特許 7173732 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージＪＬ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-08

(45)【発行日】2022-11-16

(54)【発明の名称】遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージＪＬ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/44 20060101AFI20221109BHJP

   C12N 15/30 20060101ALI20221109BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221109BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20221109BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20221109BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20221109BHJP

【ＦＩ】

C07K14/44

C12N15/30 ZNA

C12P21/02 C

G01N33/53 N

G01N33/543 541Z

G01N33/569 A

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2017523290

(86)(22)【出願日】2015-11-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2017-11-16

(86)【国際出願番号】 EP2015075692

(87)【国際公開番号】W WO2016071393

(87)【国際公開日】2016-05-12

【審査請求日】2018-05-17

【審判番号】

【審判請求日】2021-03-16

(31)【優先権主張番号】14192004.1

(32)【優先日】2014-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】15161274.4

(32)【優先日】2015-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】ウプマイヤー，バーバラ

(72)【発明者】

【氏名】ツァルント，トラルフ

(72)【発明者】

【氏名】レスラー，ディーター

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】伊藤 良子

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】特表２００２－５０８５０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，Ｖｏｌ．２５７，ｐｐ．５１－５４

【文献】Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，２０１１，Ｖｏｌ．１２７，ｐｐ．６７２－６７９

【文献】Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００９，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．６，ｐｐ．８９９－９０５

【文献】Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００３，Ｖｏｌ．４３，ｐｐ．９１－９７

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N 15/00-15/90

ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）に対する抗体の検出に好適なポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＪＬ７特異的アミノ酸配列を含み、前記トリパノソーマ・クルージＪＬ７特異的アミノ酸配列が、配列番号４で表される配列からなるものであり、さらなるトリパノソーマ・クルージ特異的アミノ酸配列が、前記ポリペプチド中に存在しない、前記ポリペプチド。

【請求項2】

単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージ抗原に対する抗体の検出に好適なポリペプチドの組成物であって、請求項１に記載のポリペプチドと、１Ｆ８、クルジパイン、ＫＭＰ－１１、およびＰＡＲ－２からなる群より選択される少なくとも１つのトリパノソーマ・クルージポリペプチドとを含む、前記組成物。

【請求項3】

可溶性で免疫反応性のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする作動可能に連結された遺伝子組み換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターによってトランスフォームされたホスト細胞を培養するステップと、
ｂ）前記トリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドの発現ステップと、
ｃ）前記トリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドの精製ステップと
を含む、前記方法。

【請求項4】

単離された試料においてトリパノソーマ・クルージに対して特異的な抗体を検出する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載の組成物が、前記トリパノソーマ・クルージ抗体に対する捕捉試薬および／または結合パートナーとして使用される、前記方法。

【請求項5】

単離された試料においてトリパノソーマ・クルージ抗原に特異的な抗体を検出する方法であって、
ａ）体液試料を、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載の組成物と混和することによって、免疫反応混和物を形成すること、
ｂ）ポリペプチド試料の組成物に対する体液試料中に存在する抗体を、トリパノソーマ・クルージポリペプチドの前記組成物と免疫反応させて免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混和物を維持すること、および、
ｃ）いかなる免疫反応生成物についてもその存在および／または濃度を検出すること、
を含む、前記方法。

【請求項6】

請求項５に記載の単離された試料においてトリパノソーマ・クルージ抗原に特異的な抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
ａ）前記試料に、固相に直接的または間接的に結合することができ、かつバイオアフィン結合対の一部であるエフェクター基を有する第１の請求項１に記載のポリペプチドと、検出可能な標識を有する第２の請求項１に記載のポリペプチドとを加えるステップであって、第１および第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドが、前記抗トリパノソーマ・クルージ抗体に特異的に結合させること、
ｂ）第１のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチド、試料抗体、および第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドを含む免疫反応混和物を形成すること、ここで前記バイオアフィン結合対に対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混和物を形成する前、形成中、または形成後に加えられる、
ｃ）体液試料中の第１および第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドに対するトリパノソーマ・クルージ抗体を第１および第２のトリパノソーマ・クルージポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混和物を維持すること、
ｄ）固相から液相を分離すること、および、
ｅ）固相もしくは液相またはその両方において、いかなる免疫反応生成物についてもその存在を検出すること、
を含む、二重抗原サンドイッチ形式において実施される、前記方法。

【請求項7】

前記第１のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドがビオチン部分を有し、および前記第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドが、電気化学ルミネセンス性のルテニウム錯体によって標識されている、請求項６に記載のトリパノソーマ・クルージ抗原に特異的な抗体を検出する方法。

【請求項8】

抗トリパノソーマ・クルージ抗体の検出のためのインビトロ診断試験における、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載の組成物の使用。

