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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-02
(45)【発行日】2022-11-11
(54)【発明の名称】哺乳動物細胞の保存液
(51)【国際特許分類】
C12N 1/04 20060101AFI20221104BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20221104BHJP
【ＦＩ】
C12N1/04
C12N5/078
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021507298
(86)(22)【出願日】2020-03-13
(86)【国際出願番号】 JP2020011002
(87)【国際公開番号】W WO2020189538
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2021-03-05
(31)【優先権主張番号】P 2019047852
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】515062289
【氏名又は名称】株式会社メガカリオン
(73)【特許権者】
【識別番号】000149435
【氏名又は名称】株式会社大塚製薬工場
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(72)【発明者】
【氏名】富塚 順子
(72)【発明者】
【氏名】重盛 智大
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 奈月
(72)【発明者】
【氏名】竹縄 太一
(72)【発明者】
【氏名】白川 智景
(72)【発明者】
【氏名】西村 益浩
(72)【発明者】
【氏名】藤田 泰毅
(72)【発明者】
【氏名】澤本 修
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０９７２２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５３８８５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０６５２８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５１６９５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２０５９２３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５１５０９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／２０８０５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】比嘉幸恵他, 水溶性ビタミン剤添加による保存ＰＣの血小板機能への影響 ビタミンＣの影響について，日本輸血学会雑誌, 2002, Vol.48, No.1, p.48, No.16
【文献】岡田英俊 ほか, 血小板の人工保存液におけるアルブミンの存在意義について，血液事業, 1988, 増刊号, 第12回日本血液事業学会総会 抄録集, p.109, 一般演題 149，1988年
【文献】British Journal of Haematology, 2006, Vol.135, pp.554-566
【文献】Experimental Cell Research, 2018, Vol.370, pp.409-416
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
等張液中に、クエン酸塩、クエン酸水和物、及びグルコースを含む血液保存液と、アルブミンと、３０～１５００ｍｇ／Ｌのナイアシン又はその塩と、３０～４０００ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸又はその塩とを含み、ビタミンＢ２又はその塩を含まない、血小板又は巨核球を、２０～２４℃で、１～１５日間保存するための、保存液。
【請求項2】
ナイアシン又はその塩の濃度が、１２０～１２００ｍｇ／Ｌである、請求項１に記載の保存液。
【請求項3】
アスコルビン酸又はその塩の濃度が、３００～３０００ｍｇ／Ｌである、請求項１又は２に記載の保存液。
【請求項4】
血小板が、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法により得られた精製血小板である、請求項１～３のいずれかに記載の保存液。（Ａ）巨核球の培養物を濃縮する濃縮工程；
（Ｂ）得られた濃縮物から血小板を遠心分離する遠心分離工程；
【請求項5】
アルブミンの濃度が、１．２５～１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１～４のいずれかに記載の保存液。
【請求項6】
血小板又は巨核球を、５～１０日間保存するための、請求項１～５のいずれかに記載の保存液。
【請求項7】
等張液中に、クエン酸塩、クエン酸水和物、及びグルコースを含む血液保存液と、アルブミンと、３０～１５００ｍｇ／Ｌのナイアシン又はその塩と、３０～４０００ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸又はその塩とを含み、ビタミンＢ２又はその塩を含まない液中で、２０～２４℃で、１～１５日間血小板又は巨核球を保存する工程を含む、血小板又は巨核球の保存方法。
【請求項8】
ナイアシン又はその塩の濃度が、１２０～１２００ｍｇ／Ｌである、請求項７に記載の保存方法。
【請求項9】
アスコルビン酸又はその塩の濃度が、３００～３０００ｍｇ／Ｌである、請求項７又は８に記載の保存方法。
【請求項10】
血小板が、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法により得られた精製血小板である、請求項７～９のいずれかに記載の保存方法。（Ａ）巨核球の培養物を濃縮する濃縮工程；
（Ｂ）得られた濃縮物から血小板を遠心分離する遠心分離工程；
【請求項11】
アルブミンの濃度が、１．２５～１０％（ｗ／ｖ）である、請求項７～１０のいずれかに記載の保存方法。
【請求項12】
血小板又は巨核球を、５～１０日間保存するための、請求項７～１１のいずれかに記載の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「ナイアシン類」と総称する場合がある）、及び抗酸化剤を含む哺乳動物細胞の保存液や、該保存液を調製するための粉末製剤や、該保存液を用いた哺乳動物細胞の保存方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血小板製剤は、手術や創傷による出血時の他、血小板の減少を伴う患者に対して投与される。現在、血小板製剤は献血により得られた血液から製造されているが、人口構成の変化に伴って献血量が低減し、血小板製剤が不足することが懸念されている。
【0003】
また、献血の提供者が細菌等の感染症に罹患している場合、血液が細菌汚染されている可能性があるため、細菌汚染された血小板製剤の投与による感染症のリスクがある。このため、インビトロで血小板を製造する方法が開発され（非特許文献１）、安定的な大量生産のための様々な技術が確立されてきている（特許文献１及び２）。
【0004】
血小板製剤は、血小板を適切な保存液に混合して血液バッグ等に充填することによって製造される。血小板の形態及び機能は低温によって急激に変化することから、血小板製剤は室温（２０～２４℃）で振盪保存して使用される。しかし、保存中に血小板の機能低下などの種々の問題が起こることが知られており、長期間の保存は不可能であった。このため、血小板の機能低下を防ぎ、血小板製剤の保存期間の延長を可能にする保存液の開発が求められている。
【0005】
また、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織などに存在する体性幹細胞であり、骨、軟骨及び脂肪などに分化する能力を有する。このため、間葉系幹細胞は、移植治療における有望な細胞ソースとして注目されており、培養及び保存方法の開発が進められている（特許文献３及び４）。さらに最近、Ｔ細胞を利用した様々ながん免疫治療が開発され、臨床試験が行われている（非特許文献２）。しかし、Ｔ細胞を凍結保存すると、Ｔ細胞膜上のＰＤ－１（免疫チェックポイント分子）の発現が顕著に低下することが報告されており（非特許文献３）、Ｔ細胞の非凍結保存方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】ＷＯ２０１７／０７７９６４
【文献】ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３４６６７
【文献】ＷＯ２０１７／０７３６５６
【文献】特開２０１８－１５３１９６
【0007】
【文献】Takayama et. al., 2008, Blood, 111: 5298-5306
【文献】Tyler et. al.,2013, Blood, 121: 308-317
【文献】Campbell et. al., 2009, Clin vaccine immunol, 16: 1648-53
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題は、従来の保存液よりも保存性に優れ、哺乳動物細胞を長期間保存できる、新規保存液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、（１）アスコルビン酸（以下、「ビタミンＣ」又は「ＶＣ」と称する場合がある）を添加した等張液中で血小板を振盪保存すると、従来の血小板保存液よりも血小板の劣化が抑制されること、（２）ナイアシン（以下、「ビタミンＢ３」又は「ＶＢ３」と称する場合がある）をＶＣと組み合わせて等張液に添加すると、血小板の劣化がより効率的に抑制されること、（３）ＶＣ及びＶＢ３を添加した等張液が、間葉系幹細胞、巨核球、Ｔ細胞等の他の哺乳動物細胞の非凍結保存にも有効であること、（４）上記のようなＶＣ及びＶＢ３による細胞保存効果がリボフラビン（ビタミンＢ２、以下「ＶＢ２」と称する場合がある）によって阻害されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は、（１）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩、及び抗酸化剤を含む、哺乳動物細胞の保存液や、（２）抗酸化剤が、アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩である、上記（１）に記載の保存液や、（３）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、１～１００００ｍｇ／Ｌである、上記（１）又は（２）に記載の保存液や、（４）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、３０～３０００ｍｇ／Ｌである、上記（１）又は（２）に記載の保存液や、（５）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、１２０～１２００ｍｇ／Ｌである、上記（１）又は（２）に記載の保存液や、（６）アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、１～１００００ｍｇ／Ｌである、上記（２）～（５）のいずれか１項に記載の保存液や、（７）アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、３０～６０００ｍｇ／Ｌである、上記（２）～（５）のいずれか１項に記載の保存液や、（８）アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、３００～３０００ｍｇ／Ｌである、上記（２）～（５）のいずれか１項に記載の保存液や、（９）哺乳動物細胞を０～４０℃で保存するための、上記（１）～（８）のいずれか１項に記載の保存液や、（１０）ビタミンＢ２若しくはその誘導体又はそれらの塩を含まない、上記（１）～（９）のいずれか１項に記載の保存液に関する。
【0011】
また、本発明は、（１１）哺乳動物細胞が、血小板又は巨核球である、上記（１）～（１０）のいずれか１項に記載の保存液や、（１２）血小板が、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法により得られた精製血小板である、上記（１１）に記載の保存液や、（Ａ）巨核球の培養物を濃縮する濃縮工程；（Ｂ）得られた濃縮物から血小板を遠心分離する遠心分離工程；（１３）さらにアルブミンを含む、上記（１１）又は（１２）に記載の保存液や、（１４）アルブミンの濃度が、１．２５～１０％（ｗ／ｖ）である、上記（１３）に記載の保存液や、（１５）さらに糖を含む、上記（１３）又は（１４）に記載の保存液や、（１６）糖が、ブドウ糖である、上記（１５）に記載の保存液や、（１７）血小板又は巨核球を、５～１０日間保存するための、上記（１１）～（１６）のいずれか１項に記載の保存液に関する。
【0012】
さらに、本発明は、（１８）哺乳動物細胞が、幹細胞又は免疫細胞である、上記（１）～（１０）のいずれか１項に記載の保存液や、（１９）幹細胞が、間葉系幹細胞である、上記（１８）に記載の保存液や、（２０）免疫細胞が、Ｔ細胞である、上記（１８）に記載の保存液や、（２１）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩、及び抗酸化剤を等張液中に含む、上記（１８）～（２０）のいずれか１項に記載の保存液や、（２２）等張液が、乳酸リンゲル液である、上記（２１）に記載の保存液や、（２３）さらにトレハロースを含む、上記（２１）又は（２２）に記載の保存液や、（２４）さらにデキストランを含む、上記（２１）～（２３）のいずれか１項に記載の保存液や、（２５）幹細胞を、１～６３日間保存するための、上記（１８）～（２４）のいずれか１項に記載の保存液や、（２６）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩、及び抗酸化剤を含む、上記（１）～（２５）のいずれか１項に記載の保存液を調製するための粉末製剤に関する。
【0013】
また、本発明は、（２７）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩、及び抗酸化剤を含む液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法や、（２８）抗酸化剤が、アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩である、上記（２７）に記載の方法や、（２９）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、１～１００００ｍｇ／Ｌである、上記（２７）又は（２８）に記載の方法や、（３０）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、３０～３０００ｍｇ／Ｌである、上記（２７）又は（２８）に記載の方法や、（３１）ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、１２０～１２００ｍｇ／Ｌである、上記（２７）又は（２８）に記載の方法や、（３２）アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、１～１００００ｍｇ／Ｌである、上記（２８）～（３１）のいずれか１項に記載の方法や、（３３）アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、３０～６０００ｍｇ／Ｌである、上記（２８）～（３１）のいずれか１項に記載の方法や、（３４）アスコルビン酸若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が、３００～３０００ｍｇ／Ｌである、上記（２８）～（３１）のいずれか１項に記載の方法や、（３５）哺乳動物細胞を０～４０℃で保存することを特徴とする、上記（２７）～（３４）のいずれか１項に記載の方法や、（３６）液が、ビタミンＢ２若しくはその誘導体又はそれらの塩を含まないことを特徴とする、上記（２７）～（３５）のいずれか１項に記載の方法に関する。
【0014】
さらに、本発明は、（３７）哺乳動物細胞が、血小板又は巨核球である、上記（２７）～（３６）のいずれか１項に記載の方法や、（３８）血小板が、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法により得られた精製血小板である、上記（３７）に記載の方法や、（Ａ）巨核球の培養物を濃縮する濃縮工程；（Ｂ）得られた濃縮物から血小板を遠心分離する遠心分離工程；（３９）液中にさらにアルブミンを含む、上記（３７）又は（３８）に記載の方法や、（４０）アルブミンの濃度が、１．２５～１０％（ｗ／ｖ）である、上記（３９）に記載の方法や、（４１）液中にさらに糖を含む、上記（３９）又は（４０）に記載の方法や、（４２）糖が、ブドウ糖である、上記（４１）に記載の方法や、（４３）血小板又は巨核球を、５～１０日間保存することを特徴とする、上記（３７）～（４２）のいずれか１項に記載の方法や、（４４）哺乳動物細胞が、幹細胞又は免疫細胞である、上記（２７）～（３６）のいずれか１項に記載の方法や、（４５）幹細胞が、間葉系幹細胞である、上記（４４）に記載の方法や、（４６）免疫細胞が、Ｔ細胞である、上記（４４）に記載の方法や、（４７）液が、等張液である、上記（４４）～（４６）のいずれか１項に記載の方法や、（４８）等張液が、乳酸リンゲル液である、上記（４７）に記載の方法や、（４９）液中にさらにトレハロースを含む、上記（４７）又は（４８）に記載の方法や、（５０）液中にさらにデキストランを含む、上記（４７）～（４９）のいずれか１項に記載の方法や、（５１）幹細胞を、１～６３日間保存することを特徴とする、上記（４４）～（５０）のいずれか１項に記載の方法に関する。また、本発明の他の態様としては、ｉ）哺乳動物細胞の保存に用いるための、ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩、及び抗酸化剤や、ii）哺乳動物細胞の保存液の調製に用いるための、ナイアシン若しくはその誘導体又はそれらの塩、及び抗酸化剤の使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、従来の保存液と比べ、保存中の哺乳動物細胞における機能や生存率の低下を効率的に抑制することができる。このため、本発明によれば、血小板等の凍結保存が困難な哺乳動物細胞を長期間保存することが可能となり、医療における良質な移植用細胞含有液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本願実施例において使用されたｉＰＳ細胞由来血小板の濃縮システムを示す模式図である。
【図2】５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「２．５％ＨＳＡ ＢＲＳ ２０％ＡＣＤ－Ａ」及び「２．５％ＨＳＡ ＢＲＳ １０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）」は従来の保存液を、「ＶＣ製剤添加１０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）（３００ｍｇ／Ｌ）」、「ＶＣ製剤添加１０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）（１０００ｍｇ／Ｌ）」、及び「ＶＣ製剤添加１０％ＡＣＤ－Ａ（ＧＬＵ）（３０００ｍｇ／Ｌ）」は、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図3】５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第１世代＋ＶＣ，ＶＢ３（＝第２世代）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図4】５日間保存後の血小板の乳酸産生に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第１世代＋ＶＣ，ＶＢ３（＝第２世代）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図5】５日間保存後の血小板の回収率に及ぼす、ＶＣ及び／又はＶＢ３（ニコチン酸）添加保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「＋ＶＣ，ＶＢ３Ｍ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図6】５又は１０日間保存後の血小板サンプルの乳酸濃度及びｐＨに及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第２世代（第１世代＋ＶＣ＋ＶＢ３）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図7】５又は１０日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第２世代（第１世代＋ＶＣ＋ＶＢ３）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図8】５又は１０日間保存後の血小板サンプル中の血小板回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液を、「第２世代（第１世代＋ＶＣ＋ＶＢ３）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。また、図中、「ｐｌｔ／ｍＬ」はサンプル中の血小板濃度を、「％」は血小板回収率をそれぞれ示す。
【図9】５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＴＲＡＰ－６を用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図10】５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＣｏｌｌａｇｅｎを用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図11】５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＡＤＰを用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図12】５又は１０日間保存後の血小板の凝集能に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では刺激剤としてＣｏｌｌａｇｅｎ／ＡＤＰを用いた。図中、「新規保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣと４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を示す。
【図13】５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第２世代（ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を、「第２世代（ニコチンアミド（４００ｍｇ／Ｌ）」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチンアミドを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図14】５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。この実験では、添加剤を含まないＶＣ試薬を使用した。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代ＶＣ試薬」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図15】５日間保存後の血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率、無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、本発明の保存液及び既知保存液の影響を比較した結果を示す図である。図中、「新規血小板保存液」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液を、「日赤血小板保存液」はＡＣＤ－Ａ液及び重炭酸リンゲル液を約１対２０で混和した保存液をそれぞれ示す。
【図16】本発明の保存液を用いて調製された血小板サンプルによる止血効果を示す図である。図中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は本発明の保存液のみ（血小板を含まない）を投与されたマウスを、「Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ」は本発明の保存液を用いて調製された血小板サンプルを投与されたマウスをそれぞれ示す。
【図17】間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「＋溶媒」とはＣＳＰ－０１溶液に水を添加した保存液を、「＋ＶＣ＋ニコチン酸」とはＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図18】巨核球のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第２世代」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図19】４８時間保存後のＴ細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。
【図20】２４又は４８時間保存後のＴ細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。
