特許 7173495 敗血症又は敗血症性ショック（ＳＳ）患者に由来する血漿中の循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂを検出する質量分析ベースの方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-08

(45)【発行日】2022-11-16

(54)【発明の名称】敗血症又は敗血症性ショック（ＳＳ）患者に由来する血漿中の循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂを検出する質量分析ベースの方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221109BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20221109BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N27/62 V

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2019546057

(86)(22)【出願日】2017-11-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-12-12

(86)【国際出願番号】 EP2017078362

(87)【国際公開番号】W WO2018083308

(87)【国際公開日】2018-05-11

【審査請求日】2020-11-06

(31)【優先権主張番号】16382509.4

(32)【優先日】2016-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518159474

【氏名又は名称】セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド

(73)【特許権者】

【識別番号】519162329

【氏名又は名称】フンダシオン インクリバ

(73)【特許権者】

【識別番号】519162341

【氏名又は名称】ウニベルシタ デ バレンシア エステュディ ヘネラル

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア ヒメネス ホセ ルイス

(72)【発明者】

【氏名】ロマ マテオ カルロス

(72)【発明者】

【氏名】パジャルド カラタユド フェデリコ ヴェ．

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１２８３８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１１－５０３０１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／１９１２８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５１６５１１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２７／６０ －２７／９２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

質量分析による測定値に基づく、ヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを検出する方法であって、
前記被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、
前記敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する前記循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を基準値、又は正常被験体の血液、血清若しくは血漿からなる生体サンプルに由来する前記循環ヒストンＨ３のレベル若しくは濃度と比較する工程と
を含み、
前記正常被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患わない健常被験体であり、
前記循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度が、トリプシンによる消化又は処理を受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当し、
前記生体サンプル中の前記循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を測定するために配列番号１の平均比を得て、
前記被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、
前記敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する前記循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を基準値、又は正常被験体の血液、血清若しくは血漿からなる生体サンプルに由来する前記循環ヒストンＨ２Ｂのレベル若しくは濃度と比較する工程と
を更に含み、
前記正常被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患わない健常被験体であり、
前記循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度が、トリプシンによる消化又は処理を受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号２のペプチド（ＬＬＰＧＥＬＡＫ）の量に相当し、
前記生体サンプル中の前記循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を測定するために配列番号２の平均比を得て、
少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度を、少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度が増大する場合には敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを示し、少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度が増大しない場合には敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを示さないという基準と比較することにより、敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを検出する、方法。

【請求項2】

循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度が、マイクロ波分解をトリプシン処理中に受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ヒストンＨ３の基準値が８６．３６ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍の増大が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを示す、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度が、マイクロ波分解をトリプシン処理中に受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号２のペプチド（ＬＬＰＧＥＬＡＫ）の量に相当する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ヒストンＨ２Ｂの基準値が２１２．０３ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍の増大が敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを示す、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

質量分析による測定値に基づく、ヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックの負の臨床的進行のリスクを検出する方法であって、
前記被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、
前記敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する前記循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を基準値と比較する工程と
を含み、
前記循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度が、トリプシンによる消化又は処理を受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当し、
前記生体サンプル中の前記循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を測定するために配列番号１の平均比を得て、
前記被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、
前記敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する前記循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を基準値と比較する工程と
を更に含み、
前記循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度が、トリプシンによる消化又は処理を受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号２のペプチド（ＬＬＰＧＥＬＡＫ）の量に相当し、
前記生体サンプル中の循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を測定するために配列番号２の平均比を得て、
少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度を、少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度が増大する場合には負の臨床的進行を示し、少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度が増大しない場合には負の臨床的進行を示さないという基準と比較することにより、負の臨床的進行のリスクを検出し、
該臨床的進行が患者の全生存期間を指す、方法。

【請求項7】

循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度が、マイクロ波分解をトリプシン処理中に受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度が、マイクロ波分解をトリプシン処理中に受けた後の前記生体サンプル中に存在する配列番号２のペプチド（ＬＬＰＧＥＬＡＫ）の量に相当する、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記ヒストンＨ３の基準値が１３４８．１３ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍の増大が負の臨床転帰のリスクを示す、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項10】

前記ヒストンＨ２Ｂの基準値が１４２６．３８ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍の増大が負の臨床転帰のリスクを示す、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

配列番号１のペプチドを含むキットの、ヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックを患うリスクを検出するための、請求項１～３、及び６～７のいずれか一項に記載の方法におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。

【請求項12】

前記ペプチドが少なくとも１種以上の重アミノ酸を用いて合成され、及び／又は、該ペプチドがＣ末端アミノ酸残基中でタグにより標識されている、請求項１１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。

【請求項13】

配列番号２のペプチドを前記キットが更に含む、請求項１１又は１２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。

【請求項14】

前記ペプチドが少なくとも１種以上の重アミノ酸を用いて合成され、及び／又は、該ペプチドがＣ末端アミノ酸残基中でタグにより標識されている、請求項１３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。

【請求項15】

開裂酵素トリプシンを前記キットが更に含む、請求項１１～１４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医療分野、特に質量分析ベースの方法を用いることによる血漿バイオマーカーの検出に基づく疾患の診断／予後診断の分野に関する。特に、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる患者における敗血症又は敗血症性ショックの診断／予後診断のための、これらの患者に由来する血漿中の循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂを検出する質量分析ベースの方法に関する。

【背景技術】

【0002】

敗血症は、生化学的異常及び臓器機能不全の存在を伴う、重度の致死的な感染に対する宿主の全身性炎症反応として規定される。敗血症は、大きな医療問題であり、毎年世界中で何百万人もの人々が罹患している。その発生率は高齢化、免疫老化、及び結果として生じる免疫障害のために増大している。さらに、敗血症は、識別されず、迅速に治療されない場合に特に、大抵の集中治療室（ＩＣＵ）において最も多い死亡原因となっている。その世界的な重要性、また公衆衛生上の懸念とみなされているにも関わらず（２０１１年には米国の総病院経費のうち２００億ドル（５．２％）超に相当する）、敗血症に対する大衆の意識は低い。

【0003】

敗血症性ショックは、特に深刻な循環異常、細胞異常及び代謝異常が敗血症単独よりも大きな死亡リスクを伴う、敗血症のサブセットと規定されるものとする。敗血症性ショックを有する患者は、適切な緊急輸液療法（volume resuscitation）にも関わらず、６５ｍｍ Ｈｇ以上の平均動脈圧を維持するための昇圧剤を必要とし、血清ラクテートレベルが２ｍｍｏｌ／Ｌ（＞１８ｍｇ／ｄＬ）を超えることによって臨床的に特定することができる。

【0004】

敗血症の短期死亡率は、１０％～４０％の範囲であり、敗血症性ショックでは３０％～６０％と高いことが報告されている。早期目標指向療法及び可能な限り早期に患者に対して行われる適切な抗生物質治療がどちらも死亡率の低下に効果的であることが証明されているが、治療の改善にも関わらず、短期死亡率は依然として非常に高い。