【請求項9】

請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載の組成物を含む、抗トリパノソーマ・クルージ抗体の検出のための試薬キット。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）は、シャーガス病と呼ばれる熱帯性の寄生虫病を引き起こす鞭毛原生動物である。シャーガス病の過程において、感染患者は、典型的には、急性期と、その後に、軽症から生命に危険を及ぼすまでの幅広い範囲で変わる症状を有する慢性期を経る。患者は、初期段階においてのみ、抗寄生虫治療の効果がある。患者によっては、死に至る心臓または腸の合併症を発症する。

【0002】

Ｔ．クルージは、一般的に、媒介昆虫であるオオサシガメ亜科の吸血性「オオサシガメ」（サシガメ科；ドイツ語では「Ｒａｕｂｗａｎｚｅｎ」）によってヒトおよび他の哺乳動物に感染する。当該疾患は、輸血および臓器移植、寄生生物で汚染された食べ物の摂取によって、ならびに母体から胎児へと広がり得る。シャーガス病のさらなる拡大を防ぐために、特に、メキシコ、中南米、および合衆国南部のような主な感染地域では、寄生虫の存在およびＴ．クルージに対する抗体について、献血および血液をベースとする医療製品を検査することは重要である。

【0003】

現在では、例えば、間接免疫蛍光法、間接赤血球凝集反応、補体結合、免疫ブロット法、およびＥＬＩＳＡによるＴ．クルージに対する抗体の検出など、いくつかの血清学的診断法が、Ｔ．クルージの感染を検出するために利用可能である。分子生物学による方法（例えば、ＰＣＲ）および入念な外因診断法も適用される。媒介生物による感染の外因診断では、研究室で育てられた無菌の昆虫（ここでは、オオサシガメ）に患者を吸血させる。当該昆虫の腸の内容物が、病原菌（ここでは、トリパノソーマ・クルージ）の存在について調べられる。

【0004】

これらの方法のそれぞれは、感度および特異度に関して、それ自体の短所および長所を示し、したがって、今のところ、利用可能なゴールドスタンダードとなる方法は存在しない。

【0005】

抗体の検出のためのシャーガス病アッセイの開発の当初、天然の抗原溶解物が適用されていたが、それは依然として用いられている。しかしながら、溶解物を使用する場合、この抗原組成物中に対応物が含まれるのはＴ．クルージの３つの発症段階のうちの１つについてのみであり、したがって、他の２つの段階の感染を見逃してしまう可能性がある程度ある。より現代的なアッセイは、遺伝子組み換え抗原の混合物を適用し、Ｔ．クルージ感染の全ての段階を示す。

【0006】

トリパノソーマ・クルージ抗原に対する抗体を検出するための血清学的アッセイは、従来技術の文献において広く説明されてきている。例えば、Ｓｉｌｖｅｉｒａら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ２００１，Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．６，ｐ．２８６－２９１）は、いくつかの研究所によって単離された、血清学的診断に関連するＴ．クルージ遺伝子組み換え抗原について記載している。これらの遺伝子のいくつかは、反復アミノ酸配列モチーフを示すタンパク質を結果として生じる縦列反復配列を有する。

【0007】

Ｔ．クルージに対する抗体の検出のために血清学的アッセイにおいて広く使用される抗原のうちの１つは、ＪＬ７（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのエントリ：Ｑ４ＣＳ８７）であり、同義語ＦＲＡ、Ａｇ１、およびＨ４９によっても記載されている（レビューについては、例えば、Ｃｏｔｒｉｍら １９９５，Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ７１，８９－９８およびＵｍｅｚａｗａら １９９９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５５４－１５６０を参照のこと）。Ｓｉｌｖｅｉｒａら（上記）も、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用するための様々な追加のＴ．クルージ抗原のいくつかの混合物において、ＦＲＡ（ＪＬ７）について記載している。しかし、特異的ＪＬ７関連ポリペプチドについては開示されていない。

【0008】

Ｖａｌｉｅｎｔｅ－Ｇａｂｉｏｕｄら（Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０１１，１２７，ｐ．６７２－６７９）は、Ｔ．クルージＦＲＡ（ＪＬ７）タンパク質の免疫原性および抗原性に対する反復の効果について論じている。ヒト感染血清から満足のいくＥＬＩＳＡ信号を得るために、４つの反復性の反復配列を使用することが推奨されている。しかし、アッセイの特異度の問題は、取り扱われておらず、特異的ＪＬ７ポリペプチドは開示されていない。

【0009】

上記において言及したＪＬ７配列に基づく全ての抗原変異型は、菌株とＴ．クルージの分離株との間において高度に保存される６８のアミノ酸の反復配列を有する。ＪＬ７は、６８のアミノ酸による上記モチーフの約３．５の反復配列を含む、２２６のアミノ酸による推定上のカルパインシステインペプチダーゼである（図１を参照のこと）。しかしながら、いくつかの同一のまたは非常に類似する反復配列を有する抗原は、しばしば、抗Ｔ．クルージ抗体の存在について分析される試料中に存在するＩｇＭまたはＩｇＧ分子あるいはリュウマチ性因子の非特異的結合によって引き起こされる干渉を受ける傾向にある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、干渉感度に関する欠点を克服する、遺伝子組み換えＪＬ７抗原組成物およびトリパノソーマ・クルージによる感染を検出するための診断方法を提供することにおいて課題を認めることができる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

