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特許7173589肝臓病の処置における使用のための抗ＣＣＬ２４（エオタキシン２）抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-08
(45)【発行日】2022-11-16
(54)【発明の名称】肝臓病の処置における使用のための抗ＣＣＬ２４（エオタキシン２）抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/24 20060101AFI20221109BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20221109BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221109BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221109BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20221109BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221109BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221109BHJP
【ＦＩ】
C07K16/24 ZNA
C07K16/46
A61K39/395 U
A61K39/395 T
A61P43/00 111
A61P37/02
A61P1/16
A61P35/00
C12N15/13
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019548321
(86)(22)【出願日】2018-03-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-16
(86)【国際出願番号】 IL2018050276
(87)【国際公開番号】W WO2018163185
(87)【国際公開日】2018-09-13
【審査請求日】2021-02-26
(31)【優先権主張番号】251024
(32)【優先日】2017-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL
(73)【特許権者】
【識別番号】516262000
【氏名又は名称】ケモマブ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣｈｅｍｏｍＡｂ Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】モル，アディ
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１３２７９０（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１２－５１６１５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Matucci-Cerinic, M., et al.，"A novel antibody blocking CCL24/CCR3 reduces chemokinesis of immune cells and the transition of fibroblasts to myofibroblasts in systemic sclerosis (SSC)."，J Scleroderma Relat Disord，2016年，Vol.1, No.1，pp.37-38
【文献】Lei, J., et al.，"CCL24 contributes to HCC malignancy via RhoB- VEGFA-VEGFR2 angiogenesis pathway and indicates poor prognosis."，Oncotarget，2016年12月22日，Vol.8, No.3，pp.5135-5148
【文献】Bataller, R., et al.，"Liver fibrosis."，J Clin Invest，2005年，Vol.115, No.2，pp.209-218
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝臓病理の処置に用いるための医薬組成物であって、当該医薬組成物が、（ｉ）完全ヒト化抗ＣＣＬ２４抗体又はその任意の抗原結合断片、及び（ｉｉ）薬学的に許容され得る担体を含み、前記抗体が、配列番号１～６で示される６つのＣＤＲ配列と、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含み、
前記肝臓病理が、胆汁鬱滞及び肝内胆汁鬱滞性肝疾患からなる群から選択される
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項2】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記抗原結合断片が、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の医薬組成物において、前記医薬組成物が、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項4】
請求項３に記載の医薬組成物において、前記医薬組成物が、前記少なくとも１つの追加の治療薬の投与前、投与と同時、又は投与後に投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項5】
請求項１に記載の医薬組成物において、前記医薬組成物が、少なくとも１つの追加の治療薬を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項6】
請求項３乃至５のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記少なくとも１つの追加の治療薬が、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作動薬、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、抗ケモカイン又は抗サイトカインモノクローナル抗体、小分子、抗炎症剤、抗線維化剤、及びステロイドからなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項7】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記肝臓病理が、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、及びＰＳＣから生じる胆管細胞癌からなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肝臓病の処置における抗ＣＣＬ２４（エオタキシン２）モノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４又はエオタキシン２）は、特に好酸球、線維芽細胞及びＴ細胞の走化性を誘導することにより、細胞輸送を促進し、Ｃ－Ｃケモカイン受容体タイプ３（ＣＣＲ３）複合体を介して炎症活性を調節するケモカインである。ＣＣＬ２４はいくつかの炎症性細胞により産生され、その受容体ＣＣＲ３は、好酸球、Ｔ細胞、単球及び線維芽細胞上に存在する。
【0003】
ＣＣＬ２４は、アレルギー応答中にＣＣＬ２４のレベルの有意な上昇が存在するため、アレルギー状態に関与することが知られている。
【0004】
国際公開第２０１０／０８６８５４号パンフレットは、心血管系、自己免疫性及び炎症性疾病の動物モデルに有効であったＣＣＬ２４に指向される抗体を開示している。
【0005】
Ｍｏｒ ｅｔ ａｌ（２０１３ ＷＪＣＤ．Ｖｏｌ．３ Ｎｏ．４：３３９－３４６）は、ＣＣＬ２４に対して調製されたモノクローナル抗体が、フィブロネクチンに対するリンパ球の接着を減弱させ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に向かうそれらの遊走を強力に阻害したことを示している。抗体はまた、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）ノックアウトマウスにおいて動脈硬化巣を有意に減少させた。Ａｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０；Ｖ１６１（２）：２７６－８３）及びＭａｕｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；３（１）：７－１４）に記載されているように、ＣＣＬ２４の阻害は、関節リウマチのラットモデル、及び実験的自己免疫性脳脊髄炎のマウスモデルにおいて保護効果を示した。
【0006】
国際公開第２０１５／１３２７９０号パンフレットは、ケモカインＣＣＬ２４における独特のエピトープに指向される単離された多特異性抗体を開示し、ここで抗体は、追加のＣＣＲ３結合ケモカインに結合する。これらの抗体は、全身性硬化症及び突発性肺線維症（ＩＰＦ）のハツカネズミモデルにおいて、線維化及び炎症性の特徴を阻害するのに有効であることが示された。
【0007】
Ｌｅｉ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ（２０１７ Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｖｏｌ．８（ｎｏ．３）：５１３５－５１４８）は、ＣＣＬ２４がＲｈｏＢ－ＶＥＧＦＡ－ＶＥＧＦＲ２血管新生を介して肝細胞癌腫（ＨＣＣ）に寄与し、予後不良を示すことを示している。しかしながら、肝炎、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）を含む非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ、胆汁うっ滞、並びに原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）及び原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）等の肝内胆汁うっ滞性肝疾患等の肝臓病理におけるＣＣＬ２４の関与は、以前に示されていなかった。
【発明の概要】
【0008】
従って、本発明は、その第１の態様において、肝臓病理の処置における使用のための、単離された抗ＣＣＬ２４（エオタキシン２）抗体、又はその任意の抗原結合断片を提供する。
【0009】
一実施形態において、前記肝臓病理は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、胆汁うっ滞、肝内胆汁うっ滞性肝疾患、肝炎（例えばアルコール性肝炎）及び肝硬変からなる群から選択される。
【0010】
一実施形態において、前記ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。
【0011】
一実施形態において、前記肝臓病理は、ＮＡＳＨから生じる肝細胞癌腫である。
【0012】
一実施形態において、前記肝内胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）又は原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）である。
【0013】
一実施形態において、前記肝臓病理は、ＰＳＣから生じる胆管細胞癌である。
【0014】
別の態様では、本発明は：
ａ．肝臓損傷による肝臓酵素の高い血清レベルの低下；
ｂ．肝臓損傷若しくは壊死の減少；及び／又は
ｃ．筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の減弱
における使用のための、単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片に関する。
ａ．肝臓損傷による肝臓酵素の高い血清レベルの低下；
ｂ．肝臓損傷若しくは壊死の減少；及び／又は
ｃ．筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の減弱
における使用のための、単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片に関する。
【0015】
一実施形態において、単離された抗ＣＣＬ２４抗体は、モノクローナル抗体であり得る。
【0016】
いくつかの実施形態において、単離された抗ＣＣＬ２４抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体であり得る。
【0017】
更なる実施形態において、その抗原結合断片は、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗原に結合することが可能な重鎖可変領域、抗原に結合することが可能な軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0018】
一実施形態において、前記抗体は：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体である。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体である。
【0019】
一実施形態において、前記抗体は、配列番号７で示される重鎖可変領域又はその変異体と、配列番号８で示される軽鎖可変領域又はその変異体とを含む完全ヒト化抗体である。
【0020】
一実施形態において、前記抗体は、配列番号１～６で示される６つのＣＤＲ配列、並びに配列番号７に対して少なくとも９０％配列相同性を有する重鎖可変領域及び配列番号８に対して少なくとも９０％配列相同性を有する軽鎖可変領域を含む完全ヒト化抗体である。
【0021】
一実施形態において、前記抗体は：
（ａ）ＮＳＧＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＶＡＳＮＬＫＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＳＮＥＥＰＷＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体と同じエピトープに結合する。一実施形態において、前記抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与される。
（ａ）ＮＳＧＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＶＡＳＮＬＫＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＳＮＥＥＰＷＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体と同じエピトープに結合する。一実施形態において、前記抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与される。
【0022】
一実施形態において、前記少なくとも１つの追加の治療薬は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作動薬、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、抗ケモカイン又は抗サイトカインモノクローナル抗体、小分子、抗炎症剤、抗線維化剤、及びステロイドからなる群から選択される。
【0023】
別の態様では、本発明は：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体と、
薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を提供し；前記医薬組成物は、肝臓病理の処置に使用するためのものである。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体と、
薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を提供し；前記医薬組成物は、肝臓病理の処置に使用するためのものである。
【0024】
一実施形態において、前記完全ヒト化抗体は、配列番号７に対して少なくとも９０％配列相同性を有する重鎖可変領域と、配列番号８に対して少なくとも９０％配列相同性を有する軽鎖可変領域とを更に含む。一実施形態において、前記医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与される。
【0025】
一実施形態において、前記医薬組成物は、前記少なくとも１つの追加の治療薬の投与前、投与と同時、又は投与後に投与される。
【0026】
一実施形態において、前記医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療薬を更に含む。
【0027】
一実施形態において、前記少なくとも１つの追加の治療薬は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作動薬、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、抗ケモカイン又は抗サイトカインモノクローナル抗体、小分子、抗炎症剤、抗線維化剤、及びステロイドからなる群から選択される。
【0028】
別の態様では、本発明は、肝臓病理の処置方法を提供し、当該方法は、それを必要とする患者に、治療的に許容され得る量の：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体、又は本発明の医薬組成物を、投与することを含む。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体、又は本発明の医薬組成物を、投与することを含む。
【0029】
