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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-31
(45)【発行日】2022-11-09
(54)【発明の名称】腸管バリア機能向上剤
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20221101BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20221101BHJP
A61K 36/48 20060101ALI20221101BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221101BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20221101BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A23L33/10
A61K36/48
A61P43/00 105
A61P1/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2018128700
(22)【出願日】2018-07-06
(65)【公開番号】P2020007255
(43)【公開日】2020-01-16
【審査請求日】2021-05-14
(73)【特許権者】
【識別番号】592262543
【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 明子
(72)【発明者】
【氏名】高木 寛
【審査官】飯室 里美
(56)【参考文献】
【文献】登録実用新案第３２１３５０８（ＪＰ，Ｕ）
【文献】中国特許出願公開第１０２１２５２１２（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０００－１２８７２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－００７４７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】PLOS ONE，2015年09月16日，pp. 1-16，DOI:10.1371/journal.pone.0138078
【文献】腸内細菌学雑誌，2011年，第25巻，第4号，pp. 213-219
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エビスグサ種子を含有することを特徴とする、腸管上皮細胞のムチン産生促進剤（腸管バリア機能向上剤、内服用肌荒れ改善剤を除く）。
【請求項2】
エビスグサ種子を含有することを特徴とする、腸管上皮細胞の抗菌ペプチド産生促進剤（腸管バリア機能向上剤、内服用肌荒れ改善剤を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エビスグサ種子を含有することを特徴とする腸管バリア機能向上剤に関する。詳しくは、腸管バリア機能向上作用が、ムチン産生促進、抗菌ペプチド産生促進、タイトジャンクション産生促進である腸管バリア機能向上剤に関する。さらに、内服用肌荒れ改善作用を有する腸管バリア機能向上剤、および腸管バリア機能向上用食品組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
消化管の一部である腸管の内側、すなわち食品消化物が通過する内腔側には、単層の腸管上皮細胞が存在する。腸管上皮細胞は、消化された食品中の各種栄養素を取り込む吸収機能に加えて、有害微生物や毒素、アレルゲンなどを生体に侵入させないバリア機能、あるいは腸管免疫と呼ばれる生体を守る機能を有していることが知られている。腸管のバリア機能が破綻すると、細菌、毒素、アレルゲンなどの異物が生体に透過、侵入し、炎症性腸疾患、肝疾患、食物アレルギーなどの疾患を引き起こす可能性がある（特許文献１）。
【0003】
腸管バリア機能は、主に粘液、抗菌ペプチド、タイトジャンクションが知られている（非特許文献１）。
【0004】
粘液の主成分は、ムチン（ｍｕｃｉｎ）と呼ばれる腸管上皮細胞が産生する糖タンパク質である。消化器内腔面の粘膜を覆っている粘液は、粘膜表面の潤滑性を保ち、外来微生物や異物の侵入に対する防御因子として重要である。しかし、タバコやアルコール、各種薬剤、あるいはストレスなど、日常生活における種々の刺激により、粘液の生成が不十分となり、粘膜を保護するムチンが減少し、粘膜が傷害を受けることが知られている（特許文献２）。従って、腸管上皮細胞のムチン産生量を高めることは、腸管のバリア機能を高め、その結果、生体を傷害から守る生体防御機能の発揮に重要である。
【0005】
抗菌ペプチドは、腸管上皮細胞が産生する抗菌作用を有するペプチドであり、病原性を有する微生物の増殖を抑える生体防御機能の一つである。ヒト由来の抗菌ペプチドは、ディフェンシンファミリー（α－ディフェンシン、β－ディフェンシンなど）、カセリシジン（ＬＬ－３７）、ダームシジン（ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）、ＬＥＡＰ－１（ヘプシジン）、ＬＥＡＰ－２、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｓｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ファミリーに属するペプチド（Ｒｅｇペプチド）などが知られている。腸管上皮細胞の抗菌ペプチドの産生量を高めることは、病原性微生物の増殖を抑えることで、腸管バリア機能を高め、生体を傷害から守る生体防御機能の発揮に重要である。
【0006】
タイトジャンクションは、腸管上皮細胞が産生するタンパク質で、その働きは、隣接する腸管上皮細胞同士を密着させるばかりでなく、細胞と細胞との隙間をシールすることで物質の透過を制御し、細胞間の接着を維持するために重要なものである。腸管上皮細胞が産生するタイトジャンクションは、膜貫通型タンパク質のオクルディンやクローディン、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２などのタンパク質によって構成される複合タンパク質群が知られている（非特許文献２）。腸管のタイトジャンクション機能が低下すると、食物アレルゲンや病原性微生物などが生体へ侵入し、炎症性腸疾患や各種感染症などの一因になると考えられている。腸管上皮細胞のタイトジャンクションの産生量を高めることは、腸管バリア機能を高め、腸炎などの炎症性腸疾患、あるいは各種感染症を防ぎ、生体を傷害から守る生体防御機能の発揮に重要である。