この課題は、特許請求の範囲において指定される本発明によって解決される。特許請求される抗原および組成物ならびに診断方法は、高い特異度および感度ならびに信頼性高い再現性を有する免疫診断的解決策を提供する。

【0012】

本発明は、単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージＪＬ７抗原に対する抗体の検出に好適なＪＬ７抗原の変異型に関する。これらの抗原は、ＪＬ７特異的アミノ酸配列を含み、当該ＪＬ７特異的配列は配列番号２の２つのコピーからなり、当該２つのコピーのそれぞれは、配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有し、さらなるトリパノソーマ・クルージ特異的アミノ酸配列が当該ポリペプチド中に存在しない。本発明はさらに、トリパノソーマ・クルージに対する抗体の検出にとって有用なポリペプチドの組成物であって、Ｔ．クルージポリペプチド１Ｆ８、クルジパイン、ＫＭＰ－１１、およびＰＡＲ－２のうちの少なくとも１つと共に、上記において特徴付けられたＪＬ７抗原を含む組成物に関する。さらに、本発明は、ＪＬ７抗原を製造する方法、ならびに当該ＪＬ７ポリペプチドを使用したＴ．クルージ抗体を検出するための診断方法に関する。それに加えて、本発明は、当該ＪＬ７ポリペプチドまたはトリパノソーマ・クルージポリペプチドの組成物を含む試薬キットに関する。
開示されるアミノ酸配列の説明
配列番号１は、ＦＲＡ、Ａｇ１、Ｈ４９としても知られる、Ｔ．クルージタンパク質の部分配列ＪＬ７（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ：Ｑ４ＣＳ８７）を示している（完全記述名：カルパインシステインペプチダーゼ（推定上））。配列番号１は、上記のＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリのアミノ酸位置６２～２８７を示しており、結果として２２６のアミノ酸長さを有するポリペプチドを示す。当該全長タンパク質は、１～１２７５のアミノ酸を含む。

【0013】

【化1】

【0014】

配列番号２は、抗原ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１を示しており、配列番号１のアミノ酸位置１～６８としても示される。

【0015】

【化2】

【0016】

配列番号３は、抗原ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２を示しており、配列番号１のアミノ酸位置６９～１３６としても示される。

【0017】

【化3】

【0018】

配列番号４は、配列番号２および３の組み合わせに対応する抗原ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２を示しており、配列番号１のアミノ酸位置１～１３６としても示される。

【0019】

【化4】

【0020】

配列番号５は、配列番号１のアミノ酸位置１３７～２２６に対応する抗原ＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４を示している。

【0021】

【化5】

【0022】

配列番号６は、配列番号１のアミノ酸位置１３７～２０４に対応する抗原ＪＬ７ｓｈｏｒｔ３を示している。

【0023】

【化6】

【0024】

配列番号７は、本発明によるポリペプチドのＮ末端に、または好ましくはＣ末端に追加することができるヘキサ－ヒスチジンタグを示している。当該タグは、タンパク質の精製を容易にするために使用される。

【0025】

【化7】

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】完全ＪＬ７アミノ酸配列における反復配列の構造。上側：４つ全ての反復配列が、アミノ酸相同性（太字）および差違（通常の下線文字）を示すように揃えられている。下側：ＪＬ７変異型およびそれらの反復配列ドメインの相対位置の概略図。ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２は、本発明によるＪＬ７抗原を表している。

【図2】ＪＬ７、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２、およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４の遠紫外線ＣＤスペクトルを示す図である。当該スペクトルは、２０℃において、サーモスタット式セルホルダーにおいてＪａｓｃｏ－７２０分光偏光計により記録した。タンパク質濃度は、０．１ｃｍのキュベットにおいて０．２ｍｇ／ｍｌであった。緩衝液は、ｐＨ７．５の１０ｍＭのリン酸カリウムであった。帯域幅は、１ｎｍであり、解像度は、１ｎｍであり、走査速度は、２秒の応答において５０ｎｍ／分であった。スペクトルは、８回記録し、信号対雑音比を向上させるために平均を取った。当該信号は、モル楕円率（ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌで与えられる）に変換した。ＪＬ７およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２のスペクトルは、高含有量のα－螺旋構造要素（２０８ｎｍおよび２２２ｎｍの信号帯域）を有するタンパク質を指している。ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２、およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４のスペクトルは、高度な不規則構造を有するタンパク質を表している（２００ｎｍ付近の信号帯域）。

