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特許7169004細胞小器官内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-01
(45)【発行日】2022-11-10
(54)【発明の名称】細胞小器官内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07D 491/16 20060101AFI20221102BHJP
C07F 9/6561 20060101ALI20221102BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221102BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20221102BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221102BHJP
C09B 57/02 20060101ALI20221102BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20221102BHJP
【ＦＩ】
C07D491/16 CSP
C07F9/6561 Z
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12Q1/02
C09B57/02 H
G01N21/64 Z
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2020511502
(86)(22)【出願日】2018-08-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-05
(86)【国際出願番号】 KR2018009743
(87)【国際公開番号】W WO2019039888
(87)【国際公開日】2019-02-28
【審査請求日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】10-2017-0107429
(32)【優先日】2017-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520058756
【氏名又は名称】セルツーイン、 インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬ２ＩＮ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン、フン ス
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヘ ミ
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ジ ウン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ミョン ジン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ギ ハン
【審査官】三須 大樹
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１６－００５９９７８（ＫＲ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３８２０１０４（ＣＮ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０００７７２３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】REGISTRY（STN）[online]，2001.12.07CAS登録番号 374544-06-6
【文献】Cho, A. Young; Choi, Kihang，A coumarin-based fluorescence sensor for the reversible detection of thiols，Chemistry Letters ，2012年，41(12)，1611-1612
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式ＶまたはＶＩで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：【化1】
【化2】
【請求項2】
前記Ｒ４は、（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２）－、または－（ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ２）－のうちのいずれか１つであり、前記化学式ＶＩで表される化合物は、下記化学式ＶＩＩ～化学式ＩＸのいずれか1つで表されるものである、請求項１に記載の化学式ＶまたはＶＩで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：【化3】
【化4】
【化5】
【請求項3】
前記化学式ＶまたはＶＩで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示すものである、請求項１に記載の化学式ＶまたはＶＩで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項4】
前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減するものである、請求項３に記載の化学式ＶまたはＶＩで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の化学式ＶまたはＶＩの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）における抗酸化能測定用組成物。
【請求項6】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオール水準の測定である、請求項５に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項7】
前記チオール水準の測定は、細胞小器官におけるチオール水準の測定である、請求項６に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項8】
前記細胞小器官は、ミトコンドリアまたはゴルジ体である、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項9】
前記ミトコンドリアにおける抗酸化能の測定は、化学式Ｖの化合物を使用するものである、請求項８に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項10】
前記ゴルジ体における抗酸化能の測定は、化学式ＶＩ～ＩＸのうちのいずれか１つの化合物を使用するものである、請求項８に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項11】
前記チオール水準の測定において、チオールが増加するに伴い、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度が減少し、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度は増加するものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項12】
前記チオール水準の測定は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施するものである、請求項１１に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項13】
前記比率は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）である、請求項１２に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項14】
前記関係は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の数学的比率関係であり、前記数学的比率関係は、ミトコンドリアにおけるチオールの量に応じて比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）かつ可逆的に増減して、細胞内小器官におけるチオール量をリアルタイムに示すものである、請求項１３に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項15】
前記チオール水準の測定は、細胞小器官内のチオールの定性または定量的検出である、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項16】
前記チオール水準の測定は、リアルタイム定量的測定である、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項17】
前記チオール水準の測定は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示すものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項18】
前記チオール水準の測定は、細胞の老化度を示すものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項19】
前記チオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）、またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項20】
次の段階を含む生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法：（ａ）請求項５に記載の組成物および候補物質を同時にまたは順序にかかわらず順次に生細胞に投与するステップ；
（ｂ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て標準データと比較するステップ；
（ｃ）試験物質をチオール増加剤または抑制剤として決定するステップ；および
（ｄ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度に対する５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率が減少する場合にチオール増加剤として決定し、蛍光強度の比率が増加する場合にチオール抑制剤として決定するステップ。
【請求項21】
蛍光比率の測定は、細胞小器官であるミトコンドリアまたはゴルジ体に対して測定するものである、請求項２０に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項22】
請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含む酸化ストレス誘発疾患診断キット。
【請求項23】
次のステップを含む対象から分離された生細胞における抗酸化能の測定方法：（ａ）生細胞における４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するステップ；
（ｂ）請求項５に記載の組成物を生細胞に投与するステップ；
（ｃ）酸化剤をステップ（ｂ）の細胞に投与するステップ；および
（ｄ）前記蛍光強度の比率値の変化を観察するステップ。
【請求項24】
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記蛍光強度の比率値が前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値、または前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時間を測定するステップを追加的に含み、前記時間が短いほど抗酸化能が高いと判断するものである、請求項２３に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項25】
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値と前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値との差の酸化剤投与時点から、前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時点までの積分値を測定するステップを追加的に含み、前記積分値が小さいほど抗酸化能が高いと判断する、請求項２３に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項26】
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値が減少し始める前記酸化剤の最小濃度を滴定するステップを追加的に含み、前記最小濃度が高いほど抗酸化能が高いと判断する、請求項２３に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項27】
前記測定方法は、生細胞内小器官であるミトコンドリアまたはゴルジ体に対して測定するものである、請求項２３に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞小器官内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞小器官内のグルタチオン測定用新規化合物、新規化合物の製造方法、前記新規化合物を含む細胞小器官内のグルタチオン測定用リアルタイムイメージングセンサ、その製造方法および前記イメージングセンサを用いた細胞小器官内のグルタチオン測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人体は抗酸化系の作用により活性酸素種を適切に除去して恒常性を維持するが、ＲＯＳの生成と抗酸化系作用との間のバランスが崩れると、酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）が増加し、これは、老化を含めて退行性関節炎、白内障、アルツハイマーなどの老化関連退行性疾患、各種癌、線維化疾患をはじめとして、最近は、糖尿病、肥満、心血管疾患などの代謝性症侯群の発病に重要な共通の原因因子として注目されている。前記ＲＯＳは、不安定で反応性が高く、生体分子を酸化させて生化学的、生理的損傷を誘発させ、これは、老化の主要機序の一つである。したがって、人体の酸化度だけでなく、抗酸化度や抗酸化能力は生体年齢の計測において主なバイオマーカーになり得る。
【0003】
一方、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、骨髄、臍帯血、胎盤（または胎盤組織細胞）、脂肪（または脂肪組織細胞）などの多様な成体細胞に由来する多分化性の性質を有する幹細胞である。例えば、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）に由来する中間葉幹細胞は、脂肪組織、骨／軟骨組織、筋肉組織に分化できる多分化性によって細胞治療剤としての開発のために多様な研究が進められている。
【0004】
しかし、細胞治療剤の主要成分である幹細胞は、分離後の培養過程で多分化能、組織再生能を喪失して老化されやすく、治療的有効量に相当する大量の細胞を得るために複数の継代を経ている間にこのような危険性はさらに大きくなる。また、組織から得られる幹細胞は非常に少ない量であり、これを用いる際には大量の細胞が必要になるので、幹細胞の数を増殖させる培養が行われる。最近は、幹細胞の品質に関連し、幹細胞の抗酸化活性を測定してこれによって品質を管理する方法として、細胞内の抗酸化活性を測定する方法が開示されている（韓国登録特許第１０－１５７５８４６号、韓国公開特許第２００４－００３０７０１号、Ｈｏｎｇｙａｎ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１４（２）；１６２－１７２，２０１２）。
【0005】
しかし、幹細胞の抗酸化活性の測定により高い活性を備えた高品質の幹細胞の選別方法に関する研究は不十分であるのが現状である。したがって、希少価値の高い細胞治療剤資源である幹細胞の使用効率性を高めるために、高活性の幹細胞の選別に必要な抗酸化能測定用組成物の開発が必要になる。
【0006】