【0005】

敗血症過程と関連した循環ヒストンの存在が以前より研究されており、幾つかの研究から、血漿中の特定のヒストンの存在と、長期敗血症によって生じる症状との間に直接相関が示されている。循環ヒストンは、健常個体の血液中では低濃度で見られるが、重度の外傷、全身性炎症、敗血症又は組織損傷を患う患者においては、そのレベルは大きく増大する。注目すべきことに、ヒストンタンパク質は、興味深い細胞毒性能を示し、これが細菌細胞及び哺乳動物細胞に影響を及ぼし、敗血症の進行の悪化に寄与することが実証されている。

【0006】

しかしながら、その病原性と関連した各ヒストンタイプの特定の濃度レベルに関して最終的な意見の一致は見られなかった。加えて、特定のヒストンレベル及び敗血症の進行のモニタリングに用いられるその能力、並びに治療の有効性との相関は、これまでに完全には明らかになっていない。これは、殆どの場合、循環ヒストンの存在を分析し、更には循環ヒストンのレベルを定量化する特異的かつ高感度の方法がないためである。

【0007】

血漿中を循環する遊離ヒストンタンパク質を検出するイムノアッセイ（ＩＡ）が以前より用いられているが、ＩＡによって得られる結果は、低い再現性、高い誤差範囲及び低い感度を示す。加えて、半定量的ＩＡは、アッセイ間の低い一致、異なる専用抗体（各アッセイにおいて異なるエピトープを認識する）を用いるメーカーの異なるキットを使用する場合の再現性の違い、及び多様な交差反応性等の多くの欠陥を示す。さらに、誤った結果を生じ、臨床副作用を引き起こす可能性がある、抗試薬抗体及びアッセイされる生体サンプル中に存在する内因性自己抗体を含む様々な干渉がＩＡにおいて起こり得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、現行のＩＡを、診断敗血症バイオマーカー及び予後敗血症バイオマーカーの検出の感度及び特異度が増大した他の方法又は技法に置き換える必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の著者らは、現行のＩＡ法を質量分析ベースの方法に置き換えることによって、敗血症の診断及び予後診断に関係するバイオマーカーの検出の感度及び特異度の顕著な改善が見られるという結論に達した。この点で、特異的な高度に標識したスパイクイン（Spike-In）ペプチドを用いる標的化質量分析（ＭＳ）が、血液循環ヒストンの同定及び定量化に効率的かつ高感度のアプローチとして本明細書で示される。したがって、上記質量分析ベースの方法を用いることにより、敗血症及び／又は敗血症性ショックのモニタリングが、高い感度及び特異度を有する新たな手頃なバイオマーカーによって大きな利益を得る。

【0010】

この意味で、本発明では、質量分析ベースの方法、特に多重反応モニタリング標的化質量分析（ＭＲＭ－ＭＳ）及び多重反応モニタリングアプローチに基づく、敗血症又は敗血症性ショック（ＳＳ）患者に由来する血漿中の循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂを検出する新規の方法を提案する。かかる方法は、内部標準を用いたヒストンの定量化を可能とし、強い特異度及び感度の値を示す。健常対照と比較される患者に由来する生体サンプルを用いることで、本発明者らの方法を更に検証し、さらに、敗血症性ショック患者の致命的転帰と相関する血漿ヒストンレベルの閾値を設定することが可能であった。このため、上記方法は、これらの循環ヒストンの存在を伴う病理におけるヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベルの質量分析ベースの定量化の導入（implantation）のための基準を設け、疾患の進行及び臨床的介入をモニタリングする最も有益なツールを提供することができた。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＭＲＭ－ＭＳによるヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の標的化タンパク質定量の概要を示す図である。遷移（重、３００ｆｍｏｌ及び内因性）に対応するシグナルからの積分ピーク面積を示すペプチドＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＳＴＥＬＬＩＲのクロマトグラム。標的化ペプチドのピーク面積を、標準として使用される安定したスパイクインペプチドのピーク面積と比較する。ＭＳ／ＭＳスペクトルから導かれる配列特異的遷移も示す。

【図2】血漿中で検出されたヒストンＨ２Ｂ及びＨ３のレベルを示す箱ひげ図である。Ａ）菌血症を有する敗血症性ショック患者に対する健常被験体におけるＨ２Ｂ及びＨ３のレベルを表す箱ひげ図；Ｂ）生存者及び非生存ＳＳ患者からのＨ２Ｂ及びＨ３のレベルを表す箱ひげ図。箱は四分位範囲を表し、線は中央値を表し、ひげは１０パーセンタイル値及び９０パーセンタイル値を表す。レベルは、血漿中のＨ２Ｂ又はＨ３のｎｇ／ｍＬとして表される。

【図3】生存ＳＳ患者と非生存ＳＳ患者との識別のためのヒストンＨ２Ｂ（３Ａ）及びＨ３（３Ｂ）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。Ｈ２Ｂ及びＨ３のレベルのＭＲＭ－ＭＳ定量化に基づくＲＯＣ曲線。

【図4】Ａ）ＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＢ）ＳＴＥＬＬＩＲの全クロマトグラムにおいて観察される非特異的内因性多重反応モニタリング（ＭＲＭ）シグナルを示す図である。矢印は、対象のペプチドに割り当てられたピークを示す。どちらのペプチドの溶出時点でも干渉ピークは見られなかった。

【図5】対照の非敗血症ＩＣＵ（集中治療室（intense care unit））患者及び健常一般集団、敗血症患者及び敗血症性ショック患者に由来する血漿中の循環ヒストンＨ２Ｂのレベルを示す図である。箱ひげ図により４つの群におけるＨ２Ｂレベルを表す。箱は四分位範囲を表し、横線は中央値を表し、ひげは１０パーセンタイル値及び９０パーセンタイル値を表す。レベルは、Ｈ２Ｂのｎｇ／ｍＬとして表される。

【図6】純粋標準タンパク質Ｈ３．１中のＳＴＬＬＩＲのナノＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳクロマトグラムにおける強度を示す図である。

【図7】純粋標準タンパク質Ｈ２Ｂ中のＬＬＬＰＧＥＬＡＫのナノＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳクロマトグラムにおける強度を示す図である。

【図8】ヒストンＨ２ＢのペプチドＬＬＬＰＧＥＬＡＫについての応答曲線を示す図である。軽ペプチドの濃度を０．０１２μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬで変化させ、重ペプチドシグナルに対して測定した。グラフから、様々な遷移について面積形式のＭＳスペクトルとペプチド濃度との間に線形回帰が示される。

【図9】Ｈ３のペプチドＳＴＥＬＬＩＲについての応答曲線を示す図である。軽ペプチドの濃度を０．０１２μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬで変化させ、重ペプチドシグナルに対して測定した。グラフから、様々な遷移について面積形式のＭＳスペクトルとペプチド濃度との間に線形回帰が示される。

【発明を実施するための形態】

【0012】

敗血症及びＳＳの早期診断及び迅速な患者層別化は、特異的治療を適時に適当な方法で見直すことにより患者転帰を改善する可能性がある。これは、より深刻な病的状態への進行を起こしやすい患者を認識するための新たなバイオマーカーを必要とするＩＣＵの医師にとって課題である。敗血症及びＳＳの病態生理の複雑さ、並びにそれらの多くの疾病分類学的脅威が、臨床的バイオマーカーも生物学的バイオマーカーも有害転帰の予測に高度に正確であることが証明されていないことの理由である。

