特許 7173502 乳酸菌及びその取得方法並びに乳酸菌含有飲食品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-08

(45)【発行日】2022-11-16

(54)【発明の名称】乳酸菌及びその取得方法並びに乳酸菌含有飲食品

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20221109BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20221109BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

A23L33/135

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020214170

(22)【出願日】2020-12-23

(65)【公開番号】P2022063828

(43)【公開日】2022-04-22

【審査請求日】2022-07-14

(31)【優先権主張番号】P 2020171989

(32)【優先日】2020-10-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-03116

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504237050

【氏名又は名称】独立行政法人国立高等専門学校機構

(73)【特許権者】

【識別番号】500228034

【氏名又は名称】株式会社 ミヤトウ野草研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100091373

【弁理士】

【氏名又は名称】吉井 剛

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼屋 朋彰

(72)【発明者】

【氏名】石山 洋平

【審査官】池上 京子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５２５８０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】岡田 早苗，5. 自然界よりL-乳酸生産乳酸菌株のスクリーニング，乳酸菌工学研究部会報告，1997年，第5号，p.367-369

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）であることを特徴とする乳酸菌。

【請求項2】

請求項１記載の乳酸菌において、前記乳酸菌は配列番号１に示される１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有することを特徴とする乳酸菌。

【請求項3】

請求項１，２いずれか１項に記載の乳酸菌において、植物発酵エキスから取得されたものであることを特徴とする乳酸菌。

【請求項4】

請求項３記載の乳酸菌において、前記植物発酵エキスは大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌。

【請求項5】

請求項４記載の乳酸菌において、前記大根発酵エキスは大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであることを特徴とする乳酸菌。

【請求項6】

請求項５記載の乳酸菌において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌。

【請求項7】

請求項１～６いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つスクロース濃度３０～６０ｗｔ％の高濃度スクロース環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌。

【請求項8】

湿式滅菌した液体培地に植物発酵エキスを加えて培養液を得、続いて、この培養液を集積培養して集積培養液を得、続いて、この集積培養液を湿式滅菌した分離用培地と混釈して平板培地を作成し、続いて、この平板培地に出現したコロニーを釣菌して、ｐＨ６～７よりも低いｐＨの環境下、且つ、スクロースが単独で含まれる高スクロース濃度の環境下での増殖率が、ｐＨ６～７の環境下に比して高い乳酸菌を取得することを特徴とする乳酸菌の取得方法。

【請求項9】

請求項８記載の乳酸菌の取得方法において、前記植物発酵エキスは、大根と上白糖と菌液とを混合し発酵させた大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。

【請求項10】

請求項９記載の乳酸菌の取得方法において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。

【請求項11】

請求項８～１０いずれか１項に記載の乳酸菌の取得方法において、前記液体培地は、野菜発酵エキス及び果物発酵エキスのいずれか一方若しくは双方を用いて得られた混合発酵エキスと、野草の煮出液と上白糖とを混合して得られた野菜・上白糖混合液とを混合したものに抗生物質を添加したものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。

【請求項12】

請求項１１記載の乳酸菌の取得方法において、前記抗生物質はシクロヘキシミドであることを特徴とする乳酸菌の取得方法。

【請求項13】

請求項１～７いずれか１項に記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品。

【請求項14】

請求項１３記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な乳酸菌及びその取得方法並びに前記乳酸菌を含有する乳酸菌含有飲食品に関するものである。

【背景技術】

【0002】

一般的な乳酸菌の最適生育ｐＨ領域はｐＨ６～７であり、酸性領域での生育限界値はｐＨ４、アルカリ性領域での生育限界値はｐＨ８と言われている。しかしながら、乳酸菌の中には優れた耐酸性を有し、一般的な乳酸菌では生育が難しい苛酷な環境下（ｐＨ３前後）でも生育可能なものもある（例えば特許文献１，２）。

【0003】

また、味噌や醤油などの塩分濃度が高い環境下でも生育が可能な優れた耐塩性を有する乳酸菌もある（例えば特許文献３，４）。

【0004】

このように乳酸菌の中には過酷な環境下でも生育可能なものが多く存在するが、低ｐＨ（高酸性）且つ高スクロース濃度という苛酷な環境下で良好に生育することができる乳酸菌の存在については本出願人の知る限りこれまで報告されていない。