また、前記のように幹細胞を含む細胞の抗酸化能の測定において、生体試料からチオールを含有する物質の検出および識別は非常に重要である。これによって、細胞を破砕せずに生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）におけるチオールを効果的に検出する蛍光方法が開発されているが、細胞内の多様なソースのチオールの測定による抗酸化能測定物質が必要になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、本発明に係るＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）またはＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｇｏｌｇｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を用いて、ミトコンドリアまたはゴルジ体内のチオールの量に応じて蛍光強度が連続的で比率計量的かつ可逆的に増減することを究明し、生きている細胞内ミトコンドリアまたはゴルジ体におけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサとして有用に利用可能であることを確認することにより、本発明を完成した。
【0008】
したがって、本発明の目的は、化学式ＩＩＩ～Ｖで表されるＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）、または化学式ＶＩＩ～ＩＸで表されるＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｇｏｌｇｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を含むミトコンドリアのチオール検出用組成物またはＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｇｏｌｇｉ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を含むゴルジ体におけるチオール検出用組成物を提供することである。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーまたはＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを用いた生細胞内ミトコンドリアまたはゴルジ体のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法を提供することである。
【0011】
本発明の目的および利点は、下記の発明の詳細な説明および請求の範囲によってより明確になる。
【0012】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は、以上に述べた課題に制限されず、述べていないさらに他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0013】
以下、本願に記載の多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の具体例はこれらの特異的詳細事項の一つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行可能である。他の例において、公知の工程および製造技術は、本発明を不必要にあいまいにしないために、特定の詳細事項として記載されない。「一つの具体例」または「具体例」についての本明細書全体を通した参照は具体例と結び付いて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が、本発明の一つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一つの具体例において」または「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同一の具体例を示さない。追加的に、特別な特徴、形態、組成、または特性は、一つ以上の具体例において、何らかの好適な方法で組み合わされる。
【0014】
本明細書内で特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【0015】
本明細書において、用語「比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）」は、算出量が投入量（ｉｎｐｕｔ）に直接的に比例することを意味する。具体的には、本発明の一実施形態において、「比率計量的」は、本発明の組成物がチオール投入量に応じて直接的に比例して蛍光強度または蛍光強度の比率が増加または減少することを意味する。
【0016】
本明細書において、用語「検出」は、試料中で化学種や生物学的物質の存在の有無やその量を測定することを意味する。
【0017】
本明細書において、用語「可逆的（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）」は、化学反応で反応物と生成物の混合物が平衡状態の混合物を生成することが可能な状態を意味する。より具体的には、本明細書において、化学式Ｉで表される化合物とチオールの反応が平衡状態をなして、チオールの量に応じて正反応または逆反応して可逆的に反応が進行できることを意味する。
【0018】
本明細書において、用語「チオール（ｔｈｉｏｌ）」は、炭素と結合したスルフヒドリル基を含む有機化合物を意味し、スルフヒドリル基またはチオール基は混用されて使用される。
【0019】
本発明の一様態によれば、本発明は、下記化学式Ｉで表される化合物またはその塩を含むミトコンドリアにおけるチオール検出用組成物を提供する：
【化1】
【0020】
前記化学式Ｉにおいて、Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３～７員環であるヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ２置換基が結合しており；前記Ｒ２は、－（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ）－（ＣＨ２）ｍ－ＰＰｈ３
＋Ｃｌ－（前記ｍは、１～４の整数である）、－（ＣＨ２）ｎ－ＰＰｈ３
＋Ｃｌ－（前記ｎは、１～６の整数である）、または－（Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｒ３（前記ｐは、１～４の整数である）であり；前記Ｒ３は、－Ｃ（ＮＨＣ（＝Ｏ）－Ｒ４）であり、前記Ｒ４は、次の化学式ＩＩで表される置換基である：
【化2】
【0021】
前記化学式ＩＩにおいて、前記ｘは、１～４の整数である。
【0022】
本発明者らは、細胞内ミトコンドリアにおけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサを開発するために鋭意研究努力をした。その結果、前記化学式Ｉで表される本発明のＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）が、細胞内ミトコンドリアにおけるチオールの量に応じて蛍光強度が連続的で比率計量的かつ可逆的に増減することを究明し、細胞内ミトコンドリアにおけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサとして有用に利用可能であることを立証した。
【0023】
本明細書において、用語「ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）」は、シアノアクリルアミド親電子体（ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）を有するクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）誘導体として化学式Ｉで表される化合物を意味し、本発明におけるミトコンドリア内のチオール検出用蛍光物質として使用される。
【0024】
本発明の一実施形態において、本発明のミトコンドリアは、生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）内に含まれたものである。本発明の組成物は、ミトコンドリア内のチオール水準を測定するにあたり、細胞から分離されたミトコンドリアに限らず、細胞内に含まれた状態のミトコンドリア内のチオール水準を測定できる特徴がある。特に、生きている細胞内ミトコンドリアにおけるチオール水準を特異的に検出することができる。
【0025】
本発明の一実施形態において、本発明のＲ１は、１つまたは２つのＮを含む６員環ヘテロシクロアルキルである。本発明において、「６員環ヘテロシクロアルキル」に含まれた用語「６員環」は、ビサイクリック化合物（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）またはスピロ化合物（Ｓｐｉｒｏ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のように複数の環が接合された環化合物形態ではない、モノサイクリック化合物としての１つの６員環形態を意味し、「ヘテロシクロアルキル」は、非－芳香族性環状アルキルであって、環内に含まれた炭素原子のうちの少なくとも１つがヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、または硫黄によって置換されているものを意味する。本実施形態において、Ｒ１は、６員環ヘテロシクロアルキルであって、１つまたは２つの窒素を環内に含まれたヘテロ原子として含む。
【0026】
本発明の一実施形態において、本発明の化学式Ｉで表される化合物は、次の化学式ＩＩＩ～Ｖで表される化合物のうちのいずれか１つ以上である：
【化3】
【化4】
【化5】
【0027】
本発明の前記化学式ＩＩＩ～Ｖで表される化合物は、生細胞内ミトコンドリアにおけるチオールの量が増加するに伴い、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーに結合するチオールの量が増加するので、フリー状態の化合物が示す５５０～６８０ｎｍの蛍光強度は減少し、チオールが結合している化合物が示す４３０～５５０ｎｍの蛍光強度は増加する。前記チオールの量に応じた蛍光強度は、比率計量的かつ可逆的に増減する。
【0028】
本発明の他の態様によれば、本発明は、下記化学式ＶＩで表される化合物またはその塩を含むゴルジ体におけるチオール検出用組成物を提供する：
【化6】
【0029】
前記化学式ＶＩにおいて、Ｒ４は、（ＣＨ２）ｐ－（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ－（ＣＨ２）ｒ、または－（ＣＨ２ＣＨ２）ｓ－である化合物（前記ｐ、ｑ、ｒ、ｓは、１～５の整数である）である。より詳細には、前記化学式ＶＩにおいて、Ｒ４は、（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－、－（ＣＨ２ＣＨ２）－、および－（ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ２）－のうちのいずれか１つである。
【0030】
本発明者らは、細胞内ゴルジ体におけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサを開発するために鋭意研究努力をした。その結果、前記化学式ＶＩで表される本発明のＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｇｏｌｇｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）が、細胞内ゴルジ体におけるチオールの量に応じて蛍光強度が連続的で比率計量的かつ可逆的に増減することを究明し、細胞内ゴルジ体におけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサとして有用に利用可能であることを立証した。
【0031】
本明細書において、用語「ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー（Ｇｏｌｇｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）」は、シアノアクリルアミド親電子体（ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）を有するクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）誘導体として化学式ＶＩで表される化合物を意味し、本発明におけるゴルジ体内のチオール検出用蛍光物質として使用される。
【0032】
本発明の前記化学式ＶＩで表される化合物は、生細胞内ゴルジ体におけるチオールの量が増加するに伴い、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーに結合するチオールの量が増加するので、フリー状態の化合物が示す５５０～６８０ｎｍの蛍光強度は減少し、チオールが結合している化合物が示す４３０～５５０ｎｍの蛍光強度は増加する。前記チオールの量に応じた蛍光強度は、比率計量的かつ可逆的に増減する。
【0033】
本発明の一実施形態において、本発明の化学式ＶＩで表される化合物は、次の化学式ＶＩＩ～ＩＸで表される化合物のうちのいずれか１つ以上である：
【化7】
【化8】
【化9】
【0034】
本発明に係る化合物を含む組成物を用いて、幹細胞を含むすべての細胞の細胞内小器官であるミトコンドリアまたはゴルジ体の抗酸化能を測定して抗酸化能に関連する細胞の活性を正確に測定することができ、高活性の細胞分類が可能である。本発明の組成物を用いた細胞の活性の測定は抗酸化能の測定を含むが、これに限定されるものではない。
【0035】
本発明の一実施形態において、化学式ＩまたはＶＩで表される化合物；そのラセミ体、光学異性体、部分立体異性体、光学異性体の混合物、または部分立体異性体の混合物；その薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む細胞内小器官の抗酸化能測定用組成物を提供した。
【0036】
本発明の一実施形態によれば、前記化学式ＩまたはＶＩで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態、すなわち、チオール基が結合していない状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示す。本発明の他の実施形態によれば、本発明の化学式ＩまたはＶＩで表される化合物は、フリー状態で５５０～６５０、５５０～６２０、５５０～６００、５７０～５９０、または５８０ｎｍで最大放出波長を示す。
【0037】
本発明の他の実施形態によれば、本発明の化学式ＩまたはＶＩで表される化合物は、チオールと結合した状態で４５０～５５０、４７０～５５０、４７０～５３０、４９０～５３０、５００～５２０、または５１０ｎｍで最大放出波長を示す。
【0038】
本発明の一実施形態によれば、本発明の化学式ＩまたはＶＩで表される化合物は、ミトコンドリアにおけるチオールが増加するに伴い、放出波長の蛍光強度が連続的で可逆的に増減する。より具体的な実施形態によれば、前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減する。
【0039】
本発明の一実施形態によれば、本発明の化学式ＩまたはＶＩで表される化合物は、ミトコンドリアにおけるチオールが増加するに伴い、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度が減少し、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度は増加する。
【0040】
本発明の一実施形態によれば、本発明のチオールの検出は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施する。
【0041】
本発明の一実施形態によれば、本発明の比率は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）である。
【0042】
本発明の一実施形態によれば、本発明の関係は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の数学的比率関係であり、前記数学的比率関係は、生細胞におけるチオールの量に応じて比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）かつ可逆的に増減して、細胞小器官におけるチオール量をリアルタイムに示す。
【0043】
本発明の一実施形態によれば、本発明の検出は、前記細胞小器官であるミトコンドリア、ゴルジ体、または核内のチオールの定性または定量的検出である。
【0044】
本発明の一実施形態によれば、本発明の検出は、リアルタイム定量的検出である。
【0045】
本発明の一実施形態によれば、本発明のミトコンドリア、ゴルジ体、または核におけるチオールの検出は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示す。
【0046】
本発明の一実施形態によれば、本発明のミトコンドリア、ゴルジ体、または核におけるチオールの検出は、細胞の老化度を示す。
【0047】
本発明の一実施形態によれば、本発明のチオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）、またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールをすべて含むが、これに限定されるものではない。
【0048】
