特許 7175769 改善された養子Ｔ細胞療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-11

(45)【発行日】2022-11-21

(54)【発明の名称】改善された養子Ｔ細胞療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20221114BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20221114BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221114BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221114BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221114BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20221114BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20221114BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20221114BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 T ZNA

A61K35/17

A61K39/395 E

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

C07K16/28

C07K16/30

C07K16/46

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2018568679

(86)(22)【出願日】2017-06-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-10-03

(86)【国際出願番号】 EP2017066375

(87)【国際公開番号】W WO2018002358

(87)【国際公開日】2018-01-04

【審査請求日】2020-06-18

(31)【優先権主張番号】16177203.3

(32)【優先日】2016-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】306021192

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(73)【特許権者】

【識別番号】514196857

【氏名又は名称】ルードヴィッヒ－マクシミリアン－ユニヴェルシタート ミュンヘン

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】サストマン， クラウディオ

(72)【発明者】

【氏名】ニーダーフェルナー， ゲルハルト

(72)【発明者】

【氏名】ガイガー， マルティナ

(72)【発明者】

【氏名】エンドレス， シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】コボルト， ゼバスティアン

【審査官】菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５０６９５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０９０３６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Drug Delivery System, 2013, 28-1, pp.35-44

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ３５／１７

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ０７Ｋ １６／３０

Ｃ０７Ｋ １６／４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）処置される対象から得られたＴ細胞に形質導入するための、融合タンパク質をコードする核酸分子であって、以下のドメイン：
（１）前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、
（２）膜貫通アンカリングドメイン、及び
（３）シグナル伝達刺激ドメイン
を有する融合タンパク質をコードする核酸分子であって、前記シグナル伝達受容体の細胞外ドメインがＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインであり、前記膜貫通アンカリングドメインがＣＤ２８の膜貫通アンカリングドメインであり、前記シグナル伝達刺激ドメインがＣＤ３のシグナル伝達刺激ドメインである、核酸分子と、
（Ｂ）三価の二重特異性抗体分子であって、
（ｉ）（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む三価の二重特異性抗体分子と
を含むキット。

【請求項2】

前記融合タンパク質が、少なくとも１つのシグナル伝達共刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

対象を処置するための医薬であって、
（ｉ）請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む三価の二重特異性抗体分子を含み、請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、医薬。

【請求項4】

薬学的組成物であって、
（ｉ）請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む、三価の二重特異性抗体分子を含み、請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、薬学的組成物。

【請求項5】

対象の悪性疾患を処置するための医薬であって、
（ｉ）請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む、三価の二重特異性抗体分子を含み、請求項１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、医薬。

【請求項6】

前記悪性疾患が、上皮由来、内皮由来、又は中皮由来のがん、及び血液がんから選択される、請求項５に記載の医薬。

【請求項7】

腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ－２、ＣＡ－１２－５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ、（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ、トランスフェリン受容体、テネイシン、及びＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）からなる群から選択される、請求項１若しくは２に記載のキット、請求項４に記載の薬学的組成物、又は請求項３、５及び６のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項8】

前記形質導入されたＴ細胞が、前記Ｔ細胞上に天然に存在するＴ細胞受容体、及び／又は前記Ｔ細胞に遺伝子導入されたＴ細胞受容体をさらに含む、請求項１、２、及び７のいずれか一項に記載のキット、請求項４若しくは７に記載の薬学的組成物、又は請求項３及び５から７のいずれか一項に記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、融合タンパク質をトランスフェクト／形質導入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞であって、融合タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する／これと相互作用する三価の二重特異性抗体分子の使用により動員されるＴ細胞に関する。より正確に述べると、本発明は、本発明の核酸分子、ベクター、及び／又は融合タンパク質、ならびに本発明の、三価の二重特異性抗体分子を含むキットに関する。本発明のさらなる態様は、融合タンパク質のほか、三価の二重特異性抗体分子もコードする核酸分子を含む発現ベクターである。さらに、本発明の、三価の二重特異性抗体分子、及び前記三価の二重特異性抗体分子を含む医薬／薬学的組成物を作製するためのプロセスについても記載する。本発明はまた、特定の疾患を処置するための方法における前記三価の二重特異性抗体分子の使用、ならびに本発明の融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与される、前記三価の二重特異性抗体分子を含む薬学的組成物／医薬も提供する。本発明はまた、特定の疾患を処置するための方法も提供する。

【背景技術】

【0002】

養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、がん特異的Ｔ細胞を使用する、強力な処置法である（Rosenberg及びRestifo、Science、348 (6230) (2015)、62-68）。ＡＣＴは、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を使用する遺伝子操作により特異的とされた、天然に存在する腫瘍特異的細胞又はＴ細胞を使用しうる（Rosenberg及びRestifo、Science、348 (6230) (2015)、62-68）。ＡＣＴは、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、又はメラノーマなど、進行性疾患及び他の形で処置不応性の疾患を患う患者であってもなお処置し、これらの患者において寛解を誘導することに成功しうる（Dudleyら、J Clin Oncol、26 (32) (2008)、5233-5239；Gruppら、N Engl J Med、368 (16) (2013)、1509-1518；Kochenderferら、J Clin Oncol.、(2015) 33 (6): 540-549、doi:10.1200/JCO.2014.56.2025.、Epub、2014年8月25日）。しかし、長期にわたる利益が、患者の小さなサブセットに限られる一方で、大半の患者は、再発し、それらの不応性疾患に屈するであろう。

【0003】

ＡＣＴの成功には、Ｔ細胞の、腫瘍細胞又は腫瘍組織へのアクセスが必須であると考えられている。したがって、Ｔ細胞の侵入を可能とする方法を、開発及び実施することが必要である（Gattinoniら、Nat Rev Immunol、6 (5) (2006)、383-393）。現在、Ｔ細胞浸潤の増強を達成するのに最も有効な方法は、腫瘍組織を透過化し、血管系をリモデリングし、抑制性細胞を枯渇させる、全身照射である（Dudleyら、J Clin Oncol、23 (10) (2005)、2346-2357）。この方法は、臨床治験において、有効性を示しているが、その非特異的性格は、重度の副作用を誘導することから、その適応可能性は制限され、より特異的な方法が求められている（Dudleyら、J Clin Oncol、23 (10) (2005)、2346-2357）。

【0004】

加えて、メラノーマ治療のための、抗ＣＴＬＡ－４又は抗ＰＤ１抗体などの阻害剤の承認は、処置環境及び転移性疾患を伴う患者の転帰を一変させた（Hodiら、N Engl J Med、363 (8) (2010)、711-723；Robertら、N Engl J Med、372 (4) (2015)、320-330）。これらのモダリティーの両方の組合せは、無進行生存率及び全生存の潜在的な延長により例示される通り、より画期的な応答の見込みを有する（Larkinら、N Engl J Med、373 (1) (2015)、23-34）。しかし、大半ではないにせよ、実質量の患者は、利益を得ないか、又は再発することから、さらなる処置選択肢が求められる。

【0005】

メラノーマ治療のためのＴ細胞の価値は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用により、さらに裏付けられており、全身照射と組み合わせた場合、処置される患者のうちの７７％という、比類のない奏功率を誘導する（Dudleyら、J Clin Oncol、26 (32) (2008)、5233-5239；Rosenbergら、Clin Cancer Res、17 (13) (2011)、4550-4557）。多数の患者が、治癒したと考えられるが、大半は、再発し、それらの疾患に屈することから、大半のメラノーマの、Ｔ細胞の攻撃に対する、主要な感受性は指し示されるが、抗腫瘍応答を持続させ、再発を防止するための、さらなる方法も求められる。

【0006】

近年、マーカー抗原を形質導入された抗原特異的Ｔ細胞と、四価の二重特異性抗体分子との組合せは、腫瘍認識を増強し、腫瘍コントロールの延長を媒介するが、局所的な免疫抑制及びＴ細胞の枯渇に、潜在的に起因して、腫瘍の根絶には失敗することが示された（国際公開第２０１３／１１３６１５号；Koboldら、J Natl Cancer Inst、107 (1) (2015)、364；Koboldら、J Natl Cancer Inst、107 (8) (2015)、1-10；Koboldら、Journal for ImmunoTherapy of Cancer、2 (増刊2号): p42 (2014)）。しかし、Ｋｏｂｏｌｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、２（増刊２号）：ｐ４２（２０１４）において記載されている二重特異性抗体分子は、完全に構造的特徴を明らかにされているわけでも、寄託されているわけでもない。国際公開第２０１３／１１３６１５号；Ｋｏｂｏｌｄら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、１０７（１）（２０１５）、３６４；Ｋｏｂｏｌｄら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、１０７（８）（２０１５）１－１０；Ｋｏｂｏｌｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、２（増刊２号）：ｐ４２（２０１４）において記載されている方法もまた、Ｔ細胞療法が、ＭＨＣ拘束に依存し、さらなるＴ細胞刺激を可能としないという不都合を有する。さらに、米国特許出願第２０１０／０２５６３４０号は、三価の二重特異性抗体分子の構築についても開示している。しかし、米国特許出願第２０１０／０２５６３４０号は、いずれの箇所でも、三価の二重特異性抗体分子の、融合タンパク質を形質導入したＴ細胞を、がん細胞に特異的に動員するためのツールとしての使用について記載していない。さらに、二重特異性抗体分子の、融合タンパク質を形質導入されたＴ細胞との組合せについても、記載されている（Urbanskaら、Journal of Translational Medicine、12 (347) (2014)、doi:10.1186/12967-014-0347-2）。しかし、Ｕｒｂａｎｓｋａらによる刊行物において記載された実験手順の、唯一の目的は、２つのモノクローナル抗体分子の架橋により得られた抗体分子であって、ＣＤ８、ＣＤ２８、及びＣＤ３ｚに融合させた葉酸受容体と、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０及びＨＥＲ２）とをターゲティングする抗体分子であれば、Ｔ細胞を、がん細胞に対してリダイレクトすると実証することであった。しかし、Ｕｒｂａｎｓｋａらによるデータは、以下の理由：１）Ｔ細胞刺激ドメインに融合させた、異なる細胞外ドメインから構成される融合タンパク質をターゲティングする抗体分子であれば、Ｔ細胞を活性化させることが可能であるというデータが提示されていないこと；２）腫瘍細胞の非存在下における、Ｔ細胞の活性化に対する、四価の影響についての解析が提示されていないこと；３）三価の二重特異性抗体分子であれば、同様であるか、なお又はより強力なＴ細胞活性化能をもたらすことが可能であるというデータが提示されていないことのために、概念のさらなる一般化を排除できない。さらに、Ｕｒｂａｎｓｋａらによる刊行物で示されたデータは、Ｔ細胞の活性化には、ＣＤ８ドメインが必須となるという形で解釈しうるであろう。

【発明の概要】

【0007】

したがって、がん患者の必要を満たすために、ターゲティングされた腫瘍治療、特に、養子Ｔ細胞療法は、改善を必要とする。したがって、ＡＣＴの安全性及び有効性を改善し、上記の欠点を克服する潜在的可能性を有する、改善された手段を提供することが、依然として必要とされている。

【0008】

本発明は、特許請求の範囲で規定される実施態様を提供することにより、この必要に対処する。

【0009】

本発明は、（Ａ）処置される対象から得られたＴ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、膜貫通アンカリングドメイン、及びシグナル伝達刺激ドメインを含む融合タンパク質と、（Ｂ）融合タンパク質の細胞外ドメイン（すなわち、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン）と、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原とに結合する、三価の二重特異性抗体分子とを含むキットに関する。より好ましい実施態様では、本発明は、（Ａ）処置される対象から得られたＴ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、膜貫通アンカリングドメイン、少なくとも１つのシグナル伝達共刺激ドメイン、及びシグナル伝達刺激ドメインを含む融合タンパク質と、（Ｂ）融合タンパク質の細胞外ドメイン（すなわち、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン）と、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原とに結合する、三価の二重特異性抗体分子とを含むキットに関する。

【0010】

本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞への、本明細書で記載される融合タンパク質の形質導入と、三価の二重特異性抗体分子による、それらの腫瘍への動員のターゲティングとに関する。国際公開第２０１３／１１３６１５号の例において記載されている、四価の二重特異性抗体であって、Ｔ細胞に導入されたマーカー抗原に対する、２つの結合ドメインと、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対する、２つの結合ドメインとを有する、四価の二重特異性抗体とは対照的に、本発明は、融合タンパク質の細胞外ドメインに対する１つだけの結合ドメインと、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対する２つの結合ドメインとを有する、三価の二重特異性抗体分子、又は、代替的に、融合タンパク質の細胞外ドメインに対する２つの結合ドメインと、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対する１つだけの結合ドメインとを有する、三価の二重特異性抗体分子の使用に基づく。添付の実施例に、本発明の概念実証として示されるように、三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる配列番号２２）、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、図９ならびに表１及び２も参照されたい）であって、第２の結合ドメイン、すなわち、１つの結合ドメインが、（ヒト）ＥＧＦＲｖＩＩＩ（前記Ｔ細胞内及び／又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを表す）と相互作用する／これに結合し、第１の結合ドメイン及び第３の結合ドメイン、すなわち、２つの結合ドメインが、マウスＥｐＣＡＭ（腫瘍細胞の表面上で天然に存在する、腫瘍特異的抗原を表す）と相互作用する／これに結合する、三価の二重特異性抗体を構築した。さらに、三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」（配列番号１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる配列番号２）、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」（配列番号４（タンパク質）及び３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」（配列番号６（タンパク質）及び５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」（配列番号８（タンパク質）及び７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３５；また、図１０ならびに表３及び４も参照されたい）であって、第２の結合ドメイン、すなわち、１つの結合ドメインが、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを表す）と相互作用する／これに結合し、第１の結合ドメイン及び第３の結合ドメイン、すなわち、２つの結合ドメインが、ヒトメソテリン（ヒトメソテリンのＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号は、Ｑ１３４２１（バージョン番号１３２、配列ナンバー２；配列番号１４９（ＤＮＡ）及び１５０（タンパク質）である）と相互作用する／これに結合する、三価の二重特異性抗体を構築した。さらに、三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（プラスミド／ベクターである、「ＭＲ１．１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＨ－Ｃｋ－（Ｇ４Ｓ）２ ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１６６２１」（配列番号２０８（タンパク質）及び２０７（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」（配列番号２１０（タンパク質）及び２０９（ＤＮＡ））、「ＭＣＳＰ ＭＬ２ ＶＬ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１６６１９」（配列番号２１２（タンパク質）及び２１１（ＤＮＡ））、及び「ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＹＲＦ，ｐＥＴＲ１６６１８」（配列番号２１４（タンパク質）及び２１３（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３４；また、図１１ならびに表５及び６も参照されたい）であって、第２の結合ドメイン、すなわち、１つの結合ドメインが、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを表す）と相互作用する／これに結合し、第１の結合ドメイン及び第３の結合ドメイン、すなわち、２つの結合ドメインが、ヒトＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン；ヒトＭＣＳＰのＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号は、Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン番号１１８、配列バージョン２；配列番号２３７（タンパク質）及び２３６（ＤＮＡ）である）と相互作用する／これに結合する、三価の二重特異性抗体を構築した。プラスミド／ベクターである「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる配列番号２２）、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））；また、図９ならびに表１及び２も参照されたい）を含む／これらからなる三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（配列番号２３３）と、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４１（ＤＮＡ）及び４２（タンパク質）を発現させる、形質導入された腫瘍特異的Ｔ細胞（好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞）との組合せによる腫瘍の処置は、驚くべきことに、非特異的細胞傷害を、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを表す）と相互作用する／これに結合する、２つの結合ドメインと、マウスＥｐＣＡＭ（前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを表す）と相互作用する／これに結合する、２つの結合ドメインとを有する、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））を使用する実験と比較して消失させる。図６及び７を参照されたい。さらに、三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；表３及び４も参照されたい）の機能性はまた、ヒト腫瘍系においても示された。例えば、図１７を参照されたい。したがって、驚くべきことに、かつ、予測外に、本発明の融合タンパク質を形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、三価の二重特異性抗体分子を使用することにより特異的に刺激することができ、前記三価の二重特異性抗体分子により、腫瘍細胞に動員しうることが見出された。したがって、本発明では、驚くべきことに、かつ、予測外に、三価の二重特異性抗体分子の、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、膜貫通アンカリングドメイン、Ｔ細胞シグナル伝達刺激ドメイン（及び、任意選択で、少なくとも１つのシグナル伝達共刺激ドメイン）を含む／これらからなる融合タンパク質を形質導入されたＴ細胞とのペアリングは、特異的活性化と、腫瘍細胞のＭＨＣ非依存性溶解とを結果としてもたらすことが示された。Ｔ細胞は、三価の二重特異性抗体分子の非存在下で、不活性であるので、この手法はまた、従来のＴ細胞ベースの手法を上回る、著明な安全性の利点も保有し、それらのアベイラビリティーは、選び出された抗体分子フォーマットにより制御することができる（すなわち、半減期を短くするための低分子、及びこの逆）。

【0011】

したがって、本発明は、（Ａ）処置される対象から得られた、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞に形質導入するための、融合タンパク質をコードする核酸分子であって、以下のドメイン：（１）前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、（２）膜貫通アンカリングドメイン、（３）任意選択で、少なくとも１つのシグナル伝達共刺激ドメイン、及び（４）シグナル伝達刺激ドメインとを有する核酸分子と、（Ｂ）三価の二重特異性抗体分子であって、（ｉ）（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び（ｉｉｉ）（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）、すなわち、前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメインを含む三価の二重特異性抗体分子とを含むキットに関する。

【0012】

本発明の文脈では、「融合タンパク質」は、異なる供給源に由来するポリペプチド部分から作られたタンパク質に関する。したがって、「融合タンパク質」はまた、「キメラタンパク質」としても理解されうる。通例、融合タンパク質は、元来、別個のタンパク質をコードした、２つ又はこれを超える遺伝子（又は好ましくは、ｃＤＮＡ）の接合を介して創出されたタンパク質である。この融合遺伝子（又は融合ｃＤＮＡ）の翻訳は、好ましくは、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を伴う、単一のポリペプチドを結果としてもたらす。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は生物学的治療剤における使用のための、組換えＤＮＡ技術により、人工的に創出される。本発明の融合タンパク質の作製についてのさらなる詳細については、本明細書の下記で記載する。

