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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-02
(45)【発行日】2022-11-11
(54)【発明の名称】ワクチンアジュバント製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20221104BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20221104BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20221104BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20221104BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20221104BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20221104BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221104BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127
A61K47/24
A61K47/28
A61K47/54
A61K39/39
A61K39/00 G
A61P37/04
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2019509942
(86)(22)【出願日】2018-03-28
(86)【国際出願番号】 JP2018012637
(87)【国際公開番号】W WO2018181420
(87)【国際公開日】2018-10-04
【審査請求日】2021-03-26
(31)【優先権主張番号】P 2017066280
(32)【優先日】2017-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000002912
【氏名又は名称】住友ファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】福島 晃久
【審査官】一宮 里枝
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１８７８７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０００－１８０４４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特許第６７６９９７６（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2014年，Vol.69，pp.168-175
【文献】Journal of Controlled Release，2012年，Vol.161，pp.609-618
【文献】Acta Biomaterialia，2017年，Vol.53，pp.367-377，(Available online 30 January 2017)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１）及び（２）：（１）水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC）とコレステロール（Chol）とジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）の混合物、または、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）と卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）の混合物を含んでなる脂質多重層、及び
（２）（１）の脂質多重層に封入され得るコンジュゲート化合物であって、
式（１）：
【化1】
R 1 及びR 2 は、独立して、水素原子又は置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表し、前記アルキル基が置換されている場合には、以下の群：
ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数1から６のアルコキシ基、
から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
R 3 は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は炭素数１～６のアルキルチオ基を表し、
R 4 は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基又はシアノ基を表し、
Y 1 は、単結合、－(CR 9 R 10 ) p －、－CH=CH－(CR 9 R 10 ) q －、
【化2】
Y 2 は、単結合又は－C(O)－を表し、
Lは、置換もしくは無置換の炭素数２～６の直鎖アルキレン又は４～８員のシクロアルカンの二価基を表し、
前記直鎖アルキレン又はシクロアルカンが置換されている場合には、以下の群：
炭素数１～５のアルキル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
L中の直鎖アルキレンにおける任意の１つのメチレン基はカルボニル基で置き換えられてもよく、
R 5 及びR 6 は、独立して水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表すか、あるいは、R 5 もしくはR 6 のどちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成しているか、又は、R 5 及びR 6 が一緒になって置換もしくは無置換の５～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
前記アルキル基が置換される場合、ヒドロキシ基、ハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
前記４～８員の含窒素飽和ヘテロ環又は前記５～８員の含窒素飽和ヘテロ環が置換される場合、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボニル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
ｍは０又は１を表し、
pは１～６の整数を表し、
q及びq’は独立して、０～４の整数を表し、
rは０～５の整数を表し、r’は１～５の整数を表し、r及びr’の和が５以下であり、Y 2 が単結合の場合、r’は２～５の整数を表す。］
で示される化合物又はその薬学上許容される塩である、コンジュゲート化合物
を含んでなり、
該コンジュゲート化合物と該脂質多重層の重量比が１：８～１：２５０である、リポソーム。
【請求項2】
コンジュゲート化合物と脂質多重層の重量比が１：８～１：３０である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項3】
（１）における脂質多重層が、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）の混合物を含んでなる脂質成分からなる脂質多重層である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項4】
ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）と卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）とのモル比が１：１～２：１である、請求項１～３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項5】
コンジュゲート化合物が、(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド、
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン、
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン、
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド、または
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド
である、請求項１～４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項6】
コンジュゲート化合物が、(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド
である、請求項１～４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項7】
（１）における脂質多重層が、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）の混合物を含んでなる脂質成分からなる脂質多重層であり、（２）（１）の脂質多重層に封入され得るコンジュゲート化合物が、(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミドである、
請求項１～４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項8】
（１）における脂質多重層が、水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC）とコレステロール（Chol）とジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）の混合物を含んでなる脂質多重層であり、
（２）（１）の脂質多重層に封入され得るコンジュゲート化合物が、(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミドである、
請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項9】
脂質多重層が脂質二重層である、請求項１～８のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載のリポソームを含む医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載のリポソームを含むワクチンアジュバント。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項に記載のリポソーム及び抗原を含むワクチン。
【請求項13】
抗原が病原体由来の物質である、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項14】
以下のａ）およびｂ）を含むキット；ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載のリポソーム；および
ｂ）抗原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチンアジュバントとして有用なリポソーム、当該リポソームを含有する組成物、および当該組成物のワクチンアジュバントとしての使用に関するものである。
【背景技術】
【0002】
微生物由来のタンパク質もしくはその部分ペプチドからなるワクチンは、化学合成又は遺伝子組換え技術により製造できることから、ワクチンの安全性及び製造方法の面で優れている。しかし、一方で、部分ペプチド（エピトープ）からなるサブユニットワクチンは、生ワクチンや不活化ワクチンに比べて免疫賦活の効能が低い傾向がある。このことから、エピトープの免疫原性を強化し、ワクチンの免疫賦活活性を向上させるために、アジュバントと抗原を併用する予防もしくは治療方法が検討されている。
アジュバントは、抗原に対する液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を高める添加剤であり、アラム（Alum）、サポニン（saponin）等がワクチンアジュバントとして用いられている。
最近になって、Toll様受容体（Toll-like Receptor; TLR）が微生物に対する生体の防御機構の一つである、自然免疫の賦活に重要な役割を果たしていることが判明した。ヒトで特定されている既知の10のTLRのうち、TLR7はその作動薬で活性化されることにより、樹状細胞（DC）等が活性化される。その結果、Ｔ細胞共刺激分子群co-stimulatory molecules（CD80, CD86, CD40）の発現増強やI型インターフェロン（特にIFNα）、TNFα、IL-6又はIL-12を含む炎症性サイトカインが産生される。
また、TLR7作動薬、すなわちTLR7アゴニストは、DC活性化に加えて、Ｂ細胞を活性化し、さらにＮＫ細胞やT細胞を刺激してIFNγ産生を促すなどの活性が知られており、ワクチンアジュバント活性を有することが期待される。実際に、Resiquimod又はImiquimodなどのTLR7作動薬のアジュバント活性が報告されている（非特許文献１）。
アジュバントは、抗原に対する液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を高める添加剤であり、アラム（Alum）、サポニン（saponin）等がワクチンアジュバントとして用いられている。
最近になって、Toll様受容体（Toll-like Receptor; TLR）が微生物に対する生体の防御機構の一つである、自然免疫の賦活に重要な役割を果たしていることが判明した。ヒトで特定されている既知の10のTLRのうち、TLR7はその作動薬で活性化されることにより、樹状細胞（DC）等が活性化される。その結果、Ｔ細胞共刺激分子群co-stimulatory molecules（CD80, CD86, CD40）の発現増強やI型インターフェロン（特にIFNα）、TNFα、IL-6又はIL-12を含む炎症性サイトカインが産生される。
また、TLR7作動薬、すなわちTLR7アゴニストは、DC活性化に加えて、Ｂ細胞を活性化し、さらにＮＫ細胞やT細胞を刺激してIFNγ産生を促すなどの活性が知られており、ワクチンアジュバント活性を有することが期待される。実際に、Resiquimod又はImiquimodなどのTLR7作動薬のアジュバント活性が報告されている（非特許文献１）。
【0003】
以上のことから、TLR7を活性化する、新たなワクチンアジュバントの開発が求められている。
【0004】
一方、スクワレンは、水中油型もしくは油中水型エマルション製剤における油成分として用いられている油状物質であり、スクワレンを含有するアジュバントとして、MF59等がインフルエンザワクチンのアジュバントとして用いられている（非特許文献２、３及び４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第００／１２４８７号
【文献】国際公開第２００９／０６７０８１号
【文献】国際公開第２０１０／１３３８８５号
【文献】国際公開第２０１２／０６６３３５号
【文献】国際公開第２０１２／０６６３３６号
【文献】国際公開第２０１２／０６７２６８号
【文献】国際公開第２０１２／０６７２６９号
【文献】国際公開第２０１３／１７２４７９号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Vaccine 2011, 29, 3341・M. A. Tomai et al, Exp. Rev. Vaccine, 6, 835
【文献】G. Ott et al. Methods in Molecular Medicine, 2000, 42, 211-228
【文献】D. T. O’Hagan et al. Vaccine 2012, 4341-4348
【文献】C.B. Fox, molecules 2009, 14, 3286
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、長期安定性と免疫賦活活性に優れた、ワクチンアジュバントとして有用な組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明者らは鋭意検討を行った結果、Toll-like Receptor7（TLR7）の生理活性（機能）を亢進する、TLR7アゴニストである低分子量化合物とスクワレンとをスペーサーを介して化学的に結合させた化合物（以下「本発明のコンジュゲート化合物」という）を、特定の脂質成分を含んでなるリポソームに封入することにより、優れたアジュバント活性を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は下記に掲げるものである：
〔１〕以下の（１）及び（２）：
（１）水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）からなる群から選択される２種類の異なる脂質の混合物、またはこれら２種類の異なる脂質とコレステロール（Chol）の混合物を含んでなる脂質多重層、及び
（２）（１）の脂質多重層に封入され得るコンジュゲート化合物であって、TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物と、スクワレンもしくはスクワレンから誘導される脂質とがスペーサーを介して化学的に結合しているコンジュゲート化合物
を含んでなるリポソーム。
〔２〕コンジュゲート化合物と脂質成分の重量比が１：８～１：２５０である、〔１〕に記載のリポソーム。
〔３〕（１）における脂質多重層が、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）の混合物を含んでなる脂質成分からなる脂質多重層である、〔１〕又は〔２〕に記載のコンジュゲート化合物
を含んでなるリポソーム。
〔４〕ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）と卵黄ホスファチジルグリセロールと（EPG）のモル比が１：１～２：１である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔５〕TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物が、分子量２００～６００を有し、アデニン骨格、ピリミジン骨格、イミダゾキノリン骨格、イミダゾピリジン骨格、又はキナゾリン骨格を有することを特徴とする、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔６〕TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物が、ピリミジン骨格、アデニン骨格又はイミダゾキノリン骨格を有する、〔５〕に記載のリポソーム。
〔７〕TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物が、式（２）：
［Xは、メチレン、酸素原子、硫黄原子、SO、SO2又はNR7（R7は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表す）を表し、