本発明の一実施形態によれば、本発明は、本発明の組成物を含む酸化ストレス誘発疾患診断キットを提供する。本明細書の用語「酸化ストレス誘発疾患」は、酸化ストレスによって発生する疾患を意味し、「活性酸素種（ＲＯＳ）連関疾患」と同一の意味で使用される。
【0049】
本発明の一実施形態によれば、本発明の酸化ストレス誘発疾患は、老化、退行性関節炎、白内障、アルツハイマー病、癌、線維化疾患、糖尿病、肥満、虚血、虚血性再灌流損傷、炎症、全身性紅斑性狼瘡、心筋梗塞、血栓性脳卒中、出血性脳卒中、出血、脊髄外傷、ダウン症候群、クローン病、リウマチ関節炎、ブドウ膜炎、肺気腫、胃潰瘍、酸素中毒、腫瘍、または放射線症である。
【発明の効果】
【0050】
本発明に係る化合物を含む組成物を用いて生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）、特に、幹細胞内小器官であるミトコンドリアまたはゴルジ体の抗酸化能を測定することができ、細胞小器官の抗酸化能の測定結果によって高活性の幹細胞を選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【図2】図２は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーがグルタチオンの還元型と可逆的で速やかに反応するとの実験結果を示すものであり（ａ．ｕ．は任意単位、Ｅｘは最大励起波長、Ｅｍは最大放出波長をそれぞれ示す）、図２Ａは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの可逆反応を示す図であり、図２Ｂは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーを２０分間多様な濃度のグルタチオン（［ＧＳＨ］０＝０～１００ｍＭ）に平衡を合わせた後、その反応を測定した結果を示す図であり、図２Ｂにて上段（ｕｐｐｅｒ）は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの可逆反応をＵＶ可視光線吸収スペクトルによって測定した結果を示す図であり、図２Ｂにて下段（ｌｏｗｅｒ）は、４３０ｎｍ（図２Ｂの下段左側）および５２０ｎｍ（図２Ｂの下段右側）で励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）によって発生したＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの蛍光放出スペクトルを５１０ｎｍ（Ｆ５１０）および５８０ｎｍ（Ｆ５８０）でそれぞれモニタリングしてグラフ（図２Ｃ）で示す図であり、図２Ｄは、Ｆ５１０およびＦ５８０に分けて計算し、増加した濃度のグルタチオンに合わせた放出比率を示す結果である。
【図4】図４は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーで生細胞のミトコンドリア内のグルタチオン水準をイメージング化できることを示す結果であって、図４Ａは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーでローディングされた細胞の共焦点顕微鏡蛍光イメージを示す結果であり（Ｆ５１０＝Ｅｘ４０３－Ｅｍ５２５／２５；Ｆ５８０＝Ｅｘ４８８－Ｅｍ５９５／２５；大きさ棒＝１０ｉｍ）、図４Ｂは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーでローディングされた細胞の顕微鏡観察を開始してから３分後に０．５ｍＭジアミド（ＤｉＡｍｉｄｅ、ＤＡ）を細胞培養液に処理した後、その共焦点顕微鏡蛍光イメージを示す結果であり（Ｆ５１０＝Ｅｘ４０３－Ｅｍ５２５／２５；Ｆ５８０＝Ｅｘ４８８－Ｅｍ５９５／２５；大きさ棒＝１０ｉｍ）、図４Ｃは、３つそれぞれの細胞の蛍光比（図４Ａ、矢先）を測定した結果を示す図である。
【図5】図５は、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーでミトコンドリアで発生した活性酸素によって減少する生細胞のミトコンドリア内のグルタチオン水準をイメージング化できることを示す結果であって、図５Ａは、アンチマイシンＡを細胞培養液に２４時間処理後、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーでローディングした細胞を共焦点顕微鏡で観察した蛍光イメージを示す結果であり（Ｆ５１０＝Ｅｘ４０３－Ｅｍ５２５／２５；Ｆ５８０＝Ｅｘ４８８－Ｅｍ５９５／２５；大きさ棒＝１０ｉｍ）、図５Ｂは、それぞれの細胞の蛍光比を測定した結果を示すものである。
【図7】図７は、ＨｅＬａ細胞においてＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーがゴルジ体内に分布するかを分析した結果である（Ｆ５１０＝Ｅｘ４０３－Ｅｍ５２５／２５；Ｆ５８０＝Ｅｘ４８８－Ｅｍ５９５／２５；大きさ棒＝１０ｉｍ）。
【発明を実施するための形態】
【0052】
本発明に係る化合物を含む組成物を用いて生細胞、特に、幹細胞内小器官であるミトコンドリアまたはゴルジ体の抗酸化能を測定することができ、細胞小器官の抗酸化能の測定結果によって高活性の幹細胞を選別することができる。
【実施例】
【0053】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0054】
製造例１．ミトコンドリア抗酸化能測定用化合物の合成
細胞小器官であるミトコンドリアの抗酸化能の測定に用いる化合物（ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－ＰＰｈ３、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ、およびＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｃｌ）の製造方法は、下記の通りである。
細胞小器官であるミトコンドリアの抗酸化能の測定に用いる化合物（ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－ＰＰｈ３、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ、およびＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｃｌ）の製造方法は、下記の通りである。
【0055】
１－１．ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－ＰＰｈ３（化学式ＩＩＩ）の製造方法
【化10】
【0056】
化合物１
【化11】
【0057】
（２－ブロモエチル）アミンヒドロブロミド｛（２－ｂｒｏｍｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ、８．６ｇ、４２ｍｍｏｌ｝とトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、１０ｇ、３８ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ５０ｍＬに溶かした溶液を加熱して、１８時間還流させた後、常温に冷却させた。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物を蒸留水に溶かした後、Ｋ２ＣＯ３飽和水溶液を添加してｐＨ値を１１に調節した。この混合物をＣＨＣｌ３で抽出した溶液をＮａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの固体をＥｔ２Ｏで洗った後、減圧乾燥して、化合物１を得た（１０ｇ、６８％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝７．６６－７．８７（ｍ，１５Ｈ），４．０１－４．０８（ｍ，２Ｈ），３．１５－３．２１（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝２４．６０．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝７．６６－７．８７（ｍ，１５Ｈ），４．０１－４．０８（ｍ，２Ｈ），３．１５－３．２１（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝２４．６０．
【0058】
化合物２
【化12】
【0059】
１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－ピペリジンカルボン酸｛１－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（０．１５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）｝、オキシマ｛ｏｘｙｍａ（０．１０ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）｝、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン｛Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ；０．３３ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）｝、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド｛１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣＩ；０．１２ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）｝、そして化合物１（０．２１ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）３ｍＬに溶かした溶液を、常温で１１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２ ６／９４）で精製して、黄色固体形態の化合物２を得た（０．２１ｇ、６３％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．９０－８．９３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６９－７．８５（ｍ，１５Ｈ），４．０７（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．６９－３．８０（ｍ，４Ｈ），２．７３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．３４－２．４２（ｍ，１Ｈ），１．７５－１．７８（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５１－１．５５（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．９０－８．９３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６９－７．８５（ｍ，１５Ｈ），４．０７（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．６９－３．８０（ｍ，４Ｈ），２．７３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．３４－２．４２（ｍ，１Ｈ），１．７５－１．７８（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５１－１．５５（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
【0060】
化合物３
【化13】
【0061】
化合物２（０．１４ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を塩酸／ジオキサン（ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅ）４Ｍ溶液に溶かした後、常温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの化合物を精製過程を経ずに次の反応に使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝９．６６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．１７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．００（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．７３－７．８５（ｍ，１５Ｈ），３．７４－３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６３－３．６７（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．９６（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．２８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．０６（ｂｒ ｓ，２Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝９．６６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．１７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．００（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．７３－７．８５（ｍ，１５Ｈ），３．７４－３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６３－３．６７（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．９６（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．２８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．０６（ｂｒ ｓ，２Ｈ）．
【0062】
前記化合物とシアノ酢酸（ｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、２１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ｏｘｙｍａ（３５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．１５ｍＬ、０．８３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液を、常温で１４時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２ ８／９２）で精製して、黄色固体形態の化合物３を得た（４９ｍｇ、４５％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝９．４７－９．４９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７０－７．８６（ｍ，１５Ｈ），４．４３－４．５６（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６６－３．８２（ｍ，４Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．１６－３．２３（ｍ，１Ｈ），２．７１－２．７８（ｍ，１Ｈ），２．５４－２．６２（ｍ，１Ｈ），１．９４－１．９７（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８２－１．８５（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），１．６４－１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５２－１．６２（ｍ，１Ｈ），１．４３－１．４７（ｍ，１Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝９．４７－９．４９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７０－７．８６（ｍ，１５Ｈ），４．４３－４．５６（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６６－３．８２（ｍ，４Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．１６－３．２３（ｍ，１Ｈ），２．７１－２．７８（ｍ，１Ｈ），２．５４－２．６２（ｍ，１Ｈ），１．９４－１．９７（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８２－１．８５（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），１．６４－１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５２－１．６２（ｍ，１Ｈ），１．４３－１．４７（ｍ，１Ｈ）．