【0013】

本発明の文脈では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語を、アミノ酸残基のポリマーを指すように、互換的に使用する。用語はまた、１又は複数のアミノ酸残基が、人工的な化学的模倣物、又は対応する、天然に存在するアミノ酸であるアミノ酸ポリマーのほか、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。したがって、本発明の文脈では、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド（アミド）結合により連結されたアミノ酸モノマーの鎖を含むか又はこれからなる分子に関する。ペプチド結合とは、１つのアミノ酸のカルボキシル基が、別のアミノ酸のアミノ基と反応する場合に形成される、共有結合的な化学結合である。本明細書の「ポリペプチド」は、長さが規定された分子に制約されない。したがって、本明細書の「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有結合的なペプチド結合により連結されたアミノ酸鎖を包摂する、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、又はポリペプチドに関する。しかし、本明細書の「ポリペプチド」という用語はまた、アミノ酸及び／又はペプチド結合を、機能的なアナログで置きかえた、このようなタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣物も包摂する。ポリペプチドという用語はまた、ポリペプチドの修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども指し、これらを除外しない。当該技術分野では、このような修飾について、十分に記載されている。

【0014】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸のほか、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学的構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム結合したα－炭素を有する化合物を指す。このようなアナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）、又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ、基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸と同様の形で機能する構造を有する化合物を指す。本明細書では、それらの、一般に公知の３文字記号によりアミノ酸に言及することもでき、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている、１文字記号によりアミノ酸に言及することもできる。

【0015】

本発明の文脈では、融合タンパク質は、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインの断片／ポリペプチド部分を含みうる。したがって、本明細書で提示される融合タンパク質内に含まれる、「Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン」は、本明細書で規定される、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の、完全長の細胞外ドメインの断片／ポリペプチド部分である。本発明の文脈では、かつ、本明細書の上記で説明した通り、本発明の、三価の二重特異性抗体分子は、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合する／これと相互作用する。

【0016】

本発明の、概念実証としての、例示的な実施態様では、本明細書で、配列番号１５１（ＤＮＡ）及び１５２（タンパク質）として示される、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩのＮＣＢＩ参照配列は、ＮＭ＿２０１２８３．１（バージョン：ＮＭ＿２０１２８３．１；ＧＩ：４１３２７７３３）である）の断片／ポリペプチド部分を含むか、又は本明細書で、配列番号１５３（ＤＮＡ）及び１５４（タンパク質）として示される、ヒトＣｒｉｐｔｏ（ヒトＣｒｉｐｔｏのＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号は、Ｐ１３３８５（バージョン番号１５１及び配列のバージョン１）である）の断片／ポリペプチド部分を含む融合タンパク質が提供される。したがって、本発明の文脈では、本明細書で記載される融合タンパク質は、配列番号１５２（配列番号１５１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示される、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列を含みうる／これからなりうる。代替的に、本発明の文脈では、融合タンパク質は、配列番号２３２（配列番号２３１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示される、ヒトｄｅｌ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列を含みうる／これからなりうる。さらに、本発明の文脈では、本明細書で記載される融合タンパク質は、配列番号１５４（配列番号１５３に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示される、ヒトＣｒｉｐｔｏのアミノ酸配列を含みうる／これからなりうる。したがって、より好ましくは、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインは、配列番号５２に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ）（配列番号５１に示されたＤＮＡ配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ）によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明の、代替的な好ましい実施態様では、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインは、配列番号２３２に示されるアミノ酸配列（配列番号２３１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。代替的に、本発明の文脈では、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインは、配列番号７６又は７８に示されるアミノ酸配列（配列番号７５又は７７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明の文脈では、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインは、配列番号６２に示されるアミノ酸配列（ヒトＣｒｉｐｔｏ）（配列番号６１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明の文脈ではまた、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＣｒｉｐｔｏの、小型の断片／短い断片も使用することができる。したがって、本発明の文脈では、配列番号５２、２３２、７６、若しくは７８に描示されるＥＧＦＲｖＩＩＩ、又は配列番号６２に描示されるＣｒｉｐｔｏの、小型の断片／短い断片を使用することができる。特に、前記細胞外ドメイン（すなわち、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＣｒｉｐｔｏ）の、任意の小片を、この小片に、本明細書で規定される二重特異性抗体が結合するという条件で、本発明の融合タンパク質内で使用することができる。このような断片ならば、本発明の融合タンパク質を介して、Ｔ細胞の活性化、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘発することが可能であろう。好ましくは、本発明の融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ又はヒトＣｒｉｐｔｏに由来する。このような細胞外部分の例は、例えば、配列番号５２に示されるアミノ酸配列（配列番号５１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、配列番号２３２（配列番号２３１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、又は配列番号７６（配列番号７５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を有する、ＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインである。さらに、本発明の文脈では、Ｃｒｉｐｔｏの細胞外ドメインは、配列番号６２に示されるアミノ酸配列（配列番号６１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含みうる／これからなりうる。

【0017】

本発明の文脈では、本発明の融合タンパク質の膜貫通アンカリングドメインは、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さないことにより特徴を明らかにされうる。本発明の文脈では、プロテアーゼは、本発明の融合タンパク質の膜貫通アンカリングドメインのアミノ酸配列を加水分解することが可能なタンパク質分解酵素を指す。プロテアーゼという用語は、エンドペプチダーゼ及びエクソペプチダーゼの両方を含む。本発明の文脈では、とりわけ、ＣＤ命名法により定められる膜貫通ドメインの、任意の細胞外部分を使用して、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体に結合すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させる、本発明の融合タンパク質を作出することができる。このような膜貫通アンカリングドメインの例は、例えば、本明細書の配列番号５４（配列番号５３に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示されるアミノ酸配列を有する、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。しかし、本発明の文脈では、ヒト配列が、最も好ましいため、融合タンパク質の膜貫通アンカリングドメインは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列（配列番号６５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明の文脈では、本発明の融合タンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号８０に示されるアミノ酸配列（配列番号７９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含みうる／これからなりうる。本明細書で提示される融合タンパク質が、配列番号８０に示される、ＥＧＦＲｖＩＩＩの膜貫通ドメインを含む場合、融合タンパク質は、配列番号８２（配列番号８１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示されるアンカリングドメインを含みうる。本発明の、概念実証としての、例示的な実施態様では、本明細書の配列番号５２（配列番号５１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、配列番号２３２（配列番号２３１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、配列番号７６（配列番号７５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、又は配列番号７８（配列番号７７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示される、ＥＧＦＲｖＩＩＩの断片／ポリペプチド部分を含むか又はこれからなり、本明細書の配列番号１５６（配列番号１５５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に示される、ＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号は、Ｐ１０７４７（バージョン番号１７３及び配列のバージョン１）である）の断片／ポリペプチド部分を含む融合タンパク質が提供される。本発明の文脈では、ＣＤ２８の、任意の部分／断片を、膜貫通アンカリングドメインとして使用することができる。代替的に、とりわけ、ＣＤ命名法により提示される膜貫通ドメインを有する、任意のタンパク質を、本発明の融合タンパク質のアンカリングドメインとして使用することができる。本発明に従い、このような哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、膜貫通アンカリングドメインを使用して、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の活性化を誘発することができる。本発明のさらなる実施態様では、融合タンパク質の、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、膜貫通アンカリングドメインは、配列番号５４に示されるアミノ酸配列（配列番号５３に示されたＤＮＡ配列（マウス）によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。しかし、より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ヒト由来のポリペプチドを含む。したがって、より好ましくは、本発明の融合タンパク質内に含まれるポリペプチドは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列（配列番号６５に示されたＤＮＡ配列（ヒト）によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。

【0018】

上記で記載した通り、本明細書で提示される融合タンパク質は、配列番号１５６に示されるヒト完全長のＣＤ２８タンパク質（配列番号１５５に示されたｃＤＮＡ配列）によりコードされる）のアミノ酸１５３－１７９、１５４－１７９、１５５－１７９、１５６－１７９、１５７－１７９、１５８－１７９、１５９－１７９、１６０－１７９、１６１－１７９、１６２－１７９、１６３－１７９、１６４－１７９、１６５－１７９、１６６－１７９、１６７－１７９、１６８－１７９、１６９－１７９、１７０－１７９、１７１－１７９、１７２－１７９、１７３－１７９、１７４－１７９、１７５－１７９、１７６－１７９、１７７－１７９、又は１７８－１７９に位置する、ＣＤ２８の膜貫通アンカリングドメインを含みうる。したがって、本発明の文脈では、膜貫通アンカリングドメインは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含むか又はこれからなりうる。

【0019】

上記で記載した通り、本明細書で提示される融合タンパク質は、任意選択で、Ｔ細胞に、さらなる活性をもたらす、少なくとも１つの共刺激ドメイン（下記を参照されたい）を含む。本明細書で提示される融合タンパク質は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又はヒトの、ＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ１０７４７（バージョン番号１７３、配列ナンバー１）であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ３１０４１（バージョン番号１３４、配列ナンバー２）である）、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ０７０１１（バージョン番号１４５、配列ナンバー１）であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２０３３４（バージョン番号１３９、配列ナンバー１）である）、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２３５１０（バージョン番号１３８、配列ナンバー１）であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ４３４８８（バージョン番号１１９、配列ナンバー１）である）、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ９Ｙ６Ｗ８（バージョン番号１２６、配列ナンバー１）である）；マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ９ＷＶ４０（主要引用寄託番号）又はＱ９ＪＬ１７（副次的引用寄託番号）、バージョン番号１０２及び配列バージョン２である）、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２６８４２（バージョン番号１６０、配列ナンバー２）であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ４１２７２（バージョン番号１３７、配列バージョン１）である）、４－１－ＢＢ（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２０３３４（バージョン番号１４０、配列バージョン１）であり、ヒト４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ０７０１１（バージョン番号１４６、配列バージョン）である）、又はＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ９ＵＢＪ５（バージョン番号２５、配列バージョン１）であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｑ９ＱＵＪ０（主要引用寄託番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（副次的引用寄託番号）、バージョン番号１０１及び配列ナンバー１である）の断片／ポリペプチド部分であるシグナル伝達共刺激ドメインを含みうる。本発明のさらなる実施態様では、本発明の融合タンパク質は、本明細書で規定されるシグナル伝達共刺激ドメインのうちの１又は複数、すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つを含みうる。したがって、本発明の文脈では、本発明の融合タンパク質は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ２８、又は、好ましくは、ヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分を、第１のシグナル伝達共刺激ドメインとして含むことが可能であり、第２のシグナル伝達共刺激ドメインは、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）、又は、好ましくは、ヒトのＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１－ＢＢ、及びＤＡＰ１０からなる群から選択される。添付の実施例に例示されるように、本発明の融合タンパク質内に含まれるシグナル伝達共刺激ドメインは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列（配列番号５５に示されたＤＮＡ配列（マウス）によりコードされる）、及び／又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列（配列番号５９に示されたＤＮＡ配列（マウス）によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。しかし、より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ヒト由来のポリペプチドを含む。したがって、より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ヒト由来のポリペプチドを含む。したがって、より好ましくは、本発明の融合タンパク質内に含まれるシグナル伝達共刺激ドメインは、配列番号６８に示されるアミノ酸配列（配列番号６７に示されたＤＮＡ配列（ヒト）によりコードされる）、及び／又は配列番号７２に示されるアミノ酸配列（配列番号７１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。

【0020】

したがって、任意選択で、本明細書で提示される融合タンパク質内に含まれうるシグナル伝達共刺激ドメインは、完全長のＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１－ＢＢ、又はＤＡＰ１０の断片／ポリペプチド部分である。本明細書では、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長のＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１－ＢＢ、又はＤＡＰ１０のアミノ酸配列は、配列番号１５８（ＣＤ２８）、１６２（ＣＤ１３７）、１６６（ＯＸ４０）、１７０（ＩＣＯＳ）、１７４（ＣＤ２７）、２０３（４－１－ＢＢ）、又は１７８（ＤＡＰ１０）（配列番号１５７（ＣＤ２８）、１６１（ＣＤ１３７）、１６５（ＯＸ４０）、１６９（ＩＣＯＳ）、１７３（ＣＤ２７）、２２７（４－１－ＢＢ）、又は１７７（ＤＡＰ１０）に示されたＤＮＡ配列によりコードされるマウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）配列）として示される。しかし、本発明の文脈では、ヒト配列が、最も好ましいため、任意選択で、本明細書で提示される融合タンパク質内に含まれうるシグナル伝達共刺激ドメインは、ヒト完全長のＣＤ２９、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１－ＢＢ、又はＤＡＰ１０の断片／ポリペプチド部分である。本明細書では、ヒト完全長のＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１－ＢＢ、又はＤＡＰ１０のアミノ酸配列は、配列番号１５６（ＣＤ２８）、１６０（ＣＤ１３７）、１６４（ＯＸ４０）、１６８（ＩＣＯＳ）、１７２（ＣＤ２７）、２０４（４－１－ＢＢ）、又は１７６（ＤＡＰ１０）（配列番号１５５（ＣＤ２８）、１５９（ＣＤ１３７）、１６３（ＯＸ４０）、１６７（ＩＣＯＳ）、１７１（ＣＤ２７）、２２８（４－１－ＢＢ）、又は１７５（ＤＡＰ１０）に示されたＤＮＡ配列によりコードされるヒト配列）として示される。

【0021】

本明細書で提示される融合タンパク質は、ＣＤ２８の、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激ドメインとしてのＣＤ２８の断片を含みうる。特に、ＣＤ２８の、任意の部分／断片は、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフのうちの少なくとも１つが含まれる限りにおいて、本発明の融合タンパク質に適する。例えば、本発明の融合タンパク質内に含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列（配列番号５５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明では、共刺激ドメインとして機能する、ＣＤ２８の細胞内ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列であって、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する配列を含みうる。しかし、より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ヒト由来のポリペプチドを含む。例えば、本発明の融合タンパク質内に含まれ得る、ヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分は、配列番号６８に示されるアミノ酸配列（配列番号６７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。したがって、本発明の文脈では、融合タンパク質は、配列番号６８に示される配列、又は配列番号６８と比較して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０カ所の置換、欠失、若しくは挿入を有し、シグナル伝達共刺激活性を有することにより特徴を明らかにされる配列を含む。シグナル伝達共刺激活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）により測定される、サイトカイン放出の増強、増殖活性の増強（細胞数の増大により測定される）、又はＬＤＨ放出アッセイにより測定される、溶解活性の増強により決定することができる。

【0022】

上述の通り、本発明の実施態様では、融合タンパク質の共刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１０７４７（寄託番号、エントリーバージョン１７３及び配列のバージョン１））から導出することができ、形質導入されたＴ細胞など、本明細書で記載される形質導入細胞の、サイトカイン産生、増殖、及び溶解活性として規定されるＣＤ２８活性をもたらす。ＣＤ２８活性は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）又はインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインについてのＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーを介する、サイトカインの放出、例えば、ｋｉ６７の測定により測定されるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞の定量化（下記の添付の実施例で記載される）、又は標的細胞のリアルタイムの立体障害測定（例えば、Thakurら、Biosens Bioelectron.、35 (1) (2012)、503-506；Krutzikら、Methods Mol Biol.、699(2011)、179-202；Ekkensら、Infect Immun.、75 (5) (2007)、2291-2296；Geら、Proc Natl Acad Sci U S A.、99 (5) (2002)、2983-2988；Duewellら、Cell Death Differ.、21 (12) (2014)、1825-1837、Cell Death Differ.、21 (12) (2014)、161における正誤表において記載されている、例えば、ＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ測定器を使用することによる）により評価される溶解活性により測定することができる。シグナル伝達共刺激ドメインであるＰＹＡＰ（配列番号１５６（配列番号１５５に示されたＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸（ＡＡ）２０８－２１１）及びＹＭＮＭ（配列番号１５６のＡＡ１９１－１９４）は、ＣＤ２８ポリペプチドの機能、及び上記で列挙した機能的な効果に有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列を、配列番号１２２に示し、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列を、配列番号１２１に示す。したがって、本発明の融合タンパク質内で、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、ＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列であって、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する配列を含む。本発明の文脈では、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する、ＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインは、例えば、形質導入されたＴ細胞など、本明細書で記載される形質導入細胞の、サイトカイン産生、増殖、及び溶解活性として規定されるＣＤ２８活性により特徴を明らかにされる。したがって、本発明の文脈では、本発明の融合タンパク質のシグナル伝達共刺激ドメインは、配列番号６８（ヒト）（配列番号６７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、又は配列番号５６（マウス（ｍｏｕｓｅ／ｍｕｒｉｎｅ））（配列番号５５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明の融合タンパク質内で、これらのドメインの一方又は両方を、それぞれ、ＦＭＮＭ（配列番号１２３）及び／又はＡＹＡＡ（配列番号１２４）に突然変異させることができる。これらの突然変異のうちのいずれかは、増殖するその能力に影響を及ぼさずに、サイトカインを放出する融合タンパク質の能力を低減し、形質導入細胞の生存を延長し、したがって、治療可能性を延長するのに使用しうるので有利である。又は、言い換えれば、このような非機能的な突然変異は、本明細書で提示される融合タンパク質を形質導入した細胞の存続を、インビボにおいて増強することが好ましい。しかし、これらのシグナル伝達モチーフは、本明細書で提示される融合タンパク質の細胞内ドメイン内の任意の部位において存在しうる。

【0023】

したがって、上述の通り、本発明の融合タンパク質は、ＣＤ２８の、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、共刺激ドメインとしてのＣＤ２８の断片を含みうる。特に、ＣＤ２８の、任意の部分／断片は、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフ、すなわち、ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）のうちの少なくとも１つが含まれる限りにおいて、共刺激ドメインとして適する。例えば、共刺激ドメインとして使用されるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列（配列番号６５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明では、共刺激ドメインとして機能する、ＣＤ２８の細胞内ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列であって、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する配列を含みうる。本発明の文脈では、ＣＤ２８ポリペプチドのシグナル伝達共刺激ドメインは、本発明の融合タンパク質の共刺激ドメインが、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を含むという条件で、任意の長さでありうる。したがって、本発明の文脈では、融合タンパク質のＣＤ２８のシグナル伝達共刺激ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドに由来する配列であって、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する配列を含みうる。例えば、本発明の融合タンパク質内に含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列（配列番号５５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。前述の通り、融合タンパク質は、好ましくは、ヒト由来のポリペプチドを含む。例えば、本発明の融合タンパク質内に含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列（配列番号６５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本発明の文脈では、ＣＤ２８ポリペプチドに由来するシグナル伝達共刺激ドメインは、本発明の融合タンパク質のシグナル伝達共刺激ドメインが、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を含むという条件で、任意の長さでありうる。したがって、本発明の文脈では、融合タンパク質のＣＤ２８の共刺激ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドに由来する配列であって、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する配列を含みうる。例えば、本発明の融合タンパク質内に含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号５６（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ））又は６６（ヒト）に示されるアミノ酸配列を含むか又はこれからなりうる。本発明の文脈では、融合タンパク質のＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号６６（ヒト）のアミノ酸配列を有する。本発明の文脈では、融合タンパク質は、配列ＹＭＮＭ（配列番号１２２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１２１）を有する、ＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインを含む。したがって、本発明の文脈では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号６６（ヒト）のアミノ酸配列を有する。