【0013】

ＭＲＭ－ＭＳは、バイオマーカーの発見及びバイオマーカーの検証の両方についての潜在的方法論を提供する。加えて、この方法は、バイオマーカーの臨床検証に必要とされる感度、正確性及び高スループットをもたらし、種々の発見及び検証の方法を行う必要性をなくす。血漿は、診断アッセイのためのバイオマーカーの供給源であるが、この流体中に存在するタンパク質の広ダイナミックレンジ（１０¹⁰）のために、プロテオミクス研究にとって厄介な生体マトリックスでもある。ペプチド１つ当たり単一の遷移のモニタリングが、血漿等の複雑混合物におけるペプチド定量化に十分に特異的であることが提唱されている。一方、古典的バイオマーカーは、敗血症患者の転帰の予測において一般的スコア以上の情報を追加するものではない。敗血症の診断を補完するＣＲＰ及びＰＣＴ、並びに予後バイオマーカーとしてのＰＣＴの有用性にも関わらず、敗血症の更なる知識には、高感度、特異的かつ経済的に手頃であり得る新たなバイオマーカーの発見が必要とされる。

【0014】

感染に対する非常に強力な免疫応答は、ネトーシス（NETosis）と呼ばれるプロセスによって感染と闘うためだけでなく、内皮損傷、並びに好中球及び他の免疫細胞のアポトーシスの結果としてもヒストンを血液中に放出し得る。全ヒストンタイプについて毒性が記載されているが、ヒストンタイプ及び血漿濃度を含む一部のデータは、この点で議論の余地がある。Abrams及び共同研究者は、リンカー（inter-linker）ヒストンＨ１、並びにコアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の両方について同様の細胞毒性結果を得ているが、他の著者によりＨ３、Ｈ４及び場合によってはＨ２ＢについてＨ２Ａよりも高い細胞毒性が見出されている。さらに、ヒストンは胸腺、脾臓及び血液を含むリンパ系コンパートメントにおける細胞のアポトーシスを媒介する。特に、Ｈ４がリンパ球アポトーシスを推進する主要ヒストンとして提唱されている。他の研究から、敗血症患者に由来する血漿中でヒストンＨ３及びヌクレオソームが特定されている。

【0015】

ヒストンタイプに加えて、ＩＡは、敗血症における循環ヒストンの種々のレベルをもたらしたが、以前の研究では、これまでに細胞毒性とみなされ得る厳密な濃度範囲を得ることができなかった。血漿サンプル中の循環ヒストンを定量化する高感度かつ特異的な方法を特定するために、Ｈ２Ｂ及びＨ３ヒストンのそれぞれの検出にＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＳＴＥＬＬＩＲスパイクイン（Spiked-In）ペプチドを用いるＭＲＭ－ＭＳベースの方法を開発する。

【0016】

本方法では、ＩＣＵにて最初の２４時間以内に、敗血症エピソードに対して生存者及び非生存者の両方で有意な相関係数を有する患者の特定が可能となる。両方のヒストンの存在が臨床目的で用いられ、患者がＩＣＵに到着した際の第一トリアージ基準として用いられる血漿ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の特定の濃度範囲を初めて確立することができ、また敗血症性ショックの致命的転帰の有益な予後バイオマーカーとなる。

【0017】

かかる方法論を提供し、ＩＣＵにて最初の２４時間以内に、敗血症エピソードに対して生存者及び非生存者の両方で有意な相関係数を有する最良のペプチドを選択するために、純粋標準であるＨ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ及びＨ３＿ＨＵＭＡＮタンパク質の５６００ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ質量分析計（SCIEX）を用いたナノＬＣＭＳＭＳ－ＤＩＡによる分析を行った。かかる分析から、Ｈ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮに対して合計２９個のトリプシンペプチドを９５％以上の統計的信頼度でＢＬＡＳＴにより特定することが可能であった。Ｈ３＿ＨＵＭＡＮの場合、この分析から１８個のペプチドが９５％以上の統計的信頼度で割り当てられた。

【0018】

加えて、バイオインフォマティクスプログラムであるＭＲＭ Ｐｉｌｏｔ（Sciex）及びＳｋｙｌｉｎｅ（Macoss Lab，Department of Genome Sciences，UW，USA）を用い、開裂の失敗及び修飾の影響を受けやすいアミノ酸（Ｍ／Ｗ／Ｑ／Ｎ）を有していたペプチドを切り捨てることにより、下流のＭＲＭ実験への使用に好適な候補のリストが以下のものに絞り込まれた。

【0019】

【表1】

【0020】

「デクラスタリング電圧（Declustering Potential）」及び「衝突エネルギー」等の取得パラメーターを調整する過程で、また複雑なマトリックス中での標準タンパク質の分析中に、最も強力なペプチドがＨ３．１についてはＳＴＥＬＬＩＲ、Ｈ２ＢについてはＬＬＬＰＧＥＬＡＫであることが決定され、これらが循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂ定量化のためのＭＲＭ－ＭＳ実験の候補として選ばれた。強度の違いが、各々の純粋標準タンパク質について図６及び図７に示されるナノＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳクロマトグラムにおいて説明される。

【0021】

複雑なマトリックス中でのペプチドの高信頼性の相対定量化を達成するために、標的化プロテオミクスアッセイを、その特異度、線形範囲、精度及び再現性に関して分析的に特徴付ける必要がある。血液循環ヒストンの定量化については、特異度、線形範囲、精度及び再現性が必須条件であり、したがって、本発明者らの実験条件でヒストンＨ２ＢについてはペプチドＬＬＬＰＧＥＬＡＫ、Ｈ３についてはペプチドＳＴＥＬＬＩＲの線形性を確認した。図８及び図９に、試験した各ペプチド濃度について様々な遷移を考慮した、ヒストンＨ２ＢのペプチドＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＨ３のペプチドＳＴＥＬＬＩＲのそれぞれの線形性を示す。

【0022】

これにより、結果から、各ペプチドの検出濃度がアッセイの定量限界を上回り、アッセイの線形範囲内であることが実証される。実際に、ヒストンＨ２ＢのペプチドＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＨ３のペプチドＳＴＥＬＬＩＲは、良好な線形範囲、良好な感度及び特異度を示した。本発明の文脈（context）において「定量限界」が定量下限として理解され、定量的測定を行うことができる分析物の最低濃度を指すことに留意されたい。定量上限は、その値を超えればシグナルが線形性から外れる、分析物の最高濃度を説明する。これら２つの定量限界によりアッセイの線形範囲が規定される。