【0007】
また、ムチン産生促進作用、抗菌ペプチド産生促進作用、タイトジャンクション産生促進作用で腸管バリア機能を向上させると、腸管内に存在するビフィズス菌などの善玉菌を増殖させ、その結果、腸内フローラを健全に保つことで、下痢や便秘を改善することが知られている。さらに、腸内フローラを健全に保つことで、各種感染症から生体を守る作用や、肌荒れやニキビ・吹き出物の改善作用も期待される。
【0008】
エビスグサは、学名をＣａｓｓｉａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａといい、近年、Ｓｅｎｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａとも示される。エビスグサの種子は、漢方名を決明子といい、中国では視力を回復させる薬として用いられてきた。また、ハブ茶としても知られている（非特許文献３）。また、薬理作用として、アディポネクチン増加（特許文献３）、歯周病予防作用（特許文献４）などが知られているが、エビスグサ種子の腸管バリア機能向上作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特開２０１４－２１０７１８号公報
【文献】特開２０１６－１６９１１９号公報
【文献】特開２０１１－６３５４２号公報
【文献】特許第２９８６９９１号
【非特許文献】
【0010】
【文献】高橋恭子、腸内細菌学雑誌、２５、ｐ．２１３－２１９（２０１１）
【文献】清水誠、蛋白質核酸酵素、４４、ｐ．８７４－８８０（１９９９）
【文献】南江堂、東京生薬協会、新常用和漢薬集、ｐ．３８－３９（１９７３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、エビスグサ種子を含有することを特徴とする腸管バリア機能向上剤を提供することである。詳しくは、腸管バリア機能向上作用が、ムチン産生促進、抗菌ペプチド産生促進、タイトジャンクション産生促進である腸管バリア機能向上剤であり、内服用肌荒れ改善作用を有する腸管バリア機能向上剤、および腸管バリア機能向上用食品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明に用いるエビスグサ種子は、マメ科の植物であるエビスグサ（Ｃａｓｓｉａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａまたはＳｅｎｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、または近縁種のＣａｓｓｉａ ｔｏｒａあるいはＳｅｎｎａ ｔｏｒａの種子を用いることができる。エビスグサ種子は、漢方名を決明子と称し、決明子に利用される植物の種子も用いることができる。
【0013】
本発明に用いるエビスグサ種子は、そのまま用いることができ、必要に応じて、乾燥、粉砕、細切などの処理を行ったものを用いることもできる。また、エビスグサ種子をそのまま、あるいは以上の処理を行ったものを抽出した抽出物も用いることができる。抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノールなど）、液状多価アルコール類（１、３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど）が挙げられる。これらの溶媒は、１種または２種以上を混合して用いても良い。本発明では、抽出溶媒は水、低級アルコールなどの極性溶媒、特に水が好ましい。
【0014】
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、活性炭などによる脱色、脱臭、エタノール沈殿などの処理をして用いても良い。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【0015】
本発明に用いるエビスグサ種子の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって適宜調整することができる。成人１日当たりのエビスグサ種子の摂取量は、エビスグサ種子の乾燥物に換算して０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～１００ｍｇの範囲で１日１回から数回、経口摂取できる。上記摂取範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて摂取する必要がある場合もある。また、製剤化における薬効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【0016】
本発明の腸管バリア機能向上剤は、食品、医薬部外品、医薬品として用いることができる。食品としては、顆粒剤、タブレット、硬カプセル、軟カプセル、飲料、ゼリーなどとして用いることができる。また、医薬部外品や医薬品では、経口用の散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤など、非経口用の注射剤、座剤などとして用いることができる。
【0017】
本発明の腸管バリア機能向上剤は、エビスグサ種子をそのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、必要に応じて通常の食品、医薬部外品または医薬品に用いられる賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料などの成分を含有することもできる。さらに、ビタミン類、糖類、タンパク質などの成分を含有することができ、本発明の目的を達するため、ビフィズス菌、乳酸菌、オリゴ糖、難消化性デキストリン、ラクトフェリンなどの成分を含有することが望ましい。
【0018】
本発明の腸管バリア機能向上剤は、腸管バリア機能の低下を抑制、あるいは回復させるために使用することができる。従って、腸管バリア機能の低下を原因とする疾患である、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎などの予防または改善のために使用することができる。
【発明の効果】
【0019】