R1及びR2は、独立して、水素原子又は置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表し、前記アルキル基が置換されている場合には、以下の群：
ヒドロキシ基、ハロゲン原子及び炭素数1から６のアルコキシ基、
から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
R3は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は炭素数１～６のアルキルチオ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、又はシアノ基、を表し、
Y1は、単結合、－(CR9R10)p－、－CH=CH－(CR9R10)q－、
、又は、－(CR9R10)r－O－(CR9’R10’)r’－（R9、R10、R9’及びR10’は独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表し、
Y2は、単結合又は－C(O)－を表し、
前記アルキル基が置換される場合、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
pは１～６の整数を表し、
q及びq’は独立して、０～４の整数を表し、
rは０～５の整数を表し、r’は１～５の整数を表し、r及びr’の和が５以下であり、Y2が単結合の場合、r’は２以上の整数を表し、
矢印はスペーサーとの結合手を表す。］
で示される構造を含み、スペーサーと結合してなる、〔６〕に記載のリポソーム。
〔８〕コンジュゲート化合物が
式（１）：
［Xは、メチレン、酸素原子、硫黄原子、SO、SO2又はNR7（R7は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表す）を表し、
R1及びR2は、独立して、水素原子又は置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表し、前記アルキル基が置換されている場合には、以下の群：
ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数1から６のアルコキシ基、
から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
R3は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は炭素数１～６のアルキルチオ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基又はシアノ基を表し、
Y1は、単結合、－(CR9R10)p－、－CH=CH－(CR9R10)q－、
、又は、－(CR9R10)r－O－(CR9’R10’)r’－（R9、R10、R9’及びR10’は独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表し、
Y2は、単結合又は－C(O)－を表し、
Lは、置換もしくは無置換の炭素数２～６の直鎖アルキレン又は４～８員のシクロアルカンの二価基を表し、
前記直鎖アルキレン又はシクロアルカンが置換されている場合には、以下の群：
炭素数１～５のアルキル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
L中の直鎖アルキレンにおける任意の１つのメチレン基はカルボニル基で置き換えられてもよく、
R5及びR6は、独立して水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6のどちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成しているか、又は、R5及びR6が一緒になって置換もしくは無置換の５～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
前記アルキル基が置換される場合、ヒドロキシ基、ハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
前記４～８員の含窒素飽和ヘテロ環又は前記５～８員の含窒素飽和ヘテロ環が置換される場合、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボニル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
ｍは０又は１を表し、
pは１～６の整数を表し、
q及びq’は独立して、０～４の整数を表し、
rは０～５の整数を表し、r’は１～５の整数を表し、r及びr’の和が５以下であり、Y2が単結合の場合、r’は２以上の整数を表す。］
で示される化合物又はその薬学上許容される塩である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔９〕脂質多重層が脂質二重層である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のリポソームを含む医薬組成物。
〔１１〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のリポソームを含むワクチンアジュバント。
〔１２〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のリポソーム及び抗原を含むワクチン。
〔１３〕抗原が病原体由来の物質である、〔１２〕に記載のワクチン。
〔１〕以下の（１）及び（２）：
（１）水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）からなる群から選択される２種類の異なる脂質の混合物、またはこれら２種類の異なる脂質とコレステロール（Chol）の混合物を含んでなる脂質多重層、及び
（２）（１）の脂質多重層に封入され得るコンジュゲート化合物であって、TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物と、スクワレンもしくはスクワレンから誘導される脂質とがスペーサーを介して化学的に結合しているコンジュゲート化合物
を含んでなるリポソーム。
〔２〕コンジュゲート化合物と脂質成分の重量比が１：８～１：２５０である、〔１〕に記載のリポソーム。
〔３〕（１）における脂質多重層が、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG）の混合物を含んでなる脂質成分からなる脂質多重層である、〔１〕又は〔２〕に記載のコンジュゲート化合物
を含んでなるリポソーム。
〔４〕ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）と卵黄ホスファチジルグリセロールと（EPG）のモル比が１：１～２：１である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔５〕TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物が、分子量２００～６００を有し、アデニン骨格、ピリミジン骨格、イミダゾキノリン骨格、イミダゾピリジン骨格、又はキナゾリン骨格を有することを特徴とする、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔６〕TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物が、ピリミジン骨格、アデニン骨格又はイミダゾキノリン骨格を有する、〔５〕に記載のリポソーム。
〔７〕TLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物が、式（２）：
【化1】
R1及びR2は、独立して、水素原子又は置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表し、前記アルキル基が置換されている場合には、以下の群：
ヒドロキシ基、ハロゲン原子及び炭素数1から６のアルコキシ基、
から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
R3は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は炭素数１～６のアルキルチオ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、又はシアノ基、を表し、
Y1は、単結合、－(CR9R10)p－、－CH=CH－(CR9R10)q－、
【化2】
Y2は、単結合又は－C(O)－を表し、
前記アルキル基が置換される場合、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
pは１～６の整数を表し、
q及びq’は独立して、０～４の整数を表し、
rは０～５の整数を表し、r’は１～５の整数を表し、r及びr’の和が５以下であり、Y2が単結合の場合、r’は２以上の整数を表し、
矢印はスペーサーとの結合手を表す。］
で示される構造を含み、スペーサーと結合してなる、〔６〕に記載のリポソーム。
〔８〕コンジュゲート化合物が
式（１）：
【化3】
R1及びR2は、独立して、水素原子又は置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表し、前記アルキル基が置換されている場合には、以下の群：
ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数1から６のアルコキシ基、
から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
R3は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は炭素数１～６のアルキルチオ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基又はシアノ基を表し、
Y1は、単結合、－(CR9R10)p－、－CH=CH－(CR9R10)q－、
【化4】
Y2は、単結合又は－C(O)－を表し、
Lは、置換もしくは無置換の炭素数２～６の直鎖アルキレン又は４～８員のシクロアルカンの二価基を表し、
前記直鎖アルキレン又はシクロアルカンが置換されている場合には、以下の群：
炭素数１～５のアルキル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
L中の直鎖アルキレンにおける任意の１つのメチレン基はカルボニル基で置き換えられてもよく、
R5及びR6は、独立して水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6のどちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成しているか、又は、R5及びR6が一緒になって置換もしくは無置換の５～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
前記アルキル基が置換される場合、ヒドロキシ基、ハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
前記４～８員の含窒素飽和ヘテロ環又は前記５～８員の含窒素飽和ヘテロ環が置換される場合、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボニル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
ｍは０又は１を表し、
pは１～６の整数を表し、
q及びq’は独立して、０～４の整数を表し、
rは０～５の整数を表し、r’は１～５の整数を表し、r及びr’の和が５以下であり、Y2が単結合の場合、r’は２以上の整数を表す。］
で示される化合物又はその薬学上許容される塩である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔９〕脂質多重層が脂質二重層である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のリポソーム。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のリポソームを含む医薬組成物。
〔１１〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のリポソームを含むワクチンアジュバント。
〔１２〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のリポソーム及び抗原を含むワクチン。
〔１３〕抗原が病原体由来の物質である、〔１２〕に記載のワクチン。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、抗原に対する特異的免疫反応をさらに増強することができ、且つ長期間にわたって安定なワクチンアジュバントを提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】調製直後の実施例５のリポソームを精製水で５倍希釈し、MALVERN ゼータサイザーナノを用いて動的光散乱法による粒度分布およびZeta電位分布を測定した結果を示すグラフである。縦軸は散乱強度、横軸はそれぞれサイズとZeta電位を示す。
【図2】実施例１および実施例５のリポソームを筋肉内投与したマウスにおける、免疫マウス血清中のOVA特異的ＩｇＧ２ｃをELISAにて定量した結果を示すグラフである。縦軸は、血清中OVA特異的IgG2cの抗体価を示す。横軸は投与したサンプル（括弧内は投与したリポソーム又はAlumの用量）を示す。１：実施例５の陰性対照（コンジュゲート化合物を含まないリポソーム、すなわち、50μg/マウスのコンジュゲート化合物を投与する場合に使用する脂質重量に相当する空のリポソーム）、２：実施例５のリポソーム（50μg/マウス）、３：実施例５のリポソーム（10μg/マウス）、４：実施例５のリポソーム（2μg/マウス）、５：実施例１の陰性対照リポソーム（コンジュゲート化合物を含まない）（前記１と同様）、６：実施例１のリポソーム（10μg/マウス）、７：実施例１のリポソーム（2μg/マウス）、８：実施例１のリポソーム（0.4μg/マウス）、９：Alum（水酸化アルミニウム）（150μg/マウス）。
【発明を実施するための形態】
【0012】
リポソームとは、両親媒性脂質分子の二分子膜（脂質二重層）などの脂質多重層からなる、内相を有する微小胞であり、本明細書では脂質多重層を構成する脂質を脂質成分と呼ぶこともある。ここで脂質多重層は好ましくは脂質二重層である。
本発明の製剤を構成するリポソームにおいて、脂質多重層、好ましくは脂質二重層を構成する脂質成分は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC；水素添加大豆リン脂質ともいう）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG；エッグホスファチジルグリセロールともいう）からなる群から選択される２種類の異なる脂質の混合物、またはこれら２種類の異なる脂質とコレステロール（Chol）の混合物を含んでなる。
上述のリポソームを構成する脂質成分が酸性基もしくは塩基性基を有する場合、適宜アルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）等の薬学上許容される塩を形成していてもよい。
また、本発明のリポソームは、その安定性に実質的な影響を与えない量の他の成分を含むことができる。
本発明の製剤を構成するリポソームにおいて、脂質多重層、好ましくは脂質二重層を構成する脂質成分は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC；水素添加大豆リン脂質ともいう）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）及び卵黄ホスファチジルグリセロール（EPG；エッグホスファチジルグリセロールともいう）からなる群から選択される２種類の異なる脂質の混合物、またはこれら２種類の異なる脂質とコレステロール（Chol）の混合物を含んでなる。
上述のリポソームを構成する脂質成分が酸性基もしくは塩基性基を有する場合、適宜アルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）等の薬学上許容される塩を形成していてもよい。
また、本発明のリポソームは、その安定性に実質的な影響を与えない量の他の成分を含むことができる。
【0013】
本発明の特定の実施形態では、脂質二重層を構成する脂質成分はDMPC及びEPGの混合物を含んでなる。DMPCとEPGの比率は、モル比（DMPC：EPG）にして、例えば、１：１０～１０：１、好ましくは１：４～４：１、より好ましくは１：１～２：１である。
本発明の特定の実施形態では、DMPCとEPGの比率は、モル比（DMPC：EPG）にして５：３である。
本発明の特定の実施形態では、DMPCとEPGの比率は、モル比（DMPC：EPG）にして５：３である。
【0014】
本発明の特定の実施形態では、脂質二重層を構成する脂質成分はHSPC、Chol及びDSPGの混合物を含んでなる。HSPC、Chol及びDSPGの比率は、適宜設定することができるが、それぞれの成分がモル比にして１０～６０％であり、全体で１００％となるように設定できる。例えばHSPC：Chol：DSPGの比率が、５０～６０：２５～３０：１０～２５（但し合計１００である）である。一例を挙げれば、HSPC：Chol：DSPGが、約５３．１：約２６．３：約２０．５（但し合計１００である）である。
【0015】
本発明の特定の実施形態では、脂質二重層を構成する脂質成分はDOPC、Chol及びDOPGの混合物を含んでなる。DOPC、Chol及びDOPGの比率は、適宜設定することができるが、それぞれの成分がモル比にして１０～６０％であり、全体で１００％となるように設定できる。例えば、DOPC：Chol：DOPGの比率が、５０～６０：２５～３０：１０～２５（但し合計１００である）である。一例を挙げれば、DOPC：Chol：DOPGが、約５３．１：約２６．３：約２０．５（但し合計１００である）である。
【0016】
本明細書において、「脂質多重層、好ましくは脂質二重層に封入（incorporate）され得るコンジュゲート化合物」または「リポソームに封入されるコンジュゲート化合物」とは、リポソームを構成する脂質多重層、好ましくは脂質二重層の内側に包含される本発明のコンジュゲート化合物、及びリポソームを構成する脂質多重層、好ましくは脂質二重層の表面もしくは脂質二重層膜内に存在する本発明のコンジュゲート化合物を包含する。
【0017】
本発明のリポソームは、本発明のコンジュゲート化合物と脂質成分とを用い、公知のリポソームの製造法により得ることができる。例えば、所定量の本発明のコンジュゲート化合物と脂質成分とを、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール、ヘキサンなど）に溶解させ、得られた溶液を容器に入れて溶媒を留去し、容器壁に薄膜を形成させ、乾燥させる。次いで、この容器内に緩衝液などの適当な水溶液を投入して再水和し、超音波処理等により薄膜をはがした後、攪拌することによりリポソームを形成させることができる。得られたリポソーム分散液をエクストルーダーに通し、そのフィルター孔径を適宜設定することにより、リポソームの粒径を調節することができる。さらに、このようにして得られたリポソーム分散液から、リポソームに含まれなかったコンジュゲート化合物及び脂質成分を、ゲルろ過法、超遠心法、透析法、イオン交換クロマトグラフィーなどにより除去することができる。
