－１００などの洗浄緩衝液でこれらの複合体を洗浄することが好ましい。
【0253】
１つの実施形態において、前記検出方法は、前記捕捉抗体タグをブリッジストランドに結合させること、及び前記検出抗体タグをブリッジストランドに結合させることをさらに含んでよい。
【0254】
前記ブリッジストランドは前記タグストランド及び前記捕捉抗体タグの配列に対して相補的な配列を含んでよい。前記ブリッジストランドは一本鎖核酸である。この場合、前記ブリッジストランドの配列の一部分は前記タグストランドの配列に対して相補的であり、前記ブリッジストランドのその他の配列は前記捕捉抗体タグの配列に対して相補的である。この相補的結合はこれらの範囲に特に限定されない。
【0255】
前記検出抗体タグに関する全ての説明が前記捕捉抗体タグに適用可能であり、捕捉抗体を含む前記キット及び前記検出方法にも同等又は同様に適用可能である。
【0256】
前記方法とキットの使用によってＦＲＥＴ効率を利用する２種類以上のバイオマーカーの同時検出、及び少量の試料からの低濃度のバイオマーカーの検知が可能になる。具体的には、本開示の方法は１ｆｇ／ｍｌのレベルの極少量で存在するバイオマーカーを含む最大で約１０００種類のバイオマーカーの同時検出に効果的であり、検出及び分析に非常に短い時間しか必要としない。
【0257】
本開示の方法を用いる２種類以上のバイオマーカーの検出について以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。
【0258】
本開示の別の態様は、蛍光物質のＦＲＥＴ効率に基づくＮ種類のバイオマーカーの同時検出及び同時特定のためのキット及び検出方法を提供する。
【0259】
前記キットは、ドナーストランド、及びフレットペアを形成する２種類以上のアクセプター蛍光物質で標識されているアクセプターストランドを含んでよい。これらの２種類のアクセプター蛍光物質はドナー及びアクセプターとして作用し、したがって、これらのアクセプターストランドは「フレットストランド」と呼ばれる。
【0260】
具体的には、前記キット及び検出方法はドッキングストランド又はフレットストランド上に標識として導入されている２種類以上の蛍光物質のＦＲＥＴ効率、及びＮ種類のバイオマーカーを同時に検出するためのドナーストランド上に標識として導入されているドナーを利用する。
【0261】
前記キットは基板、Ｎ種類の検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド（docking strand）、及びこれらのＮ種類のドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド（donor strand）を含む。これらのドッキングストランド又はドナーストランドは蛍光物質を含む。これらの蛍光物質のＦＲＥＴ効率を測定してＮ種類のバイオマーカーを同時に検知する。
【0262】
１つの実施形態において、前記キットは蛍光物質で標識されているフレットストランド（FRET strand）をさらに含んでよい。これらのフレットストランドは前記Ｎ種類のドッキングストランドに対して相補的に結合してよい。
【0263】
前記蛍光物質は前記ドッキングストランド、前記ドナーストランド、又は前記フレットストランドの特定の塩基（base）、３’末端若しくは５’末端（end）、又は基本骨格（backbone）の上でドナー（donor）又はアクセプター（acceptor）として作用し得る。
【0264】
１つの実施形態において、前記キットは捕捉抗体をさらに含んでよい。
【0265】
本開示の１つの実施形態は、複数のバイオマーカーの同時検出のための方法であって、Ｎ種類のバイオマーカーを基板に付着させること、Ｎ種類のドッキングストランド（docking strand）と結合しているＮ種類の検出抗体をこれらのＮ種類のバイオマーカーに結合させること、ドナーストランド(donor strand)をこれらのＮ種類のドッキングストランドに結合させること、及びこれらのドッキングストランド又はドナーストランド上に標識として導入されている蛍光物質のＦＲＥＴ効率を測定することを含む前記方法を提供する。これらのＦＲＥＴ効率を利用して前記Ｎ種類のバイオマーカーを検知した後に単位面積当たりの前記バイオマーカーの数から前記バイオマーカーの濃度を測定する。
【0266】
１つの実施形態において、前記方法は蛍光物質で標識されているフレットストランド(FRET strand)を前記Ｎ種類のドッキングストランドに結合させることをさらに含んでよい。これらのフレットストランドは前記Ｎ種類のドッキングストランドに対して相補的であってよい。
【0267】
１つの実施形態において、前記方法は捕捉抗体を前記基板に付着させることをさらに含んでよい。
【0268】
例えば、以下の手法によってＦＲＥＴ効率を利用してターゲット物質を検出することが可能である。ドナーとアクセプターとの間に１塩基が存在するとき、このドナーとこのアクセプターとの間の間隔を「１」として定義する。ドナーとアクセプターを１、２、３、．．．ｎの間隔によってお互いから分離する２組以上のフレットペア（FRET pair）を形成する。データベースの構築のためにこれらの異なる間隔についてＦＲＥＴ効率を測定する。同じ種類のドッキングストランドは同じ種類の検出抗体に結合しており、異なる種類のドッキングストランドは異なる種類の検出抗体に結合している。Ｎ種類のＦＲＥＴペアが、これらのドッキングストランド上に直接的に標識として導入されてもよい。その後、バイオマーカーを含有する試料との反応を進行させると特定のバイオマーカーが特定の検出抗体に結合する。この時点で前記ドナーと前記アクセプターから発せられた光の強度を測定してＦＲＥＴ効率を計算する。例えば、ドナー１として作用する蛍光物質で標識されている前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合するとき、励起されたドナー１から発せられた光を吸収するドナー２とアクセプターから成るＦＲＥＴペアのＦＲＥＴ効率を測定できる。
【0269】
加えて、前記ＦＲＥＴペアは前記ドッキングストランド上ではなく前記フレットストランド上に標識として導入される。この場合、前記ドナーストランドと前記フレットストランドが前記ドッキングストランドに結合した時点でＦＲＥＴ効率を測定できる。これらの測定値を前記データベースに保存されている値と比較することにより検出に使用される前記検出抗体の種類を決定でき、かつ、前記バイオマーカーの種類を最終的に特定できる。
【0270】
【0271】
先ず、図１９に例示されているようにこのキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、及びこれらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランドを含む構成を有する。このドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、前記ドッキングストランド上にドナー２とアクセプター蛍光物質から成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。このドナーストランドがこのドッキングストランドに結合した時点でＦＲＥＴ効率を測定できる。
【0272】
１つの実施形態において、前記キットはフレットストランド（FRET strand）をさらに含んでよい。この実施形態では光退色せずに残っている前記蛍光物質で標識されている前記ドナーとフレットストランドが繰り返し前記ドッキングストランドに結合及び解離し、この繰り返しの結合と解離の間にＦＲＥＴ効率を測定できる。
【0273】
図２０に例示されているようにこのキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、これらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド、及びこれらのドッキングストランドのうちの特定のものに対して相補的に結合するフレットストランドを含む構成を有する。このドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、このフレットストランド上にドナー２とアクセプター蛍光物質から成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。このドナーストランドとこのフレットストランドの両方がこのドッキングストランドに結合した時点でＦＲＥＴ効率を測定できる。
【0274】
図２１に例示されているようにこのキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、これらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド、及びこれらのドッキングストランドのうちの特定のものに対して相補的に結合するフレットストランドを含む構成を有する。このドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、このフレットストランド上にドナー２、ドナー３、及びアクセプター蛍光物質から成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。２種類以上の蛍光物質を使用するこのフレットストランドの標識により最も少ない可能な数の種類の蛍光物質を使用する複数のバイオマーカーの検出が可能になる。
【0275】
図２２は本開示の１つの実施形態によるＮ種類のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示している。
【0276】
図２２に示されているようにこのキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、及びこれらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランドを含む構成を有する。このドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、前記ドッキングストランド上にドナー２とアクセプター蛍光物質から成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。検出抗体１に結合している前記ドッキングストランド上に標識として導入されているドナー２と前記アクセプターはそれらの低いＦＲＥＴ効率からお互いに離れて位置している。検出抗体Ｎに結合している前記ドッキングストランド上に標識として導入されているドナー２と前記アクセプターはそれらの高いＦＲＥＴ効率からお互いに対して近くに位置している。
【0277】
前記Ｎ種類のバイオマーカーに結合した前記Ｎ種類の検出抗体に結合している前記ドッキングストランドから測定されたＦＲＥＴ効率が同じであることによって、これらの検出されたバイオマーカーの種類の特定が不可能になることが、この構成にする理由である。
【0278】
したがって、識別可能なＦＲＥＴ効率を取得するためには、標的バイオマーカーの数に相当するＮ種類の異なるドッキングストランドとＮ種類の異なるＦＲＥＴペアを使用することが好ましい。これらのＮ種類のドッキングストランドに結合する前記ドナーストランドは、同じ種類であることが好ましい。
【0279】
具体的には、２種類以上の蛍光物質が前記ドッキングストランド上に直接的に標識として導入されているときに、これらの２種類以上の標識として導入されている蛍光物質の間に異なる数の塩基が存在してよい。より具体的には、異なるＦＲＥＴ効率を有しているＦＲＥＴペアで、前記Ｎ種類のドッキングストランドを標識してよい。２種類以上の蛍光物質がフレットストランド上に標識として導入されているときに、これらの２種類以上の標識として導入されている蛍光物質の間に異なる数の塩基が存在してよい。より具体的には、異なるＦＲＥＴ効率を有しているＦＲＥＴペアで前記Ｎ種類のフレットストランドを標識してよい。ここで前記ドッキングストランド又は前記フレットストランド上に標識として導入されている前記２種類以上の蛍光物質は、ドナー又はアクセプターとして作用してよい。
【0280】
図２３は、本開示のその他の実施形態によるＮ種類のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示している。図２３に例示されているように、このキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、これらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド、及びこれらのドッキングストランドのうちの特定のものに対して相補的に結合するフレットストランドを含む構成を有する。蛍光物質としてのドナー１が、このドナーストランド上に標識として導入されている。前記ドッキングストランドに対して相補的に結合したフレットストランド１上に標識として導入されているドナー２とアクセプターは、それらの低いＦＲＥＴ効率からお互いに離れて位置している。検出抗体Ｎに結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合したフレットストランドＮ上に標識として導入されているドナー２と前記アクセプターは、それらの高いＦＲＥＴ効率からお互いに対して近くに位置している。この構成及び原理は、これらのＦＲＥＴペアが前記ドッキングストランド上よりも、むしろ前記フレットストランド上に標識として導入されていることを除いて、図２２に示されている構成及び原理と同じである。
【0281】
図２４は、本開示のその他の実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを模式的に示している。図２４に例示されているように、このキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、これらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド、及びこれらのドッキングストランドのうちの特定のものに対して相補的に結合するフレットストランドを含む構成を有する。図２４に示されているように、２本のフレットストランド１－１及び１－２が１本のドッキングストランドに結合する。これらのドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、前記検出抗体に結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合したフレットストランド１－１及び１－２の各々の上に、ドナー２とアクセプターから成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。これらのＦＲＥＴペアは、異なるＦＲＥＴ効率を有するように標識として導入されることが好ましい。
【0282】
同じＦＲＥＴ効率を有するこれらのフレットストランドは、同じ配列を有してよい。したがって、１種類のフレットストランドが多くの種類のドッキングストランドに対して相補的に結合してよい。例えば、３種類のフレットストランドが０．２５、０．５、及び０．７５のＦＲＥＴ効率を有するようにデザインされている場合、バイオマーカー１が０．２５及び０．５のＦＲＥＴ効率を有するようにデザインされており、バイオマーカー２が０．２５及び０．７５のＦＲＥＴ効率を有するようにデザインされており、そしてバイオマーカー３が０．５及び０．７５のＦＲＥＴ効率を有するようにデザインされており、０．２５のＦＲＥＴ効率を有する前記フレットストランドはバイオマーカー１及びバイオマーカー２に結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合し、０．５のＦＲＥＴ効率を有する前記フレットストランドはバイオマーカー１及びバイオマーカー３に結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合し、そして０．７５のＦＲＥＴ効率を有する前記フレットストランドはバイオマーカー２及びバイオマーカー３に結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合する。ここで前記Ｎ種類のドッキングストランドに対して相補的に結合する前記フレットストランドの種類の数はＮよりも大きくなくてよい。
【0283】
図２５は、本開示の別の実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキット模式的に示している。図２５に例示されているように、このキットは、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、これらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド、及びこれらのドッキングストランドのうちの特定のものに対して相補的に結合するフレットストランドを含む構成を有する。このドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、前記検出抗体に結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合したフレットストランド１の上に、ドナー２とアクセプターから成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。ここでは、このドナーストランドとこのフレットストランドが相補的に結合する２か所以上の結合部位を前記ドッキングストランドの各々が有するように、前記ドッキングストランドを構築する。このドナーストランドとこのフレットストランドが１か所以上の結合部位に対して同時に結合するときにＦＲＥＴ効率を測定できるので、図２３の構造よりも少なくとも２倍速い急速分析がこの構造により可能になる。