【0023】

加えて、実施例に示されるように、内科ＩＣＵへの入院時にＳＳの臨床診断を受けた合計１７人の患者を分析した。表１に患者の臨床的特性を示す。血液サンプルを上記ＩＣＵ患者及び健常被験体からＥＤＴＡチューブに採取した。各サンプルを２５００ｒｐｍで室温（ＲＴ）にて１０分間遠心分離して血漿を分離した後、アリコートをＭＲＭ－ＭＳ実験において使用するまで－８０℃で保管した。ＭＲＭ実験を本明細書に含まれる実施例に記載のように行った。Ｈ２Ｂ及びＨ３ヒストンレベルを、ＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＳＴＥＬＬＩＲペプチドについて得られる平均比に基づいて予想した。Ｈ２Ｂ及びＨ３の最終濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、標的化タンパク質の相対分子質量（Ｍｒ）値（Ｈ２Ｂ及びＨ３のそれぞれについてＭｒ １３．９０６Ｄａ及び１５．４０４Ｄａ）から推定した。

【0024】

ヒストンＨ２Ｂについては、対照の健常被験体において見られた平均レベルは、２０４．４８ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ２５．３１～２８３．６６）であり、患者では１７３６．９１ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ５５５．３４～２９１８．４７）まで増大した。観察される差は統計的に有意であり（ｐ＝０．０１４）、平均レベルが対照については２３．５０ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ －３．９７～５０．９８）、患者については２０４０．７９ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ７５６．５８～３３２５．０１）であったヒストンＨ３でより高かった（ｐ＝０．００４）（図２Ａ）。

【0025】

ヒストンのレベルは、両方の群において有意な相関係数で正に相関した（対照についてはスピアマン係数ｒ＝０．８４８、ｐ＝０．００２、患者についてはｒ＝０．８２７、ｐ＜０．０００１）。

【0026】

これらの生存患者については、ＩＣＵにて最初の２４時間以内の両方のヒストンの平均レベルは、非生存者と比較して有意に低く（図２Ｂ）、値は非生存者において検出されたレベルと比較して最大５分の１であった。ヒストンＨ２Ｂについては、平均レベルは、生存者では６０７．００ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ２０４．２０～１００９．８２）、非生存者では３００８．０５ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ６０３．９４～５４１２．１５）であり（ｐ＝０．０４６）、ヒストンＨ３のレベルに関して同じ比例差が観察され、観察された平均値は、生存者で７４０．７０ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ３１１．１６～１１７０．２３）、非生存者で３５０３．４１ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ９５５．９５～６０５０．８６）であった（ｐ＝０．０３６）。

【0027】

加えて、実施例に示されるように、ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３のレベルの診断力を評価するために行ったＲＯＣ曲線分析から、それらの両方が敗血症性ショック症例と健常対照とを区別するのに有益なバイオマーカーとなり得ることが明らかとなった。各ヒストンについてのＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）、標準誤差、信頼区間（ＣＩ）、最適濃度カットオフ値、感度及び特異度を表２に示す。

【0028】

両方のヒストンについてのＡＵＣは同様であるが、両方のバイオマーカーのレベルは健常対照と患者とで有意に異なり、ヒストンＨ３は、診断に関する感度及び特異度についてより高い値を示した。このバイオマーカーについては、最適カットオフ値としての濃度８６．３６ｎｇ／ｍＬで、方法の感度及び特異度の値は、それぞれ９４．１％及び９０．０％であった。

【0029】

さらに、敗血症性ショックの予後診断のバイオマーカーとしての血漿中のヒストンの潜在的使用を検討するために、各ヒストンについて対応するＲＯＣ曲線を作成した。生存者と非生存者とを識別するために、症例のみを選択し、バイオマーカーのパラメーター：最適カットオフ値、感度及び特異度を算出した（図３）。この場合も、ヒストンＨ３は、予後診断についてヒストンＨ２Ｂよりも良好であると分類された。感度値は、同様のカットオフ値でヒストンＨ２Ｂ（感度＝６２．５％、特異度＝８８．９％、カットオフ値＝１４２６．３８ｎｇ／ｍＬ）よりもヒストンＨ３（感度＝７５．０％、特異度＝８８．９％、カットオフ値＝１３４８．１３ｎｇ／ｍＬ）について高かった。

【0030】

したがって、本明細書に示される結果から、血液、血清又は血漿中のヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の両方のレベルが、敗血症性ショック症例と健常対照とを区別し、生存者と非生存者とを識別するために有益なバイオマーカーとなり得ることが明らかである。

【0031】

その結果として、本発明の第１の態様は、ヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックを診断又は検出する質量分析ベースの方法であって、被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル又は濃度を基準値、又は正常被験体の血液、血清若しくは血漿からなる生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル若しくは濃度と比較する工程とを含み、正常被験体が敗血症又は敗血症性ショックを患わない健常被験体であり、少なくとも循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂのレベル又は濃度の増大が敗血症又は敗血症性ショックを示唆する、質量分析ベースの方法に関する。

【0032】

患者がＩＣＵに到着した際の第一トリアージ基準として使用され、また敗血症又は敗血症性ショックの有益な診断バイオマーカーとなる血漿ヒストンＨ２Ｂ及び／又はＨ３の特定の濃度範囲は、血漿中の循環ヒストンＨ２Ｂの濃度レベルが２１２．０３ｎｇ／ｍｌを上回り、及び／又は血漿中の循環ヒストンＨ３の濃度レベルが８６．３６ｎｇ／ｍｌを上回る範囲であるのが好ましい。血漿中のＨ２Ｂ又はＨ３の濃度レベルが上記値のいずれかを超える場合、敗血症又は敗血症性ショックが示唆される。

【0033】

質量分析計は、好ましくはクロマトグラフシステムを備え、より好ましくはナノＬＣクロマトグラフシステムを備える三連四重極型／線形イオントラップ質量分析計であるのが好ましい。本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによるヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックを診断又は検出する質量分析ベースの方法において、循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度は、配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当するのが好ましい。この意味で、生体サンプル中の循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を測定するために、配列番号１の対象のペプチドのシグナル／スパイクインペプチドのシグナルの比率として理解される平均比を得る。同じ理由から、生体サンプル中の循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を測定するために、配列番号２（ＬＬＬＰＧＥＬＡＫ）の平均比を得る。より好ましくは、選択されるペプチド配列（Ｈ３についてはＳＴＥＬＬＩＲ、Ｈ２ＢについてはＬＬＬＰＧＥＬＡＫ）は、好ましくは本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによる方法における循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂの絶対的定量化のためのＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ（商標）＿ＴＱ（Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ４；Ｌｙｓ：Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ２等の重同位体で標識される）（JPT Peptide Technologies，Berlin，Germany）として調製することができる。

【0034】

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、ヒストンＨ３の基準値は８６．３６ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍の増大が敗血症又は敗血症性ショックを示唆する。

【0035】

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、ヒストンＨ２Ｂの基準値は２１２．０３ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍の増大が敗血症性ショックを示唆する。

【0036】

本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態では、上記方法は、被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル又は濃度を基準値、又は正常被験体の血液、血清若しくは血漿からなる生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル若しくは濃度と比較する工程とを含み、正常被験体は敗血症性ショックを患わない健常被験体であり、少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度の増大が敗血症性ショックを示唆する。