【0018】
本発明の一態様として、本発明のリポソームに封入されるコンジュゲート化合物は、脂質成分全体に対し、重量比（コンジュゲート化合物：脂質成分）で１：３～１：３０、より好ましくは１：５～１：１５、より好ましくは１：８～１：１２、より好ましくは１：１０である。
【0019】
本明細書におけるスクワレンから誘導される脂質としては、（６Ｅ，１０Ｅ，１４Ｅ）－２，６，１０，１５，１９－ペンタメチルイコサ－２，６，１０，１４，１８－ペンタエン（(6E,10E,14E)-2,6,10,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaene）が挙げられ、適宜当業者に周知の方法で、スクワレンから導かれる化合物をスペーサーと連結することにより、本発明のコンジュゲート化合物へ導くことができる。
【0020】
本発明のTLR7の生理活性を亢進するTLR7アゴニストである低分子量化合物としては、分子量２００～６００、好ましくは分子量２５０～５００、より好ましくは分子量３００～５００を有するものが挙げられ、好ましくは、アデニン骨格、ピリミジン骨格、イミダゾキノリン骨格、イミダゾピリジン骨格、又はキナゾリン骨格を有するものが挙げられる。
アデニン骨格を有する化合物としては４－アミノ－８－オキソ－プリン（８－オキソアデニン）骨格を有する化合物が挙げられ、例えば９位が５～６員の芳香族炭素環、５～６員の芳香族複素環もしくは４～７員の脂肪族含窒素複素環で置換されていてもよいアルキル基（例えば炭素数１～６の直鎖アルキル基）で置換された４－アミノ－８－オキソ－プリン骨格を有する化合物が挙げられる。具体的には、GSK-2245035〔2-[1(S)-メチルブトキシ]-9-[5-(1-ピペリジニル)ペンチル]-8,9-ジヒドロ-7H-アデニン-8-オン〕、又は、WO98/01448、WO99/28321、WO02/085905、WO2008/114008、WO2008/114819、WO2008/114817、WO2008/114006、WO2010/018131、WO2010/018134、WO2008/101867、WO2010/018133、WO2009/005687等に記載された化合物が挙げられる。
ピリミジン骨格を有する化合物としては、２，４－ジアミノピリミジン骨格を有する化合物が挙げられ、例えば、６位は適宜アルキル基等で置換され、5位は５～６員の芳香族炭素環、５～６員の芳香族複素環もしくは４～７員の脂肪族含窒素複素環で置換されていてもよいアルキル基（例えば炭素数１～６の直鎖アルキル基）で置換された２，４－ジアミノピリミジンが挙げられる。具体的には、WO00/12487、WO2010/133885、WO2013/172479又はWO2012/136834に記載された化合物を挙げることができる。
イミダゾキノリン骨格を有する化合物としては、イミキモド（Imiquimod）、レジキモド（resiquimod）又は852A〔N-[4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]メタンスルホンアミド〕をはじめとする４－アミノ－１H－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン骨格を有する化合物が挙げられ、例えば１位がC１－６アルキル基もしくはC１－６アルコキシ基で置換され、２位がC１－６アルキル基もしくはC１－６アルコキシ基で置換された４－アミノ－１H［４，５－ｃ］キノリンが挙げられる。具体的には、WO2010/48520、WO2008/135791、US4689338、US 4698348、又はWO2007/030777に記載された化合物を挙げることができる。
イミダゾピリジン骨格を有する化合物としては、４－アミノ－１，３－ジヒドロ－２H－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－オン骨格を有する化合物が挙げられ、例えば６位または７位がハロゲン原子で置換されていてもよいC１－６アルキル基もしくはC１－６アルコキシ基で置換され、１位は５～６員の芳香族炭素環、５～６員の芳香族複素環もしくは４～７員の脂肪族含窒素複素環で置換されていてもよいアルキル基（例えば炭素数１～４の直鎖アルキル基）で置換されている４－アミノ－１，３－ジヒドロ－２H－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－オン骨格を有する化合物が挙げられる。具体的には、WO2007/93901に記載された化合物又はPF-4171455〔4-アミノ-1-ベンジル-6-(トリフルオロメチル)-1,3-ジヒドロ-2H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-2-オン〕を例示することができる。
キナゾリン骨格を有する化合物としては、２，４－ジアミノキナゾリン骨格を有する誘導体が挙げられ、４位が適宜水酸基もしくはハロゲン原子等で置換されていてもよいアルキル基（例えば直鎖もしくは分枝の炭素数１～８のアルキル基）で置換された２，４-ジアミノキナゾリン骨格を有する化合物が挙げられる。具体的には、WO2012/156498又はWO2014/76221に記載された化合物が挙げられる。
その他、TLR7アゴニストである低分子量化合物として、ベサトリモド〔4-アミノ-2-ブトキシ-8-[[3-[(ピロリジン-1-イル)メチル]フェニル]メチル]-7,8-ジヒドロプテリジン-6(5H)-オン〕及びWO2010/077613に記載の化合物を例示することができる。
本発明のコンジュゲート化合物におけるスペーサーとしては、スクワレンもしくはスクワレンから誘導される脂質と前記低分子化合物を連結する化学的に安定な当業者に周知のスペーサーが挙げられ、具体的には、炭素数１～４のアルキレン、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレア結合、ウレタン結合及びスルホンアミド結合の組合せで構成されるリンカーが挙げられる。
アデニン骨格を有する化合物としては４－アミノ－８－オキソ－プリン（８－オキソアデニン）骨格を有する化合物が挙げられ、例えば９位が５～６員の芳香族炭素環、５～６員の芳香族複素環もしくは４～７員の脂肪族含窒素複素環で置換されていてもよいアルキル基（例えば炭素数１～６の直鎖アルキル基）で置換された４－アミノ－８－オキソ－プリン骨格を有する化合物が挙げられる。具体的には、GSK-2245035〔2-[1(S)-メチルブトキシ]-9-[5-(1-ピペリジニル)ペンチル]-8,9-ジヒドロ-7H-アデニン-8-オン〕、又は、WO98/01448、WO99/28321、WO02/085905、WO2008/114008、WO2008/114819、WO2008/114817、WO2008/114006、WO2010/018131、WO2010/018134、WO2008/101867、WO2010/018133、WO2009/005687等に記載された化合物が挙げられる。
ピリミジン骨格を有する化合物としては、２，４－ジアミノピリミジン骨格を有する化合物が挙げられ、例えば、６位は適宜アルキル基等で置換され、5位は５～６員の芳香族炭素環、５～６員の芳香族複素環もしくは４～７員の脂肪族含窒素複素環で置換されていてもよいアルキル基（例えば炭素数１～６の直鎖アルキル基）で置換された２，４－ジアミノピリミジンが挙げられる。具体的には、WO00/12487、WO2010/133885、WO2013/172479又はWO2012/136834に記載された化合物を挙げることができる。
イミダゾキノリン骨格を有する化合物としては、イミキモド（Imiquimod）、レジキモド（resiquimod）又は852A〔N-[4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]メタンスルホンアミド〕をはじめとする４－アミノ－１H－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン骨格を有する化合物が挙げられ、例えば１位がC１－６アルキル基もしくはC１－６アルコキシ基で置換され、２位がC１－６アルキル基もしくはC１－６アルコキシ基で置換された４－アミノ－１H［４，５－ｃ］キノリンが挙げられる。具体的には、WO2010/48520、WO2008/135791、US4689338、US 4698348、又はWO2007/030777に記載された化合物を挙げることができる。
イミダゾピリジン骨格を有する化合物としては、４－アミノ－１，３－ジヒドロ－２H－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－オン骨格を有する化合物が挙げられ、例えば６位または７位がハロゲン原子で置換されていてもよいC１－６アルキル基もしくはC１－６アルコキシ基で置換され、１位は５～６員の芳香族炭素環、５～６員の芳香族複素環もしくは４～７員の脂肪族含窒素複素環で置換されていてもよいアルキル基（例えば炭素数１～４の直鎖アルキル基）で置換されている４－アミノ－１，３－ジヒドロ－２H－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－２－オン骨格を有する化合物が挙げられる。具体的には、WO2007/93901に記載された化合物又はPF-4171455〔4-アミノ-1-ベンジル-6-(トリフルオロメチル)-1,3-ジヒドロ-2H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-2-オン〕を例示することができる。
キナゾリン骨格を有する化合物としては、２，４－ジアミノキナゾリン骨格を有する誘導体が挙げられ、４位が適宜水酸基もしくはハロゲン原子等で置換されていてもよいアルキル基（例えば直鎖もしくは分枝の炭素数１～８のアルキル基）で置換された２，４-ジアミノキナゾリン骨格を有する化合物が挙げられる。具体的には、WO2012/156498又はWO2014/76221に記載された化合物が挙げられる。
その他、TLR7アゴニストである低分子量化合物として、ベサトリモド〔4-アミノ-2-ブトキシ-8-[[3-[(ピロリジン-1-イル)メチル]フェニル]メチル]-7,8-ジヒドロプテリジン-6(5H)-オン〕及びWO2010/077613に記載の化合物を例示することができる。
本発明のコンジュゲート化合物におけるスペーサーとしては、スクワレンもしくはスクワレンから誘導される脂質と前記低分子化合物を連結する化学的に安定な当業者に周知のスペーサーが挙げられ、具体的には、炭素数１～４のアルキレン、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレア結合、ウレタン結合及びスルホンアミド結合の組合せで構成されるリンカーが挙げられる。
【0021】
本発明の一実施形態では、本発明のTLR7の生理活性を亢進する低分子量化合物は、上記式（２）で表される構造を含む。
【0022】
本発明の一実施形態では、本発明のコンジュゲート化合物は、上記式（１）で表される化合物又はその薬学上許容される塩である。
【0023】
式（１）または式（２）における各用語の定義を以下に記載する。
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられ、好ましくは、フッ素原子又は塩素原子が挙げられる。
「直鎖アルキレン」としては、炭素数１～６の直鎖アルキレンが挙げられる。直鎖アルキレンとして具体的には、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン又はｎ－ブチレンが挙げられるがこれらに限定されない。
「アルキル基」としては、炭素数１～６の直鎖もしくは分枝のアルキル基が挙げられる。アルキル基として具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はtert-ブチルが挙げられるがこれらに限定されない。
「シクロアルカン」としては、４～８員のシクロアルカンが挙げられる。具体的には、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン又はシクロオクタンが挙げられ、好ましくは、シクロペンタン、シクロヘキサン又はシクロヘプタンが挙げられる。
「シクロアルカンの二価基」としては特に限定は無いが、具体的には、前記シクロアルカンの異なる炭素原子上で隣接する原子と結合可能な二価基を挙げることができる。
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられ、好ましくは、フッ素原子又は塩素原子が挙げられる。
「直鎖アルキレン」としては、炭素数１～６の直鎖アルキレンが挙げられる。直鎖アルキレンとして具体的には、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン又はｎ－ブチレンが挙げられるがこれらに限定されない。
「アルキル基」としては、炭素数１～６の直鎖もしくは分枝のアルキル基が挙げられる。アルキル基として具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はtert-ブチルが挙げられるがこれらに限定されない。
「シクロアルカン」としては、４～８員のシクロアルカンが挙げられる。具体的には、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン又はシクロオクタンが挙げられ、好ましくは、シクロペンタン、シクロヘキサン又はシクロヘプタンが挙げられる。
「シクロアルカンの二価基」としては特に限定は無いが、具体的には、前記シクロアルカンの異なる炭素原子上で隣接する原子と結合可能な二価基を挙げることができる。
【0024】
「アルコキシ基」としては、炭素数１～６の直鎖もしくは分枝のアルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基として具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシル、ブトキシ、イソブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ又はイソペントキシが挙げられるがこれらに限定されない。
【0025】
「４～８員の含窒素飽和ヘテロ環」としては、２もしくは３個の窒素原子、０もしくは１個の酸素原子及び０もしくは１個の硫黄原子から選択される少なくとも２個の窒素原子を含む１～３個のヘテロ原子を環内に含む、４～８員の含窒素飽和ヘテロ環が挙げられる。具体的には、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、パーヒドロアゼピン、イミダゾリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン又はパーヒドロ－１，４－ジアゼピン等が挙げられる。
「５～８員の含窒素飽和ヘテロ環」としては、上記４～８員の含窒素飽和ヘテロ環のうち、５～８員のものを挙げることができる。
当該含窒素飽和ヘテロ環が置換される場合の置換基として、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボニル基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子、更に好ましくはヒドロキシ基又はハロゲン原子が挙げられ、同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよい。
「５～８員の含窒素飽和ヘテロ環」としては、上記４～８員の含窒素飽和ヘテロ環のうち、５～８員のものを挙げることができる。
当該含窒素飽和ヘテロ環が置換される場合の置換基として、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボニル基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子、更に好ましくはヒドロキシ基又はハロゲン原子が挙げられ、同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよい。
【0026】
式（１）において、Xは、メチレン、酸素原子、硫黄原子、SO、SO2又はNR7（R7は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表す）を表す。R7は、好ましくは、水素原子又はメチル基を表す。Xは好ましくは、メチレンを表す。
式（１）において、R１は、好ましくは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す。具体的なR１としては、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基が挙げられる。
式（１）において、R2は、水素原子、又は置換もしくは無置換の炭素数１～４のアルキル基を表す。ここで前記アルキル基が置換されている場合の置換基として具体的にはヒドロキシ基が挙げられる。具体的なR2として、好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等が挙げられる。
式（１）において、R3は、好ましくは、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基又は炭素数１～４のアルキルチオ基を表し、更に好ましくは、炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を表す。具体的なR3として、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基、更に好ましくはメチル基が挙げられる。
式（１）において、R１は、好ましくは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す。具体的なR１としては、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基が挙げられる。
式（１）において、R2は、水素原子、又は置換もしくは無置換の炭素数１～４のアルキル基を表す。ここで前記アルキル基が置換されている場合の置換基として具体的にはヒドロキシ基が挙げられる。具体的なR2として、好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等が挙げられる。
式（１）において、R3は、好ましくは、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基又は炭素数１～４のアルキルチオ基を表し、更に好ましくは、炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を表す。具体的なR3として、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基、更に好ましくはメチル基が挙げられる。
【0027】
式（１）において、R4として、好ましくは、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のアルコキシ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子等が挙げられ、更に好ましくは水素原子又はメトキシ基等が挙げられる。
式（１）において、Y１は、好ましくは、単結合、－(CR9R10)p－、又は－(CR9R10)r－O－(CR9’R10’)r’－（R9、R10、R9’及びR10’は独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表す。ここでR9、R10、R9’及びR10’は好ましくは独立して水素原子又はメチル基を表し、更に好ましくは水素原子を表す。Y１は、更に好ましくは、単結合又は－(CR9R10)p－を表す。