更なる態様では、本発明は、肝臓損傷による肝臓酵素の血清レベルを低下させる、及び／又は肝臓損傷若しくは壊死を減少させる、及び／又は筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行を減弱させる方法を提供し、当該方法は、それを必要とする患者に、治療的に許容され得る量の：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体、又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体、又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【0030】
いくつかの実施形態において、前記完全ヒト化抗体は、配列番号７に対して少なくとも９０％配列相同性を有する重鎖可変領域と、配列番号８に対して少なくとも９０％配列相同性を有する軽鎖可変領域とを含む。
【0031】
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの追加の治療薬を投与することを更に含む。
【0032】
一実施形態において、前記少なくとも１つの追加の治療薬は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作動薬、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、抗ケモカイン又は抗サイトカインモノクローナル抗体、小分子、抗炎症剤、抗線維化剤、及びステロイドからなる群から選択される。
【0033】
別の態様では、本発明は、細胞におけるＣＣＲ５活性化を低減又は阻害する方法を提供し、当該方法は：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体を投与することを含む。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む完全ヒト化抗体を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0034】
本明細書に開示する主題をより深く理解するために、またそれがどのように実際に行われ得るかを例示するために、ここで実施形態を、添付の図面を参照して、非限定的な例のみとして記載する：
【0035】
【図1】図１Ａは、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した、対照（２０人の健康な対象）と比較した、低及び高Ｆｉｂ４スコアで分割した５５人のＮＡＦＬＤ患者におけるＣＣＬ２４（エオタキシン２）の循環全身レベルを示すグラフである。結果は、ピコグラム／ミリリットル（ｐｖ－Ｐ値）で示される。線維症４スコア（Ｆｉｂ４）計算：（年齢ｘＡＳＴ）／（血小板ｘ（ｓｑｒ（ＡＬＴ））。図１Ｂ～１Ｍは、健康な対照と比較した、ＮＡＦＬＤ患者からのヒトＰＢＭＣ上の代表的なＣＣＲ３発現を示すＦＡＣＳ画像である。図１Ｂ～１Ｄは、各々、３人のＮＡＦＬＤ患者においてＰＥ標識抗ＣＣＲ３抗体により測定したＣＣＲ３染色を表す。図１Ｅ～１Ｇは、各々、３人のＮＡＦＬＤ患者の各々に関する、対応するＣＣＲ３染色／側方散乱、即ち異なる血液細胞集団のＣＣＲ３発現のレベルを表す。図１Ｈ～１Ｊは、各々、３人の健康な志願者における抗ＣＣＲ３抗体を使用したＣＣＲ３染色を表す。図１Ｋ～１Ｍは、各々、３人の健康な患者の各々に関する、対応するＣＣＲ３染色／側方散乱範囲を表す。図１Ｎは、ＦＡＣＳにより測定した、対照と比較した１０人のＮＡＦＬＤ患者からの末梢血単核細胞におけるＣＣＲ３の発現を示すグラフである。＊＊＊ｐｖ≦０．００５
【図2】図２Ａ～２Ｇは、抗ＣＣＬ２４抗体（即ち、ハツカネズミＣＣＬ２４ ｍＡｂ ＣＭ１０１）又は抗ＣＣＲ３抗体で染色した、ＮＡＳＨ患者から得たヒト肝臓生検の代表的な外観を示す写真である。図２Ａ～２Ｃは、３人の異なる患者（各々、患者Ａ～Ｃ）の肝臓生検を表す。図２Ｄは、健康な肝臓の生検を示し、陰性対照としての役割を果たす。図２Ｅは、健康な対象のリンパ節の生検を示し、陽性対照としての役割を果たす。図２Ｆ及び２Ｇは、ＮＡＳＨ肝臓生検においてケモカイン受容体ＣＣＲ３に関して染色した肝臓切片を表す。
【図3】図３Ａは、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスと比較した、野生型（ＷＴ）マウスにおける肝臓酵素ＡＬＴのレベルを示すグラフである。図３Ｂは、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスと比較した、野生型マウスにおける肝臓酵素ＡＬＰのレベルを示すグラフである。図３Ｃは、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスと比較した、野生型マウスにおけるビリルビンレベルを示すグラフである。図３Ｄは、ｓｉｒｃｏｌにより測定した、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスと比較した、野生型マウスにおけるコラーゲン濃度を示すグラフである。図３Ｅは、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスと比較した、野生型マウスのＭＣＤ（メチオニンコリン欠乏）誘導ＮＡＳＨモデルにおけるＮＡＦＬＤ活性化スコアを示すグラフである。図３Ｆは、ＨＥ染色した、通常の食餌を受容した野生型マウスの肝臓組織学的切片の規模ｘ５（図３Ｆ）及び規模ｘ２０（図３Ｇ）における写真である。図３Ｈは、ＨＥ染色した、ＭＣＤ食餌を受容した野生型マウスの肝臓組織学的切片の規模ｘ５（図３Ｈ）及び規模ｘ２０（図３Ｉ）における写真である。図３Ｊは、ＨＥ染色した、ＭＣＤ食餌を受容したＣＣＬ２４ノックアウトマウスの肝臓組織学的切片の規模ｘ５（図３Ｊ）及び規模ｘ２０（図３Ｋ）における写真である。
【図4】図４Ａ～４Ｄは、ＭＣＤ食餌を給餌し、異なる濃度の抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体（０．０５、０．５及び５ｍｇ／ｋｇ ＣＭ１０１）又はＰＢＳ（ビヒクル）で処置したマウスにおけるＡＳＴ（図４Ａ）、ＡＬＴ（図４Ｂ）、ビリルビン（図４Ｃ）又はコラーゲン（図４Ｄ）のレベルを示すグラフである。図４Ｅ及び４Ｆは、ＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ実験マウスの肝臓組織学的切片の写真である。図４Ｇ及び４Ｈは、０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＭ１０１マウスで処置したＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ実験マウスの肝臓組織学的切片の写真である。図４Ｉ及び４Ｊは、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＭ１０１で処置したＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ実験マウスの肝臓組織学的切片の写真である。図４Ｋ及び４Ｌは、５ｍｇ／ｋｇのＣＭ１０１で処置したＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ実験マウスの肝臓組織学的切片の写真である。図４Ｍは、異なる濃度のＣＭ１０１で処置したＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ実験マウスにおけるＮＡＦＬＤ活性スコアを示すグラフである。図４Ｎは、異なる濃度のＣＭ１０１で処置したＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ実験マウスの肝臓におけるＣＣＬ２４のレベルを示すグラフである。＊＊ｐｖ≦０．０５。
【図5】図５Ａ～５Ｎは、非アルコール性脂肪性肝炎のＳＴＡＭモデルにおける抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体（ＣＭ１０１－７．５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）又は対照ＩｇＧ（ｎ＝８）を用いた処置の効果を示すグラフ及び画像である。図５Ａ～５Ｄは、対照ＩｇＧ（図５Ａ及び図５Ｂ）又はＣＭ１０１抗体（図５Ｃ及び図５Ｄ）で処置したＨ＆Ｅ染色肝臓切片の代表的な画像である。図５Ｅは、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）を示すグラフである。図５Ｆは、肝細胞風船様腫大スコアを示すグラフである。図５Ｇ及び図５Ｈは、対照ＩｇＧで処置後のシリウスレッド染色により評価した肝臓線維症の画像である。図５Ｉ及び図５Ｊは、ＣＭ１０１抗体で処置後のシリウスレッド染色により評価した肝臓線維症の画像である。図５Ｋは、ＣＭ１０１抗体、対、対照で処置したマウスにおける平均シリウスレッド染色を示すグラフである。図５Ｌ～５Ｍは、対照ＩｇＧ（図５Ｌ）又はＣＭ１０１抗体（図５Ｍ）で処置後の肝臓切片におけるα－ＳＭＡ発現により評価した肝臓線維症の代表的な画像である。図５Ｎは、ＣＭ１０１抗体、対、対照で処置したマウスにおけるα－ＳＭＡ発現を比較するグラフである。
【図6】図６Ａ～６Ｗは、チオアセトアミド（ＴＡＡ）毒性誘導肝臓線維症ラットモデル［無処置（ｎ＝５）、ＴＡＡ誘導（ｎ＝１０）及びＴＡＡ＋ＣＭ１０１（２．５ｍｇ／ｋｇ）処置ラット（ｎ＝１０）］における抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体（ＣＭ１０１）による処置の効果を示すグラフ及び画像である。図６Ａ～６Ｉは、３匹の健康なラットからの対照肝臓（図６Ａ～６Ｃ）、ＴＡＡ誘導線維症を有する３匹のラットからの肝臓（図６Ｄ～６Ｆ）及びＣＭ１０１抗体で処置したＴＡＡ誘導線維症を有する３匹のラットからの肝臓（図６Ｇ～６Ｉ）を含む、ラット肝臓の代表的な肉眼画像である。図６Ｊは、肝臓酵素ＡＬＰ、ＡＳＴ及びＡＬＴのレベルを示すグラフである。図６Ｋ～６Ｔは、無処置動物（図６Ｋ～６Ｌ）、ＴＡＡ誘導線維症を有する２匹の動物（図６Ｏ～６Ｒ）及びＣＭ１０１抗体で処置したＴＡＡ誘導線維症を有する２匹の動物（図６Ｓ～６Ｔ）の肝臓切片におけるコラーゲン沈着に関するＨ＆Ｅ染色及びシリウスレッド染色の代表的な画像である。図６Ｕ～６Ｖは、線維症（図６Ｕ）及び炎症（図６Ｖ）のレベルを示す２つのグラフである。図６Ｗは、ｓｉｒｃｏｌにより測定したコラーゲン含有率を表すグラフである。
【図7】図７Ａ～７Ｄは、ＰＳＣ患者（図７Ｃ～７Ｄ）と比較した、健康な対照（図７Ａ～７Ｂ）からのヒトＰＢＭＣ上の代表的なＣＣＲ３発現を示すＦＡＣＳ図である。図７Ｅは、健康な志願者、対、ＰＳＣ患者におけるＣＣＲ３発現の百分率をまとめたグラフである。図７Ｆ～７Ｇは、抗ＣＣＬ２４抗体で染色したＰＳＣ患者からの肝臓切片を示す写真である。図７Ｈ～７Ｉは、抗ＣＣＲ３抗体で染色したＰＳＣ患者からの肝臓切片を示す写真である。
【図8】図８は、ビヒクルと比較した、抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体（５ｍｇ／ｋｇのＣＭ１０１）で処置したＰＳＣ誘導実験マウスモデルにおける肝臓酵素を示すグラフ（図８Ａ～８Ｄ）、及び代表的な写真（図８Ｅ～８Ｎ）を含む組織学的肝臓評価である。図８Ａ～８Ｄは、ＣＭ１０１抗体で処置したＰＳＣ誘導実験マウスモデルにおけるＡＬＫホスファターゼレベル（図８Ａ）、総ビリルビンホスファターゼレベル（図８Ｂ）、ＡＳＴレベル（図８Ｃ）及びＡＬＴレベル（図８Ｄ）を示すグラフである。図８Ｅ～８Ｎは、規模ｘ１０（図８Ｅ）及びｘ４０（図８Ｆ）での健康な対照；規模ｘ１０（図８Ｉ）及びｘ４０（図８Ｊ）でのＡＮＩＴ処置マウス、並びに規模ｘ１０（図８Ｋ～８Ｍ）及びｘ４０（図８Ｌ～８Ｎ）でのＣＭ１０１抗体を用いたＡＮＩＴ処置マウスの代表的な写真を含む組織学的肝臓切片のＨＥ染色である。
【図9】図９Ａ～９Ｆは、偽手術対照（図９Ａ及び図９Ｂ）（ｎ＝５）、ＰＢＳで処置した動物（図９Ｃ及び図９Ｄ）（ｎ＝１０）、及び抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体（ＣＭ１０１）で処置した動物（図９Ｅ及び図９Ｆ）（ｎ＝１０）の胆管炎ラットモデル（ＢＤＬ）における線維症に関するシリウスレッド染色の代表的な画像である。図９Ｇは、抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体（ＣＭ１０１）、ＰＢＳで処置した胆管炎ラットモデル（ＢＤＬ）、又は偽手術対照（各々、ｎ＝１０、１０及び５）における線維症に関するシリウスレッド染色の定量化グラフである。
【図10】図１０Ａ～１０Ｅは、非活性化細胞（図１０Ａ）、ＨＣＭ１０１抗体で処置していない（図１０Ｂ）又はＨＣＭ１０１抗体で処置後（図１０Ｃ）の高ＣＣＬ２４レベル（ＮＡＦＤＬ患者血清）で活性化した細胞、及びＨＣＭ１０１抗体で処置していない（図１０Ｄ）又はＨＣＭ１０１抗体で処置後（図１０Ｅ）の低ＣＣＬ２４レベル（ＮＡＦＤＬ患者血清）で活性化した細胞におけるα－ＳＭＡの細胞内発現に対する完全ヒト化抗体ＨＣＭ１０１の効果を示す代表的なＦＡＣＳグラフである。
【図11】図１１Ａは、ＨＣＭ１０１に対するＣＣＬ１１（エオタキシン１）の代表的なＢｉａｃｏｒｅ結合曲線を示す。図１１Ｂは、ＨＣＭ１０１に対するＣＣＬ７（ＭＣＰ３）の代表的なＢｉａｃｏｒｅ結合曲線を示す。
【図12】図１２Ａ～１２Ｆは、β－アレスチン動員又はｃＡＭＰ阻害のいずれかにより示される、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸシステムにおけるケモカイン受容体活性化を示す。図１２Ａは、増大する濃度のＣＣＬ２４の結合によるＣＣＲ３受容体の活性化を示す、β－アレスチンの動員曲線を表すグラフである。ＲＬＵ－相対発光量。図１２Ｂは、ＨＣＭ１０１によるＣＣＬ２４依存的ＣＣＲ３受容体活性化の阻害を示すグラフである。アッセイは、８０ｎＭの一定のＣＣＬ２４濃度及び増大する濃度のＨＣＭ１０１にて行った。図１２Ｃは、増大する濃度のＣＣＬ２４によるＣＣＲ５ケモカイン受容体の活性化を表す曲線を有する、ＧＰＣＲ活性化に関するＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ｃＡＭＰバイオアッセイを示すグラフである。図１２Ｄは、ＣＣＬ２４によるＣＣＲ５の活性化に対する異なる濃度のＨＣＭ１０１の阻害効果を示すグラフである。図１２Ｅは、増大する濃度のヒトＣＣＬ１１（ｎＭ）とのインキュベーションによるＣＣＲ５の活性化（％活性として示す）を示すグラフである。図１２Ｆは、ＣＣＬ１１によるＣＣＲ５の活性化に対する異なる濃度のＨＣＭ１０１の阻害効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本発明は、ＣＣＬ２４（エオタキシン２）ポリペプチドにおける立体構造エピトープに指向され、ＣＣＬ２４（及び追加の走化性物質、炎症誘発性ＣＣＲ３結合ケモカイン：エオタキシン１、Ｒａｎｔｅｓ及びＭＣＰ－３／１）に結合し、その活性を阻害するモノクローナル抗体は、ＮＡＳＨ及び胆汁うっ滞の動物モデルに示されるように、肝臓病理の処置に有用であるという驚くべき発見に基づくものである。本発明の抗ＣＣＬ２４抗体は、肝臓損傷により増大する様々な肝臓酵素（例えばＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビン）の血清レベルの低下に有効であった。本発明の抗体はまた、組織学的検査により評価して、様々な疾病モデルにおいて肝臓損傷又は壊死の減少に有効であり、また筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行を減弱させた。例示される抗ＣＣＬ２４ハツカネズミモノクローナル抗体（本明細書でＣＭ１０１と称される、米国特許第９，０６７，９８９号明細書）及びそのヒト化型ＨＣＭ１０１（国際公開第２０１５／１３２７９０号パンフレット）は、線維症、自己免疫炎症性疾患、単球関連疾患又はアレルギー・アトピー性疾患の処置における使用に結びつけられた。米国特許第９，０６７，９８９号明細書及び国際公開第２０１５／１３２７９０号パンフレットは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【0037】
本発明は、初めて、肝臓疾患の処置におけるこの抗体の新規な使用を提供する。
【0038】
従って、その第１の態様において、本発明は、肝臓病理の処置における使用のための、単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片を提供する。
【0039】
用語「エオタキシン２」（好酸球走化性タンパク質２）、「ＣＣＬ２４」（ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２４）又は「ＭＰＩＦ－２」（骨髄性前駆細胞阻害因子２）は、交換可能に使用され、ヒト染色体７に位置するヒトＣＣＬ２４遺伝子によりコードされるＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインを指す。ＣＣＬ２４は、ケモカイン受容体ＣＣＲ３と相互作用する。ＣＣＬ２４活性は、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球及び好中球における走化性の誘導、並びに内皮及び平滑筋細胞における血管新生及び遊走性応答の誘導を含む。
【0040】
用語「抗体」は、抗原、即ちＣＣＬ２４に特異的に結合及び認識する、免疫グロブリン遺伝子によりコードされるポリペプチドを指す。
【0041】
本発明の抗ＣＣＬ２４抗体は、いくつかの異なる炎症誘発性ＣＣＲ３結合ケモカインを認識することが以前に示された（国際公開第２０１５／１３２７９０号パンフレット）。ＣＣＬ２４に対して生成され、追加のケモカイン（例えば、エオタキシン１、Ｒａｎｔｅｓ及びＭＣＰ－３）に結合し、その活性を効果的に減弱させることがその後見出された抗体。特定の一実施形態では、この抗体は、試験した他のケモカインよりも、ＣＣＬ２４に対して高い親和性で結合する。明らかに、本発明の抗体は、これらの炎症誘発性ＣＣＲ３結合ケモカインにおける交差反応性エピトープを認識する。