【0284】
フレットペアが前記フレットストランド上よりも、むしろ前記ドッキングストランド上に標識として導入されているときでも同じ効果を実現することが可能である。
【0285】
前記ドッキングストランド又は前記フレットストランドは、複数のドナー又はアクセプターで標識されてよい。ここで、これらの２種類以上のドナーは前記アクセプターと異なる種類の蛍光物質であってよく、かつ、様々な種類の蛍光物質であってよい。あるいは、これらの２種類以上のアクセプターは、前記ドナーと異なる種類の蛍光物質であってよく、かつ、様々な種類の蛍光物質であってよい。
【0286】
一例として、１つの検出抗体に複数のドッキングストランドが付着する場合がある。これらのドッキングストランドは、同じ種類である。同じ種類のドナーストランドと同じ種類のフレットストランドが、各ドッキングストランドに結合する。この構造を図２６において模式的に示す。
【0287】
図２６は、検出抗体、これらの検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランド、これらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランド、及びこれらのドッキングストランドのうちの特定のものに対して相補的に結合するフレットストランドを含むキットを示している。具体的には、２本以上のドッキングストランドが１つの検出抗体に結合していてよい。このドナーストランド上に蛍光物質としてのドナー１が標識として導入されており、検出抗体１に結合している前記ドッキングストランドに対して相補的に結合したフレットストランド１の上にドナー２とアクセプターから成るＦＲＥＴペアが標識として導入されている。このドナーストランドとこのフレットストランドがこれらの２本以上のドッキングストランドのうちの１本に対して同時に結合するときにＦＲＥＴ効率を測定できるので、図２３の構造よりも２倍以上速い急速分析がこの構造により可能になる。すなわち、このキットが図２６に示されているときに達成される効果は、このキットが図２５に示されているときに達成される効果に類似している。フレットペアが前記フレットストランド上よりも、むしろ前記ドッキングストランド上に標識として導入されているときでも同じ効果を実現することが可能である。
【0288】
【0289】
図２７は、本開示の別の実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを示している。このキットは、マイクロＲＮＡの検出に適切である。このキットは、マイクロＲＮＡを含むＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を検出する。各標的核酸の一方の末端に、基板上に塗布されている物質に対する結合親和性を有する物質を取り付けた後、又は各標的核酸の一部分に対して相補的な核酸を基板に前もって塗布した後にＮ種類の標的核酸を前記基板上に固定化する。これらのＮ種類の標的核酸の配列は既知であるため、これらの標的核酸に対して相補的なＮ種類のドナーストランドとフレットストランドを使用してこれらの核酸を特定できる。
【0290】
図２８は、本開示の１つの実施形態に係るドナー１（Alexa Fluor 488）、ドナー２（Ｃｙ５）、及びアクセプター（Ｃｙ７）の吸収スペクトルと発光スペクトルを示している。図２８（ａ）は、これらの蛍光物質の吸収スペクトルを示している。例えば、図２８（ａ）中の黒色で垂直の破線は、ドナー１を励起するために使用される波長（４８８ｎｍ）を示している。ここでドナー１は励起されるが、ドナー２と前記アクセプターは励起されない。この場合、フレットによってエネルギーをドナー１から受け取ったときにのみドナー２と前記アクセプターが発光可能であるので、ドナー１で標識されている前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドに結合したときにのみこれらのフレットペアのＦＲＥＴ効率が測定可能である。フレットストランドを使用するときでは前記ドナーストランドと前記フレットストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合したときにのみこれらのフレットペアのＦＲＥＴ効率が測定可能である。
【0291】
図２８（ｂ）は、前記蛍光物質の発光スペクトルを示している。例えば、光学フィルター（dichroic mirror）を使用して、左と右の黒色で垂直の破線の間に規定される波長帯の中にある光の強度を統合することによりドナー２から発せられた光の明度を測定し、かつ、右の破線よりも長い波長帯の中にある光の強度を統合することにより、前記アクセプターから発せられた光の明度を測定する。このフレットペアのＦＲＥＴ効率は、ドナー２から発せられた光の明度と前記アクセプターから発せられた光の明度から計算可能である。ここで、ドナー１とドナー２との間のＦＲＥＴ効率が１に到達するようにし、そしてドナー１に由来するシグナルを光学フィルターによって除去した後に、ドナー２と前記アクセプターから発せられた光の強度だけを測定することが好ましい。
【0292】
加えて、前記ドナーストランド上に標識として導入されているドナー１と前記フレットストランド上に標識として導入されているドナー２との間の距離を変えることによりドナー１とドナー２との間のＦＲＥＴ効率を制御でき、ドナー１とドナー２から発せられた光の強度を測定することによりＦＲＥＴ効率を計算できる。この様にして複数のバイオマーカーを検出できる。
【0293】
図２９は、本開示の１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出の原理を模式的に示している。
【0294】
Ｎ種類のバイオマーカーを基板の上にあるウェルに付着させ、Ｎ種類のドッキングストランドと結合しているＮ種類の検出抗体をこれらのＮ種類のバイオマーカーに結合させ、そしてドナーストランドを含有する緩衝液（buffer）でこれらのウェルを満たす。これらのドナーストランドはこれらのウェルの中で前記ドッキングストランドに対して相補的に結合する。これらのフレットペアから発せられた光の強度を測定してＦＲＥＴ効率を決定し、かつ、前記複数のバイオマーカーを判別する。光学フィルター（dichroic mirror）を使用して異なる波長の光の強度を測定することにより、又はプリズム若しくは格子を使用して蛍光物質の相対スペクトル強度を測定することにより、これらのＦＲＥＴ効率を計算できる。
【0295】
図２９は、光学フィルター（dichroic mirroｒ）を使用して、ドナー２とアクセプターから発せられた光の強度を測定するための手法を示している。
【0296】
図２９（ａ）では、２種類のバイオマーカー１及び２が基板上に固定化されている。ドッキングストランド１と結合している検出抗体１がバイオマーカー１に結合しており、ドッキングストランド２と結合している検出抗体２はバイオマーカー２に結合している。図２９（ｂ）は、ドナーストランドがドッキングストランド２に結合し、結果としてＦＲＥＴペアが発光する状態を示している。ドナー２と前記アクセプターから発せられた光の明度値を測定してバイオマーカー２に対するＦＲＥＴ効率を計算する。図２９（ｃ）は、前記ドナーストランドがドッキングストランド２から解離し、結果として前記フレットペアが発光しない状態を示している。図２９（ｄ）は、前記ドナーストランドがドッキングストランド１に結合し、結果として前記ＦＲＥＴペアが発光する状態を示している。ドナー２と前記アクセプターから発せられた光の明度値を測定して、バイオマーカー１に対するＦＲＥＴ効率を計算する。図２９（ｅ）は、前記ドナーストランドがドッキングストランド１から解離し、結果として前記フレットペアが発光しない状態を示している。図２９（ｆ）は、前記ドナーストランドが再びドッキングストランド１に結合し、結果として前記フレットペアが発光する状態を示している。この場合もまた、ドナー２と前記アクセプターから発せられた光の明度値を測定して、バイオマーカー１に対するＦＲＥＴ効率を計算する。この観察領域中の全てのバイオマーカーに対するＦＲＥＴ効率が、各々１回又は複数回測定されるまでこの手順を継続する。その後、これらのＦＲＥＴ効率を利用して、前記バイオマーカーの種類を判別し、かつ、単位面積当たりの前記バイオマーカーの数から前記バイオマーカーの濃度を決定する。
【0297】
前記ドナーストランドの前記ドッキングストランドへの結合と前記ドッキングストランドからの解離にかかる時間は、前記ドナーストランドの種類（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等）、前記ドッキングストランドに結合する前記ドナーストランドの長さ、及び前記緩衝液のイオン濃度の変更により制御可能である。前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドの大半に結合するように時間を延長することができ、これが測定時間の減少に寄与する。一方、この時間を短縮すると前記ドナーストランドは、前記ドッキングストランドの大半に結合しない。フレットペアが発光するように、前記ドナーストランドが前記ドッキングストランドのうちの１つに一時的に結合する場合、隣接するドッキングストランドの大半は発光しない。したがって、他のフレットペアに干渉されずにＦＲＥＴ効率を測定でき、結果として１０ｎｍ未満の高い精度でこのフレットペアの位置を測定できる。さらに、１つの画像の中で多数のバイオマーカーを同時に測定でき、これにより高ダイナミックレンジ（dynamic range）が確保される。同じことがフレットストランドにも当てはまる。前記ドナーストランドの解離にかかる時間は数秒ほどの短い時間にまで短縮されることが好ましく、前記フレットストランドの解離にかかる時間は、数秒ほどの長い時間にまで延長されることが好ましい。
【0298】
前記ドッキングストランドへの前記ドナーストランド又はフレットストランドの結合速度が比例する前記ドナーストランド又はフレットストランドの濃度を上昇させることにより分析速度を上昇させることができる。
【0299】
図３０は、本開示の１つの実施形態に係るドナーストランドが、様々な濃度で記録された蛍光像を示している。図２８（ｂ）に示されているように、ドナー１のスペクトルはドナー２のスペクトルと部分的に重なり合っている。この重複領域はドナー２から発せられた光の明度の測定に影響を及ぼす。画像カメラを使用してドナー２から発せられた光の明度を測定した。これが図３０に示されている。図３０の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、それぞれ緩衝液中に、１００ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭの濃度で前記ドナーストランドが存在するときに記録された画像である。図３０に示されているように、ドナー２の画像中のバックグラウンドノイズは前記ドナーストランドの濃度が上昇すると共に増加し、ドナー２から発せられた光の明度の測定の正確性を悪化させた。すなわち、前記ドナーストランドの濃度が上昇すると共に分析速度が上昇したが、ＦＲＥＴ効率の測定の正確性が低下した。速度と正確性に関する必要条件を満たすために緩衝液中の前記ドナーストランドの濃度を１ｎＭ～１μＭに調節することが好ましい。
【0300】
別例として、複数のフレットストランドが、１本のドッキングストランドに結合する場合がある。この場合、このドッキングストランドに結合するドナーストランドの数はこれらのフレットストランドの数と同じであってよい。これらの複数のフレットストランドの上に標識として導入されているアクセプターが同じ種類であるとき、同じ種類又は異なる種類のドナーを標識として導入してよい。ここでこれらのドナーの種類は、これらのアクセプターの種類とは異なることが好ましい。
【0301】
具体的には、複数のフレットストランドが１本のドッキングストランドに結合するときにこれらのフレットストランド上に標識として導入されているドナー及びアクセプターは以下の４通りの組合せでこれらのフレットストランド上に標識として導入されている場合がある。
ｉ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプタも同じ蛍光物質であってよい。
（ｉｉ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプターは同じ蛍光物質であってよい。
ｉｉｉ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプターは異なる蛍光物質であってよい。
ｉｖ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプターも異なる蛍光物質であってよい。
ｉ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプタも同じ蛍光物質であってよい。
（ｉｉ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプターは同じ蛍光物質であってよい。
ｉｉｉ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは同じ蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプターは異なる蛍光物質であってよい。
ｉｖ）前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているドナーは異なる蛍光物質であってよく、前記複数のフレットストランド上に標識として導入されているアクセプターも異なる蛍光物質であってよい。
【0302】
前記蛍光物質は前記鎖の特定の塩基（base）、３’末端若しくは５’末端（end）、又は基本骨格（backbone）の上で、ドナー又はアクセプターとして作用してよい。ドナー又はアクセプターとして作用する前記蛍光物質は、ＦＲＥＴ効率の測定のために、前記ドッキングストランド、前記ドナーストランド、又は前記フレットストランドの特定の塩基の上に標識として導入されていることが好ましい。
【0303】
本開示において使用される前記試料は、血液、血清、血漿、唾液、組織液、及び尿からなる群より選択可能であるが、診断の種類又は性質に応じて標的バイオマーカーを含んでいる限り特に限定されない。
【0304】
アクセプターシグナルの観察により２種類以上のバイオマーカーを検出するためのＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴでは、１種類のドナーストランドが導入され、このドナーストランドに対して相補的なドッキングストランドが発見及び洗浄され、そしてこの処理がＮ回繰り返される。全測定時間はＮ分程度である（一種当たり１分程度であり、Ｎは数百から数千である）。数百ｎＭの濃度のドナーストランドがＮ回使用され、これは経済効率の点で不利である。
【0305】
対照的に、上述した本開示の方法によると、アクセプターストランドの配列よりもむしろアクセプターストランドのＦＲＥＴ効率を利用してターゲット物質が識別されるので、同じ種類のドナーストランドの使用が可能であり、新しいドナーストランドの導入と洗浄の必要性が回避される。全測定時間は約１分まで短縮可能であり、数百ｎＭの濃度のドナーストランドが１回だけ消費される。
【0306】
１本のアクセプターストランドによって、１０のＦＲＥＴ効率が識別可能であるので、ターゲットの数に応じてアクセプターストランドの数を増やすことができる。しかしながら、１本のアクセプターストランドで識別可能なターゲットの数が１０であるとき、２本のアクセプターストランドで識別可能なターゲットの数は１００ではなく５５である。この様に３本のアクセプターストランドで識別可能なターゲットの数は２２０ではなく１０００であり、４本のアクセプターストランドで識別可能なターゲットの数は７１５ではなく１００００である。これの理由は、０．１及び０．２のＦＲＥＴ効率に適合するターゲット１と０．１及び０．３のＦＲＥＴ効率に適合するターゲット２は互いに識別可能であるが、０．１及び０．２のＦＲＥＴ効率に適合するターゲット１と０．２及び０．１のＦＲＥＴ効率に適合するターゲット２はお互いに識別可能ではないことである。
【0307】
Ｎ種類の共通ドナーストランドを使用することにより上記の問題が解決可能である。例えば、共通ドナーストランドが使用される場合、０．１及び０．２のＦＲＥＴ効率に適合するターゲット１は０．２及び０．１のＦＲＥＴ効率に適合するターゲット２と識別できない。対照的に、主ドナーストランドが導入されるとターゲット１及びターゲット２についてそれぞれ０．１及び０．２が測定される。副ドナーストランドが導入されるとターゲット１及びターゲット２についてそれぞれ０．２及び０．１が測定される。したがって、ターゲット１及びターゲット２はお互いに識別可能である。すなわち、Ｎ種類の共通ドナーストランドが使用されるときにドナーストランドがＮ回だけ導入され、測定後に洗浄が繰り返され、そして１０Ｎ種類のターゲット物質、例えば、１００種類（Ｎ＝２）、１０００種類（Ｎ＝３）、及び１００００種類（Ｎ＝４）のターゲット物質が測定され得る。