【0005】

そこで、本出願人は、このような乳酸菌の存在により、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材を容易に発酵させることができ、新たな発酵食品や発酵飲料の提供が可能となると考え、上述のような低ｐＨ環境且つ高スクロース環境下で良好に生育することができる乳酸菌について研究を進め、ついに低ｐＨ且つ高スクロース濃度という苛酷な環境下で良好に生育することができる乳酸菌の取得に成功した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００９－２２５７９２号公報

【文献】ＷＯ２０１３／００１８６２号公報

【文献】特開２００７－２３６３４４号公報

【文献】特開２０１８－４２５５７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、低ｐＨ且つ高スクロース環境下で良好に生育することができる乳酸菌を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。

【0009】

受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）であることを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0010】

また、請求項１記載の乳酸菌において、前記乳酸菌は配列番号１に示される１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有することを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0011】

また、請求項１，２いずれか１項に記載の乳酸菌において、植物発酵エキスから取得されたものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0012】

また、請求項３記載の乳酸菌において、前記植物発酵エキスは大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0013】

また、請求項４記載の乳酸菌において、前記大根発酵エキスは大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0014】

また、請求項５記載の乳酸菌において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0015】

また、請求項１～６いずれか１項に記載の乳酸菌において、ｐＨ３．５～５．５の低ｐＨ環境下で増殖し、且つスクロース濃度３０～６０ｗｔ％の高濃度スクロース環境下でも増殖することを特徴とする乳酸菌に係るものである。

【0016】

また、湿式滅菌した液体培地に植物発酵エキスを加えて培養液を得、続いて、この培養液を集積培養して集積培養液を得、続いて、この集積培養液を湿式滅菌した分離用培地と混釈して平板培地を作成し、続いて、この平板培地に出現したコロニーを釣菌して、ｐＨ６～７よりも低いｐＨの環境下、且つ、スクロースが単独で含まれる高スクロース濃度の環境下での増殖率が、ｐＨ６～７の環境下に比して高い乳酸菌を取得することを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。

【0017】

また、請求項８記載の乳酸菌の取得方法において、前記植物発酵エキスは、大根と上白糖と菌液とを混合し発酵させた大根発酵エキスであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。

【0018】

また、請求項９記載の乳酸菌の取得方法において、前記菌液は酵母菌からなるものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。

【0019】

また、請求項８～１０いずれか１項に記載の乳酸菌の取得方法において、前記液体培地は、野菜発酵エキス及び果物発酵エキスのいずれか一方若しくは双方を用いて得られた混合発酵エキスと、野草の煮出液と上白糖とを混合して得られた野菜・上白糖混合液とを混合したものに抗生物質を添加したものであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。

【0020】

また、請求項１１記載の乳酸菌の取得方法において、前記抗生物質はシクロヘキシミドであることを特徴とする乳酸菌の取得方法に係るものである。

【0021】

また、請求項１～７いずれか１項に記載の乳酸菌を含有することを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。

【0022】

また、請求項１３記載の乳酸菌含有飲食品において、前記乳酸菌含有飲食品は発酵飲食品であることを特徴とする乳酸菌含有飲食品に係るものである。

【発明の効果】

【0023】

本発明の乳酸菌は、低ｐＨ且つ高スクロース環境下で優位に生育（増殖）するから、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材を容易に発酵させることができ、新たな発酵食品や発酵飲料の提供が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本実施例におけるLactobacillus acidophilus JCM 1132^TのｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。

【図2】本実施例におけるLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007のｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。

【図3】本実施例におけるLeuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^TのｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。

【図4】本実施例におけるＷＲ１６－４株のｐＨ耐性試験結果を示すグラフである。

【図5】本実施例におけるLactobacillus acidophilus JCM 1132^Tのスクロース耐性試験結果を示すグラフである。

【図6】本実施例におけるLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007のスクロース耐性試験結果を示すグラフである。

【図7】本実施例におけるLeuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^Tのスクロース耐性試験結果を示すグラフである。