【0037】

本発明の第２の態様は、敗血症又は敗血症性ショックを患うヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックの臨床的進行を予測する（予後判定する）質量分析ベースの方法であって、被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、敗血症又は敗血症性ショックを患う被験体の１種以上の生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル又は濃度を基準値と比較する工程とを含み、少なくとも循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂのレベル又は濃度の増大が負の臨床的進行を示唆し、臨床的進行が患者の全生存期間を指す、質量分析ベースの方法に関する。

【0038】

本発明の文脈において、「全生存期間」（ＯＳ）は、疾患の診断日又は治療開始のいずれかからの疾患と診断された患者が生存している時間の長さとして理解される。

【0039】

本発明の文脈において、「負の臨床的進行」は、治療に対して応答不良又は不応であり、死亡転帰を有する敗血症又は敗血症性ショックの最初の１週間にわたる臨床状態の負の日常的進行として理解される。

【0040】

患者がＩＣＵに到着した際の第一トリアージ基準として使用され、また敗血症又は敗血症性ショックの有益な予後バイオマーカーとなる血漿ヒストンＨ２Ｂ及び／又はＨ３の特定の濃度範囲は、血漿中の循環ヒストンＨ２Ｂの濃度レベルが１４２６．３８ｎｇ／ｍｌを上回り、及び／又は血漿中の循環ヒストンＨ３の濃度レベルが１３４８．１３ｎｇ／ｍｌを上回る範囲であるのが好ましい。血漿中のＨ２Ｂ又はＨ３の濃度レベルが上記値のいずれかを超える場合、負の臨床的進行が示唆され、ここで、臨床的進行は患者の全生存期間を指す。

【0041】

質量分析計は、クロマトグラフシステムを備え、より好ましくはナノＬＣクロマトグラフシステムを備える三連四重極型／線形イオントラップ質量分析計であるのが好ましい。本発明の第２の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによる敗血症性ショックを患うヒト被験体における敗血症性ショックの臨床的進行を予測する（予後判定する）質量分析ベースの方法において、循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度は、配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当するのが好ましい。この意味で、生体サンプル中の循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を測定するために、配列番号１の平均比を得る。同じ理由から、生体サンプル中の循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を測定するために、配列番号２の平均比を得る。より好ましくは、選択されるペプチド配列（Ｈ３についてはＳＴＥＬＬＩＲ、Ｈ２ＢについてはＬＬＬＰＧＥＬＡＫ）は、好ましくは本発明の第１の態様又はその好ましい実施形態のいずれかによる方法における循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂの絶対的定量化のためのＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ（商標）＿ＴＱ（Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ４；Ｌｙｓ：Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ２等の重同位体で標識される）（JPT Peptide Technologies，Berlin，Germany）として調製することができる。

【0042】

本発明の第２の態様の別の好ましい実施形態では、ヒストンＨ３の基準値は１３４８．１３ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍の増大が負の臨床的進行を示唆する。

【0043】

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、ヒストンＨ２Ｂの基準値は１４２６．３８ｎｇ／ｍＬであり、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍の増大が負の臨床的進行を示唆する。

【0044】

本発明の第２の態様又はその好ましい実施形態のいずれかの別の好ましい実施形態では、上記方法は、被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、敗血症性ショックを患う被験体の１種以上の生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル又は濃度を対照値と比較する工程とを含み、少なくとも循環ヒストンＨ３及びＨ２Ｂのレベル又は濃度の増大が負の臨床的進行を示唆する。

【0045】

本発明の第３の態様は、ヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックの診断又は検出、及び／又はヒト被験体における敗血症又は敗血症性ショックの臨床的進行の予測（予後判定）に好適なキット又はデバイスであって、配列番号１のペプチド及び／又は配列番号２のペプチドを含み、これらのペプチドが好ましくは少なくとも１種以上の重アミノ酸を用いて合成され、該ペプチドが好ましくはＣ末端アミノ酸残基中でタグにより標識される、キット又はデバイスに関する。

【0046】

本発明の文脈において、「タグ」という用語は、非標識アミノ酸対応物と同じ生理化学的性質及び同じ化学的活性を有する、安定した同位体標識アミノ酸として理解される。タグは、ＭＳ実験より前にトリプシン又は他のプロテアーゼ処理中に切断される小さな化学修飾であってもよい。プロテオタイプ（proteotypic）ペプチドに連結したタグが標的化ＭＳ実験におけるペプチド定量化に用いられる。

【0047】

本発明の文脈において、「重アミノ酸」という用語は、ＭＳによって識別することができる重原子、例えば¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁷Ｏ及び／又は³⁴Ｓを含有するタグ中に組み込まれる同位体原子を指す。

【0048】

本発明の文脈において、「少なくとも１種以上の重アミノ酸を用いて合成された」という用語は、配列番号１及び配列番号２に対応するスパイクインアミノ酸配列中の少なくとも１種以上の重原子¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁷Ｏ及び／又は³⁴Ｓを含有する「タグ」として理解される。

【0049】

本発明の第３の態様の好ましい実施形態では、キットは配列番号１のペプチド及び配列番号２のペプチドを含み、これらのペプチドは、好ましくは少なくとも１種以上の重アミノ酸を用いて合成され、該ペプチドは、好ましくはＣ末端アミノ酸残基中でタグにより標識される。

【0050】

本発明の第３の態様の別の好ましい実施形態では、キットは、同位体タグを有する配列番号１及び配列番号２に対応する（希釈又は凍結乾燥された）ペプチドの群を含み得る。キットは、キット内の材料を用いることができる方法を示す使用説明書も含み得る。

【0051】

任意に（付加的に）、キットはトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパインペプシン、パパイン、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（Ｖ８）プロテアーゼ、顎下腺（Submaxillaris）プロテアーゼ、ブロメライン、テルモリシン、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ等の開裂酵素を含んでいてもよい。キットはまた、ＣＮＢｒ、酸等の化学試薬、又はタンパク質由来ポリペプチドの化学的生成のための他の化学試薬を含んでいてもよい。

【0052】

任意に、トリプシンペプチドの形成を加速するためにマイクロ波分解（microwave-assisted digestion）をトリプシン処理中に用いてもよい（P Muralidhar Reddy, et al. Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 21, Issue 3, March 2010, Pages 421-424）。キットはトリプシン、並びに配列番号１及び配列番号２の最適分析のための特別なマイクロ波分解プロトコルを含み得る。

【0053】

本発明の第４の態様は、ヒト被験体における敗血症性ショックを診断若しくは検出するため、又はヒト被験体における敗血症性ショックの臨床的進行を予測する（予後判定する）ための本発明の第３の態様又はその好ましい実施形態のいずれかに規定されるキットのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。

【0054】

本発明の第５の態様は、製品をコンピュータ上で実行した場合に、敗血症性ショックを患う被験体の１種以上の生体サンプルに由来する循環ヒストンのレベル又は濃度を対照値と比較する工程と、ＳＳを患うリスク又は被験体の負の臨床的進行のリスクを定める工程とを行うためのソフトウェアコード部分を含む、デジタルコンピュータの内部メモリに直接ロード可能なコンピュータプログラム製品に関する。

