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特許7173980Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト及びその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-08
(45)【発行日】2022-11-17
(54)【発明の名称】Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20221109BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221109BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221109BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/02
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2019551021
(86)(22)【出願日】2018-10-16
(86)【国際出願番号】 JP2018038391
(87)【国際公開番号】W WO2019082721
(87)【国際公開日】2019-05-02
【審査請求日】2021-02-03
(31)【優先権主張番号】P 2017204687
(32)【優先日】2017-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004569
【氏名又は名称】日本たばこ産業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100120112
【氏名又は名称】中西 基晴
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】下村 一平
(72)【発明者】
【氏名】山本 岳
(72)【発明者】
【氏名】上瀧 将史
(72)【発明者】
【氏名】飛田 直哉
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第０１８６５３１６（ＥＰ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトであって、単一ベクター中に、５’側から順に、ＣＭＶプロモーター、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、前記コンストラクト。
【請求項2】
Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットが、ロドプシン様受容体のクラス又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、請求項１のコンストラクト。
【請求項3】
Ｇタンパク質共役受容体が、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、請求項１のコンストラクト。
【請求項4】
Ｇタンパク質共役受容体が、苦味受容体である、請求項１のコンストラクト。
【請求項5】
ベクターがプラスミドベクターである、請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項6】
ベクターが、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである、請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項7】
ＩＲＥＳ配列が、タイプ２のＩＲＥＳ配列である、請求項１－６のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項8】
ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である、請求項１－７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項9】
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１－６のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項10】
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドが、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、又はウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチドである、請求項９に記載のコンストラクト。
【請求項11】
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である、請求項１－１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項12】
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である、請求項１－１１のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項13】
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである、請求項１－１２のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項14】
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である、請求項１３に記載のコンストラクト。
【請求項15】
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が、ヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である、請求項１－１４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項16】
請求項１－１５
のいずれか１項に記載のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞。
【請求項17】
請求項１６
に記載の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法。
【請求項18】
物質が、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である、請求項１７の測定方法。
【請求項19】
物質の生理的応答を測定するための、請求項１６に記載の形質転換細胞の使用。
【請求項20】
請求項１６
記載の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト、本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞、本発明の形質転換細胞を用いた物質の生理的応答の測定方法、物質の生理的応答を測定するための本発明の形質転換細胞の利用、本発明の形質転換細胞を含む、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
１．Ｇタンパク質共役受容体及びＧタンパク質を介したシグナル伝達
Ｇタンパク質共役受容体は、真核生物の細胞質膜上又は細胞内部の構成膜上に存在する受容体の形式の１種である。細胞外（膜外）からの様々なシグナル（神経伝達物質、ホルモン、化学物質、光等）を受容すると、Ｇタンパク質共役受容体は構造変化を起こし、膜内側に結合している三量体Ｇタンパク質を活性化させてシグナル伝達が行われる。
Ｇタンパク質共役受容体は、真核生物の細胞質膜上又は細胞内部の構成膜上に存在する受容体の形式の１種である。細胞外（膜外）からの様々なシグナル（神経伝達物質、ホルモン、化学物質、光等）を受容すると、Ｇタンパク質共役受容体は構造変化を起こし、膜内側に結合している三量体Ｇタンパク質を活性化させてシグナル伝達が行われる。
【0003】
Ｇタンパク質は、細胞膜の内表面に結合し、ＧαサブユニットにＧβγ二量体が固く結合しているヘテロ三量体である。Ｇタンパク質共役受容体にリガンドが結合し活性化されると、Ｇタンパク質共役受容体に結合しているＧタンパク質はその保有するＧＤＰをＧαサブユニットから離し、ＧＴＰの新しい分子と結合する（ＧＤＰ型→ＧＴＰ型への変換）。この変換により、Ｇαサブユニット、Ｇβγ二量体及びＧタンパク質共役受容体が各々分離する。分離したＧαサブユニットは、その下流のエフェクタータンパク質を活性化する。
【0004】
Ｇタンパク質共役受容体及びその下流のＧタンパク質は、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、多くの基礎的な生理化学的な反応を制御している。
【0005】
２．味覚及び嗅覚に関する知見
味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。哺乳類の味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、旨味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われている。
味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。哺乳類の味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、旨味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われている。
【0006】
甘味、旨味、苦味については、味細胞に存在するＧタンパク質共役受容体と、それに共役するＧタンパク質を介したシグナル伝達によって感知されると考えられている。具体的には、苦味はＴ２Ｒファミリーと命名された分子（苦味受容体）（ヒトで２５種類）で受容され、甘味はＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（甘味受容体）、旨味はＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（旨味受容体）で受容されることが明らかにされている。
【0007】
味覚情報の伝達機構のしくみについては、一般には、以下のように理解されている。すなわち、まず、味物質が味細胞の受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ３、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。次いで、細胞内に供給されたカルシウムイオンは、神経伝達物質をシナプスに放出させて神経細胞に活動電位を発生させ、その結果、受容体を起点とした味覚シグナルが味神経から脳に伝達されて味覚情報が識別、判断される、というのが通説である。
【0008】
嗅覚受容体も、苦味受容体、甘味受容体、旨味受容体等の味覚受容体と同様に、Ｇタンパク質共役受容体である。嗅覚受容体は嗅上皮の嗅細胞上に存在する。嗅細胞は、神経細胞が外界と直接接している人体で唯一の場所であり、そのもう一方の端は、脳の嗅球という領域に直接つながっている。「匂い物質」は、分子量３０から３００程度までの低分子化合物であり、地球上には数十万個もの匂い物質が存在すると言われている。ヒトにおいて４００以上もの嗅覚受容体が同定されている。嗅覚受容体に匂い物質が結合すると、苦味受容体、甘味受容体、旨味受容体等の味覚受容体と同様に、細胞内のセカンドメッセンジャーなどを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。
【0009】
３．Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価
食品、飲料品等に含まれる化学物質、神経伝達物質、ホルモンなどは、Ｇタンパク質共役受容体に結合して構造変化を起こせしめ、膜内側に結合しているＧタンパク質を活性化させるという、一連のシグナル伝達におけるＧタンパク質共役受容体作動薬となる可能性がある。これらのＧタンパク質共役受容体作動薬の候補物質の生理的応答の評価を簡便に効率よく行えることが望ましい。タンパク質共役受容体作動薬の候補物質の生理的応答の評価を適切に行うことができれば、飲食品、医薬品等の味、品質等の改善、タンパク質共役受容体作動薬の使用量の調節などの有益な効果を達成することができる。
食品、飲料品等に含まれる化学物質、神経伝達物質、ホルモンなどは、Ｇタンパク質共役受容体に結合して構造変化を起こせしめ、膜内側に結合しているＧタンパク質を活性化させるという、一連のシグナル伝達におけるＧタンパク質共役受容体作動薬となる可能性がある。これらのＧタンパク質共役受容体作動薬の候補物質の生理的応答の評価を簡便に効率よく行えることが望ましい。タンパク質共役受容体作動薬の候補物質の生理的応答の評価を適切に行うことができれば、飲食品、医薬品等の味、品質等の改善、タンパク質共役受容体作動薬の使用量の調節などの有益な効果を達成することができる。
【0010】
また一方で、上記食品、飲料品等に含まれる物質においては官能試験による評価も行われてきた。しかしながら官能試験による評価は、評価の客観性の担保が容易でない、評価に人的、時間的、費用的な負担が大きい、大量の物質について短期間で評価を行うことができない、などの本質的な問題を伴うことが知られている。
【0011】
そこで、官能試験に代わる評価方法として、Ｇタンパク質共役受容体及びＧαタンパク質を発現させた細胞系を作製し、そのような細胞系にＧタンパク質共役受容体作動薬（候補化合物）を直接添加して効果を評価する方法が報告されている。
【0012】
Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価のための細胞系では、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質とＧαタンパク質とが同じ細胞で発現している必要がある。２種類のタンパク質を発現させるには、一般に、各タンパク質コードする核酸を含む２種類のベクターを同時に、あるいは、順番に遺伝子導入する共遺伝子導入法が広く使用されている。これは例えば、以下のような態様である。
（ａ）Ｇαタンパク質をコードする核酸を含むベクターと、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで宿主細胞をコトランスフェクトする；
（ｂ）Ｇαタンパク質を安定発現させた細胞株を、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで形質転換する。
（ａ）Ｇαタンパク質をコードする核酸を含むベクターと、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで宿主細胞をコトランスフェクトする；
（ｂ）Ｇαタンパク質を安定発現させた細胞株を、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで形質転換する。
【0013】
共遺伝子導入法を用いた例は、例えば、苦味受容体についてChem. Senses 35, p.157-170, 2010; The Journal of Neuroscience, 23(19), p.7376-7380, 2003; Biochem Biophys Res Commun 365(4): p.851-855,2008に記載されている。また、甘味受容体については、特開２００８－１３５７０号公報、特開２００８－２２８６９０号公報、ＷＯ２００７－１２１６０４号公報に記載されている。
【0014】
しかしながら、いずれの場合も作製難易度が高く（成功率が低い）、安定したデータを取得することができない。よって、Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価を行うのに使用するのに十分な品質を有する細胞系であるとは言えない。
【0015】
２種類のタンパク質を発現させる方法としては、共遺伝子導入法の他に、２種類のタンパク質を発現する各々の核酸を１つのベクターに挿入した共発現ベクターを用いる方法が知られている。一般に、単一のベクターに２種類のタンパク質を発現する２種類の核酸をタンデムにそのまま挿入しても、プロモーターから離れた位置にある核酸ほど翻訳がされにくく、タンパク質の発現量が低い。そのため、プロモーターから離れた位置にある核酸ほど翻訳効率を上昇させるための工夫が必要である。
【0016】
特許５９０５１８７は、「味受容体の味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクトであって、ＥＦ-１αプロモーターの下流に位置する、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結し、さらに、その下流に存在するＣＭＶプロモーターの下流に位置する、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなる、甘味受容体発現コンストラクト」を記載している。特許５９０５１８７のコンストラクトは、５’側から順に、ＥＦ-１αプロモーター － Ｔ１Ｒ２ －ＩＲＥＳ － Ｇα － ＣＭＶプロモーター － ＴＩＲ３ － ＩＲＥＳ － Ｇα」という特定の構造を有するものである。このコンストラクトにおいて、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３は各々特定のプロモーターの下流、そして、ＩＲＥＳの上流に配置されている。
【0017】
ＩＲＥＳは、タンパク質合成の効率をより上昇させるために、キャップ非依存的な翻訳開始を可能にするＲＮＡ因子である。ＩＲＥＳを介した翻訳は、一般にキャップ依存的な翻訳を受ける上流のタンパクと比較し低効率な傾向にあることが知られている。
【0018】
本発明前に、Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価を行うのに使用するのに十分な品質を有する細胞系は得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0019】
【文献】特開２００８－１３５７０号公報
【文献】特開２００８－２２８６９０号公報
【文献】ＷＯ２００７－１２１６０４号公報
【非特許文献】
【0020】