【図21】血小板のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率に及ぼすＶＢ２の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン」はＶＢ２を含む９種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン（ＶＢ２除く）」はＶＢ２を含まない８種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図22】血小板の無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす、ＶＢ２の影響を示す図である。図中、「第１世代」は従来の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン」はＶＢ２を含む９種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液を、「第１世代＋水溶性ビタミン（ＶＢ２除く）」はＶＢ２を含まない８種の水溶性ビタミンを含む本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図23】間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「＋溶媒」とはＣＳＰ－０１溶液に水を添加した保存液を、「＋ＶＣ＋ニコチン酸」とはＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図24】間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液を、「乳酸リンゲル液＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、乳酸リンゲル液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図25】間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液を、「ＣＳＰ－０１＋ＶＣ」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加した本発明の保存液を、「ＣＳＰ－０１＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液をそれぞれ示す。
【図26】幼若ブタ骨髄間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率に及ぼす、本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「無添加」とはＣＳＰ－０１溶液を示し、「＋ＶＣ＋ニコチン酸」とは、ＣＳＰ－０１溶液に１０００ｍｇ／ＬのＶＣ及び４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を添加した本発明の保存液を示す。
【図27】Ｔ細胞の生存率に及ぼす本発明の保存液の影響を示す図である。図中、「Ｐｒｅ」とは、保存開始前のＴ細胞の生存率を示す。また、図中、「ＬＲ」とは乳酸リンゲル液を示し、さらに、「ＧＬＣ」は８０ｍｇ／ｄＬのグルコースを、「ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを、ニコチン酸は４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸をそれぞれ示す。
【図28】Ｔ細胞生細胞回収率に及ぼす本発明の保存液の影響を示す図である。また、図中、「ＬＲ」とは乳酸リンゲル液を示す。さらに、「ＧＬＣ」は８０ｍｇ／ｄＬのグルコースを、「ＶＣ」は１０００ｍｇ／ＬのＶＣを、「ニコチン酸」は４００ｍｇ／Ｌのニコチン酸をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の哺乳動物細胞の保存液（以下、「本発明の保存液」と称する場合がある）は、ナイアシン類及び／又は抗酸化剤を含むものであって、「哺乳動物細胞の保存」という用途に限定されたものであれば特に制限されない。また、本発明の粉末製剤としては、本発明の保存液を調製するためのものであれば特に制限されず、さらに、本発明の哺乳動物細胞の保存方法としては、本発明の保存液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含むものであれば特に制限されない。ここで「哺乳動物細胞の保存」とは、対象となる哺乳動物細胞の（ｉ）生存を維持すること、（ii）劣化を抑制すること、（iii）所望の機能を維持すること、及び／又は、（iv）分化若しくは増殖を抑制することを意味する。すなわち、本発明の保存液とは、哺乳動物細胞と混合した場合に上記保存効果を奏する溶液を意味し、本発明の保存液には、保存対象細胞を未だ含まない保存液の態様の他、保存対象細胞を既に含む保存液の態様も包含される。また、本発明の保存液は、哺乳動物細胞の保存のための有効成分として、ナイアシン類を単独で含むものであっても、抗酸化剤を単独で含むものであってもよいが、ナイアシン類と抗酸化剤とを組み合わせて含むものであることが好ましい。以下、ナイアシン類及び／又は抗酸化剤を「本発明の必須保護成分」という場合がある。さらに、本発明の保存液又は粉末製剤を調製するための添加剤もまた本発明に含まれる。本発明の添加剤としては、本発明の必須保護成分を必ず含む。本発明の添加剤には、後述する「任意の有効成分」は含まなくてもよい。
【0018】
上記「ナイアシン類」におけるナイアシン（ＶＢ３）とは、ニコチン酸及び／又はニコチンアミドを意味する。すなわち、上記本発明の保存液は、ニコチン酸を含む保存液、ニコチンアミドを含む保存液、及び、ニコチン酸及びニコチンアミドを含む保存液のいずれであってもよいが、ニコチン酸を含む保存液であることが好ましい。また、ナイアシン（ＶＢ３）は、化学合成等による既知方法により製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、ニコチン酸注射製剤（トーアエイヨー社製）、ニコチンアミド（富士フイルム和光純薬社製）等の市販品を挙げることができる。
【0019】
上記「ナイアシン類」におけるナイアシン誘導体としては、特に制限されないが、例えば、トコフェロールニコチン酸エステル、ニセリトロール、ニコモール、イノシトールヘキサニコチン酸エステル、２－クロロニコチンアミド、６－メチルニコチンアミド、６－アミノニコチンアミド、Ｎ－メチルニコチンアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルニコチンアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）ニコチンアミド、キノリン酸イミド、ニコチンアニリド、Ｎ－ベンジルニコチンアミド、Ｎ－エチルニコチンアミド、ニフェナゾン、ニコチンアルデヒド、イソニコチン酸、メチルイソニコチン酸、チオニコチンアミド、ニアラミド、２－メルカプトニコチン酸、ニアプラジン、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ナトリウム等を好適に挙げることができる。さらに、上記「ナイアシン類」における「ナイアシン又はその誘導体の塩」としては、特に制限されないが、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩アンモニウム塩、トリアルキルアミン塩等の有機塩基塩、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩等の有機酸塩等を好適に挙げることができる。
【0020】
また、上記「抗酸化剤」としては、特に制限されないが、例えば、アスコルビン酸（ＶＣ）、スーパーオキシドジスムターゼ１、スーパーオキシドジスムターゼ２、スーパーオキシドジスムターゼ３、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンＥ、尿酸等、それらの誘導体、又はそれらの塩を好適に挙げることができ、中でも、アスコルビン酸（ＶＣ）若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「アスコルビン酸類」と総称する場合がある）を好適に挙げることができ、アスコルビン酸（ＶＣ）を特に好適に挙げることができる。アスコルビン酸（ＶＣ）は、化学合成等による既知方法により製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、アスコルビン酸注射液（沢井製薬社製）、Ｌ（＋）－アスコルビン酸標準品（富士フイルム和光純薬社製）等の市販品を挙げることができる。
【0021】
上記「アスコルビン酸類」におけるアスコルビン酸（ＶＣ）の誘導体としては、特に制限されないが、例えば、アスコルビン酸２－リン酸、アスコルビン酸２－硫酸、アスコルビル－２－グルコシド、アスコルビル－６－グルコシド等を好適に挙げることができる。さらに、上記「アスコルビン酸類」におけるアスコルビン酸（ＶＣ）又はその誘導体の塩としては、特に制限されないが、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩アンモニウム塩、トリアルキルアミン塩等の有機塩基塩、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩等の有機酸塩等を好適に挙げることができる。
【0022】
本発明の保存液に含まれるナイアシン類の濃度としては、例えばニコチン酸換算で、１～１００００ｍｇ／Ｌの範囲内であればよく、具体的には、１０～５０００ｍｇ／Ｌ、２０～８０００ｍｇ／Ｌ、３０～６０００ｍｇ／Ｌ、３０～４０００ｍｇ／Ｌ、３０～３０００ｍｇ／Ｌ、３０～２０００ｍｇ／Ｌ、３０～１５００ｍｇ／Ｌ、３０～１２００ｍｇ／Ｌを例として挙げることができるが、中でも、１２０～１２００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましい。
【0023】
本発明の保存液に含まれる、アスコルビン酸類の濃度としては、例えばアスコルビン酸換算で、１～１００００ｍｇ／Ｌの範囲内であればよく、例えば、１０～８０００ｍｇ／Ｌ、２０～７０００ｍｇ／Ｌ、３０～６０００ｍｇ／Ｌ、３０～５０００ｍｇ／Ｌ、３０～４０００ｍｇ／Ｌ、３０～３０００ｍｇ／Ｌ、５０～３０００ｍｇ／Ｌ、１００～３０００ｍｇ／Ｌ、を挙げることができるが、中でも、３００～３０００ｍｇ／Ｌの範囲内であることが好ましい。
【0024】
また、本発明の保存液は、本発明の必須保護成分を等張液中に含むものであってもよい。上記「等張液」としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度又は糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には、生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水［Phosphate buffered saline；ＰＢＳ］、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等を挙げることができるが、中でも、重炭酸リンゲル液又は乳酸リンゲル液であることが好ましい。等張液は、既知の組成に基づいて製造することができるが、市販品を用いることもできる。市販のものとしては、例えば、大塚生食注（生理食塩液、大塚製薬工場社製）、リンゲル液「オーツカ」（リンゲル液、大塚製薬工場社製）、ラクテック（登録商標）注（乳酸リンゲル液、大塚製薬工場社製）、ヴィーン（登録商標）Ｆ輸液（酢酸リンゲル液、扶桑薬品工業社製）、ビカネイト（登録商標）輸液（重炭酸リンゲル液、大塚製薬工場社製）等の市販品を挙げることができる。本明細書において「等張」とは、浸透圧が２５０～３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内であることを意味する。
【0025】
さらに、本発明の保存液は、哺乳動物細胞の保存のための任意の有効成分として、アルブミン又は糖を含んでいてもよい。本明細書において「任意の有効成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。また、アルブミン及び／又は糖を「本発明の任意保護成分」という場合がある。上記「アルブミン」としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清アルブミン（ＦＢＳ）等を挙げることができるが、ＨＳＡであることが好ましい。上記本発明の保存液にアルブミンを含む場合、アルブミンの濃度としては、０．１～３０（ｗ／ｖ）％の範囲内であればよく、例えば、１．０～２０（ｗ／ｖ）％、１．０～１５（ｗ／ｖ）％、１．０～１０（ｗ／ｖ）％、１．２５～１０（ｗ／ｖ）％、１．２５～７．２５（ｗ／ｖ）％、１．５～５．０（ｗ／ｖ）％、１．５～２．５（ｗ／ｖ）％、２．０～２．５（ｗ／ｖ）％を挙げることができる。
【0026】
上記「糖」としては、例えば、ブドウ糖（グルコース）、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン等を挙げることができる。上記本発明の保存液にブドウ糖を含む場合、ブドウ糖の濃度としては、１～１００００ｍｇ／Ｌの範囲内であればよく、例えば、１０～８０００ｍｇ／Ｌ、２０～６０００ｍｇ／Ｌ、３０～６０００ｍｇ／Ｌ、４０～６０００ｍｇ／Ｌ、５０～６０００ｍｇ／Ｌ、１００～６０００ｍｇ／Ｌ、２００～６０００ｍｇ／Ｌ、５００～６０００ｍｇ／Ｌ、１０００～６０００ｍｇ／Ｌ、２０００～６０００ｍｇ／Ｌ、２０００～５０００ｍｇ／Ｌを挙げることができる。上記本発明の保存液にトレハロースを含む場合、トレハロースの濃度としては、０．１～１００ｇ／Ｌ、５～８０ｇ／Ｌ、２０～６０ｇ／Ｌを挙げることができる。上記本発明の保存液にデキストランを含む場合、デキストランの濃度としては、０．１～１００ｇ／Ｌ、５～８０ｇ／Ｌ、４０～７０ｇ／Ｌを挙げることができる。上記本発明の保存液にヒドロキシエチルデンプンを含む場合、ヒドロキシエチルデンプンの濃度としては、１～５００ｇ／Ｌ、１０～１００ｇ／Ｌを挙げることができる。
【0027】
本発明の保存液は、（ａ）ビタミンＢ２（ＶＢ２、リボフラビンともいう）若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「ビタミンＢ２類」と称する場合がある）、（ｂ）培地若しくはその必須成分、又は（ｃ）細胞分化促進剤を含まないものであることが好ましい。上記（ａ）の「ビタミンＢ２類」におけるビタミンＢ２の誘導体としては、例えば、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、リボフラビンテトラブチレイト、酪酸リボフラビン、リン酸リボフラビン（リボフラビンリン酸エステル）等を挙げることができ、ビタミンＢ２又はその誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム塩等を挙げることができる。
【0028】
上記（ｂ）の「培地」とは、インビトロ環境下において細胞の維持及び増殖に必要な栄養素を提供する細胞培養用溶液を意味し、例えば、イーグル最少必須（ＥＭＥ）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＴＣ１９９培地、アルファ－最少必須培地（α－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ－Ｆ－１２、Ｅ１９９、ＭＣＤＢ、レイボヴィッツＬ－１５、ウィリアムＥ培地等を挙げることができる。また、上記（ｂ）の「培地の必須成分」とは、水性栄養素及び電解液、グリコサミノグリカン、脱腫脹剤、エネルギー源、緩衝剤、抗酸化剤、膜安定剤、抗生物質（若しくは抗真菌剤）、ＡＴＰ前駆物質、細胞栄養補助剤、及び／又はｐＨ指示薬を意味し、例えば、上記「水性栄養素及び電解液」としては、上記培地から選択される１又は２以上の培地を、上記「グリコサミノグリカン」としては、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸デルマチン、硫酸ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸ケラチン、硫酸ケラタン、又はヒアルロン酸を、上記「脱腫脹剤」としては、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、酢酸ポリビニル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシプロピルメチルセルロースを、上記「エネルギー源」としては、ピルベート、シュークロース、フルクトース、又はデキストロースを、上記「緩衝剤」としては、炭酸水素塩緩衝液又はＨＥＰＥＳ緩衝液を、上記「抗酸化剤」としては、２－メルカプトエタノール、グルタチオン、又はα－トコフェロールを、上記「膜安定剤」としては、ビタミンＡ、レチン酸、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、セレン、又はトランスフェリンを、上記「抗生物質及び／又は抗真菌剤」としては、アンホテリシン－Ｂ、硫酸ゲンタマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸ネオマイシン、ナイスタチン、ペニシリン、トブラマイシン、又はストレプトマイシンを、上記「ＡＴＰ前駆物質」としては、アデノシン、イノシン、又はアデニンを、上記「細胞栄養補助剤」としては、コレステロール、Ｌ－ヒドロキシプロリン、ｄ－ビオチン、カルシフェロール、ナイアシン、ｐ－アミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、ビタミンＢ１２、Ｆｅ（ＮＯ３）３、又は非必須アミノ酸を、上記「ｐＨ指示薬」としてはフェノールレッドを、それぞれ挙げることができる。
【0029】
上記（ｃ）の「細胞分化促進剤」とは、分化能を有する細胞から所望の型の細胞を得るために培地等に添加される薬剤を意味し、例えば、レチノール、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＫ、レチノイン酸、亜鉛、亜鉛化合物、カルシウム、カルシウム化合物、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、Ｌ－グルタミン、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、プロリン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、β－メルカプトエタノール、ジブチルサイクリックアデノシン一リン酸（ｄｂ－ｃＡＭＰ）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、プトレシン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒポキサンチン、アデニン、フォルスコリン、シロスタミド、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、５－アザシチジン、ピルベート、オカダ酸、リノール酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、抗凝固剤クエン酸デキストロース製剤Ａ（ＡＣＤＡ）、ＥＤＴＡ二ナトリウム、酪酸ナトリウム、グリセロホスフェート、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、ペントキシフィリン（１－（５－オキソヘキシル）－３，７－ジメチルキサンチン）、インドメタシン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）等を挙げることができる。上述の通り、本発明において、ナイアシン類、及び抗酸化剤（アスコルビン酸類を含む）は、哺乳動物細胞の保存のために用いられており、分化促進剤として用いられるものではない。
【0030】
本発明の保存液の対象となる「哺乳動物細胞」とは、哺乳動物に由来する生きた細胞であれば特に制限されず、生物個体から得られた初代細胞であっても、初代細胞を一世代または複数世代培養して増殖させた細胞であってもよいが、具体的には、疾患・外傷の治療等に用いられる血小板や、その製造に使用される巨核球の他、再生医療・免疫療法等に用いられる幹細胞や免疫細胞等を好適に例示することができる。また、上記「哺乳動物」としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することができ、中でも、ヒトを好適に例示することができる。
【0031】
上記「血小板」とは、血液中の細胞成分の一つであり、ＣＤ４１ａ及びＣＤ４２ｂが陽性である細胞成分を意味する。本発明の保存液の対象となる血小板は、哺乳動物の血液（全血）から赤血球及び白血球を除去することによって得られた濃縮血小板であっても、インビトロにおいて培養した巨核球から人工的に製造された精製血小板であってもよいが、精製血小板であることが好ましい。上記精製血小板の製造方法としては、特に制限されないが、（Ａ）巨核球の培養物を濃縮する濃縮工程；及び（Ｂ）得られた濃縮物から血小板を遠心分離する遠心分離工程；の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法を好適に例示することができる。また、かかる血小板製造方法にも用いられる「巨核球」は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、生殖性幹細胞（ＥＧ細胞）、体性幹細胞、胚性腫瘍細胞等の多能性細胞から誘導することができる他、骨髄、臍帯血、末梢血等から単離した造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、巨核球・赤芽球前駆細胞、巨核球前駆細胞等から誘導することもできる。
【0032】
また、上記「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem ce11）、複能性幹細胞（multipotent stem ce11）、単能性幹細胞（unipotent stem ce11）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味し、複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味し、単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。本発明の保存液の保存対象となる幹細胞は、多能性幹細胞、複能性幹細胞、及び単能性幹細胞のいずれであってもよく、例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ＥＧ細胞等の多能性幹細胞や、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞を挙げることができるが、中でも、間葉系幹細胞であることが好ましい。間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる他、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる。なかでも、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞や幼若ブタ骨髄由来の間葉系幹細胞を好適に例示できる。
【0033】
さらに、上記「免疫細胞」とは、血液やリンパ液中に存在する、免疫システムに関与する細胞を意味する。本発明の保存液の保存対象となる免疫細胞としては、例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、ミエロイド由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）等を挙げることができるが、中でも、Ｔ細胞であることが好ましい。「Ｔ細胞」とは、表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味し、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）が挙げられる。Ｔ細胞は、哺乳動物の末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる他、市販品を用いることもできる。
【0034】
本発明の保存液は、哺乳動物を非凍結状態で保存するために使用することができる。本発明を用いて哺乳動物細胞を保存する際の温度は、保存対象細胞の種類に応じて適切な温度を任意に選択することができるが、０～４０℃の範囲内であることが好ましい。例えば、本発明の保存液を用いて血小板や巨核球を保存する際の温度は、好ましくは１５～３０℃であり、さらに好ましくは２０～２４℃であり、最も好ましくは２１～２３℃である。また、本発明の保存液を用いて間葉系幹細胞やＴ細胞を保存する際の温度は、好ましくは１～３８℃であり、さらに好ましくは１～３０℃であり、特に好ましくは１～１５℃であり、最も好ましくは１～５℃である。さらに、本発明を用いて哺乳動物細胞を保存する際の温度は、０～４０℃の範囲内で変化させることもできる。例えば、以下の実施例でも示されるように、本発明の保存液を用いてＴ細胞を保存する際には、低温（例えば、１～５℃、好ましくは５℃）で一定期間保存した後に、室温（例えば、２０～２６℃、好ましくは２２～２５℃、より好ましくは２５℃）でさらに数時間保存することができる。また、本発明の保存液は、哺乳動物細胞を数時間～数十日間保存するために用いることができる。保存期間は、保存対象細胞の種類によって異なるが、以下の実施例に示されるように、血小板や巨核球であれば１～１５日間、好ましくは１～１０日間、間葉系幹細胞であれば１～６３日間、好ましくは１～３５日間、より好ましくは１～３０日間、より好ましくは１～２８日間、さらに好ましくは１～１４日間、Ｔ細胞であれば１～３０日間、好ましくは１～１４日間、より好ましくは１～２日間、さらに好ましくは３０時間保存することができる。
【0035】