【0055】

加えて、本明細書の実施例２に示されるように、本発明は、本発明の第６の態様において、敗血症と敗血症性ショックとの、これらの病理のいずれかを患うことが疑われるヒト被験体における鑑別診断の方法であって、被験体から単離された血液、血清又は血漿からなる１種以上の生体サンプル中の少なくとも循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂのレベル又は濃度を、質量分析計を用いることによって測定する工程と、敗血症又は敗血症性ショックを患うことが疑われる被験体の１種以上の生体サンプルに由来する上記循環ヒストンのレベル又は濃度を基準値と比較する工程とを含み、少なくとも循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度の増大が敗血症性ショックを示唆する、鑑別診断の方法にも関する。

【0056】

本発明の第６の態様の好ましい実施形態では、循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度は、配列番号１のペプチド（ＳＴＥＬＬＩＲ）の量に相当する。この意味で、生体サンプル中の循環ヒストンＨ３のレベル又は濃度を測定するために、配列番号１の平均比を得る。同じ理由から、生体サンプル中の循環ヒストンＨ２Ｂのレベル又は濃度を測定するために、配列番号２の平均比を得る。より好ましくは、選択されるペプチド配列（Ｈ３についてはＳＴＥＬＬＩＲ、Ｈ２ＢについてはＬＬＬＰＧＥＬＡＫ）は、循環ヒストンＨ３及び／又はＨ２Ｂの絶対的定量化のためのＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ（商標）＿ＴＱ（Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ４；Ｌｙｓ：Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ２等の重同位体で標識される）（JPT Peptide Technologies，Berlin，Germany）として調製することができる。

【0057】

本発明の第６の態様の別の好ましい実施形態では、質量分析計は、クロマトグラフシステムを備え、より好ましくはナノＬＣクロマトグラフシステムを備える三連四重極型／線形イオントラップ質量分析計である。

【0058】

本発明の第７の態様は、敗血症と敗血症性ショックとの、これらの病理のいずれかを患うことが疑われるヒト被験体における鑑別診断のための配列番号１のペプチド及び／又は配列番号２のペプチドを含むキットのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用であって、これらのペプチドが好ましくは少なくとも１種以上の重アミノ酸を用いて合成され、該ペプチドが好ましくはＣ末端アミノ酸残基中でタグにより標識される、キットのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。本発明の第３の態様の別の好ましい実施形態では、キットは、同位体タグを有する配列番号１及び配列番号２に対応する（希釈又は凍結乾燥された）ペプチドの群を含み得る。キットは、キット内の材料を用いることができる方法を示す使用説明書も含み得る。任意に（付加的に）、キットはトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパインペプシン、パパイン、黄色ブドウ球菌（Ｖ８）プロテアーゼ、顎下腺プロテアーゼ、ブロメライン、テルモリシン、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ等の開裂酵素を含んでいてもよい。キットはまた、ＣＮＢｒ、酸等の化学試薬、又はタンパク質由来ポリペプチドの化学的生成のための他の化学試薬を含んでいてもよい。

【0059】

任意に、トリプシンペプチドの形成を加速するためにマイクロ波分解をトリプシン処理中に用いてもよい（P Muralidhar Reddy, et al. Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 21, Issue 3, March 2010, Pages 421-424）。キットはトリプシン、並びに配列番号１及び／又は配列番号２の最適分析のための特別なマイクロ波分解プロトコルを含み得る。

【0060】

本発明の第８の態様は、製品をコンピュータ上で実行した場合に、敗血症性ショックを患う被験体の１種以上の生体サンプルに由来する循環ヒストンのレベル又は濃度を基準値と比較する工程と、敗血症と敗血症性ショックとの、これらの病理のいずれかを患うことが疑われるヒト被験体における鑑別診断をもたらす工程とを行うためのソフトウェアコード部分を含む、デジタルコンピュータの内部メモリに直接ロード可能なコンピュータプログラム製品に関する。

【0061】

以下の実施例は、本発明を単に説明するものであり、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0062】

材料及び方法
患者及び対照被験体の選択
Clinical University Hospital of Valencia（HCUV）（Valencia，Spain）の内科ＩＣＵへの入院時にＳＳの臨床診断を受け、続いて菌血症が確認された（４８時間の微生物学的血液陽性培養）、合計１７人の患者が本研究に参加した。除外基準は、ｉ）余命が２４時間未満の患者、ｉｉ）１８歳～８５歳の年齢範囲外の患者、ｉｉｉ）活性な腫瘍形成過程を有するか又は抗酸化剤で治療された患者、ｉｖ）病棟又は別の病院に２４時間を超えて入院している患者、ｖ）外科患者、又は心肺機能蘇生後の状態の患者、又はウイルス感染が疑われる患者とし、妊婦、及び同意が得られなかった患者も除外した。患者及び対照は、HCUVのBiomedical Research Ethics Committee（CEIC）及びIBSP-CV Biobank（Biobank for Biomedical Research and Public Health in the Valencian Community，Spain）による認可の後に研究に登録された。

【0063】

血液採取
血液サンプルをＩＣＵ患者及び健常被験体からＥＤＴＡチューブに採取した。各サンプルを２５００ｒｐｍで室温（ＲＴ）にて１０分間遠心分離して血漿を分離した後、アリコートをＭＲＭ－ＭＳ実験において使用するまで－８０℃で保管した。

【0064】

スパイクインペプチドの線形性の評定
初めに、市販の精製ヒトヒストンＨ３及びＨ２Ｂ（EpiGex，Illkirch，France）をトリプシン処理し、５６００ ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ（AB Sciex，Framingham，MA，USA）においてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ＿ＤＤＡを用いて分析して、良好なシグナルを有するこれらの明確なペプチドを特定した。種々のフラグメント化スペクトル（ＭＳＭＳ）から、ペプチド前駆体及びフラグメントイオン質量をＭＲＭ－ＭＳについて分析されるＨ３及びＨ２Ｂについて選択した。ＭＲＭパラメーターを５５００ ＱＴＲＡＰ機器（AB Sciex）においてＭＲＭ－ＰＩＬＯＴソフトウェア（AB Sciex）によって最適化し、全ペプチドについてのデクラスタリング電圧（ＤＰ）、並びに各遷移についての滞留時間（ＤＴ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）を決定した。その後、多数の検出可能な遷移、高い感度及び高い線形ダイナミックレンジを有するヒストン由来ペプチドを、ＭＲＭ－ＭＳ実験を行うために選んだ。選択されたペプチド配列（Ｈ３についてはＳＴＥＬＬＩＲ、Ｈ２ＢについてはＬＬＬＰＧＥＬＡＫ）を、絶対的定量化のためのＳｐｉｋｅＴｉｄｅｓ（商標）＿ＴＱ（Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ４；Ｌｙｓ：Ａｒｇ：¹³Ｃ６、¹⁵Ｎ２等の重同位体で標識される）（JPT Peptide Technologies，Berlin，Germany）として調製した。