【文献】Chem. Senses 35, p.157-170, 2010;
【文献】The Journal of Neuroscience, 23(19), p.7376-7380, 2003;
【文献】Biochem Biophys Res Commun 365(4): p.851-855,2008
【文献】Molecular BioSystems, 7, p.911-919, 2011
【文献】Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.88, p.5587-5591, 1991
【文献】Journal of Virology, Vol.86, No.3, p.1468-1486, 2012
【文献】GENES & DEVELOPMENT, Vol,15, p.1593-1612, 20
【文献】Archives of Physiology and Biochemistry Vol.110 p.137-45,2002
【文献】Nature Genetics, Vol.32, p.397-401, 2002; Cell, Vol.100, p.703-711, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0021】
本発明者らは、上記問題解決の為に鋭意研究に努めた結果、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトにおいて、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸と配置させることにより、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを高効率で発現し、Ｇタンパク質共役受容体作動薬に対して高効率で応答することを見出し、本発明を想到した。
【0022】
ＩＲＥＳの３’側に配置された遺伝子によりコードされるタンパク質は、発現量が低いと考えられている。よって、本発明において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットが高効率で発現することは従来の知見に反することであり特徴的である。
【課題を解決するための手段】
【0023】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトであって、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、前記コンストラクト。
［態様２］
Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットが、ロドプシン様受容体のクラス又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様３］
Ｇタンパク質共役受容体が、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様４］
Ｇタンパク質共役受容体が、苦味受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様５］
ベクターがプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様６］
ベクターが、ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様７］
ベクターが、ＣＭＶプロモーター及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様８］
ベクターが、ＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドベクターである。態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様９］
ベクターが、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１０］
ＩＲＥＳ配列が、タイプ２のＩＲＥＳ配列である、態様１－９のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１１］
ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である、態様１－１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１２］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、態様１－７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１３］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドが、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、又はウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチドである、態様１２に記載のコンストラクト。
［態様１４］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である、態様１－１３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１５］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である、態様１－１４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１６］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである、態様１－１５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１７］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である、態様１６に記載のコンストラクト。
［態様１８］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が、ヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である、態様１－１７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１９］
態様１－１８のいずれか１項に記載のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞。
［態様２０］
態様１９に記載の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法。
［態様２１］
物質が、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である、態様２０の測定方法。
［態様２２］
物質の生理的応答を測定するための、態様１９に記載の形質転換細胞の使用。
［態様２３］
態様１９記載の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット。
［態様１］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトであって、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、前記コンストラクト。
［態様２］
Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットが、ロドプシン様受容体のクラス又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様３］
Ｇタンパク質共役受容体が、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様４］
Ｇタンパク質共役受容体が、苦味受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様５］
ベクターがプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様６］
ベクターが、ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様７］
ベクターが、ＣＭＶプロモーター及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様８］
ベクターが、ＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドベクターである。態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様９］
ベクターが、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１０］
ＩＲＥＳ配列が、タイプ２のＩＲＥＳ配列である、態様１－９のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１１］
ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である、態様１－１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１２］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、態様１－７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１３］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドが、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、又はウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチドである、態様１２に記載のコンストラクト。
［態様１４］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である、態様１－１３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１５］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である、態様１－１４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１６］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである、態様１－１５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１７］
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である、態様１６に記載のコンストラクト。
［態様１８］
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が、ヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である、態様１－１７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１９］
態様１－１８のいずれか１項に記載のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞。
［態様２０］
態様１９に記載の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法。
［態様２１］
物質が、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である、態様２０の測定方法。
［態様２２］
物質の生理的応答を測定するための、態様１９に記載の形質転換細胞の使用。
［態様２３］
態様１９記載の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット。
【発明の効果】
【0024】
本発明のコンストラクトで形質転換された細胞は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを高効率で発現し、Ｇタンパク質共役受容体作動薬に対して高効率で応答する。本発明の形質転換細胞は、Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価を行うのに使用するのに十分な品質を有する細胞系を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図10】図１０は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）における、Ｔ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬（イソプロテレノール）に対する応答を測定した結果である。
【図13】図１３は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）におけるＴ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬（イソプロテレノール）に対する応答を測定した結果である。
【図18】図１８は、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）に関し、作動薬（６－ｎ－プロピルチオウラシル）に対する安定発現細胞の応答を調べた結果である。黒がＴ２Ｒ３８の結果、斜線がコントロール（発現ベクターＧα－Ｔ２Ｒ３８を組み込まない細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ））の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト、本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞、本発明の形質転換細胞を用いた物質の生理的応答の測定方法、物質の生理的応答を測定するための本発明の形質転換細胞の利用、本発明の形質転換細胞を含む、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。以下、非限定的に本発明を実施するための形態を説明する。
【0027】
Ｉ．Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト
本発明は、一態様において、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトに関する。本発明のコンストラクトは、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、ことを特徴とする。
本発明は、一態様において、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトに関する。本発明のコンストラクトは、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、ことを特徴とする。
【0028】
（１）Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニット
「Ｇタンパク質共役（型）受容体」（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）は、真核生物の細胞質膜上又は細胞内部の構成膜上に存在する受容体の形式の１種である。７つのヘリックス構造が細胞膜（又は細胞内の構成膜）を貫通し、Ｎ末端は膜外にＣ末端は膜内に位置する特徴的な構造から、別名「７回膜貫通型受容体」とも呼称される。膜外ループには２つのよく保存されたシステイン残基が含まれ、ジスルフィド結合によって受容体構造を安定化している。細胞外（膜外）からの様々なシグナル（神経伝達物質、ホルモン、化学物質、光等）を受容すると、Ｇタンパク質共役受容体は構造変化を起こし、膜内側に結合している三量体Ｇタンパク質を活性化させてシグナル伝達が行われる。Ｇタンパク質共役受容体は、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、多くの基礎的な生理化学的な反応を制御している。
「Ｇタンパク質共役（型）受容体」（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）は、真核生物の細胞質膜上又は細胞内部の構成膜上に存在する受容体の形式の１種である。７つのヘリックス構造が細胞膜（又は細胞内の構成膜）を貫通し、Ｎ末端は膜外にＣ末端は膜内に位置する特徴的な構造から、別名「７回膜貫通型受容体」とも呼称される。膜外ループには２つのよく保存されたシステイン残基が含まれ、ジスルフィド結合によって受容体構造を安定化している。細胞外（膜外）からの様々なシグナル（神経伝達物質、ホルモン、化学物質、光等）を受容すると、Ｇタンパク質共役受容体は構造変化を起こし、膜内側に結合している三量体Ｇタンパク質を活性化させてシグナル伝達が行われる。Ｇタンパク質共役受容体は、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、多くの基礎的な生理化学的な反応を制御している。
【0029】
Ｇタンパク質共役受容体は、アミノ酸配列、薬理学的動態、機能等の類似に基づいて６つのクラスに分類されている（Molecular BioSystems, 7, p.911-919, 2011）。
クラスＡ：ロドプシン様受容体
クラスＢ：セクレチン受容体ファミリー
クラスＣ：代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体
クラスＤ：真菌の接合因子受容体
クラスＥ：サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）受容体
クラスＦ：フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、スムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）