式（１）において、Y１が－(CR9R10)p－を表す場合、pは、好ましくは１～４の整数を表し、更に好ましくは、１、２又は３を表す。
式（１）において、Y１が－CH=CH－(CR9R10)q－、又は
式（１）において、Y１は、好ましくは、単結合、－(CR9R10)p－、又は－(CR9R10)r－O－(CR9’R10’)r’－（R9、R10、R9’及びR10’は独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す）を表す。ここでR9、R10、R9’及びR10’は好ましくは独立して水素原子又はメチル基を表し、更に好ましくは水素原子を表す。Y１は、更に好ましくは、単結合又は－(CR9R10)p－を表す。
式（１）において、Y１が－(CR9R10)p－を表す場合、pは、好ましくは１～４の整数を表し、更に好ましくは、１、２又は３を表す。
式（１）において、Y１が－CH=CH－(CR9R10)q－、又は
【0028】
【化5】
式（１）において、Y１が－(CR9R10)r －O－(CR9’R10’)r’－を表す場合、rは、好ましくは０～３の整数を表し、r’は好ましくは１～４の整数を表す。ここでr及びr’の和は５以下であり、更に好ましくはｒは０又は１を表し、r’は１又は２を表す。
【0029】
式（１）において、Y１が単結合又は－(CR9R10)p－を表す場合、Y2は単結合又は－C(O)－（カルボニル）を表す。
好ましい態様として、Y１が単結合を表し、Y2が－C(O)－を表す態様が挙げられる。
好ましい態様として、Y１が－(CR9R10)p－を表し、Y2が単結合を表す態様が挙げられる。ここでR9及びR10は好ましくは独立して水素原子又はメチル基を表し、更に好ましくは水素原子を表す。また、ｐは好ましくは１～４の整数を表し、更に好ましくは、１、２又は３を表す。
好ましい態様として、Y１が単結合を表し、Y2が－C(O)－を表す態様が挙げられる。
好ましい態様として、Y１が－(CR9R10)p－を表し、Y2が単結合を表す態様が挙げられる。ここでR9及びR10は好ましくは独立して水素原子又はメチル基を表し、更に好ましくは水素原子を表す。また、ｐは好ましくは１～４の整数を表し、更に好ましくは、１、２又は３を表す。
【0030】
本発明の一態様において、式（１）におけるLは、具体的には、炭素数２～４の直鎖アルキレン、更に好ましくは炭素数２もしくは３の直鎖アルキレンを表し、更に好ましくはエチレンを表す。
【0031】
本発明の一態様において、式（１）におけるLは、４～８員のシクロアルカンの二価基を表し、更に好ましくは５もしくは６員のシクロアルカンの二価基を表す。当該二価基として、具体的には、以下の二価基を例示することができる。
【0032】
【化6】
【0033】
本発明の一態様において、式（１）におけるR5及びR6は、どちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成していてもよく、好ましくは４～６員の含窒素飽和ヘテロ環を形成していてもよい。R5が、L中の任意の炭素原子と結合して形成する４～８員の含窒素飽和ヘテロ環として、具体的には以下のものを例示することができる。
【0034】
【化7】
【0035】
R6が、L中の任意の炭素原子と結合して形成する４～８員の含窒素飽和ヘテロ環として、具体的には以下のものを例示することができる。
【0036】
【化8】
【0037】
本発明の一態様において、式（１）におけるR5及びR6は、一緒になって置換もしくは無置換の５～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成していてもよく、好ましくは５もしくは６員の含窒素飽和ヘテロ環を形成していてもよい。当該含窒素飽和ヘテロ環として、具体的には以下の式：
【0038】
【化9】
R5及びR6は、どちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して形成する４～８員の含窒素飽和ヘテロ環、又はR5及びR6が一緒になって形成する５～８員の含窒素飽和ヘテロ環が置換されている場合の置換基として、好ましくは、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基が挙げられる。
【0039】
式（１）において、ｍは好ましくは1を表す。
【0040】
式（１）で表される化合物の好ましい態様として、式（１）において
Xは、メチレンを表し、
R1は炭素数１～４のアルキル基を表し、
R2は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、又は、ヒドロキシ基で置換された炭素数１～３のアルキル基を表し、
R3は、炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基を表し、
Y1は、単結合又は－(CR9R10)p－を表し、
Y2は、－C(O)－を表し、
Lは、炭素数２～６の直鎖アルキレンを表し、
R5及びR6は、独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6は、どちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成するか、又はR5は、R6と一緒になって置換もしくは無置換の４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
ｍは０又は１、好ましくは１を表す化合物が挙げられる。
Xは、メチレンを表し、
R1は炭素数１～４のアルキル基を表し、
R2は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、又は、ヒドロキシ基で置換された炭素数１～３のアルキル基を表し、
R3は、炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基を表し、
Y1は、単結合又は－(CR9R10)p－を表し、
Y2は、－C(O)－を表し、
Lは、炭素数２～６の直鎖アルキレンを表し、
R5及びR6は、独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6は、どちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成するか、又はR5は、R6と一緒になって置換もしくは無置換の４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
ｍは０又は１、好ましくは１を表す化合物が挙げられる。
【0041】
式（１）で表される化合物の好ましい態様として、式（１）において
Xは、メチレンを表し、
R1は炭素数１～４のアルキル基を表し、
R2は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、又はヒドロキシ基で置換された炭素数１～３のアルキル基を表し、
R3は、炭素数１～３のアルキル基、又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基を表し、
Y1は、－(CR9R10)p－を表し、
Y2は、単結合を表し、
Lは、炭素数２～６の直鎖アルキレンを表し、
R5及びR6は、独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6は、どちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成しているか、又はR5は、R6と一緒になって置換もしくは無置換の４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
ｍは０又は１、好ましくは１を表す化合物が挙げられる。
Xは、メチレンを表し、
R1は炭素数１～４のアルキル基を表し、
R2は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、又はヒドロキシ基で置換された炭素数１～３のアルキル基を表し、
R3は、炭素数１～３のアルキル基、又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基を表し、
Y1は、－(CR9R10)p－を表し、
Y2は、単結合を表し、
Lは、炭素数２～６の直鎖アルキレンを表し、
R5及びR6は、独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6は、どちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成しているか、又はR5は、R6と一緒になって置換もしくは無置換の４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
ｍは０又は１、好ましくは１を表す化合物が挙げられる。
【0042】
式（１）で表される化合物の好ましい態様として、式（１）において
Xは、メチレンを表し、
R1は炭素数１～４のアルキル基を表し、
R2は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、又は、ヒドロキシ基で置換された炭素数１～３のアルキル基を表し、
R3は、炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基を表し、
Y1が単結合を表しY2が－C(O)－を表すか、又はY1が－(CR9R10)p－を表しY2が単結合を表し、
Lは、炭素数２～６の直鎖アルキレンを表し、
R5及びR6は、独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表し、
ｍは０又は１、好ましくは１を表す化合物が挙げられる。
Xは、メチレンを表し、
R1は炭素数１～４のアルキル基を表し、
R2は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、又は、ヒドロキシ基で置換された炭素数１～３のアルキル基を表し、
R3は、炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基を表し、
Y1が単結合を表しY2が－C(O)－を表すか、又はY1が－(CR9R10)p－を表しY2が単結合を表し、
Lは、炭素数２～６の直鎖アルキレンを表し、
R5及びR6は、独立して水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を表し、
ｍは０又は１、好ましくは１を表す化合物が挙げられる。
【0043】
本発明の好適なコンジュゲート化合物として、以下の化合物又はその薬学上許容される塩が挙げられる：
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド；及び
4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド。
又は、
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド；及び
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド。
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド；及び
4-[(2-アミノ-4-{[1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド。
又は、
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン；
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド；及び
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド。
【0044】
本明細書において式（１）で示される化合物の薬学上許容される塩としては、例えば、式（１）で示される化合物の酸付加塩又は塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば無機又は有機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸又はマレイン酸等）との酸付加塩等が挙げられる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩もしくはカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【0045】
式（１）で表される化合物は、公知化合物を原料として、以下の製造方法で製造することができる。
原料化合物として用いられる化合物は、それぞれ塩として用いてもよい。尚、これらの製造方法は単なる例示であり、有機合成に習熟している者の知識に基づき、適宜、他の方法で製造することができる。
原料化合物として用いられる化合物は、それぞれ塩として用いてもよい。尚、これらの製造方法は単なる例示であり、有機合成に習熟している者の知識に基づき、適宜、他の方法で製造することができる。
【0046】
〔化合物（１）の製造方法１〕
式（１）で表される化合物又はその塩は、例えば下記に示す方法によって製造される。
式（１）で表される化合物又はその塩は、例えば下記に示す方法によって製造される。
【0047】
【化10】
塩基としては、有機化学反応において塩基として当業者が使用するものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリブチルアミン、１，８－ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ－５－エン、１，４－ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ－７－エン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ピコリン等の有機塩基；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の無機塩基等が挙げられる。塩基の使用量としては、化合物（３）に対して通常０．１～１００当量用いることができるが、好ましくは、１～５当量である。
縮合剤としては、実験化学講座（日本化学会編、丸善）２２巻に記載されているもの等が挙げられる。例えば、シアノリン酸ジエチル、ジフェニルホスホリルアジド等のリン酸エステル類；1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド類；2,2'-ジピリジルジスルフィド等のジスルフィド類とトリフェニルホスフィンのようなホスフィン類の組み合わせ；N,N'-ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィニッククロリド（ＢＯＰＣｌ）等のリンハライド類；アゾジカルボン酸ジエチル等のアゾジカルボン酸ジエステルとトリフェニルホスフィン等のホスフィンの組み合わせ；2-クロロ-1-メチルピリジニウムヨーダイド等の2-ハロ-1-低級アルキルピリジニウムハライド類；1,1'-カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）；ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）；ジエチルホスホリルシアニド（ＤＥＰＣ）；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウム テトラフルオロボレート（ＣＩＢ）等のテトラフルオロボレート類；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＢＯＰ）、2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）等のホスフェート類等が挙げられる。
不活性溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；ヘキサン、ヘプタン、トルエン、ベンゼン、キシレン等の炭化水素系溶媒；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒；アセトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド等の非プロトン性溶媒等が挙げられ、これらの混合物であってもよい。反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約－７０℃～１００℃の範囲から選択され、さらに好ましくは０℃～４０℃である。
また、化合物（３）を、ハロゲン化試薬（例えば、１－クロロ－Ｎ，Ｎ，２－トリメチルプロペニルアミン、オキシ塩化リン、三塩化リン、塩化チオニル、五塩化リン等が挙げられる。）を用いて、酸ハライドに導いた後、不活性溶媒中、必要に応じて塩基の存在下、化合物（２）と反応させることにより、化合物（１）を製造することもできる。
不活性溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；ヘキサン、ヘプタン、トルエン、ベンゼン、キシレン等の炭化水素系溶媒；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；メチルエチルケトン、アセトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド等の非プロトン性溶媒が挙げられる。塩基としては、例えば、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリブチルアミン、１，８－ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ－５－エン、１，４－ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ－７－エン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ピコリン等の有機塩基が挙げられる。ハロゲン化試薬は、化合物（３）に対して、０．１～１００当量用いることができるが、好ましくは、０．８～３当量用いることができる。反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約－３０℃～６０℃の範囲から選択される。
化合物（３）は、当業者に周知の方法（Org. Biomol. Chem. 2011, 9, 4367を参照）に従って製造することができる。
【0048】
〔化合物（２）の製造方法１〕
化合物（２）においてY2が-C(O)-を表す化合物（２ａ）又はその塩は、下記に示す方法で製造することができる。
化合物（２）においてY2が-C(O)-を表す化合物（２ａ）又はその塩は、下記に示す方法で製造することができる。
【0049】
【化11】
化合物（２ａ）は、化合物（４）と化合物（５ａ）から、化合物（１）の製造方法に記載の方法に従って、合成することができる。
化合物（４）は、当業者に周知の方法（例えば、国際公開パンフレット第WO2009／067081号、同第WO2010／133885号に記載の方法）に従い製造することができる。
【0050】
〔化合物（２）の製造方法２〕
化合物（２）においてY2が単結合を表す化合物（２ｂ）は、例えば以下の式で表される製造方法により、製造することができる。