【図8】本実施例におけるＷＲ１６－４株のスクロース耐性試験結果を示すグラフである。

【図9】本実施例のスクロース耐性試験におけるＭＲＳ培地の組成を示す表である。

【図10】本実施例のフルクトース・グルコース耐性試験におけるＭＲＳ培地の組成を示す表である。

【図11】本実施例におけるＷＲ１６－４株のフルクトース・グルコース耐性試験結果を示すグラフである。

【図12】本発明の遺伝子データベース（ＮＣＢＩ）における相同性検索結果を示すデータ一覧表である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

好適と考える本発明の実施形態を、図面に基づいて本発明の作用を示して簡単に説明する。

【0026】

本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）であり、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４，寄託機関の名称及びあて名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室、原寄託日：２０２０年２月５日）で寄託されている。

【0027】

本発明の乳酸菌から得られた配列データ（１６ＳｒＤＮＡ配列）をもとにＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の遺伝子データベースにて相同性検索を行った結果、前記配列と相同性が最も高かったもので９３％であり（図１２参照）、この結果から本発明の乳酸菌は従来にない新種の乳酸菌（ラクトバチルス属に属する種）と言える。

【0028】

本発明の乳酸菌は、一般的な乳酸菌の最適生育環境とされるｐＨ６～７では生育し難く、これよりも低いｐＨ（例えばｐＨ３．５～５．５）の環境下で良好に生育する特徴を有する。

【0029】

さらに、本発明の乳酸菌は、一般的な乳酸菌では生育し難い低ｐＨ（例えばｐＨ５以下）で且つ高スクロース（例えば３０ｗｔ％以上）環境下でも良好に生育する特徴を有する。

【0030】

このように、本発明の乳酸菌は、低ｐＨで且つ高スクロース環境下で優位に増殖する特徴を有するから、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材を容易に発酵させることができるものとなる。

【実施例】

【0031】

本発明の具体的な実施例について図面に基づいて説明する。

【0032】

本実施例の乳酸菌は、配列番号１に示す１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有し、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１１６（識別の表示：ＷＲ１６－４）で寄託されているラクトバチルス属に属する種（Lactobacillus sp.）の乳酸菌である。

【0033】

本実施例の乳酸菌は、細胞形態が短桿状であり、また、コロニーの状態では白色をしていて、菌体外多糖（粘性物質）を生産する。

【0034】

以下、本実施例の乳酸菌（以下、ＷＲ１６－４株という。）について詳述する。

【0035】

＜ＷＲ１６－４株の菌種について＞
ＷＲ１６－４株の１６ＳｒＤＮＡデータをもとに微生物同定検査を行い、ＷＲ１６－４株の菌種について調査した。なお、微生物同定検査は株式会社ファスマックに依頼した。

【0036】

微生物同定検査の結果、最も高い相同値を示した菌種は、Lactobacillus kefiri(ATCC=35441)であった（相同値９３．１４％）。

【0037】

＜ＷＲ１６－４株の新規性について＞
ＷＲ１６－４株の１６ＳｒＤＮＡデータをもとにＮＣＢＩの遺伝子データベースにて相同性検索を行い、ＷＲ１６－４株の新規性について調査した。

【0038】

図１２はこの相同性検索においてサンプル由来配列と高い相同性を示したデータの一覧表である。この図１２に示すように、このＷＲ１６－４株と相同性が最も高かったものでも９３％程度であった。一般的に、相同値が９８．７％以上の種がない場合は、新種と判断されることから、このＷＲ１６－４株は新規（新種）の乳酸菌であると言える。

【0039】

＜ＷＲ１６－４株の分離源＞
ＷＲ１６－４株は植物発酵エキス、具体的には、大根発酵エキスを分離源とするものである。

【0040】

分離源となる大根発酵エキスは、大根、上白糖及び菌液を混合し発酵させたものであり、具体的には、裁断した大根と、この大根と同量の上白糖とを混合し、これに酵母菌を発酵させた後、圧搾して得られた液分をさらに発酵、熟成させたものである。なお、分離源となる植物は大根以外の野菜でも良い。

【0041】

＜ＷＲ１６－４株の分離方法＞
ＷＲ１６－４株は、上記大根発酵エキスから分離する際、一般的な乳酸菌の分離方法では分離できず、本出願人が見出した以下の分離方法により分離することができる。