【0024】

上記で記載した通り、本明細書で提示される融合タンパク質は、Ｔ細胞の活性化と同じ手段により測定される、Ｔ細胞の活性化をもたらすシグナル伝達刺激ドメインを含む。本明細書で提示される融合タンパク質は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又はヒトの、ＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２０９６３（バージョン番号１７７、配列ナンバー２であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２４１６１（主要引用寄託番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（副次的引用寄託番号）、バージョン番号１４３及び配列ナンバー１である）、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ０８６３７（バージョン番号１７８、配列ナンバー２）である）、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｐ２６７１８（バージョン番号１５１、配列ナンバー１）であり、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、Ｏ５４７０９（バージョン番号１３２、配列ナンバー２）である）の断片／ポリペプチド部分であるシグナル伝達刺激ドメインを含みうる。

【0025】

したがって、本明細書で提示される融合タンパク質内に含まれるシグナル伝達刺激ドメインは、完全長の、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの断片／ポリペプチド部分でありうる。本明細書では、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長の、ＣＤ３ｚ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、配列番号１８０（ＣＤ３ｚ）又は１８２（ＮＫＧ２Ｄ）（配列番号１７９（ＣＤ３ｚ）又は１８１（ＮＫＧ２Ｄ）に示されたＤＮＡ配列によりコードされるマウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）配列）として示される。本明細書では、ヒト完全長の、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、配列番号１８４（ＣＤ３ｚ）、１８６（ＦＣＧＲ３Ａ）又は１８８（ＮＫＧ２Ｄ）（配列番号１８３（ＣＤ３ｚ）、１８５（ＦＣＧＲ３Ａ）又は１８７（ＮＫＧ２Ｄ）に示されたＤＮＡ配列によりコードされるヒト配列）として示される。本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれるという条件で、刺激ドメインとしてのＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの断片を含みうる。特に、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの、任意の部分／断片は、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフが含まれる限りにおいて、刺激ドメインとして適する。しかし、より好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ヒト由来のポリペプチドを含む。したがって、より好ましくは、本明細書で提示される融合タンパク質は、本明細書の配列番号１８４（ＣＤ３ｚ）、１８６（ＦＣＧＲ３Ａ）又は１８８（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるアミノ酸配列（配列番号１８３（ＣＤ３ｚ）、１８５（ＦＣＧＲ３Ａ）又は１８７（ＮＫＧ２Ｄ）に示されたＤＮＡ配列によりコードされるヒト配列）を含む。例えば、本発明の融合タンパク質内に含まれうる、ヒトＣＤ３ｚの断片／ポリペプチド部分は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列（配列番号６９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。したがって、本発明の文脈では、融合タンパク質は、配列番号７０に示される配列、又は配列番号７０と比較して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０カ所の置換、欠失、若しくは挿入を有し、シグナル伝達刺激活性を有することにより特徴を明らかにされる配列を含む。シグナル伝達刺激活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）により測定される、サイトカイン放出の増強、増殖活性の増強（細胞数の増大により測定される）、又はＬＤＨ放出アッセイにより測定される、溶解活性の増強により決定することができる。

【0026】

さらに、本明細書で提示される融合タンパク質は、リンカー（又は「スペーサー」）を含みうる。リンカーは、通例、最大で２０アミノ酸の長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸の長さを有しうる。例えば、本明細書で提示される融合タンパク質は、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、膜貫通アンカリングドメイン、シグナル伝達共刺激ドメイン、及び／又は刺激ドメインの間のリンカーを含みうる。このようなリンカーは、融合タンパク質の異なるポリペプチド（すなわち、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、膜貫通アンカリングドメイン、シグナル伝達共刺激ドメイン、及び／又は刺激ドメイン）が、独立してフォールドし、予測される通りに挙動する可能性を大きくしうるという利点を有する。したがって、本発明の文脈では、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、膜貫通アンカリングドメイン、シグナル伝達共刺激ドメイン、及び刺激ドメインは、単一鎖の多重機能性ポリペプチド内に含まれうる。単一鎖の融合コンストラクトは、例えば、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、膜貫通アンカリングドメイン、シグナル伝達共刺激ドメイン、及び／又は刺激ドメインを含むポリペプチドからなりうる。

【0027】

さらに、本明細書で提示される融合タンパク質は、抗体により認識される部分と、膜貫通ドメインとの間のスペーサーとして作用するヒンジドメインを含有しうる。ヒンジドメインは、任意の長さであることが可能であり、融合タンパク質上の、三価の二重特異性抗体分子により認識される抗原の、同じ細胞外部分に属する場合もあり、異なる細胞外部分に属する場合もある。本発明の文脈では、細胞外タンパク質の、任意の細胞外部分を、膜貫通ドメインと、抗体の結合部位との間のヒンジドメインとして使用しうるであろう。候補ヒンジドメインは、ＣＤ命名法による任意のメンバーを含む。したがって、本発明の文脈では、とりわけ、ＣＤ命名法により提示される、細胞外ドメインの細胞外部分を有する、任意のタンパク質を、本発明の融合タンパク質内のヒンジドメインとして使用することができる。このようなヒンジドメインの例は、例えば、本明細書の配列番号６４（配列番号６３に示されたＤＮＡ配列（マウス）によりコードされる）に示されるアミノ酸配列を有する、ＣＤ８の細胞外部分でありうる。しかし、本発明の文脈では、ヒト配列が、最も好ましいため、融合タンパク質のヒンジドメインは、配列番号７４に示されるアミノ酸配列（配列番号７３に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を含むか又はこれからなりうる。本明細書で提示される融合タンパク質が、配列番号６４（マウス）又は７４（ヒト）に描示されたヒンジドメインを含むか、又はこれらからなる場合、本発明の融合タンパク質は、膜貫通アンカリングドメインを有さない。したがって、本明細書で提示される融合タンパク質が、配列番号６４又は７４に描示されたヒンジドメインを含むか、又はこれらからなる場合、融合タンパク質は、以下のドメイン：（１）前記Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインと、（２）配列番号６４又は７４に描示されるヒンジドメインと、（３）任意選択で、少なくとも１つのシグナル伝達共刺激ドメインと、（４）シグナル伝達刺激ドメインとを含む。例示的に述べると、配列番号４６（配列番号４５に示されたＤＮＡ配列によりコードされるマウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）Ｃｒｉｐｔｏ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ）で描示される融合タンパク質は、配列番号６４で描示されるヒンジドメインを含む。さらに、配列番号１２０（配列番号１１９に示されたＤＮＡ配列によりコードされるヒトＣｒｉｐｔｏ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ）で描示される融合タンパク質は、配列番号７４で描示されるヒンジドメインを含む。本発明の別の実施態様では、本発明の融合タンパク質は、ヒンジドメインを有さないことにより特徴を明らかにされる。例示的に述べると、配列番号４２（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされるマウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ）、配列番号４４（配列番号４３に示されたＤＮＡ配列によりコードされるマウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ）、配列番号４８（配列番号４７に示されたＤＮＡ配列によりコードされるヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ）、配列番号５０（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））で描示される融合タンパク質は、ヒンジドメインを有さないことにより特徴を明らかにされる。

【0028】

本明細書で提示される融合タンパク質は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））、配列番号４４（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４３に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））、又は配列番号４６（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）Ｃｒｉｐｔｏ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。最も好ましくは、本明細書で提示される融合タンパク質は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））、配列番号５０（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））、又は配列番号１２０（ヒトＣｒｉｐｔｏ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号１１９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか、又はこれらからなる。したがって、好ましい実施態様では、本発明は、配列番号４８、配列番号５０、又は配列番号１２０のアミノ酸配列を有しうる融合タンパク質に関する。

【0029】

本明細書で提示される融合タンパク質が、Ｃｒｉｐｔｏの断片を含む場合、融合タンパク質は、リーダー配列を含みうる。このようなリーダー配列は、タンパク質を、Ｔ細胞膜の表面にもたらす。例えば、本明細書で提示される融合タンパク質内で、リーダー配列は、配列番号２０６に示されるアミノ酸配列（配列番号２０５に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）を有しうる。

【0030】

したがって、本発明の文脈では、キットは、配列番号２３５に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。代替的に、キットは、配列番号２３３に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４２に示されるアミノ酸配列（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。さらに、本発明の文脈では、キットは、配列番号２３４に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含むか又はこれからなりうる。さらに、本発明の文脈では、キットは、配列番号２３５に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４４に示されるアミノ酸配列（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４３に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。代替的に、キットは、配列番号２３３に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４４に示されるアミノ酸配列（マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４３に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。さらに、キットは、配列番号２３４に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含むか又はこれからなりうる。しかし、本発明の文脈では、ヒト配列が、最も好ましいため、本発明のキットは、配列番号２３５に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４８に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。代替的に、本発明の文脈では、本発明のキットは、配列番号２３５に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号５０に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。さらに、本発明のキットは、配列番号２３３に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４８に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。代替的に、本発明のキットは、配列番号２３３に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号５０に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４９に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。さらに、本発明のキットは、配列番号２３４に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号５０に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ）を含むか又はこれからなりうる。さらに、本発明のキットは、配列番号２３４に示される、三価の二重特異性抗体分子と組み合わされた、配列番号４８に示されるアミノ酸配列（ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））を含むか又はこれからなりうる。

【0031】

さらに、本発明のキットの部分は、バイアル内又はボトル内に、個別に包装することもでき、又はコンテナ内若しくはマルチコンテナユニット内に、組合せで包装することもできる。さらに、本発明のキットは、患者細胞、好ましくは、本明細書で記載されるＴ細胞に形質導入し、ＧＭＰ（欧州委員会により、http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm下で公表されている「医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準」のためのガイドラインにおいて記載されている、「医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準」）条件下でインキュベートしうる、（閉止）バッグによる細胞インキュベーション系を含む。さらに、本発明のキットは、単離された／得られた患者Ｔ細胞に形質導入し、ＧＭＰ下でインキュベートしうる、（閉止）バッグによる細胞インキュベーション系を含む。さらに、本発明の文脈では、キットはまた、本明細書で記載される融合タンパク質をコードするベクター、及び／又は本明細書の上記で記載したＴ細胞受容体をコードする核酸分子も含みうる。本発明のキットは、特に、本発明の方法を実行するために使用しうると有利であり、本明細書で言及される、様々な適用であって、例えば、研究ツール又は医学的ツールとしての適用において援用しうるであろう。キットの製造は、当業者に公知の、標準的な手順に従うことが好ましい。

【0032】

この文脈では、本明細書で使用される「三価の二重特異性抗体分子」という用語は、１つ又は２つの結合ドメインを介して、本明細書で記載される融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、前記Ｔ細胞内及び／又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合することが可能であり、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する（内因的に発現する）腫瘍特異的抗原に対する、残りの結合ドメインを介して、標的細胞の消失／溶解を誘導することが可能な二重特異性抗体分子に関する。本明細書で記載される融合タンパク質の細胞外ドメインの結合は、このＴ細胞を活性化させ、それらを、三価で二重特異性の結合性コンストラクトを介して、腫瘍細胞と、物理的に接触させる。形質導入されていないＴ細胞又は内因性のＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、三価で二重特異性の結合性コンストラクトの影響を受けないままである。したがって、本発明の、三価の二重特異性抗体分子は、インビボ及び／又はインビトロにおいて、標的細胞（腫瘍細胞）を溶解させる能力を有する。対応する標的細胞は、本発明の、三価の二重特異性抗体分子の、少なくとも１つ、好ましくは、２つの結合ドメインにより認識される、表面分子、すなわち、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原を発現させる細胞を含む。本発明の文脈では、このような表面分子の特徴を明らかにする。したがって、本発明の文脈では、三価の二重特異性抗体分子は、３つの結合ドメインだけを有する。これは、本発明の文脈では、「－を含むこと」という用語が、３つを超える結合ドメインを有する、二重特異性抗体分子を対象としないことを意味する。

【0033】

標的細胞の溶解は、当該技術分野で公知の方法により検出することができる。したがって、このような方法は、特に、生理的インビトロアッセイを含む。このような生理学的アッセイは、例えば、細胞膜完全性の喪失により、細胞死をモニタリングしうる（例えば、ＦＡＣＳベースのヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルーインフラックスアッセイ、光度測定酵素放出アッセイ（ＬＤＨ）、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光測定ユーロピウム放出、及びカルセインＡＭ放出アッセイ）。さらなるアッセイは、例えば、光度測定ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ－１、及びａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ、放射測定３Ｈ－Ｔｈｄ組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定する、コロニー形成アッセイ、及びミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光測定ローダミン１２３アッセイによる、細胞生存のモニタリングを含む。加えて、アポトーシスは、例えば、ＦＡＣＳベースのホスファチジルセリン曝露アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのＴＵＮＥＬ試験、カスパーゼ活性アッセイ（光度測定ベース、蛍光測定ベース、又はＥＬＩＳＡベースの）、又は細胞形態の変化（収縮、膜ブレブ形成）の解析によりモニタリングすることもできる。

【0034】

本発明の文脈で使用される「に結合すること」という用語は、少なくとも２つの「抗原相互作用部位」の、互いとの結合（相互作用）を規定する。本発明に従う、「抗原相互作用部位」という用語は、特異的抗原又は抗原の特異的基との、特異的相互作用の能力を示す、ポリペプチドのモチーフを規定する。前記結合／相互作用はまた、「特異的認識」を規定するようにも理解される。本発明に従う、「特異的認識」という用語は、抗体コンストラクトが、本明細書で規定されるヒト標的分子の各々の、少なくとも２つのアミノ酸と、特異的に相互作用し、かつ／又はこれに結合することが可能であることを意味する。抗体は、同じ標的分子上の、異なるエピトープを認識し、これと相互作用し、かつ／又はこれに結合することが可能である。この用語は、抗体分子の特異性、すなわち、本明細書で規定されるヒト標的分子の特異的領域の間を弁別する、その能力に関する。抗原相互作用部位の、その特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原のコンフォメーションの変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因する、シグナルの誘発を結果としてもたらしうる。したがって、抗原相互作用部位のアミノ酸配列内の特異的モチーフと、抗原とは、それらの一次構造、二次構造、又は三次構造の結果のほか、前記構造の二次的修飾の結果として、互いに結合する。

【0035】

本発明に従い使用される「特異的相互作用」という用語は、本発明の、三価で二重特異性の結合性コンストラクト（三価の二重特異性抗体分子）が、類似の構造の（ポリ）ペプチドと交差反応しないか、又は本質的に交差反応しないことを意味する。したがって、本発明の、三価の二重特異性抗体分子は、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在せず、腫瘍細胞の表面上に天然で存在する、特異的な、選択された、他の化合物、抗原、細胞表面マーカー、腫瘍マーカーなどと相互作用することが可能な、腫瘍マーカー、細胞表面マーカー、抗原に特異的に結合する／これらと相互作用する。本明細書の下記では、このような三価の二重特異性抗体分子の具体例を挙げる。

【0036】

被験コンストラクトのパネルの交差反応性は、例えば、従来の条件（例えば、Harlow及びLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1988)；及び「Using Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1999)を参照されたい）下における、二重特異性抗体コンストラクトの前記パネルの、目的の（ポリ）ペプチドのほか、多数の、多少とも（構造的及び／又は機能的に）近縁の（ポリ）ペプチドへの結合について評価することにより、調べることができる。目的の（ポリ）ペプチド／タンパク質には結合するが、目的の（ポリ）ペプチドと同じ組織、例えば、腫瘍組織の細胞が発現させる他の（ポリ）ペプチドのいずれにも結合しないか、又は本質的に結合しないコンストラクト（すなわち、抗体、（二重特異性）ｓｃＦｖｓなど）だけを、目的の（ポリ）ペプチド／タンパク質に特異的であると考え、本明細書で提示される方法に従う、さらなる研究のために選択する。これらの方法は、特に、構造的及び／又は機能的に近縁の分子による結合研究、ブロッキング研究、及び競合研究を含みうる。これらの結合研究はまた、ＦＡＣＳ解析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）による）、分析的超遠心、等温滴定熱量測定、蛍光異方性、蛍光分光法、又は放射性標識リガンド結合アッセイも含む。さらに、細胞傷害性アッセイ及び上述のアッセイなどの生理学的アッセイも、実施することができる。したがって、抗原相互作用部位の、特異的抗原との特異的相互作用の例は、リガンドの、その受容体に対する特異性を含みうる。前記定義は、特に、その特異的受容体に結合すると、シグナルを誘導する、リガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例は、その特異的サイトカイン受容体と相互作用する／これに結合するサイトカインを含む。前記定義には、特に、抗原相互作用部位の、セレクチンファミリー、インテグリン、及びＥＧＦなどの増殖因子のファミリーの抗原などの抗原への結合もまた含まれる。これもまた、前記定義に特に含まれる、前記相互作用の別の例は、抗原決定基（エピトープ）の、抗体の抗原結合部位との相互作用である。

【0037】

「に結合すること」という用語は、直鎖状エピトープに関するだけでなく、また、ヒト標的分子又はこの部分の２つの領域からなる、コンフォメーションエピトープ、構造的エピトープ、又は不連続エピトープにも関しうる。本発明の文脈では、コンフォメーションエピトープは、ポリペプチドが、天然タンパク質にフォールドする場合に、分子の表面上で一体となる一次配列内で隔てられた、２つ又はこれを超える、個別のアミノ酸配列により規定される（Sela、Science、166 (1969)、1365；及びLaver、Cell、61 (1990)、553-536）。さらに、本発明の文脈では、「に結合すること」という用語は、「と相互作用すること」という用語とも互換的に使用される。

【0038】

したがって、特異性は、当該技術分野で公知の方法、及び本明細書で記載される方法により、実験的に決定することができる。このような方法は、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、及びペプチドスキャンを含むがこれらに限定されない。