本発明の保存液は、哺乳動物細胞を哺乳動物に投与するという用途に使用されてもよい。すなわち、本発明の保存液と哺乳動物細胞とを含む混合液を所定の条件下で保存した後に、該混合液を哺乳動物の生体内へそのまま投与（例えば、静脈投与）することもできる。このため、本発明の保存液は、哺乳動物の生体内に投与した時に、哺乳動物の生体に悪影響を及ぼし得る成分を含まないことが好ましい。かかる「悪影響を及ぼし得る成分」としては、例えば、ポリビニルピロリドン、２－メルカプトエタノール、オカダ酸、酪酸ナトリウム、Ｇ４１８等を挙げることができる。
【0036】
本発明の一態様として、本発明の必須保護成分を含む哺乳動物劣化抑制剤を挙げることができる。かかる劣化抑制剤は、さらに本発明の任意保護成分を含むものであってもよい。本発明の哺乳動物劣化抑制剤は、上記等張液に添加して本発明の保存液を調製するために使用できる他、既知の哺乳動物保存液に添加してその保存性を高めるために用いることもできる。また、本発明は、本発明の保存液又は粉末製剤が封入された哺乳動物細胞保存容器にも関する。本発明の保存容器としては、哺乳動物細胞の懸濁液を注入した後に無菌性を保つことができる容器であればどのような形態であってもよく、例えば、血液バッグ、輸液バッグ、シリンジ、アンプル、バイアル等を挙げることができるが、血液バッグであることが好ましい。
【0037】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない
【実施例1】
【0038】
［ｉＰＳ細胞由来血小板の作製］
ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３４６６７に記載の方法に従ってｉＰＳ細胞由来血小板を作製した。具体的な手順を以下の（１－１）～（１－１２）に示す。
ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３４６６７に記載の方法に従ってｉＰＳ細胞由来血小板を作製した。具体的な手順を以下の（１－１）～（１－１２）に示す。
【0039】
（１－１）ｉＰＳ細胞からの造血前駆細胞の調製
Ｔａｋａｙａｍａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０１０，ｖｏｌ．１３，２８１７－２８３０）の方法に従って、ヒトｉＰＳ細胞（ＴＫＤＮ ＳｅＶ２及びＮＩＨ５：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞）から血球細胞への分化培養を実施した。詳細には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞コロニーを、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）存在下で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞と共に１４日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；ＨＰＣ）を作製した。上記培養は、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件で実施した。
Ｔａｋａｙａｍａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０１０，ｖｏｌ．１３，２８１７－２８３０）の方法に従って、ヒトｉＰＳ細胞（ＴＫＤＮ ＳｅＶ２及びＮＩＨ５：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来ｉＰＳ細胞）から血球細胞への分化培養を実施した。詳細には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞コロニーを、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）存在下で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞と共に１４日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；ＨＰＣ）を作製した。上記培養は、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件で実施した。
【0040】
（１－２）遺伝子導入システム
遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ制御性のＴｅｔ－ｏｎ（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。ＬＶ－ＴＲＥ－ｍＯＫＳ－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ，２０１０，ｖｏｌ．１４２，Ｎｏ．５，７８７－７９９）のｍＯＫＳカセットを、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、又はＢＣＬ－ｘＬに組み替えることで作製した。ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、又はＢＣＬ－ｘＬが導入されたベクターを、それぞれ、ＬＶ－ＴＲＥ－ｃ－Ｍｙｃ－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇ、ＬＶＴＲＥ－ＢＭＩ１－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇ、及びＬＶ－ＴＲＥ－ＢＣＬ－ｘＬ－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇとした。ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ－ｘＬウイルスは、２９３Ｔ細胞へ上記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作製した。得られたウイルスを目的の細胞に感染させることによって、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ－ｘＬ遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン（ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６３１３１１）を加えることによって強制発現させることができる。
遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ制御性のＴｅｔ－ｏｎ（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。ＬＶ－ＴＲＥ－ｍＯＫＳ－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ，２０１０，ｖｏｌ．１４２，Ｎｏ．５，７８７－７９９）のｍＯＫＳカセットを、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、又はＢＣＬ－ｘＬに組み替えることで作製した。ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、又はＢＣＬ－ｘＬが導入されたベクターを、それぞれ、ＬＶ－ＴＲＥ－ｃ－Ｍｙｃ－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇ、ＬＶＴＲＥ－ＢＭＩ１－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇ、及びＬＶ－ＴＲＥ－ＢＣＬ－ｘＬ－Ｕｂｃ－ｔＴＡ－Ｉ２Ｇとした。ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ－ｘＬウイルスは、２９３Ｔ細胞へ上記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作製した。得られたウイルスを目的の細胞に感染させることによって、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、及びＢＣＬ－ｘＬ遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン（ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６３１３１１）を加えることによって強制発現させることができる。
【0041】
（１－３）造血前駆細胞へのｃ－ＭＹＣ及びＢＭＩ１ウイルスの感染
予めＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞を播種した６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上に、上記（１－１）の方法で得られたＨＰＣを５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＢＭＩ１ウイルス及びｃ－ＭＹＣウイルスを用いたレンチウイルス法にてｃ－ＭＹＣ及びＢＭＩ１を強制発現させた。このとき、細胞株１種類につき６ ｗｅｌｌずつ使用した。具体的には、それぞれＭＯＩ（multiplicity of infection）２０となるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（３２℃、９００ｒｐｍ、６０分間遠心）で感染させた。上記スピンインフェクションは、１２時間おきに２回実施した。培地は、基本培地（１５％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、１％ Ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＴＳ－Ｇ）（ＧＩＢＣＯ社製）、０．４５ｍｍｏｌ／Ｌ １－Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５０μｇ／ｍＬ Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有するＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製））に、５０ｎｇ／ｍＬ Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）、５０ｎｇ／ｍＬ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）及び２μｇ／ｍＬ Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＯＸ、ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、＃６３１３１１）を添加した培地に（以下、「分化培地」と称する）、さらに、Ｐｒｏｔａｍｉｎｅを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加して用いた。
予めＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞を播種した６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上に、上記（１－１）の方法で得られたＨＰＣを５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＢＭＩ１ウイルス及びｃ－ＭＹＣウイルスを用いたレンチウイルス法にてｃ－ＭＹＣ及びＢＭＩ１を強制発現させた。このとき、細胞株１種類につき６ ｗｅｌｌずつ使用した。具体的には、それぞれＭＯＩ（multiplicity of infection）２０となるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（３２℃、９００ｒｐｍ、６０分間遠心）で感染させた。上記スピンインフェクションは、１２時間おきに２回実施した。培地は、基本培地（１５％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、１％ Ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＴＳ－Ｇ）（ＧＩＢＣＯ社製）、０．４５ｍｍｏｌ／Ｌ １－Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５０μｇ／ｍＬ Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有するＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製））に、５０ｎｇ／ｍＬ Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）、５０ｎｇ／ｍＬ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）及び２μｇ／ｍＬ Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＯＸ、ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、＃６３１３１１）を添加した培地に（以下、「分化培地」と称する）、さらに、Ｐｒｏｔａｍｉｎｅを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加して用いた。
【0042】
（１－４）巨核球自己増殖株の作製及び維持培養
上記（１－３）の方法でｃ－ＭＹＣ及びＢＭＩ１ウイルスの感染を実施した日を感染０日目として、以下の通りに、ｃ－ＭＹＣ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子が導入されたＨＰＣを培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。ｃ－ＭＹＣ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現は、培地に１μｇ／ｍＬ ＤＯＸを添加することにより実施した。
感染２日目～感染１１日目：
感染２日目に、ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、１２００ｒｐｍ、５分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に播種した（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。感染９日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。上記再播種時は、細胞数を計測後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌとなるようにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に播種した（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。
感染１２日目～感染１３日目：
感染２日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後３×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１００ｍｍ ｄｉｓｈとなるように、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に播種した（１００ｍｍ ｄｉｓｈ）。
感染１４日目：
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞１．０×１０５個あたり、２μＬの抗ヒトＣＤ４１ａ－ＡＰＣ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、１μＬの抗ヒトＣＤ４２ｂ－ＰＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及び１μＬの抗ヒトＣＤ２３５ａｂ－ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）をそれぞれ用いて、上記血球細胞と抗体とを反応させた。上記反応後、ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて解析した。感染１４日目において、ＣＤ４１ａ陽性率が５０％以上である細胞を、巨核球自己増殖株とした。
上記（１－３）の方法でｃ－ＭＹＣ及びＢＭＩ１ウイルスの感染を実施した日を感染０日目として、以下の通りに、ｃ－ＭＹＣ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子が導入されたＨＰＣを培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。ｃ－ＭＹＣ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の強制発現は、培地に１μｇ／ｍＬ ＤＯＸを添加することにより実施した。
感染２日目～感染１１日目：
感染２日目に、ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、１２００ｒｐｍ、５分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に播種した（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。感染９日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。上記再播種時は、細胞数を計測後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌとなるようにＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に播種した（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。
感染１２日目～感染１３日目：
感染２日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後３×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１００ｍｍ ｄｉｓｈとなるように、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に播種した（１００ｍｍ ｄｉｓｈ）。
感染１４日目：
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞１．０×１０５個あたり、２μＬの抗ヒトＣＤ４１ａ－ＡＰＣ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、１μＬの抗ヒトＣＤ４２ｂ－ＰＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及び１μＬの抗ヒトＣＤ２３５ａｂ－ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）をそれぞれ用いて、上記血球細胞と抗体とを反応させた。上記反応後、ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて解析した。感染１４日目において、ＣＤ４１ａ陽性率が５０％以上である細胞を、巨核球自己増殖株とした。
【0043】
（１－５）巨核球自己増殖株へのＢＣＬ－ｘＬウイルス感染
上記感染１４日目の巨核球自己増殖株に、ＢＣＬ－ｘＬウイルスを用いたレンチウイルス法にてＢＣＬ－ｘＬを遺伝子導入した。ＭＯＩ １０になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（３２℃、９００ｒｐｍ、６０分間遠心）で感染させた。ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子の強制発現は、培地に１μｇ／ｍＬ ＤＯＸとなるようにＤＯ
Ｘを添加することにより実施した。
上記感染１４日目の巨核球自己増殖株に、ＢＣＬ－ｘＬウイルスを用いたレンチウイルス法にてＢＣＬ－ｘＬを遺伝子導入した。ＭＯＩ １０になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（３２℃、９００ｒｐｍ、６０分間遠心）で感染させた。ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子の強制発現は、培地に１μｇ／ｍＬ ＤＯＸとなるようにＤＯ
Ｘを添加することにより実施した。
【0044】
（１－６）巨核球不死化株の作製及び維持培養
感染１４日目～感染１８日目：
上記（１－５）の方法で得られたＢＣＬ－ｘＬ遺伝子を導入した巨核球自己増殖株を回収し、１２００ｒｐｍ、５分間遠心操作を行った。上記遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に２×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように播種した（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。
感染１８日目（継代）：
ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、３×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１００ｍｍ ｄｉｓｈとなるように播種した。
感染２４日目（継代）：
ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１００ｍｍ ｄｉｓｈとなるように播種した。以後、４－７日毎に同様にして継代を行い、維持培養を行った。なお、継代時には、新たな分化培地に懸濁の上、播種した。
感染２４日目にＢＣＬ－ｘＬを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞１．０×１０５個あたり、２μＬの抗ヒトＣＤ４１ａ－ＡＰＣ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、１μＬの抗ヒトＣＤ４２ｂ－ＰＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及び１μＬの抗ヒトＣＤ２３５ａｂ－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＤ２３５ａｂ－ＰＢ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて免疫染色した後に、ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ（商標）を用いて解析した。そして、感染２４日目において、ＣＤ４１ａ陽性率が５０％以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後２４日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株ＳｅＶ２－ＭＫＣＬ及びＮＩＨ５－ＭＫＣＬとした。得られたＳｅＶ２－ＭＫＣＬ及びＮＩＨ５－ＭＫＣＬを、１０ｃｍディッシュ（１０ｍＬ／ディッシュ）で静置培養した。培地は、ＩＭＤＭを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。培養条件は、２７℃、５％ＣＯ２とした。
ＦＢＳ（シグマ社製、＃１７２０１２、ｌｏｔ．１２Ｅ２６１） １５％
Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃２５０３０－０８１） ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃４１４００－０４５） １００倍希釈
ＭＴＧ（monothioglycerol、ｓｉｇｍａ社製、＃Ｍ６１４５－２５ＭＬ） ４５０μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸（ｓｉｇｍａ社製、＃Ａ４５４４） ５０μｇ／ｍＬ
Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ８８３３－１００ＭＧ） ２μｇ／ｍＬ
ＳＣＦ（和光純薬社製、＃１９３－１５５１３） ５０ｎｇ／ｍＬ
ＴＰＯ様作用物質 ２００ｎｇ／ｍＬ
感染１４日目～感染１８日目：
上記（１－５）の方法で得られたＢＣＬ－ｘＬ遺伝子を導入した巨核球自己増殖株を回収し、１２００ｒｐｍ、５分間遠心操作を行った。上記遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいＣ３Ｈ１０Ｔ１／２フィーダ細胞上に２×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように播種した（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。
感染１８日目（継代）：
ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、３×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１００ｍｍ ｄｉｓｈとなるように播種した。
感染２４日目（継代）：
ＢＣＬ－ｘＬ遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ／１００ｍｍ ｄｉｓｈとなるように播種した。以後、４－７日毎に同様にして継代を行い、維持培養を行った。なお、継代時には、新たな分化培地に懸濁の上、播種した。