【0065】

サンプル調製
タンパク質含量を、ブラッドフォード法（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）によって測定した。１μＬの血漿（非除去）を、２０μＬの１：１重炭酸アンモニウム０．１／トリフルオロエタノール溶液で希釈した。各１μｇのタンパク質含量について、３００ｆｍｏｌの両方の重ペプチドを添加した。次いで、システイン残基を、１０ｍＭ ＤＬ－ジチオトレイトールの添加によって５６℃で３０分間還元した。スルフヒドリル基を、１４ｍＭヨードアセトアミドにより暗所においてＲＴで３０分間アルキル化した。過剰分を、１００μＬの最終容量の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭ ＤＬ－ジチオトレイトールにより３０分にわたってＲＴで中和した。サンプルを、１μｇのシークエンシンググレード修飾トリプシン（ＴＣＰＫ Ｔｒｙｐｓｉｎ、AB Sciex）によるトリプシン消化に３７℃で一晩供した。反応を最終濃度１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で停止した。サンプルを、ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて乾燥させ、５０μＬのＴＦＡ（０．１％）に再懸濁した。ペプチドを濃縮し、ＺｉｐＴｉｐ Ｃ１８チップ（Merck Millipore，Darmstadt，Germany）を用いて精製した。最後に、サンプルを注射のために２％アセトニトリル（ＣＡＮ）、０．１％ギ酸（ＦＡ）で希釈した。

【0066】

ＭＲＭ－ＭＳ
ＭＲＭ実験を、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ １Ｄ＋ｐｌｕｓナノＬＣクロマトグラフシステムを備える５５００ ＱＴＲＡＰハイブリッド三連四重極型／線形イオントラップ質量分析計（AB Sciex）で行った。トリプシン消化物（１μｇのタンパク質及び３００ｆｍｏｌの各スパイクインペプチド）をナノＬＣトラップカラム３μ Ｃ１８－ＣＬ（Eksigent，Dublin，CA，USA）に注入した後、１５ｃｍの分析用ナノＬＣカラム３μ Ｃ１８－ＣＬ（Eksigent）でＲＰ－ＨＰＬＣによって分離した。クロマトグラフィーを、溶媒Ａ（０．１％ＦＡ）及び溶媒Ｂ（１００％ＡＣＮ、０．１％ＦＡ）を移動相として用い、３００ｎｌ／分の流量の直線勾配（２％Ｂ→５０％Ｂで７０分間）を用いて行った。ＭＲＭデータをスプレー電圧２８００Ｖ、カーテンガス：２０ｐｓｉ、イオン源ガス：２０ｐｓｉ、インターフェースヒーター温度（interface heater temperature）（ＩＨＴ）：１５０℃、ＤＰ：８０、エントランス電位：１０、イグジット電位（ＥＸＰ）：１５、及び休止時間３ｍｓのポジティブモードで取得した。衝突エネルギー（ＣＥ）は、ＬＬＬＰＧＥＬＡＫ－ＬＬＬＰＧＥＬＡ［Ｋ］及びＳＴＥＬＬＩＲ－ＳＴＥＬＬＩ［Ｒ］のそれぞれについて２６Ｖ及び２３Ｖであった。遷移（ＳＴＥＬＬＩＲ及びＳＴＥＬＬＩ［Ｒ］について９、ＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＬＬＬＰＧＥＬＡ［Ｋ］について１２）を、Ｑ１及びＱ３四重極の両方におけるユニット分解能、並びにそれぞれについて４０ｍｓの滞留時間を用いてモニタリングした。データ分析を、Ａｎａｌｙｓｔ（商標） １．５．２及びＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（商標） ２．０．２ソフトウェア（AB Sciex）を用いて行った。全ての遷移についての面積比（軽／重）を算出し、平均面積比を統計分析に用いた。

【0067】

Ｈ２Ｂ及びＨ３ヒストンレベルを算出するために、ＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＳＴＥＬＬＩＲについて得られた平均比を用いた。Ｈ２Ｂ及びＨ３の最終濃度（ｍｇ／ｍＬ）を、標的化タンパク質の相対分子質量（Ｍｒ）値（Ｈ２Ｂ及びＨ３のそれぞれについてＭｒ １３．９０６Ｄａ及び１５．４０４Ｄａ）から推定した。

【0068】

統計分析
参加者の人口統計学的及び臨床的ベースライン特性を、年齢についてはスチューデントの検定、性別についてはカイ二乗検定を用いて群間で比較した。ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の濃度をスチューデントの検定、ＡＮＯＶＡ及びマン－ホイットニーのＵ検定等のパラメトリック検定及びノンパラメトリック検定を用いて比較した。Ｈ２Ｂ及びＨ３レベル、急性生理及び慢性健康状況の評価（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation）II（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）及び続発性臓器不全評価（Sequential Organ Failure Assessment；ＳＯＦＡ）スコア、ラクテート及びプロトロンビン時間の相関を、スピアマンの相関を用いて評定した。

【0069】

ＳＳの診断及び予後診断のバイオマーカーとしてのヒストンＨ２Ｂ及びＨ３のレベルの値を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の分析によって得た。

【0070】

０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。全ての分析を、ＳＰＳＳ ｖ．２０（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）を用いて行った。

【0071】

実施例１．結果
コホートの概要
内科ＩＣＵへの入院時にＳＳの臨床診断を受けた合計１７人の患者を分析した。年齢の中央値は６７歳（３７歳～８５歳）であり、男性患者が症例の６７％を占めた。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアの中央値は２５（１４～４４）であり、ＳＯＦＡスコアの中央値は１０（３～１９）であった。

【0072】

表１に患者の臨床的特性を示す。

【0073】

【表2】

【0074】

９人（５３％）の生存者及び８人（４７％）の非生存者であった。どちらの群も人口統計学的特性、チャールソン指数による入院時の併存症及び重症度に関して同様であったが、非生存者は、より高い平均ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアの傾向を有していた。感染源及び血液サンプル中で特定された微生物に関して両方の群間に差は見られず、多剤耐性及びグラム分析基準も考慮しなかった。

【0075】

初期管理は、ＳＳ患者の両方の群で同様であった。生存者及び非生存者に、ＳＳの認識後１時間以内の静脈内抗菌剤療法及び輸液による蘇生（配合禁忌（formal contraindication）の非存在下で血行動態を改善するための少なくとも２０ｍＬ／ｋｇの静脈内クリスタロイドの初回投与）を同レベルで行った。続いて、生存者群の全患者に決定的な血液培養結果に基づく「適切な」抗菌剤療法を行ったが、この値は非生存者については７５％であった。臓器支持療法によると、全患者が最初に血管作用薬を必要とし（ＳＳ組み入れ基準を考慮する）、５０％を超える患者集団を、両方の群の不応性状況に基づいてコルチコステロイドで治療した。輸液による蘇生後にラクテートレベルが１０％超低下した患者の死亡率は、そうでない患者の８３％に対して２７％であり、ＩＣＵ死亡率のオッズ比（ＯＲ）は、この代謝産物を排出する患者について０．４（ＩＣ ０．１６～１．０６）であった。両方の患者群間にＩＣＵ及び病院滞在日数の中央値に関する差は観察されなかった。