【発明を実施するための形態】

【0027】

Ｔ．クルージＪＬ７抗原およびそのアミノ酸配列の特性は、現状技術水準において広く記載されている。しかしながら、複数の反復配列を有する抗原によって引き起こされるＴ．クルージ診断アッセイが、より干渉を受けやすい問題は、十分には対処されていない。例えば、分析される試料中に存在するリュウマチ性因子を伴う非特異的ＩｇＭ分子または非特異的ＩｇＧは、陽性試験結果を生じ、本当は当該試料は陰性として検出されるべきであるのに、あたかも抗Ｔ．クルージ抗体が試料中に存在するかのような振る舞う場合、干渉に対する当該高い脆弱性は、誤った陽性結果を生じ得る。誤った陽性結果は、アッセイの特異度における望ましくない減少を生じる。しかしながら、規制当局は、感染病パラメータに対する診断方法において、高度な特異度を要求する。

【0028】

驚くべきことに、本発明者らは、依然として試料の抗体によって結合されるのに十分な抗原特性を有しつつも、誤った陽性結果を生じない、ＪＬ７変異型を特定した。当該完全なＪＬ７ポリペプチドは、６８のアミノ酸のモチーフの約３．５の反復配列を有する。疑問は、１つの反復配列で、好適な診断用希少試薬を提供するのに十分であるか否かであった。反復配列１および２（それぞれ、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１（配列番号２）およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ２（配列番号３）として指定される）が、別々の抗原として発現した場合、短くされた変異型のいずれも、陽性試料の全てを正しく検出することができなかった（表２）。同じことが、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４（配列番号５に示される）と呼ばれる、約１．５の反復配列からなる短くされた変異型に対しても当てはまった。しかしながら、例えば配列番号４など、当該６８のアミノ酸モチーフの２つの反復配列が、一緒に隣接して存在する場合、３．５の反復配列を有する完全なＪＬ７ポリペプチドを使用して初めは陽性と診断された試料は、結局、実際には誤った陽性試料であることが判明した。その一方で、配列番号２に示される６８のアミノ酸反復配列を２つ有するＪＬ７ポリペプチドは、真の陽性試料を陽性として、すなわち、Ｔ．クルージに対する抗体を含むとして、信頼性高く正しく検出することができた。

【0029】

したがって、本発明は、ＪＬ７特異的アミノ酸配列を含む、単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージＪＬ７抗原に対する抗体の検出に好適なポリペプチドであって、当該ＪＬ７特異的配列が、配列番号２の２つのコピーからなり、当該２つのコピーのそれぞれが、配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有し、さらなるトリパノソーマ・クルージ特異的アミノ酸配列が当該ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチドに関する。本発明により、配列番号２の当該２つのコピーは、さらなるアミノ酸が当該２つのコピーの間に存在しないように、お互いに直接隣接していてもよい。代替手段として、それらは、ＪＬ７特異的配列には存在しないリンカー配列によって隔てられていてもよい。

【0030】

配列番号２のこれら２つのコピーは、完全に同一である必要はないが、両方の配列は、配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を示さなければならない。例えば、配列番号４（ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２）は、配列番号２（ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１）および配列番号３（ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２）を含む。配列番号２は、単純に、配列番号２に対して１００％のアミノ酸相同性を示し、配列番号３は、６８のアミノ酸のうち６６のアミノ酸が配列番号２と同一であり、結果として、９７％のアミノ酸相同性である。別の例として、図１に示される反復配列３（配列番号６）は、配列番号２と比べて６のアミノ酸位置において異なり、結果として、９１％のアミノ酸相同性である（６２／６８）。したがって、本発明により、ＪＬ７ポリペプチドは、ＪＬ７特異的部分が、配列番号２および３、あるいは配列番号２および６、あるいは配列番号３および６からなる、アミノ酸配列を含む。好ましい様式において、当該ＪＬ７特異的部分は、配列番号２および３の組み合わせである配列番号４からなる。

【0031】

明瞭にするなら、６２、６３、６４、６５、６６、または６７のアミノ酸より短い長さのＪＬ７特異的アミノ酸配列も（この場合、当該短くされたＪＬ７断片の残りのアミノ酸残基は全て、配列番号２と同一である）、配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性という要件を満たす（例えば、６２／６８＝９１％）。別の実施形態において、配列番号２に対するアミノ酸相同性の要件は、少なくとも９５％である。好ましくは、当該短くされたＪＬ７断片の欠失は、Ｎ－およびＣ末端アミノ酸残基に関してであり、ＪＬ７配列番号２配列のコア部分は、完全なままである。

【0032】

ＪＬ７特異的アミノ酸配列は別として、さらなるトリパノソーマ・クルージ特異的アミノ酸配列が本発明によるポリペプチド中に存在しないことは、重要である。明瞭にするなら、明確に説明されるものの域を超えるさらなるＪＬ７特異的アミノ酸配列は、当該ポリペプチドに存在しない。したがって、配列番号１において開示される全長ＪＬ７は、本発明に包含されない。本発明を明瞭にするなら、例えば、配列番号２に示される配列モチーフの２つの反復配列を既に有する例えば配列番号４などのいくつかの分子も、同じポリペプチド鎖上に存在し得ない。