【0042】

(1) 湿式滅菌（１２１℃，１５分）した液体培地１０ｍｌに上記の大根発酵エキス８０μｌを加え、２５℃で６日間保温し培養液を得る。

【0043】

(2) 得られた培養液８０μｌを上記の液体培地１０ｍｌに加え、再び２５℃で３～４日間保温し培養液を得る。

【0044】

(3) 上記２の処理を数回（本実施例では８回）繰り返す集積培養を行い、集積培養液を得る。

【0045】

(4) 得られた集積培養液１ｍｌを湿式滅菌（１２１℃，１５分）した分離用培地１５ｍｌと混釈した後、冷却固化して平板を作成する。

【0046】

(5) この平板を２５℃で１０日間保温する。

【0047】

(6) 上記平板に出現したコロニーを釣菌することで、ＷＲ１６－４株が得られる。

【0048】

なお、上記液体培地は、野菜発酵エキス及び果物発酵エキスのいずれか一方若しくは双方を用いて得られた混合発酵エキスと、野草の煮出液と上白糖とを混合して得られた野草・上白糖混合液とを混合したものに抗生物質を添加したもの、具体的には、上記の混合発酵エキスと、複数の野草類の煮出液に上白糖を１：１で混合して得た野草・上白糖混合液と、１ｇ／Ｌシクロヘキシミド溶液を、１０：９０：１で混合した混合液である。

【0049】

また、上記分離用培地は、下表に示す培地Ａ及び培地Ｂを湿式滅菌し混合したものである。

【0050】

【表1】

【0051】

上記分離方法により取得したＷＲ１６－４株の特性を確認するため、一般的な乳酸菌を用い、これらとの比較によるｐＨ耐性試験及びスクロース耐性試験を行った。

【0052】

具体的には、ＷＲ１６－４株の比較対象の乳酸菌として、乳酸菌の中では広く知られている属に属する種であり、一般的な乳酸菌と同様、最適生育ｐＨ領域をｐＨ６～７とする、ラクトバチルス（Lactobacillus）属のLactobacillus acidophilus JCM 1132^T、ラクトコッカス（Lactococcus）属のLactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007、ロイコノストック（Leuconostoc）属のLeuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^Tの３種の乳酸菌を用いた。

【0053】

＜各乳酸菌の前培養＞
上記２種の耐性試験を行うにあたり、各乳酸菌に対して以下のような前培養を行った。

【0054】

(1) 図９に示すＭＲＳ培地を２倍濃縮で調整した。この際、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は４Ｎ塩酸を添加することにより、ＷＲ１６－４株用のものはｐＨ４．５に、比較対象用のものはｐＨ６．５に調整した。

【0055】

(2) ４ｗｔ％スクロース溶液又は４ｗｔ％グルコース溶液を調整した。

【0056】

(3) 上記(1)，(2)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。

【0057】

(4) 湿熱滅菌した(1)及び(2)の溶液を冷却した後、クリーンベンチ内で１：１（ｖ／ｖ）となるように混合し、２ｗｔ％スクロース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ４．５）又は２ｗｔ％グルコース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ６．５）を調整した。

【0058】

(5) ＷＲ１６－４株は２ｗｔ％スクロース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ４．５）、比較対象用は２ｗｔ％グルコース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ６．５）を用いて、３０℃で２４～４８時間の嫌気条件で行った。

【0059】

＜ｐＨ耐性試験＞
前培養した各乳酸菌のｐＨ耐性試験を以下のようにして行った。

【0060】

(1) 図９に示すＭＲＳ培地を２倍濃縮で調整した。この際、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は４Ｎ塩酸を添加することにより、ｐＨ３，３．５，４，４．５，５，５．５，６，６．５に調整した。

【0061】

(2) ４ｗｔ％スクロース溶液を調整した。

【0062】

(3) 上記(1)，(2)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。

【0063】

(4) 湿熱滅菌した(1)及び(2)の溶液を冷却した後、クリーンベンチ内で１：１（ｖ／ｖ）となるように混合し、２ｗｔ％スクロース含有ＭＲＳ培地（ｐＨ３～６．５）を調整した。

【0064】

(5) 前培養した各乳酸菌株を遠心分離（１５，０００×ｇ，１０分）して上清を取り除いた後、(3)で調整した培地に初期濃度がＡ_{６６０ｎｍ}≒０．０５～０．１０となるように再懸濁した。

【0065】

(6) ９６穴マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、各３ｗｅｌｌずつ分注した後（ｎ＝３）、３０℃、嫌気条件で培養した。