感染２４日目にＢＣＬ－ｘＬを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞１．０×１０５個あたり、２μＬの抗ヒトＣＤ４１ａ－ＡＰＣ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、１μＬの抗ヒトＣＤ４２ｂ－ＰＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及び１μＬの抗ヒトＣＤ２３５ａｂ－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ抗体（Ａｎｔｉ－ＣＤ２３５ａｂ－ＰＢ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて免疫染色した後に、ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ（商標）を用いて解析した。そして、感染２４日目において、ＣＤ４１ａ陽性率が５０％以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後２４日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株ＳｅＶ２－ＭＫＣＬ及びＮＩＨ５－ＭＫＣＬとした。得られたＳｅＶ２－ＭＫＣＬ及びＮＩＨ５－ＭＫＣＬを、１０ｃｍディッシュ（１０ｍＬ／ディッシュ）で静置培養した。培地は、ＩＭＤＭを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。培養条件は、２７℃、５％ＣＯ２とした。
ＦＢＳ（シグマ社製、＃１７２０１２、ｌｏｔ．１２Ｅ２６１） １５％
Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃２５０３０－０８１） ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃４１４００－０４５） １００倍希釈
ＭＴＧ（monothioglycerol、ｓｉｇｍａ社製、＃Ｍ６１４５－２５ＭＬ） ４５０μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸（ｓｉｇｍａ社製、＃Ａ４５４４） ５０μｇ／ｍＬ
Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ８８３３－１００ＭＧ） ２μｇ／ｍＬ
ＳＣＦ（和光純薬社製、＃１９３－１５５１３） ５０ｎｇ／ｍＬ
ＴＰＯ様作用物質 ２００ｎｇ／ｍＬ
【0045】
（１－７）巨核球の培養物の生産
ＤＯＸを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、上記（１－６）の方法で得た不死化巨核球細胞株（ＳｅＶ２－ＭＫＣＬ及びＮＩＨ５－ＭＫＣＬ）を、ＰＢＳ（－）で２度洗浄し、下記血小板生産培地に懸濁した。細胞の播種密度は、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。そして、上記血小板生産培地存在下で６日間培養して、血小板を産生させることにより、巨核球の培養物を生産させた。また、上記血小板生産培地は、ＩＭＤＭを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は、終濃度）。
ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ５％
Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃２５０３０－０８１） ４ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃４１４００－０４５） １００倍希釈
ＭＴＧ（monothioglycerol、ｓｉｇｍａ社製、＃Ｍ６１４５－２５ＭＬ） ４５０μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸（ｓｉｇｍａ社製、＃Ａ４５４４） ５０μｇ／ｍＬ
ＳＣＦ（和光純薬社製、＃１９３－１５５１３） ５０ｎｇ／ｍＬ
ＴＰＯ様作用物質 ２００ｎｇ／ｍＬ
ＡＤＡＭ阻害剤 １５μｍｏｌ／Ｌ
ＧＮＦ３５１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、＃１８２７０７） ５００ｎｍｏｌ／Ｌ
Ｙ３９９８３（Ｃｈｅｍｓｃｅｎｅ ＬＬＣ社製、＃ＣＳ－００９６） ５００ｎｍｏｌ／Ｌ
Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ５Ｕ／ｍＬ
低分子ｈｅｐａｒｉｎ（ＳＡＮＯＦＩ社製、クレキサン） １Ｕ／ｍＬ
ＤＯＸを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、上記（１－６）の方法で得た不死化巨核球細胞株（ＳｅＶ２－ＭＫＣＬ及びＮＩＨ５－ＭＫＣＬ）を、ＰＢＳ（－）で２度洗浄し、下記血小板生産培地に懸濁した。細胞の播種密度は、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。そして、上記血小板生産培地存在下で６日間培養して、血小板を産生させることにより、巨核球の培養物を生産させた。また、上記血小板生産培地は、ＩＭＤＭを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は、終濃度）。
ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ５％
Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃２５０３０－０８１） ４ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＴＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、＃４１４００－０４５） １００倍希釈
ＭＴＧ（monothioglycerol、ｓｉｇｍａ社製、＃Ｍ６１４５－２５ＭＬ） ４５０μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸（ｓｉｇｍａ社製、＃Ａ４５４４） ５０μｇ／ｍＬ
ＳＣＦ（和光純薬社製、＃１９３－１５５１３） ５０ｎｇ／ｍＬ
ＴＰＯ様作用物質 ２００ｎｇ／ｍＬ
ＡＤＡＭ阻害剤 １５μｍｏｌ／Ｌ
ＧＮＦ３５１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、＃１８２７０７） ５００ｎｍｏｌ／Ｌ
Ｙ３９９８３（Ｃｈｅｍｓｃｅｎｅ ＬＬＣ社製、＃ＣＳ－００９６） ５００ｎｍｏｌ／Ｌ
Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ５Ｕ／ｍＬ
低分子ｈｅｐａｒｉｎ（ＳＡＮＯＦＩ社製、クレキサン） １Ｕ／ｍＬ
【0046】
（１－８）巨核球の培養物の濃縮
上記（１－７）で得られた巨核球の培養物から、血小板を製造（精製）した。なお、同様の精製を２回実施した。具体的には、上記（１－７）で得られた巨核球の培養物について、培養物バッグに導入した。そして、上記培養物バッグについて、図１のように、濃縮システムに接続した。図１において、洗浄保存液バッグ１及び２は、洗浄保存液を含む。上記洗浄保存液は、ビカネイト輸液（大塚製薬社製）に２０％ＡＣＤ及び２．５％ヒト血清アルブミンを添加し、ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整したものを使用した。そして、下記表１にしたがって、中空糸膜（プラズマフローＯＰ、旭化成メディカル社製）を用いて、上記巨核球の培養物を濃縮し、得られた巨核球の培養物の濃縮液を貯蔵バッグに回収した。
上記（１－７）で得られた巨核球の培養物から、血小板を製造（精製）した。なお、同様の精製を２回実施した。具体的には、上記（１－７）で得られた巨核球の培養物について、培養物バッグに導入した。そして、上記培養物バッグについて、図１のように、濃縮システムに接続した。図１において、洗浄保存液バッグ１及び２は、洗浄保存液を含む。上記洗浄保存液は、ビカネイト輸液（大塚製薬社製）に２０％ＡＣＤ及び２．５％ヒト血清アルブミンを添加し、ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整したものを使用した。そして、下記表１にしたがって、中空糸膜（プラズマフローＯＰ、旭化成メディカル社製）を用いて、上記巨核球の培養物を濃縮し、得られた巨核球の培養物の濃縮液を貯蔵バッグに回収した。
【0047】
【表1】
【0048】
（１－９）培養物の遠心分離
まず、無菌接合装置を用いて、ＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットの廃液バッグを回収用バッグに置換した。上記回収用バッグは、ハイカリックＩＶＨバッグ（テルモ社製、ＨＣ－Ｂ３００６Ａ）を用いた。次に、上記巨核球の培養物の濃縮液に対して１０％量のＡＣＤ－Ａ液（テルモ社製）を添加した。上記添加後、ＡＣＤ－Ａ液を添加した濃縮液を、細胞バッグに注入した。上記細胞バッグは、ハイカリックＩＶＨバッグ（テルモ社製、ＨＣ－Ｂ３００６Ａ）を用いた。
さらに、無菌接合装置を用いて、ＡＣＤ－Ａ液を添加した培養物を含む細胞バッグをＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットに接合した。そして、ＡＣＰ２１５をサービスモードで立ち上げ、回転数を２５００ｒｐｍ（３５０×ｇ）にセットした。ＡＣＰ２１５をスタートさせ、上記細胞バッグ中の培養物を約１００ｍＬ／ｍｉｎで分離ボウルに導入した。上記分離ボウルより流出する液体成分は、回収バッグに回収した。上記細胞バッグ中の培養物の全量を分離ボウルに導入後、さらに５００ｍＬの洗浄保存液を上記分離ボウルに導入した。上記分離ボウルに上記洗浄保存液を導入後、遠心を止めてチューブシーラーを用いて回収液（血小板を含む回収された液体成分）を含む回収バッグを切り離した。
新しいＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットに、上記無菌接合装置を用いて回収液（血小板を含む）を含んだ回収バッグを接合した。ＡＣＰ２１５を通常モードで立ち上げた。プログラム設定はＷＰＣを選択し、機器の指示に従い、上記回収バッグを接合したＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットをセットした。なお、回収液を含んだ回収バッグはスタンドに設置した。
次に、ＡＣＰ２１５の遠心速度を５０００ｒｐｍ（１３９８．８×ｇ）に変更し、遠心をスタートさせた。上記分離ボウルへ上記回収液が導入され始めたとき、自動注入から手動注入に変更した。具体的には、上記回収液を約１００ｍＬ／ｍｉｎの導入速度で上記分離ボウルに導入した。上記回収液全量を分離ボウルに添加後、さらに５００ｍＬの洗浄保存液を追加した。
まず、無菌接合装置を用いて、ＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットの廃液バッグを回収用バッグに置換した。上記回収用バッグは、ハイカリックＩＶＨバッグ（テルモ社製、ＨＣ－Ｂ３００６Ａ）を用いた。次に、上記巨核球の培養物の濃縮液に対して１０％量のＡＣＤ－Ａ液（テルモ社製）を添加した。上記添加後、ＡＣＤ－Ａ液を添加した濃縮液を、細胞バッグに注入した。上記細胞バッグは、ハイカリックＩＶＨバッグ（テルモ社製、ＨＣ－Ｂ３００６Ａ）を用いた。
さらに、無菌接合装置を用いて、ＡＣＤ－Ａ液を添加した培養物を含む細胞バッグをＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットに接合した。そして、ＡＣＰ２１５をサービスモードで立ち上げ、回転数を２５００ｒｐｍ（３５０×ｇ）にセットした。ＡＣＰ２１５をスタートさせ、上記細胞バッグ中の培養物を約１００ｍＬ／ｍｉｎで分離ボウルに導入した。上記分離ボウルより流出する液体成分は、回収バッグに回収した。上記細胞バッグ中の培養物の全量を分離ボウルに導入後、さらに５００ｍＬの洗浄保存液を上記分離ボウルに導入した。上記分離ボウルに上記洗浄保存液を導入後、遠心を止めてチューブシーラーを用いて回収液（血小板を含む回収された液体成分）を含む回収バッグを切り離した。
新しいＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットに、上記無菌接合装置を用いて回収液（血小板を含む）を含んだ回収バッグを接合した。ＡＣＰ２１５を通常モードで立ち上げた。プログラム設定はＷＰＣを選択し、機器の指示に従い、上記回収バッグを接合したＡＣＰ２１５ディスポーザブルセットをセットした。なお、回収液を含んだ回収バッグはスタンドに設置した。
次に、ＡＣＰ２１５の遠心速度を５０００ｒｐｍ（１３９８．８×ｇ）に変更し、遠心をスタートさせた。上記分離ボウルへ上記回収液が導入され始めたとき、自動注入から手動注入に変更した。具体的には、上記回収液を約１００ｍＬ／ｍｉｎの導入速度で上記分離ボウルに導入した。上記回収液全量を分離ボウルに添加後、さらに５００ｍＬの洗浄保存液を追加した。
【0049】
（１－１０）培養物の洗浄
洗浄は、ＡＣＰ２１５のプログラムに従って、２０００ｍＬの上記洗浄保存液で洗浄した。
洗浄は、ＡＣＰ２１５のプログラムに従って、２０００ｍＬの上記洗浄保存液で洗浄した。
【0050】
（１－１１）培養物の回収
ＡＣＰ２１５のプログラムに従って、２００ｍＬの洗浄済み培養物（血小板を含む）を血小板製剤バッグに回収した。
ＡＣＰ２１５のプログラムに従って、２００ｍＬの洗浄済み培養物（血小板を含む）を血小板製剤バッグに回収した。
【0051】
（１－１２）培養物の分離
上記血小板製剤バッグについて、上記中空糸膜を用いて、常法により血小板を分離し、回収用バッグに回収した。
上記血小板製剤バッグについて、上記中空糸膜を用いて、常法により血小板を分離し、回収用バッグに回収した。
【実施例2】
【0052】
［血小板保存液へのビタミンＣの添加］
（２－１）血小板保存液の調製
重炭酸リンゲル液（ビカネイト輸液；大塚製薬工場社製）（塩化ナトリウム ５．８４ｇ／Ｌ、塩化カリウム ０．３０ｇ／Ｌ、塩化カルシウム水和物 ０．２２ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム ０．２０ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム ２．３５ｇ／Ｌ、及びクエン酸ナトリウム水和物 ０．２０ｇ／Ｌ）に、ヒト血清アルブミン製剤（ＨＳＡ；ＣＳＬベーリング社製）、及び、血液保存液（ＡＣＤ－Ａ液；テルモ社製）（クエン酸ナトリウム水和物 ２．２０Ｗ／Ｖ％、クエン酸水和物、０．８０Ｗ／Ｖ％、及びブドウ糖 ２．２０Ｗ／Ｖ％）を加えた溶液を調製した。本明細書においては、当該溶液を「第１世代保存液」ともいう。また、第１世代保存液にＶＣ製剤（添加剤を含む注射製剤；沢井製薬社製）を加えた溶液を調製した。本明細書においては、当該溶液を「ＶＣ添加保存液」ともいう。各保存液における上記添加剤の最終濃度を以下の表２に示す。また、いずれの保存液も１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．３±０．１となるように調整し、使用時まで１時間以上インキュベートした（遮光下、室温、５％ＣＯ２）。
（２－１）血小板保存液の調製
重炭酸リンゲル液（ビカネイト輸液；大塚製薬工場社製）（塩化ナトリウム ５．８４ｇ／Ｌ、塩化カリウム ０．３０ｇ／Ｌ、塩化カルシウム水和物 ０．２２ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム ０．２０ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム ２．３５ｇ／Ｌ、及びクエン酸ナトリウム水和物 ０．２０ｇ／Ｌ）に、ヒト血清アルブミン製剤（ＨＳＡ；ＣＳＬベーリング社製）、及び、血液保存液（ＡＣＤ－Ａ液；テルモ社製）（クエン酸ナトリウム水和物 ２．２０Ｗ／Ｖ％、クエン酸水和物、０．８０Ｗ／Ｖ％、及びブドウ糖 ２．２０Ｗ／Ｖ％）を加えた溶液を調製した。本明細書においては、当該溶液を「第１世代保存液」ともいう。また、第１世代保存液にＶＣ製剤（添加剤を含む注射製剤；沢井製薬社製）を加えた溶液を調製した。本明細書においては、当該溶液を「ＶＣ添加保存液」ともいう。各保存液における上記添加剤の最終濃度を以下の表２に示す。また、いずれの保存液も１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．３±０．１となるように調整し、使用時まで１時間以上インキュベートした（遮光下、室温、５％ＣＯ２）。
【0053】
【表2】
【0054】
（２－２）各保存液を用いた血小板サンプルの作製
実施例１により得られた培養物に含まれる血小板の濃度を、ＦＡＣＳにより測定した。必要量の血小板を含む培養物を分取してＡＣＤ－Ａ液（１０ｖ／ｖ％）及びＰＥＧ１（終濃度２μＭ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を添加し、１２分間の遠心分離（１２００×ｇ、２２℃）を行った。上清を除去した後に、ペレットに上記（２－１）で調製した保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を２４ウェルプレートに播種して最長５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（２－３）及び（２－４）の実験に供した。
実施例１により得られた培養物に含まれる血小板の濃度を、ＦＡＣＳにより測定した。必要量の血小板を含む培養物を分取してＡＣＤ－Ａ液（１０ｖ／ｖ％）及びＰＥＧ１（終濃度２μＭ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を添加し、１２分間の遠心分離（１２００×ｇ、２２℃）を行った。上清を除去した後に、ペレットに上記（２－１）で調製した保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を２４ウェルプレートに播種して最長５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（２－３）及び（２－４）の実験に供した。
【0055】
（２－３）血小板サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは血小板の劣化（活性化）の指標の一つであり、陽性率が高い場合には血小板が劣化している、又は異常であると評価される。そこで、上記（２－２）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
具体的には、上記（２－２）により得られた血小板サンプルをＡｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で５００倍希釈し、３本の遠心管に分注した（それぞれ、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、及び無刺激サンプル）。ネガティブコントロールサンプルにはＥＤＴＡを、ポジティブコントロールサンプルにはＩｏｎｏｍｙｃｉｎをそれぞれ添加した後に、全てのサンプルを抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により染色した（遮光下、室温、２０分間）。染色後に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを加えて速やかにＦＡＣＳで測定した。ネガティブコントロールにおけるｉＰＳ血小板（ＣＤ４１＋分画）中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を１．０±０．１％とし、無刺激サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を算出した。
結果を図２の上段に示す（いずれも、５日間保存後血小板サンプルから得られた結果）。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には６０．５±０．３～６４．４±０．１％であったのに対し、ＶＣ添加保存液を用いた場合には５３．９±２．１～５６．７±１．８％であり、ＶＣ添加により低下することが明らかとなった。これらの結果から、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加することによって、血小板保存液の血小板劣化抑制作用が改善することが明らかとなった。
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは血小板の劣化（活性化）の指標の一つであり、陽性率が高い場合には血小板が劣化している、又は異常であると評価される。そこで、上記（２－２）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
具体的には、上記（２－２）により得られた血小板サンプルをＡｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で５００倍希釈し、３本の遠心管に分注した（それぞれ、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、及び無刺激サンプル）。ネガティブコントロールサンプルにはＥＤＴＡを、ポジティブコントロールサンプルにはＩｏｎｏｍｙｃｉｎをそれぞれ添加した後に、全てのサンプルを抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により染色した（遮光下、室温、２０分間）。染色後に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを加えて速やかにＦＡＣＳで測定した。ネガティブコントロールにおけるｉＰＳ血小板（ＣＤ４１＋分画）中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を１．０±０．１％とし、無刺激サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を算出した。
結果を図２の上段に示す（いずれも、５日間保存後血小板サンプルから得られた結果）。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には６０．５±０．３～６４．４±０．１％であったのに対し、ＶＣ添加保存液を用いた場合には５３．９±２．１～５６．７±１．８％であり、ＶＣ添加により低下することが明らかとなった。これらの結果から、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加することによって、血小板保存液の血小板劣化抑制作用が改善することが明らかとなった。
【0056】
（２－４）血小板サンプルの無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率
Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎは血小板の劣化（活性化）の指標の一つであり、無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率が高い場合には血小板が劣化又は異常であると評価される。そこで、上記（２－２）により得られた血小板サンプルにおけるＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
また、血小板機能の保存状態を知るために、血小板活性化剤であるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びトロンビン受容体活性化ペプチド－６（ＴＲＡＰ－６）により各血小板サンプルを刺激した時の、ＰＡＣ－１及びＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を調べた（以下、ＡＤＰ及びＴＲＡＰ－６の組合せを「ＡＴＲ」と称する場合がある）。
具体的には、上記（２－２）により得られた血小板サンプルをＴｙｒｏａｄ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＨＢ）により５００倍希釈し、３本の遠心管に分注した（それぞれ、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、及び無刺激サンプル）。ポジティブコントロールサンプルにＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ社製、終濃度２０μＭ）及びＴＲＡＰ－６（ＢＡＣＨＥＭ社製、終濃度３０μＭ）の混合液を添加し、刺激後のポジティブコントロールサンプル及び無刺激サンプルを、抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及び抗ＰＡＣ－１抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により染色した（遮光下、室温、３０分間）。また、ネガティブコントロールサンプルは、抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体のアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及び抗ＰＡＣ－１抗体のアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）により染色した（遮光下、室温、３０分間）。染色後のサンプルに１％パラホルムアルデヒドを加えて固定し（遮光下、４℃、３０分以上）、その後２４時間以内にＦＡＣＳによりＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ及び／又はＰＡＣ―１陽性率を測定した。解析の際には、ネガティブコントロールサンプルにおけるｉＰＳ血小板（ＣＤ４１＋分画）中の、Ｐ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率及びＰＡＣ－１陽性率が１．０±０．１％以下となるようにゲーティングを行った。
Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎは血小板の劣化（活性化）の指標の一つであり、無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率が高い場合には血小板が劣化又は異常であると評価される。そこで、上記（２－２）により得られた血小板サンプルにおけるＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