【0042】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書に定義される用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に同種の抗体の集団を指し、即ち集団を構成する個々の抗体は、マイナーな量で存在し得る、天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に指向される。
【0043】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の任意の方法により調製及び精製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、免疫化動物（例えばラット又はマウス）の脾臓又はリンパ節から採取したＢ細胞から、ハイブリッド細胞の増殖に好ましい条件下で、不死化Ｂ細胞と融合させることにより調製することができる。
【0044】
マウスの免疫化は、例えば国際公開第２０１０／０８６８５４号パンフレットに記載されているように行うことができる。手短には、マウスの免疫化は、例えば、完全フロイントアジュバントで乳化された、好ましくはＮ－ループ中の立体構造エピトープ（例えば５０μｇ）を含む、所望の抗原、即ちＣＣＬ２４、又はＣＣＬ２４の断片で一次皮下（ｓ．ｃ．）免疫化することにより行うことができる。次いで、不完全フロイントアジュバントで乳化された抗原（例えば５０μｇ）を用いた２回の皮下追加免疫注射を、２週間毎に投与する。最も高い中和抗体力価を有するマウスは、ＰＢＳ中の抗原（例えば５μｇ）の更なる静脈内（ｉ．ｖ．）追加免疫を、脾臓除去の４日前に受ける。
【0045】
最終追加免疫（例えば４日間）後、最も高い中和抗体力価を有するマウスの脾臓を除去し、以前に記載されているように、ポリエチレングリコールを使用して、脾細胞をマウス骨髄腫細胞（例えばＮＳ０細胞）に融合させる（Ｋｏｅｈｌｅｒ、Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）。融合後、細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン）培地中で増殖させることにより、ハイブリドーマ細胞を選択する。次いで、例えば下記に記載するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、細胞クローンを特異的抗体産生に関してスクリーニングする。
【0046】
モノクローナル抗体の精製は、例えば親和性クロマトグラフィー、即ち、特異的エピトープが結合する親和性カラムの使用に基づくものでもよい。
【0047】
例示的な抗体構造単位は、当該技術分野で既知のように、四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽鎖」及び１つの「重鎖」を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原（又はエピトープ）認識に関与する約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を画定する。
【0048】
従って、用語「重鎖可変領域」（ＶＨ）及び「軽鎖可変領域」（ＶＬ）は、各々、これらの重鎖及び軽鎖を指す。より詳細には、可変領域は、超可変領域及びフレームワーク（ＦＲ）領域に細分される。超可変領域は、所定の位置におけるもっとも一般的なアミノ酸と比較して、その位置における高い比率の異なるアミノ酸を有する。より安定なアミノ酸配列を有する４つのＦＲ領域は、超可変領域を分離する。超可変領域は、抗原の表面の部分と直接接触する。そのため、超可変領域は、本明細書では「相補性決定領域」、又は「ＣＤＲ」と称される。
【0049】
軽鎖及び重鎖の両方は、Ｎ末端からＣ末端へ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに対する結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称され、Ｎ末端から開始して順次番号付けされ、また典型的には特定のＣＤＲが位置する鎖によっても特定される。
【0050】
従って、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、抗体の重鎖のＮ末端から開始して３つの相補性決定領域を指し、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、抗体の軽鎖のＮ末端から開始して３つの相補性決定領域を指す。
【0051】
いくつかの実施形態において、単離された抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体である。
【0052】
本明細書に定義される用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来すると共に、鎖の残りの部分が他の種に由来する抗体を指す。
【0053】
キメラ抗体は、例えば下記に記載するように、当該技術分野で既知の任意の方法により調製することができる。
【0054】
ハツカネズミ－ヒトキメラ抗体は、抗体可変領域をコードするハツカネズミＶＨ及びＶＬ遺伝子の増幅及びクローニングと、その後のハツカネズミ－ヒトキメラ抗体発現とにより調製することができる。これを目的として、所望の特性を有する抗体を分泌することが示されたハツカネズミ抗ＣＣＬ２４ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを単離し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマー、Ｍ－ＭＬＶ及びＡＭＶ逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成する。重鎖及び軽鎖可変遺伝子（ＶＨ及びＶＬ）の増幅は、基本的にＢｅｎｈａｒ及びＲｅｉｔｅｒ（Ｂｅｎｈａｒ、Ｉ．及びＲｅｉｔｅｒ、Ｙ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ １０：Ｕｎｉｔ １０ １９Ｂ）に記載されているように、各遺伝子のフレームワーク１の５’末端に、及び３’末端の定常領域（各々、ＣＨ１又はＣｋ）に指向されるプライマーのパネルを使用して行われ得る。
【0055】
次いで、例えばｐＣＭＶ－ベースの抗体発現ベクターへのクローニングのために両端に制限部位を導入する非退縮プライマーを使用して、可変遺伝子を再び増幅する。
【0056】
増幅された重及び軽可変遺伝子は別々に精製され、消化され、適切な哺乳動物完全長Ｉｇ発現ベクターにクローニングされ、対応するシグナルペプチド及び定常遺伝子を有する各鎖を提供し、ＩｇＧ１／ｋハツカネズミヒトキメラ抗体発現をもたらす。
【0057】
用語「ヒト化」抗体は、伝統的に、ＣＤＲ及び任意選択的に追加の関連位置において非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を有するヒト由来免疫グロブリンフレームワークを含む非ヒト（例えば、ハツカネズミ）抗体の形態を指す。殆どの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性及び活性を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【0058】
本明細書で使用される用語「完全ヒト化」抗体は、ヒト配列のみを有するように設計された抗体に関する。本発明の完全ヒト化抗体は、患者において抗体の免疫原性を最小限にするＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）技術を用いて調製された。このヒト化技術では、無関係のヒト抗体の可変（Ｖ）領域に由来する多数の配列セグメントが、出発抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のためのアクセプターとして使用される。ヒト配列セグメントの慎重な選択とインシリコツールの適用により、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが回避されるため、抗体親和性及び特異性を維持しながら、標準的なヒト化抗体と比較して免疫原性のリスクが低減する。そのような抗体は、ヒト配列のみを含み、従って「完全ヒト化」と定義される。
【0059】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒトにより生成され、及び／又は当該技術分野で既知のヒト抗体の作製の技術のいずれかを使用して作製された抗体に対応するアミノ酸配列を所有する抗体を指す。この定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【0060】
ヒト化及びヒト抗体の調製は、当該技術分野で周知である。抗体は、ファージディスプレイを使用して調製することもできる。当該技術分野で既知のように、抗体ファージディスプレイ（ＡＰＤ）は、バクテリオファージの遺伝子操作及び抗原誘導選択とファージの増殖の循環過程の繰り返しに基づく。
【0061】
ＡＰＤプロセスは、選択された細胞源（例えば、末梢血単核細胞）から良質のＲＮＡを調製することによる、抗体ライブラリーの調製から開始する。このＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写され、これはコードされた抗体のＶＨ及びＶＬ鎖のＰＣＲに使用される。このステップの次に、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ＰＣＲ産物のファージディスプレイベクターへのライゲーションが行われ、結果的にｍＡｂｓのクローンが分析される。
【0062】
大量の抗体（キメラ、ヒト化、完全ヒト化又はヒトのいずれか）を調製するために、抗体の重鎖及び軽鎖の両方を含むＩｇ発現ベクターで細胞（例えばＣＨＯ細胞）をトランスフェクトすることにより、抗体を発現している安定な細胞株を調製することができる。次いで、抗体は、最先端の使い捨てのバイオリアクターシステムにて製造することができる。抗体は、確立されたモノクローナル抗体精製方法を用いて臨床等級に精製され得る。次いで、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば本明細書で下記に詳細するＣＣＬ２４特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより試験して、高度に抗ＣＣＬ２４抗体を産生するクローンが選択され得、上清中の抗体レベルに基づいて拡大され得る。特定のクローンのために開発されたマスター細胞バンクは、全ての臨床等級バッチの成長原料として機能する可能性がある。
【0063】
いくつかの実施形態において、本発明は、肝臓病の処置における使用のための単離された抗ＣＣＬ２４ハツカネズミ抗体（本明細書でＣＭ１０１と称される）、又はその任意の抗原結合断片を提供し、前記抗体は：
ａ．配列番号９と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる重鎖と、配列番号１０と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる軽鎖とを含むモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片；及び
ｂ．ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ ８０９０８１７０２）により分泌されるモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片
からなる群から選択される。
ａ．配列番号９と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる重鎖と、配列番号１０と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる軽鎖とを含むモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片；及び
ｂ．ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ ８０９０８１７０２）により分泌されるモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片
からなる群から選択される。
【0064】
ハツカネズミ抗体ＣＭ１０１重鎖をコードする核酸配列は、配列番号９として示される：
【0065】
ハツカネズミ抗体ＣＭ１０１軽鎖（κ）をコードする核酸配列は、配列番号１０として示される：
【0066】
本発明は、抗体ＣＭ１０１のヒト化及び完全ヒト化型も包含する。
【0067】
いくつかの実施形態において、本発明は、肝臓病の処置における使用のための、単離された完全ヒト化抗ＣＣＬ２４抗体（本明細書でＨＣＭ１０１と称される）、又はその任意の抗原結合断片を提供し、前記抗体は：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0068】
本発明によれば、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１で示されるアミノ酸配列ＮＳＧＭＮ、又はその変異体を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２で示されるアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、又はその変異体を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３で示されるアミノ酸配列ＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮ、又はその変異体を含み；ＶＫ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ又はその変異体を含み；ＶＫ ＣＤＲ２は、配列番号５で示されるアミノ酸配列ＶＡＳＮＬＫＳ又はその変異体を含み；ＶＫ ＣＤＲ３は、配列番号６で示されるアミノ酸配列ＱＱＳＮＥＥＰＷＴ又はその変異体を含む。
【0069】
特定の一実施形態において、本発明は、肝臓病理の処置における使用のための、配列番号３で示されるアミノ酸配列ＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮを含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３を含む、単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片を提供する。
【0070】
各々、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６で示される、上記のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それらの各々の重鎖及び軽鎖配列の状況によっても表される：
【0071】
本明細書に例示される単離された完全ヒト化多特異性モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７により示され、アミノ酸配列：
のものである。
【0072】
本明細書に例示される単離されたヒト化多特異性モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８により示され、アミノ酸配列：
のものである。
【0073】
従って、更なる実施形態において、本発明による使用のための単離された抗体は、前記抗体が、配列番号７で示される重鎖可変領域又はその変異体、及び配列番号８で示される軽鎖可変領域又はその変異体を含む完全ヒト化抗体であるものである。
【0074】
別の実施形態では、本発明による使用のための単離された抗体は、前記抗体が、配列番号１～６で示される６つのＣＤＲ配列、並びに配列番号７に対して少なくとも９０％配列相同性を有する重鎖可変領域及び配列番号８に対して少なくとも９０％配列相同性を有する軽鎖可変領域を含む完全ヒト化抗体であるものである。
【0075】
別の実施形態では、本発明は：
（ａ）ＮＳＧＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＶＡＳＮＬＫＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＳＮＥＥＰＷＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体と同じエピトープに結合する、肝臓病理の処置における使用のための、単離されたモノクローナル抗体を提供する。
（ａ）ＮＳＧＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに
（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＶＡＳＮＬＫＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＳＮＥＥＰＷＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体と同じエピトープに結合する、肝臓病理の処置における使用のための、単離されたモノクローナル抗体を提供する。
【0076】
本発明は、肝臓病理の処置を必要とする対象に、上記に定義した抗体を投与することを含む、肝臓病理の処置方法も提供する。
【0077】
別の実施形態では、本発明による使用のための単離された抗体は、前記抗体が、配列番号１１で示される核酸配列によりコードされる重鎖可変領域又はその変異体、及び配列番号１２で示される核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域又はその変異体を含む完全ヒト化抗体であるものである。
【0078】
配列番号１１：
【0079】
配列番号１２：
＊ＣＤＲヌクレオチド配列は太字であり、下線が引かれている。
【0080】
本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域の変異体も包含する。変異体は、本明細書に記載した抗体の活性を変更しない、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域又はフレームワーク領域における変異を含み得る。