クラスＡ：ロドプシン様受容体
クラスＢ：セクレチン受容体ファミリー
クラスＣ：代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体
クラスＤ：真菌の接合因子受容体
クラスＥ：サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）受容体
クラスＦ：フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、スムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）
【0030】
（ｉ）クラスＡ：ロドプシン様受容体
クラスＡのロドプシン様受容体は、Ｎ末端の細胞外領域が比較的短く、複数個の膜貫通領域によってリガンド結合部位が形成される。クラスＡのロドプシン様受容体はＧタンパク質共役受容体の８０％以上を占め、苦味受容体、嗅覚受容体、ロドプシン、アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体等を含む。ロドプシン様受容体に保存されているアミノ酸配列として、３つ目の膜貫通領域の膜内側に位置するＥ／ＤＲＹ（Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ａｒｇ、Ｔｙｒ）モチーフがある。
クラスＡのロドプシン様受容体は、Ｎ末端の細胞外領域が比較的短く、複数個の膜貫通領域によってリガンド結合部位が形成される。クラスＡのロドプシン様受容体はＧタンパク質共役受容体の８０％以上を占め、苦味受容体、嗅覚受容体、ロドプシン、アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体等を含む。ロドプシン様受容体に保存されているアミノ酸配列として、３つ目の膜貫通領域の膜内側に位置するＥ／ＤＲＹ（Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ａｒｇ、Ｔｙｒ）モチーフがある。
【0031】
苦味受容体は、ロドプシン様受容体に属するＧタンパク質共役受容体である。ヒト及びマウスの第６番染色体において、Ｔ２Ｒファミリーとして同定された。少なくともマウスで３５種類、ヒトで２５種類のＴ２Ｒが苦味受容体として機能している。ヒトのＴ２Ｒとそのリガンドの関係の例は以下の通りである。
Ｔ２Ｒ４：安息香酸デナトニウム；
Ｔ２Ｒ１０：ストリキニーネ；
Ｔ２Ｒ１４：多くの構造的特徴の異なる苦味物質を非特異的に結合
Ｔ２Ｒ１６：β－グルコピラノシド（サリシン（ｓａｌｉｃｉｎ））
Ｔ２Ｒ３１：アリストロキア酸
Ｔ２Ｒ３８：イソチオシアネート基を有する苦味物質、例えば、ファニルチオカルバミド（ＰＴＣ）、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）
Ｔ２Ｒ４０：ジフェニドール
Ｔ２Ｒ４３：キニーネ
Ｔ２Ｒ４６：アブシンチン、ストリキニーネ、デナトニウム
Ｔ２Ｒ４：安息香酸デナトニウム；
Ｔ２Ｒ１０：ストリキニーネ；
Ｔ２Ｒ１４：多くの構造的特徴の異なる苦味物質を非特異的に結合
Ｔ２Ｒ１６：β－グルコピラノシド（サリシン（ｓａｌｉｃｉｎ））
Ｔ２Ｒ３１：アリストロキア酸
Ｔ２Ｒ３８：イソチオシアネート基を有する苦味物質、例えば、ファニルチオカルバミド（ＰＴＣ）、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）
Ｔ２Ｒ４０：ジフェニドール
Ｔ２Ｒ４３：キニーネ
Ｔ２Ｒ４６：アブシンチン、ストリキニーネ、デナトニウム
【0032】
マウス及びヒトのＴ２Ｒのタンパク質のアミノ酸配列及び遺伝子の核酸配列は公知である。例えば、ヒトの２５種類のＴ２Ｒ苦味受容体のアミノ酸配列及び遺伝子配列は、以下の表１に記載のアクセッション番号でＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
【0033】
【表1-1】
【0034】
【表1-2】
【0035】
なお、本明細書において「遺伝子」は、特に明記しない限り核酸と同義で用いており、プロモーター等の制御配列を含まない態様も含む。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡの双方を含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡのキメラも含む。ある特定のタンパク質の「遺伝子配列」とは、当該タンパク質のアミノ酸配列をコードする（イントロンを含まない）ＤＮＡ配列を意味する。
【0036】
嗅覚受容体も、苦味受容体と同様にロドプシン様受容体に属するＧタンパク質共役受容体である。嗅覚受容体は平均して約３１０アミノ酸残基の長さからなり、いくつかのモチーフ配列を共有する。特に特徴的なのは、３番目の膜貫通部位から４番目の膜内ループにかけて存在するＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣというモチーフ配列である。このモチーフ配列のうち、ＤＲＹ（Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ａｒｇ、Ｔｙｒ）の３アミノ酸残基は、他のロドプシン様受容体とも共通しており、Ｇタンパク質の活性化に重要と考えられている。多数の嗅覚受容体のタンパク質のアミノ酸及び遺伝子の核酸配列は公知である。
【0037】
例えば、ヒトの嗅覚受容体のアミノ酸配列及び遺伝子配列は、以下の表２に記載のアクセッション番号でＮＣＢＩ又はＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
【0038】
【表2】
【0039】
（ｉｉ）クラスＣ：代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体
クラスＣは、代謝性グルタミン酸受容体、代謝性フェロモン受容体の他に、甘味受容体、旨味受容体、ＧＡＢＡ（Ｂ型）受容体、カルシウム感知受容体等を含む。本明細書及び特許請求の範囲において「代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラス」と呼称する場合には、特に明記しない限り、クラスＣに全体を意味する。クラスＣの受容体は、ホモ又はヘテロの二量体として機能し、Ｇタンパク質共役受容体のなかで最も大きな５００～６００残基程度の細胞外領域を有する。細胞外領域のリガンド結合ドメインは、Ｖｅｎｕｓ Ｆｌｙｔｒａｐモジュール（ＶＦＴＭ）構造と呼称される構造をとる。
クラスＣは、代謝性グルタミン酸受容体、代謝性フェロモン受容体の他に、甘味受容体、旨味受容体、ＧＡＢＡ（Ｂ型）受容体、カルシウム感知受容体等を含む。本明細書及び特許請求の範囲において「代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラス」と呼称する場合には、特に明記しない限り、クラスＣに全体を意味する。クラスＣの受容体は、ホモ又はヘテロの二量体として機能し、Ｇタンパク質共役受容体のなかで最も大きな５００～６００残基程度の細胞外領域を有する。細胞外領域のリガンド結合ドメインは、Ｖｅｎｕｓ Ｆｌｙｔｒａｐモジュール（ＶＦＴＭ）構造と呼称される構造をとる。
【0040】
甘味受容体はクラスＣに属する受容体で、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体として機能する。人工甘味料であるアスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）とネオテームの受容にはヒトＴ１Ｒ２のＮ末端ドメインが、人工甘味料シクラメート（ｃｙｃｌａｍａｔｅ）や甘味抑制物質ラクチゾールの受容にはヒトヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインが、甘味修飾物質ネオクリンはヒトＴ１Ｒ３のＮ末端ドメインが各々受容に重要であることが報告されている。甘味タンパク質ブラゼインのヒトＴ１Ｒ３のＣリッチドメインが感受性に重要である、と報告されている。
【0041】
旨味受容体は、クラスＣに属する受容体で、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体として機能する。旨味物質のグルタミン酸及びイノシン酸（ＩＭＰ）は、Ｔ１Ｒ１のＮ末端ドメインに結合することが明らかにされている。
【0042】
甘味受容体、旨味受容体を構成するヒトＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ののアミノ酸配列及び遺伝子配列は、以下の表３に記載のアクセッション番号でＮＣＢＩに登録されている。
【0043】
【表3】
【0044】
本発明のコンストラクトを用いて発現されるのは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質全体であっても、あるいは、そのサブユニットであってもよい。例えば、二量体である甘味受容体又は旨味受容体を構成するサブユニット、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ１のいずれか１種類のサブユニットのみを発現するコンストラクトが含まれる。その場合、二量体を構成するもう片方のサブユニットは別のコンストラクトでコトランスフェクトしてもよい。あるいは、単一のベクター中にＧタンパク質共役受容体タンパク質を構成する複数のサブユニットをコードする核酸が含まれるようにコンストラクトを構築してもよい。本発明において、少なくとも１つのサブユニットをコードする核酸がＩＲＥＳの３'側に配置されるようにコンストラクトを構成する。
【0045】
（ｉｉｉ）クラスＢ：セクレチン受容体ファミリー
クラスＢのセクレチン受容体ファミリーは、Ｎ末端側の細胞外領域が長くリガンド結合部位を形成する。セクレチン様受容体（狭義）とＡｄｈｅｓｉｏｎ型Ｇタンパク質共役受容体の２つのサブグループに分かれる。セクレチン様受容体（狭義）には、セクレチン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン等のペプチドホルモンに結合する受容体が含まれる。Ａｄｈｅｓｉｏｎ型Ｇタンパク質共役受容体は、巨大なＮ末端部位に様々なドメイン構造を有し、細胞外マトリックス等の相互作用が示唆されている。
クラスＢのセクレチン受容体ファミリーは、Ｎ末端側の細胞外領域が長くリガンド結合部位を形成する。セクレチン様受容体（狭義）とＡｄｈｅｓｉｏｎ型Ｇタンパク質共役受容体の２つのサブグループに分かれる。セクレチン様受容体（狭義）には、セクレチン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン等のペプチドホルモンに結合する受容体が含まれる。Ａｄｈｅｓｉｏｎ型Ｇタンパク質共役受容体は、巨大なＮ末端部位に様々なドメイン構造を有し、細胞外マトリックス等の相互作用が示唆されている。
【0046】
（ｉｖ）クラスＦ：フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、スムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）
クラスＦのＧタンパク質共役受容体は、Ｗｎｔシグナル伝達経路で機能する１０種類のフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質と、ヘッジホッグシグナル伝達経路で機能するスムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）を含む。クラスＦの受容体は、細胞外にシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と呼ばれる約１２０アミノ酸残基からなる領域を有し、Ｗｎｔなどのリガンドの結合領域となっている。
クラスＦのＧタンパク質共役受容体は、Ｗｎｔシグナル伝達経路で機能する１０種類のフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質と、ヘッジホッグシグナル伝達経路で機能するスムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）を含む。クラスＦの受容体は、細胞外にシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と呼ばれる約１２０アミノ酸残基からなる領域を有し、Ｗｎｔなどのリガンドの結合領域となっている。
【0047】
本発明において、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットの種類は特に限定されない。少なくともクラスＡに属する苦味受容体Ｔ２Ｒの複数のタイプ、並びに、異なるクラスＣに属するサブユニットＴ１Ｒ２（甘味受容体を構成）及びＴ１Ｒ３（甘味受容体及び旨味受容体を構成）において、本発明の効果が確認されている。
【0048】
非限定的に、本発明の一態様において、好ましくは、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットは、ロドプシン様受容体のクラス（クラスＡ）又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラス（クラスＣ）のＧタンパク質共役受容体である。本発明の一態様において、Ｇタンパク質共役受容体は、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である。より好ましくは、Ｇタンパク質共役受容体は、苦味受容体である。
【0049】
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が由来する生物種は特に限定されない。好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物種由来である。哺乳動物は、例えば、ヒト、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウス等を含む。本発明の一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質はヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である。
【0050】
（２）Ｇタンパク質αサブユニット
「Ｇタンパク質（グアニジンヌクレオチド結合タンパク質）」は、ＧＴＰアーゼのグループに属するタンパク質で、一般に、α、β、γの３つのサブユニットから構成される、膜受容体関連ヘテロ三量体を指す。
「Ｇタンパク質（グアニジンヌクレオチド結合タンパク質）」は、ＧＴＰアーゼのグループに属するタンパク質で、一般に、α、β、γの３つのサブユニットから構成される、膜受容体関連ヘテロ三量体を指す。
【0051】
Ｇタンパク質は、細胞膜の内表面に結合し、ＧαサブユニットにＧβγ二量体が固く結合している。Ｇタンパク質共役受容体にリガンドが結合し活性化されると、Ｇタンパク質共役受容体に結合しているＧタンパク質は持っているＧＤＰをＧαサブユニットから離し、ＧＴＰの新しい分子と結合する（ＧＤＰ型→ＧＴＰ型への変換）。この変換により、Ｇαサブユニット、Ｇβγ二量体及びＧタンパク質共役受容体が各々分離する。分離したＧαサブユニットは、その下流のエフェクタータンパク質を活性化する。
【0052】
Ｇタンパク質αサブユニットはＧＴＰアーゼドメインとαヘリックスドメインの２つのドメインからなる。現在、少なくとも２０種類のＧαサブユニットが知られており、主に４つのファミリーに分類されている。
【0053】
【表4】
【0054】
本発明において、Ｇタンパク質αサブユニットの種類は特に限定されない。本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、非限定的に、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である。本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である。
【0055】
Ｇタンパク質サブユニットが由来する生物種は特に限定されない。好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物種由来である。哺乳動物は、例えば、ヒト、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウス等を含む。本発明の一態様において、Ｇタンパク質はヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である。
【0056】
ヒトのＧα１６は、例えばProc.Natl.Acad.Sci.USA, Ｖｏｌ．８８，ｐ．５５８７－５５９１， １９９１に記載されており、ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｍ６３９０４．１で登録されている。ヒトのＧα１６の塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本出願の配列表の配列番号６５及び６６として記載されている。ヒトＧα１６をコードする遺伝子は、例えば、ＨＬ６０細胞等の培養細胞から入手することも可能である。
【0057】
ラットＧａｓｔｄｕｃｉｎのｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿１７３１３９．１で登録されている。ラットＧａｓｔｄｕｃｉｎの塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本出願の配列表の配列番号６７及び６８として記載されている。
【0058】
ヒトのＧαｏｌｆのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＦ４９３８９３．１で登録されている。ヒトのＧαｏｌｆの塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本出願の配列表の配列番号６９及び７０として記載されている。
【0059】
Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、キメラタンパク質であってもよい。キメラタンパク質は、同じ生物種由来の異なる種類のＧタンパク質αサブユニットの融合タンパク質であってもよく、異なる生物種由来の同じ種類のＧタンパク質αサブユニットの融合タンパク質であってもよく、あるいは、異なる生物種由来の異なる種類のＧタンパク質αサブユニットの融合タンパク質であってもよい。Ｇタンパク質αサブユニットタンパクｎのキメラタンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体への結合特異性、結合強度、あるいは、安定性などの特徴が元来のＧタンパク質αサブユニットタンパク質と異なる場合がある。このようなキメラタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクトを利用することにより、所望の特徴を有する形質転換細胞を得ることができる。そして、所望の特徴を有する形質転換細胞は、物質の生理的応答の測定方法に適宜利用することができる。
【0060】
本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである。ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔは、ヒトＧα１６のＣ末端側をラットＧαｇｕｓｔのＣ末端配列に置換したキメラタンパク質である。Ｇα１６のＣ末端側を３７アミノ酸残基以上のＧαｇｕｓｔのＣ末端配列に置換したキメラタンパク質は、苦味受容体Ｔ２Ｒに応答することが報告されている（The Journal of Neuroscience, 23(19), p.7376-7380, 2003）。
【0061】
ヒトＧα１６を置換するラットＧαｇｕｓｔのＣ末端配列は、好ましくは少なくとも２５アミノ酸基以上、３０アミノ酸基以上、３５アミノ酸残基以上、３７アミノ酸残基以上、４０アミノ酸基以上、４３アミノ酸残基以上である。ヒトＧα１６を置換するラットＧαｇｕｓｔのＣ末端配列は、好ましくは、６０アミノ酸残基以下、５０アミノ酸基以下、４５アミン酸基以下、４３アミノ酸基以下である。本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である。
【0062】
本明細書の実施例では、ヒトのＧα１６の配列番号６５の３’末端の１３２塩基（終始コドン含む）Ｃ末端の４３アミノ酸をコードする配列に相当）を、ラットＧａｓｔｄｕｃｉｎの相当する配列、即ち、配列番号６７の３’末端の１３２塩基（終始コドン含む、Ｃ末端の４３アミノ酸をコードする配列に相当）に置換した（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα））。
【0063】
（３）ＩＲＥＳ
本発明のコンストラクトは、単一ベクター中のＧタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸の下流（３’側）、かつ、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の上流（５’側）の位置に、ＩＲＥＳ配列を含む核酸を含む。ＩＲＥＳは、Internal ribosome entry site（内部リボソーム進入部位）の略称であり、タンパク質合成の効率をより上昇させるために、キャップ非依存的な翻訳開始を可能にするＲＮＡ因子である。多くのＩＲＥＳは、ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ（５’非翻訳領域）に存在するが、哺乳動物細胞の細胞性ｍＲＮＡの中にもＩＲＥＳが存在することが示唆されている。
本発明のコンストラクトは、単一ベクター中のＧタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸の下流（３’側）、かつ、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の上流（５’側）の位置に、ＩＲＥＳ配列を含む核酸を含む。ＩＲＥＳは、Internal ribosome entry site（内部リボソーム進入部位）の略称であり、タンパク質合成の効率をより上昇させるために、キャップ非依存的な翻訳開始を可能にするＲＮＡ因子である。多くのＩＲＥＳは、ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ（５’非翻訳領域）に存在するが、哺乳動物細胞の細胞性ｍＲＮＡの中にもＩＲＥＳが存在することが示唆されている。
【0064】
現在までに発見されているウイルス性ＩＲＥＳは、５つのクラスに大別される（Journal of Virology, Vol.86, No.3, p.1468-1486, 2012)。
【0065】
１つめのクラスは、ジシストロウイルスのＩＲＥＳ群である。２つめのクラスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びペスチウイルス属のウイルスのＩＲＥＳ，さらに、構造的に類似した多くのウイルスのＩＲＥＳを含む。
【0066】
さらに、タイプ１～タイプ３と呼称される３つのクラスのＩＲＥＳが知られている。これらは、いずれも、ピコルナウイルス科の５'ＵＴＲにおいて同手されたものである。
【0067】
これらのうちタイプ２は、主に、アフトウイルス属（Aphthovirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）に見出されるＩＲＥＳである。さらに、エルボウイルス属（Erbovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）にも分岐メンバーが存在する。カルジオウイルス属（Cardiovirus）は、脳心筋炎ウイルス（Encephalomyocarditis virus） (EMCV)、タイロウイルス（Theilovirus）を含む。タイプ２のＩＲＥＳは、約４５０塩基の長さで、３'－末端Ｙｎ－Ｘｍ－ＡＵＧ（Ｙｎはピリミジントラクトであり、ｎは８－１０の整数であり、そして、ｍは、１８－２０である。）のモチーフを有し、ＡＵＧトリプレットが開始コドンとなる場合がある。タイプ２のＩＲＥＳは、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬの５つの主たるドメインを含む。タイプ２のＩＲＥＳは、真核生物の翻訳開始因子ＩＦ４Ｅ及びリボソームスキャンニングに関与する因子、例えば、ｅＩＦ１及びｅＩＦ１Ａ等の関与なしに機能する。ただし、タイプ２のＩＲＥＳのうちいくつかは、１又は複数のＩＲＥＳトランス活性因子（ＩＴＡＦｓ）を必要とする。ＩＴＡＦは、ピリミジントラクト結合タンパク質（ＰＴＢ）などの細胞性ＲＮＡ結合タンパク質である。
【0068】
タイプ１のＩＲＥＳは、エンテロウイルス属（Enterovirus）のみに見出されるＩＲＥＳである。タイプ１のＩＲＥＳは、ＩＩ－ＶＩの５つの主たるドメインを含む。タイプ２のＩＲＥＳは、約４５０塩基の長さで、タイプ２と同様に３'－末端Ｙｎ－Ｘｍ－ＡＵＧのモチーフを有する。ただし、タイプ１のＩＲＥＳではこのモチーフは非保存スペーサーによって開始コドンから離されている。タイプ３は、Ａ型肝炎ウイルスのみで見出されるＩＲＥＳである。
【0069】
細胞性ＩＲＥＳについては、例えば、GENES & DEVELOPMENT, Vol,15, p.1593-1612, 2001に記載されている。
【0070】
本発明において、ＩＲＥＳの種類は特に限定されない。非限定的に、本発明の一態様において、ＩＲＥＳはウイルス性のＩＲＥＳである。本発明の一態様において。ＩＲＥＳ配列は、タイプ２のＩＲＥＳ配列、例えば、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である。脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳの核酸配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｍ８１８６１．１で登録されている。本明細書の実施例で用いたＩＲＥＳ配列は配列番号７１で、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ８１８６１．１の配列に対し、ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＩＲＥＳ部位を模して、一部修正している。具体的には、配列番号７１において塩基番号１にＧが、塩基番号５１２にＡが追加されている。
【0071】
（４）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチド
本発明のコンストラクトは、一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。
本発明のコンストラクトは、一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0072】
このようなコンストラクトを用いた場合、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのＮ'末端側に、このようなポリペプチドが結合した融合タンパク質が発現する。従って、当該コンストラクトで形質転換された細胞において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行が向上する。より多くのＧタンパク質共役受容体が細胞膜へ移行している形質転換細胞は、物質の生理的応答の測定方法により利用しやすくなる。
【0073】
本発明において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドの種類は、「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める」という機能を有する限り、特に限定されない。「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める」とは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのＮ末端側に当該ポリププチドが結合している場合、結合していない場合と比較して、発現したＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットが形質転換細胞の核から細胞膜へ移行する割合が（有意に）上昇することを意味する。
【0074】
Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドは、非限定的に、ラットのソマトスタチン受容体の全体又は一部を含むポリペプチド、ウシのロドプシンの全体又は一部を含むポリペプチドを含む（Archives of Phisiology and Biochemistry Vol.110 p.137-45,2002; Nature Genetics, Vol.32, p.397-401, 2002; Cell, Vol.100, p.703-711, 2000）。本発明の一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドは、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、ウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチド、又は、ヒトのロドプシンのＮ末端２１アミノ酸を含むポリペプチドである。
【0075】
ラットのソマトスタチン受容体のｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿１３３５２２．１で登録されている。ラットソマトスタチン受容体の塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本願の配列表の配列番号７２及び７３として記載されている。本願明細書の実施例では、配列番号７２の５’末端の１３５塩基をＧタンパク質共役受容体をコードする塩基配列の５'側に結合した。
【0076】
ヒトのロドプシンのｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿０００５３９．１で登録されている。ヒトロドプシンの塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本願の配列表の配列番号７４及び７５として記載されている。
【0077】
（５）ベクター
本発明のコンストラクトは、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、並びに、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を、単一ベクター中に５’側から順に含む。単一ベクター中に上記核酸を上記順に含むことにより、形質転換細胞において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇する、並びに／或いは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇する、という効果が得られる。ベクターにおいて、５’側から、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の順序で並んでいることが重要である。ＩＲＥＳの３’側の核酸にコードされるタンパク質は発現量が高くない、というのが従来の定説であった。本発明者らは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの場合、ＩＲＥＳの５’側よりも３'側に配置することで発現量が高まる、という発見に基づき本発明を想到した。
本発明のコンストラクトは、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、並びに、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を、単一ベクター中に５’側から順に含む。単一ベクター中に上記核酸を上記順に含むことにより、形質転換細胞において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇する、並びに／或いは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇する、という効果が得られる。ベクターにおいて、５’側から、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の順序で並んでいることが重要である。ＩＲＥＳの３’側の核酸にコードされるタンパク質は発現量が高くない、というのが従来の定説であった。本発明者らは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの場合、ＩＲＥＳの５’側よりも３'側に配置することで発現量が高まる、という発見に基づき本発明を想到した。
【0078】
なお、Ｇタンパク質共役受容体が、例えば、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）、旨味受容体（Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３）のような二量体の場合、二量体を構成する一方のサブユニットをコードする核酸のみを、上述のように、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳとともに単一ベクターに含ませてもよい。もう片方のサブユニットをコードする核酸を別のベクターに含ませ、上記ベクターとコトランスフェクトしてもよい。
【0079】
ベクターの種類は、所望の細胞においてタンパク質を発現できる発現ベクターであれば特に限定されない。非限定的に、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等を含む。当業者は、タンパク質を発現させる細胞の種類に応じて、適宜ベクターを選択可能である。
【0080】
本発明の一態様において、ベクターはプラスミドベクターである。プラスミドベクターは、例えば、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＳＨ１５、ｐＳＨ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４等を含む。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のｐｃＤＮＡ（商標）シリーズ（ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ５は、哺乳動物細胞における発現ベクターとして使用しうる。哺乳動物細胞における発現ベクターとしては、その他に、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）も使用することができる。
【0081】
本発明のベクターは好ましくは、プロモーターを含む。プロモーターの種類は特に限定されない、例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来プロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＥＦ１αプロモーター等が含まれる。本発明の一態様において、ベクターはＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクター、あるいは、ＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドベクターである。
【0082】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞を選択するための選択マーカーを含む。選択マーカーの種類は特に限定されず、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等、公知のプロモーターを含む。選択マーカーを含むことにより、安定してタンパク質を発現する細胞株を選択することが可能になる。
【0083】
本発明の一態様として、選択マーカーは薬剤耐性遺伝子である。薬剤耐性遺伝子は、非限定的に、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等を含む。
【0084】
本発明の一態様において、ベクターは、ＣＭＶプロモーター及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。このようなベクターの一例は、本明細書の実施例で用いた、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。
【0085】