【0063】
ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－ＰＰｈ３（化学式ＩＩＩ）
【化14】
【0064】
１０－オキソ－２，３，５，６－テトラヒドロ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－オキサ－３ａ－アザベンゾ［ｄｅ］アントラセン－９－カルボアルデヒド｛１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（３６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）｝、化合物３（７０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、そしてピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ、１３ｉＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を２－プロパノール１ｍＬに溶かした溶液を、６０℃で１時間加熱した後、常温に冷却した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２ ５／９５）で精製して、赤色固体形態の化合物（ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－ＰＰｈ３）を得た（３６ｍｇ、３６％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝９．４４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．３６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７１－７．８４（ｍ，１５Ｈ），７．５０（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），３．６２－３．８８（ｍ，４Ｈ），３．３２－３．３８（ｍ，４Ｈ），２．８４－２．８８（ｍ，２Ｈ），２．７５－２．７８（ｍ，２Ｈ），２．５３－２．６０（ｍ，１Ｈ），１．９６－２．０４（ｍ，４Ｈ），１．８８－１．９５（ｍ，４Ｈ），１．６２－１．７１（ｍ，４Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝９．４４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．３６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．７１－７．８４（ｍ，１５Ｈ），７．５０（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），３．６２－３．８８（ｍ，４Ｈ），３．３２－３．３８（ｍ，４Ｈ），２．８４－２．８８（ｍ，２Ｈ），２．７５－２．７８（ｍ，２Ｈ），２．５３－２．６０（ｍ，１Ｈ），１．９６－２．０４（ｍ，４Ｈ），１．８８－１．９５（ｍ，４Ｈ），１．６２－１．７１（ｍ，４Ｈ）．
【0065】
１－２．ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ（化学式ＩＶ）の合成
【化15】
【0066】
化合物４
【化16】
【0067】
タート－ブチルピペラジン－１－カルボン酸塩｛ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（１．０ｇ、５．３ｍｍｏｌ）｝とシアノ酢酸（ｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、０．５４ｇ、１．２ｅｑ．）をＤＭＦ１０ｍＬに溶かした溶液に、ＤＩＥＡ（３．２８ｍＬ、３．５ｅｑ．）とＥＤＣＩ（１．５６ｇ、１．５ｅｑ．）を添加した。常温で１２時間撹拌した後、減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体形態の化合物４を得た（１．１３ｇ、８４％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝３．６０３．６４（ｍ，２Ｈ），３．５０３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．４３３．４８（ｍ，４Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋２５４．１４９６．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝３．６０３．６４（ｍ，２Ｈ），３．５０３．５５（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．４３３．４８（ｍ，４Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋２５４．１４９６．
【0068】
化合物５
【化17】
【0069】
化合物４（０．３０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を塩酸／ジオキサン（ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅ）４Ｍ溶液５ｍＬに溶かした後、常温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの化合物５を精製過程を経ずに次の反応に使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：ａ（ｐｐｍ）＝９．５４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．６７３．７０（ｍ，２Ｈ），３．５８３．６１（ｍ，２Ｈ），３．０４３．１２（ｍ，４Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：ａ（ｐｐｍ）＝９．５４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．６７３．７０（ｍ，２Ｈ），３．５８３．６１（ｍ，２Ｈ），３．０４３．１２（ｍ，４Ｈ）．
【0070】
化合物６
【化18】
【0071】
化合物５（０．１５ｍｍｏｌ）と（４－ブロモブチル）トリフェニルホスホニウムブロミド｛（４－ｂｒｏｍｏｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（０．１５ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）１ｍＬに溶かした溶液に、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、６４ｍｇ、０．７５４５ｍｍｏｌ）を添加した。５０℃で２０時間撹拌した後、減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２ １５／８５）で精製して、白色固体形態の化合物６を得た（７１ｍｇ、７１％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝７．６９－７．８８（ｍ，１５Ｈ），３．７８－３．８６（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ），３．５１－３．５３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４７－３．４９（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），２．５４－２．５６（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４６－２．４９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８－２．４０（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８５－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６６－１．７４（ｍ，２Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝７．６９－７．８８（ｍ，１５Ｈ），３．７８－３．８６（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，２Ｈ），３．５１－３．５３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４７－３．４９（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），２．５４－２．５６（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４６－２．４９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８－２．４０（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８５－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６６－１．７４（ｍ，２Ｈ）．
【0072】
ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ（化学式ＩＶ）
【化19】
【0073】
１０－オキソ－２，３，５，６－テトラヒドロ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－オキサ－３ａ－アザベンゾ［ｄｅ］アントラセン－９－カルボアルデヒド｛１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（３５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、化合物６（６４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、そしてピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ、１２ｉＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を２－プロパノール１ｍＬに溶かした溶液を、６０℃で１時間撹拌した後、常温に冷却した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２ ６／９４）で精製して、赤色固体形態の化合物ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅを得た（６１ｍｇ、６６％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６１（ｓ，１Ｈ），７．６９－７．９１（ｍ，１５Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），３．５６（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．３５－３．３９（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ），２．８４－２．８８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７５－２．７８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４１－２．４９（ｍ，４Ｈ），１．８４－２．０４（ｍ，１２Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６１（ｓ，１Ｈ），７．６９－７．９１（ｍ，１５Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），３．５６（ｂｒ ｓ，４Ｈ），３．３５－３．３９（ｑ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ），２．８４－２．８８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７５－２．７８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４１－２．４９（ｍ，４Ｈ），１．８４－２．０４（ｍ，１２Ｈ）．
【0074】
１－３．ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｃｌ（化学式Ｖ）の合成
【化20】
【0075】
化合物７
５－ベンジルＮ－（タート－ブトキシカルボニル）－Ｌ－グルタミン酸塩｛５－ｂｅｎｚｙｌ Ｎ－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ（０．１０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）｝、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、ＨＯＢｔ、８０ｍｇ、２．０ｅｑ．）、そしてＤＩＥＡ（０．１８ｍＬ、３．５ｅｑ．）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液に、ＥＤＣＩ（０．１１ｇ、２．０ｅｑ．）と化合物１（０．１３ｇ、１．２ｅｑ．）を添加した。常温で１６時間撹拌した溶液をエチル酢酸塩（ＥｔＯＡｃ）で希釈した後、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）０．５Ｍ水溶液と炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）飽和水溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）飽和水溶液で洗浄した。有機層を分離した後、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体形態の化合物４を得た（０．１６ｇ、７６％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝９．４９（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６８７．８３（ｍ，１５Ｈ），７．２７７．３５（ｍ，５Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．１８４．２３（ｍ，１Ｈ），３．６１３．８７（ｍ，４Ｈ），２．４３２．４７（ｍ，２Ｈ），２．１２２．２２（ｍ，１Ｈ），１．９４２．０１（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１７２．８，１７２．７，１５５．２，１３５．８，１３５．３（ｄ，４ＪＣＰ＝３．０Ｈｚ），１３３．４（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．４Ｈｚ），１３０．５（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１２８．４，１２８．１，１２８．０，１１７．４（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．９Ｈｚ），７９．２，６６．１，５３．９，３３．３，３０．４，２８．４，２８．３，２２．２（ｄ，１ＪＣＰ＝４９．７Ｈｚ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．１；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋６２５．２８２６．