【0081】
用語「変異体」は、１つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが削除、置換又は付加された、本明細書に詳細に特定した配列とは異なるアミノ酸又はヌクレオチドの配列を意味する。
【0082】
本明細書で使用される用語「付加された」は、本明細書に記載した配列へのアミノ酸残基の任意の付加を意味することを認識するべきである。
【0083】
変異体は、様々なアミノ酸置換を包含する。アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸が、同様の又は異なる構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸と置き換えられた結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行われ得る。
【0084】
典型的には、変異体は、保存的アミノ酸置換を包含する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み；正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含み；負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
【0085】
以下の８つのグループの各々は、互いに保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【0086】
保存的核酸置換は、上記に定義した保存的アミノ酸置換をもたらす核酸置換である。
【0087】
本発明による変異体は、非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換及びその逆も包含する。
【0088】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸ミメティックを指す。
【0089】
変異体配列は、それらのアミノ酸又はヌクレオチド配列の、本明細書に記載したアミノ酸又はヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載した抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸又はヌクレオチド配列）との同一性の百分率により特徴付けられ得るアミノ酸又は核酸配列を指す。
【0090】
いくつかの実施形態において、本明細書に定義される変異体配列は、本明細書に記載した重鎖及び軽鎖可変領域の配列と比較した場合に、各々、少なくとも７０％又は７５％の配列同一性、およそ８０％又は８５％の配列同一性、およそ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を指す。
【0091】
用語「肝臓病理」又は「肝臓病」は、本明細書で交換可能に使用され、肝臓の任意の疾患に関する。肝臓病理は、一般に、肝臓の硬変又は瘢痕、感染（例えばＢ型肝炎又はＣ型肝炎）又は非感染原因（アルコール性脂肪性肝炎を含む化学的又は自己免疫性肝炎）により生じる炎症（肝炎）、腫瘍、良性及び悪性（肝癌）並びに代謝疾患を含む。ある特定の実施形態において、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含むＮＡＦＬＤ）、胆汁うっ滞、並びに原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）及び原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）を含む肝内胆汁うっ滞性肝疾患等の肝臓病理の処置における使用のための抗ＣＣＬ２４抗体を提供する。
【0092】
本発明は：
ａ．肝臓損傷による肝臓酵素（例えばＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビン）の高い血清レベルの低下；
ｂ．肝臓損傷若しくは壊死の減少；及び／又は
ｃ．筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の減弱
における使用のための単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片も提供する。
ａ．肝臓損傷による肝臓酵素（例えばＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビン）の高い血清レベルの低下；
ｂ．肝臓損傷若しくは壊死の減少；及び／又は
ｃ．筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の減弱
における使用のための単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片も提供する。
【0093】
いくつかの実施形態において、前記肝臓酵素の高いレベル、又は前記肝臓損傷若しくは壊死は、上述した肝臓病理により生じる。
【0094】
いくつかの実施形態において、前記単離された抗ＣＣＬ２４抗体は、ハツカネズミ抗体（本明細書でＣＭ１０１と称される）、又はその任意の抗原結合断片であり、前記抗体は：
ａ．配列番号９と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる重鎖及び配列番号１０と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片；並びに
ｂ．ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ ８０９０８１７０２）により分泌されるモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片
からなる群から選択される。
ａ．配列番号９と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる重鎖及び配列番号１０と少なくとも９０％相同性を有する核酸によりコードされる軽鎖を含むモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片；並びに
ｂ．ハイブリドーマＤ８（ＥＣＡＣＣ受入番号Ｄ ８０９０８１７０２）により分泌されるモノクローナル抗体、又は抗体の結合活性を保持するその断片
からなる群から選択される。
【0095】
いくつかの実施形態において、前記単離された抗ＣＣＬ２４抗体は、完全ヒト化抗体（本明細書でＨＣＭ１０１と称される）、又はその任意の抗原結合断片であり、前記抗体は：
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変異体；
を含む重鎖可変領域と、
ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変異体；
ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変異体；及び
ｆ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変異体
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0096】
用語「抗体の活性」は、抗体がＣＣＬ２４に結合する能力、及び好ましくはＣＣＬ２４により仲介される生物学的機能を阻害する能力、例えば細胞動員又は走化性（例えば、好酸球又は単球又は線維芽細胞の動員又は走化性）を阻害する能力を意味する。生物学的機能は、当該技術分野で周知の方法を用いてインビボで又はインビトロで測定することができる。そのようなインビボアッセイのいくつかは、下記の実施例に記載されている。
【0097】
本発明の抗体の、その標的タンパク質に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。
【0098】
本発明は、本発明の単離された抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体の任意の抗原結合断片を更に包含する。そのような抗原結合断片は、抗原に結合することが可能な、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２であってもよい。そのような断片は、当該技術分野で既知の任意の方法により、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を生成するための）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するための）等の酵素を使用したタンパク質切断により、生成することができる。
【0099】
従って、いくつかの実施形態において、抗体断片は、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗原に結合することが可能な重鎖可変領域、抗原に結合することが可能な軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0100】
その態様の別の１つにおいて、本発明は、本発明による抗体又はその任意の抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供し、前記抗体は、肝臓病の処置における使用のためのものである。
【0101】
本明細書に定義される用語「核酸」又は「核酸分子」は、単鎖又は二本鎖のいずれかであり得、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び、適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチドであるヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡ又はＤＮＡの類似体、並びに、記載される実施形態に適用可能な場合、単鎖（センス又はアンチセンス等）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解するべきである。本明細書で使用される用語ＤＮＡは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の作用によりＲＮＡ鋳型から生成されるｃＤＮＡ、即ち相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡも包含する。
【0102】
本発明は、本明細書に定義される単離された核酸分子を含む発現ベクターを更に提供する。
【0103】
時折「発現ビヒクル」又は「発現コンストラクト」と称される、本明細書で使用される「発現ベクター」は、ＤＮＡ断片を宿主のゲノムに統合することが可能な、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、統合可能なＤＮＡ断片、及び他のビヒクル等のベクターを包含する。発現ベクターは、典型的には、所望の遺伝子又はその断片、及び好適な宿主細胞内で認識され、所望の遺伝子の発現をもたらす作動可能に結合した遺伝子制御エレメントを含む自己複製ＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクトである。これらの制御エレメントは、好適な宿主内で発現をもたらすことが可能である。本発明による発現ベクターは、いくつか挙げると、細菌、酵母又は哺乳動物宿主細胞内での発現に適格であり得る。
【0104】
その態様の更なる別の１つにおいて、本発明は、本発明による単離された核酸分子又は本発明による発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【0105】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、本発明による単離された核酸分子又は本発明による発現ベクターの導入を受けやすい細胞を指す。好ましくは、前記細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である。本発明による単離された核酸分子又は発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションは、当該技術分野で既知の任意の方法により行うことができる。
【0106】
その態様の更なる別の１つにおいて、本発明は、本発明による抗体又はその任意の抗原結合断片と、下記にて本明細書に定義される追加の治療薬とを含む免疫複合体を提供する。
【0107】
本明細書に定義される用語「免疫複合体」は、追加の薬剤に複合（結合又は連結）している本発明による抗体又はその任意の抗原結合断片を指す。免疫複合体は、当業者に既知の任意の方法により、例えば、追加の薬剤を本発明による抗体と架橋させることにより、又は組換えＤＮＡ方法により調製することができる。
【0108】
本発明の抗ＣＣＬ２４抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【0109】
本明細書で使用される用語「追加の治療薬」は、肝臓病の処置に使用できる任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態によれば、前記少なくとも１つの追加の治療薬は、化学療法薬、サイトカイン、ペプチド、抗体及び抗生物質からなる群から選択される。
【0110】
ある特定の実施形態において、前記追加の治療薬は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作動薬（例えばカフェストール、ケノデオキシコール酸、オベチコール酸、フェキサラミン）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、抗ケモカイン又はサイトカインモノクローナル抗体、ケモカイン又はサイトカイン機能を阻害する小分子、ステロイドを含む抗炎症剤及び抗線維化剤、及び可溶性タンパク質抗炎症剤を含むがこれらに限定されない。
【0111】
ある特定の実施形態において、追加の治療薬は、追加の抗体である。本明細書に定義される用語「追加の抗体」は、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る、本発明による抗体ではない抗体を指す。
【0112】
本発明は、活性成分としての、本発明の単離された抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片、又は本明細書に定義される免疫複合体、及び薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を更に提供し、前記医薬組成物は、肝臓病の処置における使用のため、及び／又は：
ａ．肝臓損傷による肝臓酵素（例えばＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビン）の高い血清レベルの低下；
ｂ．肝臓損傷若しくは壊死の減少；及び／又は
ｃ．筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の減弱
における使用のためのものである。
ａ．肝臓損傷による肝臓酵素（例えばＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビン）の高い血清レベルの低下；
ｂ．肝臓損傷若しくは壊死の減少；及び／又は
ｃ．筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の減弱
における使用のためのものである。
【0113】
本発明の「医薬組成物」は、一般に、本明細書に定義される抗体又はその任意の抗原結合断片、及び組成物の浸透圧を調整する薬剤である緩衝剤、並びに任意選択的に、当該技術分野で既知の１つ以上の薬学的に許容され得る担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。
【0114】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤」は、当該技術分野で既知のように、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤等を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。各担体は、他の成分と適合性を有し、対象に傷害性ではないという意味で、薬学的及び生理学的の両方で許容され得る必要がある。任意の従来の培地又は薬剤が活性成分と不適合な場合を除いて、治療的組成物におけるその使用が想定される。
【0115】
別の実施形態では、本発明による医薬組成物は、追加の治療薬を更に含む。追加の治療薬の非限定的な例としては、ＦＸＲ作動薬、ＰＰＡＲ作動薬、抗ケモカイン若しくは抗サイトカインモノクローナル抗体、又はケモカイン若しくはサイトカインの活性を阻害する任意の小分子、タンパク質若しくはペプチド、ステロイドを含む抗炎症剤及び抗線維化剤が挙げられる。
【0116】
特定の実施形態において、本発明は、単離された抗ＣＣＬ２４完全ヒト化抗体、又はその任意の抗原結合断片を含む医薬組成物に関し、前記抗体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域又はその変異体と、配列番号８で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域又はその変異体とを含み、前記医薬組成物は、肝臓病の処置における使用のためのものである。
【0117】
肝臓病の予防、処置又は回復方法を更に提供し、当該方法は、それを必要とする対象に、治療的有効量の単離された抗ＣＣＬ２４抗体又はその任意の抗原結合断片又は本発明による医薬組成物を投与することを含む。
【0118】
肝臓損傷による肝臓酵素（例えばＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビン）の高い血清レベルを低下させる方法も提供し、当該方法は、それを必要とする対象に、治療的有効量の単離された抗ＣＣＬ２４抗体又はその任意の抗原結合断片又は本発明による医薬組成物を投与することを含む。
【0119】