【0308】
上記のように、ＦＲＥＴ効率を使用して２種類以上のバイオマーカーを同時に検出し、かつ、少量の試料の中に低濃度で存在するバイオマーカーの種類を識別することが可能である。蛍光物質で標識されているこれらの鎖はお互いに一時的に結合する傾向がある。したがって、ドナー又はアクセプターとして作用する蛍光物質に光退色が起きたときでも光退色せずに残っている蛍光物質で標識されているドナーストランド又はフレットストランドがドッキングストランドに結合し、結合と解離を繰り返している間にＦＲＥＴ効率を測定でき、これにより光退色が起こるか否かに関係なくＮ種類のバイオマーカーの同時検出が可能になる。
【0309】
前記フレットストランド上に標識として導入されている前記蛍光物質は、前記ドナーストランドと前記フレットストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合したときにのみ発光する。一方、フレットストランドを使用しないときに前記ドッキングストランド上に標識として導入されている前記蛍光物質は、このドナーストランドがこのドッキングストランドに結合したときにのみ発光する。したがって、隣接する蛍光物質に干渉されずにこの一時的に発光する蛍光物質を測定でき、結果として１０ｎｍ未満の高い精度で前記蛍光物質の位置を測定できる。さらに、１つの画像の中で多数のバイオマーカーを同時に測定でき、これにより高ダイナミックレンジ（dynamic range）が確保される。
【0310】
本開示の方法を用いるＮ種類のバイオマーカーの検出について、以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。
【0311】
本開示の別の態様は、異なる種類の蛍光物質間のフレット（ＦＲＥＴ）による発光スペクトルの測定に基づく、Ｎ種類のバイオマーカーの同時検出及び同時特定のためのキット及び方法を提供する。
【0312】
本開示によると、同じ組合せのアクセプター蛍光物質が種々のアクセプターストランド上に標識として導入されているが、これらのアクセプターストランド間の距離が異なるのでこれらのアクセプターストランドのＦＲＥＴ効率によってターゲットを識別できると判断されている。
【0313】
対照的に、異なる組合せのアクセプター蛍光物質が種々のアクセプターストランド上に標識として導入されており、これらのアクセプターストランドのＦＲＥＴ効率によってターゲットを識別できると判断されている。例えば、ターゲット１がアクセプター１とアクセプター２で標識されており、かつ、ターゲット２がアクセプター１とアクセプター５で標識されている場合、ターゲット１のスペクトルはターゲット２のスペクトルから識別される。したがって、種々のアクセプターが同時に発光し得るので全てのドナーとアクセプターをドッキングストランド上に標識として導入してよい。これらのドナーが励起されると全てのアクセプターが蛍光シグナルを発するので全測定時間をわずか数秒にまで短縮でき、かつ、これらのドナーストランドを使用する必要を回避でき、これは経済的に望ましい。
【0314】
１つの実施形態において、前記キットは基板、２種類以上の蛍光物質で標識されているＮ種類のドッキングストランド（docking strand）、及びこれらのドッキングストランドと結合しているＮ種類の検出抗体を含む。
【0315】
その他の実施形態では、前記キットは基板、１種以上の蛍光物質で標識されているＮ種類のドッキングストランド（docking strand）、これらのドッキングストランドと結合しているＮ種類の検出抗体、及び１種以上の蛍光物質で標識されているドナーストランド（donor strand）を含む。
【0316】
別の実施形態では前記キットは基板、Ｎ種類のドッキングストランド（docking strand）、これらのドッキングストランドと結合しているＮ種類の検出抗体、１種以上の蛍光物質で標識されているドナーストランド（donor strand）、及び１種以上の蛍光物質で標識されているアクセプターストランド（acceptor strand）を含む。
【0317】
上記の実施形態の各々において、前記蛍光物質は、前記ドッキングストランド、前記ドナーストランド、又は前記アクセプターストランドの特定の塩基（base）、３’末端若しくは５’末端（end）、又は基本骨格（backbone）の上でドナー（donor）又はアクセプター（acceptor）として作用してよい。
【0318】
前記実施形態によるキットは、異なる種類の蛍光物質間のフレット（ＦＲＥＴ）による発光スペクトルを測定して、Ｎ種類のバイオマーカーを同時に判別できる。
【0319】
前記ドッキングストランドは、前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランドと相補的に結合可能である。
【0320】
１つの実施形態において、前記キットの各々は捕捉抗体をさらに含んでよい。
【0321】
本開示の１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のための方法は、Ｎ種類のバイオマーカーを基板に付着させること、Ｎ種類のドッキングストランドと結合しているＮ種類の検出抗体をこれらのＮ種類のバイオマーカーに結合させること、及びこれらのドッキングストランドの発光スペクトルを測定することを含む。ここで異なる蛍光物質間のＦＲＥＴにより発光スペクトルを測定して前記Ｎ種類のバイオマーカーを同時に判別し、その後で単位面積当たりの前記バイオマーカーの数から試料中の前記バイオマーカーの濃度を測定する。
【0322】
本開示の１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のための方法は、Ｎ種類のバイオマーカーを基板に付着させること、Ｎ種類のドッキングストランド（docking strand）と結合しているＮ種類の検出抗体をこれらのＮ種類のバイオマーカーに結合させること、ドナーストランドをこれらのＮ種類のドッキングストランドに結合させること、及び発光スペクトルを測定することを含む。ここで異なる蛍光物質間のフレット（ＦＲＥＴ）により発光スペクトルを測定して前記Ｎ種類のバイオマーカーを同時に判別し、その後で単位面積当たりの前記バイオマーカーの数から試料中の前記バイオマーカーの濃度を測定する。
【0323】
１つの実施形態において、前記検出方法は、前記蛍光物質で標識されているアクセプターストランドを、前記ドッキングストランドに結合させることをさらに含んでよい。
【0324】
１つの実施形態において、前記検出方法は、捕捉抗体を前記基板に付着させることをさらに含んでよい。
【0325】
本開示に係るキットと検出方法によると、前記ドッキングストランド又は前記ドナーストランド又は前記アクセプターストランド上に標識として導入されている２種類以上の蛍光物質の共鳴により誘導されるＦＲＥＴに基づいて発光スペクトルを測定して、複数のバイオマーカーを同時に検出することができる。
【0326】
前記検出抗体は、抗原抗体反応に基づく検出に使用される。前記検出抗体の種類の数は、検出対象とするバイオマーカーの種類の数と同じであることが好ましい。前記Ｎ種類のドッキングストランド上に標識として導入されている前記ドナーか前記アクセプターのどちらかは同じ種類であり、これは検出キットの構成を簡単にするために好ましい。具体的には、前記Ｎ種類のドッキングストランド上に標識として導入されている前記ドナーが同じ種類であるときに、Ｎ種類のバイオマーカーを特定するために他の光源を使用せずに、わずかに１つの光源と光学フィルターを使用して前記ドッキングストランドの発光スペクトルを測定できる。より具体的には、前記ドナーとしての蛍光物質の発光スペクトルが前記アクセプターとして作用する蛍光物質の吸収スペクトルと所定の波長域において重複（overlap）するときにフレット（ＦＲＥＴ）が起こる。
【0327】
例えば、図３１に示されているように、同じ種類のドナーで標識されている前記ドッキングストランドが検出抗体１～Ｎに結合しており、かつ、アクセプター１～Ｎが前記ドッキングストランド上に標識として導入されているとき、同じ種類のドナーは初回の照射のためにわずかに１つの光源を励起する。発光スペクトルは前記アクセプターとして作用する前記蛍光物質の種類に応じて変化するので、光の測定スペクトルの決定により前記アクセプターの種類を特定できる。検出抗体Ｎに結合しているドッキングストランドＮのアクセプターＮによる標識が前記アクセプターで標識されている前記検出抗体の特定、及び前記検出抗体に対する結合親和性を有するバイオマーカーの種類の特定を可能にする。
【0328】
図３２に示されているように、検出抗体１～Ｎに結合しているドッキングストランドが同じ種類のドナーと同じ種類のアクセプターで標識されていてよい。これらのドナーとこれらのアクセプターとの間の距離は、図３２の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）に示されているように変化する。これらのドナーとこれらの前記アクセプターを使用することにより図３２の右のスペクトルに示されているようにＦＲＥＴ効率によるスペクトルの差に基づく複数のバイオマーカーの同時検出が可能になる。
【0329】
あるいは、図３３に示されているように、同じ種類のアクセプターと２種類以上のドナーを、検出抗体に結合しているドッキングストランド上に標識として導入してもよい。前記ドナーとして作用する２種類以上の蛍光物質のスペクトル（破線）が重複する（図３３の右のスペクトル参照）ので、これらの２種類以上の蛍光物質は１つの光源によって励起可能である。さらに、発光スペクトル（実線）は明確に識別可能である。まとめると、同じ種類のドナーを使用するよりも２種類以上のドナーを使用するほうが、より多種類のバイオマーカーの検出が可能になる（図３１又は図３２参照）。
【0330】
【0331】
これらの標識された２種類以上のアクセプターは、図３４ａに示されているようにお互いに隣接してアクセプターアクセプターフレットペアを形成してよく、又は図３４ｂに示されているようにお互いに隣接してドナーアクセプターフレットＴペアを形成してよい。これらのアクセプターアクセプターフレットペア内のこれらの標識されたアクセプター間の距離を変えることにより、バイオマーカーの種類を特定できる。図３４ｃは図３４ａに示されるような同じ種類のドナーと５種類のアクセプターで前記アクセプターアクセプターフレットペアを標識することによる多重検出の結果を示している。具体的には、図３４ｃは、下から順に（アクセプター１、アクセプター２）、（アクセプター１、アクセプター３）、（アクセプター１、アクセプター４）、（アクセプター１、アクセプター５）、（アクセプター２、アクセプター３）、（アクセプター２、アクセプター４）、（アクセプター２、アクセプター５）、（アクセプター３、アクセプター４）、（アクセプター３、アクセプター５）、及び（アクセプター４、アクセプター５）というフレットペアで標識されているドッキングストランドから発光した光のスペクトルを示している。すなわち、測定されたスペクトルに基づいて、これらのドッキングストランドの種類を明確に識別でき、結果としてこれらのドッキングストランドに使用されている前記アクセプターアクセプターフレットペアの種類を決定してこれらの検出されたバイオマーカーの種類を特定できる。
【0332】
本開示に係る前記実施形態によるキットは、単独で使用してもよく、約１０００種類のバイオマーカーの多重検出及び多重特定のためにそれらのキットを組み合わせて使用してもよい。
【0333】
１本のドッキングストランドに対して同じ２種類以上の蛍光物質を２組以上組み合わせることで、シグナル強度が２倍以上増強し得る。
【0334】
図３５ａ及び図３５ｂは、本開示の例となる実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のための方法を示している。これらの方法によるとＮ種類の検出しようとするバイオマーカーは、これらのバイオマーカーに特異的に結合するＮ種類の検出抗体に結合しているＮ種類のドッキングストランドの様々な発光スペクトルの測定によって特定可能である。
【0335】
先ず、バイオマーカーを基板上に固定化し、検出抗体と結合させる。Ｎ種類の捕捉抗体をこの基板に前もって取り付けてもよい。この場合、Ｎ種類の捕捉抗体が対応するバイオマーカーに特異的に結合することが好ましい。しかしながら、これは単に例示であり、急速で、経済的、かつ、簡便な測定のために、前記基板にこれらのバイオマーカーが直接的に付着してもよい。必要であれば測定結果の正確性をさらに高めるために、前記基板に取り付けられた捕捉抗体を使用して抗原抗体反応を介してこれらのバイオマーカーを検出してもよい。
【0336】
基板表面に、検出しようとするバイオマーカーを直接的に付着させてよい。あるいは、前記捕捉抗体がバイオマーカーを捕捉するために基板表面に取り付けられるように前記基板を表面修飾してよい。前記基板を前記捕捉抗体に特異的に結合可能な物質で被覆することが好ましい。具体的には、前記捕捉抗体に対して特異的であり、かつ、前記検出抗体又は鎖に対して非特異的である物質で前記基板を被覆することが好ましい。
【0337】
前記捕捉抗体をｐＨ９．５で０．０６Ｍの炭酸緩衝溶液又は重炭酸緩衝溶液で希釈し、かつ、この希釈物を前記基板と所定の温度、所定の時間にわたって接触させることによりこれらの捕捉抗体を前記基板に付着させてよい。前記基板の表面をビオチン（biotin）化ＰＥＧ（polyethylene glycol）又はＢＳＡ（bovine serum albumin）で被覆し、この被覆基板にストレプトアビジン（streptavidin）を結合し、そしてこのストレプトアビジン結合基板にビオチン化捕捉抗体を結合することにより前記捕捉抗体を前記基板に吸着させてもよい。その後、前記基板を生試料又は処理済み試料で処理する。前記基板に吸着した捕捉抗体は前記試料中の前記バイオマーカーと複合体を形成する。さらに、非特異的に結合した抗体又は混入汚染物質の除去のためにツイーン２０又はトリトンＸ－１００などの洗浄緩衝液でこれらの複合体を洗浄することが好ましい。
【0338】
上記のように、前記捕捉抗体、又は前記基板に塗布された前記物質を介して、前記基板にＮ種類のバイオマーカーが固定化され、前記検出抗体を前記バイオマーカーに結合させる。その後、ドッキングストランドの発光スペクトルを測定し、データベースに保存されている以前に測定された発光スペクトルと比較して対応するバイオマーカーを特定する。画像中の単位面積当たりの前記バイオマーカーの数を様々な濃度で以前に測定された単位面積当たりの前記バイオマーカーの数と比較することにより、前記バイオマーカーの濃度を測定できる。光源からの光の照射によりドナーを励起すると、図３５ａに示されているように各分子の発光スペクトルを画像中に観察し、データベースに保存されている以前に測定された発光スペクトル（Ａ、Ｂ、Ｃ等）と比較してどのバイオマーカーがこの画像中に観察された各分子に対応するか特定する（例えば、スペクトル形状がＡのときはバイオマーカー１、スペクトル形状がＢのときはバイオマーカー２、そしてスペクトル形状がＣのときはバイオマーカー３）。その後、画像中の単位面積当たりの前記バイオマーカーの数を測定し、その数を様々な濃度で以前に測定された単位面積当たりの前記バイオマーカーの数と比較することにより、前記試料中の各バイオマーカーの濃度を測定できる。例えば、所定の濃度（ｎｇ／ｍｌ）における以前に測定された単位面積当たりのバイオマーカー１の数が１０であり、かつ、実際に測定された単位面積当たりのバイオマーカー１の数が５であるとき、前記試料中のバイオマーカー１の濃度は０．５ｎｇ／ｍｌである。
【0339】
図３５ｂは、発光スペクトルを測定するための例となる方法を示している。例えば、一般的な顕微鏡を使用して様々な種類の蛍光物質を観察すると、左側の図に示されているように、発光スペクトルと無関係に円形の点像強度分布（point spread function；ＰＳＦ）が観察される。しかしながら、光路（optical path）上に、プリズム（prism）又は格子（grating）等の波長依存的な光路差を引き起こす光学要素を使用することによって、各蛍光物質の円形の点像強度分布を楕円形の点像強度分布に変形できる。元の円の中心をこの楕円の中心と比較し、かつ、この楕円の長軸に沿ってプロファイル分析することにより発光スペクトルを測定できる。この測定された発光スペクトルをデータベースに保存されている以前に測定された発光スペクトルと比較して、対応する分子の構成蛍光物質を決定する（「Ultrahigh-throughput single-molecule spectroscopy and spectrally resolved super-resolution microscopy」、Zhengyang Zhang, Samuel J Kenny、Margaret Hauser、Wan Li & Ke Xu著、Nature Methods誌、第１２巻（２０１５年）、９３５～９３８頁を参照）。
【0340】
１つの実施形態において、前記検出抗体に結合している前記ドッキングストランドがドナーストランド又はアクセプターストランドに対して相補的に結合してよい。