５－ベンジルＮ－（タート－ブトキシカルボニル）－Ｌ－グルタミン酸塩｛５－ｂｅｎｚｙｌ Ｎ－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ（０．１０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）｝、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、ＨＯＢｔ、８０ｍｇ、２．０ｅｑ．）、そしてＤＩＥＡ（０．１８ｍＬ、３．５ｅｑ．）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液に、ＥＤＣＩ（０．１１ｇ、２．０ｅｑ．）と化合物１（０．１３ｇ、１．２ｅｑ．）を添加した。常温で１６時間撹拌した溶液をエチル酢酸塩（ＥｔＯＡｃ）で希釈した後、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）０．５Ｍ水溶液と炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）飽和水溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）飽和水溶液で洗浄した。有機層を分離した後、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体形態の化合物４を得た（０．１６ｇ、７６％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝９．４９（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６８７．８３（ｍ，１５Ｈ），７．２７７．３５（ｍ，５Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．１８４．２３（ｍ，１Ｈ），３．６１３．８７（ｍ，４Ｈ），２．４３２．４７（ｍ，２Ｈ），２．１２２．２２（ｍ，１Ｈ），１．９４２．０１（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝１７２．８，１７２．７，１５５．２，１３５．８，１３５．３（ｄ，４ＪＣＰ＝３．０Ｈｚ），１３３．４（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．４Ｈｚ），１３０．５（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１２８．４，１２８．１，１２８．０，１１７．４（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．９Ｈｚ），７９．２，６６．１，５３．９，３３．３，３０．４，２８．４，２８．３，２２．２（ｄ，１ＪＣＰ＝４９．７Ｈｚ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．１；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋６２５．２８２６．
【0076】
化合物８
化合物７（１．２ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をメタノール（ＣＨ３ＯＨ）５ｍＬと蒸留水５ｍＬに溶かした溶液に、１０％Ｐｄ－Ｃ（０．１２ｇ）を添加した後、Ｈ２気体（１ａｔｍ）を満たした反応容器で１２時間撹拌する。セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）を用いて濾過した溶液を減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの化合物８（１．０４ｇ、９９％）を精製過程を経ずに次の反応に使用する。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝８．９５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．７０７．８２（ｍ，１５Ｈ），５．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６０３．９０（ｍ，４Ｈ），２．３５２．４５（ｍ，２Ｈ），１．９５２．０５（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；３１ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．１．
化合物７（１．２ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をメタノール（ＣＨ３ＯＨ）５ｍＬと蒸留水５ｍＬに溶かした溶液に、１０％Ｐｄ－Ｃ（０．１２ｇ）を添加した後、Ｈ２気体（１ａｔｍ）を満たした反応容器で１２時間撹拌する。セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）を用いて濾過した溶液を減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの化合物８（１．０４ｇ、９９％）を精製過程を経ずに次の反応に使用する。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝８．９５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．７０７．８２（ｍ，１５Ｈ），５．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６０３．９０（ｍ，４Ｈ），２．３５２．４５（ｍ，２Ｈ），１．９５２．０５（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）；３１ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．１．
【0077】
化合物９
化合物８（０．１５ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、化合物５（４９ｍｇ、１．０５ｅｑ．）、そしてＤＩＥＡ（０．１５ｍＬ、３．５ｅｑ．）をＤＭＦ２ｍＬに溶かした溶液に、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．１ｅｑ．）とＥＤＣＩ（９５ｍｇ、２．０ｅｑ．）を添加する。常温で４時間撹拌した後、減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、黄色固体形態の化合物９を得る（０．１４ｇ、７８％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主配座異性体）９．４６（ｂｒ ｓ １Ｈ），７．７２７．８４（ｍ，１５Ｈ），５．７９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１５４．２１（ｍ，１Ｈ），３．４７３．７９（ｍ，１４Ｈ），２．５０２．６０（ｍ，２Ｈ），２．１２２．１５（ｍ，１Ｈ），２．００－２．０４（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（＊主配座異性体；＊＊副配座異性体）１７２．８＊＊，１７２．７＊，１７１．２＊＊，１７１．０＊，１６１．１，１５５．２，１３５．３，１３３．４（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．３Ｈｚ），１３０．５（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１１７．４（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．８Ｈｚ），１１４．５，７９．２，５４．０．４６．３＊，４５．８＊＊，４５．３＊，４４．７＊＊，４２．２＊＊，４１．９＊，４１．２＊＊，４０．８＊，３３．３，３０．０＊＊，２９．５＊，２９．２＊，２８．９＊＊，２８．３，２５．４，２２．２（ｄ，１ＪＣＰ＝４９．８Ｈｚ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．１；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋６７０．３１５７．
化合物８（０．１５ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、化合物５（４９ｍｇ、１．０５ｅｑ．）、そしてＤＩＥＡ（０．１５ｍＬ、３．５ｅｑ．）をＤＭＦ２ｍＬに溶かした溶液に、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．１ｅｑ．）とＥＤＣＩ（９５ｍｇ、２．０ｅｑ．）を添加する。常温で４時間撹拌した後、減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、黄色固体形態の化合物９を得る（０．１４ｇ、７８％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主配座異性体）９．４６（ｂｒ ｓ １Ｈ），７．７２７．８４（ｍ，１５Ｈ），５．７９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１５４．２１（ｍ，１Ｈ），３．４７３．７９（ｍ，１４Ｈ），２．５０２．６０（ｍ，２Ｈ），２．１２２．１５（ｍ，１Ｈ），２．００－２．０４（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（＊主配座異性体；＊＊副配座異性体）１７２．８＊＊，１７２．７＊，１７１．２＊＊，１７１．０＊，１６１．１，１５５．２，１３５．３，１３３．４（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．３Ｈｚ），１３０．５（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１１７．４（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．８Ｈｚ），１１４．５，７９．２，５４．０．４６．３＊，４５．８＊＊，４５．３＊，４４．７＊＊，４２．２＊＊，４１．９＊，４１．２＊＊，４０．８＊，３３．３，３０．０＊＊，２９．５＊，２９．２＊，２８．９＊＊，２８．３，２５．４，２２．２（ｄ，１ＪＣＰ＝４９．８Ｈｚ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．１；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋６７０．３１５７．
【0078】
化合物１０
化合物９（０．２３ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を塩酸／ジオキサン（ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅ）４Ｍ溶液３ｍＬに溶かした後、常温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの化合物１０を精製過程を経ずに次の反応に使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝９．４４（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），８．４９（ｂｒｓ，３Ｈ），７．７６７．９４（ｍ，１５Ｈ），４．０９４．１１（ｍ，１Ｈ），３．８０３．８４（ｍ，２Ｈ），３．３３３．５０（ｍ，１２Ｈ），２．５０２．５５（ｍ，２Ｈ），１．９４１．９８（ｍ，２Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝２２．４．
化合物９（０．２３ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を塩酸／ジオキサン（ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅ）４Ｍ溶液３ｍＬに溶かした後、常温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの化合物１０を精製過程を経ずに次の反応に使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝９．４４（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），８．４９（ｂｒｓ，３Ｈ），７．７６７．９４（ｍ，１５Ｈ），４．０９４．１１（ｍ，１Ｈ），３．８０３．８４（ｍ，２Ｈ），３．３３３．５０（ｍ，１２Ｈ），２．５０２．５５（ｍ，２Ｈ），１．９４１．９８（ｍ，２Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝２２．４．
【0079】
化合物１１
化合物１０（０．１０ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）と３－（クロロメチル）ベンゾイル塩化物｛３－（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２５μＬ、１．０５ｅｑ．）｝をＣＨ２Ｃｌ２ １ｍＬに溶かした溶液に、ＤＩＥＡ（５８μＬ、２．０ｅｑ．）を添加した。常温で１時間撹拌した後、減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体形態の化合物１１を得た（０．１０ｇ、８５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主配座異性体）９．６５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６９７．８２（ｍ，１５Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４２７．４６（ｍ，１Ｈ），４．７４４．７９（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），３．３５３．７４（ｍ，１４Ｈ），２．５３２．６０（ｍ，２Ｈ），２．２５２．３０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（＊主配座異性体；＊＊副配座異性体）１７３．１＊＊，１７３．０＊，１７１．３＊，１７１．２＊＊，１６６．４，１６０．９，１３７．７，１３５．５，１３４．１，１３３．５（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．３Ｈｚ），１３１．７，１３０．６（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１２８．９，１２８．３＊，１２８．２＊＊，１２７．８＊，１２７．７＊＊，１１７．５（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．９Ｈｚ），１１４．５，５４．２，４６．３＊，４５．９，４５．８＊＊，４５．３＊，４４．８＊＊，４２．１＊＊，４２．０＊，４１．３＊＊，４１．０＊，３０．２＊＊，２９．７＊，２８．３＊，２８．０＊＊，２５．３，２２．３（ｄ，１ＪＣＰ＝４９．８Ｈｚ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．２；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋７２２．２６６２．
化合物１０（０．１０ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）と３－（クロロメチル）ベンゾイル塩化物｛３－（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２５μＬ、１．０５ｅｑ．）｝をＣＨ２Ｃｌ２ １ｍＬに溶かした溶液に、ＤＩＥＡ（５８μＬ、２．０ｅｑ．）を添加した。常温で１時間撹拌した後、減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、白色固体形態の化合物１１を得た（０．１０ｇ、８５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主配座異性体）９．６５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６９７．８２（ｍ，１５Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４２７．４６（ｍ，１Ｈ），４．７４４．７９（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），３．３５３．７４（ｍ，１４Ｈ），２．５３２．６０（ｍ，２Ｈ），２．２５２．３０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（＊主配座異性体；＊＊副配座異性体）１７３．１＊＊，１７３．０＊，１７１．３＊，１７１．２＊＊，１６６．４，１６０．９，１３７．７，１３５．５，１３４．１，１３３．５（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．３Ｈｚ），１３１．７，１３０．６（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１２８．９，１２８．３＊，１２８．２＊＊，１２７．８＊，１２７．７＊＊，１１７．５（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．９Ｈｚ），１１４．５，５４．２，４６．３＊，４５．９，４５．８＊＊，４５．３＊，４４．８＊＊，４２．１＊＊，４２．０＊，４１．３＊＊，４１．０＊，３０．２＊＊，２９．７＊，２８．３＊，２８．０＊＊，２５．３，２２．３（ｄ，１ＪＣＰ＝４９．８Ｈｚ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．２；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋７２２．２６６２．