肝臓損傷又は壊死を減少させる方法も提供し、当該方法は、それを必要とする対象に、治療的有効量の単離された抗ＣＣＬ２４抗体又はその任意の抗原結合断片又は本発明による医薬組成物を投与することを含む。
【0120】
筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行を減弱させる方法も提供し、当該方法は、それを必要とする対象に、治療的有効量の単離された抗ＣＣＬ２４抗体又はその任意の抗原結合断片又は本発明による医薬組成物を投与することを含む。
【0121】
用語「対象」又は「患者」は、交換可能に使用され、本発明から利益を受け得る対象、例えば哺乳動物（例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ又はヒト）を指す。特定の一実施形態では、患者はヒトである。
【0122】
本明細書に定義される用語「予防」は、「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）処置」又は「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置」を提供すること、即ち保護的に作用して、肝臓病の症状の出現、又は肝臓病の発症若しくは進行に対して防御する又は予防することを意味する。
【0123】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置している」、「処置」又はその形態は、疾病又は状態の有害効果を低減する、予防する、治癒させる、逆行させる、回復させる、減弱させる、緩和する、最小限にする、抑制する若しくは停止させること、又は本明細書に定義した肝臓病の１つ以上の臨床的徴候の発症を遅延させることを意味することを理解するべきである。
【0124】
本発明による投与は、以下の経路のいずれかにより行われ得る：経口投与、静脈内、筋内、腹腔内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｅｃｈａｌ）又は皮下注射；直腸内投与；鼻腔内投与、眼投与又は局所投与。
【0125】
特定の実施形態において、本発明による投与は、静脈内で行われ得る。別の特定の実施形態では、投与は、腹腔内で行われ得る。別の特定の実施形態では、投与は、吸入により行われ得る。
【0126】
本明細書に定義される抗体若しくは抗体断片、当該抗体若しくは抗体断片又はそれらの任意の複合体を含む任意の医薬組成物は、疾病発症の前又は後に対象に投与され得る。
【0127】
従って、いくつかの実施形態において、本発明による肝臓病の予防、処置又は回復方法は、本発明による前記単離された抗ＣＣＬ２４抗体若しくはその任意の抗原結合断片、又は本発明による医薬組成物が、疾病発症の前又は後に、前記対象に投与される方法である。
【0128】
本明細書に定義された目的のための、本発明による単離されたモノクローナル抗体若しくはその任意の抗原結合断片、又は本発明による医薬組成物の「治療的有効量」は、医学的状態を治癒させる、抑止する又は少なくとも緩和する又は回復させるための当該技術分野で既知のもの等の考慮事項により決定される。本発明の方法に使用される任意の製剤の場合、投与量又は治療的有効量は、当初、インビトロでの細胞培養アッセイから、又は本明細書に詳細する動物モデル等の動物モデルに基づいて見積もられ得る。
【0129】
いくつかの実施形態において、本発明による治療的有効量は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【0130】
別の実施形態では、本発明による治療的有効量は、０．０１～４０ｍｇ／ｋｇ、０．１～４０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、又は５～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【0131】
別の実施形態では、本発明による単離された抗ＣＣＬ２４抗体若しくはその任意の抗原結合断片、又は本発明による医薬組成物は、単回用量又は多回用量として対象に投与される。
【0132】
特定の例示的な用量は、各々、１日１回用量として与えられる、０．７５ｍｇ／ｋｇ、又は２．５ｍｇ／ｋｇ、又は５ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇを含むがこれらに限定されない。一実施形態において、用量は、静脈内に与えられる。
【0133】
本発明の文脈における用語「それを必要とする対象」は、本明細書に定義した肝臓病を患う哺乳動物、特にヒト対象を指す。
【0134】
本発明は、本明細書に定義した肝臓病の予防、処置又は回復方法における使用のための、本発明による単離された抗ＣＣＬ２４抗体若しくはその任意の抗原結合断片、又は本発明による医薬組成物を更に提供する。
【0135】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に定義した肝臓病の予防、処置又は回復方法における使用のための、単離された完全ヒト化抗ＣＣＬ２４抗体、又はその任意の抗原結合断片を提供し、前記抗体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域又はその変異体と、配列番号８で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域又はその変異体とを含む。
【0136】
用語「精製された」又は「単離された」は、それらの自然環境から除去され、単離され又は分離されたアミノ酸又は核酸配列、ペプチド、ポリペプチド又は抗体等の分子を指すことが認識される。従って、「単離された抗体」は、精製された抗体である。本明細書で使用される用語「精製された」又は「精製すること」は、サンプルからの汚染物質の除去も指す。
【0137】
下記の実施例に示すように、本発明の抗体は、ケモカイン受容体ＣＣＲ３及びＣＣＲ５の両方の活性化を低減又は阻害することができる。更に、本発明の抗体は、ＣＣＲ５のＣＣＬ２４誘導及びＣＣＬ１１誘導活性化の両方を阻害することが可能であった。
【0138】
従って、別の態様では、本発明は、細胞におけるＣＣＲ５活性化の阻害方法を提供し、当該方法は、上記に定義した本発明の抗体を投与することを含む。
【0139】
従って、本発明の抗体は、ＣＣＲ５活性化に関連した疾病又は疾患の処置に使用することができる。そのような疾病又は疾患の非限定的な例は、上記に定義した肝臓病理である。
【実施例】
【0140】
更に詳細に述べることなく、当業者は、先行する記載により本開示を最大限に利用できると考えられる。従って、以下の好ましい特定の実施形態は、単なる例示であり、特許請求された本発明を如何様にも限定するものではないと解釈される。
【0141】
本明細書に詳細に記載しない当該技術分野で既知の標準的な分子生物学プロトコルは、一般に、基本的にＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１に従う。
【0142】
本明細書に詳細に記載しない当該技術分野で既知の標準的な医薬品化学方法は、一般に、基本的に、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓにより出版されている、様々な著者及び編集者による「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」シリーズに従う。
【0143】
材料及び方法
ヒト対象の血清におけるケモカインレベル
ＮＡＳＨ及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）患者と健康なドナーとの血清中のエオタキシン－２レベルを、以下のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って決定した：ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＣＣＬ２４（エオタキシン２）（Ｒ＆Ｄ）。
ヒト対象の血清におけるケモカインレベル
ＮＡＳＨ及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）患者と健康なドナーとの血清中のエオタキシン－２レベルを、以下のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って決定した：ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＣＣＬ２４（エオタキシン２）（Ｒ＆Ｄ）。
【0144】
ヒト患者の肝臓生検の免疫組織化学的検査
ヒトＣＣＬ２４に関する免疫組織化学染色を、ＮＡＳＨ患者からの厚さ５μｍの肝臓生検の凍結切片上で行った。メタノール及びアセトンを用いて固定化した後、切片を非免疫ウサギ及びヤギ血清でブロックし、その後ＣＡＳブロッキング試薬と共にインキュベートした。続いて、一次抗体を室温で１時間加えた。洗浄後、ビオチン化親和性精製ヤギ抗マウス／ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を加えた。次いで、スライドを０．３％ Ｈ２Ｏ２と共にインキュベートし、その後、更に濯ぎ、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に室温で３０分間インキュベートした。スライドを３－アミノ－９エチルカルバゾール基質（Ｄａｋｏ）で１５分間現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、肝臓切片におけるＮＡＦＬＤ活性化スコア変化の分析に使用した。
ヒトＣＣＬ２４に関する免疫組織化学染色を、ＮＡＳＨ患者からの厚さ５μｍの肝臓生検の凍結切片上で行った。メタノール及びアセトンを用いて固定化した後、切片を非免疫ウサギ及びヤギ血清でブロックし、その後ＣＡＳブロッキング試薬と共にインキュベートした。続いて、一次抗体を室温で１時間加えた。洗浄後、ビオチン化親和性精製ヤギ抗マウス／ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を加えた。次いで、スライドを０．３％ Ｈ２Ｏ２と共にインキュベートし、その後、更に濯ぎ、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に室温で３０分間インキュベートした。スライドを３－アミノ－９エチルカルバゾール基質（Ｄａｋｏ）で１５分間現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、肝臓切片におけるＮＡＦＬＤ活性化スコア変化の分析に使用した。
【0145】
マウスからの肝臓サンプルにおけるＣＣＬ２４レベル
マウスから得た肝臓組織を秤量し、溶解緩衝液中に懸濁させた（各１０ｍｇの組織について－抗プロテアーゼを含む１００μｌの溶解緩衝液を加えた）。次いで、組織をＰｏｌｙｔｒｏｎで粉砕し、４℃にて１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、商業的なＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を使用して、上清をＣＣＬ２４レベルに関してアッセイした。
マウスから得た肝臓組織を秤量し、溶解緩衝液中に懸濁させた（各１０ｍｇの組織について－抗プロテアーゼを含む１００μｌの溶解緩衝液を加えた）。次いで、組織をＰｏｌｙｔｒｏｎで粉砕し、４℃にて１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、商業的なＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を使用して、上清をＣＣＬ２４レベルに関してアッセイした。
【0146】
マウス肝臓切片におけるＨ＆Ｅ染色
マウスからの肝臓、動物当たり２つの肝葉を回収し、犠牲日に２．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定した。組織をトリミングし、パラフィン中に包埋し、厚さ５マイクロメートル以下で分割し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０）を使用して、倍率Ｘ１０、Ｘ２０及びＸ４０で写真を撮影した。
マウスからの肝臓、動物当たり２つの肝葉を回収し、犠牲日に２．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定した。組織をトリミングし、パラフィン中に包埋し、厚さ５マイクロメートル以下で分割し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０）を使用して、倍率Ｘ１０、Ｘ２０及びＸ４０で写真を撮影した。
【0147】
ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＴｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５ ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ、Ｖｏｌ．４１、Ｎｏ．６）により定義される容認可能なスコアに従って、ＮＡＦＬＤ活性スコアの計算のために以下のパラメーターを評価した。スコアは、脂肪沈着（０～３）、小葉内炎症（０～３）、及び肝細胞風船様腫大（０～２）のスコアの非加重合計として定義する；従って、０～８の範囲である：
１．脂肪沈着（低～中－実質性病変のパワー評価）
（０≦５％、１－５～３３％、２－３３～６６％、３≧６６％）。
２．炎症（全ての炎症性病巣の全体的評価）（０＝病巣なし、１ ２００ｘ視野当たり≦２病巣、２：２００ｘ視野当たり２～４病巣、３：２００ｘ視野当たり≧４病巣。）
肝細胞風船様腫大（０＝なし、１＝数個の腫大変化、２＝多数の細胞／顕著な風船様腫大）
１．脂肪沈着（低～中－実質性病変のパワー評価）
（０≦５％、１－５～３３％、２－３３～６６％、３≧６６％）。
２．炎症（全ての炎症性病巣の全体的評価）（０＝病巣なし、１ ２００ｘ視野当たり≦２病巣、２：２００ｘ視野当たり２～４病巣、３：２００ｘ視野当たり≧４病巣。）
肝細胞風船様腫大（０＝なし、１＝数個の腫大変化、２＝多数の細胞／顕著な風船様腫大）
【0148】
ラット肝臓切片におけるシリウスレッド染色
肝臓組織を１０％緩衝中性ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋した。切片（４μｍ）を脱パラフィンし、ピクロシリウスレッドで室温（ＲＴ）で１５分間染色し、脱水し、マウンティング培地でマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ光／落射蛍光顕微鏡及びビデオサブシステムとインターフェースしたＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ画像解析ソフトウエアプログラム（ＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）を使用して、肝臓線維症を染色切片中で測定した。ＳＴＡＭマウスのピクロシリウスレッド染色切片における線維症の評価のために、デジタルカメラ（ＤＦＣ２９５；Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、染色切片の明視野画像（各スライドで４０視野）によりコラーゲン沈着を可視化及び定量化し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
肝臓組織を１０％緩衝中性ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋した。切片（４μｍ）を脱パラフィンし、ピクロシリウスレッドで室温（ＲＴ）で１５分間染色し、脱水し、マウンティング培地でマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ光／落射蛍光顕微鏡及びビデオサブシステムとインターフェースしたＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ画像解析ソフトウエアプログラム（ＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）を使用して、肝臓線維症を染色切片中で測定した。ＳＴＡＭマウスのピクロシリウスレッド染色切片における線維症の評価のために、デジタルカメラ（ＤＦＣ２９５；Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、染色切片の明視野画像（各スライドで４０視野）によりコラーゲン沈着を可視化及び定量化し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
【0149】
肝臓切片における免疫蛍光染色
蛍光免疫組織化学的検査：
肝臓組織切片（厚さ５μｍ）を脱パラフィンし、再水和し、クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中で１０分間煮沸した。切片をＰＢＳ中で洗浄し、２ｍｇ／ｍｌグリシン中で１０分間インキュベートして、遊離アルデヒドにより生じた自家蛍光を消光した後、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。次いで、１％ ＢＳＡを有するＰＢＳ中で希釈した以下の一次抗体と共に、切片を４℃で一晩インキュベートした：マウスモノクローナル抗ヒトＣＣＬ２４（１：１００希釈；Ｃｈｅｍｏｍａｂ、Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、Ｉｓｒａｅｌ）及びラットポリクローナル抗ヒトＣＣＲ３（；１：５０希釈；カタログ番号ＭＡＢ１５５－１００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。翌日、スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、１％ ＢＳＡを有するＰＢＳ中で１：２００に希釈した、二次抗体としてのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８複合ヤギ抗マウスＩｇＧ又はローダミンＲｅｄ－Ｘ－複合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に、暗所内で室温で４５分間インキュベートした。無関係アイソタイプ適合及び濃度適合マウス及びラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を負の対照として使用した。二次抗体の交差反応性を、一次抗体を省略した対照実験にて試験した。核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で対比染色した。次いで、肝臓切片を退色防止水性マウント培地（Ｂｉｏｍｅｄａ Ｇｅｌ Ｍｏｕｎｔ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）でマウントし、完全自動化蛍光軸を備えたＬｅｉｃａ ＤＭ４０００ Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査した。ＬｅｉｃａソフトウエアアプリケーションスイートＬＡＳ Ｖ３．８を備えたＬｅｉｃａ ＤＦＣ３１０ ＦＸ １．４－メガピクセルデジタルカラーカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光画像を捕捉した。