本発明の別の一態様において、ベクターは、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。このようなベクターの一例は、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）である。
【0086】
本明細書の実施例で使用したｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター及びｐＥＡＫ１０ベクターの配列を各々本願の配列表の配列番号８０及び８１で示す。配列番号８０の塩基８９５―９４２は、目的遺伝子が挿入されるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）である。配列番号８１の塩基１８９２－２８２３はＥＦ－１αプロモーター配列、塩基２８４４－２８４５は目的遺伝子が挿入される部位、塩基３２９３－３８９２はピューロマイシン耐性遺伝子配列に相当する。
【0087】
ＩＩ．形質転換細胞
本発明はまた、上記本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞に関する。本発明のコンストラクトを遺伝子導入し形質転換細胞を作製するための宿主細胞の種類は、遺伝子導入により外因性核酸を導入し形質転換可能な細胞であれば、特に限定されない。
本発明はまた、上記本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞に関する。本発明のコンストラクトを遺伝子導入し形質転換細胞を作製するための宿主細胞の種類は、遺伝子導入により外因性核酸を導入し形質転換可能な細胞であれば、特に限定されない。
【0088】
例えば、細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【0089】
哺乳動物由来の細胞は、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞である「株化細胞」を含む。例えば、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する株化細胞が存在する。
【0090】
本明細書における植物細胞の由来は特に限定されない。コケ植物、シダ植物、種子植物を含む植物の細胞が対象となる。種子植物細胞が由来する植物は、単子葉植物、双子葉植物のいずれも含まれる。本明細書における昆虫細胞の由来も特に限定されない。本明細書における古細菌及び細菌の種類も特に限定されない。
【0091】
非限定的に、本発明の形質転換細胞を作製するための宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、３２Ｄ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞などの真核細胞を利用できる。本発明の一態様において、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【0092】
本発明のコンストラクトを用いて、宿主細胞を遺伝子導入（形質転換する）方法は特に限定されない。動物細胞、植物細胞、細菌へ核酸を遺伝子導入する方法については、各々適した方法が公知である（例えば、MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Michael R Green and Joseph Sambrook, 2012, (Cold Spring Harbor Laboratory Press)）。当業者は、ベクターの種類、細胞の種類等に応じて、適宜適切な遺伝子導入法を使用しうる。例えば、プラスミドベクター等の非ウイルスベクターの場合、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などの遺伝子導入法が知られている。
【0093】
形質転換細胞は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを安定的に発現する細胞（安定発現株）であってもよいし、一過性に発現する細胞（一過性発現細胞）であってもよい。「安定発現株」は、例えば、遺伝子導入によりコンストラクトに含まれる核酸が宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれたことが選択マーカーによって確認され、従って、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを安定して発現する細胞株をいう。「一過性発現細胞」は、コンストラクトに含まれる核酸が宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれたことが確認されておらず、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを安定して発現することが確認できていない細胞を意味する。
【0094】
本発明の形質転換細胞は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇している、並びに／或いは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇している、という特徴を有する。「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇している」とは、従来技術を用いてＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現させた場合と比較して、その発現量が上昇していることを意味する。「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇している」とは、本発明前の従来技術を用いてＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現させた場合と比較して、そのリガンド物質への応答性が上昇していることを意味する。
【0095】
「従来技術」とは例えば、以下の態様を含む。
（１）共遺伝子導入
（１ａ）Ｇαタンパク質をコードする核酸を含むベクターと、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで宿主細胞をコトランスフェクトする；
（１ｂ）Ｇαタンパク質を安定発現させた細胞株を、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで形質転換する。
（２）ＩＲＥＳを含む共発現ベクター
５’側から順に、プロモーター － Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸 － ＩＲＥＳ － Ｇαタンパク質をコードする核酸を含む単一ベクターで形質転換する。
（１）共遺伝子導入
（１ａ）Ｇαタンパク質をコードする核酸を含むベクターと、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで宿主細胞をコトランスフェクトする；
（１ｂ）Ｇαタンパク質を安定発現させた細胞株を、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで形質転換する。
（２）ＩＲＥＳを含む共発現ベクター
５’側から順に、プロモーター － Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸 － ＩＲＥＳ － Ｇαタンパク質をコードする核酸を含む単一ベクターで形質転換する。
【0096】
本発明の形質転換細胞は、従来技術を用いてＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現させた場合と比較して、安定性が優れている。安定性とは、通常の細胞の培養条件における安定性、凍結保存等の保存条件における安定性を含む。例えば、本明細書の実施例において、凍結保存で１ヶ月程度保存した場合でも、リガンドに対する応答強度が凍結保存前と比較して０．８以上とほとんど低下しなかった。これに対し、共遺伝子導入（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｂｌｅ）では、リガンドに対する応答強度が凍結乾燥後に、０．６未満に低下していた。
【0097】
ＩＩＩ．物質の生理的応答の測定方法。
本発明はさらに、物質の生理的応答の測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する工程を含む。
本発明はさらに、物質の生理的応答の測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する工程を含む。
【0098】
「物質」は、Ｇタンパク質共役受容体に結合し作動薬となり得る物質であれば、特に限定されない。物質は、Ｇタンパク質共役受容体に構造変化を起こし、膜内側に結合しているＧタンパク質を活性化させてシグナル伝達を行うものであり、食品、飲料品等に含まれる化学物質、匂い分子、神経伝達物質、ホルモン等を含む。シグナルは、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、生理的応答を引き起こす。物質は、Ｇタンパク質共役受容体の種類に応じて異なる。
【0099】
一態様において、物質は、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である。
【0100】
「苦味物質」は、ヒトが苦味を感知できる物質であれば特に限定されない。例えば、安息香酸デナトニウム、ストリキニーネ、β－グルコピラノシド（サリシン（ｓａｌｉｃｉｎ））、アリストロキア酸、イソチオシアネート基を有する苦味物質（例えば、ファニルチオカルバミド（ＰＴＣ）、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ））、ジフェニドール、キニーネ、アブシンチン、デナトニウムを含む。
【0101】
「匂い物質」は、分子量３０から３００程度までの低分子化合物である。例えば、脳内ホルモンであるセロトニンの基本骨格はインドールという糞臭の物質であり、ドーパミンやアドレナリンの骨格は、バニラのにおいであるバニリンと似ている。揮発性という性質をもっている低分子有機化合物であればどんな物質でも匂い物質になりうる。匂いは、様々な食べ物、植物、動物から発せられ、嗅覚が退化したといわれている人間でも１万種類くらいは識別できるといわれている。「匂い物質」の例として、具体的な「匂い物質」の例として、麝香（ムスク）臭の主成分であるムスコン、霊猫香（シベット）香の主成分であるシベトンや、スミレの花の香りを醸し出すα－ヨノン、リラの花の香りの主成分α－テルピネオール、スペアミントの香りを成す（－）５Ｒ－カルボン、更に魚臭を成すメチルアミン、ジメチルアミンやトリメチルアミン等が挙げられる。
【0102】
「旨味物質」は、例えば、ヒトが旨味を感知できる物質であれば特に限定されない。例えば、グルタミン酸及びイノシン酸（ＩＭＰ）を含む。
【0103】
「甘味物質」は、例えば、ヒトが甘味を感知できる物質であれば特に限定されない。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、スクロース、マルトース、乳糖、水飴、異性化糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、イソマルトール、還元水飴、還元パラチノース、和三盆、黒糖、三温糖、蜂蜜、糖蜜、甘草抽出物及びメープルシロップなどの糖質系甘味料、及び、アスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）、サッカリン、ズルチン、ステビオシド、ステビア抽出物、グリチルリチン、アセスルファム－Ｋ、スクラロース（登録商標；三栄源エフ・エフ・アイ）、シクラメート（ｃｙｃｌａｍａｔｅ）、アリテーム、ネオテーム、ペリラルチン、モネリン、クルクリン（登録商標；ＡＤＥＫＡ）などの非糖質系甘味料が広く含まれる。
【0104】
「苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質の調節物質」とは、単独では、苦味、匂い、旨味、甘味を生じないが、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質と共に受容されることにより、各物質の味覚、嗅覚を増強、修飾、又は抑制するものである。
【0105】
例えば、「苦味物質の調節物質」には、ベネコートＢＭＩ（花王）、プロベネシド等が含まれる。「匂い物質の調節物質」には、嗅覚抑制剤である、２．４．６－トリクロロアニソール、ゲラニオール等が含まれる。「甘味物質の調節物質」には、甘味抑制物質ラクチゾール、甘味抑制物質ギムネマ酸、甘味修飾物質ネオクリン等が含まれる。
【0106】
本発明の形質転換細胞を用いてある物質の生理的応答を測定するためには、例えば、以下のようにして行う。
【0107】
本発明の形質転換細胞の所定の数を多数のウェル（２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴など）を有するマイクロプレートの各ウェルに撒き（例えば、１万～５０万個／ウェル）、所定の培地（例えば、ＤＭＥＭ培地）中で培養する。細胞培養後、特定の物質を添加した場合において、上記安定培養細胞株に発生した生理的応答を測定し、その測定結果に基づいて物質の生理的応答を評価する。生理的応答を測定は、物質の種類に応じて、Ｇタンパク質共役受容体の活性化に伴って変化する事象が適宜選択される。
【0108】
例えば、苦味受容体、甘味受容体、旨味受容体などの味覚受容体が活性化されると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ3（イノシトール三リン酸）、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。したがって、測定対象とする生理的応答としては、味覚受容体の活性化に伴って変化する細胞内のセカンドメッセンジャーの変化、細胞内のカルシウム濃度の変化などが挙げられる。よって、細胞内のセカンドメッセンジャー又はカルシウム濃度の変化を測定することによって、生理的応答を測定することが可能である。
【0109】
例えば、苦味、甘味又は旨味等の味覚刺激によって惹起される細胞内カルシウム濃度変化を、蛍光カルシウムインジケーターを用いることにより観察するカルシウムイメージング法で行うことができる。蛍光カルシウムインジケーターには、生理的に変化し得るカルシウム濃度において蛍光特性が変化すること、及びそのときの変化がカルシウム特異的に誘導されることが要求される。蛍光カルシウムインジケーターの例は、Ｆｌｕｏ－８（登録商標）（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１４ｎｍ）、Ｆｌｕｏ-４ ＡＭ（（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍ）、Ｆｕｒａ-２ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍ）を含む。
【0110】
匂い物質の生理的応答の測定は、例えば、匂い物質の生理応答測定には匂い物質の嗅覚刺激によって惹起される細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定する手法が用いられる。細胞内ｃＡＭＰを測定する方法としては、蛍光若しくはＨＲＰ等の酵素を標識したｃＡＭＰと抗ｃＡＭＰ抗体を用いた蛍光偏光イムノアッセイ又は競合型イムノアッセイ、あるいは、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の下流にルシフェラーゼを挿入したベクターを遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイにより測定する手法、などが挙げられる。
【0111】
本発明は、物質の生理的応答を測定するための本発明の記載の形質転換細胞の使用を含む。
【0112】
本発明は、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸とＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を、単一ベクター中に含む。よって、形質転換細胞におけるＧタンパク質αサブユニットタンパク質とＧタンパク質共役受容体タンパク質の発現量は正の相関関係があると推定される。本発明の形質転換細胞において、Ｇタンパク質共役受容体のＧタンパク質共役受容体作動薬に対する応答性とＧα作動薬に対する応答強度は高い正の相関性を示す（実施例７，図８）。従って、物質（Ｇタンパク質共役受容体作動薬）を添加した形質転換細胞において、Ｇタンパク質αサブユニットのＧα作動薬に対する応答強度を測定することにより、物質に対する生理応答強度を推測することも可能である。
【0113】
ＩＶ．物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット
本発明はさらにまた、本発明の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。
本発明はさらにまた、本発明の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。
【0114】
本発明のキットは、本発明の形質転換細胞の他に、物質の生理的応答の測定方法に使用するために必要な材料、使用説明書などを含むことができる。物質の生理的応答の測定方法に使用するために必要な材料とは、例えば、形質転換細胞を維持・培養するための培地、物質の生理的応答により生じたセカンドメッセンジャー又はカルシウムの濃度を測定するための試薬（例えば、カルシウム濃度を測定するための蛍光カルシウムインジケーター等）などである。
【0115】
本発明は、形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するための装置に関する。本発明の装置は、本発明のキット、物質の生理的応答により生じたセカンドメッセンジャー又はカルシウムの濃度を測定するための機器等を含む。
【0116】
苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質などの呈味物質に対する生理的応答を測定するための装置の例として、例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｅｎｓｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．により「人工脂質膜味覚センサー」が開発されている（http://www.insent.co.jp/products/taste#sensor#index.html）。この味覚センサーは、種々の呈味物質と静電相互作用や疎水性相互作用することによる人工脂質膜の膜電位の変位をセンサー出力として、コンピュータにより検知する、というものである。例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｅｎｓｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．より味認識装置TS-5000Zが販売されている。本発明の装置は、このようなセンサー中の人工脂質膜の代わりに、本発明の形質転換細胞を利用するものである。具体的には、本発明の形質転換細胞を、人工膜と置き換えて装置に固定し、物質を作用させ、細胞内のセカンドメッセンジャー又はカルシウム濃度の変化を測定することによって、物質の生理的応答を測定する。本発明の装置は、使用後、洗浄等により試験物質を除去することにより、繰り返し測定に使用することが可能である。
【実施例】
【0117】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【0118】
実施例１ コンストラクトの構成及び作製方法
本実施例では、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質を発現するためのコンストラクトを作製した。本発明のコンストラクトは、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質をコードする核酸を含む。
本実施例では、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質を発現するためのコンストラクトを作製した。本発明のコンストラクトは、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質をコードする核酸を含む。
【0119】
以下の３種類の遺伝子をそれぞれＰＣＲによって増幅した。
－５’末端にラットソマトスタチン受容体３（ｓｓｒ３）の開始コドンから１３５塩基目の遺伝子配列を、３’末端にＶ５エピトープ配列を付加したヒト苦味受容体（Ｔ２Ｒ１６）発現遺伝子（ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５）
なお、Ｖ５エピトープ配列は、Ｔ２Ｒのタンパク質発現量を調べるための抗体認識タグである（塩基配列：配列番号７６）；
－脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来のＩＲＥＳ；及び
－ヒトのＧタンパク質αサブユニットＧ１６の末端１２９塩基をラットのガストデューシン（Ｇｇｕｓｔ）の末端１２９塩基に置換したＧα１６／ｇｕｓｔ発現遺伝子（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３）（配列番号７７）。
－５’末端にラットソマトスタチン受容体３（ｓｓｒ３）の開始コドンから１３５塩基目の遺伝子配列を、３’末端にＶ５エピトープ配列を付加したヒト苦味受容体（Ｔ２Ｒ１６）発現遺伝子（ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５）
なお、Ｖ５エピトープ配列は、Ｔ２Ｒのタンパク質発現量を調べるための抗体認識タグである（塩基配列：配列番号７６）；
－脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来のＩＲＥＳ；及び
－ヒトのＧタンパク質αサブユニットＧ１６の末端１２９塩基をラットのガストデューシン（Ｇｇｕｓｔ）の末端１２９塩基に置換したＧα１６／ｇｕｓｔ発現遺伝子（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３）（配列番号７７）。
【0120】
得られた遺伝子断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに、挿入した。挿入順は以下の通りである。
本発明のベクター： Ｇα－Ｔ２Ｒ１６
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５
比較例のベクター： Ｔ２Ｒ１６－Ｇα
ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５ －ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
各ベクターの構成を図１に示す。
本発明のベクター： Ｇα－Ｔ２Ｒ１６
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５
比較例のベクター： Ｔ２Ｒ１６－Ｇα
ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５ －ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
各ベクターの構成を図１に示す。
【0121】
実施例２ 本発明のコンストラクトを含む安定発現株の作製
本実施例では、本発明のコンストラクト（Ｇα－Ｔ２Ｒ１６）を組み込み、苦味受容体Ｔ２Ｒ１６を安定に発現する細胞株（Ｔ２Ｒ１６安定発現株）を作製した。
本実施例では、本発明のコンストラクト（Ｇα－Ｔ２Ｒ１６）を組み込み、苦味受容体Ｔ２Ｒ１６を安定に発現する細胞株（Ｔ２Ｒ１６安定発現株）を作製した。
【0122】
具体的には、培養容器に１×１０6個播種したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（理化学研究所より入手）に、実施例１で作製したＧα－Ｔ２Ｒ１６及びＴ２Ｒ１６－Ｇαの各プラスミドベクター５μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて遺伝子導入した。４８時間培養後、培地に１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを添加し１５日程度培養することで薬剤耐性スクリーニングを行った。薬剤耐性を獲得した細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに１個ずつとなるよう播種することでクローニングした。１０日程度培養後、安定発現株を取得した。
【0123】
実施例３ 苦味物質に対する安定発現株の応答測定
（１）Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の応答測定
本実施例において、実施例２のＴ２Ｒ１６安定発現株の苦味物質に対する応答を測定した。
（１）Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の応答測定
本実施例において、実施例２のＴ２Ｒ１６安定発現株の苦味物質に対する応答を測定した。
【0124】
実施例２に記載の方法に基づき作製したＴ２Ｒ１６安定発現株を、９６ウェルプレートに２×１０4個／ウェルでそれぞれ播種した。細胞の培養培地には、緑色蛍光カルシウムインジケーターＦｌｕｏ－８（登録商標）（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）を含ませており、細胞株へのＦｌｕｏ－８の取り込みを調べた。Ｆｌｕｏ－８（登録商標）は、細胞内のカルシウム動態の検出に適しており、ＧＰＣＲ活性の示標となる。
【0125】
Ｆｌｕｏ－８（登録商標）を取り込ませた細胞を４９０ｎｍで励起させ、５１４ｎｍの蛍光強度を測定した。測定中にＴ２Ｒ１６作動薬であるサリシン（１０、３、１、０．３、又は０．１ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ２Ｒ１６の応答強度として算出した。結果を図２に示す。
【0126】
図２に示されるように、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６プラスミドを含む細胞株のみサリシンに対する応答を示した。Ｔ２Ｒ１６－Ｇαプラスミドを含む細胞株ではサリシンに対する応答はほとんど観測されず、応答を示すクローンを単離することができなかった。
【0127】
（２）Ｇα－Ｔ２Ｒ４０及びＧα－Ｔ２Ｒ４３の安定発現株の応答測定
Ｔ２Ｒ１６以外の苦味受容体のサブタイプＴ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３についても、実施例３（１）と同様に、安定発現株の応答を測定した。
Ｔ２Ｒ１６以外の苦味受容体のサブタイプＴ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３についても、実施例３（１）と同様に、安定発現株の応答を測定した。
【0128】
具体的には、実施例１、実施例２に記載の方法と同様に、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ４０／Ｖ５を含む）及びＧα－Ｔ２Ｒ４３安定発現株（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ４３／Ｖ５を含む）を作製した。
【0129】
実施例２に記載の方法と同様の方法を用いて、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株及びＧα－Ｔ２Ｒ４３安定発現株を作製した。これらの細胞株にそれぞれの作動薬（Ｔ２Ｒ４０：ジフェニドール，Ｔ２Ｒ４３：キニーネ）を１００μＭ又は３００μＭ作用させ、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３の応答強度として算出した。結果を図３に示す。Ｔ２Ｒ４０－Ｇα、Ｔ２Ｒ４３－Ｇαと比較して、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０及びＧα－Ｔ２Ｒ４３が各々の作動薬に対し高い応答強度を示した。
【0130】
実施例４ 苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定
９６ウェルプレートに２×１０4個播種したＨＥＫ２９３Ｔに、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６及びＴ２Ｒ１６－Ｇαの各プラスミドベクター０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用いて遺伝子導入した。３０時間培養後、実施例３（１）と同様の手法を用いてサリシンに対する応答強度を測定した（サリシンの添加後４０秒間における蛍光強度の最大値）。なお、実施例２のようなハイグロマイシンＢによる薬剤耐性スクリーニングは行っていない（一過性発現細胞）。
９６ウェルプレートに２×１０4個播種したＨＥＫ２９３Ｔに、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６及びＴ２Ｒ１６－Ｇαの各プラスミドベクター０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用いて遺伝子導入した。３０時間培養後、実施例３（１）と同様の手法を用いてサリシンに対する応答強度を測定した（サリシンの添加後４０秒間における蛍光強度の最大値）。なお、実施例２のようなハイグロマイシンＢによる薬剤耐性スクリーニングは行っていない（一過性発現細胞）。
【0131】
さらに、比較例としてＴ２Ｒ１６－Ｇα発現細胞以外に、以下の細胞も作製し、サリシンに対する応答を測定した。
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３発現遺伝子及びｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに組込んだＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３ｇｕｓｔ発現ベクターとｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現ベクターを計０．１μｇ同時に遺伝子導入し一過性発現させた細胞（コトランスフェクション）；並びに
実施例２と同様の手法を用いて作製したＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現株（ハイグロマイシンＢによる薬剤耐性スクリーニング済）に、０．１μｇのｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現ベクターを遺伝子導入し、一過性発現させた細胞（Ｇα ｓｔａｂｌｅ）。
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３発現遺伝子及びｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに組込んだＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３ｇｕｓｔ発現ベクターとｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現ベクターを計０．１μｇ同時に遺伝子導入し一過性発現させた細胞（コトランスフェクション）；並びに
実施例２と同様の手法を用いて作製したＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現株（ハイグロマイシンＢによる薬剤耐性スクリーニング済）に、０．１μｇのｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現ベクターを遺伝子導入し、一過性発現させた細胞（Ｇα ｓｔａｂｌｅ）。
【0132】
結果を図４に示す。図４の結果から分かるように、一過性発現系においてもＧα－Ｔ２Ｒ１６がＴ２Ｒ１６－Ｇαと比較して高い応答強度を示し、さらに、既報の一過性発現系（コトランスフェクション及びＧα ｓｔａｂｌｅ）と比較しても高い応答強度を示すことが確認された。
【0133】
実施例５ Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３及び苦味受容体Ｔ２Ｒ１６の発現量
一般的にＩＲＥＳを介したｍＲＮＡの翻訳は、５’末端からのキャップ依存的な翻訳と比較して低効率と考えられている。本実施例では、キャップ依存的翻訳とＩＲＥＳ依存的翻訳に関し、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３及び苦味受容体Ｔ２Ｒ１６の発現量を調べた。
一般的にＩＲＥＳを介したｍＲＮＡの翻訳は、５’末端からのキャップ依存的な翻訳と比較して低効率と考えられている。本実施例では、キャップ依存的翻訳とＩＲＥＳ依存的翻訳に関し、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３及び苦味受容体Ｔ２Ｒ１６の発現量を調べた。
【0134】
（１）Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量
実施例４で作製したＧα－Ｔ２Ｒ１６（本発明）、Ｔ２Ｒ１６－Ｇα、コトランスフェクションの一過性発現細胞に関し、Ｔ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノール（３μＭ）に対する応答強度を、実施例３の方法と同様に測定して比較した。その結果を図５に示す。
実施例４で作製したＧα－Ｔ２Ｒ１６（本発明）、Ｔ２Ｒ１６－Ｇα、コトランスフェクションの一過性発現細胞に関し、Ｔ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノール（３μＭ）に対する応答強度を、実施例３の方法と同様に測定して比較した。その結果を図５に示す。
【0135】
イソプロテレノールに対する応答強度は、Ｇα１６の発現量に比例すると考えられる。図５に示されるように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３がキャップ依存的に翻訳されるＧα－Ｔ２Ｒ１６、ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎと比較し、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３がＩＲＥＳを介して翻訳されるＴ２Ｒ１６－Ｇαの発現量が低いことが確認された。即ち、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であることが示された。
【0136】
（２）Ｔ２Ｒ１６の発現量
Ｔ２Ｒ１６－Ｇα、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６（本発明）及びｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５のみ（Ｔ２Ｒ１６ ｓｉｎｇｌｅ）を一過性発現させた細胞を用い、Ｉｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によりＴ２Ｒ１６の発現量を比較した。Ｉｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにはＩｎ Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＯＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｔ２Ｒ１６の検出にはＣ末端に付加したＶ５エピトープを認識する抗Ｖ５－ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。Ｔ２Ｒ１６の相対的発現量はＨＲＰ基質の発色を４５０ｎｍの吸光度を測定することで取得した。