本発明のエビスグサ種子を含有することを特徴とする腸管バリア機能向上剤は、ムチン産生促進作用、抗菌ペプチド産生促進作用、タイトジャンクション産生促進作用、肌荒れ改善作用を有する。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す含有量の％は重量％を示す。
【0021】
以下に、エビスグサ種子を用いた溶媒抽出物の製造例を示す。
【実施例1】
【0022】
製造例１ エビスグサ種子熱水抽出物
エビスグサの種子の破砕物１００ｇに精製水２０００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾液を濃縮し、凍結乾燥することでエビスグサ種子熱水抽出物７．０ｇを得た。
エビスグサの種子の破砕物１００ｇに精製水２０００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾液を濃縮し、凍結乾燥することでエビスグサ種子熱水抽出物７．０ｇを得た。
【0023】
製造例２ エビスグサ種子３０％エタノール抽出物
エビスグサの種子の破砕物１００ｇに精製水１４００ｍＬとエタノール６００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、エビスグサ種子３０％エタノール抽出物５．１ｇを得た。
エビスグサの種子の破砕物１００ｇに精製水１４００ｍＬとエタノール６００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、エビスグサ種子３０％エタノール抽出物５．１ｇを得た。
【0024】
製造例３ エビスグサ種子５０％エタノール抽出物
エビスグサの種子の破砕物１００ｇに精製水１０００ｍＬとエタノール１０００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、エビスグサ種子５０％エタノール抽出物３．８ｇを得た。
エビスグサの種子の破砕物１００ｇに精製水１０００ｍＬとエタノール１０００ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、エビスグサ種子５０％エタノール抽出物３．８ｇを得た。
【0025】
製造例４ エビスグサ種子エタノール抽出物
エビスグサの種子の破砕物１００ｇにエタノール２０００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、エビスグサ種子エタノール抽出物１．２ｇを得た。
エビスグサの種子の破砕物１００ｇにエタノール２０００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、エビスグサ種子エタノール抽出物１．２ｇを得た。
【実施例2】
【0026】
処方例１ 顆粒剤
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１） ０．０５
２．ショ糖 ５０．００
３．コーンスターチ ４９．９５
［製造方法］成分１～３を、流動層造粒（噴霧液は水）により、顆粒剤を得た。
［用法］１日当り１包（１．５ｇ）を摂取する。
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１） ０．０５
２．ショ糖 ５０．００
３．コーンスターチ ４９．９５
［製造方法］成分１～３を、流動層造粒（噴霧液は水）により、顆粒剤を得た。
［用法］１日当り１包（１．５ｇ）を摂取する。
【0027】
処方例２ 顆粒剤
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１） ０．０１
２．ビフィズス菌末 １０．００
３．乳酸菌末 ５．００
４．ミルクオリゴ糖 ５０．００
５．難消化性デキストリン ３３．９９
６．プルラン １．００
[製造方法]成分１～５を、流動槽造粒（噴霧液はプルランを水に溶解させる）により、顆粒剤を得た。
[用法]１日当り１包（１．５ｇ）を摂取する。
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１） ０．０１
２．ビフィズス菌末 １０．００
３．乳酸菌末 ５．００
４．ミルクオリゴ糖 ５０．００
５．難消化性デキストリン ３３．９９
６．プルラン １．００
[製造方法]成分１～５を、流動槽造粒（噴霧液はプルランを水に溶解させる）により、顆粒剤を得た。
[用法]１日当り１包（１．５ｇ）を摂取する。
【0028】
処方例３ 錠剤
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子３０％エタノール抽出物（製造例２） ０．１
２．乳酸菌末 ２．０
３．ミルクオリゴ糖 ３０．０
４．コーンスターチ ５５．９
５．結晶セルロース １０．０
６．グリセリン脂肪酸エステル ２．０
[製造方法]成分１～５を混合し、１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後、乾燥する。成型した顆粒に成分６を加えて混合し、打錠する。１錠０．５ｇとする。
[用法]１日当り４錠を摂取する。
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子３０％エタノール抽出物（製造例２） ０．１
２．乳酸菌末 ２．０
３．ミルクオリゴ糖 ３０．０
４．コーンスターチ ５５．９
５．結晶セルロース １０．０
６．グリセリン脂肪酸エステル ２．０
[製造方法]成分１～５を混合し、１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後、乾燥する。成型した顆粒に成分６を加えて混合し、打錠する。１錠０．５ｇとする。
[用法]１日当り４錠を摂取する。
【0029】
処方例４ 散剤
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子５０％エタノール抽出物（製造例３） ０．０１
２．ビフィズス菌末 １０．００
３．コーンスターチ ２５．００
４．結晶セルロース ６４．９９
[製造方法]成分１～４を混合し、散剤とする。
[用法]１日当り１包（３ｇ）を摂取する。
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子５０％エタノール抽出物（製造例３） ０．０１
２．ビフィズス菌末 １０．００
３．コーンスターチ ２５．００
４．結晶セルロース ６４．９９
[製造方法]成分１～４を混合し、散剤とする。
[用法]１日当り１包（３ｇ）を摂取する。
【0030】
処方例５ ゼリー