化合物（２）においてY2が単結合を表す化合物（２ｂ）は、例えば以下の式で表される製造方法により、製造することができる。
【0051】
【化12】
【0052】
【化13】
化合物（２ｂ）は、化合物（６）と化合物（５ｂ）を、当業者に周知されている還元的アミノ化反応の条件によって縮合することにより製造することができる。具体的には、溶媒中、アルデヒド化合物及びアミン化合物を酢酸等の酸存在下又は非存在下、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤と反応させることにより、化合物（２ｂ）を製造することができる。
化合物（６）は、当業者に周知の方法（例えば、国際公開パンフレット第WO2010／133885号、同第WO2012／066335号、同第WO2012／066336号に記載の方法）に従い製造することができる。
【0053】
〔化合物（２）の製造方法３〕
化合物（２ｂ）又はその塩は、下記に示す方法でも製造することができる。
化合物（２ｂ）又はその塩は、下記に示す方法でも製造することができる。
【0054】
【化14】
【0055】
【化15】
【0056】
工程１
化合物（７）は、当業者に周知の方法（国際公開パンフレット第WO2010／133885号、同第WO2012／066336号等を参照）に従い製造することができる。化合物（８）の脱離基ＬＧは、当業者に周知されている脱離基であれば特に限定はなく、ハロゲン原子又はアルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を適宜用いることができる。化合物（８）は、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基存在下に、化合物（７）を塩化メタンスルホニル、塩化p-トルエンスルホニル等と反応させることにより、製造することができる。反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約０℃～１２０℃の範囲から選択される。
化合物（７）は、当業者に周知の方法（国際公開パンフレット第WO2010／133885号、同第WO2012／066336号等を参照）に従い製造することができる。化合物（８）の脱離基ＬＧは、当業者に周知されている脱離基であれば特に限定はなく、ハロゲン原子又はアルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を適宜用いることができる。化合物（８）は、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の塩基存在下に、化合物（７）を塩化メタンスルホニル、塩化p-トルエンスルホニル等と反応させることにより、製造することができる。反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約０℃～１２０℃の範囲から選択される。
【0057】
工程２
化合物（２ｂ）は、化合物（８）を不活性溶媒中、塩基存在下で化合物（５ａ）と反応させることにより製造することができる。
塩基としては、通常の反応において塩基として使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリブチルアミン、１，８－ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ－５－エン、１，４－ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ－７－エン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン等の有機塩基；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。塩基の使用量としては、化合物（８）に対して通常０．１～１００当量用いることができるが、好ましくは、１～３当量用いることができる。
不活性溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；ヘキサン、ヘプタン、トルエン、ベンゼン、キシレン等の炭化水素系溶媒；アセトニトリル、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性溶媒が挙げられ、これらの混合物であってもよい。反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約０℃～１２０℃の範囲から選択される。
化合物（２ｂ）は、化合物（８）を不活性溶媒中、塩基存在下で化合物（５ａ）と反応させることにより製造することができる。
塩基としては、通常の反応において塩基として使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリブチルアミン、１，８－ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ－５－エン、１，４－ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ－７－エン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン等の有機塩基；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。塩基の使用量としては、化合物（８）に対して通常０．１～１００当量用いることができるが、好ましくは、１～３当量用いることができる。
不活性溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；ヘキサン、ヘプタン、トルエン、ベンゼン、キシレン等の炭化水素系溶媒；アセトニトリル、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性溶媒が挙げられ、これらの混合物であってもよい。反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約０℃～１２０℃の範囲から選択される。
【0058】
〔化合物（２）の製造方法４〕
化合物（２ｂ）又はその塩は、下記に示す方法でも製造することができる。
化合物（２ｂ）又はその塩は、下記に示す方法でも製造することができる。
【0059】
【化16】
【0060】
【化17】
化合物（２ｂ）は、化合物（９）と化合物（５ｃ）を用い、化合物（２）の製造方法３に記載されている工程２と同様の方法によって、製造することができる。
化合物（９）は、当業者に周知の方法（国際公開パンフレット第WO2010／133885号、同第WO2012／066336号等を参照）に従い製造することができる。
【0061】
〔化合物（２）の製造方法５〕
化合物（２ｃ）又はその塩は、例えば下記に示す方法で製造することができる。
化合物（２ｃ）又はその塩は、例えば下記に示す方法で製造することができる。
【0062】
【化18】
【0063】
【化19】
化合物（２ｃ）は、化合物（９）と化合物（５ｄ）を用い、化合物（１）の製造方法に記載されている方法によって、製造することができる。
【0064】
本発明は、上記製造方法における製造中間体を包含する。具体的には、式（２）：
【0065】
【化20】
R1及びR2は、独立して、水素原子又は置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表し、前記アルキル基が置換されている場合には、以下の群：
ヒドロキシ基、ハロゲン原子及び炭素数1から６のアルコキシ基、
から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
R3は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基又は炭素数１～６のアルキルチオ基を表し、
R4は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１～６のアルキル基又は炭素数１～６のアルコキシ基又はシアノ基を表し、
Y1は、単結合、－(CR9R10)p－、－CH=CH-(CR9R10)q－、
【0066】
【化21】
Y2は、単結合又は-C(O)-を表し、
Lは、置換もしくは無置換の炭素数２～６の直鎖アルキレン又は４～８員のシクロアルカンの二価基を表し、
前記直鎖アルキレン、又はシクロアルカンが置換されている場合には、以下の群：
炭素数１～５のアルキル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
L中の直鎖アルキレンにおける任意の１つのメチレン基はカルボニル基で置き換えられてもよく、
R5及びR6は、独立して水素原子、置換もしくは無置換の炭素数１～６のアルキル基を表すか、あるいは、R5もしくはR6のどちらか一方が、L中の任意の炭素原子と結合して４～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成しているか、又は、R5及びR6が一緒になって置換もしくは無置換の５～８員の含窒素飽和ヘテロ環を形成してもよく、
前記アルキル基が置換される場合、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
前記４～８員の含窒素飽和ヘテロ環又は前記５～８員の含窒素飽和ヘテロ環が置換される場合、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、カルボニル基、ヒドロキシ基及びハロゲン原子から選択される同一もしくは異なる１～４個の置換基で置換されていてもよく、
pは１～６の整数を表し、
q及びq’は独立して、０～４の整数を表し、
rは０～５の整数を表し、r’は１～５の整数を表し、r及びr’の和が５以下であり、Y2が単結合の場合、r’は２以上の整数を表し、
R8は、水素原子又はアミノ基の保護基を表す。］
で示される、化合物又はその塩が挙げられる。
式（２）中R8における保護基としては、特に限定はなく、アミノ基の保護基として汎用される基が挙げられる。具体的には、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基等のカーバメート類、ベンジル基、ノシル基等のスルホン類、フタルイミド等のイミド類等を例示することができる。
本発明の任意の製造工程において、反応試薬における特定の官能基（ヒドロキシル基又はアミノ基等）を保護基で保護する必要があれば、適宜当業者に周知の方法で、適当な段階で、１又はそれ以上の保護基による保護・脱保護を行うことができる。
【0067】
官能基の保護と脱保護は、「Protective Groups in Organic Chemistry」（J.W.F. McOmie編, Plenum Press (1973)）、 「Protective Groups in Organic Synthesis', 3rd edition」（T.W. Greene及びP.G.M. Wuts著, Wiley-Interscience (1999)）に記載されている。
【0068】
当業者であれば、上記製造方法に類似の方法に適宜当業者に周知の有機合成技術を組合せて本発明のコンジュゲート化合物を製造することができる。
【0069】
本発明のコンジュゲート化合物が、１又はそれ以上の不斉炭素原子を有し、光学活性体として又はラセミ体として存在する場合、本発明の概念には、後述の生理活性を有する任意の光学活性体又はラセミ体が包含される。光学活性体の合成は、当分野でよく知られた有機化学の標準的な技術（例えば光学活性な出発物質からの合成又はラセミ体の分割）によって行うことができる。当該生理活性は、以下に記載する標準的な実験技術を用いて評価することができる。
【0070】
本発明のコンジュゲート化合物は、溶媒和されていない形態でも溶媒和された形態（例えば水和物）であってもよい。
また、本発明のコンジュゲートのいずれか１つ又は２つ以上の１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も本発明のコンジュゲート化合物に包含される。
また、本発明のコンジュゲートのいずれか１つ又は２つ以上の１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も本発明のコンジュゲート化合物に包含される。
【0071】
また、本発明のコンジュゲート化合物の形態に特に限定はなく、不定形であっても特定の結晶として存在していてもよい。結晶として得られる式（１）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩は、結晶多型が存在する場合があり、本発明化合物には、あらゆる結晶形のものが含まれる。
【0072】
本発明の一実施形態では、本発明のリポソームを含有する組成物、詳しくは医薬組成物を提供する。
当該組成物は、免疫賦活活性を有する有効成分の免疫賦活活性を維持もしくは増強するためのアジュバントとして用いることができる。
すなわち、本発明のリポソームを含有する組成物は、抗原特異的抗体、詳しくは抗原特異的IgG、さらに詳しくはTh1型抗原特異的IgG（例えばIgG2c）を誘導又は亢進する活性を有する。
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、CD4陽性（すなわち、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ２拘束性）及び／又はCD8陽性（すなわち、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ １拘束性）Tリンパ球を誘導又は亢進する活性を有する。
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、MHC拘束性抗原特異的なTリンパ球を誘導又は亢進する活性を有する。
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、メモリーTリンパ球、詳しくはCD8陽性エフェクターメモリーTリンパ球を誘導又は亢進する活性を有する。
当該組成物は、免疫賦活活性を有する有効成分の免疫賦活活性を維持もしくは増強するためのアジュバントとして用いることができる。
すなわち、本発明のリポソームを含有する組成物は、抗原特異的抗体、詳しくは抗原特異的IgG、さらに詳しくはTh1型抗原特異的IgG（例えばIgG2c）を誘導又は亢進する活性を有する。
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、CD4陽性（すなわち、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ２拘束性）及び／又はCD8陽性（すなわち、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ １拘束性）Tリンパ球を誘導又は亢進する活性を有する。
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、MHC拘束性抗原特異的なTリンパ球を誘導又は亢進する活性を有する。
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、メモリーTリンパ球、詳しくはCD8陽性エフェクターメモリーTリンパ球を誘導又は亢進する活性を有する。
【0073】
さらに、本発明のリポソームを含有する組成物は抗原を含有し得る。当該抗原としては、腫瘍抗原タンパク質、又は当該腫瘍抗原タンパク質由来の腫瘍抗原ペプチド（例えばNY-ESO-1、MAGE-3、WT1又はHer2/neu）、抗体の超可変領域、病原体由来抗原、例えばウイルスもしくは細菌等の病原体由来のタンパク質又はその部分ペプチド等が挙げられ、さらにこれらの抗原と担体との複合体等も本明細書における抗原の範疇に含まれる。このような複合体としては、抗原（タンパク質、ペプチドが挙げられるがこれらに限定されない）が担体となるタンパク質と当業者に周知のリンカーを介して化学的に架橋されたもの、抗原がウイルス様粒子（Virus-like Particle；VLP）に含まれるもの等が挙げられる。従って、本発明のリポソームを含有する組成物は、前記抗原と組合せて用いることで、癌又はウイルスもしくは細菌等の感染症の治療又は予防のための薬剤として有用である。
【0074】
また、本発明のリポソームを含有する組成物は、他の免疫学的あるいは免疫反応を誘導する治療方法において免疫賦活作用を補助するためのアジュバントとして用いることができる。具体的な治療方法として、例えば、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増大させるためのex vivoおよびin vivoアプローチ（例えばインターロイキン２、インターロイキン４又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子等のサイトカインでのトランスフェクション）、Ｔ細胞アネルギーを低下させるためのアプローチ、トランスフェクト免疫細胞（例えばサイトカイントランスフェクト樹状細胞）を使用したアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を使用したアプローチ、免疫抑制細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、骨髄由来抑制細胞又はIDO（インドールアミン２,３－ジオキシゲナーゼ）発現樹状細胞）の機能を減少させるためのアプローチ、免疫反応を誘導する放射線療法等が挙げられる。
【0075】
当該組成物の投与経路としては、例えば非経口投与、具体的には、血管内（例えば静脈内）、皮下、皮内、筋肉内、経鼻、経皮投与が挙げられる。
【0076】
一態様において、本発明のリポソームを含有する組成物は、本発明のリポソーム、及びリポソームの安定性及びコンジュゲート化合物の有効性に実質的な影響を与えない程度の量の薬学上許容される希釈剤、抗酸化剤、安定化剤、糖、緩衝剤、もしくは担体を含有し得る。
【0077】
当該組成物の形態としては、注射用又は点鼻用の液剤、又は前記液剤を凍結乾燥して調製される凍結乾燥製剤等が挙げられる。
注射用液剤としては、例えば本発明のリポソームを水に分散させた水性懸濁液剤等が挙げられる。
点鼻用液剤としては、例えば本発明のリポソームを水に分散させた水性懸濁液剤等が挙げられる。
ここで水性の溶液、もしくは水性懸濁液剤としては、注射用蒸留水、適宜緩衝剤、ｐH調節剤、安定化剤、等張化剤又は乳化剤を含む水溶液もしくは水性懸濁液等が挙げられる。
緩衝剤としてはリン酸塩、有機酸塩等が挙げられる。
注射用液剤としては、例えば本発明のリポソームを水に分散させた水性懸濁液剤等が挙げられる。
点鼻用液剤としては、例えば本発明のリポソームを水に分散させた水性懸濁液剤等が挙げられる。
ここで水性の溶液、もしくは水性懸濁液剤としては、注射用蒸留水、適宜緩衝剤、ｐH調節剤、安定化剤、等張化剤又は乳化剤を含む水溶液もしくは水性懸濁液等が挙げられる。
緩衝剤としてはリン酸塩、有機酸塩等が挙げられる。
【0078】
凍結乾燥製剤を調製する場合、適宜、賦形剤を添加することができる。当該賦形剤としては、糖類、糖アルコール類、アミノ酸類、塩化ナトリウム等が挙げられ、良好な凍結乾燥ケーキ又は凍結乾燥粉末を形成するのに適切な成分、配合比率であれば特に限定はされないが、例えば、０．１～２０％のマンニトール等が挙げられる。
【0079】
本発明の組成物は、他の添加剤を更に含んでいてもよく、当該添加剤としては、例えば、抗酸化剤、保存剤、無痛化剤等が挙げられる。
【0080】