蛍光免疫組織化学的検査：
肝臓組織切片（厚さ５μｍ）を脱パラフィンし、再水和し、クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中で１０分間煮沸した。切片をＰＢＳ中で洗浄し、２ｍｇ／ｍｌグリシン中で１０分間インキュベートして、遊離アルデヒドにより生じた自家蛍光を消光した後、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。次いで、１％ ＢＳＡを有するＰＢＳ中で希釈した以下の一次抗体と共に、切片を４℃で一晩インキュベートした：マウスモノクローナル抗ヒトＣＣＬ２４（１：１００希釈；Ｃｈｅｍｏｍａｂ、Ｔｅｌ Ａｖｉｖ、Ｉｓｒａｅｌ）及びラットポリクローナル抗ヒトＣＣＲ３（；１：５０希釈；カタログ番号ＭＡＢ１５５－１００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。翌日、スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、１％ ＢＳＡを有するＰＢＳ中で１：２００に希釈した、二次抗体としてのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８複合ヤギ抗マウスＩｇＧ又はローダミンＲｅｄ－Ｘ－複合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に、暗所内で室温で４５分間インキュベートした。無関係アイソタイプ適合及び濃度適合マウス及びラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を負の対照として使用した。二次抗体の交差反応性を、一次抗体を省略した対照実験にて試験した。核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で対比染色した。次いで、肝臓切片を退色防止水性マウント培地（Ｂｉｏｍｅｄａ Ｇｅｌ Ｍｏｕｎｔ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）でマウントし、完全自動化蛍光軸を備えたＬｅｉｃａ ＤＭ４０００ Ｂ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査した。ＬｅｉｃａソフトウエアアプリケーションスイートＬＡＳ Ｖ３．８を備えたＬｅｉｃａ ＤＦＣ３１０ ＦＸ １．４－メガピクセルデジタルカラーカメラ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光画像を捕捉した。
【0150】
ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビンの測定：
血液を遠心分離し、血清を得た。ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビンのレベルを、ＣＯＢＡＳ ６０００を使用して血清中で測定した。
血液を遠心分離し、血清を得た。ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビンのレベルを、ＣＯＢＡＳ ６０００を使用して血清中で測定した。
【0151】
ＣＣＬ２４に対するノックアウトマウスの生成
ＣＣＬ２４ノックアウト（ＫＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－仲介ゲノム操作により生成した。ＣＣＬ２４のためのＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、インビトロ転写により生成し、次いでＫＯマウス生成のために受精卵に注入した。ファウンダーマウスの遺伝子型をＰＣＲと、その後のＤＮＡ配列決定解析により同定した。陽性ファウンダーを次世代まで飼育し、これの遺伝子型をＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定解析により同定した。追加の飼育を行い、ＰＣＲ遺伝子型同定により解明して、ＣＣＬ２４に関する二重ノックアウトマウスを確立した。ＰＣＲ及び配列解析により同定された潜在的なオフターゲット部位を試験し、陰性と確認した。
ＣＣＬ２４ノックアウト（ＫＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－仲介ゲノム操作により生成した。ＣＣＬ２４のためのＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、インビトロ転写により生成し、次いでＫＯマウス生成のために受精卵に注入した。ファウンダーマウスの遺伝子型をＰＣＲと、その後のＤＮＡ配列決定解析により同定した。陽性ファウンダーを次世代まで飼育し、これの遺伝子型をＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定解析により同定した。追加の飼育を行い、ＰＣＲ遺伝子型同定により解明して、ＣＣＬ２４に関する二重ノックアウトマウスを確立した。ＰＣＲ及び配列解析により同定された潜在的なオフターゲット部位を試験し、陰性と確認した。
【0152】
誘導性ＮＡＳＨを有するＣＣＬ２４ノックアウトマウス
Ｃ５７ＢＬ背景に関するＣＣＬ２４ノックアウトを、上述したようにＣＲＩＳＰＥＲ技術を用いて生成した。６週齢のＷＴ Ｃ５７ＢＬマウス又はＣＣＬ２４ノックアウトマウスにメチオニンコリン欠乏食餌を４週間給餌した。４週間後、マウスを犠牲にし、組織学的検査及びコラーゲン測定（Ｓｉｒｃｏｌ（商標））のために、それらの肝臓を回収した。ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビンの評価のために眼窩静脈叢から血液を収集した。
Ｃ５７ＢＬ背景に関するＣＣＬ２４ノックアウトを、上述したようにＣＲＩＳＰＥＲ技術を用いて生成した。６週齢のＷＴ Ｃ５７ＢＬマウス又はＣＣＬ２４ノックアウトマウスにメチオニンコリン欠乏食餌を４週間給餌した。４週間後、マウスを犠牲にし、組織学的検査及びコラーゲン測定（Ｓｉｒｃｏｌ（商標））のために、それらの肝臓を回収した。ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ及びビリルビンの評価のために眼窩静脈叢から血液を収集した。
【0153】
インビボでのＭＣＤ食餌誘導ＮＡＳＨモデル
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬマウスにメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌を６週間給餌した。食餌開始から１０日目に開始して、マウスを５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ又は０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＭ－１０１又はＰＢＳの１００μｌ腹腔内注射で週に２回処置した。ＣＭ－１０１を用いた処置は、疾病症状の発症後に開始した。
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬマウスにメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌を６週間給餌した。食餌開始から１０日目に開始して、マウスを５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ又は０．０５ｍｇ／ｋｇのＣＭ－１０１又はＰＢＳの１００μｌ腹腔内注射で週に２回処置した。ＣＭ－１０１を用いた処置は、疾病症状の発症後に開始した。
【0154】
６週間後にマウスを犠牲にし、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ及びビリルビンレベルの評価のために、眼窩静脈叢から血液を収集した（ＡＮＩＴモデルに関して下記に記載するように４℃（３０００×ｇ）で遠心分離して血清を得た）。加えて、肝臓を病理組織学分析のために回収し、ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ染色）のためにパラフィン包埋に供した。凍結組織をコラーゲンアッセイ（Ｓｉｒｃｏｌ（商標））及び肝臓ＣＣＬ２４レベルの評価に使用した。
【0155】
ＮＡＳＨ誘導のためのＳＴＡＭマウスモデル
２００μｇストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）溶液の単回皮下注射を、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの誕生から２日後に投与した後、４週齢から高脂肪食餌（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％脂肪、Ｃａｔ＃ＨＦＤ３２、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ、Ｊａｐａｎ）を与えた。対照ＩｇＧ及びＣＭ１０１（７．５ｍｇ／ｋｇ）を６～９週齢から１０μｌ／ｋｇの容積で週に２回、腹腔内投与した。
２００μｇストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）溶液の単回皮下注射を、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの誕生から２日後に投与した後、４週齢から高脂肪食餌（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％脂肪、Ｃａｔ＃ＨＦＤ３２、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ、Ｊａｐａｎ）を与えた。対照ＩｇＧ及びＣＭ１０１（７．５ｍｇ／ｋｇ）を６～９週齢から１０μｌ／ｋｇの容積で週に２回、腹腔内投与した。
【0156】
α－ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）誘導胆汁うっ滞マウスモデル
雌Ｃ５７ＢＬマウスを１日目に経口経管栄養（１０ｍｌ／ｋｇ）によりＡＮＩＴ（油に溶解、６０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照グループに経口経管栄養によりオリーブ油を投与した。ＣＭ１０１又はビヒクルをＡＮＩＴ処置グループに１回５ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。ＡＮＩＴ投与から４８時間後、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、安楽死させた。血液サンプルを収集し、４℃（３０００×ｇ）で遠心分離して血清を得て：ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビン（化学パネル）を試験した。加えて、肝臓をホルマリン中に収集し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにパラフィン中に包埋した。
雌Ｃ５７ＢＬマウスを１日目に経口経管栄養（１０ｍｌ／ｋｇ）によりＡＮＩＴ（油に溶解、６０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。対照グループに経口経管栄養によりオリーブ油を投与した。ＣＭ１０１又はビヒクルをＡＮＩＴ処置グループに１回５ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。ＡＮＩＴ投与から４８時間後、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、安楽死させた。血液サンプルを収集し、４℃（３０００×ｇ）で遠心分離して血清を得て：ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビン（化学パネル）を試験した。加えて、肝臓をホルマリン中に収集し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにパラフィン中に包埋した。
【0157】
胆管結索により誘導された胆汁うっ滞
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（８週齢）にケタミン／キシラジン（Ｋｅｔ ５０ｍｇ／ｋｇ及びＸｙｌ １０ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内で麻酔をかけた。腹壁の手術部位を剪毛及び浄化し、肝臓を穏やかに後退させて結索のために胆管をあらわにした。対照の偽手術動物は同じ手順を経たが、結索は行わなかった。０日（結索の日）から、ラットにＰＢＳ又はＨＣＭ１０１ １０ｍｇ／ｋｇの容積１０ｍｌ／ｋｇの静脈内注射を週に２回投与した。実験は実験動物を１４日後に犠牲にすることにより終了した。
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（８週齢）にケタミン／キシラジン（Ｋｅｔ ５０ｍｇ／ｋｇ及びＸｙｌ １０ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内で麻酔をかけた。腹壁の手術部位を剪毛及び浄化し、肝臓を穏やかに後退させて結索のために胆管をあらわにした。対照の偽手術動物は同じ手順を経たが、結索は行わなかった。０日（結索の日）から、ラットにＰＢＳ又はＨＣＭ１０１ １０ｍｇ／ｋｇの容積１０ｍｌ／ｋｇの静脈内注射を週に２回投与した。実験は実験動物を１４日後に犠牲にすることにより終了した。
【0158】
ラットのチオアセトアミド（ＴＡＡ）誘導肝臓線維症モデル
疾病誘導のために、７～９週齢の雄Ｗｉｓｔａｒラットにチオアセトアミド（２５０ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃１７２５０２）を週に２回、８週間腹腔内注射した。ＨＣＭ１０１処理動物（２．５ｍｇ／ｋｇ）は抗体の静脈内注射を週に２回、４週間受けた。
疾病誘導のために、７～９週齢の雄Ｗｉｓｔａｒラットにチオアセトアミド（２５０ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃１７２５０２）を週に２回、８週間腹腔内注射した。ＨＣＭ１０１処理動物（２．５ｍｇ／ｋｇ）は抗体の静脈内注射を週に２回、４週間受けた。
【0159】
Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して、ＨＣＭ１０１の親和定数を評価した。この方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）電気光学現象を使用して、結合定数及び結合パートナー間のオン／オフ率を測定する。ＨＣＭ１０１をＣＭ－１チップの表面に固定化し、エオタキシン１（ＣＣＬ１１）／ＭＣＰ３（ＣＣＬ７）の溶液を表面上に通過させた。ＳＰＲ角の変化を測定し、ＫＤ（平衡解離定数）の決定を可能にした。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して、ＨＣＭ１０１の親和定数を評価した。この方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）電気光学現象を使用して、結合定数及び結合パートナー間のオン／オフ率を測定する。ＨＣＭ１０１をＣＭ－１チップの表面に固定化し、エオタキシン１（ＣＣＬ１１）／ＭＣＰ３（ＣＣＬ７）の溶液を表面上に通過させた。ＳＰＲ角の変化を測定し、ＫＤ（平衡解離定数）の決定を可能にした。
【0160】
ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ β－アレスチンＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ及びｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＣＣＲ５アッセイ