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子エタノール抽出物（製造例４） ０．００１
２．ミルクオリゴ糖 １．０００
３．カラギーナン ２．０００
４．ゼラチン １．０００
５．ショ糖 ２５．０００
６．精製水 ７０．９９９
[製造方法]成分１～６を混合し、加熱しながら煮詰め、ゼリーの型に流し込み、冷却する。
[用法]１日当り１個（１００ｇ）を摂取する。
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子エタノール抽出物（製造例４） ０．００１
２．ミルクオリゴ糖 １．０００
３．カラギーナン ２．０００
４．ゼラチン １．０００
５．ショ糖 ２５．０００
６．精製水 ７０．９９９
[製造方法]成分１～６を混合し、加熱しながら煮詰め、ゼリーの型に流し込み、冷却する。
[用法]１日当り１個（１００ｇ）を摂取する。
【0031】
処方例６ 飲料
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１） ０．０１
２．マルチトール ５．００
３．クエン酸 １．００
４．香料 ０．５０
５．精製水 ９３．４９
[製造方法]成分１～４を成分５の一部に攪拌溶解する。成分５の残りを加えて混合し、９０℃に加熱して３０ｍＬのガラス瓶に充填する。
[用法]１日当り１本（３０ｍＬ）を摂取する。
処方 含有量（％）
１．エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１） ０．０１
２．マルチトール ５．００
３．クエン酸 １．００
４．香料 ０．５０
５．精製水 ９３．４９
[製造方法]成分１～４を成分５の一部に攪拌溶解する。成分５の残りを加えて混合し、９０℃に加熱して３０ｍＬのガラス瓶に充填する。
[用法]１日当り１本（３０ｍＬ）を摂取する。
【実施例3】
【0032】
試験例１ 腸管上皮細胞に対するエビスグサ種子のムチン、抗菌ペプチド、タイトジャンクション産生促進作用
腸管上皮細胞Ｃａｃｏ－２を１％非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で１４日間培養した後、エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１）を添加した。蛍光免疫染色は、試料添加２４時間後に細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定し、タイトジャンクション（ＴＪＰ２、Ｂｉｏｓｓ製）、ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ製）で染色を行い、細胞数当たりの蛍光強度を比較した。遺伝子発現解析は、試料添加２４時間後に抽出したＲＮＡからｃＤＮＡ溶液を調製し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現は、ムチン（ＭＵＣ２）、抗菌ペプチド（ＲＥＧ１Ａ）、タイトジャンクション（ＴＪＰ２）について解析した。その際、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部標準として、目的遺伝子とＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
腸管上皮細胞Ｃａｃｏ－２を１％非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で１４日間培養した後、エビスグサ種子熱水抽出物（製造例１）を添加した。蛍光免疫染色は、試料添加２４時間後に細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定し、タイトジャンクション（ＴＪＰ２、Ｂｉｏｓｓ製）、ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ製）で染色を行い、細胞数当たりの蛍光強度を比較した。遺伝子発現解析は、試料添加２４時間後に抽出したＲＮＡからｃＤＮＡ溶液を調製し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現は、ムチン（ＭＵＣ２）、抗菌ペプチド（ＲＥＧ１Ａ）、タイトジャンクション（ＴＪＰ２）について解析した。その際、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部標準として、目的遺伝子とＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【0033】
ＭＵＣ２用のプライマーセット
（配列番号１）ＣＡＡＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧ
（配列番号２）ＣＣＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＴＡＧＴＡＣＴＴＣＣ
ＲＥＧ１Ａ用のプライマーセット
（配列番号３）ＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣ
（配列番号４）ＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣ
ＴＪＰ２用のプライマーセット
（配列番号５）ＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＡＧ
（配列番号６）ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号７）ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ
（配列番号８）ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ
（配列番号１）ＣＡＡＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧ
（配列番号２）ＣＣＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＴＡＧＴＡＣＴＴＣＣ
ＲＥＧ１Ａ用のプライマーセット
（配列番号３）ＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣ
（配列番号４）ＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣ
ＴＪＰ２用のプライマーセット
（配列番号５）ＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＡＧ
（配列番号６）ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号７）ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ
（配列番号８）ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ
【0034】
試験例１の蛍光免疫染色の結果を表１に示した。エビスグサ種子熱水抽出物を添加すると、ＴＪＰ２の蛍光強度が増加したことから、エビスグサ種子熱水抽出物に、タイトジャンクション産生促進作用が認められた。
【0035】
【表1】
【0036】
試験例１の遺伝子発現解析の結果を表２に示した。エビスグサ種子熱水抽出物により、ＭＵＣ２、ＲＥＧ１Ａ、ＴＪＰ２の遺伝子発現量が増加した。
【0037】
【表2】
【0038】
また、試験例１のエビスグサ種子熱水抽出物を、製造例２、３、４のエビスグサ種子抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、エビスグサ種子に、ムチン産生促進作用、抗菌ペプチド産生促進作用、タイトジャンクション産生促進作用が認められ、腸管バリア機能向上作用を有することが明らかとなった。
【0039】
試験例２ 腸管上皮細胞に対するエビスグサ種子の腸管バリア機能低下抑制作用
腸管上皮細胞Ｃａｃｏ－２を１２ウェルトランスウェル上に播種し、１％非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で１４日間培養した後、ＴＮＦαとエビスグサ種子熱水抽出物を添加し、７２時間後にバリア機能の指標として、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。遺伝子発現解析は、ＴＮＦαとエビスグサ種子熱水抽出物の添加２４時間後に細胞を回収し、試験例１と同様の方法で、タイトジャンクション（ＴＪＰ２）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６）について解析した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
腸管上皮細胞Ｃａｃｏ－２を１２ウェルトランスウェル上に播種し、１％非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で１４日間培養した後、ＴＮＦαとエビスグサ種子熱水抽出物を添加し、７２時間後にバリア機能の指標として、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。遺伝子発現解析は、ＴＮＦαとエビスグサ種子熱水抽出物の添加２４時間後に細胞を回収し、試験例１と同様の方法で、タイトジャンクション（ＴＪＰ２）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６）について解析した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【0040】
ＴＪＰ２用のプライマーセット
（配列番号５）ＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＡＧ
（配列番号６）ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣ
ＩＬ－６用のプライマーセット
（配列番号９）ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＴ
（配列番号１０）ＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号７）ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ
（配列番号８）ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ
（配列番号５）ＡＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＡＧ
（配列番号６）ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣ
ＩＬ－６用のプライマーセット
（配列番号９）ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＴ
（配列番号１０）ＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号７）ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ
（配列番号８）ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ
【0041】
試験例２において、未添加の経上皮電気抵抗を１００とし、ＴＮＦα、あるいはＴＮＦα＋エビスグサ種子熱水抽出物を添加した場合の経上皮電気抵抗の結果を表３に示した。エビスグサ種子熱水抽出物により、ＴＮＦαによって低下した経上皮電気抵抗が増加した。以上の結果から、エビスグサ種子に、優れた腸管バリア機能低下抑制作用があることが明らかとなった。
【0042】
【表3】
【0043】
試験例２の遺伝子発現解析の結果を表４に示した。エビスグサ種子熱水抽出物により、ＴＮＦαによるＴＪＰ２低下抑制と、ＩＬ－６増加抑制が認められた。
【0044】
【表4】
【0045】
試験例３ マウスを用いたエビスグサ種子の腸管バリア機能向上作用
５週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、対照群、エビスグサ種子投与群の２群に分け、対照群には通常の粉末飼料を、エビスグサ種子群には、エビスグサ種子熱水抽出物を１．２％混合した粉末飼料を、１４日間自由摂取させた。大腸組織からＲＮＡを抽出し、試験例１と同様の方法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現は、ムチン（ＭＵＣ２）、抗菌ペプチド（ＲＥＧ１Ａ）、タイトジャンクション（ＴＪＰ２、ＣＬＤＮ４）について解析し、目的遺伝子と内部標準であるＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