Ｔ２Ｒ１６－Ｇα、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６（本発明）及びｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５のみ（Ｔ２Ｒ１６ ｓｉｎｇｌｅ）を一過性発現させた細胞を用い、Ｉｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によりＴ２Ｒ１６の発現量を比較した。Ｉｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにはＩｎ Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＯＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｔ２Ｒ１６の検出にはＣ末端に付加したＶ５エピトープを認識する抗Ｖ５－ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。Ｔ２Ｒ１６の相対的発現量はＨＲＰ基質の発色を４５０ｎｍの吸光度を測定することで取得した。
【0137】
結果を図６に示す。この結果、Ｔ２Ｒ１６がＩＲＥＳを介して翻訳されるＧα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６発現量が、キャップ依存的にＴ２Ｒ１６が翻訳されるＴ２Ｒ１６－Ｇα及びＴ２Ｒ１６ ｓｉｎｇｌｅより高いことが確認された。即ち、Ｔ２Ｒ１６の発現量は、キャップ依存的＜ＩＲＥＳ依存的であることが示された。同様の結果は、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３よりもＴ２Ｒとの結合性が弱いＧα１６をもちいた場合にも得られた（データ示さず）。
【0138】
よって、本発明のＧα－Ｔ２Ｒ１６は、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（及びＧα１６）、Ｔ２Ｒ１６共に高発現させることが示された。さらに、苦味受容体のＴ２Ｒ１６以外のサブタイプ（Ｔ２Ｒ４０及びＴ２Ｒ４３）でも同様の結果が観察された（データ示さず）。
【0139】
実施例６ Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の保存安定性
本実施例では、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の凍結保存前後の応答強度を調べた。
本実施例では、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の凍結保存前後の応答強度を調べた。
【0140】
本実施例のＧα－Ｔ２Ｒ１６は、実施例２のＧα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株と同様に作成したが、発現ベクターとして、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用い、「ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５」の代わりに、「ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６」（Ｖ５無し）を挿入した。また、薬剤耐性スクリーニングは、ハイグロマイシンＢの代わりに１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで行った。
【0141】
比較例として、実施例２と同様の手法を用いて作製したＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現株（ピューロマイシンによる薬剤耐性スクリーニング済）に、さらに５μｇのｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６発現ベクターを遺伝子導入し、次いで、ピューロマイシンによる薬剤耐性スクリーニングを行うことにより作成した、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現＋Ｔ２Ｒ１６安定発現の安定発現細胞株（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｂｌｅ）を用いた。
【0142】
細胞株の凍結保存の前後に、実施例３と同様にサリシン（１又は０．１ｍＭ）に対する応答強度を調べた。凍結保存にはＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社）を用い、液体窒素下で、１ヶ月保存した。凍結保存後の応答強度は、凍結保存した細胞を常温に戻し、２回以上継代を行った後に測定した。結果を図７に示す。
【0143】
その結果、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株では凍結による影響はほとんど確認されなかった。これに対し、Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｂｌｅは、凍結後に著しく応答強度が低下する細胞株が散見された。結果の一例を図７に示す。図７において、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株では応答強度の凍結後／凍結前の比率がサリシン濃度１ｍＭ、０．１ｍＭのいずれの場合も、０、８以上であった。これに対し、Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｂｌｅは０．６未満であった（特に、サリシン０．１ｍＭの場合０．４以下）。
【0144】
実施例７ Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株のＴ２Ｒ４０作動薬に対する応答強度とＧα作動薬に対する応答強度
本実施例では、本発明のＧα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株について、Ｔ２Ｒ４０作動薬（ジフェニドール）に対する応答強度とＧα作動薬（イソプロテレノール）に対する応答強度の相関を調べた。
本実施例では、本発明のＧα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株について、Ｔ２Ｒ４０作動薬（ジフェニドール）に対する応答強度とＧα作動薬（イソプロテレノール）に対する応答強度の相関を調べた。
【0145】
実施例３（２）に記載の通り、実施例１、実施例２に記載の方法と同様の方法を用いてＧα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株を作製し、１５個クローニングした。１５個のクローンについて、イソプロテレノール（１０μＭ）及びジフェニドール（３００μＭ）に対する応答の相関を図８に示す。この結果、Ｔ２Ｒ４０作動薬であるジフェニドールとＧα１６作動薬であるイソプロテレノールへの応答に高い相関が得られた。
【0146】
よって、本発明のコンストラクトを用いる方法では、Ｔ２ＲあるいはＧαサブユニットのいずれかタンパク質に関する１回の評価のみで、ＧαサブユニットとＴ２Ｒの双方のタンパク質を発現する所望の細胞株を得ることができる。これに対し、従来法を用いる場合、ＧαサブユニットとＴ２Ｒの各タンパク質を発現する遺伝子を順に細胞に導入し、その度に、各タンパク質が安定して発現しているかを評価しながらスクリーニングを進める必要があった。具体的には、Ｇα安定発現株を作製しスクリーニング（評価１）後、Ｔ２Ｒタンパク質をコードする遺伝子を導入し、Ｇαタンパク質の（高）発現を維持しつつ（評価２）、かつＴ２Ｒタンパク質も（高）発現する（評価３）細胞株を取得する。即ち、所望の細胞株を得るのに３回の評価が必要である。
【0147】
本発明により、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株を得るための作業効率が著しく向上した。
【0148】
実施例８ 甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系１：Ｔ１Ｒ２の検討
甘味受容体は、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２種類のサブユニットの組み合わせからなる代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である。本実施例では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系のＴ１Ｒ２について検討した。
甘味受容体は、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２種類のサブユニットの組み合わせからなる代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である。本実施例では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系のＴ１Ｒ２について検討した。
【0149】
（１）発現ベクターの作製
ヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３、並びに、実施例１に記載のＩＲＥＳ及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα）を準備した。それらを以下の通り、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、各コンストラクトを得た。
コンストラクトＧα－Ｔ１Ｒ２
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－Ｔ１Ｒ２／Ｖ５
コンストラクトＴ１Ｒ２－Ｇα
ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ２／Ｖ５－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
コンストラクトＴ１Ｒ３
Ｔ１Ｒ３
ヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３、並びに、実施例１に記載のＩＲＥＳ及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα）を準備した。それらを以下の通り、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、各コンストラクトを得た。
コンストラクトＧα－Ｔ１Ｒ２
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－Ｔ１Ｒ２／Ｖ５
コンストラクトＴ１Ｒ２－Ｇα
ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ２／Ｖ５－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
コンストラクトＴ１Ｒ３
Ｔ１Ｒ３
【0150】
（２）Ｔ１Ｒ２の発現量
実施例４に記載された方法と同様の方法により、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）を得た。比較例として、Ｔ１Ｒ２－Ｇα及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３）を得た。
実施例４に記載された方法と同様の方法により、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）を得た。比較例として、Ｔ１Ｒ２－Ｇα及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３）を得た。
【0151】
実施例５（２）と同様の方法により、Ｉｎ Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＯＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたＩｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によりＴ１Ｒ２の発現量を調べた。結果を図９に示す。Ｔ１Ｒ２の発現量は、「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」が「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」よりも高い傾向を示した。苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＜ＩＲＥＳ依存的であった。
【0152】
（３）Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量
「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」と「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」について、実施例５（１）と同様の方法により、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量を調べた。Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノールは１０μＭ用いた。図１０に示すように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３の方が高いことが示された。苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」と「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」について、実施例５（１）と同様の方法により、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量を調べた。Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノールは１０μＭ用いた。図１０に示すように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３の方が高いことが示された。苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
【0153】
（４）Ｔ１Ｒ２作動薬に対する応答
「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」と「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」について、Ｔ１Ｒ２作動薬に対する応答を調べた。アスパルテーム（１０ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ１Ｒ２の応答強度として算出した。
「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」と「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」について、Ｔ１Ｒ２作動薬に対する応答を調べた。アスパルテーム（１０ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ１Ｒ２の応答強度として算出した。
【0154】
比較例として、「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」の他に、「Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の各タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ含む３種類のベクターをコトランスフェクションした細胞（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３＋Ｇα）」、並びに、「Ｔ１Ｒ２－ＧαとＴ１Ｒ３－Ｇαをコトランスフェクションした細胞（Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３－Ｇα）」を用いた。図１１に示すように、「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」がＴ１Ｒ２作動薬に対する最も高い応答を示した。
【0155】
実施例９ 甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系２：Ｔ１Ｒ３の検討
本実施例では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系のＴ１Ｒ３について検討した。
本実施例では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系のＴ１Ｒ３について検討した。
【0156】
（１）発現ベクターの作製
ヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３、並びに、実施例１に記載のＩＲＥＳ及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα）を準備した。それらを以下の通り、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、各コンストラクトを得た。
コンストラクトＧα－Ｔ１Ｒ３
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ３／Ｖ５
コンストラクトＴ１Ｒ３－Ｇα
ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ３／Ｖ５－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
コンストラクトＴ１Ｒ２
Ｔ１Ｒ２
ヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３、並びに、実施例１に記載のＩＲＥＳ及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα）を準備した。それらを以下の通り、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、各コンストラクトを得た。
コンストラクトＧα－Ｔ１Ｒ３
Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ３／Ｖ５
コンストラクトＴ１Ｒ３－Ｇα
ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ３／Ｖ５－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
コンストラクトＴ１Ｒ２
Ｔ１Ｒ２
【0157】
（２）Ｔ１Ｒ３の発現量