【0080】
ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｃｌ（化学式Ｖ）
化合物１１（０．１２ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）と１０－オキソ－２，３，５，６－テトラヒドロ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－オキソ－３ａ－アザベンゾ［ｄｅ］－アントラセン－９－カルボアルデヒド｛１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］－ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（４６ｍｇ、１．１ｅｑ．）｝をＤＭＦ１ｍに溶かした溶液に、クロロトリメチルシラン（ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ、６０μＬ、３．０ｅｑ．）を添加した後、１３０℃で５時間撹拌した。常温に冷却後、減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、赤色固体形態の化合物ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｃｌを得た（７９ｍｇ、５０％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主異性体）９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７２８．２１（ｍ，１８Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２７．４５（ｍ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），４．７４４．８０（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），３．５８３．７３（ｍ，１２Ｈ），３．３３３．３８（ｍ，４Ｈ），２．８３２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７２２．７８（ｍ，２Ｈ），２．５５２．５８（ｍ，２Ｈ），２．２７－２．３１（ｍ，２Ｈ），１．９７２．０４（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主異性体）１７２．９，１７１．１，１６６．２，１６３．９，１６１．３，１５２．５，１４９．０，１４５．９，１４２．８，１３７．６，１３５．４，１３４．０，１３３．４（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．３Ｈｚ），１３１．６，１３０．６（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１２８．８，１２８．２，１２７．７，１２７．５，１１９．９，１１７．４（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．９Ｈｚ），１１７．１，１０９．７，１０８．２，１０６．０，１００．４，５４．２，５０．４，４９．９，４５．９，４５．１（ｂｒ），４１．２（ｂｒ），３３．４，２９．９，２８．０，２７．２，２２．２（ｄ，１ＪＣＰ＝５０．０Ｈｚ），２０．９，１９．９，１９．８；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．２；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋９７３．３６１６．
化合物１１（０．１２ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）と１０－オキソ－２，３，５，６－テトラヒドロ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－オキソ－３ａ－アザベンゾ［ｄｅ］－アントラセン－９－カルボアルデヒド｛１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］－ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（４６ｍｇ、１．１ｅｑ．）｝をＤＭＦ１ｍに溶かした溶液に、クロロトリメチルシラン（ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ、６０μＬ、３．０ｅｑ．）を添加した後、１３０℃で５時間撹拌した。常温に冷却後、減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、赤色固体形態の化合物ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－Ｃｌを得た（７９ｍｇ、５０％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主異性体）９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７２８．２１（ｍ，１８Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２７．４５（ｍ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），４．７４４．８０（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），３．５８３．７３（ｍ，１２Ｈ），３．３３３．３８（ｍ，４Ｈ），２．８３２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７２２．７８（ｍ，２Ｈ），２．５５２．５８（ｍ，２Ｈ），２．２７－２．３１（ｍ，２Ｈ），１．９７２．０４（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝（主異性体）１７２．９，１７１．１，１６６．２，１６３．９，１６１．３，１５２．５，１４９．０，１４５．９，１４２．８，１３７．６，１３５．４，１３４．０，１３３．４（ｄ，３ＪＣＰ＝１０．３Ｈｚ），１３１．６，１３０．６（ｄ，２ＪＣＰ＝１２．７Ｈｚ），１２８．８，１２８．２，１２７．７，１２７．５，１１９．９，１１７．４（ｄ，１ＪＣＰ＝８５．９Ｈｚ），１１７．１，１０９．７，１０８．２，１０６．０，１００．４，５４．２，５０．４，４９．９，４５．９，４５．１（ｂｒ），４１．２（ｂｒ），３３．４，２９．９，２８．０，２７．２，２２．２（ｄ，１ＪＣＰ＝５０．０Ｈｚ），２０．９，１９．９，１９．８；３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝２２．２；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ］＋９７３．３６１６．
【0081】
製造例２．ゴルジ体の抗酸化能測定用化合物の合成
細胞小器官であるゴルジ体の抗酸化能の測定に用いる化合物（ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー；ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－Ａ／Ｂ／Ｃ）の製造方法は、下記の通りである。
細胞小器官であるゴルジ体の抗酸化能の測定に用いる化合物（ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー；ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－Ａ／Ｂ／Ｃ）の製造方法は、下記の通りである。
【化21】
【0082】
前記Ｒ４によるＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－Ａ／Ｂ／Ｃの区分は、下記表１の通りである。
【表1】
【0083】
ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー１～３の構造は、下記の通りである。
［ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー１、化学式ＶＩＩ］
［ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー２、化学式ＶＩＩＩ］
［ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー３、化学式ＩＸ］
［ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサー１、化学式ＶＩＩ］
【化22】
【化23】
【化24】
【0084】
化合物２
【化25】
【0085】
化合物１とシアノ酢酸（ｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、１．２当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ、ＨＯＢｔ；１．５当量）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン｛Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ；２．０当量）｝、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド｛１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣＩ；２．５当量）｝をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド｛Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）｝に溶かした溶液を、常温で１５～２０時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をエチル酢酸塩（ＥｔＯＡｃ）で希釈した後、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）飽和水溶液で洗浄した。有機層を分離した後、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物２を得た。
【0086】
化合物２Ａ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝６．７３（ｂｒ，１Ｈ），４．９６（ｂｒ，１Ｈ），３．５７－３．６９（ｍ，８Ｈ），３．５１（ｍ，２Ｈ），３．４１（ｓ，２Ｈ），３．３４（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝６．７３（ｂｒ，１Ｈ），４．９６（ｂｒ，１Ｈ），３．５７－３．６９（ｍ，８Ｈ），３．５１（ｍ，２Ｈ），３．４１（ｓ，２Ｈ），３．３４（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）．
【0087】
化合物２Ｂ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：ａ（ｐｐｍ）＝８．１９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｓ，２Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．３３－１．３９（ｍ，４Ｈ），１．２２－１．２４（ｍ，４Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：ａ（ｐｐｍ）＝８．１９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｓ，２Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．３３－１．３９（ｍ，４Ｈ），１．２２－１．２４（ｍ，４Ｈ）．
【0088】
化合物２Ｃ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝７．１８（ｂｒ，１Ｈ），４．９０（ｂｒ，１Ｈ），３．６２－３．６９（ｍ，８Ｈ），３．６０（ｍ，２Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝７．１８（ｂｒ，１Ｈ），４．９０（ｂｒ，１Ｈ），３．６２－３．６９（ｍ，８Ｈ），３．６０（ｍ，２Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
【0089】
化合物３
【化26】
【0090】
１０－オキソ－２，３，５，６－テトラヒドロ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－オキサ－３ａ－アザベンゾ［ｄｅ］アントラセン－９－カルボアルデヒド（１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）と化合物２（１．０当量）、そしてピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ、１．０当量）を２－プロパノールに溶かした溶液を、６０℃で２～４時間加熱した後、常温に冷却させた。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物３を得た。
【0091】
化合物３Ａ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６２（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｂｒ，１Ｈ），５．０８（ｂｒ，１Ｈ），３．６２－３．６５（ｍ，５Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．３４－３．３９（ｍ，６Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９６－２．００（ｍ，４Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６２（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｂｒ，１Ｈ），５．０８（ｂｒ，１Ｈ），３．６２－３．６５（ｍ，５Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．３４－３．３９（ｍ，６Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９６－２．００（ｍ，４Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
【0092】
化合物３Ｂ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６０（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．２２（ｂｒ，１Ｈ），４．５３（ｂｒ，１Ｈ），３．３５－３．４０（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９６－２．００（ｍ，４Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．４４－１．５０（ｍ，４Ｈ），１．３５－１．３８（ｍ，４Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６０（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．２２（ｂｒ，１Ｈ），４．５３（ｂｒ，１Ｈ），３．３５－３．４０（ｍ，６Ｈ），３．１１（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９６－２．００（ｍ，４Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．４４－１．５０（ｍ，４Ｈ），１．３５－１．３８（ｍ，４Ｈ）．
【0093】
化合物３Ｃ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６０（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｂｒ，１Ｈ），５．０１（ｂｒ，１Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．６３－３．６７（ｍ，６Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），３．５２－３．５６（ｍ，４Ｈ），３．３５－３．３９（ｍ，４Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９６－２．００（ｍ，４Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．６０（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｂｒ，１Ｈ），５．０１（ｂｒ，１Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．６３－３．６７（ｍ，６Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），３．５２－３．５６（ｍ，４Ｈ），３．３５－３．３９（ｍ，４Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９６－２．００（ｍ，４Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）．