【0033】

本発明により、ＪＬ７特異的配列が配列番号２の２つのコピーからなり、それぞれが、配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するという前提条件が満たされる限り、そのようなＪＬ７抗原の変異型も想到される。ある実施形態において、当該アミノ酸相同性は、配列番号２に対して少なくとも９５％である。変異型は、インビトロ診断イムノアッセイにおける免疫反応性が維持される限り、そのようなものとして分類され、すなわち、当該変異型は、依然として、試料中に存在する抗Ｔ．クルージ抗体に結合することができ、それらを検出することができる。変異型は、例えば、ポリペプチドまたは抗原への、リンカーアミノ酸配列、標識、タグ、アミノ酸配列、または担体部分の共有結合によって修飾されたＪＬ７ポリペプチドでもある。用語「変異型」は、翻訳後に修飾されたタンパク質、例えば、グリコシル化またはホスホリル化されたタンパク質など、あるいは、クローニング、発現、精製、およびフォールディングを容易にする融合タンパク質にも関する。

【0034】

ＪＬ７変異型、ＪＬ７抗原、ＪＬ７ポリペプチド、またはＪＬ７抗原性ポリペプチドもしくはタンパク質なる用語は、本明細書において同じ意味において使用される。トリパノソーマ・クルージ（＝Ｔ．クルージ）特異的抗原またはＴ．クルージポリペプチドなる用語も同義語として理解され、それぞれが、ＵｎｉＰｒｏｔなどの国際タンパク質配列データベースによってアクセス可能な任意の天然に存在するＴ．クルージ菌株に見出すことができるポリペプチド配列を意味し、またアミノ酸配列を意味する。

【0035】

通常、Ｔ．クルージ感染の全ての段階を検出するために、いくつかの異なるＴ．クルージ抗原が、Ｔ．クルージ抗体を検出するためのアッセイにおいて適用される。したがって、本発明のさらなる態様は、単離された生体試料におけるトリパノソーマ・クルージ抗原に対する抗体の検出に好適なポリペプチドの組成物であって、上記において指定されるようなＪＬ７ポリペプチドと、１Ｆ８、クルジパイン、ＫＭＰ－１１、およびＰＡＲ－２からなる群より選択される少なくとも１つのトリパノソーマ・クルージポリペプチドとを含む組成物である。これらの追加の抗原に由来するアミノ酸配列は、当技術分野において既知であり、ＵｎｉＰｒｏｔなどの公的に利用可能なデータベースから取得可能である；例えば、１Ｆ８（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ：Ｑ４Ｄ１Ｑ２）（ＦＣａＢＰ、ＴＣ２４、またはＴＣ２８としても知られる）；クルジパイン（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ：Ｑ９ＴＷ５１）（クルザイン、ｇｐ５１／５７、Ａｇ １６３Ｂ６としても知られる）；ＫＭＰ－１１（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ：Ｑ９Ｕ６Ｚ１）；ＰＡＲ２（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ：Ｑ０１５３０）（ＰＦＲ２としても知られる）など。

【0036】

組成物なる用語は、単離された別々のＴ．クルージポリペプチドが混和物へと混合されることを意味する。この用語は、全てのポリペプチドが多重抗原融合ポリペプチドとしての１つだけのポリペプチド鎖上に位置するように、アミノ酸からなる単一鎖上において遺伝子組み換え的に発現させたかまたは合成したポリペプチドを含まない。換言すれば、天然において単一のペプチド鎖上には現れないいくつかのエピトープの多重エピトープ融合抗原は除かれる。むしろ、追加のＴ．クルージポリペプチドの１Ｆ８、クルジパイン、ＫＭＰ－１１、およびＰＡＲ２のそれぞれは、別々のポリペプチド鎖上に発現するか、別々のポリペプチド鎖として化学的に合成される。当該組成物は、個々のＴ．クルージポリペプチドを１つの容器または管において混合することによって作製され、結果として組成物を生じる。

【0037】

当該組成物は、液体であり得、すなわち、当該Ｔ．クルージポリペプチドは、水可溶形態または緩衝液可溶形態において混合物に加えられる。好適な緩衝液の原料成分は、当業者に既知である。当該組成物は、固体であってもよく、すなわち、Ｔ．クルージ抗原を凍結乾燥状態またはそれ以外の乾燥状態において含む。

【0038】

さらに、本発明は、上記においてより詳しく説明される、可溶性で免疫反応性のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）トリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドをコードする作動可能に連結された遺伝子組み換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターによってトランスフォームされたホスト細胞を培養するステップ、
ｂ）トリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドの発現ステップ、および
ｃ）トリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドの精製ステップ
を含む方法にも関する。

【0039】

本発明の別の態様は、単離された試料においてトリパノソーマ・クルージに対して特異的な抗体を検出する方法であって、上記において開示されるトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチド、または上記において定義される方法によって得られるトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチド、またはまさにその説明されたトリパノソーマ・クルージポリペプチドの組成物が、当該トリパノソーマ・クルージ抗体に対する捕捉試薬および／または結合パートナーとして使用される、方法である。