【0341】
この実施形態では前記ドナーストランドはドナーで標識されており、前記アクセプターストランドは、１種以上のアクセプター又はアクセプターアクセプターフレットペアで標識されている。前記ドッキングストランドが２種類以上のアクセプターで直接的に標識されているとき、図３６ａに示されているように前記ドナーストランドはそれらの標識領域に隣接する部位に対して相補的に結合できる。その結合時にフレットが起こり、結果として前記アクセプターが発光できる。前記ドッキングストランドが蛍光物質で標識されていないとき、図３６ｂに示されているように前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが繰り返し前記ドッキングストランドに結合及び解離する。したがって、前記アクセプターは前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合したときにのみ発光し、それらの発光スペクトルが測定され得る。この理由から、幾つかの蛍光物質で光退色が起こっているときでも所定の反応時間が許されるとすれば、光退色していない蛍光物質で標識されている前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランド同時に結合した時点で発光スペクトルを測定できる。さらに、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが前記ドッキングストランドに対して同時に結合した時点で、発光スペクトルを測定及び記録できる。これにより、前記バイオマーカーの種類に対応する多くの像が１つの画像の中に同時に出力され、前記バイオマーカーの特定を困難にするという問題に対する解決策を提供できる。
【0342】
【0343】
先ず、Ｎ種類のバイオマーカーを検出しようとするとき、Ｎ種類のドッキングストランド及びこれらのドッキングストランドに対して相補的に結合するドナーストランドとアクセプターストランドをデザインし、これらのストランドの発光スペクトルを前もって測定してデータベースを構築する。検出抗体１～Ｎをそれぞれバイオマーカー１～Ｎに結合させ、ドッキングストランド１～Ｎをそれぞれ検出抗体１～Ｎに結合させる。
【0344】
前記データベースの記録完了後に、前記バイオマーカーを基板上に固定化する。以下のように、前記検出しようとするバイオマーカーの種類に適した前記ドッキングストランドを使用して前記バイオマーカーを特定する。対応するバイオマーカーに前記検出抗体を結合させ、そして前もって構築した前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドを所定の時間にわたって繰り返し前記ドッキングストランドに結合及び解離させる。前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドが１本のドッキングストランドに対して同時に結合すると、図３７に示されているように画像中にシグナルが表示される。対応するシグナルのスペクトルを分析し、前記データベースに記録されている以前に測定されたスペクトルと比較してバイオマーカーの種類を特定する。これらのシグナルが各画像上で検出される位置が累積的に表示され、１つのバイオマーカー分子によって繰り返し発せられるシグナルがガウス関数（Gaussian function）の形態で、特定の位置の周りに集団を形成する。１集団を１バイオマーカー分子とみなすことによって、単位面積当たりの前記バイオマーカーの数を計算し、様々な濃度で以前に測定された単位面積当たりの前記バイオマーカーの数との比較によって、前記試料中の前記バイオマーカーの濃度を測定できる。
【0345】
図３１～図３４に示されている構造のうちの１つ、又はそれらのうちの２つ以上から成る組合せについて、前記ドナーストランド上にドナーを標識として導入し、かつ、前記ドッキングストランド又は前記アクセプターストランド上にアクセプターを標識として導入することにより約１０００種類のバイオマーカーを判別できる。例えば、図３８ａに示されているように複数のドナーストランドと複数のアクセプターストランドが、１本のドッキングストランドに対して相補的に結合する。この組合せによって、図３６ｂの構造によって検出されるバイオマーカーと同じ種類のバイオマーカーの検出が可能になる。前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドに対して相補的に結合する２か所以上の部位が前記ドッキングストランドに存在するため、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドがそれらの部位のうちのいずれか１つに対して同時に結合する限り発光スペクトルが測定可能である。したがって、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの結合と解離が繰り返されることが、前記ドッキングストランドへ結合する確率を上げ、これにより２倍以上速い検出が達成される。
【0346】
この場合、前記複数のドナーストランド上に種々のドナーを標識として導入してよい。隣接するアクセプター又はアクセプターアクセプターフレットペアが異なるＦＲＥＴ効率のために種々の距離で存在するように、前記複数のドナーストランドの各々をドナーで標識してよい。前記アクセプター又は前記アクセプターアクセプターフレットペアは異なる蛍光物質から構成されてよい。異なるＦＲＥＴ効率のために、前記ドナーから種々の距離で存在するように、前記複数のアクセプター又はアクセプターアクセプターフレットペアを標識として導入してよい。前記アクセプターが異なるＦＲＥＴ効率のために種々の距離で存在するように、前記アクセプターアクセプターフレットペアを標識として導入してよい。
【0347】
図３８ａに示されている効果と類似する効果を得る方法として、図３８ｂに示されているように、同じ構造を有するドッキングストランドがバイオマーカーのより短時間での検出のために１つの検出抗体に結合していてよい。
【0348】
図３８ａ及び図３８ｂに示される構造の組合せとして、複数のドナーストランドと複数のアクセプターストランドが相補的に結合し得る２種類以上のドッキングストランドが１つの検出抗体に結合していてよい。この組合せによってバイオマーカーの検出率がさらに上昇し得る。
【0349】
本開示に係る１つの実施形態による複数のバイオマーカーの同時検出のためのキットを、図３９に示されているように使用してマイクロＲＮＡを検出できる。
【0350】
図３９は、マイクロＲＮＡを含むＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を検出するための例となるキットを示している。各標的核酸の一方の末端に、基板上に塗布されている物質に対する結合親和性を有する物質を取り付けた後、又は各標的核酸の一部分に対して相補的な核酸を基板に前もって塗布した後にＮ種類の標的核酸を前記基板上に固定化する。これらのＮ種類の標的核酸の配列は既知であるため、これらの標的核酸に対して相補的なＮ種類のドナーストランドとアクセプターストランドを使用してこれらの核酸を特定できる。
【0351】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＭＮＡ、ＧＮＡ、若しくはＴＮＡなどの核酸又は核酸の類縁体を、ドッキングストランド、ドナーストランド、又はアクセプターストランドとして使用できる。さらに、図３１～図３４に示されているようなドナーストランドとアクセプターストランドの使用を省いてもよい。この場合、前記ドッキングストランドはポリペプチド又は炭水化物であってよい。
【0352】
ドナー又はアクセプターから発せられた光の強度は前記ドナーと前記アクセプターとの間の距離によって影響されることがあるが、所望の特定の塩基、３’末端若しくは５’末端、又は骨格の上に前記ドナーと前記アクセプターの各々を標識として導入してドナーアクセプター間距離又はアクセプターアクセプター間距離を制御することにより異なるＦＲＥＴ効率を有するドッキングストランドを構築できる。
【0353】
例えば、異なるＦＲＥＴ効率を有する蛍光物質がＮ種類のドッキングストランド上に標識として導入されており、これらのドッキングストランドの発光スペクトルをデータベース構築のために前もって測定し、これらの発光スペクトルをバイオマーカー検出のための反応時に生成した発光スペクトルと比較し、その結果としてこれらのバイオマーカーの種類を検出できる。異なるＦＲＥＴ効率を有する前記蛍光物質は（ドナー１、アクセプター１）、（ドナー１、アクセプター２）、．．．、（ドナー１、アクセプターＮ）、．．．、（ドナー１、アクセプター１）、（ドナー２、アクセプター１）、．．．、（ドナーＮ、アクセプター１）から成ってよい。異なるＦＲＥＴ効率を有する前記蛍光物質は同じドナーで標識されているドッキングストランド上の（アクセプター１、アクセプター２）、（アクセプター１、アクセプター３）、（アクセプター２、アクセプター３）、．．．などの２種類以上の異なるアクセプターから成ってよい。
【0354】
異なるＦＲＥＴ効率を有する前記蛍光物質の前記組合せは単に例示であり、検出時にＦＲＥＴ効率が識別されるほど充分に異なる限り、それらの組合せは特に限定されない。
【0355】
本開示に係る１つの実施形態によると、前記方法の各々は前記Ｎ種類のドッキングストランドの発光スペクトルを測定してデータベースを構築することをさらに含んでよい。検出するための反応の前に上記の構造のうちの１又は複数の構造を有するようにドッキングストランドをデザインし、データベースを構築するためにそれらのドッキングストランドの発光スペクトルを測定、かつ、検出に使用される検出抗体の種類を決定するための反応時に測定された値と比較し、そして最終的に前記バイオマーカーの種類を特定できる。
【0356】
Ｎ種類のバイオマーカーの検出のためには、発光スペクトルを同時又は連続的に測定してよい。例えば、３種類のバイオマーカーを検出しようとするとき、ドナーストランドは検出抗体１、２、及び３に結合しているドッキングストランド１、２、及び３に対して同時又は連続的に相補的結合を行う。アクセプターがこれらのドッキングストランド上に直接的に標識として導入されているとき、これらのドナーストランドが、前記ドッキングストランドに対して一時的に結合したときにのみ発光スペクトルが測定可能である。アクセプターストランド１、２、及び３をさらに使用するとき、これらのドナーストランドは、繰り返しアクセプターストランド１、２、及び３に対して同時又は連続的に結合及び解離を行う。結合と解離を繰り返している間は、これらのドナーストランドが前記ドッキングストランドのうちのいずれか１つに対して同時に結合したときにのみ発光スペクトルが測定可能である。換言すると、これらのドナーストランドとアクセプターストランド１がドッキングストランド１に対して同時に結合したときにのみ、ドッキングストランド１の発光スペクトルが測定可能である。対照的に、アクセプターストランド１がドッキングストランド１に結合した時点でこれらのドナーストランドがドッキングストランド２又は３にのみ結合する場合、ドッキングストランド１の発光スペクトルを測定できない。すなわち、Ｎ種類のバイオマーカーの検出のために発光スペクトルが同時又は連続的に測定可能であり、それらの測定値を前記データベースに保存されている値と比較して前記Ｎ種類のバイオマーカーを同時に判別する。
【0357】
本開示によるとフレットに基づいて、Ｎ種類のバイオマーカーを同時に検出でき、かつ、少量の試料の中に低濃度で存在するバイオマーカーの種類を先に説明したように識別できる。具体的には、本開示によれば、蛍光物質で標識されている鎖の発光スペクトルをエネルギー共鳴に基づいて測定してバイオマーカーの種類を特定できる。さらに、ドナーとして作用する複数の蛍光物質を等しく標識として導入することにより、１つの光源で複数のバイオマーカーを特定でき、これにより追加の光源及び光学フィルターの必要性が回避される。このことは簡単な構成に貢献し、かつ、測定する必要がある発光スペクトルが追加の光学フィルターのために失われることを防止する。
【0358】
さらに、ドナー及びアクセプターで標識されている鎖がお互いに一時的に結合する傾向がある。したがって、ドナー又はアクセプターとして作用する蛍光物質に光退色が起きたときでも結合と解離を繰り返している間に光退色せずに残っている蛍光物質で標識されているドナーストランド（donor strand）又はアクセプターストランド（acceptor strand）がドッキングストランド（docking strand）に結合した時点で発光スペクトルが測定可能であり、これにより光退色が起こるか否かに関係なくＮ種類のバイオマーカーの同時検出が可能になる。また、隣接する蛍光物質に干渉されずにこの一時的に発光する蛍光物質を測定でき、結果として１０ｎｍ未満の高い精度前記蛍光物質の位置を測定でき、これにより高ダイナミックレンジ（dynamic range）が確保される。
【0359】
本開示の一実施形態に係るターゲット物質の検出方法を用いるＮ種類のバイオマーカーの検出について、以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。
【実施例】
【0360】
１．異なる配列を有するドナーストランドを使用するバイオマーカーの多重検出
実験方法
１）試薬及び材料の準備
インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社から修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Modynamic rang）を購入した。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社からＡｌｅｘａ４８８（アレクサフルオロ４８８ＮＨＳエステル、カタログ番号：Ａ２００００）を購入した。ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社からＣｙ３（Ｃｙ３ＮＨＳエステル、カタログ番号：ＰＡ１３１０１）及びＣｙ５（Ｃｙ５ＮＨＳエステル、カタログ番号：ＰＡ１５１０１）を購入した。韓国細胞株バンクからＣＯＳ－７細胞を購入した。Ａｂｃａｍ社から抗チューブリン抗体（anti-tubulin antibody；カタログ番号：ａｂ６１６０）を購入した。サンタクルーズ・バイオテクノロジー社から抗Ｔｏｍ２０抗体（ｓｃ－１１４１５）を購入した。ジャクソン・イムノリサーチラボラトリーズ社からロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Donkey anti-rabbit IgG antibody；カタログ番号：７１１－００５－１５２）及びロバ抗ラットＩｇＧ抗体（donkey anti-rat IgG antibody；カタログ番号：７１２－００５－１５３）を購入した。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社からカルボキシルラテックスビーズ（Carboxyl latex beads；カタログ番号：Ｃ３７２８１）を購入し、メルク社からパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde；カタログ番号：１．０４００５．１０００）を購入した。シグマ・アルドリッチ社からグルタルアルデヒド（Glutaraldehyde；カタログ番号：Ｇ５８８２）、トリトンＸ－１００（Triton X-100；カタログ番号：Ｔ９２８４）、及びＢＳＡ（Bovine Serum Albumin；カタログ番号：Ａ４９１９）を購入した。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社から購入した抗体オリゴヌクレオチド・オールインワン・コンジュゲーションキット（Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit；カタログ番号：Ａ－９２０２－００１）を使用して、二次抗体にドッキングストランドを結合した。
実験方法
１）試薬及び材料の準備
インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社から修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Modynamic rang）を購入した。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社からＡｌｅｘａ４８８（アレクサフルオロ４８８ＮＨＳエステル、カタログ番号：Ａ２００００）を購入した。ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社からＣｙ３（Ｃｙ３ＮＨＳエステル、カタログ番号：ＰＡ１３１０１）及びＣｙ５（Ｃｙ５ＮＨＳエステル、カタログ番号：ＰＡ１５１０１）を購入した。韓国細胞株バンクからＣＯＳ－７細胞を購入した。Ａｂｃａｍ社から抗チューブリン抗体（anti-tubulin antibody；カタログ番号：ａｂ６１６０）を購入した。サンタクルーズ・バイオテクノロジー社から抗Ｔｏｍ２０抗体（ｓｃ－１１４１５）を購入した。ジャクソン・イムノリサーチラボラトリーズ社からロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Donkey anti-rabbit IgG antibody；カタログ番号：７１１－００５－１５２）及びロバ抗ラットＩｇＧ抗体（donkey anti-rat IgG antibody；カタログ番号：７１２－００５－１５３）を購入した。サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社からカルボキシルラテックスビーズ（Carboxyl latex beads；カタログ番号：Ｃ３７２８１）を購入し、メルク社からパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde；カタログ番号：１．０４００５．１０００）を購入した。シグマ・アルドリッチ社からグルタルアルデヒド（Glutaraldehyde；カタログ番号：Ｇ５８８２）、トリトンＸ－１００（Triton X-100；カタログ番号：Ｔ９２８４）、及びＢＳＡ（Bovine Serum Albumin；カタログ番号：Ａ４９１９）を購入した。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ社から購入した抗体オリゴヌクレオチド・オールインワン・コンジュゲーションキット（Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit；カタログ番号：Ａ－９２０２－００１）を使用して、二次抗体にドッキングストランドを結合した。
【0361】
２）ＤＮＡ蛍光標識
ＮＨＳエステル基を有するフルオロフォアでアミン修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを標識した。５μｌの１ｍＭのＤＮＡを２５μｌの１００ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）と混合した。その後、５μｌのＤＭＳＯ中の２０ｍＭフルオロフォアを添加した。この混合物を４℃で一晩にわたって培養した。２６５μｌの蒸留水、９００μｌのエタノール、及び３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加し、混合した。この混合物を－２０℃で１時間にわたってインキュベートした後、２時間にわたって遠心分離した。次に、上澄みを捨て、ＤＮＡペレットを冷エタノールで洗浄した。エタノールを完全に蒸発させた後に、このＤＮＡペレットを５０μｌの蒸留水中に再懸濁し、そして蛍光標識効率を測定した。
ＮＨＳエステル基を有するフルオロフォアでアミン修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドを標識した。５μｌの１ｍＭのＤＮＡを２５μｌの１００ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）と混合した。その後、５μｌのＤＭＳＯ中の２０ｍＭフルオロフォアを添加した。この混合物を４℃で一晩にわたって培養した。２６５μｌの蒸留水、９００μｌのエタノール、及び３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加し、混合した。この混合物を－２０℃で１時間にわたってインキュベートした後、２時間にわたって遠心分離した。次に、上澄みを捨て、ＤＮＡペレットを冷エタノールで洗浄した。エタノールを完全に蒸発させた後に、このＤＮＡペレットを５０μｌの蒸留水中に再懸濁し、そして蛍光標識効率を測定した。
【0362】
３）細胞培養と固定
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴイメージングのドリフト補正のために、ガラスカバースリップをカルボキシルラテックスビーズでコーティングした。
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴイメージングのドリフト補正のために、ガラスカバースリップをカルボキシルラテックスビーズでコーティングした。
【0363】
蒸留水中に１：１０の割合で希釈したビーズ溶液をカバースリップに塗布し、１００℃のホットプレート上で１０分間加熱した後、蒸留水で洗浄し、そしてＮ２ガスで乾燥させた。ＣＯＳ－７細胞をビーズ被覆カバースリップ上にて培養し、その後１０分間固定した。微小管の撮像には２％グルタルアルデヒドを使用し、微小管とミトコンドリアの撮像にはＰＢＳ緩衝液中の３％パラホルムアルデヒドと０．１％グルタルアルデヒドの混合物を使用した。固定された試料を必要になるまでＰＢＳ緩衝液中において４℃で保存した。
【0364】
４）免疫染色
カバースリップにて細胞を培養して固定した後、微小管をブロッキング溶液（ＰＢＳ緩衝液中の５％ＢＳＡ及び０．２５％トリトンＸ－１００）中の１：１００希釈抗チューブリン抗体で処理し、４℃で一晩にわたってインキュベートし、そして免疫染色した。ＰＢＳ緩衝液で遊離抗チューブリン抗体を徹底的に洗い落とした後に細胞を１００ｎＭのドッキングストランドと結合している二次抗体（Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ１）と１時間にわたって培養した。ミトコンドリアを１：１００希釈抗Ｔｏｍ２０抗体で処理し、４℃で一晩にわたって培養し、そして免疫染色した。ＰＢＳ緩衝液で遊離抗Ｔｏｍ２０抗体を徹底的に洗い落とした後に細胞を１００ｎＭのドッキングストランドと結合している二次抗体（Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ２）と１時間にわたってインキュベートした。
カバースリップにて細胞を培養して固定した後、微小管をブロッキング溶液（ＰＢＳ緩衝液中の５％ＢＳＡ及び０．２５％トリトンＸ－１００）中の１：１００希釈抗チューブリン抗体で処理し、４℃で一晩にわたってインキュベートし、そして免疫染色した。ＰＢＳ緩衝液で遊離抗チューブリン抗体を徹底的に洗い落とした後に細胞を１００ｎＭのドッキングストランドと結合している二次抗体（Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ１）と１時間にわたって培養した。ミトコンドリアを１：１００希釈抗Ｔｏｍ２０抗体で処理し、４℃で一晩にわたって培養し、そして免疫染色した。ＰＢＳ緩衝液で遊離抗Ｔｏｍ２０抗体を徹底的に洗い落とした後に細胞を１００ｎＭのドッキングストランドと結合している二次抗体（Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ２）と１時間にわたってインキュベートした。
【0365】
５）単分子イメージング
単分子イメージングのため、プリズム型ＴＩＲＦ（total internal reflection fluorescence）顕微鏡法及び薄層斜光照明法（highly inclined and laminated optical sheet；ＨＩＬＯ）顕微鏡法を使用した。市販の倒立顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社）を改変して組み立て、これに１００倍の１．４ＮＡ油浸対物レンズ（ＵＰｌａｎＳＡｐｏ、オリンパス社）を装着した。
単分子イメージングのため、プリズム型ＴＩＲＦ（total internal reflection fluorescence）顕微鏡法及び薄層斜光照明法（highly inclined and laminated optical sheet；ＨＩＬＯ）顕微鏡法を使用した。市販の倒立顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社）を改変して組み立て、これに１００倍の１．４ＮＡ油浸対物レンズ（ＵＰｌａｎＳＡｐｏ、オリンパス社）を装着した。
【0366】
ストレプトアビジン－ビオチン間の相互作用を使用することにより、高分子被覆石英スライドグラスの表面にドッキングストランドを固定化し、イメージングチャネル内にドナーストラン及びとアクセプターストランドを添加した。Ａｌｅｘa ４８８、Ｃｙ３、及びＣｙ５をそれぞれ青色レーザー（４７３ｎｍ、１００ｍＷ、ＭＢＬ－ＩＩＩ－４７３－１００ｍＷ、ＣＮＩ社）、緑色レーザー（５３２ｎｍ、５０ｍＷ、Ｃｏｍｐａｓｓ ２１５Ｍ－５０、コーヘレント社）、及び赤色レーザー（６４２ｎｍ、６０ｍＷ、Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ－６４２－６０、スペクトラ・フィジクス社）によって励起した。６４０ｄｃｘｒダイクロイックミラー（dichroic mirror、Ｃｈｒｏｍａ社）を使用してＣｙ３シグナルをフィルタリングし、ダイクロイックミラー（７４０ｄｃｘｒ、Ｃｈｒｏｍａ社）を使用してＣｙ５シグナルをフィルタリングした。ＥＭＣＣＤ（Electron multiplying charge-coupled devic）カメラ（ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ ＤＵ－８９７ＵＣＳ０－＃ＢＶ、Ａｎｄｏｒ社）を使用して１０Ｈｚのフレーム速度で単分子イメージを記録した。
【0367】
６）ＦＲＥＴペアの特性
図１ｄのフレーム毎に検出された検出光子（photon）の特徴を分析するため、２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、及び１１ヌクレオチドのＣｙ３－Ｃｙ５（Ａｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５）間距離のＦＲＥＴペア(FRET pair)について、それぞれ１３９９７（８０９６）、１１０２１（５１００、１１２０８（３４５１）、及び１７０５１（３９８０）の単分子スポット（single-molecule spot）を収集した。図１ｊ～図１ｋのＳＮＲの特徴を分析するため、Ｃｙ３、Ｃｙ３－Ｃｙ５ペア、及びＡｌｅｘa ４８８－Ｃｙ５ペアについて、それぞれ７９５、２３２２、及び７４２の単分子スポット（single-molecule spot）を収集した。
図１ｄのフレーム毎に検出された検出光子（photon）の特徴を分析するため、２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、及び１１ヌクレオチドのＣｙ３－Ｃｙ５（Ａｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５）間距離のＦＲＥＴペア(FRET pair)について、それぞれ１３９９７（８０９６）、１１０２１（５１００、１１２０８（３４５１）、及び１７０５１（３９８０）の単分子スポット（single-molecule spot）を収集した。図１ｊ～図１ｋのＳＮＲの特徴を分析するため、Ｃｙ３、Ｃｙ３－Ｃｙ５ペア、及びＡｌｅｘa ４８８－Ｃｙ５ペアについて、それぞれ７９５、２３２２、及び７４２の単分子スポット（single-molecule spot）を収集した。
【0368】
７）ドリフト補正（Drift correction）
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴを用いる超高解像イメージングのため、画像補正法に基づく自作のオートフォーカス・ドリフト補正システムを使用した。フィルム撮影の前に１枚の焦点内の明視野画像と２枚の焦点外の画像を撮影した。これらの３枚の基準画像を使用してｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸のずれを抑制した。ピエゾステージ（ＰＺ－２０００、アプライド・サイエンティフィック・インスツルメンテーション社）を使用してｚ方向のずれをリアルタイムで補正し、一方で画像分析中にｘｙ平面のずれを補正した。
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴを用いる超高解像イメージングのため、画像補正法に基づく自作のオートフォーカス・ドリフト補正システムを使用した。フィルム撮影の前に１枚の焦点内の明視野画像と２枚の焦点外の画像を撮影した。これらの３枚の基準画像を使用してｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸のずれを抑制した。ピエゾステージ（ＰＺ－２０００、アプライド・サイエンティフィック・インスツルメンテーション社）を使用してｚ方向のずれをリアルタイムで補正し、一方で画像分析中にｘｙ平面のずれを補正した。
【0369】
実施例１－１：ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの特性分析
表面に固定化されたＤＮＡストランドとＴＩＲＦ顕微鏡を使用して、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ顕微鏡法の実行可能性を試験した。
表面に固定化されたＤＮＡストランドとＴＩＲＦ顕微鏡を使用して、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ顕微鏡法の実行可能性を試験した。
【0370】
【0371】
具体的には、図１ａは、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの特徴を分析するために使用されたドッキングストランド（黒色）、ドナーストランド（暗灰色）、及びアクセプターストランド（明灰色）を示しており、図１ｂはＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの模式図であり、図１ｃは代表的なＣｙ５蛍光強度の時間トレース（１０００ｎＭ Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ ４８８と１００ｎＭ Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ１１＿Ｃｙ５）を示しており、図１ｄはＣｙ３－Ｃｙ５ペア及びＡｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５ペアのドナーアクセプター間距離の関数としてのアクセプターの明度を示している。
【0372】
図１ｅは、Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ１１＿Ｃｙ３の表示濃度における表面に固定化されたドッキングストランド（Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ０）のＤＮＡ－ＰＡＩＮＴイメージを示しており、図１ｆは１０ｎＭに固定されたＡｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ６＿Ｃｙ５とＤｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ｃｙ３の表示濃度におけるＤｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ０のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージを示しており、図１ｇは１０ｎＭに固定されたＤｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ｃｙ３とＡｃｃｅｐｏｔｏｒ＿Ｐ６＿Ｃｙ５の表示濃度におけるＤｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ０のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージを示しており、図１ｈは１０ｎＭに固定されたＡｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５とＤｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ４８８の表示濃度におけるＤｏｃｋｎｇ＿Ｐ０のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージを示しており、図１ｉは１０ｎＭに固定されたＤｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ４８８Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５の表示濃度におけるＤｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ０のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージを示している（スケールバー：１μｍ）。
【0373】
図１ｊは様々なＣｙ３イメージャー（Cy3 imager）ストランド濃度におけるＤＮＡ－ＰＡＩＮＴのＳＮＲ及び様々なＣｙ３ドナー（Cy3 donor）ストランドとＣｙ５アクセプター（Cy3 acceptor）ストランドの濃度におけるＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのＳＮＲを比較しており、図１ｋは様々なＣｙ３イメージャー（Cy3 imager）ストランド濃度におけるＤＮＡ－ＰＡＩＮＴのＳＮＲ及び様々なＡｌｅｘａ ４８８ドナー（donor）ストランドとＣｙ５アクセプター（acceptor）ストランドの濃度におけるＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのＳＮＲを比較している。