５週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、対照群、エビスグサ種子投与群の２群に分け、対照群には通常の粉末飼料を、エビスグサ種子群には、エビスグサ種子熱水抽出物を１．２％混合した粉末飼料を、１４日間自由摂取させた。大腸組織からＲＮＡを抽出し、試験例１と同様の方法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現は、ムチン（ＭＵＣ２）、抗菌ペプチド（ＲＥＧ１Ａ）、タイトジャンクション（ＴＪＰ２、ＣＬＤＮ４）について解析し、目的遺伝子と内部標準であるＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【0046】
ＭＵＣ２用のプライマーセット
（配列番号１１）ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧ
（配列番号１２）ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＧ
ＲＥＧ１Ａ用のプライマーセット
（配列番号１３）ＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣ
（配列番号１４）ＣＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧ
ＴＪＰ２用のプライマーセット
（配列番号１５）ＡＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧ
（配列番号１６）ＴＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧ
ＣＬＤＮ４用のプライマーセット
（配列番号１７）ＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号１８）ＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＣ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号１９）ＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号２０）ＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＣ
（配列番号１１）ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧ
（配列番号１２）ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＧ
ＲＥＧ１Ａ用のプライマーセット
（配列番号１３）ＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣ
（配列番号１４）ＣＴＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧ
ＴＪＰ２用のプライマーセット
（配列番号１５）ＡＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧ
（配列番号１６）ＴＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧ
ＣＬＤＮ４用のプライマーセット
（配列番号１７）ＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号１８）ＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＣ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号１９）ＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号２０）ＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＣ
【0047】
試験例３の遺伝子発現解析の結果を表５に示した。エビスグサ種子熱水抽出物により、ＭＵＣ２、ＲＥＧ１Ａ、ＴＪＰ２、ＣＬＤＮ４の遺伝子発現量が増加した。
【0048】
【表5】
【0049】
試験例４ ＤＳＳ大腸炎モデルを用いたエビスグサ種子の腸管バリア機能低下抑制作用
炎症性腸疾患のモデルとしてＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）誘発マウスを用いた。５週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、デキストラン硫酸ナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を水に溶解させ摂取させた。試験では、対照群、大腸炎群、大腸炎＋エビスグサ種子群の３群を設けた。大腸炎＋エビスグサ種子群には、エビスグサ種子熱水抽出物を１．２％混合した粉末飼料を、ＤＳＳ投与５日前から自由摂取させた。ＤＳＳ投与翌日から、１日１回、体重の測定と、便性状を目視によりスコア判定を行った。便性状のスコアは、下痢について０点（正常）１点（軟便）２点（下痢便）３点（水様便）とし、血便について０点（正常）１点（便に血が混じる）２点（肛門に血液が付着）３点（肛門から常に出血）とした。下痢と血便スコアの合計を個体当りの大腸炎スコアとして算出した。ＤＳＳ投与９日目に、大腸組織の長さを計測し、大腸長とした。また、大腸組織の遺伝子発現解析は試験例１と同様の方法で行い、タイトジャンクション（ＴＪＰ２、ＣＬＤＮ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦα）について解析し、目的遺伝子と内部標準であるＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。