【0040】

さらなる別の実施形態は、単離された試料においてトリパノソーマ・クルージに対して特異的な抗体を検出する方法であって、
ａ）体液試料を、本発明によるトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチド、または既に説明した組成物、または本明細書の先行の段落において説明した方法によって得られるトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドと混和することによって免疫反応混和物を形成するステップ、
ｂ）ポリペプチド試料の上記組成物に対する、当該体液試料中に存在する抗体を、トリパノソーマ・クルージポリペプチドの当該組成物と免疫反応させて、免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、当該免疫反応混和物を維持するステップ、および
ｃ）いかなる免疫反応生成物についてもその存在および／または濃度を検出するステップ
を含む方法である。

【0041】

さらなる態様において、本発明によるイムノアッセイ方法は、シャーガス病診断に対して最も関連するサブクラスとしてＩｇＧおよびＩｇＭを含む、全ての可溶性の免疫グロブリンのサブクラスのＴ．クルージ抗体の検出に好適である。

【0042】

本発明はさらに、いわゆる二重抗原サンドイッチ形式ＤＡＧＳにおいて、単離された試料においてトリパノソーマ・クルージに対して特異的な抗体を検出する方法に関する。単離された試料においてトリパノソーマ・クルージに対して特異的な抗体を検出するための上記方法は、好ましくは二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）形式において実施される。そのようなアッセイでは、少なくとも２種の異なる所定の抗原の分子をその２つ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）または１０（ＩｇＭ）の抗原結合部位に結合させる抗体の能力が必要とされ、ならびにその能力を利用する。上記ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて、「固相抗原」および「検出抗原」の基本構造は、本質的に同じであり、そのため、当該試料の抗体は、２つの特異的抗原の間に橋かけを形成する。したがって、１つの抗体が両方の抗原に結合することができるように、両方の抗原は、同一であるかまたは免疫学的に交差反応性であるかのどちらかでなければならない。そのようなアッセイを実施するための必須要件は、関連するエピトープ（複数可）が両方の抗原に存在することである。２種の抗原の一方は、固相に結合し得、他方は検出可能な標識を有する。

【0043】

この方法は、
ａ）単離された試料に、固相に直接的または間接的に結合することができ、かつバイオアフィン結合対の一部であるエフェクター基を有する第１のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドと、検出可能な標識を有する第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドとを加えるステップであって、第１および第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドが、上記抗トリパノソーマ・クルージ抗体に特異的に結合する、ステップ、
ｂ）第１のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチド、試料抗体、および第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドを含む免疫反応混和物を形成するステップであって、上記バイオアフィン結合対における対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混和物を形成する前、形成中、または形成後に加えられる、ステップ、
ｃ）体液試料中の第１および第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドに対するトリパノソーマ・クルージ抗体を、第１および第２のトリパノソーマ・クルージポリペプチドと免疫反応させて、免疫反応生成物を形成させるのに十分な期間、免疫反応混和物を維持するステップ、
ｄ）固相から液相を分離するステップ、
ｅ）固相もしくは液相またはその両方において、いかなる免疫反応生成物についてもその存在を検出するステップ
を含む。

【0044】

当該説明したサンドイッチ法の好ましい様式において、第１のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドは、ビオチン部分を有しており、第２のトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドは、その信号を検出することができる電気化学ルミネセンス性ルテニウム錯体で標識される。

【0045】

本発明はさらに、抗トリパノソーマ・クルージ抗体の検出のためのインビトロ診断試験における、全てが上記において本明細書において詳細に説明される、トリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチドの使用、またはＴ．クルージ特異的ポリペプチドの組成物の使用、または上記において定義される遺伝子組み換え製造方法によって得られるＪＬ７ポリペプチドの使用も網羅する。

【0046】

本発明の別の態様は、本発明によるトリパノソーマ・クルージＪＬ７ポリペプチド、または上記において詳細に説明される製造方法によって得られるＪＬ７ポリペプチド、またはＪＬ７ポリペプチドの組成物と、１Ｆ８、クルジパイン、ＫＭＰ－１１、およびＰＡＲ２から選択される少なくとも１つのさらなるＴ．クルージ抗原とを含む、抗トリパノソーマ・クルージ抗体の検出のための試薬キットである。

【0047】

当該キットは、抗トリパノソーマ・クルージ抗体の検出のためのインビトロ診断試験にとって有用であり、さらに、別々のバイアル瓶での対照および標準溶液、ならびに一般的な添加剤、緩衝液、塩、洗浄薬などを伴う１つまたは複数の溶液形態もしくは凍結形態での追加の試薬、ならびに当業者に既知の使用のための取扱説明書も含み得る。