【0374】
図１ａに示されるように、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴは３本のＤＮＡ鎖（ドッキングストランド、ドナーストランド、及びアクセプターストランド）を使用した。５’末端においてビオチンで標識されているこのドッキングストランド（Ｄｏｃｋｉｎｇ＿ＰＯ）は２か所のドッキング部位を有し、これらの部位の各々がドナーストランド又はアクセプターストランドと塩基対合する。ＦＲＥＴ確率を上昇させるためにアクセプターストランドよりもドナーストランドについて短い長さを選択し、一方で比較的に長いアクセプターストランドを使用した。前記ドナーストランドの３’末端をＡｌｅｘａ４８８で標識し（Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ ４８８）、一方で前記アクセプターストランドの３’末端をＣｙ５で標識した（Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ１１＿Ｃｙ５）。
【0375】
各ストランドの配列は、以下の通りである。
Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ０ ＝ ５’－Ｂｉｏｔｉｎ－ＴＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡ－３’（配列番号１）
Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ｃｙ３＝５’－ＴＡＡＴＧＡＡＧＡ－Ｃｙ３－３’（配列番号２）
Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ４８８＝ ５’－ＴＡＡＴＧＡＡＧＡ－Ａｌｅｘａ４８８－３’（配列番号２）
Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５＝ ５’－Ｃｙ５－ＴＡＴＧＴＡＧＡＴＣ－３’（配列番号３）
Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ６＿Ｃｙ５＝ ５’－ＴＡＴＧ－Ｃｙ５－ＴＡＧＡＴＣ－３’（配列番号３）
Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ１１＿Ｃｙ５＝ ５’－ＴＡＴＧＴＡＧＡＴＣ－Ｃｙ５－３’（配列番号３）
Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ０ ＝ ５’－Ｂｉｏｔｉｎ－ＴＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡ－３’（配列番号１）
Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ｃｙ３＝５’－ＴＡＡＴＧＡＡＧＡ－Ｃｙ３－３’（配列番号２）
Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ４８８＝ ５’－ＴＡＡＴＧＡＡＧＡ－Ａｌｅｘａ４８８－３’（配列番号２）
Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５＝ ５’－Ｃｙ５－ＴＡＴＧＴＡＧＡＴＣ－３’（配列番号３）
Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ６＿Ｃｙ５＝ ５’－ＴＡＴＧ－Ｃｙ５－ＴＡＧＡＴＣ－３’（配列番号３）
Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ１１＿Ｃｙ５＝ ５’－ＴＡＴＧＴＡＧＡＴＣ－Ｃｙ５－３’（配列番号３）
【0376】
その後、ストレプトアビジン－ビオチン（streptavidin-biotin）間の相互作用を用いてポリマー被覆した石英（quartz）の表面に、前記ドッキングストランドを固定化し、前記ドナーストランド（１０００ｎＭ）及び前記アクセプターストランド（１００ｎＭ）の注入後に青色レーザーを使用してＡｌｅｘａ４８８を励起することによりＣｙ５の単分子像を撮影した（図１ｂ）。
【0377】
その結果、図１ｃに示されているように、高ドナー濃度及び高アクセプター濃度で明確なＣｙ５蛍光強度の時間トレースが得られた。
【0378】
同じスキームを実施して２組のＦＲＥＴペア（Ｃｙ３－Ｃｙ５及びＡｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５）について最大のＦＲＥＴシグナルを生じるＦＲＥＴプローブの最適な標識位置を見出した。この目的のため、ドナーストランドの３’末端をＣｙ３（Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ｃｙ３）又はＡｌｅｘ４８８（Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ４８８）で標識し、アクセプターストランドの様々な位置をＣｙ５で標識した（Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５、Ｐ４＿Ｃｙ５、Ｐ６＿Ｃｙ５、及びＰ１１＿Ｃｙ５）。
【0379】
その結果、図１ｄに示されているように、ドナーストランドとアクセプターストランドとの間の間隔が６ヌクレオチドのときにはＣｙ３－Ｃｙ５のＦＲＥＴペアが最も高いＣｙ５シグナルを発生し、一方でドナーストランドとアクセプターストランドとの間の間隔が２ヌクレオチドのときにはＡｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５のＦＲＥＴペアが最も高いＣｙ５シグナルを発生した。
【0380】
その後、ＨＩＬＯ（(Highly Inclined and Laminated Optical sheet）顕微鏡法を用いて超高解像度蛍光像を記録した。様々なＤＮＡ濃度におけるＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのシグナルノイズ比（ＳＮＲ）を比較した。
【0381】
結果を図１ｅ～図１ｉにした。ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴについてはＤＮＡ濃度が５ｎＭを超えると単分子像にノイズが生成した（図１ｅ）。Ｃｙ３－Ｃｙ５ペアのＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについてはＤＮＡ濃度が１００ｎＭを超えるとノイズが生成した（図１ｆ及び図１ｇ）。Ａｌｅｘａ４８８－Ｃｙ５ペアのＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについてはＤＮＡ濃度が１５０ｎＭを超えるとノイズが生成した（図１ｈ及び図１ｉ）。
【0382】
これらの画像はＤＮＡ－ＰＡＩＮＴと比較してＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴではより高いイメージャー濃度で同じＳＮＲを得られることを示している。例えば、図１ｊ及び図１ｋに示されているように、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴについては、３．３のＳＮＲを得るために５ｎＭのイメージャー濃度を使用した。同じＳＮＲのために、Ｃｙ３－Ｃｙ５ペアのＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについては１８０ｎＭのドナーと１２０ｎＭのアクセプター濃度を使用し、Ａｌｅｘａ４８８－Ｃ５ペアのＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについては２５０ｎＭのドナーと９０ｎＭのアクセプター濃度を使用した。
【0383】
実施例１－２：ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ及びＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ超高解像度の画像確認
従来のＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの超高解像度イメージングの速度を比較しために、以下の実験を行った。
従来のＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの超高解像度イメージングの速度を比較しために、以下の実験を行った。
【0384】
先ず、Ｄｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ１で標識されている前記抗チューブリン抗体（anti-tubulin antibody）を用いてＣＯＳ－７細胞の微小管を免疫染色した。
【0385】
その後、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴについては、１ｎＭのＣｙ５標識イメージャーストランド（imager strand；Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２’＿Ｃｙ５）を注入した後に微小管を撮像した。ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについては３０ｎＭのドナーストランド（Ｄｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ａｌｅｘａ４８８）と２０ｎＭのアクセプターストランド（Ａｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５）の注入後に同じ領域の微小管を撮像した。ドナーストランドとアクセプターストランドの結合を確実に検出するために充分速い速度である１０Ｈｚのフレーム速度で単分子イメージを記録した。
【0386】
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を定量的に比較するために、図２ａ及び図２ｂに示されたスポットの数を測定した。９つの箇所で同様に測定して、平均速度を比較した。また、次の式６を用いて、畳み込み解像度（convolved resolutions）を定量して、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度を比較した。ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの位置決定精度は、それぞれ６．９ｎｍ及び１１．１ｎｍであった。
（式６）
（（位置決定精度（localization precision））２＋（ナイキスト分解能（Nyquist resolution））２）１／２
（式６）
（（位置決定精度（localization precision））２＋（ナイキスト分解能（Nyquist resolution））２）１／２
【0387】
【0388】
図２ａは、特定の収集時間において再構成されたＤＮＡ－ＰＡＩＮＴイメージを示す。図２ｂは、特定の収集時間において再構成された図２ａと同じ領域のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージを示す。図２ｃは、図２ａのＤＮＡ－ＰＡＩＮＴイメージと図２ｂのＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージの時間の関数としての位置決定された光点（locarized spot）の累積数を示す。図２ｄは、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ及びＤＮＡ－ＰＡＩＮＴの位置決定された単分子スポット数／秒を比較した結果を示す。図２ｅは、結像時間の関数としてのＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの空間分解能を比較た結果を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【0389】
合計で１８０００フレームが１０Ｈｚのフレーム速度で記録されるため、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴについては合計の結像時間は３０分であった（図２ａ）。他方、合計で６００フレームが１０Ｈｚのフレーム速度で記録されるため、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴについては合計の結像時間は６０秒であった（図２ｂ）。ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度はＤＮＡ－ＰＡＩＮＴと比較して２９倍上昇した（図２ｃ）。前記の異なる領域について測定された平均値はイメージング速度の平均で３２倍の上昇を示した（図２ｄ）。ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴとＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴのイメージング速度をそれらの畳み込み解像度に基づいて比較し、結果としてＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴでイメージング速度の３６倍の上昇が得られた（図２ｅ）。
【0390】
実施例１－３：ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ多重イメージング（Multiplexed imaging）
ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ顕微鏡法の多重化能を、以下の実験手法により評価した。
ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴ顕微鏡法の多重化能を、以下の実験手法により評価した。
【0391】
前記抗チューブリン抗体（anti-tubulin antibody）と前記抗Ｔｏｍ２０抗体（anti-Tom20 antibody）を使用してＣＯＳ－７細胞の微小管とミトコンドリアをそれぞれ免疫染色した。前記抗チューブリン抗体と前記抗Ｔｏｍ２０抗体をそれぞれＤｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ１及びＤｏｃｋｉｎｇ＿Ｐ２と直交的に結合させた。ここでは、２通りのアプローチを用いて多重イメージングに使用した。
【0392】
【0393】
図３ａ～図３ｈは、ＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴの多重化能力を示している。具体的には、図３ａはドナーストランドとアクセプターストランドの交換スキームを用いる多重イメージングを模式的に示しており、図３ｂ～図３ｄはこのスキーム（図３ａ）を用いて得られた微小管（microtubule、図３ｂ）とミトコンドリア（mitochondria、図３ｃ）のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージ、及び（図３ｄ）図３ｂと図３ｃの重ね撮り像を示しており、図３ｅは緩衝液の交換を伴わない多重イメージングを模式的に示しており、図３ｆ～図３ｈはこのスキーム（図３ｅ）を用いて得られた微小管（図３ｆ）とミトコンドリア（図３ｇ）のＦＲＥＴ－ＰＡＩＮＴイメージ、及び図３ｆと図３ｇの重ね撮り像（図３ｈ）を示している（ＭＴ：微小管（microtubule）；ＭＣ：ミトコンドリア（mitochondria）、ＤＳ：ドナーストランド（donor strand）、ＡＳ：アクセプターストランド（acceptor strand）。スケールバー：５μｍ）。
【0394】
図３ａに示されている（ドナーストランドとアクセプターストランドを使用する連続処理による）１つのアプローチでは、２０ｎＭのＤｏｎｏｒ＿Ｐ１＿ＡｌｅｘＡＦ４８８と１０ｎＭのＡｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５を注入することにより微小管を先ず撮像し（図３ｂ）、１０ｎＭのＤｏｎｏｒ＿Ｐ２＿ＡＦ４８８と１０ｎＭのＡｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２＿Ｃｙ５を注入することによりミトコンドリアを次に撮像した（図３ｃ）。図３ｅに示されている（ドナーストランドとアクセプターストランドを使用する同時処理による）２つ目のアプローチでは、全てのＤＮＡプローブ（微小管には１０ｎＭのＤｏｎｏｒ＿Ｐ１＿Ｃｙ３、ミトコンドリアには２０ｎＭのＤｏｎｏｒ＿Ｐ２＿Ａｌｅｘａ４８８、及び微小管とミトコンドリアの両方には１０ｎＭのＡｃｃｅｐｔｏｒ＿Ｐ２’＿Ｃｙ５）を同時に注射した後にＣｙ３励起（exicitation）により微小管を先ず撮像し（図３ｆ）、Ａｌｅｘａ４８８励起によりミトコンドリアを次に撮像した（図３ｇ）。
【0395】