【0039】

（Ｉｇ由来の）「第１の結合ドメイン」、（Ｉｇ由来の）「第２の結合ドメイン」、又は（Ｉｇ由来の）「第３の結合ドメイン」という用語は、「免疫グロブリン由来のドメイン」に関し、具体的には、抗体分子又はこの断片、単鎖抗体、合成抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆｖ、若しくはｓｃＦｖ断片など、又はこれらのうちのいずれかの化学修飾された誘導体などの抗体断片に関する。これらの抗体分子は、異なる種に由来する場合もあり、キメラ由来の場合もある。本発明の文脈では（添付の実施例に例示される通り）、本発明の二重特異性抗体分子内に含まれる、前記（Ｉｇ由来の）第１のドメイン及び第３のドメインは、第３の（Ｉｇ由来の）「結合ドメイン」を融合させた（モノクローナル）抗体でありうる。

【0040】

本発明の「抗体」は、３つの結合ドメインを有し、二重特異性である。抗体は、単一の種に由来する完全長抗体の場合もあり、キメラ化抗体の場合もあり、ヒト化抗体の場合もある。２つを超える抗原結合ドメインを伴う抗体について、タンパク質が、２つの異なる抗原の結合ドメインを有する限りにおいて、一部の結合ドメインは、同一でありうる。

【0041】

本出願内で使用される「三価」という用語は、抗体分子内の、指定された数の結合ドメインの存在を表す。それ自体、「三価」という用語は、二重特異性抗体分子内の、３つの結合ドメインの存在を表す。三価の二重特異性抗体分子は、例えば、Bacacら、Clin. Cancer Res、1-12（DOI:10.1158/1078-0432.CCR-15-1696）、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１４／１３１７１２号、及び国際公開第２０１６／０２０３０９号において記載されている。図９、１０、及び１１に例示される通り、本発明の、三価の二重特異性抗体分子は、第１の抗原に特異的に結合する完全長抗体を含むことが可能であり、第２の抗原に特異的に結合するＦａｂ断片を含む／これらからなる。「完全長抗体」という用語は、２つの「完全長抗体重鎖」と、２つの「完全長抗体軽鎖」とからなる抗体を表す。「完全長の抗体重鎖」とは、Ｎ末端－Ｃ末端の方向において、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３として略記される、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）と、任意選択で、サブクラスであるＩｇＥの抗体の場合には、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）とからなるポリペプチドである。好ましくは、「完全長の抗体重鎖」は、Ｎ末端－Ｃ末端の方向において、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長の抗体軽鎖」は、Ｎ末端－Ｃ末端の方向において、ＶＬ－ＣＬとして略記される、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）ドメイン又はλ（ラムダ）ドメインでありうる。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインと、ＣＨ１ドメインとの間、及び完全長の抗体重鎖のヒンジ領域の間の、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して、併せて連結される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）など、天然の抗体である。本発明に従う完全長抗体は、単一の種、例えば、ヒトに由来する場合もあり、キメラ化抗体又はヒト化抗体の場合もある。本発明に従う完全長抗体は、それらの両方が、同じ抗原に特異的に結合する、ＶＨ及びＶＬのペアにより、各々が形成された、２つの抗原結合部位を含む。前記完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端とは、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端における、最後のアミノ酸を表す。本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖と、ＣＨ１と、１つの重鎖の可変領域とを含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子と共に、ジスルフィド結合を形成しえない。したがって、本発明の、三価の二重特異性抗体は、１又は複数のペプチド－リンカーを介して、さらなる抗原結合ドメイン、例えば、単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン、及び／若しくはＶＬドメイン、又はＦａｂを連結した、完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体を含む。本発明の好ましい実施態様では、前記完全長抗体分子のＣＨ３ドメインは、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９（１９９６）、６１７－６２１において、いくつかの例を伴い、詳細に記載されている「ノブ・イントゥー・ホール」技術により変更することができる。「ノブ・イントゥー・ホール」技術では、２つのＣＨ３ドメイン（完全長抗体分子の２つの重鎖の）の相互作用表面が「ノブ」でありうるのに対し、他方は、「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマーをさらに安定化させ（Merchantら、Nature Biotech 16 (1998)、667-681、Atwellら、J. Mol. Biol. 270 (1997)、26-35）、収量を増大させる。

【0042】

したがって、本発明の一態様では、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、完全長抗体分子の、１つの重鎖のＣＨ３ドメイン、及び完全長抗体分子の、他の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の元の接触面を含む接触面において遭遇するという点で、さらなる特徴を明らかにされるが、この場合、変更は、（ｉ）三価の二重特異性抗体内の、他の重鎖のＣＨ３ドメインの元の接触面に遭遇する、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基を、大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置きかえ、これにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内の空隙に配置させうる、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内の突出を作出するように、１つの重鎖のＣＨ３ドメインが置換されている点と、（ｉｉ）三価の二重特異性抗体内の、第１のＣＨ３ドメインの元の接触面に遭遇する、第２のＣＨ３ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基を、小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基で置きかえ、これにより、第１のＣＨ３ドメインの接触面内の突出を配置させうる、第２のＣＨ３ドメインの接触面内の空隙を作出するように、他の重鎖のＣＨ３ドメインが置換されている点において、特徴を明らかにされる。

【0043】

好ましくは、大きな側鎖容積を有する、前記アミノ酸残基は、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、小さな側鎖容積を有する、前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択される。本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメインの間に、ジスルフィド架橋を形成しうるように、両方のＣＨ３ドメインを、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としての、システイン（Ｃ）の導入により、さらに変更する。

【0044】

本発明の好ましい実施態様では、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＰ３２９Ｇ突然変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＰ３２９Ｇ突然変異とを含む。例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインに、Ｙ３４９Ｃ突然変異を導入し、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインに、「Ｅ３５６Ｃ」突然変異又は「Ｓ３５４Ｃ」突然変異を導入することにより、ＣＨ３ドメインの間の、さらなる鎖間ジスルフィド架橋もまた、使用することができる（Merchantら、Nature Biotech 16 (1998)、667-681、Atwellら、J. Mol. Biol. 270 (1997)、26-35）。

【0045】

本発明の代替的な実施態様では、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、ＣＨ３ドメイン内の静電相補性会合を介して会合する。静電相補性会合技術は、例えば、Ｋｌｅｉｎら、ＬａｎｄｅｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４ （６）（２０１２）、６５３－６６３、Ｋｉｔａｚａｗａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．１８（１０）（２０１２）、１５７０－１５７４、及びＧｕｎａｓｅｋｅｒａｎ Ｋ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５（２５）（２０１０）、１９６３７－１９６４６において記載されている。

【0046】

本発明に従い援用される、三価の二重特異性抗体分子、抗体断片、抗体誘導体（全てＩｇ由来である）は、当該技術分野で公知の従来の技法を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、添加、及び／若しくは組換え、ならびに／又は当該技術分野で公知である、他の任意の修飾を、単独で若しくは組合せで使用することにより、さらに修飾することができる。当業者には、免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底をなすＤＮＡ配列内に、このような修飾を導入するための方法が周知である（例えば、Sambrook(1989)、前出を参照されたい）。「Ｉｇ由来のドメイン」という用語は、特に、少なくとも１つのＣＤＲを含む（ポリ）ペプチドコンストラクトに関する。列挙されたＩｇ由来ドメインの断片又は誘導体は、上記の抗体分子の部分であり、かつ／又は化学的／生化学的方法若しくは分子生物学的方法により修飾された（ポリ）ペプチドを規定する。当該技術分野では、対応する方法が公知であり、特に、実験室マニュアルにおいて記載されている（Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2版(1989)及び3版(2001)；Gerhardtら、「Methods for General and Molecular Bacteriology」、ASM Press (1994)；Lefkovits、「Immunology Methods Manual: Comprehensive Sourcebook of Techniques」、Academic Press (1997)；Golemis、「Protein-Protein Interactions: Molecular Cloning Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)を参照されたい）。

【0047】

本明細書で援用される「ＣＤＲ」という用語は、当該技術分野で周知の「相補性決定領域」に関する。ＣＤＲとは、前記分子の特異性を決定し、特異的リガンドと接触する、免疫グロブリンの部分である。ＣＤＲは、分子内の最も可変性の部分であり、これらの分子の多様性に寄与する。各Ｖドメイン内には、３つのＣＤＲ領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ－Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域について描示し、ＣＤＲ－Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。ＶＨとは、可変重鎖を意味し、ＶＬとは、可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、ＮＩＨ刊行物第９１－３２４２号、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（１９８７）、９０１－９１７；又はＣｈｏｔｈｉａ、Ｎａｔｕｒｅ、３４２（１９８９）、８７７－８８３において記載されている通りに決定することができる。

【0048】

したがって、本発明の文脈では、「抗体」という用語は、完全長免疫グロブリン分子のほか、このような免疫グロブリン分子の部分に関する。さらに、用語は、上記で論じた通り、修飾及び／又は変更された抗体分子にも関する。用語はまた、組換え又は合成により作出された抗体／合成された抗体にも関する。

【0049】

本発明の、三価の二重特異性抗体分子が、本明細書で規定される第１の（Ｉｇ由来の）ドメイン、第２の（Ｉｇ由来の）ドメイン、及び第３の（Ｉｇ由来の）ドメインに加えて、例えば、組換えにより作製されたコンストラクトを単離及び／又は調製するための、さらなるドメインも含みうることは、注目に値する。

【0050】

本発明に従い、上記で記載したドメインであって、本明細書で記載される融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、前記Ｔ細胞内及び／又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインと特異的に相互作用する／これに特異的に結合するドメインだけを修飾しうるわけではないことは、注目に値する。また、例えば、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、又は完全ヒト抗体のために、（Ｉｇ由来の）第１のドメイン、（Ｉｇ由来の）第２のドメイン、（Ｉｇ由来の）第３のドメイン、及び／又は接続するリンカー領域を修飾することも想定される。

【0051】

当該技術分野では、「ヒト化法」が周知であり、特に、抗体分子、例えば、（Ｉｇ由来の）分子について記載されている。「ヒト化」という用語は、非ヒト抗体に由来する配列の一部を含有する、非ヒト（例えば、マウス）抗体又はこの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖｓ、又は抗体の、他の抗原結合部分の配列など）のヒト化形態を指す。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基を、所望される結合特異性、結合アフィニティー、及び結合能を有する、マウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲに由来する残基で置きかえたヒト免疫グロブリンを含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つであり、一般に、２つの可変ドメインであって、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である可変ドメインのうちの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むことが最適であろう。特に、Jonesら、Nature、321 (1986)、522-525、Presta、Curr. Op. Struct. Biol.、2 (1992)、593-596を参照されたい。当該技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための方法が周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された、１又は複数のアミノ酸を有し、抗体の、元の結合活性を保持する。抗体／抗体分子をヒト化するための方法については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１（１９８６）、５２２－５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２（１９８８）、３２３－３２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９（１９８８）、１５３４－１５３６において、さらに詳述されている。当該技術分野では、ヒト化抗体の具体例、例えば、ＥｐＣＡＭに対する抗体が公知である（例えば、LoBuglio、「Proceedings of American Society of Clinical Oncology Abstract」(1997)、1562；及びKhor、「Proceedings of American Society of Clinical Oncology Abstract」(1997)、847を参照されたい）。

【0052】

したがって、本発明の文脈では、特に、ヒト化され、薬学的組成物中の援用に成功する、三価の二重特異性抗体分子が提供される。本発明の文脈では、本明細書で記載される（ヒト化された）三価の二重特異性抗体分子を、本明細書で規定されるキット内で援用することができる。

【0053】

本発明の文脈では、三価の二重特異性抗体分子（Ｉｇ由来の）結合ドメインは、前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに対する特異性を伴う、抗原相互作用部位を含む。

【0054】

本明細書で使用される「前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン」という用語は、Ｔ細胞に組み込まれ、天然では、Ｔ細胞の表面内及び／又はＴ細胞の表面上に提示されず、正常（非形質導入）Ｔ細胞内又は正常（非形質導入）Ｔ細胞上では、（内因的に）発現しない分子に関する。したがって、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない抗原／マーカーを、Ｔ細胞に人工的に導入する。本発明の文脈では、前記Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、本明細書で規定される、処置される対象から単離する／得る。したがって、人工的に導入され、その後、前記Ｔ細胞の表面内及び／又はＴ細胞の表面上に提示される、これらの分子は、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、（Ｉｇ由来の）結合ドメイン、好ましくは、抗体、抗体断片、又は抗体誘導体にアクセス可能な（インビトロ又はインビボにおいて）ドメイン又はエピトープを含む。本発明の文脈では、これらの、人工的に導入された分子は、本明細書の下記で記載される（レトロウイルスによる）形質導入の後で、前記Ｔ細胞の表面内及び／又はＴ細胞の表面上に提示される。

【0055】

本発明の文脈では、「前記Ｔ細胞内及び／又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン」という用語は、Ｔ細胞１個当たりの抗原分子が、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００個を超える、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で、天然に存在しない／内因的に発現しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを指す。したがって、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で、天然に存在しない／内因的に発現しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインは、正常（非形質導入）Ｔ細胞の集団のうちの、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２．０‰（パーミル）を超える細胞内で発現しない。Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞上で、天然に存在する、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインの存在及び量は、ＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ、共焦点顕微鏡法、解析用ＨＰＬＣなど、当該技術分野で公知の方法によりモニタリングすることができる。

【0056】

これらの分子の例は、好ましくは、ヒト由来の、非免疫原性タンパク質を含む。代替的に、前記分子は、それ自体、機能的に不活性のタンパク質分子でありうるか、又は当該技術分野で公知の遺伝子組換え法により、機能的に不活性とされる（例は、ヒトＥＧＦＲの突然変異バージョン、例えば、配列番号１５２、２３２、５２、７６、又は７８に描示されるＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１５１、２３１、５１、７５、又は７７によりコードされる）であろう）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、膠芽細胞腫内、ならびに乳癌内、卵巣癌内、及び肺癌内で見出される、ヒト上皮増殖因子受容体の突然変異体である。突然変異体受容体は、その細胞外ドメイン内に欠失を有する（Lorimerら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、93 (1996)、14815-14820）。突然変異していないヒトＥＧＦＲバージョンを、配列番号１９８（配列番号１９７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）に描示する。

【0057】

これらの上述の基準を満たすマーカーの例を、本明細書の下記に示すが、これらは、Ｃｒｉｐｔｏ（ｃｒｙｐｔｉｃファミリーのタンパク質）、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ファミリー（非Ｔ細胞）のメンバー、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＧＦＲ、又はＴＳＨ－Ｒを含むがこれらに限定されない。

【0058】

本発明の文脈では、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、本明細書で記載される融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合する。本発明の文脈では、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインは、Ｃｒｉｐｔｏ（ｃｒｙｐｔｉｃファミリーのタンパク質）、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ファミリー（非Ｔ細胞）のメンバー、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＧＦＲ、及びＴＳＨ－Ｒからなる群から選択される。したがって、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、（もっぱら）Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在するわけではない、ＣＤファミリーのメンバー（「非Ｔ細胞」という用語で言及される）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＧＦＲ、又はＴＳＨ－Ｒと相互作用する／これに結合する。本発明の文脈では、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で内因的に発現しない、ＣＤファミリーのメンバー（「非Ｔ細胞」という用語で言及される）、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＧＦＲ、又はＴＳＨ－Ｒと相互作用する／これに結合する。

【0059】

Ｃｒｉｐｔｏ（ｃｒｙｐｔｉｃファミリーのタンパク質）、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ファミリー（非Ｔ細胞）のメンバー、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＧＦＲ、又はＴＳＨ－Ｒの（ヒト）メンバーの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースで利用可能であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｒｅｖｉｅｗｅｄ％３Ａｙｅｓから検索することができる。これらの（タンパク質）配列はまた、注釈された修飾配列にも関する。本発明はまた、本明細書で提示されるコンサイス配列の同種配列を使用し、また、対立遺伝子変異体なども使用する技法及び方法も提供する。本明細書のコンサイス配列の、このような「変異体」などを使用することが好ましい。好ましくは、このような「変異体」は、遺伝子変異体である。当業者は、ゲノムＤＮＡのほか、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのエントリーもまた含みうる、これらのデータバンクエントリー内の、これらの（タンパク質）配列の関与性のコード化領域を、容易に推定することができる。例示的に述べると、ＮＧＦＲのマウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｚ０Ｗ１（エントリーバージョン１３２、配列バージョン１）から得ることができる。ＮＧＦＲのヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８１３８（エントリーバージョン１８２、配列バージョン１）から得ることができる。

【0060】

「Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない／内因的に発現しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン」との関連において、本明細書で使用される「ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ）ファミリー（非Ｔ細胞）」という用語は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４３、ＣＤ４６、ＣＤ４８、ＣＤ４９、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２１、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５３、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３６、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４６、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２及びＣＤ３６３からなる群から選択されるＣＤ配列のうちのいずれか１つを指す。