本発明のリポソームは、抗原物質（免疫原）と同時又は時間差で投与することができ、その投与量は、温血動物に対し、本発明のコンジュゲート化合物含有量として通常５～５０００ｍｇ／ｍ2（体表面積）、即ち、約０．１ｎｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、の範囲の単位用量にて投与し、これは通常、予防もしくは治療上有効な用量をもたらす。注射剤、錠剤又はカプセルのような単位投与形態は、通常、例えば１ｎｇ～２５０ｍｇの本発明コンジュゲート化合物を含むリポソームを含有する。好ましくは、本発明のコンジュゲート化合物含有量として1日あたり１ｎｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で用いられる。但し、この１日あたりの用量は、処置を受ける宿主、具体的な投与経路および処置される疾患の重症度によって変更する必要もある。したがって、至適用量は、個別の患者もしくは温血動物を処置する施術者が決定することもできる。
【0081】
本明細書において用いられる「治療」は、疾患の症状のいずれか、幾つか又はすべてを全体的に又は部分的に緩和すること、又は病態の進行を阻止もしくは遅延させることを含む意味で用いられる。
【0082】
本明細書において用いられる「予防」は、疾患の一次予防（疾患の発症を防ぐ）又は二次予防（疾患の発症後、症状が緩和された患者又は病気が治癒した患者に対して再発を防ぐ、再発防止）を含む意味で用いられる。
【0083】
本発明のリポソームは、in vitroもしくはin vivoで免疫アジュバント活性を有するため、ワクチンアジュバントとして、抗原の免疫原性（immunogenicity）を維持もしくは増強させるために有用である。
【0084】
本発明のリポソームは、疾患の治療薬もしくは予防剤である免疫賦活物質（免疫刺激物質）、すなわち抗原特異的免疫反応を誘導する物質の作用を維持もしくは向上させるために用いることができる。
本発明のリポソーム、及び抗原特異的免疫反応を増強させる物質（抗原ともいう）を含む医薬組成物も、本発明の一態様である。当該抗原としては、特に限定はないが、抗原タンパク質又は該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド（部分ペプチド）、さらにこれらと担体との複合体が挙げられる。
本発明のリポソーム、及び抗原特異的免疫反応を増強させる物質（抗原ともいう）を含む医薬組成物も、本発明の一態様である。当該抗原としては、特に限定はないが、抗原タンパク質又は該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド（部分ペプチド）、さらにこれらと担体との複合体が挙げられる。
【0085】
本発明の特定の実施形態では、本発明のリポソームは、癌免疫療法のための腫瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ペプチドと組合せて投与することにより、癌を治療もしくは予防することができる。癌としては、例えば、膀胱癌、頭頸部癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓臓、腸および大腸癌、胃癌、皮膚癌および脳腫瘍などの一般的な癌、骨髄（白血病を含む）およびリンパ増殖系に影響を及ぼす悪性疾患（ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫等）等が挙げられる。ここで癌の治療もしくは予防には、転移性疾患および腫瘍再発防止、並びに腫瘍随伴症候群の予防および治療が含まれる）。
【0086】
抗原としては、特に限定はないが、例えばMAGE（Science，254:p1643 (1991))、gp100（J.Exp.Med.，179:p1005(1994)）、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:p3515 (1994)）、チロシナーゼ（J.Exp.Med.，178:p489 (1993)）、MAGE関連タンパク質群（J.Exp.Med.，179:p921 (1994)）、β－カテニン（J.Exp.Med.，183:p1185(1996)）、CDK4（Science ，269 ：p1281(1995)）、HER2/neu(J.Exp.Med.，181:p2109(1995)）、変異型p53（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:p14704(1996)）、CEA（J.Natl.Cancer.Inst.，87:p982(1995)）、PSA（J.Natl.Cancer.Inst.，89:p293(1997)）、WT1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101:p13885(2004))、HPV由来抗原（J.Immunol.，154:p5934(1995)）、EBV由来抗原（Int.Immunol.，7:p653(1995)）等が挙げられる。
癌抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドとしては、特に限定はないが、例えば、MAGEA3ペプチド168-176（Coulie PG et al.,Immunol. Rev. 188:33(2002))、gp100ペプチド209-217（Rosenberg SA et al., Nat. Med. 4:321(1998)）、gp100ペプチド280-288（Phan GQ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8372(2003)）、Melan-Aペプチド27-35（Cormier JN et al., Cancer J. Sci. Am. 3:37(1997)）、Melan-Aペプチド26-35、Tyrosinaseペプチド1-9、Tyrosinaseペプチド368-376、gp100ペプチド280-288、gp100ペプチド457-466（Jager E et al., Int. J. Cancer 67:54(1996)）、HER-2ペプチド369-384、HER-2ペプチド688-703、HER-2ペプチド971-984（Knutson KL et al., J. Clin. Invest. 107:477(2001)）、MAGE-A12ペプチド170-178（Bettinotti MP et al., Int. J. Cancer 105:210(2003)）等が挙げられる。
癌抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドとしては、特に限定はないが、例えば、MAGEA3ペプチド168-176（Coulie PG et al.,Immunol. Rev. 188:33(2002))、gp100ペプチド209-217（Rosenberg SA et al., Nat. Med. 4:321(1998)）、gp100ペプチド280-288（Phan GQ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8372(2003)）、Melan-Aペプチド27-35（Cormier JN et al., Cancer J. Sci. Am. 3:37(1997)）、Melan-Aペプチド26-35、Tyrosinaseペプチド1-9、Tyrosinaseペプチド368-376、gp100ペプチド280-288、gp100ペプチド457-466（Jager E et al., Int. J. Cancer 67:54(1996)）、HER-2ペプチド369-384、HER-2ペプチド688-703、HER-2ペプチド971-984（Knutson KL et al., J. Clin. Invest. 107:477(2001)）、MAGE-A12ペプチド170-178（Bettinotti MP et al., Int. J. Cancer 105:210(2003)）等が挙げられる。
【0087】
また、本発明のリポソームは、感染症予防ワクチンの有効成分と組合せて投与することにより、種々の感染症、例えば、生殖器疣、尋常性疣贅、足底疣贅、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、伝染性軟属腫、天然痘、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＲＳウイルス、ノロウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ライノウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザなどのウイルス疾患；結核、マイコバクテリウムアビウム、ハンセン病などの細菌性疾患；真菌症、クラミジア、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス髄膜炎、ニューモシスチス・カリニ、クリプトスポリジウム症、ヒストプラズマ症、トキソプラズマ症、マラリア、トリパノソーマ感染およびリーシュマニア症等の感染を予防することができる。感染症予防ワクチンの有効成分としては、特に限定はないが、感染症の原因となる細菌、真菌、原虫、ウイルス等の微生物・病原体由来の物質が挙げられ、例えば、抗原タンパク質、当該タンパク質由来の抗原ペプチド（部分ペプチド）、多糖、脂質、及びそれらの組合せ等、又は前記微生物・病原体由来の物質及び担体の組合せが挙げられる。
【0088】
ウイルス抗原に由来するウイルス抗原ペプチドとしては、特に限定はないが、例えば、インフルエンザマトリックスプロテインペプチド58-66（Jager E et al., Int. J. Cancer 67:54(1996)）、HPV16 E7ペプチド86-93（van Driel WJ et al., Eur. J. Cancer 35:946(1999)）、HPV E7ペプチド12-20（Scheibenbogen C et al., J. Immunother 23:275(2000)）、HPV16 E7ペプチド11-20（Smith JWI et al., J. Clin. Oncol. 21:1562(2003)）、HSV2 gD（Berman PW et al., Science 227:1490(1985)）、CMV gB（Frey SE et al., Infect Dis. 180:1700(1999), Gonczol E. et al., Exp. Opin. Biol. Ther. 1:401(2001)）,CMV pp65（Rosa CL et al., Blood 100:3681(2002), Gonczol E. et al., Exp. Opin. Biol. Ther. 1:401(2001)）等が挙げられる。
【0089】
本発明において用いられる担体とは、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチドを化学的及び／又は物理的に結合させる物質であり、タンパク質や脂質等が挙げられ、特に限定はないが、例えば、CRM197（Vaccine. 2013 Oct 1;31(42):4827-33）、KLH（Cancer Immunol Immunother. 2003 Oct;52(10):608-16）、ウイルス様粒子（PLoS ONE 5(3): e9809）やリポソーム（J Liposome Res. 2004;14(3-4):175-89）が挙げられる。
【0090】
抗原タンパク質は、Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratoy Press(1989)等の基本書に従って、抗原タンパク質をコードするcDNAをクローニングし宿主細胞で発現させることにより調製することができる。
【0091】
抗原ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis）, Interscience，New York, 1966；ザ・プロテインズ（The Proteins）, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976）などに記載されている方法が挙げられる。
【0092】
本発明は、更に、以下を含んでいるキットを提供する：
ａ）本発明のリポソーム；
ｂ）抗原；および
ｃ）前記ａ）及びｂ）の単位投与形態を合わせて又は独立して入れるための容器もしくはデバイス。
ここで、抗原としては、ワクチンの有効成分として用いられ得る抗原であれば特に限定はないが、上述の抗原タンパク質又は該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド（部分ペプチド）等、さらにこれらと担体との複合体等が挙げられる。
ａ）本発明のリポソーム；
ｂ）抗原；および
ｃ）前記ａ）及びｂ）の単位投与形態を合わせて又は独立して入れるための容器もしくはデバイス。
ここで、抗原としては、ワクチンの有効成分として用いられ得る抗原であれば特に限定はないが、上述の抗原タンパク質又は該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド（部分ペプチド）等、さらにこれらと担体との複合体等が挙げられる。
【0093】
本発明の一態様として、ワクチンアジュバントの製造のための本発明のリポソームの使用を提供する。
また、本発明の一態様として、疾患又は状態の処置のためのワクチンの製造における、ワクチンアジュバントとしての、本発明のリポソームの使用を提供する。
また、本発明の一態様として、疾患又は状態の処置のためのワクチンの製造における、ワクチンアジュバントとしての、本発明のリポソームの使用を提供する。
【0094】
さらに、本発明の一態様として、本発明のリポソームを、抗原とともに患者に投与する工程を含む、疾患の治療、進行防止又は予防方法を提供する。
【0095】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例】
【0096】
THF：テトラヒドロフラン
EtOAc：酢酸エチル
NMP：N-メチルピロリジノン
TEA：トリエチルアミン
EtOAc：酢酸エチル
NMP：N-メチルピロリジノン
TEA：トリエチルアミン
【0097】
高速液体クロマト質量分析（ＬＣＭＳ）の測定条件は、以下の通りであり、観察された質量分析の値［ＭＳ（ｍ／ｚ）］をＭ＋Ｈで示す。
ＭＳ検出器：ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＬＣ ３０ＡＤ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ １．７ｕ Ｃ１８ １００Ａ Ｎｅｗ ｃｏｌｕｍｎ ５０×２．１ｍｍ
流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長：２５４ｎｍ
移動層：Ａ液；０．１％ギ酸水溶液
Ｂ液；アセトニトリル
タイムプログラム：
ステップ 時間（分）
１ ０．０１－１．４０ Ａ液：Ｂ液＝９０:１０～５：９５
２ １．４０－１．６０ Ａ液：Ｂ液＝５：９５
３ １．６１－２．００ Ａ液：Ｂ液＝９９：１
ＭＳ検出器：ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＬＣ ３０ＡＤ
カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ １．７ｕ Ｃ１８ １００Ａ Ｎｅｗ ｃｏｌｕｍｎ ５０×２．１ｍｍ
流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長：２５４ｎｍ
移動層：Ａ液；０．１％ギ酸水溶液
Ｂ液；アセトニトリル
タイムプログラム：
ステップ 時間（分）
１ ０．０１－１．４０ Ａ液：Ｂ液＝９０:１０～５：９５
２ １．４０－１．６０ Ａ液：Ｂ液＝５：９５
３ １．６１－２．００ Ａ液：Ｂ液＝９９：１
【0098】
コンジュゲート化合物の調製
（製造例１）
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド
（製造例１）
(4E,8E,12E,16E,20E)-N-{2-[{4-[(2-アミノ-4-{[(3S)-1-ヒドロキシヘキサン-3-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]ベンジル}(メチル)アミノ]エチル}-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエンアミド
【化22】
【0099】
工程１
公知化合物であるメチル 4-(2-(エトキシカルボニル)-3-オキソブチル)ベンゾエート(3.56g, 12.8mmol)とグアニジンカルボネート（4.61 g, 25.6 mmol）をメタノール（23 ml）に溶解し、加熱還流下７時間撹拌した。反応溶液を放冷した後、水30 ml、酢酸（0.660 ml, 11.5 mmol）を加え、析出した固体をろ取した。得られた固体をＴＨＦに懸濁させて加熱還流下１時間撹拌し、反応溶液を放冷した後ろ取した。この固体をＴＨＦ洗浄し、乾燥させることで、目的物（1.62 g, 46%）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO－ｄ６) δ2.00 (3H, s), 3.71 (2H, s), 3.82 (3H, s), 6.35(1H, br), 7.31 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.84 (2H, d, J = 8.3 Hz).
【化23】
1H-NMR (400 MHz, DMSO－ｄ６) δ2.00 (3H, s), 3.71 (2H, s), 3.82 (3H, s), 6.35(1H, br), 7.31 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.84 (2H, d, J = 8.3 Hz).
【0100】
工程２
工程１で得た化合物（1.62 g, 5.93 mmol）とN,N,N’,N’-テトラメチル-1,3-プロパンジアミン（1.41 ml, 8.89 mmol）をＴＨＦ（24 ml）に懸濁させ、2-メシチレンスルホニルクロリド（1.94 g, 8.89 mmol）を加えて、室温で２０時間撹拌した。反応溶液に水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、減圧濃縮した。得られた固体をエーテル、ヘキサンで洗浄し、乾燥させることで目的物（2.69 g, 99.6%）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO－ｄ６) δ2.20 (3H, s), 2.29 (3H, s), 2.48 (6H, s),3.84 (3H, s), 3.88 (2H, s), 6.35 (1H, br), 7.08 (2H, s), 7.19 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.85 (2H, d, J = 8.3 Hz).
【化24】
1H-NMR (400 MHz, DMSO－ｄ６) δ2.20 (3H, s), 2.29 (3H, s), 2.48 (6H, s),3.84 (3H, s), 3.88 (2H, s), 6.35 (1H, br), 7.08 (2H, s), 7.19 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.85 (2H, d, J = 8.3 Hz).