【0066】

(7) マイクロプレートリーダーを用いて経時的に濁度測定を行った。

【0067】

図１～３は比較対象用（Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T（図１）、Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007（図２）、Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T（図３））の乳酸菌の濁度測定結果を示すグラフであり、図４はＷＲ１６－４株の濁度測定結果を示すグラフである。

【0068】

上記２ｗｔ％スクロースを炭素源としたｐＨ耐性試験においては、各乳酸菌の濁度測定結果に示されるように、比較対象用の乳酸菌はｐＨ５～６．５の中性に近い酸性領域で生育が良好であったのに対し、ＷＲ１６－４株はこれらの乳酸菌が良好に生育する領域よりもより酸性側の領域、具体的には、ｐＨ３．５～５の低ｐＨ領域で生育し、これよりｐＨが高い中性に近い領域ではほとんど生育しないことが確認された。

【0069】

＜スクロース耐性試験＞
前培養した各乳酸菌のスクロース耐性試験を以下のようにして行った。

【0070】

(1) スクロースを添加した図９に示すＭＲＳ培地を、スクロース濃度が５ｗｔ％，１０ｗｔ％，２０ｗｔ％，３０ｗｔ％，４０ｗｔ％，５０ｗｔ％，６０ｗｔ％，７０ｗｔ％となるように調整した後、それぞれに対して４Ｎ塩酸を添加しｐＨ４．５となるように調整した。

【0071】

(2) 上記(1)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。

【0072】

(3) 前培養した各乳酸菌株を遠心分離（１５，０００×ｇ，１０分）して上清を取り除いた後、(2)で調整した培地に初期濃度がＡ_{６６０ｎｍ}≒０．０５～０．１０となるように再懸濁した。

【0073】

(4) ９６穴マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、各３ｗｅｌｌずつ分注した後（ｎ＝３）、３０℃、嫌気条件で培養した。

【0074】

(5) マイクロプレートリーダーを用いて経時的に濁度測定を行った。

【0075】

図５～８は比較対象用（Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T（図５）、Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007（図６）、Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T（図７））の乳酸菌の濁度測定結果を示すグラフであり、図８はＷＲ１６－４株の濁度測定結果を示すグラフである。

【0076】

上記初期ｐＨ４．５の酸性条件下でのスクロース耐性試験においては、各乳酸菌の濁度測定結果に示されるように、比較対象用の乳酸菌はスクロース濃度が２０ｗｔ％以下での生育が確認されたもののその生育状態（増殖率）は低く、３０ｗｔ％以上の高スクロース環境ではほぼ生育できない結果であったのに対し、ＷＲ１６－４株はスクロース濃度４０ｗｔ％程度までは良好な生育状態を示し、６０ｗｔ％の高スクロース環境でも生育することが確認された。

【0077】

＜フルクトース・グルコース耐性試験＞
スクロースは、単糖のフルクトースとグルコースとが結合した二糖類であり、ＷＲ１６－４株は上記のように高スクロース環境で生育可能なことが確認されたことから、フルクトース及びグルコースが夫々単糖状態で存在するフルクトース・グルコース高濃度環境下でも、スクロースの場合と同様に生育可能であるのではないかと考え、上記スクロース耐性試験と同様に、フルクトース・グルコース耐性試験を以下のようにして行った。

【0078】

(1) スクロース、フルクトース、グルコースの糖を夫々単独で添加した図１０に示すＭＲＳ培地を、夫々糖濃度が２０ｗｔ％となるように調整した後、それぞれに対して４Ｎ塩酸を添加しｐＨ４．５となるように調整した。

【0079】

(2) 別途、フルクトース及びグルコースを添加した図１０に示すＭＲＳ培地を、フルクトース、グルコース夫々の糖濃度が１０ｗｔ％（合計で２０ｗｔ％）となるように調整した後、それぞれに対して４Ｎ塩酸を添加しｐＨ４．５となるように調整した。

【0080】

(3) 上記(1)，(2)について、それぞれオートクレーブを用いた湿熱滅菌（１２１℃，２０分）を行った。

【0081】

(4) 前培養したＷＲ１６－４株を遠心分離（１５，０００×ｇ，１０分）して上清を取り除いた後、調整した培地に初期濃度がＡ_{６６０ｎｍ}≒０．０５～０．１０となるように再懸濁した。