炎症性腸疾患のモデルとしてＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）誘発マウスを用いた。５週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、デキストラン硫酸ナトリウム（ＭＰ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を水に溶解させ摂取させた。試験では、対照群、大腸炎群、大腸炎＋エビスグサ種子群の３群を設けた。大腸炎＋エビスグサ種子群には、エビスグサ種子熱水抽出物を１．２％混合した粉末飼料を、ＤＳＳ投与５日前から自由摂取させた。ＤＳＳ投与翌日から、１日１回、体重の測定と、便性状を目視によりスコア判定を行った。便性状のスコアは、下痢について０点（正常）１点（軟便）２点（下痢便）３点（水様便）とし、血便について０点（正常）１点（便に血が混じる）２点（肛門に血液が付着）３点（肛門から常に出血）とした。下痢と血便スコアの合計を個体当りの大腸炎スコアとして算出した。ＤＳＳ投与９日目に、大腸組織の長さを計測し、大腸長とした。また、大腸組織の遺伝子発現解析は試験例１と同様の方法で行い、タイトジャンクション（ＴＪＰ２、ＣＬＤＮ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦα）について解析し、目的遺伝子と内部標準であるＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。
【0050】
ＴＪＰ２用のプライマーセット
（配列番号１５）ＡＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧ
（配列番号１６）ＴＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧ
ＣＬＤＮ４用のプライマーセット
（配列番号１７）ＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号１８）ＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＣ
ＩＬ－６用のプライマーセット
（配列番号２１）ＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＴＣＴＡＴＡＣＣＡ
（配列番号２２）ＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡ
ＴＮＦα用のプライマーセット
（配列番号２３）ＧＣＣＡＧＣＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＡ
（配列番号２４）ＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＴＧＡ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号１９）ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ
（配列番号２０）ＣＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡ
（配列番号１５）ＡＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧ
（配列番号１６）ＴＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧ
ＣＬＤＮ４用のプライマーセット
（配列番号１７）ＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号１８）ＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＴＣ
ＩＬ－６用のプライマーセット
（配列番号２１）ＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＴＣＴＡＴＡＣＣＡ
（配列番号２２）ＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡ
ＴＮＦα用のプライマーセット
（配列番号２３）ＧＣＣＡＧＣＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＴＡ
（配列番号２４）ＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＴＧＡ
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
（配列番号１９）ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ
（配列番号２０）ＣＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡ
【0051】
試験例４の体重変化の結果を表６、大腸炎スコアの結果を表７、大腸長の結果を表８に示した。エビスグサ種子熱水抽出物を摂取することで、ＤＳＳ誘発大腸炎マウスにおける体重の減少抑制、大腸炎スコアの抑制、大腸長の短縮抑制の作用が認められた。
【0052】
【表6】
【0053】
【表7】
【0054】
【表8】
【0055】
また、試験例４の遺伝子発現解析の結果を表９に示した。エビスグサ種子熱水抽出物を摂取することで、ＤＳＳ誘発大腸炎マウスにおけるＴＪＰ２、ＣＬＤＮ４の低下、ＩＬ－６、ＴＮＦαの増加が抑制された。以上の結果から、エビスグサ種子は、タイトジャンクション産生低下抑制作用と炎症抑制作用を示すことから、エビスグサ種子の腸管バリア機能低下抑制作用、大腸炎予防作用が期待できる。
【0056】
【表9】
【0057】
試験例５ エビスグサ種子の肌荒れ改善作用
肌荒れに悩む男女２２名に、処方例１のエビスグサ種子熱水抽出物を含有する顆粒剤を３ヶ月間摂取させた。その結果、肌の角質水分量、表皮水分保持能が上昇した。また、肌荒れ改善作用についてアンケート調査をおこなったところ、表１０に示す様に極めて優れた肌荒れ改善作用が認められた。
肌荒れに悩む男女２２名に、処方例１のエビスグサ種子熱水抽出物を含有する顆粒剤を３ヶ月間摂取させた。その結果、肌の角質水分量、表皮水分保持能が上昇した。また、肌荒れ改善作用についてアンケート調査をおこなったところ、表１０に示す様に極めて優れた肌荒れ改善作用が認められた。
【0058】
【表10】
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明は、エビスグサ種子を含有する、ムチン産生促進、抗菌ペプチド産生促進、タイトジャンクション産生促進作用を有する腸管バリア機能向上剤を提供する。また、内服用肌荒れ改善作用を有する腸管バリア機能向上剤、あるいは腸管バリア機能向上用食品組成物を提供することができ、これらの作用を有するエビスグサ種子を含有する食品、医薬部外品、医薬品に利用できる。
【配列表】