【0061】

（ヒト）ＣＤ９（ＣＤ９抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１９２６（エントリーバージョン１２３、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０（ネプリライシン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８４７３（エントリーバージョン１５１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１（インテグリンアルファＤ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１３３４９（エントリーバージョン１１０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５１４４（エントリーバージョン１４５、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４（単球分化抗原であるＣＤ１４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８５７１（エントリーバージョン１３１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６（Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＬＶ２（エントリーバージョン５１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８（インテグリンベータ２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０５１０７（エントリーバージョン１６２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１９（Ｂリンパ球抗原であるＣＤ１９）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５３９１（エントリーバージョン１２８、配列バージョン６）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原であるＣＤ２０）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６（エントリーバージョン１１８、
配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２１（２型補体受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２００２３（エントリーバージョン１２８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０２７３（エントリーバージョン１３６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３（低アフィニティー免疫グロブリンエプシロンＦｃ受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６７３４（エントリーバージョン１３３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４（シグナル伝達物質ＣＤ２４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２５０６３（エントリーバージョン１０６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６（ジペプチジルペプチダーゼ４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２７４８７（エントリーバージョン１４０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２７（ＣＤ２７抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２６８４２（エントリーバージョン１１９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９（インテグリンベータ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０５５５６（エントリーバージョン１５４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２８９０８（エントリーバージョン１２９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６２８４（エントリーバージョン１４６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２（低アフィニティー免疫グロブリンガンマＦｃ領域受容体ＩＩ－ｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３１９９４（エントリーバージョン１３８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原であるＣＤ３３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０１３８（エントリーバージョン１３０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３４（造血系前駆細胞抗原であるＣＤ３４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２８９０６（エントリーバージョン１０８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５（１型補体受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１７９２７（エントリーバージョン１３１、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３６（血小板糖タンパク質４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６６７１（エントリーバージョン１３３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３８（ＡＤＰリボシルシクラーゼ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２８９０７（エントリーバージョン１２６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４９９６１（エントリーバージョン１１４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２５９４２（エントリーバージョン１４７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ４１（インテグリンアルファＩＩｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８５１４（エントリーバージョン１５８、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ４３（ロイコシアリン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６１５０（エントリーバージョン１１０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ４６（膜補助因子タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５５２９（エントリーバージョン１４５、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ４８（ＣＤ４８抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０９３２６（エントリーバージョン１３７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ４９（インテグリンアルファ４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３６１２（エントリーバージョン１２８、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５０（細胞間接着分子３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２９４２（エントリーバージョン１２８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５１（インテグリンアルファＶ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６７５６（エントリーバージョン１４９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５４（細胞間接着分子１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０５３６２（エントリーバージョン１６０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５５（補体崩壊促進因子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８１７４（エントリーバージョン１４３、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５６（神経細胞接着分子１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３５９１（エントリーバージョン１３２、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５７（キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９６Ｅ９３（エントリーバージョン７２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ５９（ＣＤ５９糖タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３９８７（エントリーバージョン１３９、配列情報１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ６１（インテグリンベータ３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０５１０６（エントリーバージョン１７５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ６３（ＣＤ６３抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８９６２（エントリーバージョン１２２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ６４（高アフィニティー免疫グロブリンガンマＦｃ受容体Ｉ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１２３１４（エントリーバージョン１２８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ６６（がん胎児性抗原関連細胞接着分子１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３６８８（エントリーバージョン１３３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ６７（がん胎児性抗原関連細胞接着分子８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３１９９７（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ６８（マクロシアリン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３４８１０（エントリーバージョン１０６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ７０（ＣＤ７０抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２９７０（エントリーバージョン１０１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原であるＣＤ７２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８５４（バージョンエントリー１１３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ７４（ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原ガンマ鎖）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４２３３（エントリーバージョン１４１、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ７５（ベータ－ガラクトシドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９０７（エントリーバージョン１３０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ７７（ラクトシルセラミド４－アルファ－ガラクトシルトランスフェラーゼ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＰＣ４（エントリーバージョン１００、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ７９（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１９１２（エントリーバージョン１２０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ８１（ＣＤ８１抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ６００３３（エントリーバージョン８２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ８２（ＣＤ８２抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２７７０１（エントリーバージョン９８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ８３（ＣＤ８３抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０１１５１（エントリーバージョン１１３、配列バージョン１）から得ることもでき、
（ヒト）ＣＤ８４（ＳＬＡＭファミリーメンバー５）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＩＢ８（エントリーバージョン８７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ８７（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子表面受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０３４０５（エントリーバージョン１２９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ８８（Ｃ５ａアナフィラトキシン走化性受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１７３０（エントリーバージョン１１６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ８９（免疫グロブリンアルファＦｃ受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４０７１（エントリーバージョン１２１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１膜糖タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４２１６（エントリーバージョン１２８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９１（プロ低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０７９５４（エントリーバージョン１３３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９２（コリントランスポーター様タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＷＩ５（エントリーバージョン７９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９３（補体成分Ｃ１ｑ受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＰＹ３（エントリーバージョン１１５、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９４（ナチュラルキラー細胞抗原であるＣＤ９４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１３２４１（エントリーバージョン１０７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９５（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー６）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４８０２３（エントリーバージョン１３４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９７（ＣＤ９７抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４８９６０（エントリーバージョン１２５、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９８（４Ｆ２細胞表面抗原重鎖）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８１９５（エントリーバージョン１４０、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ９９（ＣＤ９９抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１４２０９（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１００（セマフォリン４Ｄ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９２８５４（エントリーバージョン１２５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９３０３３（エントリーバージョン８９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０２（細胞間接着分子２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３５９８（エントリーバージョン１３１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０３（インテグリンアルファＥ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３８５７０（エントリーバージョン１１８、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０４（インテグリンベータ４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６１４４（エントリーバージョン１６０、配列バージョン５）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０５（エンドグリン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１７８１３（エントリーバージョン１３３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０６（血管細胞接着タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１９３２０（エントリーバージョン１５８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０７（リソソーム関連膜糖タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１２７９（エントリーバージョン１１７、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０８（セマフォリン７Ａ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ７５３２６（エントリーバージョン１０７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１０９（ＣＤ１０９抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ６ＹＨＫ３（エントリーバージョン６４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１０（トロンボポエチン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４０２３８（エントリーバージョン１２２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１１（ポリオウイルス受容体関連タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１５２２３（エントリーバージョン１１４、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１２（ポリオウイルス受容体関連タンパク質２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９２６９２（エントリーバージョン１２３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１３（ポリオウイルス受容体関連タンパク質３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＱＳ３（エントリーバージョン７８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１４（顆粒球コロニー刺激因子受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９０６２（エントリーバージョン１２９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１５（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０７３３３（エントリーバージョン１４５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１６（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体サブユニットアルファ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５５０９（エントリーバージョン１２８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１７（マスト細胞／幹細胞増殖因子受容体であるＫｉｔ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１０７２１（エントリーバージョン１５０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１８（白血病阻害因子受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４２７０２（エントリーバージョン１１５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１１９（インターフェロンガンマ受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５２６０（エントリーバージョン１４０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１２１（１型インターロイキン１受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１４７７８（エントリーバージョン１５１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体サブユニットアルファ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２６９５１（エントリーバージョン１１０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１２４（インターロイキン４受容体サブユニットアルファ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４３９４（エントリーバージョン１４４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１２５（インターロイキン５受容体サブユニットアルファ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０１３４４（エントリーバージョン１２０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１２６（インターロイキン６受容体サブユニットアルファ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８８８７（エントリーバージョン１４３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３０（インターロイキン６受容体サブユニットベータ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４０１８９（エントリーバージョン１４２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３１（サイトカイン受容体共通サブユニットベータ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２９２７（エントリーバージョン１２８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３３（プロミニン１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ４３４９０（エントリーバージョン１１０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３４（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４３４８９（エントリーバージョン１０６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３５（受容体型チロシンプロテインキナーゼＦＬＴ－３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８８８（エントリーバージョン１１９、配列バージョン２）
から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３６（マクロファージ刺激タンパク質受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４９１２（エントリーバージョン１２９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０７０１１（エントリーバージョン１０９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１３８（シンデカン１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１８８２７（エントリーバージョン１１４、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４０（血小板由来増殖因子受容体ベータ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０９６１９（エントリーバージョン１５４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４１（トロンボモジュリン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０７２０４（エントリーバージョン１６２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４２（組織因子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３７２６（エントリーバージョン１３７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４３（アンジオテンシン転換酵素）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１２８２１（エントリーバージョン１５７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４４（カドヘリン５）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３３１５１（エントリーバージョン１０８、配列バージョン５）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４６（細胞表面糖タンパク質ＭＵＣ１８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４３１２１（エントリーバージョン１０９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４７（ベイシジン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３５６１３（エントリーバージョン１３４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１４８（受容体型チロシンタンパク質ホスファターゼエータ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１２９１３（エントリーバージョン１２４、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５１（ＣＤ１５１抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４８５０９（エントリーバージョン１０８、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５３（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２９７１（エントリーバージョン９０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５１５１（エントリーバージョン１３２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５６（ディスインテグリン／メタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ７８３２５（エントリーバージョン１１５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５７（ＡＤＰリボシルシクラーゼ２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１０５８８（エントリーバージョン１１６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５８（キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８Ｎ７４３（エントリーバージョン９１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１５９（ＩＩ型ＮＫＧ２－Ａ／ＮＫＧ２－Ｂ内在性膜タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２６７１５（エントリーバージョン１１６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６０（ＣＤ１６０抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ９５９７１（エントリーバージョン９８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６１（キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＢメンバー１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１２９１８（エントリーバージョン８１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６２（Ｐセレクチン糖タンパク質リガンド１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１４２４２（エントリーバージョン１０３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６３（１型スカベンジャー受容体システインリッチタンパク質Ｍ１３０）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８６ＶＢ７（エントリーバージョン７７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６４（シアロムチンコアタンパク質２４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４９００（エントリーバージョン８９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６６（ＣＤ１６６抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１３７４０（エントリーバージョン１１１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６７（ディスコイジンドメイン含有受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６８３２（エントリーバージョン１２０、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６８（ＨＭＭＲ（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ））の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ７５３３０（エントリーバージョン９９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１６９（シアロアドヘシン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＢＺＺ２（エントリーバージョン１０３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１７０（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１５３８９（エントリーバージョン１０６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１７１（神経細胞接着分子Ｌ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２００４（エントリーバージョン１３９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１７２（シグナル制御タンパク質ベータ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ００２４１（エントリーバージョン１１２、配列バージョン５）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１７７（ＣＤ１７７抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８Ｎ６Ｑ３（エントリーバージョン６５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１７８（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー６）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４８０２３（エントリーバージョン１３４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１７９（免疫グロブリンイオタ鎖）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１２０１８（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８０（ＣＤ１８０抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９４６７（エントリーバージョン１０１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８１（１型Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２５０２４（エントリーバージョン１２５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８２（２型Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２５０２５（エントリーバージョン１２３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８３（３型Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４９６８２（エントリーバージョン１１８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８４（４型Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ６１０７３（エントリーバージョン９５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８５（５型Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２３０２（エントリーバージョン１０９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１８６（６型Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ００５７４（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１９１（１型Ｃ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３２２４６（エントリーバージョン１０６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１９２（２型Ｃ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４１５９７（エントリーバージョン１２８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ１９３（３型Ｃ－Ｃケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ５１６７７（エントリーバージョン１１２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２００（ＯＸ－２膜糖タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４１２１７（エントリーバージョン１１０、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０１（内皮タンパク質Ｃ受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＮＮ８（エントリーバージョン１１０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０４（Ｉ型及びＩＩ型マクロファージスカベンジャー受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１７５７（エントリーバージョン１２２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０６（マクロファージマンノース受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２２８９７（エントリーバージョン１３８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０７（Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＫ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＪ７１（エントリーバージョン８５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０８（リソソーム関連膜糖タンパク質３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＱＶ４（エントリーバージョン６９、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０９（ＣＤ２０９抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＮＸ６（エントリーバージョン１０３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２１７（インターロイキン１７受容体Ａ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９６Ｆ４６（エントリーバージョン９４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２１８（インターロイキン１８受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１３４７８（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２０（インスリン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６２１３（エントリーバージョン１７５、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２１（インスリン様増殖因子１受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８０６９（エントリーバージョン１４５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２２（カチオン非依存性マンノース６リン酸受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１７１７（エントリーバージョン１３７、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２３（リンパ球活性化遺伝子
３タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１８６２７（エントリーバージョン１０８、配列バージョン５）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２４（ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１９４４０（エントリーバージョン１３７、配列バージョン２）
から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２５（インターフェロン誘導性膜貫通タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１３１６４（エントリーバージョン１０１、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２６（ＣＤ２２６抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１５７６２（エントリーバージョン８９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２７（ムチン１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９４１（エントリーバージョン１３６、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２８（メラノトランスフェリン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８５８２（エントリーバージョン１２４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３０（プリオンタンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４１５６（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３１（テトラスパニン７）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４１７３２（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３２（プレクシンＣ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ６０４８６（エントリーバージョン８０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３３（バンド３アニオン輸送タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０２７３０（エントリーバージョン１６７、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３４（ダフィー抗原／ケモカイン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６５７０（エントリーバージョン１１４、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３６（グリコホリンＣ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４９２１（エントリーバージョン１１６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３８（Ｋｅｌｌ血液群糖タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２３２７６（エントリーバージョン１２４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２３９（基底細胞接着分子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ５０８９５（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４１（Ｒｈ Ａ型アンモニウムトランスポーター）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０２０９４（エントリーバージョン９８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４２（細胞間接着分子４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１４７７３（エントリーバージョン１０６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４３（多剤耐性タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８１８３（エントリーバージョン１４６、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＢＺＷ８（エントリーバージョン９４、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４６（ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＭ７３（エントリーバージョン１２０、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４８（エンドシアリン）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＨＣＵ０（エントリーバージョン８７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２４９（グルタミルアミノペプチダーゼ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０７０７５（エントリーバージョン１２１、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２５２（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４）の配列を、
Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２３５１０（エントリーバージョン１０１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２５３（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１０）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ５０５９１（エントリーバージョン１１８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２５４（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１４７８８（エントリーバージョン１１０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２５６（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ７５８８８（エントリーバージョン１１１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２５７（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ２７５（エントリーバージョン１２７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２５８（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ４３５５７（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ００２２０（エントリーバージョン１１２、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６２（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１４７６３（エントリーバージョン１３３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６３（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｃ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１４７９８（エントリーバージョン９９、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６４（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｄ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＢＮ６（エントリーバージョン１０９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６５（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ａ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ６Ｑ６（エントリーバージョン１００、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６６（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１２Ａ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＰ８４（エントリーバージョン８９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１４８３６（エントリーバージョン１０２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６８（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｃ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９６ＲＪ３（エントリーバージョン９１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２６９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０２２２３（エントリーバージョン１２５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２７０（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９２９５６（エントリーバージョン１３４、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２７１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１６）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８１３８（エントリーバージョン１３５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２７６（ＣＤ２７６抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ５ＺＰＲ３（エントリーバージョン７１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２７７（ブチロフィリンサブファミリー３メンバーＡ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ００４８１（エントリーバージョン１０２、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８０（Ｃ型マンノース受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＢＧ０（エントリーバージョン７９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８１（Ｔｏｌｌ様受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１５３９９（エントリーバージョン１２５、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８２（Ｔｏｌｌ様受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ６０６０３（エントリーバージョン１２９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８３（Ｔｏｌｌ様受容体３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１５４５５（エントリーバージョン１２０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８４（Ｔｏｌｌ様受容体４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ００２０６（エントリーバージョン１２５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８６（Ｔｏｌｌ様受容体６）
の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ２Ｃ９（エントリーバージョン１０８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８８（Ｔｏｌｌ様受容体８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＲ９７（エントリーバージョン１０３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＲ９６（エントリーバージョン１０７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９０（Ｔｏｌｌ様受容体１０）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＢＸＲ５（エントリーバージョン１０５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９２（１Ａ型骨形成タンパク質受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８９４（エントリーバージョン１４６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９４（推定Ｇタンパク質共役受容体４４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ５Ｙ４（エントリーバージョン９１、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９５（レプチン受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ４８３５７（エントリーバージョン１３２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９６（ＧＰＩ結合型ＮＡＤ（Ｐ）（＋）－Ｌ－アルギニンＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ５２９６１（エントリーバージョン９６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９７（エクトＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９３０７０（エントリーバージョン１０６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９８（ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼサブユニットベータ３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ５４７０９（エントリーバージョン１０２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２９９（Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＭ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｈ２Ｘ３（エントリーバージョン１０８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３００（ＣＭＲＦ３５様分子９）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ６ＵＸＧ３（エントリーバージョン６７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０１（Ｃ型レクチンドメインファミリー１０メンバーＡ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＩＵＮ９（エントリーバージョン８０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０２（ＣＤ３０２抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＩＸ０５（エントリーバージョン６４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０３（Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＣ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＴＴ０（エントリーバージョン８２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０４（ニューロピリン１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１４７８６（エントリーバージョン１２９、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０５（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ６ＧＴＸ８（エントリーバージョン７０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０６（白血球関連免疫グロブリン様受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ６ＩＳＳ４（エントリーバージョン６３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３０９（血管内皮増殖因子受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３５９６８（エントリーバージョン１３８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１２（ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＨＸ３（エントリーバージョン１１３、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１４（ＩＩ型ＮＫＧ２－Ｄ内在性膜タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２６７１８（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１５（プロスタグランジンＦ２受容体負調節因子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｐ２Ｂ２（エントリーバージョン９８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１６（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９６９Ｐ０（エントリーバージョン８１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１７（骨髄間質抗原２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１０５８９（エントリーバージョン９５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１８（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｈ５Ｖ８（エントリーバージョン７８、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３１９（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＱ２５（エントリーバージョン９２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２０（ＣＤ３２０抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＰＦ０（エントリーバージョン８６、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２１（接合部接着分子Ａ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ６２４（エントリーバージョン１２４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２２（接合部接着分子Ｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ５７０８７（エントリーバージョン１０７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２４（カドヘリン１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１２８３０（エントリーバージョン１５７、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２５（カドヘリン２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１９０２２（エントリーバージョン１１８、配列バージョン４）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２６（上皮細胞接着分子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４２２（エントリーバージョン１１８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２７（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン６）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ４３６９９（エントリーバージョン１０７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２８（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ２８６（エントリーバージョン１１１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３２９（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＹＺ４（エントリーバージョン１００、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３１（線維芽細胞増殖因子受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１３６２（エントリーバージョン１６９、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３２（線維芽細胞増殖因子受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８０２（エントリーバージョン１６５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３３（線維芽細胞増殖因子受容体３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２２６０７（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３４（線維芽細胞増殖因子受容体４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２２４５５（エントリーバージョン１３６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３５（ＮＣＲ１（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １））の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ７６０３６（エントリーバージョン９８、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３６（ＮＣＲ２（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２））の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ９５９４４（エントリーバージョン８６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３７（ＮＣＲ３（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３））の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ１４９３１（エントリーバージョン１０３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３８（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＮＱ０（エントリーバージョン１２０、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３９（ｊａｇｇｅｄ－１タンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ７８５０４（エントリーバージョン１２９、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３４０（受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４６２６（エントリーバージョン１６２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３４４（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－４）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＬＶ１（エントリーバージョン１０７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３４９（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－９）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ００１４４（エントリーバージョン１０３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５０（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－１０）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＬＷ２（エントリーバージョン１００、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５１（高アフィニティー免疫グロブリンアルファＦｃ受容体及び高アフィニティー免疫グロブリンミューＦｃ受容体）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＷＶ６（エントリーバージョン６５、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５２（ＳＬＡＭファミリーメンバー６）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９６ＤＵ３（エントリーバージョン９３、
配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５３（ＳＬＡＭファミリーメンバー８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｐ０Ｖ８（エントリーバージョン８０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５４（ＴＲＥＭ１（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ １））の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＰ９９（エントリーバージョン９３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５５（細胞傷害性／調節性Ｔ細胞分子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ９５７２７（エントリーバージョン８１、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９Ｙ５Ｕ５（エントリーバージョン１０３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３５８（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＯ７５５０９（エントリーバージョン１１０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３６０（インターロイキン２１受容体）の配列を、
Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＨＢＥ５（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３６１（ＥＶＩ２Ｂタンパク質）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３４９１０（エントリーバージョン８７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３６２（シンデカン２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３４７４１（エントリーバージョン１０５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３６３（スフィンゴシン１リン酸受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１４５３（エントリーバージョン１１６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）Ｃｒｉｐｔｉｃファミリータンパク質（Ｃｒｉｐｔｉｃファミリータンパク質１－Ｂ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０ＣＧ３６（エントリーバージョン１２、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）サイロトロピン受容体（ＴＳＨ－Ｒ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４７３（エントリーバージョン１５２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３（エントリーバージョン１７８、配列バージョン２；（配列番号１９８（タンパク質）及び１９７（ＤＮＡ）））から得ることもできる。