【0094】
ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ
【化27】
【0095】
化合物３をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン｛ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）／ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ（１／１）｝溶液に溶かした後、常温で１～２時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物とインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、１．１当量）、ＨＯＢｔ（２．５当量）、ＤＩＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣＩ（２．５当量）をＤＭＦに溶かした溶液を、常温で７～８時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＥｔＯＡｃで希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去した。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨを得た。
【0096】
ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－Ａ（化学式ＶＩＩ）
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．５２（ｓ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６１－６．６３（ｍ，２Ｈ），６．３９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｓ，２Ｈ），３．４８－３．５５（ｍ，１０Ｈ），３．４４（ｍ，２Ｈ），３．３５－３．３９（ｍ，４Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．９５－１．９９（ｍ，４Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．５２（ｓ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６１－６．６３（ｍ，２Ｈ），６．３９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｓ，２Ｈ），３．４８－３．５５（ｍ，１０Ｈ），３．４４（ｍ，２Ｈ），３．３５－３．３９（ｍ，４Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．９５－１．９９（ｍ，４Ｈ）．
【0097】
ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－Ｂ（化学式ＶＩＩＩ）
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．５７（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄｄ，３Ｊ＝９．１Ｈｚ，４Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｓ，２Ｈ），３．２８－３．３９（ｍ，６Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），１．９５－２．００（ｍ，４Ｈ），１．５０（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｍ，２Ｈ），１．２２－１．３１（ｍ，４Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋７６９．２７７２．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．５７（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄｄ，３Ｊ＝９．１Ｈｚ，４Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｓ，２Ｈ），３．２８－３．３９（ｍ，６Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），１．９５－２．００（ｍ，４Ｈ），１．５０（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｍ，２Ｈ），１．２２－１．３１（ｍ，４Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋７６９．２７７２．
【0098】
ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－Ｃ（化学式ＩＸ）
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．５５（ｓ，１Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５７－３．６３（ｍ，８Ｈ），３．４２－３．５１（ｍ，８Ｈ），３．３１－３．３８（ｍ，６Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．９５－１．９９（ｍ，４Ｈ），１．８４（ｍ，２Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋９００．３３９０．
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ａ（ｐｐｍ）＝８．５５（ｓ，１Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５７－３．６３（ｍ，８Ｈ），３．４２－３．５１（ｍ，８Ｈ），３．３１－３．３８（ｍ，６Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），１．９５－１．９９（ｍ，４Ｈ），１．８４（ｍ，２Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋９００．３３９０．
【0099】
実施例１．実験材料および実験方法
１－１．試薬
ジアミド（ｄｉａｍｉｄｅ）、アンチマイシンＡ（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ）をそれぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５－ｃｅｒａｍｉｄｅをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
１－１．試薬
ジアミド（ｄｉａｍｉｄｅ）、アンチマイシンＡ（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ）をそれぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５－ｃｅｒａｍｉｄｅをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【0100】
１－２．ＦｒｅＳＨ－ｔｒａｃｅｒ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）化合物のチオール化合物とのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応
グルタチオン化合物（０～１００ｍＭ）とＦｒｅＳＨ－トレーサー化合物Ｖ（１０ｉｍ）が混合された緩衝溶液（リン酸塩１０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｈ２Ｏ：ＤＭＳＯ＝９８：２）を製造し、この溶液の時間によるＵＶ可視光線吸収スペクトルと蛍光放出スペクトルの変化をそれぞれシンコＳ－３１００とＨｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００分光光度計で測定した（図２参照）。
グルタチオン化合物（０～１００ｍＭ）とＦｒｅＳＨ－トレーサー化合物Ｖ（１０ｉｍ）が混合された緩衝溶液（リン酸塩１０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｈ２Ｏ：ＤＭＳＯ＝９８：２）を製造し、この溶液の時間によるＵＶ可視光線吸収スペクトルと蛍光放出スペクトルの変化をそれぞれシンコＳ－３１００とＨｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００分光光度計で測定した（図２参照）。
【0101】
１－３．チオール化合物のＫｄ値の測定
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によりグルタチオン（０～１００ｍＭ）とＦｒｅＳＨ－トレーサー派生化合物との間の化学平衡を形成した後、４３０ｎｍ波長の光で励起させた時に放出される蛍光放出スペクトルを測定した。最大放出波長（５８０ｎｍ）での蛍光強度とチオール化合物の濃度との間の相関関係を非線形回帰分析して、チオール化合物とＦｒｅＳＨ－トレーサーとの間の化学平衡定数（Ｋｄ）が１～５ｍＭを計算した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によりグルタチオン（０～１００ｍＭ）とＦｒｅＳＨ－トレーサー派生化合物との間の化学平衡を形成した後、４３０ｎｍ波長の光で励起させた時に放出される蛍光放出スペクトルを測定した。最大放出波長（５８０ｎｍ）での蛍光強度とチオール化合物の濃度との間の相関関係を非線形回帰分析して、チオール化合物とＦｒｅＳＨ－トレーサーとの間の化学平衡定数（Ｋｄ）が１～５ｍＭを計算した。
【0102】
１－４．細胞毒性試験（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
ＨｅＬａ細胞（５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに１８時間培養した後、ジメチルスルホキシ化物（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ（化学式ＩＩＩ～Ｖ）、またはＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ（化学式ＶＩＩ～ＩＸ）を２４時間処理した。ＰＢＳで洗浄後、メチルチアゾリルジフェニル－テトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ、Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液（５００ｉｇ／培養液ｍＬ）で３～４時間培養した。ＭＴＴ溶液除去後、ＤＭＳＯでホルマザンクリスタル（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）を溶かした後、５７０ｎｍで吸光度を測定した。ＬＤ５０（５０％Ｌｅｔｈａｌ Ｄｏｓｅ、半致死量）はＧｒａｐｈｐａｄ５．０ソフトウェアを用いて計算した（図３参照）。
ＨｅＬａ細胞（５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに１８時間培養した後、ジメチルスルホキシ化物（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ（化学式ＩＩＩ～Ｖ）、またはＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨｔｒａｃｅｒ（化学式ＶＩＩ～ＩＸ）を２４時間処理した。ＰＢＳで洗浄後、メチルチアゾリルジフェニル－テトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ、Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液（５００ｉｇ／培養液ｍＬ）で３～４時間培養した。ＭＴＴ溶液除去後、ＤＭＳＯでホルマザンクリスタル（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）を溶かした後、５７０ｎｍで吸光度を測定した。ＬＤ５０（５０％Ｌｅｔｈａｌ Ｄｏｓｅ、半致死量）はＧｒａｐｈｐａｄ５．０ソフトウェアを用いて計算した（図３参照）。
【0103】
１－５．生きている細胞のイメージング（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ）
ＨｅＬａ細胞を１０％熱－不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｉｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、および２ｍＭグルタミンを含み、フェノールレッドのないＤＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍカバーガラスボトムディッシュ（ＳＰＬ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分注した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で表示された時間の間培養した。蛍光顕微鏡分析の前に、１０ｉＭのＦｒｅＳＨ－トレーサー派生化合物を含む２ｍＬの培養培地を用いて、ＨｅＬａ細胞を０．５～１．５時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞のリアルタイムイメージをＮｉｋｏｎ Ａ１レーザスキャニング共焦点顕微鏡を用いて取得した。ＣＦＩプランアポクロマート６０Ｘ（Ｐｌａｎ ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６０Ｘ）および１．４０開口数（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｐｅｒｔｕｒｅ、ＮＡ）対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ逆相顕微鏡に装着されたチャンバ内で、３７℃および５％ＣＯ２条件で細胞を培養し、イメージング実験を進行させた。ＦｒｅＳＨ－トレーサー派生化合物を４０３ｎｍおよび４８８ｎｍレーザ線で励起させ、それぞれ５００～５５０ｎｍおよび５７０～６２０ｎｍバンド間隔のフィルタを通して蛍光を検出した。ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアを用いて実験データの分析と蛍光比率をイメージ化した（図４および図５）。
ＨｅＬａ細胞を１０％熱－不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｉｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、および２ｍＭグルタミンを含み、フェノールレッドのないＤＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍカバーガラスボトムディッシュ（ＳＰＬ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分注した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で表示された時間の間培養した。蛍光顕微鏡分析の前に、１０ｉＭのＦｒｅＳＨ－トレーサー派生化合物を含む２ｍＬの培養培地を用いて、ＨｅＬａ細胞を０．５～１．５時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞のリアルタイムイメージをＮｉｋｏｎ Ａ１レーザスキャニング共焦点顕微鏡を用いて取得した。ＣＦＩプランアポクロマート６０Ｘ（Ｐｌａｎ ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６０Ｘ）および１．４０開口数（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｐｅｒｔｕｒｅ、ＮＡ）対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ逆相顕微鏡に装着されたチャンバ内で、３７℃および５％ＣＯ２条件で細胞を培養し、イメージング実験を進行させた。ＦｒｅＳＨ－トレーサー派生化合物を４０３ｎｍおよび４８８ｎｍレーザ線で励起させ、それぞれ５００～５５０ｎｍおよび５７０～６２０ｎｍバンド間隔のフィルタを通して蛍光を検出した。ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアを用いて実験データの分析と蛍光比率をイメージ化した（図４および図５）。