また、血小板機能の保存状態を知るために、血小板活性化剤であるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びトロンビン受容体活性化ペプチド－６（ＴＲＡＰ－６）により各血小板サンプルを刺激した時の、ＰＡＣ－１及びＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を調べた（以下、ＡＤＰ及びＴＲＡＰ－６の組合せを「ＡＴＲ」と称する場合がある）。
具体的には、上記（２－２）により得られた血小板サンプルをＴｙｒｏａｄ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＨＢ）により５００倍希釈し、３本の遠心管に分注した（それぞれ、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、及び無刺激サンプル）。ポジティブコントロールサンプルにＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ社製、終濃度２０μＭ）及びＴＲＡＰ－６（ＢＡＣＨＥＭ社製、終濃度３０μＭ）の混合液を添加し、刺激後のポジティブコントロールサンプル及び無刺激サンプルを、抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及び抗ＰＡＣ－１抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により染色した（遮光下、室温、３０分間）。また、ネガティブコントロールサンプルは、抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ抗体のアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及び抗ＰＡＣ－１抗体のアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）により染色した（遮光下、室温、３０分間）。染色後のサンプルに１％パラホルムアルデヒドを加えて固定し（遮光下、４℃、３０分以上）、その後２４時間以内にＦＡＣＳによりＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ及び／又はＰＡＣ―１陽性率を測定した。解析の際には、ネガティブコントロールサンプルにおけるｉＰＳ血小板（ＣＤ４１＋分画）中の、Ｐ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率及びＰＡＣ－１陽性率が１．０±０．１％以下となるようにゲーティングを行った。
【0057】
図２の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図２の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す（いずれも、５日間保存後血小板サンプルから得られた結果）。無刺激の血小板（ＣＤ４１＋分画）におけるＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には３３．２±０．３～４５．６±１．２％であったのに対し、ＶＣ添加保存液を用いた場合には１３．０±０．２～１９．７±１．１％であり、ＶＣ添加により低下することが明らかとなった。また、Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率の低下は、ＶＣ添加濃度に依存する傾向が認められた。これらの結果から、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加することによって、血小板保存液の血小板劣化抑制作用が改善することが示された。
また、ＡＴＲ刺激後の血小板（ＣＤ４１＋分画）におけるＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には１７．６～２０．８％であったのに対し、ＶＣ添加保存液を用いた場合には２３．９～２６．９％であり、ＶＣ添加により上昇することが明らかとなった。これらの結果から、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加することによって、血小板保存液の血小板機能維持作用が改善することが示された。
また、ＡＴＲ刺激後の血小板（ＣＤ４１＋分画）におけるＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には１７．６～２０．８％であったのに対し、ＶＣ添加保存液を用いた場合には２３．９～２６．９％であり、ＶＣ添加により上昇することが明らかとなった。これらの結果から、３００～３０００ｍｇ／ＬのＶＣを添加することによって、血小板保存液の血小板機能維持作用が改善することが示された。
【実施例3】
【0058】
［血小板保存液へのＶＣ及びＶＢ３の添加］
（３－１）血小板保存液の調製
ＶＣ添加保存液にニコチン酸（ニコチン酸注射製剤；トーアエイヨー社製）を添加した溶液を調製した。なお、上述の通り、本願明細書において、「ＶＢ３」はニコチン酸及び／又はニコチンアミドを意味するが、実施例３～５、及び８～１３ではＶＢ３としてニコチン酸が使用されており、実施例６ではＶＢ３としてニコチン酸又はニコチンアミドが使用されている。また、本明細書においては、ＶＣ添加保存液にＶＢ３（ニコチン酸又はニコチンアミド）を添加した溶液を「ＶＣ／ＶＢ３添加保存液」又は「第２世代保存液」ともいう。各保存液における、上記添加剤の最終濃度は以下の表３に示す通りである。また、いずれの保存液も１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．３±０．１となるように調整し、使用時まで１時間以上インキュベートした（遮光下、室温、５％ＣＯ２）。
（３－１）血小板保存液の調製
ＶＣ添加保存液にニコチン酸（ニコチン酸注射製剤；トーアエイヨー社製）を添加した溶液を調製した。なお、上述の通り、本願明細書において、「ＶＢ３」はニコチン酸及び／又はニコチンアミドを意味するが、実施例３～５、及び８～１３ではＶＢ３としてニコチン酸が使用されており、実施例６ではＶＢ３としてニコチン酸又はニコチンアミドが使用されている。また、本明細書においては、ＶＣ添加保存液にＶＢ３（ニコチン酸又はニコチンアミド）を添加した溶液を「ＶＣ／ＶＢ３添加保存液」又は「第２世代保存液」ともいう。各保存液における、上記添加剤の最終濃度は以下の表３に示す通りである。また、いずれの保存液も１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．３±０．１となるように調整し、使用時まで１時間以上インキュベートした（遮光下、室温、５％ＣＯ２）。
【0059】
【表3】
【0060】
（３－２）各保存液を用いた血小板サンプルの作製
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記（３－１）で調製した保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して最長５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（３－３）～（３－５）の実験に供した。
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記（３－１）で調製した保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して最長５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（３－３）～（３－５）の実験に供した。
【0061】
（３－３）血小板サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（３－２）により得られた血小板サンプル（５日間保存後）におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図３に示す。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には６１．４±１．９％、ＶＣ添加保存液を用いた場合には４６．３±０．７％、ＶＣ／ＶＢ３添加保存液を用いた場合には４４．３±０．５％であった。これらの結果から、ＶＣとＶＢ３を組み合わせて使用することによって、ＶＣのみと比較して、血小板の劣化がより強く抑制されることが明らかとなった。
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（３－２）により得られた血小板サンプル（５日間保存後）におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図３に示す。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には６１．４±１．９％、ＶＣ添加保存液を用いた場合には４６．３±０．７％、ＶＣ／ＶＢ３添加保存液を用いた場合には４４．３±０．５％であった。これらの結果から、ＶＣとＶＢ３を組み合わせて使用することによって、ＶＣのみと比較して、血小板の劣化がより強く抑制されることが明らかとなった。
【0062】
（３－４）血小板サンプルの乳酸産生
保存中の血小板製剤では嫌気的代謝により乳酸が産生されており、乳酸濃度の上昇に伴ってｐＨが低下し、結果として血小板の劣化が起こることが知られている。そこで、上記（３－２）により得られた血小板サンプルにおける乳酸濃度を測定し、各保存液による乳酸産生抑制作用を調べた。
具体的には、上記（３－２）により得られた血小板サンプル（５日間保存後）を、１．５ｍＬチューブに入れて遠心した（１２００×ｇ、２２℃、１０分間）。上清を回収して新しいチューブに入れ、測定まで－８０℃で凍結保存した。Ｎ－アッセイＬ ＬＡＣニットーボー（ニットーボーメディカル株式会社製）及び自動分析装置７１８０（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、上記上清中の乳酸濃度を測定した。
結果を図４に示す。サンプル上清中の乳酸濃度は、第１世代保存液を用いた場合には０．３５±０．０１ｇ／Ｌ、ＶＣ添加保存液を用いた場合には０．１６±０．０１ｇ／Ｌ、ＶＣ／ＶＢ３添加保存液を用いた場合には０．１３±０．０１ｇ／Ｌであった。これらの結果から、ＶＣとＶＢ３を組み合わせて使用することによって、ＶＣのみと比較して、保存中の血小板における嫌気的代謝がより強く抑制されることが明らかとなった。
保存中の血小板製剤では嫌気的代謝により乳酸が産生されており、乳酸濃度の上昇に伴ってｐＨが低下し、結果として血小板の劣化が起こることが知られている。そこで、上記（３－２）により得られた血小板サンプルにおける乳酸濃度を測定し、各保存液による乳酸産生抑制作用を調べた。
具体的には、上記（３－２）により得られた血小板サンプル（５日間保存後）を、１．５ｍＬチューブに入れて遠心した（１２００×ｇ、２２℃、１０分間）。上清を回収して新しいチューブに入れ、測定まで－８０℃で凍結保存した。Ｎ－アッセイＬ ＬＡＣニットーボー（ニットーボーメディカル株式会社製）及び自動分析装置７１８０（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、上記上清中の乳酸濃度を測定した。
結果を図４に示す。サンプル上清中の乳酸濃度は、第１世代保存液を用いた場合には０．３５±０．０１ｇ／Ｌ、ＶＣ添加保存液を用いた場合には０．１６±０．０１ｇ／Ｌ、ＶＣ／ＶＢ３添加保存液を用いた場合には０．１３±０．０１ｇ／Ｌであった。これらの結果から、ＶＣとＶＢ３を組み合わせて使用することによって、ＶＣのみと比較して、保存中の血小板における嫌気的代謝がより強く抑制されることが明らかとなった。
【0063】
（３－５）血小板サンプルの血小板回収率
保存時における血小板の活性化は、容器への付着や、凝集塊の形成を引き起こし、血小板回収率低下の原因となると考えられている。そこで、上記（３－２）により得られた、保存前及び保存後の血小板サンプルにおける血小板濃度を測定し、各保存液による回収率の変化を調べた。
具体的には、上記（３－２）で作製した血小板サンプル（保存前、及び５日間保存後）をＴＨＢにより５００倍希釈し、ＴｒｕＣＯＵＮＴチューブ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に分注した。抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）及び抗ＣＤ４２ｂ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）により染色し（遮光下、室温、２０分間）、再度ＴＨＢを加えた後にＦＡＣＳで測定した。ＴｒｕＣＯＵＮＴチューブのビーズカウント値に基づいて、ＣＤ４１＋細胞（血小板）の濃度を算出した。各血小板サンプルについて、保存前の血小板濃度を分母とし、保存後の血小板濃度を分子として、回収率を算出した。
結果を図５に示す。血小板の回収率は、第１世代保存液を用いた場合には１０２．０±４．２％、ＶＣ添加保存液を用いた場合には１０１．１±６．８％、ＶＣ／ＶＢ３添加保存液を用いた場合には９９．９±３．９％であった。これらの結果から、ＶＣ及び／又はＶＢ３を添加しても、回収率に差が認められないことが明らかとなった。
保存時における血小板の活性化は、容器への付着や、凝集塊の形成を引き起こし、血小板回収率低下の原因となると考えられている。そこで、上記（３－２）により得られた、保存前及び保存後の血小板サンプルにおける血小板濃度を測定し、各保存液による回収率の変化を調べた。
具体的には、上記（３－２）で作製した血小板サンプル（保存前、及び５日間保存後）をＴＨＢにより５００倍希釈し、ＴｒｕＣＯＵＮＴチューブ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に分注した。抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）及び抗ＣＤ４２ｂ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）により染色し（遮光下、室温、２０分間）、再度ＴＨＢを加えた後にＦＡＣＳで測定した。ＴｒｕＣＯＵＮＴチューブのビーズカウント値に基づいて、ＣＤ４１＋細胞（血小板）の濃度を算出した。各血小板サンプルについて、保存前の血小板濃度を分母とし、保存後の血小板濃度を分子として、回収率を算出した。
結果を図５に示す。血小板の回収率は、第１世代保存液を用いた場合には１０２．０±４．２％、ＶＣ添加保存液を用いた場合には１０１．１±６．８％、ＶＣ／ＶＢ３添加保存液を用いた場合には９９．９±３．９％であった。これらの結果から、ＶＣ及び／又はＶＢ３を添加しても、回収率に差が認められないことが明らかとなった。
【実施例4】
【0064】
［血小板保存液へのＶＣ及びニコチン酸の添加］
（４－１）血小板保存液の調製と、血小板サンプルの作製
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）を添加し、ＶＣ添加保存液を調製した。また、当該ＶＣ添加保存液にニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を添加し、第２世代保存液を調製した。各溶液のｐＨは７．３±０．１となるように調整した。以下の表４に、本実施例で使用した第２世代保存液の組成を示す。
（４－１）血小板保存液の調製と、血小板サンプルの作製
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）を添加し、ＶＣ添加保存液を調製した。また、当該ＶＣ添加保存液にニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を添加し、第２世代保存液を調製した。各溶液のｐＨは７．３±０．１となるように調整した。以下の表４に、本実施例で使用した第２世代保存液の組成を示す。
【0065】
【表4】
【0066】
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液（第１世代保存液、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液）を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５若しくは１０日間水平振盪保存（遮光下、２２℃、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（４－２）～（４－４）の実験に供した。
【0067】
（４－２）血小板サンプルの乳酸濃度及びｐＨ
上記（２－４）でも述べたように、保存中の血小板製剤では嫌気的代謝により乳酸が産生されており、それがｐＨの低下の原因となることが知られている。本実験では、上記（４－１）により得られた血小板サンプルにおける乳酸濃度及びｐＨを測定し、各保存液による乳酸産生抑制作用を調べた。
具体的には、上記（４－１）により得られた血小板サンプル（保存前、５日間保存後、及び１０日間保存後）を１．５ｍＬチューブに入れ、細胞培養用分析装置ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）により、乳酸濃度及びｐＨを測定した。
結果を図６に示す。図６の左グラフに示すように、乳酸濃度はいずれの保存液を用いた場合でも経時的に上昇していたが、第２世代保存液を用いたサンプルでは上昇の程度が最も低かった。また、図６の右グラフに示すように、ｐＨはいずれの保存液を用いた場合でも経時的に低下していたが、第２世代保存液を用いたサンプルでは低下の程度が最も低く、１０日間保存後でも中性に保たれていた。
上記（２－４）でも述べたように、保存中の血小板製剤では嫌気的代謝により乳酸が産生されており、それがｐＨの低下の原因となることが知られている。本実験では、上記（４－１）により得られた血小板サンプルにおける乳酸濃度及びｐＨを測定し、各保存液による乳酸産生抑制作用を調べた。
具体的には、上記（４－１）により得られた血小板サンプル（保存前、５日間保存後、及び１０日間保存後）を１．５ｍＬチューブに入れ、細胞培養用分析装置ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）により、乳酸濃度及びｐＨを測定した。
結果を図６に示す。図６の左グラフに示すように、乳酸濃度はいずれの保存液を用いた場合でも経時的に上昇していたが、第２世代保存液を用いたサンプルでは上昇の程度が最も低かった。また、図６の右グラフに示すように、ｐＨはいずれの保存液を用いた場合でも経時的に低下していたが、第２世代保存液を用いたサンプルでは低下の程度が最も低く、１０日間保存後でも中性に保たれていた。
【0068】
（４－３）血小板サンプルの無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率
実施例２の（２－４）でも述べたように、Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎは血小板の劣化マーカーとして知られており、また、ＡＴＲ（ＡＤＰ／ＴＲＡＰ－６）刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎは血小板の反応性マーカーとして知られている。そこで本実験では、実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（４－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図７の左に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図７の右にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）が１８．０％であったのに対し、５日間保存後（Ｄａｙ５）では３３．０％、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では３１．１％と上昇していた。一方、ＶＣ添加保存液を用いた場合、５及び１０日間保存後のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率はいずれも第１世代保存液を用いた場合と比較して低く、それぞれ２６．２％（Ｄａｙ５）及び２４．４％（Ｄａｙ１０）であった。また、第２世代保存液を用いた場合、５及び１０日間保存後のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、ＶＣ添加保存液を用いた場合よりもさらに低く、それぞれ２４．２％（Ｄａｙ５）及び１９．３％（Ｄａｙ１０）であった。以上の結果から、第２世代保存液を使用することによって、１０日間保存後でも血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）では４３．４％であったのに対し、５日間保存後（Ｄａｙ５）では３４．５％、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では５．９％と急激に低下していた。一方、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を用いた場合、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、５日間保存後（Ｄａｙ５）では第１世代保存液を用いた場合と同程度（それぞれ、３５．９％及び３５．３％）であったが、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では第１世代保存液よりも顕著に高い値を示した（それぞれ、１９．４％及び１９．９％）。以上の結果から、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を使用することによって、１０日間保存後でも血小板の反応性が維持されることが明らかとなった。
実施例２の（２－４）でも述べたように、Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎは血小板の劣化マーカーとして知られており、また、ＡＴＲ（ＡＤＰ／ＴＲＡＰ－６）刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎは血小板の反応性マーカーとして知られている。そこで本実験では、実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（４－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図７の左に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図７の右にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）が１８．０％であったのに対し、５日間保存後（Ｄａｙ５）では３３．０％、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では３１．１％と上昇していた。一方、ＶＣ添加保存液を用いた場合、５及び１０日間保存後のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率はいずれも第１世代保存液を用いた場合と比較して低く、それぞれ２６．２％（Ｄａｙ５）及び２４．４％（Ｄａｙ１０）であった。また、第２世代保存液を用いた場合、５及び１０日間保存後のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、ＶＣ添加保存液を用いた場合よりもさらに低く、それぞれ２４．２％（Ｄａｙ５）及び１９．３％（Ｄａｙ１０）であった。以上の結果から、第２世代保存液を使用することによって、１０日間保存後でも血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）では４３．４％であったのに対し、５日間保存後（Ｄａｙ５）では３４．５％、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では５．９％と急激に低下していた。一方、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を用いた場合、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、５日間保存後（Ｄａｙ５）では第１世代保存液を用いた場合と同程度（それぞれ、３５．９％及び３５．３％）であったが、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では第１世代保存液よりも顕著に高い値を示した（それぞれ、１９．４％及び１９．９％）。以上の結果から、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を使用することによって、１０日間保存後でも血小板の反応性が維持されることが明らかとなった。
【0069】
（４－４）血小板サンプルの血小板回収率
上記（３－５）に記載の方法によって、上記（４－１）により得られた血小板サンプルにおける血小板濃度及び回収率を測定した。
結果を図８に示す。第１世代保存液を用いた場合の血小板回収率は、５日間保存後（Ｄａｙ５）では８５．４％、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では８６．８％であった。一方、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を用いた場合には、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）でも血小板回収率が９０％以上であった（それぞれ、９０．０％及び９１．４％）。これらの結果は、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を使用することによって、保存時の血小板活性化が抑制されるという上記（４－３）の結果と一致するものである。
上記（３－５）に記載の方法によって、上記（４－１）により得られた血小板サンプルにおける血小板濃度及び回収率を測定した。