【0062】

上述の通り、上記で記載した三価の二重特異性抗体分子の（Ｉｇ由来の）ドメインは、腫瘍細胞の表面上に天然で存在する細胞表面分子、すなわち、腫瘍特異的抗原に対する特異性を伴う、抗原相互作用部位を含みうる。

【0063】

本明細書で使用される「腫瘍細胞の表面上に天然で存在する細胞表面分子」／「腫瘍細胞の表面上に天然で存在する腫瘍特異的抗原」という用語はまた、腫瘍細胞の表面上に提示された分子も表す。「天然に存在する」という用語は、腫瘍細胞の表面上に、内因的に発現する分子に関する。「細胞表面分子」という用語は、細胞の表面上に（天然で／内因的に）発現し／提示され、本明細書で記載される（Ｉｇ由来の）三価の二重特異性抗体のドメインに、（インビトロ又はインビボにおいて）アクセス可能なドメイン又はエピトープを含む分子に関する。前記細胞表面分子の例は、膜タンパク質及び膜貫通タンパク質、前記タンパク質又は細胞表面に適合させた分子などである。したがって、本発明の文脈では、前記細胞表面分子は、腫瘍特異的マーカーである。本発明の文脈では、前記腫瘍特異的マーカーは、通例、腫瘍細胞の表面上で内因的に発現するマーカーに関する。

【0064】

本発明の文脈では、「腫瘍特異的マーカー」という用語は、腫瘍細胞の表面上に、天然に／内因的に提示され、かつ／若しくは位置し、又は遍在的に発現するが、腫瘍細胞の表面上の、三価の二重特異性抗体分子、抗体断片、又は抗体誘導体の結合だけにアクセス可能である分子に関する。本明細書で言及される「腫瘍特異的マーカー」は、腫瘍細胞上で優先的に、又は専一的に発現するタンパク質について記載する。「優先的に」が、正常体細胞上より、腫瘍細胞上における、比較的高度な発現を意味するのに対し、「専一的に」とは、専門家に公知の、タンパク質検出の標準的な手段により、体細胞上では見出されない、腫瘍細胞上のタンパク質の発現を意味する。これらの基準を満たすタンパク質は、例えば、当該技術分野で周知の、控除的発現スクリーン又は示差的発現スクリーンにより同定することができる。本発明の治療法により利用するのに、腫瘍細胞特異的な発現がどの程度要請されるのかは、目的の抗原を発現させる細胞と、この抗原に特異的なＴ細胞とを、併せてインキュベートし、誘導的殺滅の特異性を決定する細胞アッセイにより評価することができる。

【0065】

「優先的発現」とは、遺伝子増幅、転写の上方調節、若しくはｍＲＮＡ安定化に媒介されるタンパク質の過剰発現、又はこのようなタンパク質の代謝回転に影響を及ぼす突然変異に起因して、正常細胞と比較して、腫瘍細胞上で高度に発現するタンパク質を指す。優先的とはまた、腫瘍細胞上で発現し、また、正常細胞上でも発現するが、ヒト体内の免疫特権領域など、正常細胞が、通例、Ｔ細胞又は抗体にアクセス可能ではない場合のタンパク質も規定する。加えて、胎児性発生時に、専一的に発現するタンパク質など、処置の範囲内で、腫瘍細胞上では発現するが、正常細胞上では発現しないタンパク質も、この定義下に収まる。

【0066】

「専一的発現」とは、処置コース中に、腫瘍細胞上だけで見出されるタンパク質を指す。このようなタンパク質は、細胞表面上に提示され、それらの細胞外部分内に、正常細胞上では見出されない、点突然変異又は欠失を保有することが好ましい。同様に、シェダーゼの腫瘍特異的活性から生じるネオエピトープは、この類型に属する。専一的発現はまた、腫瘍上で専一的に見出され、正常細胞上では見出されない、異常な糖構造体も含む。

【0067】

腫瘍細胞の表面上に天然で存在する腫瘍マーカーの例を、本明細書の下記に示すが、これらは、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮増殖因子受容体１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子受容体２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮増殖因子受容体３）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原（抗原Ｄ）関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、テネイシン、又は炭素脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）を含むがこれらに限定されない。

【0068】

したがって、本発明の文脈では、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子は、腫瘍細胞の表面上に天然で存在する抗原／マーカーであって、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮増殖因子受容体１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子受容体２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮増殖因子受容体３）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原（抗原Ｄ）関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、テネイシン、又はＣＡ－ＩＸ（炭素脱水酵素ＩＸ）からなる群から選択される抗原／マーカーに結合する。

【0069】

ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮増殖因子受容体１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子受容体２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮増殖因子受容体３）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原（抗原Ｄ）関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、テネイシン、又はＣＡ－ＩＸ（炭素脱水酵素ＩＸ）の（ヒト）メンバーの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースで利用可能であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｒｅｖｉｅｗｅｄ％３Ａｙｅｓから検索することができる。これらの（タンパク質）配列はまた、注釈された修飾配列にも関する。本発明はまた、本明細書で提示されるコンサイス配列の同種配列を使用し、また、対立遺伝子変異体なども使用する技法及び方法も提供する。本明細書のコンサイス配列の、このような「変異体」などを使用することが好ましい。好ましくは、このような「変異体」は、遺伝子変異体である。当業者は、ゲノムＤＮＡのほか、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのエントリーもまた含みうる、これらのデータバンクエントリー内の、これらの（タンパク質）配列の関与性のコード化領域を、容易に推定することができる。

【0070】

（ヒト）ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４２２（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から得ることもでき；（ヒト）ＭＳＬＮ（メソテリン）の配列を、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１３４２１（バージョン番号１３２、配列ナンバー２；配列番号１４９（ＤＮＡ）及び１５０（タンパク質））から得ることもでき、（ヒト）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８８８（主要引用寄託番号）又はＱ１３４１４（副次的寄託番号）、バージョン番号１６５及び配列バージョン２から得ることもでき、（ヒト）ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列を、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン番号１１８、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）の配列を、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１５３２８（主要引用寄託番号）又はＱ５３ＥＷ２（副次的寄託番号）、バージョン番号１５３及び配列バージョン３から得ることもでき、（ヒト）栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の配列を、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０９７５８（主要引用寄託番号）又はＱ１５６５８（副次的寄託番号）、バージョン番号１７２及び配列バージョン３から得ることもでき、（ヒト）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）の配列を、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｏ４３６５３（主要引用寄託番号）又はＱ６ＵＷ９２（副次的寄託番号）、バージョン番号１３４及び配列バージョン１から得ることもでき、（ヒト）ＨＥＲ－１（上皮増殖因子受容体１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３（エントリーバージョン１７７、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＨＥＲ－２（上皮増殖因子受容体２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４６２６（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＨＥＲ－３（上皮増殖因子受容体３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８６０（エントリーバージョン１４０、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原であるＣＤ２０）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ２２（Ｂリンパ球抗原であるＣＤ２２）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０２７３（エントリーバージョン１３５、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＤ３３（Ｂリンパ球抗原であるＣＤ３３）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０１３８（エントリーバージョン１２９、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＣＡ－１２－５（ムチン１６）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＸＩ７（エントリーバージョン６６、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）ＨＬＡ－ＤＲの配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ２９９００（エントリーバージョン５９、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＭＵＣ－１（ムチン１）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９４１（エントリーバージョン１３５、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）Ａ３３（細胞 表面 Ａ３３抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９７９５（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４６０９（エントリーバージョン１３３、配列バージョン１）から得ることもでき、（ヒト）トランスフェリン受容体の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＰ５２（エントリーバージョン９９、配列バージョン１）及びＰ０２７８６（エントリーバージョン１５２、配列バージョン２）から得ることもでき、（ヒト）テネイシンの配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４８２１（エントリーバージョン１４１、配列バージョン３）から得ることもでき、（ヒト）ＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）の配列を、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６７９０（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から得ることもできる。

【0071】

本明細書で提示される分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）は、医療現場において、特に、有用である。例えば、悪性疾患は、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子により処置することができる。本発明の文脈では、悪性疾患は、上皮由来、内皮由来、若しくは中皮由来のがん／癌腫、又は血液がんでありうる。本発明の文脈では、がん／癌腫は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、Ｂリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（メラノーマ）、泌尿生殖器がん、例えば、精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、及び甲状腺がん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫、若しくは骨肉腫など、他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。

【0072】

本明細書で提示される分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される二重特異性抗体分子）は、医療現場において、特に、有用である。例えば、腫瘍性疾患及び／又はリンパ腫は、これらの医学的適応を指向する二重特異性コンストラクトにより処置することができる。三価の二重特異性抗体／分子の適応は、腫瘍抗原の発現によりもたらされる。実態内で発現する腫瘍抗原を、上述のＴ細胞マーカー（天然に存在する／腫瘍細胞の表面上に内因的に発現する抗原を表す）のうちのいずれかと、実質的に結びつけることができる。例えば、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、（ヒト）ＥｐＣＡＭ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、１つ又はＴ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）で処置することができる。したがって、本発明の文脈では、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭを指向し、Ｃｒｉｐｔｏを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインをさらに含む、三価の二重特異性抗体コンストラクトを、胃腸がん、例えば、胃腸由来の腺癌の処置において使用することができる。したがって、本発明の文脈では、三価の二重特異性抗体コンストラクト／分子は、１つの結合ドメインを介して、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭを指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、２つの結合ドメインを含む。本発明の代替的な実施態様では、三価の二重特異性抗体分子はまた、２つの結合ドメインを介して、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭを指向し、１つの結合ドメインが、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向するようにデザインすることもできる。

【0073】

胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＨＥＲ１、好ましくは、ヒトＨＥＲ１（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。これは、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、２つの結合ドメインを介して、ＨＥＲ１、好ましくは、ヒトＨＥＲ１（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する１つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置しうることを意味する。代替的に、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、１つの結合ドメインを介して、ＨＥＲ１、好ましくは、ヒトＨＥＲ１（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。さらに、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＭＣＳＰ、好ましくは、ヒトＭＣＳＰ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＦＯＬＲ１、好ましくは、ヒトＦＯＬＲ１（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、Ｔｒｏｐ－２、好ましくは、ヒトＴｒｏｐ－２（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＰＳＣＡ、好ましくは、ヒトＰＳＣＡ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、好ましくは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＭＳＬＮ、好ましくは、ヒトＭＳＬＮ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＨＥＲ２、好ましくは、ヒトＨＥＲ２（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃がん及び／又は肺がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＨＥＲ３、好ましくは、ヒトＨＥＲ３（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＣＤ２０、好ましくは、ヒトＣＤ２０（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＣＤ２２、好ましくは、ヒトＣＤ２２（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。骨髄性白血病は、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＣＤ３３、好ましくは、ヒトＣＤ３３（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価の二重特異性コンストラクトにより処置することができる。卵巣がん、肺がん、乳がん、及び／又は胃腸がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＣＡ１２－５、好ましくは、ヒトＣＡ１２－５（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、白血病、及び／又は鼻咽頭癌は、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくは、ヒトＨＬＡ－ＤＲ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、及び／又は膵臓がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＭＵＣ－１、好ましくは、ヒトＭＵＣ－１（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。結腸がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、Ａ３３、好ましくは、ヒトＡ３３（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、
すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。前立腺がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＰＳＭＡ、好ましくは、ヒトＰＳＭＡ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、トランスフェリン受容体、好ましくは、ヒトトランスフェリン受容体（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。膵臓がん、肺がん、及び／又は乳がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、トランスフェリン受容体、好ましくは、ヒトトランスフェリン受容体（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。腎がんは、１つ又は２つの結合ドメインを介して、ＣＡ－ＩＸ、好ましくは、ヒトＣＡ－ＩＸ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向し、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価で二重特異性の分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）により処置することができる。

【0074】

また、添付の実施例でも、本発明の概念実証として、例示的に示されるように、本発明の、特異的な、三価の二重特異性抗体分子は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、上記で規定された第１の（Ｉｇ由来の）ドメイン及び第２の（Ｉｇ由来の）ドメインと、マウスＥｐＣＡＭに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、第２の（Ｉｇ由来の）ドメインとを含む（図９を参照されたい）。さらに、図１０は、本発明の、特異的な、三価の二重特異性抗体分子は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、上記で規定された第１の（Ｉｇ由来の）ドメイン及び第２の（Ｉｇ由来の）ドメインと、ヒトＭＳＬＮに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、第２の（Ｉｇ由来の）ドメインとを含むことを例示する。さらに、図１１は、本発明の、特異的な、三価の二重特異性抗体分子は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、上記で規定された第１の（Ｉｇ由来の）ドメイン及び第２の（Ｉｇ由来の）ドメインと、ヒトＭＣＳＰに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、第２の（Ｉｇ由来の）ドメインとを含むことを例示する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥｐＣＡＭに対する、三価の二重特異性抗体を使用するか、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＭＳＬＮに対する、三価の二重特異性抗体を使用するか、又はＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＭＣＳＰを指向する、三価の二重特異性抗体を使用することにより処置しうる疾患は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんを含む。

【0075】

上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ；また、１７－１Ａ抗原、ＫＳＡ、ＥＧＰ４０、ＧＡ７３３－２、ｋｓ１－４、又はｅｓａとも呼ばれる）は、ある特定の上皮内及び多くのヒト癌腫上の特異的発現を伴う、３１４アミノ酸で、４０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である（Balzar、J. Mol. Med. (1999)、77、699-712に概説がある）。ＥｐＣＡＭは、発見され、その後、マウスモノクローナル抗体である１７－１Ａ／エドレコロマブによるその認識を介してクローニングされた（Goettlinger、Int J Cancer、38 (1986)、47-53；及びSimon、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87 (1990)、2755-2759）。ＥｐＣＡＭは、方向付けられ、高度に順序付けられた形で、上皮細胞に接着するように働く（Litvinov、J Cell Biol.、139 (1997)、1337-1348）。上皮細胞が悪性形質転換すると、急速に増殖する腫瘍細胞は、上皮の高度な細胞秩序を放棄する。結果として、ＥｐＣＡＭの表面分布の拘束は低下し、腫瘍細胞上の分子の露出はより大きくなり、腫瘍細胞の表面上の、抗体、抗体断片、又は抗体誘導体の結合にアクセス可能となる。それらの上皮細胞由来のために、大半の癌腫に由来する腫瘍細胞はやはり、それらの表面上に、ＥｐＣＡＭを発現させる。

【0076】

インビボにおけるＥｐＣＡＭの発現は、上皮の増殖の増大に関し、細胞の分化と負に相関する（概説については、Balzar、J. Mol. Med.、77 (1999)、699-712を参照されたい）。ＥｐＣＡＭの発現は、全ての主要な癌腫に本質的にみられる（Balzar、J. Mol. Med.、77 (1999)、699-712に概説があるか、又は、特に、De Bree、Nucl Med Commun.、15 (1994)、613-27；Zhang、Clin Cancer Res.、4 (1998)、295-302に記録されている）。その広範な発現のために、ＥｐＣＡＭを、「汎癌」抗原と称する。多くの症例では、腫瘍細胞は、それらの親上皮又は前記がんの侵襲性の小さな形態よりはるかに高度に、ＥｐＣＡＭを発現させることが観察された。例えば、ＥｐＣＡＭ発現の増大は、前立腺がんの発生における早期イベントを表す（Poczatek、J. Urol.、162 (1999)、1462-1644）。加えて、頸部の扁平上皮癌及び腺癌のいずれの大半でも、強いＥｐＣＡＭの発現は、増殖の増大、及び終末分化についてのマーカーの消滅と相関する（Litvinov、Am. J. Pathol.、148 (1996)、865-75）。乳がんでは、腫瘍細胞上の、ＥｐＣＡＭの過剰発現は、生存率の予測因子である（Gastl、Lancet、356 (2000)、1981-1982）。ＥｐＣＡＭは、頭部、頸部、及び肺の扁平上皮癌を患う患者における、播種性腫瘍細胞の検出のためのマーカーである（Chaubal、Anticaner Res.、19 (1999)、2237-2242；及びPiyathilake、Hum. Pathol.、31 (2000)、482-487）。表皮、口腔、喉頭蓋、咽頭、喉頭、及び食道において見出される、正常な扁平上皮は、ＥｐＣＡＭを、著明に発現させなかった（Quak、Hybridoma、9 (1990)、377-387）。ＥｐＣＡＭは、原発性ＮＳＣＬＣ、転移性ＮＳＣＬＣ、及び播種性ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん細胞（Passlick、Int J Cancer、87 (2000)、548-552））の大半の上、胃腺癌及び胃－食道接合点腺癌（Martin、J. Clin. Pathol.、52 (1999)、701-4）の上、ならびに結腸直腸癌、膵臓癌、及び乳癌に由来する細胞株内（Szala、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87 (1990)、3542-6；及びPackeisen、Hybridoma、18 (1999)、37-40）で発現することが示されている。

【0077】

添付の実施例で、本発明の概念実証として、例示的に示されるように、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０を含む／これらからなる配列番号２３３）であって、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、１つのドメインと、マウスＥｐＣＡＭに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、２つのドメインとを含む、三価の二重特異性抗体分子を構築した。三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」の配列（アミノ酸及びＤＮＡ）を、下記の表１及び２に示す。
表1:

表2:

【0078】

さらに、本発明の概念実証として、図１０で例示される通り、三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＣＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」を含む／これらからなる配列番号２３５）であって、ヒトＭＳＬＮに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、２つのドメインと、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、１つのドメインとを含む、三価の二重特異性抗体分子を構築した。三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」の配列（アミノ酸及びＤＮＡ）を、表３及び４に示す。
表3:

表4:

【0079】

さらに、本発明の概念実証として、図１１で例示される通り、三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（プラスミドである、「ＭＲ１．１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＨ－Ｃｋ－（Ｇ４Ｓ）２ ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１６６２１」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＭＣＳＰ ＭＬ２ ＶＬ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１６６１９」、及び「ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＹＲＦ，ｐＥＴＲ１６６１８」を含む／これらからなる配列番号２３４）であって、ヒトＭＣＳＰに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、２つのドメインと、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する／これを指向する／これと相互作用するか又はこれ上で相互作用する、１つのドメインとを含む、三価の二重特異性抗体分子を構築した。三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」の配列（アミノ酸及びＤＮＡ）を、表５及び６に示す。
表5:

表6

【0080】

本発明はまた、本発明の、三価の二重特異性抗体分子をコードする核酸分子も提供する。本発明にはまた、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子も包摂される。

【0081】

「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドにより構成される、プリン塩基及びピリミジン塩基を含む塩基であって、核酸分子の一次構造を表す塩基の配列に関する。本明細書の「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成型、及びこれらの分子のうちの２つ又はこれを超える分子を含む混合型ポリマーを含む。加えて、「核酸分子」という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む。さらに、本明細書で記載される「核酸分子」は、当業者によりたやすく察知される通り、非天然ヌクレオチド塩基又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含有しうる。本発明の融合タンパク質をコードする、例示的核酸分子を、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、又は１１９に示す。さらに、例示的に述べると、本発明の、三価の二重特異性抗体分子の、重鎖及び／又は軽鎖の領域をコードする核酸分子を、配列番号１、３、５、７（表１及び２を参照されたい）、配列番号２１、２３、２５、２７（表３及び４を参照されたい）、ならびに配列番号２０７、２０９、２１１、及び２１３（表５及び６を参照されたい）に示す。

【0082】

本発明の核酸分子は、調節配列の制御下にありうる。例えば、プロモーター、転写エンハンサー、及び／又は本発明の融合タンパク質の誘導的発現を可能とする配列を援用することができる。本発明の文脈では、核酸分子を、構成的プロモーター又は誘導的プロモーターの制御下で発現させる。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＵＢＣプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＰＧＫ（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、EF１Ａプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＣＡＧＧプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＳＶ４０プロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、ＴＲＥプロモーター（Qinら、PLoS One、5 (5) (2010)、e10611）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Changら、Molecular Therapy、9(2004)、S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)）、又はＮａｎｏｇプロモーター（Wuら、Cell Res.、15 (5) (2005)、317-24）である。

【0083】

「調節配列」という用語は、それらがライゲーションされたコード配列の発現を行うのに必要なＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性格は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含む。真核生物では、一般に、制御配列は、プロモーター、ターミネーターを含み、場合によって、エンハンサー、トランス活性化因子、又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低限で、それらの存在が発現に必要な、全ての構成要素を含むことを意図し、また、さらなる有利な構成要素も含みうる。

【0084】

前記核酸分子は、前述の核酸分子のうちのいずれかを、単独で、又は組合せで含む、組換えにより作製されたキメラ核酸分子でありうる。本発明の文脈では、核酸分子は、ベクターの一部である。

【0085】

したがって、本発明はまた、本発明で記載される核酸分子を含むベクターにも関する。本明細書における「ベクター」という用語は、それが導入された宿主細胞（すなわち、形質導入細胞）内で自律的に複製されうる、環状又は直鎖状の核酸分子に関する。当業者には、多くの適切なベクターが公知であり、分子生物学では、それらの選択は、所望される機能に依存し、遺伝子操作において、従来使用されている、プラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージ、及び他のベクターを含む。当業者に周知の方法を使用して、多様なプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；及びＡｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、（１９９４）において記載されている技法を参照されたい。代替的に、本発明のポリヌクレオチド及びベクターを、標的細胞への送達のためのリポソームに再構築することができる。下記でさらに詳細に論じる通り、クローニングベクターを使用して、ＤＮＡの個別の配列を単離する。関与性の配列を、特定のポリペプチドの発現が要請される発現ベクターに導入することができる。典型的なクローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８、及びｐＧＢＴ９を含む。典型的な発現ベクターは、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴを含む。

【0086】

本発明はまた、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体コンストラクト（分子）をコードする前記核酸分子に動作可能に連結された調節配列である核酸分子を含むベクターにも関する。本発明の文脈では、ベクターは、ポリシストロニックでありうる。添付の実施例に示されるように、三価の二重特異性抗体分子は、各核酸分子が、調節配列に動作可能に連結された、少なくとも３つの異なる核酸分子上で発現させることができる。

【0087】

当業者には、このような調節配列（制御エレメント）が公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳部位、及びインサートを、ベクターに導入するための挿入部位を含みうる。本発明の文脈では、前記核酸分子を、真核細胞内又は原核細胞内の発現を可能とする前記発現制御配列に、動作的に連結する。

【0088】

前記ベクターは、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体コンストラクト（分子）をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。

【0089】

「調節配列」という用語は、それらがライゲーションされたコード配列の発現を行うのに必要なＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性格は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含む。真核生物では、一般に、制御配列は、プロモーター、ターミネーターを含み、場合によって、エンハンサー、トランス活性化因子、又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低限で、それらの存在が発現に必要な、全ての構成要素を含むことを意図し、また、さらなる有利な構成要素も含みうる。

【0090】

「動作可能に連結された」という用語は、そのように記載された構成要素を、それらが、それらの目的の形で機能することを可能とする関係に置く並置を指す。コード配列に「動作可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるような形でライゲーションされている。制御配列がプロモーターである場合、当業者には、二本鎖核酸を使用することが好ましいことが明らかである。

【0091】

本発明の文脈では、列挙されたベクターは、発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換するのに使用することが可能であり、選択された宿主において、コード配列の発現をもたらすコンストラクトである。例えば、発現ベクターは、クローニングベクター、二元ベクター、又は組込みベクターでありうる。発現は、核酸分子の、好ましくは、翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。当業者には、原核生物及び／又は真核細胞における発現を確保する調節エレメントが周知である。真核細胞の場合、調節エレメントは、通常、転写の開始を確保するプロモーターを含み、任意選択で、転写の終結及び転写物の安定化を確保するポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞内の発現を可能とする、可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、又はｔａｃプロモーターを含み、真核生物の宿主細胞内の発現を可能とする調節エレメントの例は、酵母におけるＡＯＸ１プロモーター若しくはＧＡＬ１プロモーター、又は哺乳動物及び他の動物細胞における、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、又はグロビンイントロンである。

【0092】

転写の開始の一因となるエレメントのほか、このような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流において、ＳＶ４０－ｐｏｌｙ－Ａ部位又はｔｋ－ｐｏｌｙ－Ａ部位などの転写終結シグナルも含みうる。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを、細胞コンパートメントに方向付けるか、又は培地に分泌することが可能なリーダー配列を、列挙された核酸配列のコード配列に添加することもでき、当該技術分野では、これらが周知である（例えば、また、添付の実施例も参照されたい）。

【0093】

リーダー配列は、適切な段階で、翻訳配列、開始配列、及び終止配列、ならびに、好ましくは、翻訳されたタンパク質又はこの部分の、細胞周辺腔又は細胞外培地への分泌を方向付けることが可能なリーダー配列と共にアセンブルされる。任意選択で、異種配列は、所望の特性、例えば、発現させた組換え産物の安定化又は精製の簡略化を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしうる（前出を参照されたい）。この文脈では、当該技術分野では、岡山－バーグによるｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ若しくはｐＥＦ－ｎｅｏ（Raumら、Cancer Immunol Immunother、50 (2001)、141-150）、又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）など、適切な発現ベクターが公知である。

【0094】

本発明の文脈では、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換するか、又はこれにトランスフェクトすることが可能なベクター内の、真核性プロモーター系であるが、原核生物宿主の制御配列もまた使用することができる。ベクターを、適切な宿主に組み込んだら、宿主を、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適する条件下で維持する。所望に応じ、本発明のポリペプチドの回収及び精製が後続する。例えば、添付の実施例を参照されたい。

【0095】

細胞周期相互作用型タンパク質を発現させるのに使用されうる、代替的な発現系は、昆虫系である。１つのこのような系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、ヨトウガ細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ属幼虫において、外来の遺伝子を発現させるベクターとして使用する。列挙された核酸分子のコード配列は、ポリヘドリン遺伝子など、ウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。前記コード配列の挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子を不活性とし、コートタンパク質のコートを欠く組換えウイルスをもたらす。次いで、組換えウイルスを使用して、ヨトウガ細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ属幼虫に感染させ、これらの中で、本発明のタンパク質を発現させる（Smith、J. Virol.、46 (1983)、584；Engelhard、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、91 (1994)、3224-3227）。

【0096】

さらなる調節エレメントは、転写エンハンサーのほか、翻訳エンハンサーを含みうる。上記で記載された、本発明のベクターは、選択マーカー及び／又はスコア付け用マーカーを含むと有利である。

【0097】

当業者には、形質転換細胞の選択に有用であり、例えば、形質転換された植物組織及び形質転換植物の選択に有用な選択マーカー遺伝子が周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Reiss、Plant Physiol. (Life Sci. Adv.)、13 (1994)、143-149）、アミノグリコシドである、ネオマイシン、カナマイシン、及びパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Herrera-Estrella、EMBO J.、2 (1983)、987-995）、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Marsh、Gene 32 (1984)、481-485）についての選択のベースとしての代謝拮抗剤耐性を含む。さらなる選択遺伝子、すなわち、細胞が、トリプトファンの代わりにインドールを活用することを可能とするｔｒｐＢ；細胞が、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを活用することを可能とするｈｉｓＤ（Hartman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85 (1988)、8047）；細胞が、マンノースを活用することを可能とするマンノース－６－リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）、及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤に対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯ（McConlogue、1987、「Current Communications in Molecular Biology」、Cold Spring Harbor Laboratory刊）、又はブラストサイジンＳに対する耐性を付与するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓに由来するデアミナーゼ（Tamura、Biosci. Biotechnol. Biochem.、59 (1995)、2336-2338）についても記載されている。

【0098】

当業者には、有用なスコア付けマーカーもまた公知であり、市販されている。前記マーカーが、ルシフェラーゼ（Giacomin、Pl. Sci.、116 (1996)、59-72；Scikantha、J. Bact.、178 (1996)、121）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes、FEBS Lett.、389 (1996)、44-47）、又はβ－グルクロニダーゼ（Jefferson、EMBO J.、6 (1987)、3901-3907）をコードする遺伝子であると有利である。この実施態様は、列挙されたベクターを含有する、細胞、組織、及び生物体の、簡略及び迅速なスクリーニングに、特に、有用である。

【0099】

上記で記載した通り、列挙された核酸分子を、単独で使用することもでき、コードされる、三価の二重特異性コンストラクトを、例えば、精製を目的に、また、遺伝子治療も目的に、細胞内で発現させるベクターの一部として、好ましくは、形質導入されたＴ細胞と組み合わせて使用することもできる。上記で記載した、三価の二重特異性抗体分子のうちのいずれか１つをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸分子又はベクターを、細胞に導入すると、これにより、目的のポリペプチドが産生される。エクスビボ法又はインビボ法により、治療用遺伝子を、細胞に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の、最も重要な適用のうちの１つである。インビトロ又はインビボにおける遺伝子治療に適するベクター、方法、又は遺伝子送達系は、文献において記載されており、当業者にも公知である。例えば、Giordano、Nature Medicine、2 (1996)、534-539；Schaper、Circ. Res.、79 (1996)、911-919；Anderson、Science、256 (1992)、808-813；Verma、Nature、389 (1994)、239；Isner、Lancet、348 (1996)、370-374；Muhlhauser、Circ. Res.、77 (1995)、1077-1086；Onodera、Blood、91 (1998)、30-36；Verma、Gene Ther.、5 (1998)、692-699；Nabel、Ann. N.Y. Acad. Sci.、811 (1997)、289-292；Verzeletti、Hum. Gene Ther.、9 (1998)、2243-51；Wang、Nature Medicine、2 (1996)、714-716；国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号；米国特許第５５８０８５９号；米国特許第５５８９４６６号；又はSchaper、Current Opinion in Biotechnology、7 (1996)、635-640.を参照されたい。列挙された核酸分子及びベクターは、細胞への直接的導入のためにデザインすることもでき、細胞への、リポソーム又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のためにデザインすることもできる。本発明の文脈では、前記細胞は、生殖系列細胞、胚細胞、若しくは卵母細胞であるか、又はこれ由来し、最も好ましくは、前記細胞は、幹細胞である。胚性幹細胞の例は、特に、Ｎａｇｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（１９９３）、８４２４－８４２８において記載されている幹細胞でありうる。

【0100】

上記に従い、本発明は、本明細書で規定される二重特異性抗体コンストラクトのポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む遺伝子操作において、従来使用されている、ベクター、特に、プラスミド、コスミド、及びバクテリオファージを導出する方法に関する。本発明の文脈では、前記ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子導入ベクター若しくはターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを、列挙されたポリヌクレオチド又はベクターの、標的細胞集団への送達に使用することができる。

【0101】

当業者に周知の方法を使用して、組換えベクターを構築することができる。例えば、Sambrookら(前出)、Ausubel(1989、前出)、又は他の標準的な教科書において記載されている技法を参照されたい。代替的に、列挙された核酸分子及びベクターを、標的細胞への送達のためのリポソームに再構築することができる。本発明の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変動する、周知の方法により、宿主細胞に導入することができる。例えば、原核細胞には、塩化カルシウムトランスフェクションを一般に活用するのに対し、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処置又はエレクトロポレーションを使用することができる（Sambrook、前出を参照されたい）。列挙されるベクターは、特に、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ、又はｐＥＦ－ｎｅｏでありうる。ベクターである、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ、及びｐＥＦ－ｎｅｏについては、当該技術分野で、例えば、Ｍａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２ （１９９５）、７０２１－７０２５；及びＲａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、５０（２００１）、１４１－１５０において記載されている。

【0102】

本発明はまた、本明細書で記載されるベクターで形質転換されるか、又はこれをトランスフェクトされた宿主も提供する。前記宿主は、上記で記載されたベクターのうちの少なくとも１つ、又は上記で記載された核酸分子のうちの少なくとも１つを、宿主に導入することにより作製することができる。宿主内の、前記少なくとも１つのベクター、又は少なくとも１つの核酸分子の存在は、上記で記載された、三価の二重特異性抗体分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）をコードする遺伝子の発現を媒介しうる。本発明のベクターは、ポリシストロニックでありうる。

【0103】

本発明の、三価の二重特異性抗体分子の発現の場合、軽鎖の重複は、完全な、三価の二重特異性抗体分子のアセンブリー及び／又は発現の、軽鎖のコード化領域が、宿主細胞内に、重鎖のコード化領域と、１：１の比で存在する状況を上回る改善を可能としうる。したがって、本発明は、コンストラクト及び方法を提供するが、この場合、軽鎖成分の、重鎖成分に対するコード化領域の比は、１：１又は１：１を超える。例えば、ある実施態様では、軽鎖成分の、重鎖成分に対する比は、２：１又は２：１を超える、例えば、３：１、３：２、４：１、又は４：１を超える。本発明の、三価の二重特異性抗体分子が、ＣＨ３ドメインの変更を含む場合、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「軽鎖（ＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ＶＨ－ＣＫ－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「交差軽鎖（ＶＬ－ＣＨ１）」）でトランスフェクトすることができる。

【0104】

宿主内に導入された、記載の核酸分子又はベクターは、宿主のゲノムに組み込まれる場合もあり、染色体外に維持される場合もある。

【0105】

宿主は、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。

【0106】

「原核生物」という用語は、本発明のタンパク質を発現させるために、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子で形質転換されるか、これらを形質導入されるか、又はトランスフェクトされうる全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主は、グラム陰性菌のほか、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのグラム陽性菌を含みうる。「真核生物」という用語は、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞と、好ましくは、哺乳動物細胞とを含むことを意味する。組換え作製手順において援用される宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、グリコシル化される場合もあり、グリコシル化されない場合もある。とりわけ、本発明のポリペプチドのコード配列と、これに遺伝子的に融合させた、Ｎ末端のＦＬＡＧタグ及び／又はＣ末端のＨｉｓタグとを含有するプラスミド又はウイルスの使用が好ましい。好ましくは、前記ＦＬＡＧタグの長さは、約４－８アミノ酸、最も好ましくは、８アミノ酸である。当業者に一般に公知の技法のうちのいずれかを使用して、宿主を形質転換するか、又はこれにトランスフェクトするのに、上記で記載したポリヌクレオチドを使用することができる。さらに、当該技術分野では、融合させた、動作可能に連結された遺伝子を調製し、それらを、例えば、哺乳動物細胞内及び細菌内で発現させる方法が周知である（Sambrook、前出）。

【0107】

本発明の文脈では、宿主（細胞）は、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、又は動物細胞である。

【0108】

特に、列挙された宿主は、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞又はヒト細胞株でありうることが想定される。

【0109】

特に好ましい宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２／０又はＮＳ／０などの骨髄腫細胞株を含む。添付の実施例に例示されるように、宿主としては、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が、特に、好ましい。

【0110】

したがって、本発明は、上記で記載した、三価の二重特異性抗体分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を作製するための方法であって、本発明の細胞及び／又は宿主細胞を、三価の二重特異性抗体分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）の発現を可能とする条件下で培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ））と、分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、細胞及び／又は培地から回収することとを含む方法に関する。

【0111】

形質転換宿主は、発酵槽内で増殖させ、当該技術分野で公知の技法に従い培養して、最適の細胞増殖を達成することができる。次いで、本発明のポリペプチドを、増殖培地から単離することができる。本発明のポリペプチド、例えば、微生物により発現させた本発明のポリペプチドの単離及び精製は、例えば、例えば、本発明のポリペプチド又は添付の実施例で記載されるポリペプチドのタグを指向する、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の使用を伴う分離など、調製用クロマトグラフィーによる分離及び免疫学的分離など、任意の従来の手段による単離及び精製でありうる。

【0112】

さらに、本発明は、本明細書で規定される三価の二重特異性（モノクローナル）抗体分子又は上記で開示した方法により作製される、三価の二重特異性（ヒト）抗体分子、本発明の三価の二重特異性抗体分子をコードする核酸分子、ベクター又は本明細書で記載される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞を含む組成物（医薬）を提供する。本発明の文脈では、前記組成物は、任意選択で、担体、安定剤、及び／又は賦形剤による、適切な製剤をさらに含む薬学的組成物である。