【0048】

本発明はさらに、実施例のセクションによって説明される。

【実施例1】

【0049】

トリパノソーマ・クルージＪＬ７抗原変異型のクローニングおよび精製
免疫診断試験におけるその適用に好適な、Ｔ．クルージＪＬ７抗原の最小サイズを調査するために、１つまたは２つの反復ユニットからなるいくつかの変異型を作製した。

【0050】

表１に一覧される、Ｔ．クルージ抗原をコードする合成遺伝子は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（エーバースベルク、ドイツ）から購入した。Ｎｏｖａｇｅｎ（マディソン、ウィスコンシン、米国）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドに基づいて、以下のクローニングステップを実施した。当該ベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、それぞれのＴ．クルージ抗原を含むカセットを挿入した。結果として得られるプラスミドのインサートを配列決定し、所望のタンパク質をコードすることを見出した。結果として得られるタンパク質のアミノ酸配列が、本発明の配列プロトコルに示されている。全ての遺伝子組み換えＴ．クルージポリペプチド変異型は、Ｎｉ－ＮＴＡ－補助精製を容易にするために、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号７）を有した。配列番号を表１にまとめる。

【0051】

全てのＴ．クルージ抗原を以下のプロトコルに従って精製した。発現プラスミドを宿す大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を伴うＬＢ培地において１ＯＤ_６００まで培養し、３７℃の培養温度において、１ｍＭの最終濃度までイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって、サイトゾル過剰発現を誘発させた。誘発の４時間後、遠心分離（５０００×ｇで２０分間）によって細胞を収穫し、冷凍して、－２０℃で保存した。細胞溶解物に対しては、緩衝液５０ｍｌ中における２５ｍＭのｐＨ８．５のリン酸ナトリウム、６ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、１タブレットのＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）、および１タブレットのＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ－フリー（プロテアーゼ阻害剤カクテル）に凍結ペレットを再懸濁させ、結果として得られる懸濁液を高圧ホモジナイゼーションによって溶解させた。粗溶解物に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾールとなるようにこれらを補った。遠心分離後、当該上澄みを、緩衝液Ａ（５０ｍＭのｐＨ８．５のリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾール）で事前に平衡化させたＮｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリロトリアセテート）カラム上に適用した。溶離の前に、汚染タンパク質を除去するためにイミダゾール濃度を４０ｍＭまで上げた。次いで、２５０ｍＭの濃度のイミダゾールを適用することによって、タンパク質を溶離させた。最終的に、当該タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィにかけて、タンパク質含有分画をプールして濃縮した。

【0052】

【表1】

【実施例2】

【0053】

分光計測
円偏光二色性分光法（ＣＤ）は、タンパク質における二次構造を評価するための最適の方法である。アミド範囲（１９０～２５０ｎｍ）における楕円率は、タンパク質骨格における規則的な反復要素、すなわち、二次構造を反映する。

【0054】

近紫外ＣＤスペクトルは、サーモスタット式セルホルダーを備えるＪａｓｃｏ－７２０分光偏光計によって記録し、モル楕円率に変換した。緩衝液は、ｐＨ７．５の１０ｍＭのリン酸カリウムであった。経路長は０．１ｃｍであり、タンパク質濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌであった。帯域幅は１ｎｍであり、走査速度は、１ｎｍの解像度において５０ｎｍ／分であり、応答は２秒であった。信号対雑音比を向上させるために、スペクトルは、８回測定して平均した。

【0055】

図２は、ＪＬ７、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２、およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４の遠紫外線ＣＤスペクトルを示している。ＪＬ７およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２のスペクトルは、高含有量のα－螺旋構造要素（２０８ｎｍおよび２２２ｎｍの信号帯域）を有するタンパク質を指し示している。ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２、およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４のスペクトルは、高度な不規則構造を有するタンパク質を表している（２００ｎｍ付近の信号帯域）。

【0056】

したがって、よく構造化された変異型ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２がイムノアッセイにおいて最も良好な結果を示した（実施例４および表２）という調査結果は一貫している。本発明者らは、より短い変異型ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２、およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４は、試料の抗体によって結合されることができる、重要な認識可能なエピトープを維持する三次元構造を維持することができないと仮定する。ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２は、配列番号２のアミノ酸配列の２つの完全な反復配列を有しないより短い変異型ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１、ＪＬ７ｓｈｏｒｔ２、およびＪＬ７ｓｈｏｒｔ３＋４と比べてより良好なアクセス可能な方式において、試料の抗体に対する関連するエピトープを提示する。

【実施例3】

【0057】

Ｔ．クルージＪＬ７抗原変異型へのビオチンおよびルテニウム部分のカップリング
遺伝子組み換えタンパク質のリジンε－アミノ基を、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、それぞれ、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識によって修飾した。標識／タンパク質のモル比は、それぞれビオチンおよびルテニウム標識コンジュゲーションに対して、５：１および１５：１に調節した。反応緩衝液は、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡであった。当該反応を室温において３０分間実施し、緩衝されたＬ－リシンを１０ｍＭの最終濃度まで加えることによって当該反応を止めた。当該カップリング反応後、粗タンパク質コンジュゲートをゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＩ Ｌｏａｄ）を通すことによって未反応の遊離標識を除去した。