結果を図８に示す。第１世代保存液を用いた場合の血小板回収率は、５日間保存後（Ｄａｙ５）では８５．４％、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）では８６．８％であった。一方、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を用いた場合には、１０日間保存後（Ｄａｙ１０）でも血小板回収率が９０％以上であった（それぞれ、９０．０％及び９１．４％）。これらの結果は、ＶＣ添加保存液、又は第２世代保存液を使用することによって、保存時の血小板活性化が抑制されるという上記（４－３）の結果と一致するものである。
【実施例5】
【0070】
［血小板サンプルの凝集能］
（５－１）保存液及び血小板サンプルの調製
実施例３の（３－１）に記載の方法によって、第１世代保存液及び第２世代保存液を調製した。実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５若しくは１０日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ、）した後に、以下の（５－２）の実験に供した。
（５－１）保存液及び血小板サンプルの調製
実施例３の（３－１）に記載の方法によって、第１世代保存液及び第２世代保存液を調製した。実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５若しくは１０日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ、）した後に、以下の（５－２）の実験に供した。
【0071】
（５－２）血小板サンプルの凝集能測定
上記（５－１）により得られた血小板サンプルを遠心して（１２００×ｇ、室温、１０分間）、上清を除去した。５％ＡＣＤ－Ａを含む重炭酸リンゲル液を加えて、細胞濃度が１．０×１０９ｐｌｔｓ／ｍｌとなるように懸濁した。得られた懸濁液をヒト血漿／ＣａＣｌ２溶液（コスモ・バイオ社製）により希釈し、以下の表５に示す刺激剤を添加して刺激した。刺激後の各サンプルの凝集率を、血小板凝集能測定装置ＰＲＰ３１３Ｍ（タイヨウ社製）により測定した。
上記（５－１）により得られた血小板サンプルを遠心して（１２００×ｇ、室温、１０分間）、上清を除去した。５％ＡＣＤ－Ａを含む重炭酸リンゲル液を加えて、細胞濃度が１．０×１０９ｐｌｔｓ／ｍｌとなるように懸濁した。得られた懸濁液をヒト血漿／ＣａＣｌ２溶液（コスモ・バイオ社製）により希釈し、以下の表５に示す刺激剤を添加して刺激した。刺激後の各サンプルの凝集率を、血小板凝集能測定装置ＰＲＰ３１３Ｍ（タイヨウ社製）により測定した。
【0072】
【表5】
【0073】
図９～１２に、刺激剤としてＴＲＡＰ－６、Ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＡＤＰ、及びＣｏｌｌａｇｅｎ／ＡＤＰを用いた結果をそれぞれ示す。第１世代保存液を用いた血小板サンプルの最大凝集率は、いずれの刺激剤を用いた場合でも、５～１０日間の保存中に大幅に低下することが明らかとなった（図９～１２の「従来保存液（Ｄａｙ１０）」）。一方、このような凝集率の急激な低下は、第２世代保存液を用いた血小板サンプルでは認められなかった（図９～１２の「新規保存液（Ｄａｙ１０）」）。以上の結果から、第２世代保存液を使用することによって、保存中の血小板の凝集能（止血能）が１０日以上維持できることが明らかとなった。
【実施例6】
【0074】
［保存液へのニコチン酸又はニコチンアミドの添加］
（６－１）保存液及び血小板サンプルの調製
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、ＶＣ（１０００ｍｇ／Ｌ）と、ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ；富士フイルム和光純薬社製）又はニコチンアミド（４００ｍｇ／Ｌ；富士フイルム和光純薬社製）とを添加し、１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．３±０．１となるように調整した。以下、第１世代保存液にＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液を「第２世代保存液（ニコチン酸）」と、第１世代保存液にＶＣ及びニコチンアミドを添加した保存液を「第２世代保存液（ニコチンアミド）」と、それぞれ称する場合がある。
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（６－２）及び（６－３）の実験に供した。
（６－１）保存液及び血小板サンプルの調製
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、ＶＣ（１０００ｍｇ／Ｌ）と、ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ；富士フイルム和光純薬社製）又はニコチンアミド（４００ｍｇ／Ｌ；富士フイルム和光純薬社製）とを添加し、１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．３±０．１となるように調整した。以下、第１世代保存液にＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液を「第２世代保存液（ニコチン酸）」と、第１世代保存液にＶＣ及びニコチンアミドを添加した保存液を「第２世代保存液（ニコチンアミド）」と、それぞれ称する場合がある。
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（６－２）及び（６－３）の実験に供した。
【0075】
（６－２）血小板サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率の変化
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（６－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図１３の上段に示す。図中、「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「第１世代」、「第２世代（ニコチン酸）」、「第２世代（ニコチンアミド）」は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、ニコチン酸を添加した保存液では３８．２±０．３％であり、ニコチンアミドを添加した保存液では３８．５±０．３％であった。これらの値はいずれも、第１世代保存液を用いた場合（５３．１±０．４％）よりも低かった。これらの結果から、広くビタミンＢ３（ニコチン酸及び／又はニコチンアミド）でも、保存中の血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（６－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図１３の上段に示す。図中、「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「第１世代」、「第２世代（ニコチン酸）」、「第２世代（ニコチンアミド）」は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、ニコチン酸を添加した保存液では３８．２±０．３％であり、ニコチンアミドを添加した保存液では３８．５±０．３％であった。これらの値はいずれも、第１世代保存液を用いた場合（５３．１±０．４％）よりも低かった。これらの結果から、広くビタミンＢ３（ニコチン酸及び／又はニコチンアミド）でも、保存中の血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
【0076】
（６－３）血小板サンプルの無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす各保存液の影響
実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（６－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図１３の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図１３の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）の１１．６％から５日間保存後（Ｄａｙ５）の２８．３±０．５％へと上昇していた。一方、ニコチン酸又はニコチンアミドを添加した第２世代保存液を用いた場合には、５日間保存後でも９．４±０．２％～１０．６±０．２％と低く抑えられていた。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には３３．９±２．４％であったが、ニコチン酸又はニコチンアミドを添加した第２世代保存液を用いた場合には４１．６±０．８％～４１．２±１．９％であった。これらの結果から、ニコチン酸又はニコチンアミドにより保存中の血小板の反応性が維持されることが明らかとなった。
実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（６－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図１３の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図１３の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）の１１．６％から５日間保存後（Ｄａｙ５）の２８．３±０．５％へと上昇していた。一方、ニコチン酸又はニコチンアミドを添加した第２世代保存液を用いた場合には、５日間保存後でも９．４±０．２％～１０．６±０．２％と低く抑えられていた。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には３３．９±２．４％であったが、ニコチン酸又はニコチンアミドを添加した第２世代保存液を用いた場合には４１．６±０．８％～４１．２±１．９％であった。これらの結果から、ニコチン酸又はニコチンアミドにより保存中の血小板の反応性が維持されることが明らかとなった。
【実施例7】
【0077】
［保存液へのＶＣ単独添加］
（７－１）保存液及び血小板サンプルの調製
上記実施例２～６では、「ＶＣ」として沢井製薬社製のＶＣ製剤を用いた。当該ＶＣ製剤には、ピロ亜硫酸ナトリウム、Ｌ－システイン塩酸塩一水和物及びベンジルアルコールからなる添加物が含まれていることから、これら添加物が実験結果に影響していないかを、以下の実験により確認した。
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、ＶＣ試薬（添加剤を含まないＶＣ；１０００ｍｇ／Ｌ、富士フイルム和光純薬社製）を添加し、ｐＨ７．３±０．１となるように調整した。以下、かかる保存液を「第１世代保存液（ＶＣ試薬）」と称する場合がある。実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（７－２）及び（７－３）の実験に供した。
（７－１）保存液及び血小板サンプルの調製
上記実施例２～６では、「ＶＣ」として沢井製薬社製のＶＣ製剤を用いた。当該ＶＣ製剤には、ピロ亜硫酸ナトリウム、Ｌ－システイン塩酸塩一水和物及びベンジルアルコールからなる添加物が含まれていることから、これら添加物が実験結果に影響していないかを、以下の実験により確認した。
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、ＶＣ試薬（添加剤を含まないＶＣ；１０００ｍｇ／Ｌ、富士フイルム和光純薬社製）を添加し、ｐＨ７．３±０．１となるように調整した。以下、かかる保存液を「第１世代保存液（ＶＣ試薬）」と称する場合がある。実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（７－２）及び（７－３）の実験に供した。
【0078】
（７－２）血小板サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（７－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図１４の上段に示す（Ｄａｙ１は保存前のサンプルを、第１世代及び第１世代ＶＣ試薬は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す）。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合（５３．１±０．４％）よりも、第１世代ＶＣ試薬を用いた場合（３８．９±０．４％）の方が低かった。これらの結果から、ＶＣのみの添加（ＶＢ３を含まない）により、保存中のｉＰＳ由来血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（７－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図１４の上段に示す（Ｄａｙ１は保存前のサンプルを、第１世代及び第１世代ＶＣ試薬は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す）。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合（５３．１±０．４％）よりも、第１世代ＶＣ試薬を用いた場合（３８．９±０．４％）の方が低かった。これらの結果から、ＶＣのみの添加（ＶＢ３を含まない）により、保存中のｉＰＳ由来血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
【0079】
（７－３）血小板サンプルの無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率
実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（７－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図１４の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図１４の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合（２８．３±０．５％）よりも、第１世代ＶＣ試薬を用いた場合（９．５±０．４％）の方が低かった。これらの結果から、ＶＣのみの添加により、保存中のｉＰＳ由来血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合（３３．９±２．４％）よりも、第１世代ＶＣ試薬を用いた場合（３８．２±１．６％）の方が高かった。これらの結果から、ＶＣ試薬のみの添加により、保存中のｉＰＳ由来血小板の反応性が維持されることが明らかとなった。すなわち、ＶＣの添加効果は、沢井製薬社製のＶＣ製剤に含まれる添加剤によるものではないことが明らかになった。
実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（７－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図１４の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図１４の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合（２８．３±０．５％）よりも、第１世代ＶＣ試薬を用いた場合（９．５±０．４％）の方が低かった。これらの結果から、ＶＣのみの添加により、保存中のｉＰＳ由来血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合（３３．９±２．４％）よりも、第１世代ＶＣ試薬を用いた場合（３８．２±１．６％）の方が高かった。これらの結果から、ＶＣ試薬のみの添加により、保存中のｉＰＳ由来血小板の反応性が維持されることが明らかとなった。すなわち、ＶＣの添加効果は、沢井製薬社製のＶＣ製剤に含まれる添加剤によるものではないことが明らかになった。
【実施例8】
【0080】
［日赤血小板洗浄液との比較］
（８－１）保存液及び血小板サンプルの調製
ビカネイト輸液に、以下の表６に示す添加剤を添加して、第２世代保存液を調製した。また、既知の血小板保存液（日本赤十字社、照射洗浄血小板－ＬＲ「日赤」の添付文書、２０１６年３月、及び、Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol. 59.No. 3 59（3）：492―498, 2013）と同じ組成の溶液を調製した。本明細書においては、当該既知の保存液を「日赤血小板洗浄液」ともいう。いずれの保存液も１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．３±０．１となるように調整し、使用時まで１時間以上インキュベートした（遮光下、室温、５％ＣＯ２）。実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（８－２）及び（８－３）の実験に供した。
（８－１）保存液及び血小板サンプルの調製
ビカネイト輸液に、以下の表６に示す添加剤を添加して、第２世代保存液を調製した。また、既知の血小板保存液（日本赤十字社、照射洗浄血小板－ＬＲ「日赤」の添付文書、２０１６年３月、及び、Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol. 59.No. 3 59（3）：492―498, 2013）と同じ組成の溶液を調製した。本明細書においては、当該既知の保存液を「日赤血小板洗浄液」ともいう。いずれの保存液も１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．３±０．１となるように調整し、使用時まで１時間以上インキュベートした（遮光下、室温、５％ＣＯ２）。実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（８－２）及び（８－３）の実験に供した。
【0081】
【表6】
【0082】
（８－２）血小板サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（８－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図１５上段の上段に示す（「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「Ｄａｙ５」は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す）。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性率は、日赤血小板洗浄液を用いた場合（７３．９％）よりも、第２世代保存液を用いた場合（４９．３％）の方が低かった。これらの結果から、第２世代保存液により、保存中のｉＰＳ由来血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（８－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図１５上段の上段に示す（「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「Ｄａｙ５」は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す）。血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性率は、日赤血小板洗浄液を用いた場合（７３．９％）よりも、第２世代保存液を用いた場合（４９．３％）の方が低かった。これらの結果から、第２世代保存液により、保存中のｉＰＳ由来血小板の劣化が抑制されることが明らかとなった。
【0083】
（８－３）血小板サンプルの無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率
実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（８－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図１５の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図１５の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、日赤血小板洗浄液を用いた場合（３０．４％）よりも、第２世代保存液を用いた場合（１６．５％）の方が低かった。これらの結果から、ｉＰＳ由来血小板の保存において第２世代保存液は、日赤血小板洗浄液により優れた劣化抑制効果を奏することが明らかとなった。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、日赤血小板洗浄液を用いた場合（９．８％）よりも、第２世代保存液を用いた場合（２４．８％）の方が高かった。これらの結果から、ｉＰＳ由来血小板の保存において第２世代保存液は、日赤血小板洗浄液により優れた機能維持効果を奏することが明らかとなった。
実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（８－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図１５の中段に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図１５の下段にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、日赤血小板洗浄液を用いた場合（３０．４％）よりも、第２世代保存液を用いた場合（１６．５％）の方が低かった。これらの結果から、ｉＰＳ由来血小板の保存において第２世代保存液は、日赤血小板洗浄液により優れた劣化抑制効果を奏することが明らかとなった。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、日赤血小板洗浄液を用いた場合（９．８％）よりも、第２世代保存液を用いた場合（２４．８％）の方が高かった。これらの結果から、ｉＰＳ由来血小板の保存において第２世代保存液は、日赤血小板洗浄液により優れた機能維持効果を奏することが明らかとなった。
【実施例9】
【0084】
［血小板減少症モデルマウスを用いた止血試験］
（９－１）血小板サンプルの調製
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、第２世代保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ、１０日間）した後に、以下の（９－２）の実験に供した。
（９－１）血小板サンプルの調製
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、第２世代保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．０×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ、１０日間）した後に、以下の（９－２）の実験に供した。
【0085】
（９－２）止血試験
血小板減少症モデルＮＯＧマウスの尾静脈内に、上記（９－１）により得られた血小板サンプルを投与した（マウス１匹あたり２００μＬ（２×１０８ｐｌｔｓ））。投与１０分後、注射針を用いて腹側の尾動脈に切創を作製した。切創は１個体あたり１か所とした。切創からの出血を確認した後に、切創箇所を含む尾先端部を３７℃の生理食塩水に漬けて、止血までの時間を測定した。測定時間は最大６００秒とした。また、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として、第２世代保存液のみ（血小板を含まない）を用いて同様の試験を行った。
結果を図１６に示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では全てのマウスにおいて、６００秒間以内での止血は認められなかった。一方、血小板投与群では、止血までの時間は平均で３９１秒であり、最も短い個体では１３０秒であった。これらの結果から、本発明の第２世代保存液により保存されたｉＰＳ細胞由来血小板が止血効果を有することが明らかとなった。
血小板減少症モデルＮＯＧマウスの尾静脈内に、上記（９－１）により得られた血小板サンプルを投与した（マウス１匹あたり２００μＬ（２×１０８ｐｌｔｓ））。投与１０分後、注射針を用いて腹側の尾動脈に切創を作製した。切創は１個体あたり１か所とした。切創からの出血を確認した後に、切創箇所を含む尾先端部を３７℃の生理食塩水に漬けて、止血までの時間を測定した。測定時間は最大６００秒とした。また、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として、第２世代保存液のみ（血小板を含まない）を用いて同様の試験を行った。
結果を図１６に示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では全てのマウスにおいて、６００秒間以内での止血は認められなかった。一方、血小板投与群では、止血までの時間は平均で３９１秒であり、最も短い個体では１３０秒であった。これらの結果から、本発明の第２世代保存液により保存されたｉＰＳ細胞由来血小板が止血効果を有することが明らかとなった。
【実施例10】
【0086】
［ヒト間葉系幹細胞の保存］
（１０－１）間葉系幹細胞保存液の調製
乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に、３％トレハロース及び５％デキストランを添加した（以下、かかる溶液を「ＣＳＰ－０１溶液」と称する場合がある。特開２０１２－１１５２５３、及びＷＯ２０１４／２０８０５３参照）。上記ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、間葉系幹細胞保存液を調製した。また、ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ及びニコチン酸に代えて蒸留水（大塚蒸留液；大塚製薬工場社製）を加えたコントロール保存液を調製した。
（１０－１）間葉系幹細胞保存液の調製
乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に、３％トレハロース及び５％デキストランを添加した（以下、かかる溶液を「ＣＳＰ－０１溶液」と称する場合がある。特開２０１２－１１５２５３、及びＷＯ２０１４／２０８０５３参照）。上記ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、間葉系幹細胞保存液を調製した。また、ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ及びニコチン酸に代えて蒸留水（大塚蒸留液；大塚製薬工場社製）を加えたコントロール保存液を調製した。
【0087】
（１０－２）間葉系幹細胞の保存
上記（１０－１）により調製した保存液を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５×１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で２４、４８、９６、及び１６８時静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）を以下の式１及び２を用いて算出した。
上記（１０－１）により調製した保存液を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５×１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で２４、４８、９６、及び１６８時静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）を以下の式１及び２を用いて算出した。
【0088】
［式１］
細胞生存率（％）＝（全細胞数－死細胞数）／全細胞数×１００
細胞生存率（％）＝（全細胞数－死細胞数）／全細胞数×１００
【0089】
［式２］
生細胞回収率（％）＝各時点の生存細胞数／懸濁直後（保存前）の生存細胞数×１００
生細胞回収率（％）＝各時点の生存細胞数／懸濁直後（保存前）の生存細胞数×１００
【0090】
結果を図１７に示す。コントロール保存液を用いた場合、細胞生存率及び生細胞回収率は４８時間保存後に急激に低下することが明らかとなった。一方、ＶＣ及びニコチン酸添加保存液を用いた場合には、細胞生存率及び生細胞回収率の大幅な低下は認められず、１６８時間後でも保存前と同程度で維持されることが明らかとなった。これらの結果から、ＶＣ及びニコチン酸は、間葉系幹細胞の保存においても優れた効果を奏することが示された。
【実施例11】
【0091】
［ｉＰＳ細胞由来巨核球の保存］
（１１－１）ｉＰＳ細胞由来巨核球の調製
実施例１により得られた培養物に含まれる血小板の濃度を、ＦＡＣＳにより測定した。必要量の培養物を分取してＡＣＤ－Ａ液（１０ｖ／ｖ％）及びＰＥＧ１（終濃度２μＭ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を添加し、１２分間の遠心分離（１２００×ｇ、２２℃、ブレーキ最小）を行った。上清を除去した後に、ペレットに第１世代又は第２世代保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５又は１０日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（１１－２）の実験に供した。
（１１－１）ｉＰＳ細胞由来巨核球の調製
実施例１により得られた培養物に含まれる血小板の濃度を、ＦＡＣＳにより測定した。必要量の培養物を分取してＡＣＤ－Ａ液（１０ｖ／ｖ％）及びＰＥＧ１（終濃度２μＭ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を添加し、１２分間の遠心分離（１２００×ｇ、２２℃、ブレーキ最小）を行った。上清を除去した後に、ペレットに第１世代又は第２世代保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約１．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は血液保存バッグに充填して５又は１０日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（１１－２）の実験に供した。
【0092】
（１１－２）巨核球サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、アポトーシス細胞における細胞膜の変化（フォスファチジルセリンの細胞膜外側への表出）を検出するプローブとしても知られている。そこで、上記（１１－１）により得られた巨核球サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率を測定し、各保存液による巨核球のアポトーシス抑制効果を調べた。
具体的には、上記（１１－１）により得られた巨核球サンプル（巨核球及び血小板を含む培養物）をＡｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で５００倍希釈し、３本の遠心管に分注した（それぞれ、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、及び無刺激サンプル）。ネガティブコントロールサンプルにはＥＤＴＡを、ポジティブコントロールサンプルにはＩｏｎｏｍｙｃｉｎをそれぞれ添加した後に、全てのサンプルを抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により染色した（遮光下、室温、２０分間）。染色後に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを加えて速やかにＦＡＣＳで測定した。得られたＦＳＣ（前方散乱光）及びＳＳＣ（側方散乱光）の値に基づき血小板と巨核球とを区分した。そして、ネガティブコントロールにおけるｉＰＳ血小板（ＣＤ４１＋分画）中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を１．０±０．１％とし、無刺激サンプルにおける巨核球のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率を算出した。
結果を図１８に示す（「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「Ｄａｙ５」は５日間保存後のサンプルを、「Ｄａｙ１０」は１０日間保存後のサンプルをそれぞれ示す）。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率は、第１世代保存液を用いたサンプルでも、第２世代保存液を用いたサンプルでも、経時的に低下した。しかし、第２世代保存液を用いた場合には、第１世代保存液を用いた場合よりも、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率の低下が抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、第２世代保存液を用いたサンプルにおいては、アポトーシスを起こしていない、細胞膜が安定した生細胞がより高い割合で含まれることが示された。したがって、本実施例により、第２世代保存液がｉＰＳ細胞由来巨核球の保存にも有効であることが示された。
Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、アポトーシス細胞における細胞膜の変化（フォスファチジルセリンの細胞膜外側への表出）を検出するプローブとしても知られている。そこで、上記（１１－１）により得られた巨核球サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率を測定し、各保存液による巨核球のアポトーシス抑制効果を調べた。
具体的には、上記（１１－１）により得られた巨核球サンプル（巨核球及び血小板を含む培養物）をＡｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で５００倍希釈し、３本の遠心管に分注した（それぞれ、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、及び無刺激サンプル）。ネガティブコントロールサンプルにはＥＤＴＡを、ポジティブコントロールサンプルにはＩｏｎｏｍｙｃｉｎをそれぞれ添加した後に、全てのサンプルを抗ＣＤ４１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により染色した（遮光下、室温、２０分間）。染色後に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを加えて速やかにＦＡＣＳで測定した。得られたＦＳＣ（前方散乱光）及びＳＳＣ（側方散乱光）の値に基づき血小板と巨核球とを区分した。そして、ネガティブコントロールにおけるｉＰＳ血小板（ＣＤ４１＋分画）中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率を１．０±０．１％とし、無刺激サンプルにおける巨核球のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率を算出した。
結果を図１８に示す（「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「Ｄａｙ５」は５日間保存後のサンプルを、「Ｄａｙ１０」は１０日間保存後のサンプルをそれぞれ示す）。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率は、第１世代保存液を用いたサンプルでも、第２世代保存液を用いたサンプルでも、経時的に低下した。しかし、第２世代保存液を用いた場合には、第１世代保存液を用いた場合よりも、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陰性率の低下が抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、第２世代保存液を用いたサンプルにおいては、アポトーシスを起こしていない、細胞膜が安定した生細胞がより高い割合で含まれることが示された。したがって、本実施例により、第２世代保存液がｉＰＳ細胞由来巨核球の保存にも有効であることが示された。
【実施例12】
【0093】
［Ｔ細胞の保存］
（１２－１）Ｔ細胞保存液の調製
乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に３％トレハロースを添加した（以下、かかる溶液を「ＣＳＰ－１１溶液」と称する場合がある）。上記ＣＳＰ－１１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及び／又はニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、以下の４種類のＴ細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－１１
ＣＳＰ－１１＋ＶＣ
ＣＳＰ－１１＋ニコチン酸
ＣＳＰ－１１＋ＶＣ＋ニコチン酸
（１２－１）Ｔ細胞保存液の調製
乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に３％トレハロースを添加した（以下、かかる溶液を「ＣＳＰ－１１溶液」と称する場合がある）。上記ＣＳＰ－１１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及び／又はニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、以下の４種類のＴ細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－１１
ＣＳＰ－１１＋ＶＣ
ＣＳＰ－１１＋ニコチン酸
ＣＳＰ－１１＋ＶＣ＋ニコチン酸
【0094】
（１２－２）Ｔ細胞の保存
市販の凍結ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ベリタス社製）を融解して、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Ｌｏｎｚａ社製）で洗浄した後に、約１時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。必要量のＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、ＴＬＹ ＣＵＬＴＵＲＥキット２５（ＧＣリンフォテック社製）を用いて細胞を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して増殖させた（Ｔ細胞濃度：約１．１×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍｌ）。拡大培養開始から７日後に、ＣＳＰ－１１溶液で細胞を洗浄して、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注し、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、上記（１２－１）で調製した保存液を加えて懸濁した（Ｔ細胞濃度：約５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ）。各ステムフルチューブから２０μＬの細胞懸濁液を分取し、２０μＬトリパンブルー（ｇｉｂｃｏ社製）を混合し、ワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて生存率を測定した（１ヵ所の細胞計数部の四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数及び死細胞数を計測した）。また、上記細胞懸濁液を５℃で４８時間保存した後に、同様に生存率を測定した。
市販の凍結ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ベリタス社製）を融解して、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Ｌｏｎｚａ社製）で洗浄した後に、約１時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。必要量のＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、ＴＬＹ ＣＵＬＴＵＲＥキット２５（ＧＣリンフォテック社製）を用いて細胞を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して増殖させた（Ｔ細胞濃度：約１．１×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍｌ）。拡大培養開始から７日後に、ＣＳＰ－１１溶液で細胞を洗浄して、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注し、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、上記（１２－１）で調製した保存液を加えて懸濁した（Ｔ細胞濃度：約５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ）。各ステムフルチューブから２０μＬの細胞懸濁液を分取し、２０μＬトリパンブルー（ｇｉｂｃｏ社製）を混合し、ワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて生存率を測定した（１ヵ所の細胞計数部の四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数及び死細胞数を計測した）。また、上記細胞懸濁液を５℃で４８時間保存した後に、同様に生存率を測定した。
【0095】
結果を図１９に示す。保存前の生存率は、各保存液の間で差が認められなかった（図１９）。一方、４８時間保存後では、ＶＣ単独、又はＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液を用いた方が、生存率が有意に高いことが明らかとなった（図１９）。さらに、ＶＣ単独と比較して、ＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液を用いた方が、有意に高い生存率を示した。したがって、本発明の保存液はＴ細胞の冷蔵保存にも有効であることが示された。
【実施例13】
【0096】
［Ｔ細胞の保存］
（１３－１）Ｔ細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）、ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）、及び／又はグルコース（８０ｍｇ／ｄＬ、大塚製薬工場社製）を加え、以下の４種類のＴ細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－０１
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸
ＣＳＰ－０１＋グルコース
ＣＳＰ－０１＋グルコース＋ＶＣ＋ニコチン酸
（１３－１）Ｔ細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）、ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）、及び／又はグルコース（８０ｍｇ／ｄＬ、大塚製薬工場社製）を加え、以下の４種類のＴ細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－０１
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸
ＣＳＰ－０１＋グルコース
ＣＳＰ－０１＋グルコース＋ＶＣ＋ニコチン酸
【0097】
（１３－２）Ｔ細胞の保存
市販の凍結ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ベリタス社製）を融解して、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Ｌｏｎｚａ社製）で洗浄した後に、約６時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。必要量のＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、ＴＬＹ ＣＵＬＴＵＲＥキット２５（ＧＣリンフォテック社製）を用いて細胞を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して増殖させた（Ｔ細胞濃度：約１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍｌ）。拡大培養開始から６日後に、３％トレハロース含有乳酸リンゲル液で細胞を洗浄して、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注し、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、上記（１２－１）で調製した保存液を加えて懸濁した（Ｔ細胞濃度：約５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ）。各ステムフルチューブから２０μＬの細胞懸濁液を分取し、２０μＬトリパンブルー（ｇｉｂｃｏ社製）を混合し、ワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて生存率を測定した（１ヵ所の細胞計数部の四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数及び死細胞数を計測した）。また、上記細胞懸濁液を５℃で２４又は４８時間保存した後に、同様に生存率を測定した。得られた各時点での生存率から、以下の式３を用いて生細胞回収率を算出した。
市販の凍結ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ベリタス社製）を融解して、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Ｌｏｎｚａ社製）で洗浄した後に、約６時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。必要量のＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、ＴＬＹ ＣＵＬＴＵＲＥキット２５（ＧＣリンフォテック社製）を用いて細胞を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して増殖させた（Ｔ細胞濃度：約１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍｌ）。拡大培養開始から６日後に、３％トレハロース含有乳酸リンゲル液で細胞を洗浄して、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注し、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、上記（１２－１）で調製した保存液を加えて懸濁した（Ｔ細胞濃度：約５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ）。各ステムフルチューブから２０μＬの細胞懸濁液を分取し、２０μＬトリパンブルー（ｇｉｂｃｏ社製）を混合し、ワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて生存率を測定した（１ヵ所の細胞計数部の四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数及び死細胞数を計測した）。また、上記細胞懸濁液を５℃で２４又は４８時間保存した後に、同様に生存率を測定した。得られた各時点での生存率から、以下の式３を用いて生細胞回収率を算出した。
【0098】
［式３］
生細胞回収率（％）＝（保存後の生細胞数）÷（保存前の生細胞数）×１００
生細胞回収率（％）＝（保存後の生細胞数）÷（保存前の生細胞数）×１００
【0099】
結果を図２０に示す。保存前の生存率は、各保存液の間で差が認められなかった（図２０の左グラフ）。一方、２４及び４８時間保存後では、ＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液を用いた方が、生存率及び生細胞回収率が高いことが明らかとなった（図２０の中央及び右グラフ）。したがって、本発明の保存液はＴ細胞の冷蔵保存にも有効であることが示された。また、ＶＣ及びニコチン酸に加え、グルコースを添加することにより、生存率および生細胞回収率が向上する傾向にあることが明らかとなった。
【実施例14】
【0100】
［ＶＢ２による阻害作用］
（１４－１）水溶性ビタミン群を添加した保存液の調製
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、水溶性ビタミン群（Ｂ１、ＶＢ２、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ６、ＶＢ７、ＶＢ９、ＶＢ１２、及びＶＣ）を添加した（以下、かかる保存液を「第１世代＋水溶性ビタミン」と称する場合がある）。また、第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、上記水溶性ビタミン群からＶＢ２を除いた群（Ｂ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ６、ＶＢ７、ＶＢ９、ＶＢ１２、及びＶＣ）を添加した（以下、かかる保存液を「第１世代＋水溶性ビタミン（ＶＢ２除く）」と称する場合がある）。いずれの保存液も、１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．３±０．１となるように調整した。
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（１３－２）及び（１３－３）の実験に供した。
（１４－１）水溶性ビタミン群を添加した保存液の調製
第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、水溶性ビタミン群（Ｂ１、ＶＢ２、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ６、ＶＢ７、ＶＢ９、ＶＢ１２、及びＶＣ）を添加した（以下、かかる保存液を「第１世代＋水溶性ビタミン」と称する場合がある）。また、第１世代保存液（２０％のＡＣＤ－Ａ液を含む）に、上記水溶性ビタミン群からＶＢ２を除いた群（Ｂ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ６、ＶＢ７、ＶＢ９、ＶＢ１２、及びＶＣ）を添加した（以下、かかる保存液を「第１世代＋水溶性ビタミン（ＶＢ２除く）」と称する場合がある）。いずれの保存液も、１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．３±０．１となるように調整した。
実施例１に記載の方法によって作製したｉＰＳ細胞由来血小板製剤に、上記保存液を加え、均一な懸濁液となるように穏やかに懸濁した（血小板濃度：約０．３×１０９ｐｌｔｓ/ｍＬ）。各懸濁液を直ちに、又は２４ウェルプレートに播種して５日間水平振盪保存（遮光下、２２度、５０ｒｐｍ）した後に、以下の（１３－２）及び（１３－３）の実験に供した。
【0101】
（１４－２）血小板サンプルのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率の変化