これらの２つのアプローチの間ではイメージング時間に差が無かったが、微小管像とミトコンドリア像との間の相互干渉が（ドナーストランドとアクセプターストランドを使用する同時処理による）この２つ目のアプローチの不利な点である。したがって、ドナーストランドとアクセプターストランドを使用するこの連続処理の方が多重イメージングを行う良い方法であることが確認された。
【0396】
実施例１－４：広い濃度範囲におけるバイオマーカーの測定
広い濃度範囲のバイオマーカーを測定する能力を、以下の実験手法により評価した。
広い濃度範囲のバイオマーカーを測定する能力を、以下の実験手法により評価した。
【0397】
【0398】
図４ａは、異なるウェル中に固定化され、かつ、ドナーストランドとアクセプターストランドを使用して測定された１０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、１０００ｐｇ／ｍｌ、及び１００００ｐｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを示している。図４ｂは、それぞれ使用前に１／１０及び１／１００に希釈された後の１０００ｐｇ／ｍｌ及び１００００ｐｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを示している。図４ｃは、図４ａ及び図４ｂに表示される濃度で測定された光点の数をグラフで示している。図４ｃでは、この１０００ｐｇ／ｍｌでのデータは１／１０の希釈後に光点の数を計数し、その数を１０倍することにより得られ、この１００００ｐｇ／ｍｌのデータは１／１００の希釈後に光点の数を計数し、この数を１００倍することにより得られた。
【0399】
図４ａは、１０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、１０００ｐｇ／ｍｌ、及び１００００ｐｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを異なるウェル中に固定化し、そしてドナーストランドとアクセプターストランドを使用して画像中の光点（個々のバイオマーカー分子）の数を測定した結果である。画像中の光点の数は濃度に比例して増加した。１０００ｐｇ／ｍｌ以上の濃度ではこれらの光点は重なり合い始め、これによりそれらの光点の数の正確な計数が不可能になった。
【0400】
図４ｂは、１０００ｐｇ／ｍｌ及び１００００ｐｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを１／１０及び１／１００に希釈し、かつ、異なるウェル中に固定化し、そしてドナーストランドとアクセプターストランドを使用して画像中の光点の数を測定した結果である。
【0401】
図４ｃは、表示濃度において光点を数えて、グラフで表したものである。この１０００ｐｇ／ｍｌのデータは、１／１０の希釈後に光点の数を計数し、その数を１０倍することにより得られ、この１００００ｐｇ／ｍｌのデータは１／１００の希釈後に光点の数を計数し、その数を１００倍することにより得られた。
【0402】
このデータを線形関数に近似させるとその相関係数は０．９９９９７であると計算された。この相関係数から、高濃度のバイオマーカーを希釈した後でも正確な測定結果が得るられることを確認した。
【0403】
２．ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質で標識されている２種類以上のタグストランドを使用するバイオマーカーの多重検出
【0404】
実施例２－１：ＦＲＥＴ効率についてのデータベースの構築
これまでに説明したようにＦＲＥＴ効率についてのデータベースを構築するため、ドナーとしてのＣｙ３とアクセプターとしてのＣｙ５をＤＮＡ鎖上に標識として導入してタグストランドを構築した。
これまでに説明したようにＦＲＥＴ効率についてのデータベースを構築するため、ドナーとしてのＣｙ３とアクセプターとしてのＣｙ５をＤＮＡ鎖上に標識として導入してタグストランドを構築した。
【0405】
ＤＮＡの一方の末端をビオチン化し、ドナーアクセプター間距離が１～５０であるように前記ドナーと前記アクセプターを特定の塩基の上に取り付けて標識した。合計で５０種類のタグストランドを調製した。
【0406】
ストレプトアビジンビオチン間相互作用を用いて基板上にＤＮＡを固定化することが、このビオチン化の理由である。同様の役割を果たすためにジゴキシゲニン（digoxigenin）とその抗体との間、又はＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＦＬＡＧタグ、及びＨｉｓタグなどのタグと、それぞれのリガンドとの間の相互作用を用いて基板上にＤＮＡを固定化してもよい。
【0407】
ストレプトアビジンで前記基板を被覆した後にドナーアクセプター間の距離が１であるＤＮＡ鎖を固定化し、距離が１であるときのＦＲＥＴ効率を測定して基準値を確定した。このＦＲＥＴ効率は、１）前記ドナーが光により励起されるときに励起された前記アクセプターから発せられる光、２）光学部材（ダイクロイックミラー：dichroic mirror）によって完全には分離されない前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の一部、及び、３）前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の波長の差に左右されるイメージセンサの検出効率の差を補正することにより得られる値であってよい。
【0408】
同様にして、その他の２～５０の距離に当てはめてそれらの距離での基準値を得た。測定時に生成したノイズが原因の誤差を計算し、ＦＲＥＴ効率が実際に明確に識別可能である距離だけを使用した。以下の実施例は、ＦＲＥＴ効率の基準値のうちの１０が１～５０の距離で明確に識別可能であるという前提に基づいている。
【0409】
実施例２－２：タグストランドの構築
実際に検出しようとするバイオマーカーの種類の数と同じ数のタグストランドを構築した。実施例２－１において使用されたこれらのＤＮＡ鎖は修飾せずに使用可能であったが、ＤＮＡの一方の末端に標識されたビオチンの代わりに検出抗体に結合可能な官能基をこれらのＤＮＡ鎖に使用前に取り付けた。ＤＮＡ上に蛍光物質を標識として導入するための公知の方法に従ってこの官能基を結合させた。
実際に検出しようとするバイオマーカーの種類の数と同じ数のタグストランドを構築した。実施例２－１において使用されたこれらのＤＮＡ鎖は修飾せずに使用可能であったが、ＤＮＡの一方の末端に標識されたビオチンの代わりに検出抗体に結合可能な官能基をこれらのＤＮＡ鎖に使用前に取り付けた。ＤＮＡ上に蛍光物質を標識として導入するための公知の方法に従ってこの官能基を結合させた。
【0410】
実施例２－１の１組のドナーアクセプターペアを使用して１０のＦＲＥＴ効率が明確に識別可能であるという前提に基づくと、たった１組のドナーアクセプターペアを使用して１０種類のバイオマーカーを充分に検出できる。
【0411】
２組以上のドナーアクセプターペアを使用して１０種類を超えるバイオマーカーを検出できる。例えば、２組のドナーアクセプターペアを使用するとき、最大で５５のＦＲＥＴ効率が明確に識別可能になる。３組のドナーアクセプターペアを使用するとき、最大で２０５のＦＲＥＴ効率が明確に識別可能になる。１組のドナーアクセプターペアを使用して最大で１０のＦＲＥＴ効率が識別可能である場合、理論的に計算すると２組のドナーアクセプターペアを使用して識別可能なＦＲＥＴ効率の数は１００である。しかしながら、ＦＲＥＴペア１とＦＲＥＴペア２のＦＲＥＴ効率が、それぞれ、ｉ）ａ及びｂである場合と、ｉｉ）ｂ及びａである場合が存在する場合、ＦＲＥＴ効率がａ及びｂであるＦＲＥＴペア１は、ＦＲＥＴ効率がｂ及びａであるＦＲＥＴペア２と識別できない。したがって、タグストランドがＦＲＥＴペア１又は２のどちらかで標識されているとき、総計で５５のＦＲＥＴ効率を実質的に識別できる。ＦＲＥＴペア１及び２の両方における前記ドナー、前記アクセプター、又は全ての蛍光物質の種類が異なっているとき、これらの２組のペアを使用して１００のＦＲＥＴ効率が識別可能である。３組のペアを使用して１０００のＦＲＥＴ効率が識別可能である。
【0412】
実施例２－３：光退色の前後のＦＲＥＴ効率の変化
この実施例ではお互いに距離を空けているＤｏｎｏｒ１アクセプター１及びＤｏｎｏｒ２アクセプター２で標識されているＤＮＡ鎖を使用した。これらのドナーとアクセプターから発せられた光の明度値及びこれらのドナーアクセプターペアのＦＲＥＴ効率を光退色の前に測定した（表１）。各ＦＲＥＴ効率は、１）前記ドナーが光により励起されるときに励起された前記アクセプターから発せられる光、２）ダイクロイックミラーによって完全には分離されない前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の一部、及び、３）前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の波長の差に左右されるイメージセンサの検出効率の差を補正することにより得られる値であってよい。
この実施例ではお互いに距離を空けているＤｏｎｏｒ１アクセプター１及びＤｏｎｏｒ２アクセプター２で標識されているＤＮＡ鎖を使用した。これらのドナーとアクセプターから発せられた光の明度値及びこれらのドナーアクセプターペアのＦＲＥＴ効率を光退色の前に測定した（表１）。各ＦＲＥＴ効率は、１）前記ドナーが光により励起されるときに励起された前記アクセプターから発せられる光、２）ダイクロイックミラーによって完全には分離されない前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の一部、及び、３）前記ドナー及び前記アクセプターから発せられる光の波長の差に左右されるイメージセンサの検出効率の差を補正することにより得られる値であってよい。
【0413】
ＦＲＥＴペア１のＦＲＥＴ効率は０．５であり、ＦＲＥＴペア２のＦＲＥＴ効率は０．７であるが、実際に観察されたＦＲＥＴ効率は０．６であり、それはこれらの２組のＦＲＥＴペアのＦＲＥＴ効率の平均である。これらの２組のＦＲＥＴペアのＦＲＥＴ効率はこの観察値から決定できない。
【0414】
【表1】
【0415】
表１に示されている合計４種類のドナーとアクセプターには、光退色が起こる場合がある。ＦＲＥＴ効率の補正のため、各ＦＲＥＴペアの前記ドナー及び前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計は光退色の前後で一定である。本実施例ではその合計は１００である。以下のようにＦＲＥＴ効率を測定する。
【0416】
１）ドナー１に光退色が起こる場合
ドナー１とアクセプター１の両方が発光しないため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から３０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から７０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては５０であり、前記アクセプターについても５０である。すなわち、光退色の前後の明度の差から測定されるＦＲＥＴ効率は０．５であり、光退色後に観察された明度から測定されるＦＲＥＴ効率は０．７である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
ドナー１とアクセプター１の両方が発光しないため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から３０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から７０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては５０であり、前記アクセプターについても５０である。すなわち、光退色の前後の明度の差から測定されるＦＲＥＴ効率は０．５であり、光退色後に観察された明度から測定されるＦＲＥＴ効率は０．７である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
【0417】
２）ドナー２に光退色が起こる場合
ドナー２とアクセプター２の両方が発光しないため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から５０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から５０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては３０であり、前記アクセプターについては７０である。すなわち、光退色の前後の明度の差から測定されるＦＲＥＴ効率は０．７であり、光退色後に観察された明度から測定されるＦＲＥＴ効率は０．５である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
ドナー２とアクセプター２の両方が発光しないため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から５０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から５０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては３０であり、前記アクセプターについては７０である。すなわち、光退色の前後の明度の差から測定されるＦＲＥＴ効率は０．７であり、光退色後に観察された明度から測定されるＦＲＥＴ効率は０．５である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
【0418】
３）アクセプター１に光退色が起こる場合
アクセプター１の代わりにドナー１が発光するため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から１３０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から７０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては５０であり、前記アクセプターについても５０である。前記ＦＲＥＴペアのドナーとアクセプターから発せられた光の明度値の合計は光退色の前後で一定（１００）に維持され、その結果として前記アクセプターの明度変化（５０）からＦＲＥＴ効率は０．５である。光退色後の前記ドナーから発せられた光の明度値の合計（１３０）からドナー１から発せられた光の明度（１００）を除いて測定されたＦＲＥＴ効率は０．７である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
アクセプター１の代わりにドナー１が発光するため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から１３０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から７０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては５０であり、前記アクセプターについても５０である。前記ＦＲＥＴペアのドナーとアクセプターから発せられた光の明度値の合計は光退色の前後で一定（１００）に維持され、その結果として前記アクセプターの明度変化（５０）からＦＲＥＴ効率は０．５である。光退色後の前記ドナーから発せられた光の明度値の合計（１３０）からドナー１から発せられた光の明度（１００）を除いて測定されたＦＲＥＴ効率は０．７である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
【0419】
４）アクセプター２に光退色が起こる場合
アクセプター２の代わりにドナー２が発光するため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から１５０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から５０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては７０であり、前記アクセプターについても７０である。前記ＦＲＥＴペアのドナーとアクセプターから発せられた光の明度値の合計は光退色の前後で一定（１００）に維持され、その結果として前記アクセプターの明度変化（７０）からＦＲＥＴ効率は０．７である。光退色後の前記ドナーから発せられた光の明度値の合計（１５０）からドナー２から発せられた光の明度（１００）を除いて測定されたＦＲＥＴ効率は０．５である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
アクセプター２の代わりにドナー２が発光するため、前記ドナーから発せられた光の明度値の合計が８０から１５０に変化し、かつ、前記アクセプターから発せられた光の明度値の合計が１２０から５０に変化し、その結果として光退色の前後の明度の変化が前記ドナーについては７０であり、前記アクセプターについても７０である。前記ＦＲＥＴペアのドナーとアクセプターから発せられた光の明度値の合計は光退色の前後で一定（１００）に維持され、その結果として前記アクセプターの明度変化（７０）からＦＲＥＴ効率は０．７である。光退色後の前記ドナーから発せられた光の明度値の合計（１５０）からドナー２から発せられた光の明度（１００）を除いて測定されたＦＲＥＴ効率は０．５である。したがって、対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率は０．５及び０．７である。