【0082】

(5) ９６穴マイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、各３ｗｅｌｌずつ分注した後（ｎ＝３）、３０℃、嫌気条件で培養した。

【0083】

(6) マイクロプレートリーダーを用いて経時的に濁度測定を行った。

【0084】

この初期ｐＨ４．５の酸性条件下でのフルクトース・グルコース耐性試験における上記濁度測定の結果を図１１に示す。

【0085】

この図１１に示されるように、ＷＲ１６－４株は、フルクトース、グルコースのいずれかが単独で含まれている場合は増殖率が低いが（低生育状態であるが）、フルクトース、グルコースの両方が含まれる場合は、スクロースを含む場合と同様、増殖率が高くなり（高生育状態になり）、この結果から、ＷＲ１６－４株は、スクロース耐性だけでなく、フルクトース・グルコース耐性も有することが確認された。

【0086】

また、前述したようにスクロースはフルクトースとグルコースが結合した二糖類であることから、ＷＲ１６－４株は、スクロースの場合と同様、例えば、フルクトースとグルコースを夫々３０ｗｔ％ずつ含む（糖濃度の合計が６０ｗｔ％）高糖濃度環境でも十分生育可能と考える。

【0087】

＜ＷＲ１６－４株の用途＞
ＷＲ１６－４株は乳酸菌含有飲食品、具体的には、発酵飲食品に用いることができる。

【0088】

ＷＲ１６－４株は、上述したように、低ｐＨで且つ高スクロース環境下で優位に増殖する特徴を有する乳酸菌であるから、例えば、植物と糖を混合し圧搾して得られる液やこの液を基にした飲料、或いはジャム、フルーツソースなどの酸性値及びスクロース濃度が高く、一般的な乳酸菌では発酵が難しい素材（酸性且つ高糖濃度抽出液）を容易に発酵させることができ、これにより前記抽出液に有機酸を含有させることができ、酸味の付与（甘さの軽減やさわやかさの付与）や防腐（添加物としての保存料が不要になる）などの効果が得られる。

【0089】

また、ＷＲ１６－４株は、低ｐＨで且つ高フルクトース・グルコース環境下でも優位に増殖する特徴を有する乳酸菌であるから、上記の他に、フルクトースとグルコースの両方を含む糖（異性化糖、ブドウ糖及び果糖の夫々の精製糖を混合したものなど）を用いた飲食品にも用いることができる。

【0090】

また、上記酸性且つ高糖濃度抽出液の取得方法の一例を以下に示す。なお、抽出液の取得方法はこれに限定されるものではない。

【0091】

(1) 裁断した野菜や果物と上白糖とを同比率で混合し、菌液を加えて発酵させる。

【0092】

(2) 発酵後、圧搾して液分を回収し、この回収液をさらに発酵・熟成させて発酵液Ａを得る。

【0093】

(3) 野草の煮出し液に上白糖を加えたものに発酵液Ａを加え、発酵・熟成させて発酵液Ｂを得る。

【0094】

この発酵液Ａや発酵液Ｂが酸性且つ高糖濃度抽出液となる。なお、この発酵液Ａ及び発酵液Ｂは飲料として製造されるものであり、ＷＲ１６－４株によって発酵させることで、酸味を付与すると共に、保存料を添加することなく防腐効果が得られ、これまでにない飲料の提供が可能となる。

【0095】

また、ＷＲ１６－４株は、上記試験結果に示すように、一般的な乳酸菌の最適ｐＨ環境であるｐＨ６～７の環境下でほとんど生育しない特性を有するから、例えば、スクロース濃度が高くてｐＨが中性付近の素材を、ＷＲ１６－４株と他の微生物（例えば一般的な乳酸菌や酵母など）で発酵させようとする場合、ＷＲ１６－４株は至適ｐＨに到達するまでの間は生育しないので、他の微生物の生育を阻害しない。よって、複数種の微生物による複合的な発酵を利用する場合に有用となる。

【0096】

また、上記特性から、ＷＲ１６－４株は、素材のｐＨを中性付近に調整することで発酵を非加熱的に停止させることができ、加熱できない発酵製品への利用も有用となる。

【0097】

なお、本発明は、本実施例に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。

【受託番号】

【0098】

ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１１６

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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