【0076】

ＩＣＵ滞在の１日目の患者の血液検査結果に関して、両方の群間に僅かな差が見られた。炎症性パラメーター（白血球数、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びプロカルシトニン（ＰＣＴ）レベル）、並びに均一な臨床的低灌流を反映するラクテートの最初のレベルは同等であった。両方の群間で有意な差が療法の６時間後のラクテートレベル、プロトロンビン時間及び動脈酸素分圧対吸気酸素濃度（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）比に観察され、この場合も非生存者群におけるより悪い状況及びより進行した臓器機能不全が示された。

【0077】

合計１０人の健常対照を採用したが、症例よりも若く、男性である可能性が高かった。対照の年齢の中央値は４２歳（２０歳～５６歳）であり、男性の対照が７０％を占めていた。

【0078】

Ｈ２Ｂ及びＨ３のＭＲＭ分析
初めに、ヒストンペプチドの選択をアッセイし、スパイクイン調製及び後の血液サンプルにおけるＭＲＭ－ＭＳ測定に最良のペプチドを選んだ。精製Ｈ２Ｂ及びＨ３のそれぞれのトリプシン消化によって得られるペプチドＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＳＴＥＬＬＩＲが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験において実験観察により選択された。このことは、同じタンパク質に由来する異なるペプチドがＭＳ応答について大きく異なり、血漿サンプルにおいて干渉を生じ得ることから、ＭＲＭアッセイを設計するために重要な点である。選ばれた独自のペプチド配列は良好なクロマトグラフィーパラメーター、最適なイオン化効率及び高いＭＳ／ＭＳ品質を示し、シグナルについて大きな濃度線形性を示した（データは示さない）。両方の配列をＳＳ患者及び健常被験体の血漿サンプルのスパイキングに使用した。

【0079】

図１に、血漿サンプル中のＨ２Ｂ及びＨ３を追跡する、最も強力な（先に規定したように）ＭＲＭシグナルを有するクロマトグラムを示す。１μｇのタンパク質当たり３００ｆｍｏｌのＬＬＬＰＧＥＬＡＫ及びＳＴＥＬＬＩＲをスパイキングした血漿サンプルの分析にＭｕｌｔｉｑｕａｎｔ（商標）（AB Sciex）を用いることで、ペプチドを良好なシグナル対ノイズ比で検出することができた。

【0080】

どちらのペプチドの溶出時点でも干渉ピークは見られなかった（図４）。

【0081】

ＳＳの診断及び予後診断のための潜在的バイオマーカーとしての循環ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３
ヒストンＨ２Ｂについては、対照において見られた平均レベルは、２０４．４８ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ２５．３１～２８３．６６）であり、患者では１７３６．９１ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ５５５．３４～２９１８．４７）まで増大した。観察される差は統計的に有意であり（ｐ＝０．０１４）、平均レベルが対照については２３．５０ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ －３．９７～５０．９８）、患者については２０４０．７９ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ７５６．５８～３３２５．０１）であったヒストンＨ３でより高かった（ｐ＝０．００４）（図２）。

【0082】

ヒストンのレベルは、両方の群において有意な相関係数で正に相関した（対照についてはスピアマン係数ｒ＝０．８４８、ｐ＝０．００２、患者についてはｒ＝０．８２７、ｐ＜０．０００１）。

【0083】

これらの生存患者については、ＩＣＵにて最初の２４時間以内の両方のヒストンの平均レベルは、非生存者と比較して有意に低く（図２）、値は非生存者において検出されたレベルと比較して最大５分の１であった。ヒストンＨ２Ｂについては、平均レベルは、生存者では６０７．００ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ２０４．２０～１００９．８２）、非生存者では３００８．５０ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ６０３．９４～５４１２．１５）であり（ｐ＝０．０４６）、ヒストンＨ３のレベルに関して同じ比例差が観察され、観察された平均値は、生存者で７４０．７０ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ３１１．１６～１１７０．２３）、非生存者で３５０３．４１ｎｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ ９５５．９５～６０５０．８６）であった（ｐ＝０．０３６）。

【0084】

ＭＲＭ－ＭＳ法によって検出されるヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の特異度及び感度
ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３のレベルの診断力を評価するために行ったＲＯＣ曲線分析から、それらの両方が敗血症性ショック症例と健常対照とを区別するのに有益なバイオマーカーとなり得ることが明らかとなった。各ヒストンについてのＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）、標準誤差、信頼区間（ＣＩ）、最適濃度カットオフ値、感度及び特異度を表２に示す。

【0085】

【表3】

【0086】

両方のヒストンについてのＡＵＣは同様であるが、両方のバイオマーカーのレベルは健常対照と患者とで有意に異なり、ヒストンＨ３は、診断に関する感度及び特異度についてより高い値を示した。このバイオマーカーについては、最適カットオフ値としての濃度８６．３６ｎｇ／ｍＬで、方法の感度及び特異度の値は、それぞれ９４．１％及び９０．０％であった。

【0087】

循環Ｈ２Ｂ及びＨ３、並びにそれらの患者の早期転帰予測の可能性
敗血症性ショックの予後診断のバイオマーカーとしての血漿中のヒストンの潜在的使用を検討するために、各ヒストンについて対応するＲＯＣ曲線を作成した。生存者と非生存者とを識別するために、症例のみを選択し、バイオマーカーのパラメーター：最適カットオフ値、感度及び特異度を算出した（図３）。この場合も、ヒストンＨ３は、予後診断についてヒストンＨ２Ｂよりも良好であると分類された。感度値は、同様のカットオフ値でヒストンＨ２Ｂ（感度＝６２．５％、特異度＝８８．９％、カットオフ値＝１４２６．３８ｎｇ／ｍＬ）よりもヒストンＨ３（感度＝７５．０％、特異度＝８８．９％、カットオフ値＝１３４８．１３ｎｇ／ｍＬ）について高かった。

【0088】

実施例２． 鑑別診断
以下の群間の分布を研究に含めて、合計４０個のサンプルを分析した：感染病理を有しないＩＣＵで選択された１１対照（対照非敗血症ＩＣＵ患者）、健常一般集団からされた１１対照、敗血症の８症例及び敗血症性ショックの１０症例。

【0089】

ヒストンＨ２Ｂについては、４０個の血漿において見られた平均レベルは、以下の通りであった（表２）。

【0090】

【表4】

【0091】

結果は、対照（ＩＣＵ及び一般集団）、敗血症及び敗血症性ショック患者に由来する血漿中の循環ヒストンＨ２Ｂのレベルを示す図５に示される。箱ひげ図により４つの群におけるＨ２Ｂレベルを表す。箱は四分位範囲を表し、横線は中央値を表し、ひげは１０パーセンタイル値及び９０パーセンタイル値を表す。レベルは、Ｈ２Ｂのｎｇ／ｍＬとして表される。

【0092】

観察された差が統計的に有意であったかを評定するために、ＡＮＯＶＡ検定（ｐ＜０．０００１）を行った。事後検定（シェッフェ）から、これらの統計的差異が敗血症性ショックサンプルとＩＣＵ対照群（ｐ＜０．０００１）、一般集団対照群（ｐ＜０．０００１）及び敗血症群（ｐ＝０．００１）との間に見られたことが示される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】