【0104】
１－６．高速大量細胞のイメージ分析
ＨｅＬａ細胞を１０％熱－不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｉｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、および２ｍＭグルタミンを含み、フェノールレッドのないＤＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞をＧｒｅｉｎｅｒ ９６ｗｅｌｌディッシュ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に分注した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で表示された時間の間培養した。蛍光顕微鏡分析の前に、１０ｉＭのＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを含む培養培地を用いて、ＨｅＬａ細胞を０．５～１．５時間培養した。Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗った後、細胞のリアルタイムイメージをＯｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて得た。顕微鏡に装着されたチャンバ内で、３７℃および５％ＣＯ２条件で細胞を培養し、イメージング実験を進行させた。ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを４１０～４３０ｎｍおよび４９０～５１０ｎｍのＬＥＤで励起させ、それぞれ４６０～５４０ｎｍおよび５６０～６３０ｎｍバンド間隔のフィルタを通して蛍光を検出した。ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５ｃｅｒａｍｉｄｅは５６０～５８０ｎｍのＬＥＤで励起させ、５９０～６４０ｎｍバンド間隔のフィルタを通して蛍光を検出した。Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアを用いて実験データの分析を実施した（図４、図５、および図８参照）。
ＨｅＬａ細胞を１０％熱－不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｉｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、および２ｍＭグルタミンを含み、フェノールレッドのないＤＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞をＧｒｅｉｎｅｒ ９６ｗｅｌｌディッシュ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に分注した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で表示された時間の間培養した。蛍光顕微鏡分析の前に、１０ｉＭのＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを含む培養培地を用いて、ＨｅＬａ細胞を０．５～１．５時間培養した。Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗った後、細胞のリアルタイムイメージをＯｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて得た。顕微鏡に装着されたチャンバ内で、３７℃および５％ＣＯ２条件で細胞を培養し、イメージング実験を進行させた。ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを４１０～４３０ｎｍおよび４９０～５１０ｎｍのＬＥＤで励起させ、それぞれ４６０～５４０ｎｍおよび５６０～６３０ｎｍバンド間隔のフィルタを通して蛍光を検出した。ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５ｃｅｒａｍｉｄｅは５６０～５８０ｎｍのＬＥＤで励起させ、５９０～６４０ｎｍバンド間隔のフィルタを通して蛍光を検出した。Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェアを用いて実験データの分析を実施した（図４、図５、および図８参照）。
【0105】
実施例２．細胞小器官ミトコンドリアの抗酸化能の測定
２－１．ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（ｔｒａｃｅｒ）の比率計量的かつ可逆的にＧＳＨと速やかに反応する特性の観察
ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーにグルタチオンの濃度を増加させながら添加した場合、紫外線および可視光線に対する吸光度がｅｍａｘ＝４３０ｎｍで増加し、ｅｍａｘ＝５２０ｎｍでは減少し（図２Ｂ）、蛍光放出強度は約５１０ｎｍ（Ｆ５１０、ｅｅｘ＝４３０ｎｍ；ｅｅｍ＝５１０ｎｍ）で増加し、約５８０ｎｍ（Ｆ５８０、ｅｅｘ＝５２０ｎｍ；ｅｅｍ＝５８０ｎｍ）で減少した（Ｋｄ＝１．３ｍＭ；図２Ｂ、図２Ｃ）。本発明者らは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨトレーサーのＦ５１０とＦ５８０の蛍光放出強度比（Ｆ５１０／Ｆ５８０）が広いＧＳＨ濃度範囲で比例的に変化するという事実を確認した（図２Ｄ）。これは、前記センサが比率計量的センサとして利用可能であることを意味する。蛍光比から得られた回帰曲線は、細胞内に存在するグルタチオンの濃度より広い範囲（０～２０ｍＭ）で線形性（Ｒ２＝０．９８３６）を示した（図２Ｄ、ｉｎｓｅｒｔ）。
２－１．ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサー（ｔｒａｃｅｒ）の比率計量的かつ可逆的にＧＳＨと速やかに反応する特性の観察
ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーにグルタチオンの濃度を増加させながら添加した場合、紫外線および可視光線に対する吸光度がｅｍａｘ＝４３０ｎｍで増加し、ｅｍａｘ＝５２０ｎｍでは減少し（図２Ｂ）、蛍光放出強度は約５１０ｎｍ（Ｆ５１０、ｅｅｘ＝４３０ｎｍ；ｅｅｍ＝５１０ｎｍ）で増加し、約５８０ｎｍ（Ｆ５８０、ｅｅｘ＝５２０ｎｍ；ｅｅｍ＝５８０ｎｍ）で減少した（Ｋｄ＝１．３ｍＭ；図２Ｂ、図２Ｃ）。本発明者らは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨトレーサーのＦ５１０とＦ５８０の蛍光放出強度比（Ｆ５１０／Ｆ５８０）が広いＧＳＨ濃度範囲で比例的に変化するという事実を確認した（図２Ｄ）。これは、前記センサが比率計量的センサとして利用可能であることを意味する。蛍光比から得られた回帰曲線は、細胞内に存在するグルタチオンの濃度より広い範囲（０～２０ｍＭ）で線形性（Ｒ２＝０．９８３６）を示した（図２Ｄ、ｉｎｓｅｒｔ）。
【0106】
前記データは、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーが細胞内のグルタチオン量をモニタリングするための最適なセンサ特性を有することを示す。
【0107】
２－２．ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの比率計量的分析による生きている細胞におけるミトコンドリアのグルタチオン水準の変化の可視化
本発明者らは、生きている細胞のミトコンドリアにおけるグルタチオン水準の変化を研究するにあたり、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの適用の可能性を研究した。本発明者らは、最小２４時間毒性のない１０ｉＭ ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーを添加した培地でＨｅＬａ細胞を培養しながら、共焦点顕微鏡分析により測定された蛍光比を擬色（ｆａｌｓｅ ｃｏｌｏｒ）イメージとして典型的なミトコンドリア染色パターンを示すことを確認することができた（図４Ａ）。センサがミトコンドリア内のグルタチオンの酸化還元条件の変化に反応するかを究明するために、本発明者らは、細胞内のグルタチオンを酸化させるために、センサがローディングされた生細胞に０．５ｍＭジアミド（ＤＡ、Ｄｉａｍｉｄｅ）を処理した。培養培地にジアミドを添加すると、生細胞で即刻なセンサ反応が誘導されることを確認した（図４Ｂおよび４Ｃ）。生きている細胞のイメージから計算された当該センサの蛍光比はジアミド処理によって減少した（図４Ｂおよび４Ｃ）。
本発明者らは、生きている細胞のミトコンドリアにおけるグルタチオン水準の変化を研究するにあたり、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの適用の可能性を研究した。本発明者らは、最小２４時間毒性のない１０ｉＭ ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーを添加した培地でＨｅＬａ細胞を培養しながら、共焦点顕微鏡分析により測定された蛍光比を擬色（ｆａｌｓｅ ｃｏｌｏｒ）イメージとして典型的なミトコンドリア染色パターンを示すことを確認することができた（図４Ａ）。センサがミトコンドリア内のグルタチオンの酸化還元条件の変化に反応するかを究明するために、本発明者らは、細胞内のグルタチオンを酸化させるために、センサがローディングされた生細胞に０．５ｍＭジアミド（ＤＡ、Ｄｉａｍｉｄｅ）を処理した。培養培地にジアミドを添加すると、生細胞で即刻なセンサ反応が誘導されることを確認した（図４Ｂおよび４Ｃ）。生きている細胞のイメージから計算された当該センサの蛍光比はジアミド処理によって減少した（図４Ｂおよび４Ｃ）。
【0108】
この後、本発明者らは、ミトコンドリアで活性酸素が生成される条件でＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの蛍光変化を調べた。ミトコンドリアで電子伝達系を妨げて活性酸素の生成を増加させるアンチマイシンＡを７５分間処理した場合、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーの蛍光変化比がアンチマイシンＡ濃度依存的に減少することを確認した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【0109】
したがって、本発明者らは、前記実験結果により、ＭｉｔｏＦｒｅＳＨ－トレーサーが生細胞のミトコンドリア内のＧＳＨ量の変化をリアルタイムモニタリングするのに利用可能であることを立証した。
【0110】
実施例３．細胞小器官ゴルジ体の抗酸化能の測定
３－１．ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーの比率計量的分析による生きている細胞におけるグルタチオン水準の分析
本発明者らは、生きている細胞のゴルジ体におけるグルタチオン水準の変化を研究するにあたり、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーが細胞内で維持され適用可能か否かを研究した。ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを細胞培養液に添加後、細胞内の蛍光強度と蛍光比の変化を観察した。ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーとゴルジ体マーカーであるＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５－ｃｅｒａｍｉｄｅをローディングしたＨｅＬａ細胞において高速大量細胞のイメージ分析により測定された蛍光位置を確認して、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーのＦ５１０がＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５－ｃｅｒａｍｉｄｅ蛍光と大部分重なって現れることを確認して、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーがゴルジ体内に位置することを観察することができた（図７）。センサが細胞内のグルタチオンの酸化還元条件の変化に反応するかを究明するために、本発明者らは、センサがローディングされた生細胞に１ｍＭジアミドを処理して細胞内のグルタチオンを酸化させた。培養培地にジアミドを添加すると、生細胞でセンサ反応が誘導されることを確認した（図８Ａ）。生きている細胞のイメージから計算された当該センサの蛍光比はジアミド処理によって減少した（図８Ｂ）。次に、多様な濃度のジアミドを処理して分析した結果、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーの蛍光比がジアミド濃度依存的に減少することを確認することができた（図９）。したがって、本発明者らは、前記実験結果により、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーが生細胞のゴルジ体内のグルタチオン量の変化をリアルタイムモニタリングするのに利用可能であることを立証した。
３－１．ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーの比率計量的分析による生きている細胞におけるグルタチオン水準の分析
本発明者らは、生きている細胞のゴルジ体におけるグルタチオン水準の変化を研究するにあたり、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーが細胞内で維持され適用可能か否かを研究した。ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーを細胞培養液に添加後、細胞内の蛍光強度と蛍光比の変化を観察した。ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーとゴルジ体マーカーであるＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５－ｃｅｒａｍｉｄｅをローディングしたＨｅＬａ細胞において高速大量細胞のイメージ分析により測定された蛍光位置を確認して、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーのＦ５１０がＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃ５－ｃｅｒａｍｉｄｅ蛍光と大部分重なって現れることを確認して、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーがゴルジ体内に位置することを観察することができた（図７）。センサが細胞内のグルタチオンの酸化還元条件の変化に反応するかを究明するために、本発明者らは、センサがローディングされた生細胞に１ｍＭジアミドを処理して細胞内のグルタチオンを酸化させた。培養培地にジアミドを添加すると、生細胞でセンサ反応が誘導されることを確認した（図８Ａ）。生きている細胞のイメージから計算された当該センサの蛍光比はジアミド処理によって減少した（図８Ｂ）。次に、多様な濃度のジアミドを処理して分析した結果、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーの蛍光比がジアミド濃度依存的に減少することを確認することができた（図９）。したがって、本発明者らは、前記実験結果により、ＧｏｌｇｉＦｒｅＳＨ－トレーサーが生細胞のゴルジ体内のグルタチオン量の変化をリアルタイムモニタリングするのに利用可能であることを立証した。
【0111】
本発明に係る化合物または組成物を用いて、生きている細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）内小器官であるミトコンドリアおよびゴルジ体の抗酸化能を測定することができる。これを幹細胞に適用して、幹細胞における抗酸化能の測定結果によって高活性の幹細胞を選別して細胞治療剤の効率性を増大させることができる。
【0112】
本明細書で引用したすべての参照文献、記事、公報および特許および特許出願が完全に本明細書に参照として組み込まれている。したがって、下記の請求の範囲の真義および範疇は上記の好ましい実施形態の説明に制限されてはならない。
【産業上の利用可能性】
【0113】
本発明に係る化合物を含む組成物を用いて生細胞、特に、幹細胞内小器官であるミトコンドリアまたはゴルジ体の抗酸化能を測定することができ、細胞小器官の抗酸化能の測定結果によって高活性の幹細胞を選別することができる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