【0101】
工程３
メチル 4-((2-アミノ-4-((メシチルスルホニル)オキシ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)ベンゾエート(3.6 g, 8.0 mmol)をプロピオニトリル(80 ml)に溶解し、(S)-(+)-3-アミノ-1-ヘキサノール(5.6 g, 48 mmol)、トリフルオロ酢酸(1.2 ml, 16 mmol)を加え110℃に加熱した。36時間撹拌後室温に戻し、減圧濃縮後残渣をシリカゲルカラム（酢酸エチル：メタノール＝20:1 ～ 5:1）で精製し、目的物（2.1 g, 71 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.73 (t, J = 7.2Hz, 3H), 0.90-1.76 (m, 6H), 2.41 (s, 3H), 3.49-3.61 (m, 2H), 3.69-3.87 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 4.24 (m, 1H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
【化25】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.73 (t, J = 7.2Hz, 3H), 0.90-1.76 (m, 6H), 2.41 (s, 3H), 3.49-3.61 (m, 2H), 3.69-3.87 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 4.24 (m, 1H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
【0102】
工程４
(S)-メチル 4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシヘキサン-3-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)ベンゾエート](2.1 g, 5.6 mmol)をテトラヒドロフラン(56 mL)/メタノール(5.6 mL)に溶解し水素化ホウ素リチウム（3M テトラヒドロフラン溶液）(5.6 mL, 17 mmol)を加え60℃に加熱した。2時間撹拌後、水素化ホウ素リチウム（3M テトラヒドロフラン溶液）(5.6 mL, 17 mmol)を追加し、さらに60℃で2時間撹拌した。0℃に冷却後、4N 塩酸(30 mL)を加え室温で1時間撹拌し、炭酸水素ナトリウム水溶液を加え中和した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮することにより粗目的物（1.2 g）を得た。
1H-NMR (CD3OD) δ 0.78 (t, J = 7.2Hz, 3H), 1.03-1.76 (m, 6H), 2.18 (s, 3H), 3.41-3.48 (m, 2H), 3.76-3.88 (m, 2H), 4.23 (m, 1H), 4.55 (s, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
【化26】
1H-NMR (CD3OD) δ 0.78 (t, J = 7.2Hz, 3H), 1.03-1.76 (m, 6H), 2.18 (s, 3H), 3.41-3.48 (m, 2H), 3.76-3.88 (m, 2H), 4.23 (m, 1H), 4.55 (s, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
【0103】
工程５
(S)-3-((2-アミノ-5-(4-(ヒドロキシメチル)ベンジル)-6-メチルピリミジン-4-イル)アミノ)ヘキサン-1-オール (1.2g, 3.5 mmol)をクロロホルム(35 ml)/メタノール(3.5 mL)に溶解し、二酸化マンガン(3.1 g, 35 mmol)を加えた。一晩撹拌した後、反応液をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝99:1 ～ 4:1）で精製し、目的物（0.72 g、37 % (2工程)）を得た。
1H-NMR (CD3OD) δ 0.70 (t, J = 7.2Hz, 3H), 1.05-1.77 (m, 6H), 2.20 (s, 3H), 3.42-3.50 (m, 2H), 3.90-4.03 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 9.93 (s, 1H).
【化27】
1H-NMR (CD3OD) δ 0.70 (t, J = 7.2Hz, 3H), 1.05-1.77 (m, 6H), 2.20 (s, 3H), 3.42-3.50 (m, 2H), 3.90-4.03 (m, 2H), 4.32 (m, 1H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 9.93 (s, 1H).
【0104】
工程６
(S)-4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシヘキサン-3-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)ベンズアルデヒド (0.28 g, 0.82 mmol)をクロロホルム (8 mL)に溶解し、t-ブチル (2-(メチルアミノ)エチル)カルバメート (0.29 g, 1.6 mmol)、酢酸 (0.23 mL, 4.1 mmol)及びトリアセトキシ水素化ほう素ナトリウム(0.52 g, 2.5 mmol)を加えた。室温で一晩撹拌した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮し残渣をアミノシリカゲルカラム（酢酸エチル：メタノール＝99:1～95:5）で精製し、粗目的物（0.23 g, 56 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.66 (t, J = 7.2Hz, 3H), 0.91-1.77 (m, 6H), 1.40 (s, 9H), 2.12 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.39-2.44 (m, 2H), 3.15-3.46 (m, 4H), 3.43 (s, 2H), 3.61-3.86 (m, 2H), 4.05(m, 1H), 4.67-4.77 (br, 2H), 4.91-5.01 (br, 1H), 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
【化28】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.66 (t, J = 7.2Hz, 3H), 0.91-1.77 (m, 6H), 1.40 (s, 9H), 2.12 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.39-2.44 (m, 2H), 3.15-3.46 (m, 4H), 3.43 (s, 2H), 3.61-3.86 (m, 2H), 4.05(m, 1H), 4.67-4.77 (br, 2H), 4.91-5.01 (br, 1H), 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H).
【0105】
工程７
(S)-t-ブチル (2-((4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシヘキサン-3-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)ベンジル)(メチル)アミノ)エチル)カルバメート(0.150 g, 0.29 mmol)をクロロホルム (4 mL)に溶解し、塩化水素 （4Mシクロペンチルメチルエーテル溶液(2.2 ml, 8.80 mmol)）を加えた。室温で1時間撹拌させた後、減圧濃縮した。(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン酸(123 mg, 0.262 mmol)、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-1-イウム3-オキシド・ヘキサフルオロホスファート(150 mg, 0.393 mmol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン (0.137 ml, 0.787 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (3 ml)に溶解し5分撹拌させた後、粗生成物をN,N-ジメチルホルムアミド (3 ml)で溶解させた溶液を加えた。室温で一晩撹拌した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮し残渣をアミノシリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール＝99:1～90:10）で精製し、目的物（80 mg, 32 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.71 (t, J = 7.2Hz, 3H), 0.92-1.83 (m, 27H), 1.95-2.08 (m, 20H), 2.18-2.32 (m, 10H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.28-3.43 (m, 4H), 3.46 (s, 2H), 3.64-3.81 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 4.48-4.58 (br, 2H), 5.06-5.17 (m, 6H), 5.94-6.04 (br, 1H), 7.06 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.0 Hz, 2H). ESI: [M+H]+ 852.6
【化29】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.71 (t, J = 7.2Hz, 3H), 0.92-1.83 (m, 27H), 1.95-2.08 (m, 20H), 2.18-2.32 (m, 10H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.28-3.43 (m, 4H), 3.46 (s, 2H), 3.64-3.81 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 4.48-4.58 (br, 2H), 5.06-5.17 (m, 6H), 5.94-6.04 (br, 1H), 7.06 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.0 Hz, 2H). ESI: [M+H]+ 852.6
【0106】
（製造例２）
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン
公知化合物である(S)-4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシペンタン-2-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)-3-メトキシベンズアルデヒド(0.10 g, 0.28 mmol)、t-ブチル ピペラジン-1-カルボキシレート(0.13 g, 0.71 mmol)及び(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン酸(72 mg, 0.15 mmol)から実施例１工程６および７と同様の方法により目的物(96 mg, 23 %(2工程))を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.77 (t, J = 7.2Hz, 3H), 1.00-1.44 (m, 4H), 1.57-1.65 (m, 21H),1.88-2.04 (m, 20H), 2.23-2.38 (m, 11H), 3.38-3.74 (m, 6H), 3.44 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 4.00 (m, 1H), 4.77-4.87 (br, 2H), 5.03-5.11 (m, 6H), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H). ESI: [M+H]+ 879.6
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンジル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン
【化30】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.77 (t, J = 7.2Hz, 3H), 1.00-1.44 (m, 4H), 1.57-1.65 (m, 21H),1.88-2.04 (m, 20H), 2.23-2.38 (m, 11H), 3.38-3.74 (m, 6H), 3.44 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 4.00 (m, 1H), 4.77-4.87 (br, 2H), 5.03-5.11 (m, 6H), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H). ESI: [M+H]+ 879.6
【0107】
（製造例３）
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン
(4E,8E,12E,16E,20E)-1-(4-{4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-3-メトキシベンゾイル}ピペラジン-1-イル)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン-1-オン
【化31】
【0108】
工程１
国際公開パンフレットWO2012/066336記載された方法で製造した (S)-4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシペンタン-2-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)-3-メトキシ安息香酸 (190 mg, 0.507 mmol)と1-BOC-ピペラジン (142 mg, 0.761 mmol)をN,N-ジメチルホルミアミド(5 ml)に溶解し、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド ヘキサフルオロホスファート (289 mg, 0.761 mmol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(197 mg, 1.52 mmol)を加えて、室温で10時間撹拌した。反応溶液に水を加えてクロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル/メタノール = 20/1－5/1）で精製することにより、目的の化合物(202 mg, 73%)を無色アモルファスとして得た。
MS (ESI+): [M+H]+ 543.4
【化32】
MS (ESI+): [M+H]+ 543.4
【0109】
工程２
(S)-tert-ブチル 4-(4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシペンタン-2-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)-3-メトキシベンゾイル)ピペラジン-1-カルボキシレート (200 mg, 0.369 mmol)をクロロホルム(3.0 ml)に溶解し、４Ｍ塩酸－シクロペンチルメチルエーテル溶液 (3 ml, 12.0 mmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応溶液にトルエンを加えて減圧濃縮した。得られた残渣を、(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエン酸(166 mg, 0.355 mmol)、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド ヘキサフルオロホスファート(202 mg, 0.532 mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.185 ml, 1.065 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(5 ml)溶液に加えて、室温で6時間撹拌した。反応溶液に水を加えてクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム/メタノール20/1）で精製することにより、表題の化合物(159 mg, 50%)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.83 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.15-1.48 (m, 4H), 1.58-1.68 (m, 21H), 1.94-2.15 (m, 20H), 2.25-2.32 (m, 2H), 2.32 (s, 3H), 2.40-2.48 (m, 2H), 3.37-3.80 (m, 12H), 3.93 (s, 3H), 3.99-4.05 (m, 1H), 4.65 (brs, 2H), 4.80 (br, 1H), 5.07-5.18 (m, 6H), 6.86 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 6.97-7.00 (m, 2H). MS (ESI+): [M+H]+ 893.6
【化33】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.83 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.15-1.48 (m, 4H), 1.58-1.68 (m, 21H), 1.94-2.15 (m, 20H), 2.25-2.32 (m, 2H), 2.32 (s, 3H), 2.40-2.48 (m, 2H), 3.37-3.80 (m, 12H), 3.93 (s, 3H), 3.99-4.05 (m, 1H), 4.65 (brs, 2H), 4.80 (br, 1H), 5.07-5.18 (m, 6H), 6.86 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 6.97-7.00 (m, 2H). MS (ESI+): [M+H]+ 893.6
【0110】
（製造例４）
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル]アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド
【化34】
【0111】
工程１
国際公開パンフレットWO2012/066336号に記載された方法で製造した (S)-4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシペンタン-2-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)-3-メトキシ安息香酸(0.14 g, 0.41 mmol)およびtert-ブチル(2-アミノエチル)カルバメート(137 mg, 0.855 mmol)から、実施例３工程１と同様の方法により表題の化合物（216 mg, 78 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.81 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.07-1.40 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 2.32 (s, 3H), 3.37-3.45 (m, 3H), 3.52-3.57 (m, 2H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.58 (br, 2H), 4.75-4.77 (br, 1H), 4.97-4.99 (br, 1H), 6.95-6.98 (m, 1H), 7.22-7.23 (m, 1H), 7.27-7.31 (br, 1H), 7.47-7.49 (m, 1H).
【化35】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.81 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.07-1.40 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 2.32 (s, 3H), 3.37-3.45 (m, 3H), 3.52-3.57 (m, 2H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.58 (br, 2H), 4.75-4.77 (br, 1H), 4.97-4.99 (br, 1H), 6.95-6.98 (m, 1H), 7.22-7.23 (m, 1H), 7.27-7.31 (br, 1H), 7.47-7.49 (m, 1H).
【0112】
工程２
実施例３工程２と同様の方法により、工程１で得た化合物(205 mg, 0.397 mmol)から表題の化合物（84.0 mg, 24%）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.81 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.07-1.46 (m, 4H), 1.55-1.70 (m, 21H), 1.90-2.10 (m, 20H), 2.26-2.30 (m, 4H), 2.33 (s, 3H), 3.38-3.44 (m, 1H), 3.46-3.58 (m, 4H), 3.62-3.67 (m, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.54-4.57 (br, 2H), 4.76-4.79 (br, 1H), 5.06-5.15 (m, 6H), 6.10-6.14 (br, 1H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.38-7.41 (br, 1H), 7.45 (d, J = 1.6 Hz, 1H). MS (ESI+): [M+H]+ 867.6．
【化36】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.81 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.07-1.46 (m, 4H), 1.55-1.70 (m, 21H), 1.90-2.10 (m, 20H), 2.26-2.30 (m, 4H), 2.33 (s, 3H), 3.38-3.44 (m, 1H), 3.46-3.58 (m, 4H), 3.62-3.67 (m, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.54-4.57 (br, 2H), 4.76-4.79 (br, 1H), 5.06-5.15 (m, 6H), 6.10-6.14 (br, 1H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.38-7.41 (br, 1H), 7.45 (d, J = 1.6 Hz, 1H). MS (ESI+): [M+H]+ 867.6．
【0113】
（製造例５）
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド
4-[(2-アミノ-4-{[(2S)-1-ヒドロキシペンタン-2-イル]アミノ}-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル]-N-(2-{[(4E,8E,12E,16E,20E)-4,8,12,17,21,25-ヘキサメチルヘキサコサ-4,8,12,16,20,24-ヘキサエノイル](メチル)アミノ}エチル)-3-メトキシベンズアミド
【化37】
【0114】
工程１
国際公開パンフレットWO2012／066336号に記載された方法で製造した (S)-4-((2-アミノ-4-((1-ヒドロキシペンタン-2-イル)アミノ)-6-メチルピリミジン-5-イル)メチル)-3-メトキシ安息香酸 (0.14 g, 0.41 mmol)、及びN-(2-アミノエチル)-N-メチル カルバミン酸 t-ブチルエステル(98 mg, 0.561 mmol)から、実施例３工程１と同様の方法により表題の化合物（242 mg, 81%）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.84 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.07-1.41 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 2.31 (s, 3H), 2.91 (s, 3H), 3.39-3.44 (m, 1H), 3.45-3.55 (m, 2H), 3.56-3.61 (m, 2H), 3.62-3.67 (m, 1H), 3.73 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.55-4.59 (br, 2H), 4.74-4.78 (br, 1H), 6.94-6.97 (m, 1H), 7.21-7.24 (m, 1H), 7.47-7.50 (m, 2H).