【0420】
一方の蛍光物質に光退色が起こるまで明度を測定し、かつ、他方の蛍光物質についてこの手法を繰り返し、これによって対応するタグストランドのＦＲＥＴ効率が０．５及び０．７であることが明らかになる。
【0421】
実施例２－４：ＦＲＥＴ効率の測定とバイオマーカーの種類の特定
バイオマーカー１及び２を検出するためのキットを以下の手法によって操作した。タグストランド１をバイオマーカー１に結合した検出抗体１に結合し、かつ、タグストランド２をバイオマーカー２に結合した検出抗体２に結合した。前記タグストランド１及び２の各々を２組のドナーアクセプターＦＲＥＴペアで標識した。検出抗体１のＦＲＥＴ効率の基準値はＦＲＥＴペア１については０．１であり、ＦＲＥＴペア２については０．５であった。検出抗体２のＦＲＥＴ効率の基準値は、ＦＲＥＴペア１＝０．２であり、ＦＲＥＴペア２＝０．４であった。
バイオマーカー１及び２を検出するためのキットを以下の手法によって操作した。タグストランド１をバイオマーカー１に結合した検出抗体１に結合し、かつ、タグストランド２をバイオマーカー２に結合した検出抗体２に結合した。前記タグストランド１及び２の各々を２組のドナーアクセプターＦＲＥＴペアで標識した。検出抗体１のＦＲＥＴ効率の基準値はＦＲＥＴペア１については０．１であり、ＦＲＥＴペア２については０．５であった。検出抗体２のＦＲＥＴ効率の基準値は、ＦＲＥＴペア１＝０．２であり、ＦＲＥＴペア２＝０．４であった。
【0422】
その後、実施例２－３のように光退色の前後の明度の差を測定してＦＲＥＴ効率を分析した。明度観察のために画像カメラを使用して分子Ａと分子Ｂを観察した。分子ＡのＦＲＥＴ効率は０．１及び０．５であると測定され、これにより分子Ａがバイオマーカー１であることが示された。同じ原理に基づいて分子ＢのＦＲＥＴ効率は０．２及び０．４であると測定され、これにより分子Ｂはバイオマーカー２であることが示された（図１５）。
【0423】
試料中のバイオマーカーの濃度は、バイオマーカーの種類に応じてｆｇ／ｍｌ～ｍｇ／ｍｌまで大きく変化する。過度に高濃度のバイオマーカーを基板上に固定化すると非常に多数の光点が１つの画像の中に観察され、かつ、お互いに重複する。この重複のためにそれらの個々の分子のＦＲＥＴ効率の測定が不可能になる。したがって、正確な数の前記バイオマーカー分子が１つの画像の中に検出されるように様々な比率で前記試料を希釈してよい。
【0424】
似たような濃度範囲内のバイオマーカーを検出しようとするとき、分析のために同じ比率でそれらのバイオマーカーを希釈する。例えば、通常では約１ｎｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを１：１００の割合で希釈し、かつ、正確な数の前記バイオマーカー分子が１つの画像の中に検出される場合、通常では約１００ｎｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを分析のために１：１００００の割合で希釈する。
【0425】
３．Ｎ種類のドッキングストランドとＮ種類のフレットストランドを使用するバイオマーカーの多重検出
実施例３－１：ＦＲＥＴ効率についてのデータベースの構築
異なる蛍光物質Ａ、Ｂ、及びＣをそれぞれドナー１、ドナー２、及びアクセプターとして使用した。ドナー１をドナーストランド上に標識として導入し、ドナー２と前記アクセプターをフレットストランド上に標識として導入した。
実施例３－１：ＦＲＥＴ効率についてのデータベースの構築
異なる蛍光物質Ａ、Ｂ、及びＣをそれぞれドナー１、ドナー２、及びアクセプターとして使用した。ドナー１をドナーストランド上に標識として導入し、ドナー２と前記アクセプターをフレットストランド上に標識として導入した。
【0426】
ドナー１及び２のＦＲＥＴ効率が最大になるように２種類の蛍光物質Ａ及びＢの間の距離を設定した。これらのフレットストランド上に標識として導入されている蛍光物質Ｂ及びＣがＦＲＥＴペアを構成した。これらのフレットストランドを必要なだけ多くの種類の異なるＦＲＥＴペアで標識した。
【0427】
例えば、データベースに５０種類が必要なときに様々な距離で蛍光物質Ｂ及びＣによって標識されている５０種類のフレットストランドを調製した。市販の蛍光物質をドナー１、ドナー２、及び前記アクセプターとして使用するときには上記の手法を実行せずにドナー１、ドナー２、及び前記アクセプターで標識されている市販のフレットストランドを使用できる。
【0428】
ドナー１、ドナー２、及び前記アクセプターとしての前記蛍光物質の決定ではドナー１のピーク発光波長が最も短く、かつ、前記アクセプターのピーク発光波長が最も長いことが好ましい。
【0429】
前記２種類以上のフレットストランドを調製した後にドナー２アクセプター間の距離が１である前記フレットストランドと前記ドナーストランドをドッキングストランドに結合させ、対応する距離におけるＦＲＥＴ効率を測定した。その後、同じ手法を前記ドナー２アクセプターＦＲＥＴペア間の距離が２である前記フレットストランドから繰り返してＦＲＥＴ効率の基準値を取得し、それらの基準値をデータベースに構築した。
【0430】
その後、バイオマーカー検出時に測定されたＦＲＥＴ効率値を、これらのＦＲＥＴ効率の基準値と比較した。この比較から前記ＦＲＥＴペアのドナー２アクセプター間距離を決定してこれらの検出されたバイオマーカーの種類を特定した。
【0431】
しかしながら、ＦＲＥＴ効率測定時に生成したノイズによって誤差が生じる場合があるため、全ての距離におけるＦＲＥＴ効率は識別できない。例えば、ＦＲＥＴ効率が距離１において０．９５（平均値）±０．０５（誤差）であり、かつ、距離２において０．９４±０．０５であるとき、これらのＦＲＥＴ効率によってそれらの距離（１及び２）を識別できない。したがって、実際のバイオマーカーの検出時には前記データベースに保存されている値の中でもＦＲＥＴ効率を明確に識別する距離を使用することが好ましい。以下の実施例はＦＲＥＴ効率の基準値のうちの１０が１～５０の距離で明確に識別可能であるという前提に基づいている。
【0432】
実施例３－２：Ｎ種類のドッキングストランドとＮ種類のフレットストランドの構築
実際の標的バイオマーカーの種類の数と同じ数のドッキングストランドを構築した。
実際の標的バイオマーカーの種類の数と同じ数のドッキングストランドを構築した。
【0433】
実施例３－１の１組のドナー２アクセプターＦＲＥＴペアを使用して１０のＦＲＥＴ効率が明確に識別可能であるという前提に基づくと、たった１組のドナー２アクセプターＦＲＥＴペアを使用して１０種類のバイオマーカーを充分に検出できる。したがって、１本のフレットストランドを各ドッキングストランドに結合させた。
【0434】
２組以上のドナー２アクセプターペアを使用して１０種類を超える標的バイオマーカーを検出できる。したがって、２本以上のフレットストランドを各ドッキングストランドに結合させた。例えば、２組のＦＲＥＴペアを使用するとき、最大で５５のＦＲＥＴ効率が明確に識別可能になる。３組のＦＲＥＴペアを使用するとき、最大で２０５のＦＲＥＴ効率が明確に識別可能になる。１組のＦＲＥＴペアを使用して最大で１０のＦＲＥＴ効率が識別可能である場合、理論的に計算すると２組のＦＲＥＴペアを使用して識別可能なＦＲＥＴ効率の数は１００である。しかしながら、ＦＲＥＴペア１とＦＲＥＴペア２のＦＲＥＴ効率が、それぞれ、ｉ）ａ及びｂである場合と、ｉｉ）ｂ及びａである場合が存在する場合、ＦＲＥＴ効率がａ及びｂであるＦＲＥＴペア１は、ＦＲＥＴ効率がｂ及びａであるＦＲＥＴペア２と識別できない。したがって、ドッキングストランドがＦＲＥＴペア１又は２のどちらかで標識されているとき、総計で５５のＦＲＥＴ効率を実質的に識別できる。ＦＲＥＴペア１及び２の両方における前記ドナー２、前記アクセプター、又は全ての蛍光物質の種類が異なっているとき、これらの２組のペアを使用して１００のＦＲＥＴ効率が識別可能である。３組のペアを使用して１０００のＦＲＥＴ効率が識別可能である。
【0435】
実施例３－３：ＦＲＥＴ効率の測定とバイオマーカーの特定
バイオマーカー１及び２を検出するためのキットを、以下の手法によって操作した。
バイオマーカー１及び２を検出するためのキットを、以下の手法によって操作した。
【0436】
ドッキングストランド１をバイオマーカー１に結合した検出抗体１に結合し、かつ、ドッキングストランド２をバイオマーカー２に結合した検出抗体２に結合した。前記ドッキングストランド１及び２の各々を２種類のフレットストランドと結合させた。具体的には、ＦＲＥＴ効率が０．２及び０．４であるフレットストランドをドッキングストランド１に結合させ、ＦＲＥＴ効率が０．６及び０．８である別のフレットストランドをドッキングストランド２に結合させた。
【0437】
バイオマーカー１及び２を基板上に固定化し、それぞれ検出抗体１及び２と結合させた。ドナーストランドと０．２、０．４、０．６、及び０．８というＦＲＥＴ効率を有する４種類のフレットストランドを含有する緩衝液をウェルに添加し、前記ドッキングストランドに結合した前記フレットストランドのＦＲＥＴ効率を測定した。図２９に関して説明したように、ドナー２と前記アクセプターの明度値を観察するための画像カメラを使用して分子１と分子２の位置を断続的な蛍光シグナルとして観察した。ドナー２と前記アクセプターの明度値を測定してＦＲＥＴ効率を分析した。その結果、これらのＦＲＥＴ効率は分子１の位置では０．２及び０．４であると測定され、これにより分子１はバイオマーカー１であることが示された。同じ原理に基づいてこれらのＦＲＥＴ効率は分子２の位置０．２及び０．４であると測定され、これにより分子２がバイオマーカー２であることが示された。
【0438】
試料中のバイオマーカーの濃度はバイオマーカーの種類に応じてｆｇ／ｍｌ～ｍｇ／ｍｌまで大きく変化する。過度に高濃度のバイオマーカーを基板上に固定化すると非常に多数の光点が１つの画像の中に観察され、かつ、お互いに重複する。この重複のためにそれらの個々の分子のＦＲＥＴ効率の測定が不可能になる。したがって、正確な数の前記バイオマーカー分子が１つの画像の中に検出されるように様々な比率で前記試料を希釈してよい。
【0439】
似たような濃度範囲内のバイオマーカーを検出しようとするとき、分析のために同じ比率でそれらのバイオマーカーを希釈する。例えば、通常では約１ｎｇ/ｍｌの濃度のバイオマーカーを１：１００の割合で希釈し、かつ、正確な数の前記バイオマーカー分子が１つの画像の中に検出される場合、通常では約１００ｎｇ/ｍｌの濃度のバイオマーカーを分析のために１：１００００の割合で希釈する。
【0440】
４．Ｎ種類のドッキングストランド、ドナーストランド、及びアクセプターストランドを使用するバイオマーカーの多重検出
【0441】
実施例４－１：発光スペクトルについてのデータベースの構築
１つの光源により励起されるＡ種類のドナーで標識されているＡ種類（Ａは１以上の整数）のドナーストランドを構築した。これらのＡ種類のドナーとＦＲＥＴペアを形成するＢ種類のアクセプターで標識されているＢ種類（Ｂは１以上の整数）のアクセプターストランドを構築した。これらのＡ種類のドナーストランド及びこれらのＢ種類のアクセプターストランドと相補的に結合可能な合計でＡ×Ｂ種類のドッキングストランドを構築した。
１つの光源により励起されるＡ種類のドナーで標識されているＡ種類（Ａは１以上の整数）のドナーストランドを構築した。これらのＡ種類のドナーとＦＲＥＴペアを形成するＢ種類のアクセプターで標識されているＢ種類（Ｂは１以上の整数）のアクセプターストランドを構築した。これらのＡ種類のドナーストランド及びこれらのＢ種類のアクセプターストランドと相補的に結合可能な合計でＡ×Ｂ種類のドッキングストランドを構築した。
【0442】
ドナーストランド１、アクセプターストランド１、及びこれらの鎖に相補的なドッキングストランド１を使用して前記ドナーと前記アクセプターの発光スペクトルを測定した。同じことをその他のドナーストランド及びアクセプターストランドの発光スペクトルに当てはめた。
【0443】
これらの測定されたＡ×Ｂ種類の発光スペクトルの中のノイズが原因の誤差を考慮すると、これらの発光スペクトルのうちの明確に識別可能なものだけをデータベース構築のために使用し、かつ、対応する発光スペクトルを生じる前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドの組合せだけをバイオマーカー検出のために使用した。
【0444】
上で説明した方法は、図３１及び図３３に示されている方法と組み合わせて図３６ｂに示されている構造を説明するためのものである。前記データベースに保存されている発光スペクトルの数が標的バイオマーカーの数よりも少ないとき、前記ドナーと前記アクセプターとの間のＦＲＥＴ効率が異なるように構築された図３２の構造をさらに適用し、図３６ｂに示されているように１本のアクセプターストランド上に２種類以上のアクセプターを標識として導入し、又は２種類以上の異なるアクセプターストランドを１本のドッキングストランドに結合させ、その結果として標的バイオマーカーの数よりも多い数の発光スペクトルが前記データベースに保存される。
【0445】
実施例４－２：Ｎ種類のドッキングストランド、ドナーストランド、及びアクセプターストランドの構築
Ｎ種類のドッキングストランドを構築してＮ種類のバイオマーカーを検出する。これらのＮ種類のドッキングストランドはデータベースに発光スペクトルを提供するドナーストランドとアクセプターストランドの配列に対して相補的な配列を有した。
Ｎ種類のドッキングストランドを構築してＮ種類のバイオマーカーを検出する。これらのＮ種類のドッキングストランドはデータベースに発光スペクトルを提供するドナーストランドとアクセプターストランドの配列に対して相補的な配列を有した。
【0446】
実施例４－３：発光スペクトルの測定とバイオマーカーの特定
２種類のバイオマーカーを検出するためのキットを以下の手法によって操作した。
２種類のバイオマーカーを検出するためのキットを以下の手法によって操作した。
【0447】
ドッキングストランド１をバイオマーカー１に結合した検出抗体１に結合し、かつ、ドッキングストランド２をバイオマーカー２に結合した検出抗体２に結合した。ドナーストランド１とアクセプターストランド１をドッキングストランド１に結合させ、ドナーストランド２とアクセプターストランド２をドッキングストランド２に結合させた。
【0448】
バイオマーカー１及び２を基板上に固定化し、それぞれ検出抗体１及び２と結合させた。ドナーストランド１、アクセプターストランド１、ドナーストランド２、及びアクセプターストランド２を含有する緩衝液をウェルに添加し、前記ドナーストランドと前記アクセプターストランドを前記ドッキングストランドに対して同時に結合させたときに発せられる光のスペクトルを観察した。図３７に示されているように画像カメラを使用して撮影された画像中の分子１と分子２の位置に断続的な蛍光シグナルが観察された。対応する位置におけるこれらの発光スペクトルをデータベースに保存されている発光スペクトルと比較して前記バイオマーカーの種類を特定した。
【0449】
試料中のバイオマーカーの濃度はバイオマーカーの種類に応じてｆｇ／ｍｌ～ｍｇ／ｍｌまで大きく変化する。過度に高濃度のバイオマーカーを基板上に固定化すると非常に多数の光点が１つの画像の中に観察され、かつ、お互いに重複する。この重複のためにそれらの個々の分子のＦＲＥＴ効率の測定が不可能になる。したがって、正確な数の前記バイオマーカー分子が１つの画像の中に検出されるように様々な比率で前記試料を希釈してよい。
【0450】
似たような濃度範囲内のバイオマーカーを検出しようとするとき、分析のために同じ比率でそれらのバイオマーカーを希釈する。例えば、通常では約１ｎｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを１：１００の割合で希釈し、かつ、正確な数の前記バイオマーカー分子が１つの画像の中に検出される場合、通常では約１００ｎｇ／ｍｌの濃度のバイオマーカーを分析のために１：１００００の割合で希釈する。
【0451】
限定的な図面を参照しながら例となる実施形態を説明してきたが、当業者はこれらの実施形態に対して上記の説明に基づく様々な技術的な変更と改変を行えることを理解する。例えば、本記載の技術を記載された方法とは異なる順序で実施してよいとき、及び／又は本記載の構成要素を記載された方法とは異なる形で結合若しくは合同させる、若しくは他の構成要素若しくは同等物によって交換若しくは置換するときであっても適切な結果が達成可能である。したがって、添付されている特許請求の範囲内に他の実施形態、他の実施例、及び特許請求の均等物が包含される。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図1i】
【図1j】
【図1k】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34a】
【図34b】
【図34c】
【図35a】
【図35b】
【図36a】
【図36b】
【図37】
【図38a】
【図38b】
【図39】
【配列表】