リガンド結合後のＧ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性化を評価するために、ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）及びβ－アレスチンＰａｔｈＨｕｎｔｅｒアッセイキット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って使用した。手短には、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ＧＰＣＲ β－アレスチンアッセイにおいて、ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）（ＰＫ）タグ化ＣＣＲ３及びＥｎｚｙｍｅ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（ＥＡ）タグ化β－アレスチンを共発現するように操作されたＣＨＯ β－アレスチンＣＣＲ３細胞を、９６ウェルプレート内に蒔いた。ケモカイン受容体活性化を誘導するために、細胞を高い（０、７．８、１５．６、３１．２５、６２．５、１２５、５００及び２０００ｎＭ）レベルのＣＣＬ２４に暴露した。ＨＣＭ１０１阻害効果を、高い抗体濃度５、１５、４５及び１３５μｇ／ｍｌと共に、８０ｎＭの一定のＣＣＬ２４濃度で評価した。ＣＣＲ３－ＰＫ受容体の活性化により誘導されたβ－アレスチン－ＥＡの動員は、２つのβ－ガラクトシダーゼ酵素断片（ＥＡ及びＰＫ）の補完をもたらす。次いで、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬基質を細胞に加えて暗所にて室温で６０分間インキュベートし、基質のβ－ガラクトシダーゼ酵素加水分解を可能にした。生成した化学発光シグナルをＶｅｒｉｔａｓ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）により評価した。ＣＣＲ５活性化の評価のために、ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）システムを使用した。ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＣＣＲ５ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｇｉ細胞は、受容体の作動薬刺激に応答した細胞内ｃＡＭＰレベルの変化を検出するよう設計されている。細胞を９６ウェルプレート内に蒔き、一晩インキュベートする。細胞を高濃度の作動薬（０．１５６２５、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５及び５μＭ ｍｉｐ－１α又はＣＣＬ２４）に暴露し、暗所内でｃＡＭＰ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと共に１時間インキュベートする。ｃＡＭＰ ＳｏｌｕｔｉｏｎＡを添加した後、化学発光シグナルを評価する前に、追加の３時間のインキュベーション期間を行う。ＨＣＭ１０１阻害を評価するために、一定の１００ｎＭのＣＣＬ２４を、高いレベルのＨＣＭ１０１（１、２、７、２０及び６０μｇ／ｍｌ）と共に加えた。
リガンド結合後のＧ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性化を評価するために、ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）及びβ－アレスチンＰａｔｈＨｕｎｔｅｒアッセイキット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って使用した。手短には、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ＧＰＣＲ β－アレスチンアッセイにおいて、ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）（ＰＫ）タグ化ＣＣＲ３及びＥｎｚｙｍｅ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（ＥＡ）タグ化β－アレスチンを共発現するように操作されたＣＨＯ β－アレスチンＣＣＲ３細胞を、９６ウェルプレート内に蒔いた。ケモカイン受容体活性化を誘導するために、細胞を高い（０、７．８、１５．６、３１．２５、６２．５、１２５、５００及び２０００ｎＭ）レベルのＣＣＬ２４に暴露した。ＨＣＭ１０１阻害効果を、高い抗体濃度５、１５、４５及び１３５μｇ／ｍｌと共に、８０ｎＭの一定のＣＣＬ２４濃度で評価した。ＣＣＲ３－ＰＫ受容体の活性化により誘導されたβ－アレスチン－ＥＡの動員は、２つのβ－ガラクトシダーゼ酵素断片（ＥＡ及びＰＫ）の補完をもたらす。次いで、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬基質を細胞に加えて暗所にて室温で６０分間インキュベートし、基質のβ－ガラクトシダーゼ酵素加水分解を可能にした。生成した化学発光シグナルをＶｅｒｉｔａｓ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）により評価した。ＣＣＲ５活性化の評価のために、ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）システムを使用した。ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＣＣＲ５ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｇｉ細胞は、受容体の作動薬刺激に応答した細胞内ｃＡＭＰレベルの変化を検出するよう設計されている。細胞を９６ウェルプレート内に蒔き、一晩インキュベートする。細胞を高濃度の作動薬（０．１５６２５、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５及び５μＭ ｍｉｐ－１α又はＣＣＬ２４）に暴露し、暗所内でｃＡＭＰ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎと共に１時間インキュベートする。ｃＡＭＰ ＳｏｌｕｔｉｏｎＡを添加した後、化学発光シグナルを評価する前に、追加の３時間のインキュベーション期間を行う。ＨＣＭ１０１阻害を評価するために、一定の１００ｎＭのＣＣＬ２４を、高いレベルのＨＣＭ１０１（１、２、７、２０及び６０μｇ／ｍｌ）と共に加えた。
【0161】
コラーゲン含有率の測定
Ｓｉｒｃｏｌ可溶性コラーゲンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、Ｂｅｌｆａｓｔ、ＵＫ）を用いて、可溶性コラーゲンを定量化した。ＣＭ１０１（５、２０又は１００μｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ又はＰＢＳのいずれかで処置したマウスから肝臓サンプルを得た。このサンプルを酸－ペプシン溶液中に抽出した。サンプルを製造業者のプロトコルに従って、コラーゲン含有率に関して分析した。手短には、１００μｌのサンプルを１ｍｌの比色分析試薬（ピクリン酸中の染料ＳＲ）に加え、３０分間撹拌した後、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ＳＲ染料をアルカリ試薬（１Ｎ ＮａＯＨ）によりペレットから解放し、分光光度読み取りを、マイクロプレートリーダー上で５５５ｎｍで獲得した。
Ｓｉｒｃｏｌ可溶性コラーゲンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、Ｂｅｌｆａｓｔ、ＵＫ）を用いて、可溶性コラーゲンを定量化した。ＣＭ１０１（５、２０又は１００μｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ又はＰＢＳのいずれかで処置したマウスから肝臓サンプルを得た。このサンプルを酸－ペプシン溶液中に抽出した。サンプルを製造業者のプロトコルに従って、コラーゲン含有率に関して分析した。手短には、１００μｌのサンプルを１ｍｌの比色分析試薬（ピクリン酸中の染料ＳＲ）に加え、３０分間撹拌した後、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ＳＲ染料をアルカリ試薬（１Ｎ ＮａＯＨ）によりペレットから解放し、分光光度読み取りを、マイクロプレートリーダー上で５５５ｎｍで獲得した。
【0162】
活性化ヒト肝星細胞におけるＳＭＡ－α測定
肝星細胞を血清フリーＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。ＳＭＡ－αの基礎測定のためにベースライン細胞サンプルを０日目に得た。
肝星細胞を血清フリーＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。ＳＭＡ－αの基礎測定のためにベースライン細胞サンプルを０日目に得た。
【0163】
ＥＬＩＳＡにより以前に測定して高い又は低いレベルのＣＣＬ２４を含む１％ ＮＡＦＬＤ患者血清と共に、ＨＣＭ１０１（５μｇ／ｍｌ）を有し又は有さずに、細胞を４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を遠心分離し、商業的なキット（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ Ｉ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ ＰＥ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、細胞内ＳＭＡ－α蛍光検出用に染色した。蛍光シグナルをＦＡＣＳ（Ｇａｌｉｕｓ）により測定し、Ｋａｌｕｚａソフトウエアを使用して解析を行った。
【0164】
肝臓切片のΑ－ＳＭＡ染色
切片をＯ．Ｃ．Ｔ．中に包埋された凍結肝臓組織から切り取り、アセトン中で固定化し、０．０３％ Ｈ２Ｏ２で５分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を抗α－ＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ 希釈１：２００）と共に室温で１時間インキュベートした。二次抗体（ＨＲＰ－ヤギ抗ウサギ）とのインキュベーション後、３，３’－ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を使用して酵素－基質反応を行った。α－ＳＭＡ－陽性範囲の明視野画像を、デジタルカメラ（ＤＦＣ２９５；Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２００倍の拡大率で、中心静脈の周囲にて捕捉し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して４０視野／切片における陽性範囲を測定した。
切片をＯ．Ｃ．Ｔ．中に包埋された凍結肝臓組織から切り取り、アセトン中で固定化し、０．０３％ Ｈ２Ｏ２で５分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を抗α－ＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ 希釈１：２００）と共に室温で１時間インキュベートした。二次抗体（ＨＲＰ－ヤギ抗ウサギ）とのインキュベーション後、３，３’－ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を使用して酵素－基質反応を行った。α－ＳＭＡ－陽性範囲の明視野画像を、デジタルカメラ（ＤＦＣ２９５；Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２００倍の拡大率で、中心静脈の周囲にて捕捉し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して４０視野／切片における陽性範囲を測定した。
【0165】
実施例１：高いレベルのＣＣＬ２４は、ＮＡＳＨ及びＮＡＦＬＤを有する患者の血清及び肝臓生検の両方で見出される。
ＮＡＳＨにおけるＣＣＬ２４の潜在的な関与を検討するために、ＮＡＦＬＤ患者の血清中のＣＣＬ２４のレベルを、健康な対象と比較して評価した。結果は、図１Ａに示すように、高いＦＩＢ ４スコアを有する患者においてＣＣＬ２４の２倍の増大（ｐｖ≦０．０１）と、低いＦＩＢ ４スコアを有する患者において１．５倍の増大（ｐｖ≦０．０５）とを示した。高い線維化スコアは、ＮＡＳＨの高い可能性の指標である。従って、ＮＡＦＬＤ患者における高いレベルのＣＣＬ２４は、健康な又はＮＡＦＬＤ患者のいずれかの血液サンプルから採取したＰＢＭＣ上の高いＣＣＲ３発現にも関連していた（図１Ｂ～１Ｎ）。ＣＣＲ３レベルは、抗ＣＣＲ３抗体で染色した単離ＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析を用いて測定した。図１Ｂ、１Ｃから明らかであり得るように、健康な患者のＰＢＭＣにおける０．４７％、０．５４％又は０．６１％と比較して、ＮＡＦＬＤ患者のＰＢＭＣの４．８８％、３．２％又は４．６９％は、ＣＣＲ３発現を示した。
ＮＡＳＨにおけるＣＣＬ２４の潜在的な関与を検討するために、ＮＡＦＬＤ患者の血清中のＣＣＬ２４のレベルを、健康な対象と比較して評価した。結果は、図１Ａに示すように、高いＦＩＢ ４スコアを有する患者においてＣＣＬ２４の２倍の増大（ｐｖ≦０．０１）と、低いＦＩＢ ４スコアを有する患者において１．５倍の増大（ｐｖ≦０．０５）とを示した。高い線維化スコアは、ＮＡＳＨの高い可能性の指標である。従って、ＮＡＦＬＤ患者における高いレベルのＣＣＬ２４は、健康な又はＮＡＦＬＤ患者のいずれかの血液サンプルから採取したＰＢＭＣ上の高いＣＣＲ３発現にも関連していた（図１Ｂ～１Ｎ）。ＣＣＲ３レベルは、抗ＣＣＲ３抗体で染色した単離ＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析を用いて測定した。図１Ｂ、１Ｃから明らかであり得るように、健康な患者のＰＢＭＣにおける０．４７％、０．５４％又は０．６１％と比較して、ＮＡＦＬＤ患者のＰＢＭＣの４．８８％、３．２％又は４．６９％は、ＣＣＲ３発現を示した。
【0166】
加えて、有意に高いＣＣＬ２４の発現は、ＮＡＳＨ患者から採取した肝臓生検にて検出されたが（図２Ａ～Ｃ）、ＣＣＬ２４発現は健康な肝臓には検出されなかった（図２Ｄ、２Ｅ）。図２Ｆ及び２Ｇは、ＣＣＬ２４関連受容体ＣＣＲ３も肝臓内に発現していることを示す。理論に束縛されるものではないが、ＣＣＬ２４はＮＡＳＨの進行に重要な役割を有し得ると思われる。次の実施例では、抗ＣＣＬ２４モノクローナル抗体の効果をインビボで肝臓病のモデルにおいて評価した。
【0167】
実施例２：ＣＣＬ２４ノックアウトマウスのＭＣＤ誘導ＮＡＳＨモデルにおける肝臓機能の特徴付け
ＣＣＬ２４ノックアウト（ＫＯ）マウスを、材料及び方法の節に記載したように生成した。ＣＣＬ２４ ＫＯ Ｃ５７ＢＬマウスにＭＣＤを給餌することにより、これらのマウスにＮＡＳＨを誘導した。ＮＡＳＨは、正常な遺伝的Ｃ５７ＢＬ背景を有する（「野生型」と称する）対照グループにも誘導した。様々な肝臓特性を試験して、疾病進行に対するＣＣＬ２４ノックアウトの効果を示した。図３に示すように、ＡＬＴ（図３Ａ）、ＡＬＰ（図３Ｂ）及びビリルビン（図３Ｃ）血清レベルは、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスよりも野生型マウスで有意に高かった。同様に、図３Ｄに示すように、肝臓内のコラーゲン濃度は、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスにおけるよりも野生型マウスにおいて遥かに高かった。また図３Ｅに示すように、ＮＡＳスコア（ＮＡＦＬＤ活性スコア）、治験中のＮＡＦＬＤの変化を測定するツールとして開発された非アルコール性脂肪性肝疾患の特徴を点数化するシステムは、野生型におけるよりもノックアウトマウスにおいて遥かに低かった。理論に束縛されるものではないが、結果はＮＡＳＨ発生におけるＣＣＬ２４の重要性を明らかに示している。図３Ｆ～３Ｋは、代表的なＨＥ染色肝臓切片を示す。
ＣＣＬ２４ノックアウト（ＫＯ）マウスを、材料及び方法の節に記載したように生成した。ＣＣＬ２４ ＫＯ Ｃ５７ＢＬマウスにＭＣＤを給餌することにより、これらのマウスにＮＡＳＨを誘導した。ＮＡＳＨは、正常な遺伝的Ｃ５７ＢＬ背景を有する（「野生型」と称する）対照グループにも誘導した。様々な肝臓特性を試験して、疾病進行に対するＣＣＬ２４ノックアウトの効果を示した。図３に示すように、ＡＬＴ（図３Ａ）、ＡＬＰ（図３Ｂ）及びビリルビン（図３Ｃ）血清レベルは、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスよりも野生型マウスで有意に高かった。同様に、図３Ｄに示すように、肝臓内のコラーゲン濃度は、ＣＣＬ２４ノックアウトマウスにおけるよりも野生型マウスにおいて遥かに高かった。また図３Ｅに示すように、ＮＡＳスコア（ＮＡＦＬＤ活性スコア）、治験中のＮＡＦＬＤの変化を測定するツールとして開発された非アルコール性脂肪性肝疾患の特徴を点数化するシステムは、野生型におけるよりもノックアウトマウスにおいて遥かに低かった。理論に束縛されるものではないが、結果はＮＡＳＨ発生におけるＣＣＬ２４の重要性を明らかに示している。図３Ｆ～３Ｋは、代表的なＨＥ染色肝臓切片を示す。
【0168】
実施例３：抗ＣＣＬ２４ ｍＡｂ ＣＭ１０１による処置は、マウスモデルにおいてＮＡＳＨの特徴を低減する。
ＮＡＳＨ進行に対するＣＣＬ２４の阻害の効果を、ハツカネズミ抗ＣＣＬ２４抗体ＣＭ１０１を使用して更に評価した。ハツカネズミＣＭ１０１は、ヒトＣＣＬ２４に指向されるマウスモノクローナル抗体である（国際公開第２０１０／０８６８５４号パンフレット）。ＣＭ１０１を用いたＮＡＳＨに対する処置の効果を評価するために、メチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌を使用してハツカネズミモデルにＮＡＳＨを誘導した。
ＮＡＳＨ進行に対するＣＣＬ２４の阻害の効果を、ハツカネズミ抗ＣＣＬ２４抗体ＣＭ１０１を使用して更に評価した。ハツカネズミＣＭ１０１は、ヒトＣＣＬ２４に指向されるマウスモノクローナル抗体である（国際公開第２０１０／０８６８５４号パンフレット）。ＣＭ１０１を用いたＮＡＳＨに対する処置の効果を評価するために、メチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌を使用してハツカネズミモデルにＮＡＳＨを誘導した。
【0169】
Ｃ５７ＢＬマウスにＭＣＤ食餌を６週間給餌することによりＮＡＳＨを誘導した。対照グループに通常の固形飼料食餌を給餌した。
【0170】
ＣＭ１０１（０．０５、０．５、５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳを１０日目からＭＣＤ給餌マウスに週に２回腹腔内注射し、このとき疾病の症状が既に存在していた。食餌の開始から６週間後、マウスを犠牲にし、肝臓及び血液サンプルを全グループから得た。
【0171】