実施例４に記載された方法と同様の方法により、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）を得た。比較例として、Ｔ１Ｒ３－Ｇα及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２）を得た。
実施例４に記載された方法と同様の方法により、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）を得た。比較例として、Ｔ１Ｒ３－Ｇα及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２）を得た。
【0158】
実施例５（２）と同様の方法により、Ｉｎ Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＯＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたＩｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によりＴ１Ｒ３の発現量を調べた。結果を図１２に示す。「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」の方が「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」よりも、Ｔ１Ｒ３の発現量が多かった。Ｔ１Ｒ３の発現量は、キャップ依存的＜ＩＲＥＳ依存的であった。
【0159】
（３）Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量
「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」と「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」について、実施例５（１）と同様の方法により、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量を調べた。Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノールは１０μＭ用いた。図１３に示すように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２の方が高く、苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」と「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」について、実施例５（１）と同様の方法により、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量を調べた。Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノールは１０μＭ用いた。図１３に示すように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２の方が高く、苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
【0160】
実施例９（２）の結果と併せると、本発明のＧα－Ｔ１Ｒ３は、Ｔ１Ｒ３、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３共に高発現させることが示された。
【0161】
（４）Ｔ１Ｒ３作動薬に対する応答
「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」と「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」について、Ｔ１Ｒ３作動薬に対する応答を調べた。シクラメート（１０ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ１Ｒ３の応答強度として算出した。
「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」と「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」について、Ｔ１Ｒ３作動薬に対する応答を調べた。シクラメート（１０ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ１Ｒ３の応答強度として算出した。
【0162】
比較例として、「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」の他に、「Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の各タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ含む３種類のベクターをコトランスフェクションした細胞」、並びに、「Ｔ１Ｒ２－ＧαとＴ１Ｒ３－Ｇαをコトランスフェクトした細胞」を用いた。図１４に示すように、「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」がＴ１Ｒ３作動薬に対する最も高い応答を示した。
【0163】
実施例１０ ＩＲＥＳを介したタンパク質の発現
ＩＲＥＳがタンパク質の発現量に与える効果を調べるために、ＧＰＣＲタンパク質以外のタンパク質をＩＲＥＳの上流及び下流で発現させた。タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）（塩基配列：配列番号７８（ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＥＵ０５６３６３．１）；アミノ酸配列：配列番号７９）を用いた。ｐｃＤＮＡベクターに以下のＡ－Ｄの核酸配列を含むコンストラクトを作製し、細胞株ＨＥＫ２９３Ｔに遺伝子導入し、一過性発現させた。
Ａ： ｓｓｒ－ ＥｍＧＦＰ － ＩＲＥＳ－ Ｇα
Ｂ： ＥｍＧＦＰ － ＩＲＥＳ － Ｇα
Ｃ： Ｇα － ＩＲＥＳ － ｓｓｒ － ＥｍＧＦＰ
Ｄ： Ｇα － ＩＲＥＳ － ＥｍＧＦＰ
コントロール： 挿入遺伝子を含まないｐｃＤＮＡベクター
ＩＲＥＳがタンパク質の発現量に与える効果を調べるために、ＧＰＣＲタンパク質以外のタンパク質をＩＲＥＳの上流及び下流で発現させた。タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）（塩基配列：配列番号７８（ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＥＵ０５６３６３．１）；アミノ酸配列：配列番号７９）を用いた。ｐｃＤＮＡベクターに以下のＡ－Ｄの核酸配列を含むコンストラクトを作製し、細胞株ＨＥＫ２９３Ｔに遺伝子導入し、一過性発現させた。
Ａ： ｓｓｒ－ ＥｍＧＦＰ － ＩＲＥＳ－ Ｇα
Ｂ： ＥｍＧＦＰ － ＩＲＥＳ － Ｇα
Ｃ： Ｇα － ＩＲＥＳ － ｓｓｒ － ＥｍＧＦＰ
Ｄ： Ｇα － ＩＲＥＳ － ＥｍＧＦＰ
コントロール： 挿入遺伝子を含まないｐｃＤＮＡベクター
【0164】
４８７ｎｍの波長で励起し、５０９ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。蛍光強度はＥｍＧＦＰの発現量に比例する。結果を図１５に示す。ＥｍＧＦＰ遺伝子がＩＲＥＳ上流に配置された場合（Ａ、Ｂ）の方が下流に配置した場合（Ｃ、Ｄ）よりも、ＥｍＧＦＰタンパク質の発現量が高かった。ＥｍＧＦＰタンパク質の発現量は、Ｇαタンパク質と同様にキャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
【0165】
実施例１１ ｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を一過性発現させた細胞におけるＴ２Ｒ１６発現量
本実施例では、ｐＥＡＫ１０－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６を導入し、一過性発現させたＨＥＬ２９３Ｔ細胞におけるＴ２Ｒ１６発現量を調べた。以下、実施例１１－１５において、「ＩＲＥＳ」の記載を省略する場合がある。
本実施例では、ｐＥＡＫ１０－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６を導入し、一過性発現させたＨＥＬ２９３Ｔ細胞におけるＴ２Ｒ１６発現量を調べた。以下、実施例１１－１５において、「ＩＲＥＳ」の記載を省略する場合がある。
【0166】
Ｔ２Ｒ１６－ＩＲＥＳ－Ｇα、Ｇα－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６をコードする遺伝子配列を、ｐＥＡＫ１０ベクター（Ｅｄｇｅ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にサブクローニングし、発現ベクターｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を作製した。ｐＥＡＫ１０ベクターは、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。作製した発現ベクターを実施例４と同様の方法によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、これらを一過性発現させた細胞を作製した。
【0167】
実施例５（２）と同様の手法を用いて、Ｉｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法により一過性発現細胞のＴ２Ｒ１６の発現量を評価した。コントロールとして、遺伝子を挿入していないｐＥＡＫ発現ベクタ－を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。検出には実施例５（２）と同様に、Ｃ末端に付加したＶ５エピトープを認識する抗Ｖ５－ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
【0168】
図１６に示されるように、発現ベクターｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を導入した細胞が、発現ベクターｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－Ｇαを導入した細胞より高いＴ２Ｒ１６発現量を示した。このことから、本発明の効果はプロモーターや非翻訳領域といったベクター固有の遺伝子配列に影響を受けないことが示された。
【0169】
実施例１２ 苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定（２）
本実施例では、７種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）に関し、苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定を行った。
本実施例では、７種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）に関し、苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定を行った。
【0170】
実施例４における、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６をコードする遺伝子の代わりに、表５に示す７種類のＴ２Ｒサブタイプをコードする遺伝子の各々を含む７種類の発現ベクターを作製し、実施例４と同様の方法により、各サブタイプに対する既知作動薬（表５）に対する一過性発現細胞の応答を測定した。
【0171】
【表5】
【0172】
その結果、いずれのＴ２Ｒサブタイプも作動薬に対する応答を示した（図１７）。
【0173】
実施例１３ 苦味物質に対する安定発現細胞の応答測定（２）
本実施例では、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）に関し、苦味物質に対する安定発現細胞の応答測定を行った。
本実施例では、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）に関し、苦味物質に対する安定発現細胞の応答測定を行った。
【0174】
実施例１、２におけるＧα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６をコードする遺伝子の代わりに、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）をコードする遺伝子を含む発現ベクターＧα－Ｔ２Ｒ３８を作製し、実施例１、２と同様の方法により安定発現株を作製した。
【0175】
続いて実施例３と同様の方法を用いて、Ｔ２Ｒ３８の既知の作動薬６－ｎ－プロピルチオウラシル（１０００μＭ，３００μＭ）に対する応答を測定した。コントロールとして、発現ベクターＧα－Ｔ２Ｒ３８を組み込まない細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）を用いた。その結果、６－ｎ－プロピルチオウラシル（１０００μＭ，３００μＭいずれも場合も）に対する応答を示した（図１８）。
【0176】
実施例１４ 苦味受容体の一過性発現細胞における発現量
本実施例では１４種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）の一過性発現細胞における発現量を調べた。
本実施例では１４種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）の一過性発現細胞における発現量を調べた。
【0177】
実施例４における、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６をコードする遺伝子の代わりに、表６に示す１４種類のＴ２Ｒサブタイプの遺伝子の各々をコードする遺伝子を含む１４種類の発現ベクターを作製し、実施例４と同様の方法により各Ｔ２ＲおよびＧαをそれぞれ一過性発現させた細胞を作製した。
【0178】
【表6】
【0179】
次いで、実施例５（２）と同様の手法を用いたＩｎ ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法により各細胞のＴ２Ｒの発現量を測定した。得られた各Ｔ２Ｒの発現量を、実施例１２にて既知の作動薬への応答が確認されたＧα－Ｔ２Ｒ４の一過性発現細胞のＴ２Ｒ４発現量と比較した。その結果、１４種類全てにおいてＴ２Ｒ４以上のＴ２Ｒ発現量を示した（図１９）。この結果から、１４種類のＴ２Ｒ全てにおいて応答測定を行うに十分なＴ２Ｒ発現量を有していることが示された。
【0180】
実施例１５ 嗅覚受容体の一過性発現細胞における応答測定と発現量
本実施例では、嗅覚受容体（ＯＲ３Ａ１）の一過性発現細胞における応答測定と発現量を調べた。
本実施例では、嗅覚受容体（ＯＲ３Ａ１）の一過性発現細胞における応答測定と発現量を調べた。
【0181】
を調べた。
実施例１と同様の方法により、ＯＲ３Ａ１のＮ末端にヒトロドプシンのＮ末端２１アミノ酸（Ｒｈｏ）を付加したＲｈｏ－ＯＲ３Ａ１、並びにＧαｏｌｆをコードする遺伝子をＩＲＥＳと共にｐｃＤＮＡベクターに導入した発現ベクターＯＲ３Ａ１－ＧαｏｌｆおよびＧαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を作製した。これらの発現ベクターを用いて、実施例４と同様の方法によりＨＥＫ２９３Ｔに一過性発現させた細胞を作製した。コントロールとして、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別にｐｃＤＮＡに導入し、ＨＥＫ２９３Ｔに共遺伝子導入したものを用いた。
実施例１と同様の方法により、ＯＲ３Ａ１のＮ末端にヒトロドプシンのＮ末端２１アミノ酸（Ｒｈｏ）を付加したＲｈｏ－ＯＲ３Ａ１、並びにＧαｏｌｆをコードする遺伝子をＩＲＥＳと共にｐｃＤＮＡベクターに導入した発現ベクターＯＲ３Ａ１－ＧαｏｌｆおよびＧαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を作製した。これらの発現ベクターを用いて、実施例４と同様の方法によりＨＥＫ２９３Ｔに一過性発現させた細胞を作製した。コントロールとして、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別にｐｃＤＮＡに導入し、ＨＥＫ２９３Ｔに共遺伝子導入したものを用いた。
【0182】
次いで、作製した細胞上にＯＲ３Ａ１に対する既知の作動薬であるヘリオナールを添加した（１００μＭ、３０μＭ）。ヘリオナールの添加より２０分後ＯＲ３Ａ１の応答に伴い産生されたｃＡＭＰの量を、ｃＡＭＰ－ＧｌｏＭａｘ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた発光測定により検出した。その結果、発現ベクターＧαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を導入した細胞で、１００μＭのヘリオナールの添加に伴いｃＡＭＰの増加を示した。発現ベクターＯＲ３Ａ１－Ｇαｏｌｆを導入した場合、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別に導入した場合は、いずれもヘリオナールの添加に伴う応答（ｃＡＭＰの増加）は観察されなかった（図２０）。
【0183】
さらに、Ｒｈｏ－ＯＲ３Ａ１とＧαｏｌｆの発現量を抗Ｒｈｏ抗体（Ｍｅｒｃｋ）および抗Ｇαｏｌｆ抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ）を用いたＩｎ Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡにより比較した。コントロールとしては、いずでの遺伝子も挿入していないｐｃＤＮＡを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。その結果、Ｇαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を導入した細胞の方が、ＯＲ３Ａ１－Ｇαｏｌｆを導入した細胞と比較して高いＧαｏｌｆ、ＯＲ３Ａ１発現量を示した（図２１）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】