【実施例4】

【0058】

免疫診断試験における遺伝子組み換えＴ．クルージＪＬ７抗原変異型の干渉に対する免疫学的反応性および脆弱性の評価
異なるタンパク質の免疫学的反応性を、自動化されたｃｏｂａｓ（登録商標） ｅ６０１アナライザ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）において評価した。測定は、二重抗原サンドイッチ形式において実施した。それにより、ビオチン－コンジュゲート（すなわち、捕捉抗原）が、ストレプトアビジンをコーティングした磁性ビーズの表面に固定され、その一方で、当該検出抗原は、シグナリング部分として、錯体化されたルテニウムカチオンを有する。ｃｏｂａｓ（登録商標） ｅ６０１におけるシグナル検出は、電気化学ルミネセンスに基づいている。

【0059】

特異的免疫グロブリン分析物の存在下で、当該発色性ルテニウム錯体は、固相に橋かけ結合し、白金電極での励起後に６２０ｎｍにおいて発光する。シグナル出力は、光の任意単位による。測定は、いくつかの供給元から購入した、抗Ｔ．クルージ陽性および陰性のヒト血清およびヒト血漿試料において実施した。

【0060】

本発明による遺伝子組み換えＴ．クルージＪＬ７抗原変異型を、二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイ形式において対毎に評価した。例えば、ＪＬ７－ビオチンコンジュゲートを、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のポリドカノール、０．２％のウシアルブミン、０．０１％のＮ－メチルイソチアゾロン、０．１％のオキシ－ピリオンを含有するアッセイ緩衝液において、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの濃度において、ＪＬ７－ルテニウム錯体コンジュゲートと共に評価した。使用した試料体積は３０μｌであった。抗Ｔ．クルージ陰性ヒト血清を対照として使用した。抗Ｔ．クルージ陽性ヒト血清を使用して各変異型の抗原性を評価した。

【0061】

【表2】

【0062】

表２に、表１に一覧される全てのＴ．クルージＪＬ７抗原変異型（ＪＬ７ｓｈｏｒｔ３を除く）の免疫学的活性を示す。
表２の全ての試料を、製造元の取扱説明書に従って、いくつかのＴ．クルージ抗原を使用するがＪＬ７は使用しない市販のシャーガス病アッセイ（Ｂｉｏｋｉｔ Ｓ．Ａ．のｂｉｏｅｌｉｓａ Ｃｈａｇａｓ）によって試験した。

【0063】

バイエルン赤十字からの血液ドナー（ｎ＝９９８）を含む特異度研究では、バイエルン（ドイツ）は、シャーガス病の風土病地域ではなく、承認されたｂｉｏｅｌｉｓａ Ｃｈａｇａｓ（Ｂｉｏｋｉｔ Ｓ．Ａ．）も非反応性であったという事実から、抗Ｔ．クルージ抗体に対して４つの試料が誤った反応性であると予想されることが明らかとなった。

【0064】

試料が反応性であるかまたは非反応性であるかを決定するために、平均バックグラウンド信号を特定し（陰性試料の平均）、当該平均バックグラウンド信号の４．５倍（平均×４．５）としてカットオフ値を算出した。

【0065】

試料が反応性であるかまたは非反応性であるかを特定するための閾値としての当該カットオフ値は、個別に、アッセイ条件に応じて選択される。そのような手順は、当業者に既知である。それに加えて、絶対信号カウントは、当該信号カウントを所定のカットオフ値で割ることによって正規化することができる（データは示されず）。したがって、陽性、すなわち反応性試料は、１を超える（＞１）正規化された値として現れ、非反応性試料による結果は、０と１の間の値を有するであろう。

【0066】

再び表２を参照すると、Ｔ．クルージＪＬ７抗原変異型の反応性が、完全反復ユニットの数に強く依存していることは明らかである。そのため、当該孤立した繰り返しユニット１または２、ならびに短くされたユニット４と融合された繰り返しユニット３は、著しく減少した抗原性を示した。干渉に対するその脆弱性も、直ちに著しく減少すると思われる。これとは対照的に、変異型ＪＬ７ｓｈｏｒｔ１＋２の場合のように２つの完全な繰り返しユニットの融合は、完全なＪＬ７分子の場合と同様に全体の抗原性を維持し、同時に陰性および陽性試料を正しく識別する。４つの干渉試料のうちの２つは、測定された信号において著しい減少を示した。ＪＬ７特異的部分が配列番号２の２つの反復配列のみからなるＪＬ７変異型（ならびに配列番号２に対して、少なくとも９０％、ある実施形態では少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有する変異型）の使用は、抗Ｔ．クルージイムノアッセイの特異度をかなり増加させる。

【図1】

【図2】

【配列表】

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