特許7169503IP Force 特許公報全文掲載

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ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「ナイアシン類」と総称する場合がある）、及び抗酸化剤を含む哺乳動物細胞の保存液や、該保存液を調製するための粉末製剤や、該保存液を用いた哺乳動物細胞の保存方法

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明の課題は、従来の保存液よりも保存性に優れ、哺乳動物細胞を長期間保存できる、新規保存液を提供することにある。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明者らは、課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、（１）アスコルビン酸（以下、「ビタミンＣ」又は「ＶＣ」と称する場合がある）を添加した等張液中で血小板を振盪保存すると、従来の血小板保存液よりも血小板の劣化が抑制されること、（２）ナイアシン（以下、「ビタミンＢ３」又は「ＶＢ３」と称する場合がある）をＶＣと組み合わせて等張液に添加すると、血小板の劣化がより効率的に抑制されること、（３）ＶＣ・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明によれば、従来の保存液と比べ、保存中の哺乳動物細胞における機能や生存率の低下を効率的に抑制することができる。このため、本発明によれば、血小板等の凍結保存が困難な哺乳動物細胞を長期間保存することが可能となり、医療における良質な移植用細胞含有液を提供することができる。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 本願実施例において使用されたｉＰＳ細胞由来血小板の濃縮システムを示す模式図である。
【図2】 ５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「２．５％ＨＳＡ ＢＲＳ ２０％ＡＣＤ－Ａ」及び「２．５％ＨＳＡ ＢＲＳ １０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）」は従来の保存液を、「ＶＣ製剤添加１０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）（３００ｍｇ／Ｌ）」、「ＶＣ製剤添加１０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）（１０００ｍｇ／Ｌ）」、及び「ＶＣ製剤添加１０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）（３０００ｍｇ／Ｌ）」は、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図3】 ５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第１世代＋ＶＣ，ＶＢ３（＝第２世代）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図4】 ５日間保存後の血小板の乳酸産生に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第１世代＋ＶＣ，ＶＢ３（＝第２世代）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図5】 ５日間保存後の血小板の回収率に及ぼす、ＶＣ及び／又はＶＢ３（ニコチン酸）添加保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「＋ＶＣ，ＶＢ３Ｍ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図6】 ５又は１０日間保存後の血小板サンプルの乳酸濃度及びｐＨに及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第２世代（第１世代＋ＶＣ＋ＶＢ３）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図7】 ５又は１０日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第２世代（第１世代＋ＶＣ＋ＶＢ３）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図8】 ５又は１０日間保存後の血小板サンプル中の血小板回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第２世代（第１世代＋ＶＣ＋ＶＢ３）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。また、図中、「ｐｌｔ／ｍＬ」はサンプル中の血小板濃度を、「％」は血小板回収率をそれぞれ示す。
【図9】 ５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＴＲＡＰ－６を用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図10】 ５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＣｏｌｌａｇｅｎを用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図11】 ５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＡＤＰを用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図12】 ５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＣｏｌｌａｇｅｎ／ＡＤＰを用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図13】 ５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第２世代（ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を、「第２世代（ニコチンアミド（４００ｍｇ／Ｌ）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチンアミドを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図14】 ５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では、添加剤を含まないＶＣ試薬を使用した。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代ＶＣ試薬」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図15】 ５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液及び既知保存液の影響を比較した結果を示す図である。図中、「新規血小板保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を、「日赤血小板保存液」はＡＣＤ－Ａ液及び重炭酸リンゲル液を約１対２０で混和した保存液をそれぞれ示す。
【図16】 本発明の保存液を用いて調製された血小板サンプルによる止血効果を示す図である。図中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は本発明の保存液のみ（血小板を含まない）を投与されたマウスを、「Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ」は本発明の保存液を用いて調製された血小板サンプルを投与されたマウスをそれぞれ示す。
【図17】 間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「＋溶媒」とはＣＳＰ－０１溶液に水を添加した保存液を、「＋ＶＣ＋ニコチン酸」とはＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図18】 巨核球のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第２世代」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図19】 ４８時間保存後のＴ細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。
【図20】 ２４又は４８時間保存後のＴ細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。
【図21】 血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率に及ぼすＶＢ２の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン」はＶＢ２を含む９種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン（ＶＢ２除く）」はＶＢ２を含まない８種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図22】 血小板の無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、ＶＢ２の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン」はＶＢ２を含む９種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン（ＶＢ２除く）」はＶＢ２を含まない８種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図23】 間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「＋溶媒」とはＣＳＰ－０１溶液に水を添加した保存液を、「＋ＶＣ＋ニコチン酸」とはＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図24】 間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液を、「乳酸リンゲル液＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、乳酸リンゲル液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図25】 間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液を、「ＣＳＰ－０１＋ＶＣ」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加した本発明の保存液を、「ＣＳＰ－０１＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図26】 幼若ブタ骨髄間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「無添加」とはＣＳＰ－０１溶液を示し、「＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液を示す。
【図27】 Ｔ細胞の生存率に及ぼす本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「Ｐｒｅ」とは、保存開始前のＴ細胞の生存率を示す。また、図中、「ＬＲ」とは乳酸リンゲル液を示し、さらに、「ＧＬＣ」は８０ｍｇ／ｄＬのグルコースを、「ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを、ニコチン酸は４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸をそれぞれ示す。
【図28】 Ｔ細胞生細胞回収率に及ぼす本発明の保存液の影響を示す図である。また、図中、「ＬＲ」とは乳酸リンゲル液を示す。さらに、「ＧＬＣ」は８０ｍｇ／ｄＬのグルコースを、「ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを、「ニコチン酸」は４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸をそれぞれ示す。

代表図 図1本件の代表的な図

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