【化38】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.84 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.07-1.41 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 2.31 (s, 3H), 2.91 (s, 3H), 3.39-3.44 (m, 1H), 3.45-3.55 (m, 2H), 3.56-3.61 (m, 2H), 3.62-3.67 (m, 1H), 3.73 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.55-4.59 (br, 2H), 4.74-4.78 (br, 1H), 6.94-6.97 (m, 1H), 7.21-7.24 (m, 1H), 7.47-7.50 (m, 2H).
【0115】
工程２
実施例３工程２と同様の方法により、工程１で得た化合物(236 mg, 0.445 mmol)から表題の化合物（149 mg, 38%）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ 0.80 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.06-1.45 (m, 4H), 1.56-1.68 (m, 21H), 1.90-2.09 (m, 20H), 2.21-2.31 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2,37-2.43 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.37-3.45 (m, 1H), 3.55-3.69 (m, 5H), 3.73 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.55-4.58 (br, 2H), 4.77-4.80 (br, 1H), 5.06-5.14 (m, 6H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.53-7.55 (br, 1H). MS (ESI+): [M+H]+ 881.6
【化39】
1H-NMR (CDCl3) δ 0.80 (t, J = 7.3Hz, 3H), 1.06-1.45 (m, 4H), 1.56-1.68 (m, 21H), 1.90-2.09 (m, 20H), 2.21-2.31 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2,37-2.43 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.37-3.45 (m, 1H), 3.55-3.69 (m, 5H), 3.73 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.97-4.03 (m, 1H), 4.55-4.58 (br, 2H), 4.77-4.80 (br, 1H), 5.06-5.14 (m, 6H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.53-7.55 (br, 1H). MS (ESI+): [M+H]+ 881.6
【0116】
リポソームの調製
脂質成分と製造例１記載の化合物とを表１に示す組成で含むクロロホルム溶液をそれぞれ調製し、必要量の溶液をナスフラスコに採取し、３７℃設定加温器にて３０分間撹拌した。窒素封入下、３７℃設定温浴下で溶媒を留去し、真空乾燥した。ＰＢＳを添加、再水和し、バス型超音波処理により薄膜をはがしてから３７℃設定加温器にて１時間撹拌した。エクストルーダー処理（室温、４００ｎｍ）を実施した後、回収し、０．２２μｍフィルター濾過滅菌を行い、リポソームを得た。
HSPC：水素添加大豆ホスファチジルコリン（日本油脂；COATSOME NC-21E）
DOPC：ジオレオイルホスファチジルコリン（日本油脂；COATSOME MC-8181）
DSPG：ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム（日本油脂；COATSOME MG-8080LS）
DOPG：ジオレオイルホスファチジルグリセロールナトリウム（日本油脂；COATSOME MG-8181LS）
DMPC：ジミリストイルホスファチジルコリン（日本油脂；COATSOME MC-4040）
EPG：卵黄ホスファチジルグリセロール（日本油脂；COATSOME NG-50LS）
Chol：コレステロール（日本油脂；Cholesterol (HP)）
脂質成分と製造例１記載の化合物とを表１に示す組成で含むクロロホルム溶液をそれぞれ調製し、必要量の溶液をナスフラスコに採取し、３７℃設定加温器にて３０分間撹拌した。窒素封入下、３７℃設定温浴下で溶媒を留去し、真空乾燥した。ＰＢＳを添加、再水和し、バス型超音波処理により薄膜をはがしてから３７℃設定加温器にて１時間撹拌した。エクストルーダー処理（室温、４００ｎｍ）を実施した後、回収し、０．２２μｍフィルター濾過滅菌を行い、リポソームを得た。
【表1】
DOPC：ジオレオイルホスファチジルコリン（日本油脂；COATSOME MC-8181）
DSPG：ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム（日本油脂；COATSOME MG-8080LS）
DOPG：ジオレオイルホスファチジルグリセロールナトリウム（日本油脂；COATSOME MG-8181LS）
DMPC：ジミリストイルホスファチジルコリン（日本油脂；COATSOME MC-4040）
EPG：卵黄ホスファチジルグリセロール（日本油脂；COATSOME NG-50LS）
Chol：コレステロール（日本油脂；Cholesterol (HP)）
【0117】
（試験例１）
各実施例のリポソームの様状外観を目視によって観察した。実施例３はクリーミング、実施例４と実施例６は沈殿をそれぞれ認めた。調製直後の各実施例リポソームを精製水で５倍希釈し、MALVERN ゼータサイザーナノを用いて動的光散乱法による粒度分布および表面電荷測定を行った（表２を参照）。実施例５の粒子径分布図とZeta電位分布図を図1に示した。多分散指数の比較的小さな実施例１と実施例５について、冷蔵庫（４℃）にて６週間静置したリポソームを精製水で５倍希釈し、MALVERN ゼータサイザーナノを用いて動的光散乱法による粒度分布および表面電荷測定を行い、調製直後とほぼ同等であることを確認した。各実施例のコンジュゲート化合物含量は外部標準法によって定量した。すなわち標準試料の極大吸収波長288nmに対する吸光度を用いて検量線を作成し、定量した。
以上の結果から、実施例１と実施例５が単分散性が高く、かつ安定性が高いことがわかった。なお、以下の試験における実施例１および実施例５のリポソームは、リポソーム調製後６週間以内に使用された。
各実施例のリポソームの様状外観を目視によって観察した。実施例３はクリーミング、実施例４と実施例６は沈殿をそれぞれ認めた。調製直後の各実施例リポソームを精製水で５倍希釈し、MALVERN ゼータサイザーナノを用いて動的光散乱法による粒度分布および表面電荷測定を行った（表２を参照）。実施例５の粒子径分布図とZeta電位分布図を図1に示した。多分散指数の比較的小さな実施例１と実施例５について、冷蔵庫（４℃）にて６週間静置したリポソームを精製水で５倍希釈し、MALVERN ゼータサイザーナノを用いて動的光散乱法による粒度分布および表面電荷測定を行い、調製直後とほぼ同等であることを確認した。各実施例のコンジュゲート化合物含量は外部標準法によって定量した。すなわち標準試料の極大吸収波長288nmに対する吸光度を用いて検量線を作成し、定量した。
【表2】
【0118】
（試験例２）
７もしくは８週齢のC57BL/6雄性マウスにオボアルブミン（OVA）(2mg/mL)と製造例１の化合物(0.008～1mg/mL)の等量混合液(100μL/マウス)を腓腹筋に筋肉内投与し初回免疫とした。さらに２週間後に等量の同混合液を腓腹筋に筋肉内投与し追加免疫とした。追加免疫から１週間後、イソフルラン吸入麻酔維持下において心臓採血を行い遠心分離により血清を回収した。血清中のOVA特異的IgG2c値を次のELISA法によって定量した。すなわち、９６wellプレートにOVA溶液(SIGMA)を添加した後、１％スキムミルク(Wako)にてブロッキングを行い、リン酸緩衝液を用いて希釈した血清サンプルを添加後、二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ１(Jackson)もしくはＩｇＧ２ｃ(Southern Bio)を添加し、SureBlue（商標）TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL)添加後、酵素反応の生成物をマイクロプレートリーダーにて測定し定量した（図２を参照）。
実施例１と実施例５のリポソームは、陰性対照群と比較して有意に強いOVA特異的ＩｇＧ２ｃ誘導を示した。特に実施例５のリポソームは、陰性対照群と比較して、OVA特異的ＩｇＧ２ｃの産生を顕著に誘導した。
７もしくは８週齢のC57BL/6雄性マウスにオボアルブミン（OVA）(2mg/mL)と製造例１の化合物(0.008～1mg/mL)の等量混合液(100μL/マウス)を腓腹筋に筋肉内投与し初回免疫とした。さらに２週間後に等量の同混合液を腓腹筋に筋肉内投与し追加免疫とした。追加免疫から１週間後、イソフルラン吸入麻酔維持下において心臓採血を行い遠心分離により血清を回収した。血清中のOVA特異的IgG2c値を次のELISA法によって定量した。すなわち、９６wellプレートにOVA溶液(SIGMA)を添加した後、１％スキムミルク(Wako)にてブロッキングを行い、リン酸緩衝液を用いて希釈した血清サンプルを添加後、二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ１(Jackson)もしくはＩｇＧ２ｃ(Southern Bio)を添加し、SureBlue（商標）TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL)添加後、酵素反応の生成物をマイクロプレートリーダーにて測定し定量した（図２を参照）。
実施例１と実施例５のリポソームは、陰性対照群と比較して有意に強いOVA特異的ＩｇＧ２ｃ誘導を示した。特に実施例５のリポソームは、陰性対照群と比較して、OVA特異的ＩｇＧ２ｃの産生を顕著に誘導した。
【0119】
（試験例３）
試験例２のマウスの脾臓細胞を調製し、OVAとブレフェルジンＡ(eBioscience)を添加後一晩培養した。細胞を回収し、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３ｅ抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体、およびFixable Viability Dye eFluor（登録商標）450(eBioscience)で染色後、Fixation/Permeabilization buffer(eBioscience)で固定した。細胞をPermeabilization buffer (eBioscience)処置後、抗体カクテルPerCP-Cy5.5標識抗IFN-γ抗体、PE-Cy7標識抗IL-2抗体、およびPE標識TNF-α (eBioscience)で染色した。FACS Cant II（BD Biosciences）およびFLOWJOソフトウェア（TreeStar）を用いてデータ取り込みおよび解析を行った。結果を図３に示す。
また、上記脾臓細胞を、eFluor450標識抗マウスCD3e抗体、Alexa Fluor（登録商標）647標識抗マウスCD8抗体、PE標識H-2Kb OVA Tetramer -SIINFEKL (MBL)およびFixable Viability Dye eFluor520(eBioscience)で染色した。FACS Cant II（BD Biosciences）およびFLOWJOソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ取り込みおよび解析を行った。結果を図４に示す。
更に、上記脾臓細胞を、抗体カクテルeFluor450標識抗マウスCD3e抗体、Alexa Fluor647標識抗マウスCD8抗体、PE-Cy7標識抗マウスCD44抗体、PerCP-Cy5.5標識抗マウスCD62L抗体およびFixable Viability Dye520(eBioscience)で染色した。FACS Cant II（BD Biosciences）およびFLOWJOソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ取り込みおよび解析を行った。結果を図５に示す。
実施例１と実施例５のリポソームは、OVA特異的１型ヘルパーT細胞、特にOVA特異的multifunctional CD4陽性Tリンパ球の割合や、MHC拘束性OVA特異的CD8陽性Tリンパ球（図３のOVAテトラマー陽性CD8T細胞）の割合、およびCD8陽性エフェクターメモリーTリンパ球の割合を陰性対照群と比較して有意に増加させた。特に、実施例５のリポソームは、OVA特異的multifunctional CD4陽性Tリンパ球の割合、およびMHC拘束性OVA特異的CD8陽性Tリンパ球の割合を陰性対照群と比較して顕著に増加させた。
試験例２のマウスの脾臓細胞を調製し、OVAとブレフェルジンＡ(eBioscience)を添加後一晩培養した。細胞を回収し、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３ｅ抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体、およびFixable Viability Dye eFluor（登録商標）450(eBioscience)で染色後、Fixation/Permeabilization buffer(eBioscience)で固定した。細胞をPermeabilization buffer (eBioscience)処置後、抗体カクテルPerCP-Cy5.5標識抗IFN-γ抗体、PE-Cy7標識抗IL-2抗体、およびPE標識TNF-α (eBioscience)で染色した。FACS Cant II（BD Biosciences）およびFLOWJOソフトウェア（TreeStar）を用いてデータ取り込みおよび解析を行った。結果を図３に示す。
また、上記脾臓細胞を、eFluor450標識抗マウスCD3e抗体、Alexa Fluor（登録商標）647標識抗マウスCD8抗体、PE標識H-2Kb OVA Tetramer -SIINFEKL (MBL)およびFixable Viability Dye eFluor520(eBioscience)で染色した。FACS Cant II（BD Biosciences）およびFLOWJOソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ取り込みおよび解析を行った。結果を図４に示す。
更に、上記脾臓細胞を、抗体カクテルeFluor450標識抗マウスCD3e抗体、Alexa Fluor647標識抗マウスCD8抗体、PE-Cy7標識抗マウスCD44抗体、PerCP-Cy5.5標識抗マウスCD62L抗体およびFixable Viability Dye520(eBioscience)で染色した。FACS Cant II（BD Biosciences）およびFLOWJOソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ取り込みおよび解析を行った。結果を図５に示す。
実施例１と実施例５のリポソームは、OVA特異的１型ヘルパーT細胞、特にOVA特異的multifunctional CD4陽性Tリンパ球の割合や、MHC拘束性OVA特異的CD8陽性Tリンパ球（図３のOVAテトラマー陽性CD8T細胞）の割合、およびCD8陽性エフェクターメモリーTリンパ球の割合を陰性対照群と比較して有意に増加させた。特に、実施例５のリポソームは、OVA特異的multifunctional CD4陽性Tリンパ球の割合、およびMHC拘束性OVA特異的CD8陽性Tリンパ球の割合を陰性対照群と比較して顕著に増加させた。
【産業上の利用可能性】
【0120】
本発明のリポソームは、ワクチン製剤に添加して用いられる、免疫賦活化作用を増強させるアジュバントとして有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