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（１４－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図２１に示す。図中、「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「Ｄａｙ５」は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す。５日間保存後の血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には、５２．０％であったのに対し、水溶性ビタミン群を添加した保存液では４３．０％に低下していた。また、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、水溶性ビタミン群（ＶＢ２除く）を添加した保存液ではさらに低下しており、４０．３％であった。これらの結果から、ＶＣ及びＶＢ３による血小板劣化抑制効果が、ＶＢ２により阻害される可能性が示された。
実施例２の（２－３）に記載の方法によって、上記（１４－１）により得られた血小板サンプルにおけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（劣化マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
結果を図２１に示す。図中、「Ｄａｙ１」は保存前のサンプルを、「Ｄａｙ５」は５日間保存後のサンプルをそれぞれ示す。５日間保存後の血小板（ＣＤ４１＋分画）のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合には、５２．０％であったのに対し、水溶性ビタミン群を添加した保存液では４３．０％に低下していた。また、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性率は、水溶性ビタミン群（ＶＢ２除く）を添加した保存液ではさらに低下しており、４０．３％であった。これらの結果から、ＶＣ及びＶＢ３による血小板劣化抑制効果が、ＶＢ２により阻害される可能性が示された。
【0102】
（１４－３）血小板サンプルの無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率に及ぼす各保存液の影響 実施例２の（２－４）に記載の方法によって、上記（１４－１）により得られた血小板サンプルにおける無刺激時のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（劣化マーカー）陽性率、及びＡＴＲ刺激時のＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（反応性マーカー）陽性率を測定し、各保存液による血小板の劣化抑制効果を調べた。
図２２の左側に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図２２の右側にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）の２７．４％から５日間保存後（Ｄａｙ５）の４２．９％へと上昇していた。一方、５日間保存後のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、水溶性ビタミン群を添加した保存液を用いた場合には３４．９％と低く抑えられており、水溶性ビタミン群（ＶＢ２除く）を添加した保存液を用いた場合には２４．０％とさらに低く抑えられていた。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）の３５．６％から５日間保存後（Ｄａｙ５）の３２．４％へと低下していた。一方、水溶性ビタミン群を添加した保存液を用いた場合には、５日間保存後でも３６．８％であった。さらに、水溶性ビタミン群（ＶＢ２除く）を添加した保存液を用いた場合には、５日間保存後に４３．０％と上昇することが明らかとなった。これらの結果から、ＶＣ及びＶＢ３による血小板機能維持効果が、ＶＢ２により阻害される可能性が示された。
図２２の左側に無刺激時Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率を、図２２の右側にＡＴＲ刺激時ＰＡＣ―１/Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率をそれぞれ示す。Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）の２７．４％から５日間保存後（Ｄａｙ５）の４２．９％へと上昇していた。一方、５日間保存後のＰ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、水溶性ビタミン群を添加した保存液を用いた場合には３４．９％と低く抑えられており、水溶性ビタミン群（ＶＢ２除く）を添加した保存液を用いた場合には２４．０％とさらに低く抑えられていた。
また、ＡＴＲ刺激ＰＡＣ―１／Ｐ―Ｓｅｌｅｃｔｉｎ陽性率は、第１世代保存液を用いた場合、保存前（Ｄａｙ１）の３５．６％から５日間保存後（Ｄａｙ５）の３２．４％へと低下していた。一方、水溶性ビタミン群を添加した保存液を用いた場合には、５日間保存後でも３６．８％であった。さらに、水溶性ビタミン群（ＶＢ２除く）を添加した保存液を用いた場合には、５日間保存後に４３．０％と上昇することが明らかとなった。これらの結果から、ＶＣ及びＶＢ３による血小板機能維持効果が、ＶＢ２により阻害される可能性が示された。
【実施例15】
【0103】
［ヒト間葉系幹細胞の長期保存］
（１５－１）間葉系幹細胞保存液の調製
実施例１０の（１０－１）の記載に従ってＣＳＰ－０１溶液を調製した。かかるＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、間葉系幹細胞保存液を調製した。また、ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ及びニコチン酸に代えて、溶媒である蒸留水（大塚蒸留液；大塚製薬工場社製）を加えたコントロール保存液を調製した。
（１５－１）間葉系幹細胞保存液の調製
実施例１０の（１０－１）の記載に従ってＣＳＰ－０１溶液を調製した。かかるＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、間葉系幹細胞保存液を調製した。また、ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ及びニコチン酸に代えて、溶媒である蒸留水（大塚蒸留液；大塚製薬工場社製）を加えたコントロール保存液を調製した。
【0104】
（１５－２）間葉系幹細胞の保存
上記（１５－１）により調製した保存液を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で、１、２、４、７、１４、２１、２８、３５及び６３日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
上記（１５－１）により調製した保存液を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で、１、２、４、７、１４、２１、２８、３５及び６３日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
【0105】
結果を図２３に示す。コントロール保存液（図中では「＋溶媒」）を用いた場合、細胞生存率及び生細胞回収率は２日間の保存後に急激に低下することが明らかとなった。一方、ＶＣ及びニコチン酸添加保存液（図中では「＋ＶＣ＋ニコチン酸」）を用いた場合には、細胞生存率及び生細胞回収率の急激な低下は認められず、３５日後でも保存前と同程度で維持されることが明らかとなった。また、ＶＣ及びニコチン酸添加保存液を用いた場合は、コントロール保存液と比較して、６３日間保存後でも細胞生存率及び生細胞回収率が有意に高いことが示された。これらの結果から、ＶＣ及びニコチン酸は、間葉系幹細胞の長期間の保存においても優れた効果を奏することが示された。
【実施例16】
【0106】
［ヒト間葉系幹細胞の長期保存］
（１６－１）間葉系幹細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液又は乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、以下の４種の間葉系幹細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－０１
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸
乳酸リンゲル液
乳酸リンゲル液＋ＶＣ＋ニコチン酸
（１６－１）間葉系幹細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液又は乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、以下の４種の間葉系幹細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－０１
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸
乳酸リンゲル液
乳酸リンゲル液＋ＶＣ＋ニコチン酸
【0107】
（１６－２）間葉系幹細胞の保存
上記（１６－１）により調製した保存液を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で７、１４、２１及び２８日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
上記（１６－１）により調製した保存液を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で７、１４、２１及び２８日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
【0108】
結果を図２４に示す。ＣＳＰ－０１又は乳酸リンゲル液のみを用いた場合には、細胞生存率及び生細胞回収率は７日間保存後の時点において著しく低下した。一方、ＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液を用いた場合には、細胞生存率及び生細胞回収率の低下は抑制されることが明らかとなった。特に、ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸を用いた場合には、２８日間保存後でも、細胞生存率及び生細胞回収率がいずれも高く維持されることが明らかとなった。また、乳酸リンゲル液＋ＶＣ＋ニコチン酸を用いた場合には、１４日間保存後でも、細胞生存率及び生細胞回収率がいずれも高く維持されることが明らかとなった。これらの結果から、ＶＣ及びニコチン酸は、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の長期保存においても優れた効果を奏することが示された。
【実施例17】
【0109】
［ヒト間葉系幹細胞の長期保存］
（１７－１）間葉系幹細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及び／又はニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、さらに炭酸水素ナトリウム製剤（メイロン静注８．４％、大塚製薬工場社製）を加えてｐＨを７．０～７．３に調整した。また、コントロール保存液として、ＣＳＰ－０１溶液に、炭酸水素ナトリウム製剤（メイロン静注８．４％、大塚製薬工場社製）を加えてｐＨを７．０～７．３に調整した。以上のようにして、以下の４種の間葉系幹細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－０１
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ
ＣＳＰ－０１＋ニコチン酸
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸
（１７－１）間葉系幹細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及び／又はニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、さらに炭酸水素ナトリウム製剤（メイロン静注８．４％、大塚製薬工場社製）を加えてｐＨを７．０～７．３に調整した。また、コントロール保存液として、ＣＳＰ－０１溶液に、炭酸水素ナトリウム製剤（メイロン静注８．４％、大塚製薬工場社製）を加えてｐＨを７．０～７．３に調整した。以上のようにして、以下の４種の間葉系幹細胞保存液を調製した。
ＣＳＰ－０１
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ
ＣＳＰ－０１＋ニコチン酸
ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸
【0110】
（１７－２）間葉系幹細胞の保存
上記（１７－１）により調製した保存液を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で７、１４、２１及び２８日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
上記（１７－１）により調製した保存液を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で７、１４、２１及び２８日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
【0111】
結果を図２５に示す。ＣＳＰ－０１＋ニコチン酸を用いた場合、細胞生存率及び生細胞回収率はコントロール（ＣＳＰ－０１）と同様に直線的に低下した。一方、ＣＳＰ－０１＋ＶＣを用いた場合には、細胞生存率及び生細胞回収率の低下は有意に抑制された。さらに、ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸を用いた場合には、細胞生存率及び生細胞回収率はより顕著に改善された。これらの結果から、間葉系幹細胞の長期保存において、ＶＣは単独でも有効であるが、ＶＣとニコチン酸とを併用することにより、さらに優れた効果を発揮することが示された。
【実施例18】
【0112】
［幼若ブタ骨髄間葉系幹細胞の保存］
（１８－１）間葉系幹細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、間葉系幹細胞保存液（ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸）を調製した。また、コントロール保存液として、ＣＳＰ－０１溶液にのみを用いた。
（１８－１）間葉系幹細胞保存液の調製
ＣＳＰ－０１溶液に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）及びニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）を加え、間葉系幹細胞保存液（ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸）を調製した。また、コントロール保存液として、ＣＳＰ－０１溶液にのみを用いた。
【0113】
（１８－２）間葉系幹細胞の保存
Nishimuraら（Xenotransplantation. 2019 May;26(3):e12501.）の方法に従って、幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞（ｎｐ間葉系幹細胞）を作製した。かかるｎｐ間葉系幹細胞を、上記（１８－１）により調製した保存液を用いて懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で７、１４、２１及び２８日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
Nishimuraら（Xenotransplantation. 2019 May;26(3):e12501.）の方法に従って、幼若ブタ骨髄由来間葉系幹細胞（ｎｐ間葉系幹細胞）を作製した。かかるｎｐ間葉系幹細胞を、上記（１８－１）により調製した保存液を用いて懸濁した（５ｘ１０５細胞／ｍＬ）。懸濁液を５℃で７、１４、２１及び２８日静置した後に、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
【0114】
結果を図２６に示す。ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸を用いた場合には、コントロール（ＣＳＰ－０１）と比較して、いずれの保存期間においてもｎｐ間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率が改善された。また、ＣＳＰ－０１＋ＶＣ＋ニコチン酸により、２８日間保存後でもｎｐ間葉系幹細胞の生存率及び生細胞回収率が高く維持されることが明らかとなった。これらの結果から、ＶＣ及びニコチン酸を添加した保存液は、ｎｐ間葉系幹細胞の保存においても優れた効果を奏することが示された。
【実施例19】
【0115】
［Ｔ細胞の保存］
（１９－１）Ｔ細胞保存液の調製
乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）、ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）、及び／又はグルコース（８０ｍｇ／ｄＬ、大塚製薬工場社製）を加え、以下の８種類のＴ細胞保存液を調製した。
ＬＲ
ＬＲ＋グルコース
ＬＲ＋ＶＣ
ＬＲ＋ニコチン酸
ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸
ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース
ＬＲ＋ニコチン酸＋グルコース
ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース
（１９－１）Ｔ細胞保存液の調製
乳酸リンゲル液（ラクテック輸液；大塚製薬工場社製）に、ＶＣ製剤（１０００ｍｇ／Ｌ、沢井製薬社製）、ニコチン酸（４００ｍｇ／Ｌ、トーアエイヨー社製）、及び／又はグルコース（８０ｍｇ／ｄＬ、大塚製薬工場社製）を加え、以下の８種類のＴ細胞保存液を調製した。
ＬＲ
ＬＲ＋グルコース
ＬＲ＋ＶＣ
ＬＲ＋ニコチン酸
ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸
ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース
ＬＲ＋ニコチン酸＋グルコース
ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース
【0116】
（１９－２）Ｔ細胞の保存
市販の凍結ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ベリタス社製）を融解して、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Ｌｏｎｚａ社製）で洗浄した後に、１時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。必要量のＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、ＴＬＹ ＣＵＬＴＵＲＥキット２５（ＧＣリンフォテック社製）を用いて細胞を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して増殖させた（Ｔ細胞濃度：約８×１０５ｃｅｌｌｓ／５ｍｌ）。拡大培養開始から７日後に、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄して、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注し、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、上記（１９－１）で調製した保存液を加えて懸濁した（Ｔ細胞濃度：約５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ）。上記細胞懸濁液を５℃で２４時間保存した時点、及び、その後さらに２５℃で６時間保存した時点（合計３０時間保存後）で、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
市販の凍結ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ベリタス社製）を融解して、リンパ球培養培地（ＬＧＭ３、Ｌｏｎｚａ社製）で洗浄した後に、１時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。必要量のＣＤ８陽性Ｔ細胞を分取して、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、ＴＬＹ ＣＵＬＴＵＲＥキット２５（ＧＣリンフォテック社製）を用いて細胞を浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して増殖させた（Ｔ細胞濃度：約８×１０５ｃｅｌｌｓ／５ｍｌ）。拡大培養開始から７日後に、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄して、ステムフルチューブ（住友ベークライト社製）に分注し、１０分間の遠心分離（３００×ｇ、室温）を行った。上清を取り除いた後に、上記（１９－１）で調製した保存液を加えて懸濁した（Ｔ細胞濃度：約５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ）。上記細胞懸濁液を５℃で２４時間保存した時点、及び、その後さらに２５℃で６時間保存した時点（合計３０時間保存後）で、顕微鏡を用いて全細胞数及び死細胞数を計測した。各時点での細胞生存率（％）及び生細胞回収率（％）は、実施例１０の（１０－２）に記載の式１及び２を用いて算出した。
【0117】
保存後のＴ細胞生存率を図２７に示す。図２７の上グラフに示すように、５℃で２４時間保存後の生存率は、ＬＲ保存液と比較して、ＶＣ添加保存液（ＬＲ＋ＶＣ、ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸、ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース、及びＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース）を用いた場合に有意に上昇することが明らかとなった。また、図２７の下グラフに示すように、５℃で２４時間＋２５℃で６時間保存後の生存率は、ＬＲ保存液と比較して、ＶＣ及びグルコース添加保存液（ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース、及びＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース）を用いた場合に有意に上昇し、さらに、ＶＣ及びニコチン酸添加保存液（ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸）を用いた場合に上昇傾向が認められた。
【0118】
保存後のＴ細胞の生細胞回収率を図２８に示す。図２８の上グラフに示すように、５℃で２４時間保存後の生細胞回収率は、ＬＲ保存液と比較して、ＶＣ添加保存液（ＬＲ＋ＶＣ、ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸、ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース、及びＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース）を用いた場合に有意に上昇することが明らかとなった。中でも、ＶＣとグルコースを組み合わせて添加した保存液（ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース、及びＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース）において、より顕著な生細胞回収率改善作用が認められた。また、図２８の下グラフに示すように、５℃で２４時間＋２５℃で６時間保存後の生細胞回収率は、ＬＲ保存液と比較して、ＶＣ及びグルコース添加保存液（ＬＲ＋ＶＣ＋グルコース、及びＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸＋グルコース）を用いた場合に有意に上昇し、さらに、ＶＣ及びニコチン酸添加保存液（ＬＲ＋ＶＣ＋ニコチン酸）を用いた場合に上昇傾向が認められた。
【0119】
以上の結果から、Ｔ細胞を５℃で保存した後に、２５℃に温度を変化させてさらに保存するという、実際のＴ細胞移植を想定した条件においては、ＶＣ及びニコチン酸の組合せの使用により、それぞれを単独で使用するよりも、生存率及び生細胞回収率がともに向上することが示された。また、ＶＣ及びグルコースを組み合わせて使用することにより、生存率及び生細胞回収率がより向上することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0120】
本発明によれば、血小板の機能を維持したまま少なくとも１０日間振盪保存することが可能であるため、疾患や創傷治療のための血小板製剤の作製に有用である。また、本発明によれば、間葉系幹細胞、巨核球、Ｔ細胞などの非凍結保存においても、長期間の保存が可能となるため、再生医療等における移植医療分野やがん治療分野で有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
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【図15】
【図16】
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【図20】
【図21】
【図22】
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【図24】
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【図26】
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【図28】