ＰＢＳ又はより低い用量で処置したマウスと比較して、５ｍｇ／ｋｇ ＣＭ－１０１で処置したマウスにＮＡＳＨパラメーターの有意な低下が観察された。図４に示すように、５ｍｇ／ｋｇ ＣＭ－１０１高用量は、試験したパラメーター（肝臓酵素、肝臓コラーゲンレベル及び肝臓組織学的スコア）の全ての増大を減弱させた。ＡＬＴ、ＡＳＴ及びビリルビン（図４Ａ～４Ｃ）は、ＰＢＳ処置マウスと比較して高用量ＣＭ－１０１処置グループで有意に低下した（ｐ＜０．０５）。ＣＭ－１０１の効果は、肝臓コラーゲン濃度の有意な低下においても明らかであり、５ｍｇ／ｋｇ ＣＭ－１０１で処置したグループにおける肝臓コラーゲンの９５％低下を示し、正常な基礎コラーゲンレベルに逆戻りした（図４Ｄに示すように）。Ｈ＆Ｅ肝臓染色（図４Ｅ～４Ｌの組織学的切片の写真）におけるＮＡＦＬＤ活性化スコアの決定により、５ｍｇ／ｋｇ ＣＭ－１０１で処置したグループにおける７スコアから５スコアへの有意な低下が明らかとなった（図４Ｍ）。
【0172】
最終的に、肝臓内の標的結合を検証するために、肝臓内のＣＣＬ２４のレベルを評価し、ＣＭ１０１を用いた処置によるタンパク質発現の十分な低下を示した（図４Ｎ）。
【0173】
実施例４：ＣＭ１０１処置によるＳＴＡＭマウスＮＡＳＨモデルにおけるＮＡＦＬＤ活性スコア及び線維症の回復
ＣＭ１０１処置の抗線維化及び抗炎症剤効果を、ＳＴＡＭマウスモデルにおいてＮＡＳＨに対して更に評価した。ＳＴＡＭマウスは、ヒトにおけるＮＡＳＨ発生の病態生理学的プロセスを密接に模倣するモデルであり、脂肪肝からＮＡＳＨを経由した線維症及び肝臓癌腫への疾病の全段階を示す。これらの動物は、誕生から２日後にストレプトゾトシンの単回皮下注射を受け、その後、肝臓損傷に似たＮＡＳＨを誘導する高脂肪食餌を受けた。
ＣＭ１０１処置の抗線維化及び抗炎症剤効果を、ＳＴＡＭマウスモデルにおいてＮＡＳＨに対して更に評価した。ＳＴＡＭマウスは、ヒトにおけるＮＡＳＨ発生の病態生理学的プロセスを密接に模倣するモデルであり、脂肪肝からＮＡＳＨを経由した線維症及び肝臓癌腫への疾病の全段階を示す。これらの動物は、誕生から２日後にストレプトゾトシンの単回皮下注射を受け、その後、肝臓損傷に似たＮＡＳＨを誘導する高脂肪食餌を受けた。
【0174】
病理組織学的分析では、ＳＴＡＭマウスへの７．５ｍｇ／ｋｇのＣＭ１０１の投与が、Ｈ＆Ｅ染色により評価して、肝臓損傷を減少させ（図５Ａ～５Ｄ）、対照ＩｇＧ処置グループと比較してＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳスコア）を３２％、有意に減弱させることが示された（図５Ｅ）。この効果は、優勢に、６５％低下した肝細胞風船様腫大の相当の改善から得られた（図５Ｆ）。ＣＭ１０１は、肝臓コラーゲンの蓄積及び線維症を有意に低下させ、これは対照グループと比較して低下したシリウスレッド陽性範囲により示された（図５Ｇ～５Ｋ）。線維症の確立及び肝臓内のコラーゲン沈着の大部分に関与する、肝臓肝星細胞の活性化を表すα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）もＳＴＡＭマウスにて評価した。抗ＣＣＬ２４処置は、対照ＩｇＧグループと比較してα－ＳＭＡ陽性染色範囲の有意な低下をもたらした（図５Ｌ～５Ｎ）。
【0175】
実施例５：ＣＭ１０１は、ラットＴＡＡ誘導肝臓線維症モデルにおいて肝臓損傷及び線維症を有意に低下させる。
線維症に対するＨＣＭ１０１処置の特異的な効果を決定するために、ラット毒性（ＴＡＡ）誘導線維症モデルを研究した。ＣＣＬ２４の阻害は肝臓損傷の低下をもたらし、これは未処置対照と比較して有意に低下した肝臓酵素レベルにより示される。更に、肝臓損傷の肉眼検査により、再生結節の減少及び損傷の低下を伴う肝臓病理の顕著な回復が明らかとなった（図６Ａ、６Ｂ）。肝臓切片のシリウス染色による線維症の評価は、未処置対照と比較してＨＣＭ１０１処置グループのコラーゲン沈着の平均５倍の減少と、炎症のほぼ２倍の低下を示した（図６Ｃ）。Ｓｉｒｃｏｌ定量化によるコラーゲン沈着の更なる評価は、コラーゲン含有率における４５％の有意な低下を明らかにした（図６Ｄ）。
線維症に対するＨＣＭ１０１処置の特異的な効果を決定するために、ラット毒性（ＴＡＡ）誘導線維症モデルを研究した。ＣＣＬ２４の阻害は肝臓損傷の低下をもたらし、これは未処置対照と比較して有意に低下した肝臓酵素レベルにより示される。更に、肝臓損傷の肉眼検査により、再生結節の減少及び損傷の低下を伴う肝臓病理の顕著な回復が明らかとなった（図６Ａ、６Ｂ）。肝臓切片のシリウス染色による線維症の評価は、未処置対照と比較してＨＣＭ１０１処置グループのコラーゲン沈着の平均５倍の減少と、炎症のほぼ２倍の低下を示した（図６Ｃ）。Ｓｉｒｃｏｌ定量化によるコラーゲン沈着の更なる評価は、コラーゲン含有率における４５％の有意な低下を明らかにした（図６Ｄ）。
【0176】
実施例６：ＣＣＬ２４及びその受容体ＣＣＲ３は、ＰＳＣ患者の肝臓及び循環内で過剰発現している。
商業的な抗ＣＣＲ３抗体を使用して、ＣＣＲ３レベルを原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）及び健康な志願者（各々、ｎ＝１０、ｎ＝２２）からのＰＢＭＣに対して評価した。図７Ａ～７Ｅに示すように、健康な個人（０．６８％＋０．３６）と比較して、ＰＳＣ患者（３．９４％＋１．３５）においてＣＣＲ３レベルの有意な増大が認められた。ＣＣＬ２４及びＣＣＲ３を、ＰＳＣ患者の肝臓内で免疫蛍光法を用いて評価した。図７Ｆ～７Ｉに示すように、ＣＣＬ２４及びＣＣＲ３レベルは、免疫細胞、胆管細胞及び肝細胞内で有意に過剰発現していた。
商業的な抗ＣＣＲ３抗体を使用して、ＣＣＲ３レベルを原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）及び健康な志願者（各々、ｎ＝１０、ｎ＝２２）からのＰＢＭＣに対して評価した。図７Ａ～７Ｅに示すように、健康な個人（０．６８％＋０．３６）と比較して、ＰＳＣ患者（３．９４％＋１．３５）においてＣＣＲ３レベルの有意な増大が認められた。ＣＣＬ２４及びＣＣＲ３を、ＰＳＣ患者の肝臓内で免疫蛍光法を用いて評価した。図７Ｆ～７Ｉに示すように、ＣＣＬ２４及びＣＣＲ３レベルは、免疫細胞、胆管細胞及び肝細胞内で有意に過剰発現していた。
【0177】
実施例７：ＣＭ１０１は、実験的原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）モデルの肝臓損傷を強く回復させる。
ＰＳＣ動物モデルにおけるＣＭ１０１の効果を評価するために、ＡＮＩＴ化合物により誘導した齧歯類胆汁うっ滞モデルを使用した。
ＰＳＣ動物モデルにおけるＣＭ１０１の効果を評価するために、ＡＮＩＴ化合物により誘導した齧歯類胆汁うっ滞モデルを使用した。
【0178】
この疾病モデルに典型的なビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ及びＡＳＴの高い血清レベルは、ＣＭ１０１処置によって、ＡＮＩＴ誘導胆汁うっ滞性マウスにおいて各々８７、４７、３３及び４８％、有意に低下した（図８Ａ）。加えて、Ｈ＆Ｅ染色を用いて肝臓壊死を評価することによって、ＣＭ１０１の病理組織学的効果を研究した。ＡＮＩＴ誘導肝臓損傷は、マウスにおいてＣＭ１０１処置により減弱することが認められた（図８Ｂ）。ラットにて胆管結索により誘導した胆汁うっ滞の第二のモデルで、ＣＭ１０１を用いた処置の効果を更に評価した。このモデルにおけるドクトラル（ｄｏｃｔｏｒａｌ）反応及び肝臓損傷に関連した線維症をシリウスレッド染色により評価し、処置を受けなかった手術動物と比較して、抗ＣＣＬ２４ ｍＡｂで処置したラットの肝臓における損傷の有意な低下を示した（図９Ａ、９Ｂ）。
【0179】
実施例８：完全ヒト化ＨＣＭ１０１抗体は、筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行を減弱させる。
多数の器官において、筋線維芽細胞は、損傷に応答した瘢痕プロセスの主な役割を担う。肝臓線維化又は硬変では、肝星細胞（ＨＳＣ）は、筋線維芽細胞への前駆体集団（即ち、それらは分化転換する）と見なされる。
多数の器官において、筋線維芽細胞は、損傷に応答した瘢痕プロセスの主な役割を担う。肝臓線維化又は硬変では、肝星細胞（ＨＳＣ）は、筋線維芽細胞への前駆体集団（即ち、それらは分化転換する）と見なされる。
【0180】
筋線維芽細胞は、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）を有する細胞質ストレス線維により特徴付けられる、特殊化した線維芽細胞である。αＳＭＡは筋線維芽細胞を特徴付ける因子であるため、細胞内αＳＭＡレベルの測定は、筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行の指標の役割を果たすことができ、従って、肝臓細胞の状態の重篤さの指標として機能する。
【0181】
ＣＣＬ２４仲介による筋芽細胞へのＨＳＣ移行に対する抗ＣＣＬ２４抗体の効果を測定するために、ＨＳＣ細胞株を使用した。完全ヒト化抗ＣＣＬ２４抗体ＨＣＭ１０１を使用してアッセイを行った（国際公開第２０１５／１３２７９０号パンフレット）。細胞を１％のＮＡＦＬＤ患者の血清の存在下、ヒト化ＨＣＭ１０１（５μｇ／ｍｌ）を有し又は有さずに３７℃で４８時間インキュベートした。αＳＭＡのレベルをＦＡＣＳにより測定して、細胞活性化及び筋線維芽細胞への移行を評価した（図１０）。
【0182】
対照の非活性化細胞、即ち患者の血清に暴露されなかった細胞は、細胞内染色及びＦＡＣＳ分析により測定して、２．７％ ＳＭＡ陽性染色を示した。高いＣＣＬ２４レベル（ＥＬＩＳＡにより測定して３５２１ｐｇ／ｍｌ）を有するＮＡＦＬＤ患者から得た血清で活性化した肝星細胞培養物では、３４％の細胞がＳＭＡ陽性細胞であった。血清がヒト化抗ＣＣＬ２４抗体ＨＣＭ１０１（１０μｇ／ｍｌ）により３７℃で１時間予備処理された場合、１５％のみのＳＭＡ陽性細胞が培養物中に存在した。興味深いことに、２３％のみのＳＭＡ陽性細胞が、低いＣＣＬ２４レベル（１９３ｐｇ／ｍｌ）を有するＮＡＦＬＤ患者から得た血清で活性化した肝星細胞に存在した。血清がヒト化抗ＣＣＬ２４抗体ＨＣＭ１０１（１０μｇ／ｍｌ）で予備処理された場合、１９％のみのＳＭＡ陽性細胞が培養物中に存在した。
【0183】
この結果は、αＳＭＡの高い発現が、高いレベルのＣＣＬ２４を含むＮＡＦＬＤ血清で処理したＨＳＣにおいて、より低いレベルのケモカインを含む血清よりも強いことを示す。
【0184】
更に、ヒト化抗ＣＣＬ２４抗体ＨＣＭ１０１は、高いＣＣＬ２４レベルを含む血清に暴露することにより活性化された培養物において、αＳＭＡの発現を５０％低下させた。理論に束縛されるものではないが、抗ＣＣＬ２４抗体は、ＣＣＬ２４仲介による筋線維芽細胞への肝星細胞（ＨＳＣ）の移行を減弱させると思われる。
【0185】
実施例９：ＨＣＭ１０１の親和性及び結合特異性
Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲベースの技術を用いて、ＣＨＯ細胞により産生されたＨＣＭ１０１の、他の非ＣＣＬ２４ケモカインに対する結合親和性を検討した。Ｂｉａｃｏｒｅによってエオタキシン１（ＣＣＬ１１）及びＭＣＰ３（ＣＣＬ７）に対する抗体の相当の結合が示され（各々、図１０Ａ及び１０Ｂ）、各々、３０ｎＭ及び１３０ｎＭの親和定数が明らかとなった。
Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲベースの技術を用いて、ＣＨＯ細胞により産生されたＨＣＭ１０１の、他の非ＣＣＬ２４ケモカインに対する結合親和性を検討した。Ｂｉａｃｏｒｅによってエオタキシン１（ＣＣＬ１１）及びＭＣＰ３（ＣＣＬ７）に対する抗体の相当の結合が示され（各々、図１０Ａ及び１０Ｂ）、各々、３０ｎＭ及び１３０ｎＭの親和定数が明らかとなった。
【0186】
実施例１０：ＨＣＭ１０１は、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５ケモカイン受容体活性化の両方を阻害する。
ＨＣＭ１０１はＣＣＬ１１及びＣＣＬ７にも結合できることを確立した後、おそらく他のケモカイン受容体に結合することによるＣＣＬ２４の活性化の潜在力を評価することによって、その有効性及び効力を更に評価した。これを目的として、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸケモカイン活性化システムを使用した。このシステムは、受容体活性化により誘導される発光シグナルを生成する、操作された細胞を使用する。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ細胞の２つの異なる活性化システム、操作されたβ－アレスチンの動員によりＣＣＲ３が活性化された際にシグナルを生成するＣＣＲ３ β－アレスチンアッセイ、及び受容体活性化の開始時に低下するｃＡＭＰの細胞内濃度に比例してシグナルを与えるＣＣＲ５ ｃＡＭＰアッセイを使用した。
ＨＣＭ１０１はＣＣＬ１１及びＣＣＬ７にも結合できることを確立した後、おそらく他のケモカイン受容体に結合することによるＣＣＬ２４の活性化の潜在力を評価することによって、その有効性及び効力を更に評価した。これを目的として、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸケモカイン活性化システムを使用した。このシステムは、受容体活性化により誘導される発光シグナルを生成する、操作された細胞を使用する。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ細胞の２つの異なる活性化システム、操作されたβ－アレスチンの動員によりＣＣＲ３が活性化された際にシグナルを生成するＣＣＲ３ β－アレスチンアッセイ、及び受容体活性化の開始時に低下するｃＡＭＰの細胞内濃度に比例してシグナルを与えるＣＣＲ５ ｃＡＭＰアッセイを使用した。
【0187】
ＣＣＬ２４は、ＣＣＲ３ β－アレスチンシステムにおいて用量依存性応答を誘導し、７～２０００ｎＭの範囲のリガンド（ＣＣＬ２４）濃度により、受容体の明白な活性化が存在した（図１２Ａ）。ＨＣＭ１０１を異なる濃度で加えると、ＣＣＬ２４によるＣＣＲ３活性化の有意な用量依存的阻害がもたらされ（図１２Ｂ）、活性が７０％まで低下した。
【0188】
ＣＣＬ２４が更なるケモカイン受容体を介して細胞を活性化する能力を評価するために、第２のＤｉｓｃｏｖｅｒＸシステムを使用してＣＣＲ５ケモカイン受容体の活性化を示した。対照として、ｍｉｐ－１α、既知の及び確立されたＣＣＲ５リガンドを、その受容体活性化を誘導する能力に関して試験し、これはｃＡＭＰの細胞内レベルの低下により表された。実際に、ｃＡＭＰの用量依存性低下が異なる濃度のｍｉｐ－１αにて観察された（データは示さず）。これらのＣＣＲ５－ｃＡＭＰ細胞をＣＣＬ２４で処理すると、０．１５～５μＭの範囲の濃度のｃＡＭＰレベルの低下から明らかな、受容体の用量依存的活性化がもたらされた（図１２Ｃ）。ＨＣＭ１０１補給はこの効果に対抗し、異なる（７～６０μｇ／ｍｌ）抗体濃度でｃＡＭＰ細胞内レベルを増大させ、これはＣＣＲ５活性化の７０％阻害までの受容体活性化の低下を示している（図１２Ｄ）。ＣＣＲ５ ｃＡＭＰシステムを更に、ＣＣＬ１１に対するＨＣＭ１０１の効果の検討に使用した。４ｎＭ～５μＭの範囲の濃度のＣＣＬ１１の投与は、ＣＣＲ５の用量依存的活性化をもたらした。ＨＣＭ１０１の投与は、ＣＣＬ１１誘導ＣＣＲ５活性化を６０％まで減弱させた（図１２Ｅ及び１２Ｆ）。
【0189】
実施例１１：自己免疫性肝炎に対するＣＭ１０１の効果
自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）は、インターフェース肝炎、血漿肝臓酵素の上昇、自己抗体の存在、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）機能不全に関連した慢性炎症性肝臓病である。ラットのコンカナバリン（Ｃｏｎ）－Ａ誘導肝炎は、ＡＩＨの研究及び潜在的な治療学の評価のための動物モデルである。
自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）は、インターフェース肝炎、血漿肝臓酵素の上昇、自己抗体の存在、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）機能不全に関連した慢性炎症性肝臓病である。ラットのコンカナバリン（Ｃｏｎ）－Ａ誘導肝炎は、ＡＩＨの研究及び潜在的な治療学の評価のための動物モデルである。
【0190】
ラットモデルにおける急性肝炎の誘導のために、３００μｌ ＰＢＳに溶解したコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を用量５ｍｇ／ｋｇで、尾静脈を介して各ラットに投与する。対照ラットは３００μｌのＰＢＳのみを受容する。動物は０日目にＨＣＭ１０１ ２．５ｍｇ／ｋｇ又は対照ＩｇＧを皮下にて受容する。動物をＣｏｎ Ａ投与から４８時間後に犠牲にする。ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＣＣＬ２４レベルを評価する。肝臓白血球浸潤、肝臓壊死及び肝臓線維症の病理組織学分析も評価する。
【0191】
慢性肝炎の誘導のために、１０ｍｇ／ｋｇ Ｃｏｎ Ａを週に１回、１２週間ＩＶ投与する。２．５ｍｇ／ｋｇ ＣＭ１０１又はＩｇＧを２週～１２週に皮下投与する。対照グループは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の代わりにＰＢＳを受容する。肝臓酵素（例えばＡＳＴ、ＡＬＴ）、壊死及び炎症線維症及びα－ＳＭＡに関する肝臓の組織学的分析を評価する。
【図1A-1G】
【図1H-1N】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A-3C】
【図3D-3J】
【図4A-4D】
【図4E-4N】
【図5A-5K】
【図5L-5N】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J-6T】
【図6U-6W】
【図7A-7D】
【図7E-7I】
【図8A-8D】
【図8E-8N】
【図9A-9F】
【図9G】
【図10A-10E】
【図11A-11B】
【図12A-12B】
【図12C-12F】
【配列表】