【0113】

さらに、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書の上記で規定した、三価の二重特異性抗体分子であって、本明細書で記載される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、三価の二重特異性抗体分子を提供する。

【0114】

本発明の文脈では、本明細書で記載される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与される、本明細書の上記で規定した三価の二重特異性抗体分子であって、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない抗原を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られた、三価の二重特異性抗体分子を含む薬学的組成物／医薬が提供される。

【0115】

本発明の文脈では、Ｔ細胞に、本明細書の上記で規定した融合タンパク質をコードする核酸分子、及び／又はこのような核酸分子を含むベクターを形質導入する。Ｔ細胞への、本明細書で規定される融合タンパク質のトランスフェクションの文脈では、「ベクター」という用語は、それが導入された宿主細胞（すなわち、形質導入細胞）内で自律的に複製されうる、環状又は直鎖状の核酸分子に関する。本明細書で使用される「ベクター」は、特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子操作において一般に使用される、他のベクターを指す。好ましい実施態様では、本発明のベクターは、細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の形質転換に適する。したがって、本発明の一態様では、本明細書で提示されるベクターは、発現ベクターである。発現ベクターについては、文献において、広範にわたり記載されている。特に、本明細書で提示されるベクターは、好ましくは、組換えポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子）のほか、発現させるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む。本明細書で提示されるベクターは、好ましくは、プロモーターをさらに含む。Ｔ細胞への形質導入のための、本明細書で記載されるベクターはまた、宿主（すなわち、形質導入細胞）内の複製を確保する、選択マーカー遺伝子及び複製起点も含みうる。さらに、Ｔ細胞への形質導入のための、本明細書で提示されるベクターはまた、転写終結シグナルも含みうる。プロモーターと、終結シグナルとの間には、好ましくは、発現させることが所望される核酸分子（例えば、融合タンパク質をコードする本発明の核酸分子）の挿入を可能とする、少なくとも１つの制限部位又はポリリンカーが存在する。当業者には、このような挿入をどのようにして実施しうるのかが公知である。当該技術分野では、Ｔ細胞のトランスフェクションのための本発明のベクターを形成するように、本発明の核酸分子を含むのに適するベクターの例が公知である。例えば、本発明の文脈では、適切なベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドのプラスミド、又はリポソーム内に含有されたプラスミド）と、本発明の核酸分子（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子）を組み込むウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）とを含む。好ましくは、本発明のベクターは、ウイルスベクターである。より好ましくは、本発明のベクターは、レンチウイルスベクターであり、なおより好ましくは、本発明のベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＭＰ７１ベクター）である。したがって、本発明の文脈では、ベクターは、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。本発明のベクターは、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子の、構成的発現又は条件的発現を可能とする。この文脈では、当該技術分野では、本発明の融合タンパク質を発現させるのに適するレトロウイルスベクターであって、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Clayら、J. Immunol.、163 (1999)、507-513）、ＬＺＲＳ－ｉｄ３－ＩＨＲＥＳ（Heemskerkら、J. Exp. Med.、186 (1997)、1597-1602）、ＦｅＬＶ（Neilら、Nature、308 (1984)、814-820）、ＳＡＸ（Kantoffら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83 (1986)、6563-6567）、ｐＤＯＬ（Desiderio、J. Exp. Med.、167 (1988)、372-388）、Ｎ２（Kasidら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87 (1990)、473-477）、ＬＮＬ６（Tiberghienら、Blood、84 (1994)、1333-1341）、ｐＺｉｐＮＥＯ（Chenら、J. Immunol.、153 (1994)、3630-3638）、ＬＡＳＮ（Mullenら、Hum. Gene Ther.、7 (1996)、1123-1129）、ｐＧ１ＸｓＮａ（Taylorら、J. Exp. Med.、184 (1996)、2031-2036）、ＬＣＮＸ（Sunら、Hum. Gene Ther.、8 (1997)、1041-1048）、ＬＸＳＮ（Sunら、Hum. Gene Ther.、8 (1997)、1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardoら、Blood、90 (1997)、952-957）、ＨＭＢ－Ｈｂ－Ｈｕ（Vieillardら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94 (1997)、11595-11600）、ｐＭＶ７（Cochloviusら、Cancer Immunol. Immunother.、46 (1998)、61-66）、ｐＳＴＩＴＣＨ（Weitjensら、Gene Ther、5 (1998)、1195-1203）、ｐＬＺＲ（Yangら、Hum. Gene Ther.、10 (1999)、123-132）、ｐＢＡＧ（Wuら、Hum. Gene Ther.、10 (1999)、977-982）、ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Gilhamら、J. Immunother.、25 (2002)、139-151）、ｐＬＧＳＮ（Engelsら、Hum. Gene Ther.、14 (2003)、1155-1168）、ｐＭＰ７１（Engelsら、Hum. Gene Ther.、14 (2003)、1155-1168）、ｐＧＣＳＡＭ（Morganら、J. Immunol.、171 (2003)、3287-3295）、ｐＭＳＧＶ（Zhaoら、J. Immunol.、174 (2005)、4415-4423）、又はｐＭＸ（de Witteら、J. Immunol.、181 (2008)、5128-5136などのベクターが公知である。さらに、本発明の文脈では、本発明の融合タンパク質を発現させるのに適するレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ－ＳＩＮレンチウイルスベクター（Hottaら、Nat Methods.、6 (5) (2009)、370-376）、ｐ１５６ＲＲＬ－ｓｉｎＰＰＴ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Campeauら、PLoS One、4 (8) (2009)、e6529）、ｐＣＭＶＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅ型番２２０３６）、ＦＵＧＷ（Loisら、Science、295 (5556) (2002)、868-872）、ｐＬＶＸ－ＥＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅ型番６４３６８）、ｐＬＶＥ（Brungerら、Proc Natl Acad Sci U S A、111 (9) (2014)、E798-806）、ｐＣＤＨ１－ＭＣＳ１－ＥＦ１（Huら、Mol Cancer Res.、7 (11) (2009)、1756-1770）、ｐＳＬＩＫ（Wangら、Nat Cell Biol.、16 (4) (2014)、345-356）、ｐＬＪＭ１（Solomonら、Nat Genet.、45 (12) (2013)、1428-30）、ｐＬＸ３０２（Kangら、Sci Signal.、6 (287) (2013)、rs13）、ｐＨＲ－ＩＧ（Xieら、J Cereb Blood Flow Metab.、33 (12) (2013)、1875-85）、ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ型番６２０５３）、ｐＬＳ（Miyoshiら、J Virol.、72 (10) (1998)、8150-8157）、ｐＬＬ３．７（Lazebnikら、J Biol Chem.、283 (7) (2008)、11078-82）、ＦＲＩＧ（Raissiら、Mol Cell Neurosci.、57(2013)、23-32）、ｐＷＰＴ（Ritz-Laserら、Diabetologia.、46 (6) (2003)、810-821）、ｐＢＯＢ（Marrら、J Mol Neurosci.、22(1-2)(2004)、5-11）、又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ型番２７９７６）である。

【0116】

本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子によりコードされる融合タンパク質を発現させる、形質導入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞にも関する。したがって、本発明の文脈では、形質導入細胞は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子、又は本発明の融合タンパク質を発現させる、本発明のベクターを含みうる。

【0117】

本発明の文脈では、「形質導入細胞」という用語は、遺伝子改変細胞（すなわち、核酸分子を、意図的に導入した細胞）に関する。本明細書で提示される形質導入細胞は、本発明のベクターを含みうる。好ましくは、本明細書で提示される形質導入細胞は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子及び／又は本発明のベクターを含む。本発明の形質導入細胞は、外来のＤＮＡ（すなわち、細胞に導入された核酸分子）を、一過性又は安定的に発現させる細胞でありうる。特に、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子は、レトロウイルス又はレンチウイルスによる形質導入を使用することにより、細胞のゲノムに、安定的に組み込むことができる。ｍＲＮＡトランスフェクションを使用することにより、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を、一過性に発現させることができる。好ましくは、本明細書で提示される形質導入細胞は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を介して、細胞内に核酸分子を導入することにより、遺伝子改変されている。したがって、融合タンパク質の発現は、構成的であることが可能であり、融合タンパク質の細胞外ドメインは、細胞表面上で検出可能でありうる。この融合タンパク質の細胞外ドメインは、本明細書で規定される、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の、完全な細胞外ドメインを含みうるが、また、その部分も含みうる。要請される最小のサイズは、融合タンパク質の側の、三価の二重特異性抗体分子が結合するエピトープである。

【0118】

誘導的プロモーター又は抑制的プロモーターの制御下で、融合タンパク質を、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に導入する場合、発現はまた、条件的な場合もあり、誘導的な場合もある。このような誘導的プロモーター又は抑制的プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子のプロモーターと、トランス活性化因子タンパク質であるａｌｃＲとを含有する転写系でありうる。ａｌｃＡプロモーターに連結された、目的の遺伝子の発現を制御するのに、異なる農業用アルコールベースの製剤が使用される。さらに、テトラサイクリン応答性プロモーター系は、テトラサイクリンの存在下で、遺伝子発現系を活性化させるように機能する場合もあり、これを抑制するように機能する場合もある。系のエレメントの一部は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びＴｅｔＲと、単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化配列との融合体である、テトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む。さらに、ステロイド応答性プロモーター、金属関連プロモーター、又は感染特異的（ＰＲ）タンパク質関連プロモーターも使用することができる。

【0119】

発現は、使用される系に応じて、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ又はｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）でありうる。本発明の融合タンパク質は、本明細書で提示される形質導入細胞の表面上で発現させることができる。融合タンパク質の細胞外部分（すなわち、Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン）が、細胞表面上で検出しうるのに対し、細胞内部分（すなわち、融合タンパク質の膜貫通アンカリングドメイン、シグナル伝達共刺激ドメイン及びシグナル伝達刺激ドメイン）は、膜に結合するが、細胞表面上で検出可能ではない。融合タンパク質の細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使用することにより実行することができる。細胞外ドメインは、これらの抗体を使用して、フローサイトメトリーにより検出することもでき、顕微鏡法により検出することもできる。本発明の形質導入細胞は、任意の免疫細胞でありうる。これらは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ－（ＮＫ）Ｔ細胞、γδＴ細胞、生得的リンパ系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、又は好中球を含むがこれらに限定されない。優先的には、前記免疫細胞は、リンパ球であり、優先的には、ＮＫ又はＴ細胞であろう。前記Ｔ細胞は、ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。白血球の表面上の、本発明の融合タンパク質の誘発は、細胞が由来する系統に関わらず、細胞を、その標的細胞に対して、細胞傷害性とするであろう。細胞傷害性は、融合タンパク質のために選び出された、シグナル伝達刺激ドメイン又はシグナル伝達共刺激ドメインに関わらず生じ、さらなるサイトカインの外因性供給に依存しない。したがって、本発明の形質導入細胞は、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、骨髄細胞、又は間葉系幹細胞でありうる。好ましくは、本明細書で提示される形質導入細胞は、Ｔ細胞（例えば、自家Ｔ細胞）であり、より好ましくは、形質導入細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈では、形質導入細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに、本発明の文脈では、形質導入細胞は、自家Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈では、形質導入細胞は、好ましくは、自家ＣＤ８＋Ｔ細胞である。対象から単離された自家細胞（例えば、Ｔ細胞）の使用に加えて、本発明はまた、同種異系細胞の使用も包含する。したがって、本発明の文脈では、形質導入細胞はまた、同種異系ＣＤ８＋Ｔ細胞などの同種異系細胞でもありうる。同種異系細胞の使用は、細胞、好ましくは、Ｔ細胞が、ＡＰＣが、Ｔ細胞により認識される抗原エピトープと共に、特異的に応答する細胞集団、すなわち、Ｔ細胞集団が拘束される、クラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ分子を発現させるという条件で、外来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される特異的抗原エピトープを認識しうるという事実に基づく。したがって、同種異系という用語は、非類縁のドナー個体／ドナー対象に由来する細胞であって、例えば、本明細書で記載される融合タンパク質を発現させる形質導入細胞により処置される個体／対象と、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合性である細胞を指す。自家細胞は、本明細書で記載される形質導入細胞で処置される対象から、本明細書の上記で記載される通りに単離された／得られた細胞を指す。

【0120】

上記で記載した通り、本発明の形質導入細胞に、本明細書で提示される融合タンパク質を発現させる核酸分子を形質導入する。腫瘍浸潤リンパ球など、天然の抗腫瘍特異性を保有する細胞（ＴＩＬ；Dudleyら、J Clin Oncol.、31 (17) (2013)、2152-2159 (doi:10.1200/JCO.2012.46.6441)）、又はフローサイトメトリーにより、患者の末梢血から、それらの腫瘍特異性について分取された抗原特異性細胞（Hunsuckerら、Cancer Immunol Res.、3 (3) (2015)、228-235 (doi:10.1158/2326-6066.CIR-14-0001)）の場合、本明細書で記載される細胞には、本発明の融合タンパク質だけが形質導入されるであろう。しかし、本発明の形質導入細胞には、さらなる核酸分子、例えば、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体をコードする核酸分子も共形質導入することができる。さらに、本発明の文脈では、本発明の形質導入細胞には、さらなる核酸分子、例えば、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）をコードする核酸分子も共形質導入することができる。ＦａｓＬは、Ｆａｓと相互作用することが公知である（Nagataら、Science、267 (5203) (1995)、1449-1456；Walkerら、J Immunol.、158 (10) (1997)、4521-4524）。Ｆａｓ及びそのリガンドであるＦａｓＬは、Ｉ型膜貫通タンパク質及びＩＩ型膜貫通タンパク質であり、それぞれ、腫瘍壊死因子／神経増殖因子受容体及び腫瘍壊死因子ファミリータンパク質のメンバーである（ヒトＦＡＳは、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ２５４４５（エントリーバージョン２１８、配列バージョン１；配列番号２４１（タンパク質）及び２４０（ＤＮＡ））下で入手可能であり；ヒトＦａｓＬは、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ４８０２３（エントリーバージョン１９０、配列バージョン１；配列番号２４５（タンパク質）及び２４４（ＤＮＡ））を有し；マウスＦＡＳは、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ４１０４７（エントリーバージョン１６９、配列バージョン１；配列番号２３９（タンパク質）及び２３８（ＤＮＡ））を有し；マウスＦａｓＬは、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ４１０４７（エントリーバージョン１６９、配列バージョン１；配列番号２４３（タンパク質）及び２４２（ＤＮＡ））を有する）。本発明の文脈では、驚くべきことに、かつ、予測外に、ＦａｓＬが、作用方式に重要であることが見出されている。特に、本明細書で記載される融合タンパク質をトランスフェクト／形質導入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞の殺滅能は、ＦａｓＬ－Ｆａｓ間相互作用をブロックすることにより損いうることが示された（図１３を参照されたい）。したがって、驚くべきことに、Ｆａｓを（過剰）発現させる細胞を有する腫瘍細胞を有することにより特徴を明らかにされる疾患を処置するために、ＦａｓＬを（過剰）発現させる形質導入細胞を使用しうることが見出された。

【0121】

本発明に従い、「Ｔ細胞受容体」という用語は、当該技術分野で一般に公知である。特に、本明細書にでは、「Ｔ細胞受容体」という用語は、以下の３つの基準：（ｉ）腫瘍特異性、（ｉｉ）（大半の）腫瘍細胞の認識であって、抗原又は標的が、（大半の）腫瘍細胞内で発現すべきことを意味する認識、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲが、処置される対象のＨＬＡ型にマッチすることを満たすという条件で、任意のＴ細胞受容体を指す。この文脈では、当該技術分野では、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍特異的抗原１；配列情報については、例えば、Sugiyama、Japanese Journal of Clinical Oncology、40 (2010)、377-87を参照されたい）、ＭＡＧＥ（配列については、例えば、国際公開第２００７／０３２２５５号（Ａ１）及びＰＣＴ／米国出願第２０１１／５７２７２号を参照されたい）、ＳＳＸ（米国仮出願第６１／３８８９８３号）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（配列情報については、例えば、ＰＣＴ／英国出願第２００５／００１９２４号を参照されたい）、及び／又はＨＥＲ２ｎｅｕ（配列情報については、国際公開第２０１１／０２８０８９４号（Ａ１）を参照されたい）を認識する受容体など、上述の３つの基準を満たす、適切なＴ細胞受容体が公知である。

【0122】

当該技術分野では、「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」という用語が公知であり、スペーサー配列により、ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８のシグナルドメインに融合させた、単鎖抗体ドメインの細胞外部分から構成された受容体を指す。このキメラ抗原受容体もまた、腫瘍特異性をもたらし、大半の腫瘍細胞の認識を可能とするものとする。適切なキメラ受容体は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＡＲ（配列については、国際公開第２０１２／１３８４７５号（Ａ１）を参照されたい）、抗ＣＤ２２－ＣＡＲ（国際公開第２０１３／０５９５９３号（Ａ１）を参照されたい）、抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（国際公開第２０１３／１５４７６０号（Ａ１）を参照されたい）、抗ＣＤ１９－ＣＡＲ（国際公開第２０１２／０７９０００号（Ａ１）又は米国特許出願第２０１４／０２７１６３５号（Ａ１）を参照されたい）、抗ＣＤ１２３－ＣＡＲ（米国特許出願第２０１４／０２７１５８２号（Ａ１）を参照されたい）、抗ＣＤ３０－ＣＡＲ（国際公開第２０１５／０２８４４４号（Ａ１）を参照されたい）、又は抗メソテリン－ＣＡＲ（国際公開第２０１３／１４２０３４号（Ａ１）を参照されたい）を含む。

【0123】

本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現させる、形質導入された細胞を作製するための方法であって、細胞に、本発明のベクターを形質導入する工程と、形質導入された細胞を、前記形質導入された細胞内又は細胞上で、融合タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程と、前記形質導入された細胞を回収する工程とを含む方法にも関する。

【0124】

本発明の文脈では、本発明の形質導入細胞は、以下のプロセスにより作製することが好ましい：細胞（例えば、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、対象（好ましくは、ヒト患者）から単離する／得る。当該技術分野では、細胞（例えば、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を、患者又はドナーから単離する／得るための方法が周知であり、本発明の文脈では、患者又はドナーに由来する細胞（例えば、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、採血又は骨髄の摘出により単離することができる。患者の試料としての細胞を単離した／得た後で、細胞（例えば、Ｔ細胞）を、試料の他の成分から分離する。試料から細胞（例えば、Ｔ細胞）を分離するための、いくつかの方法が公知であり、限定せずに述べると、例えば、患者又はドナーに由来する末梢血試料から、細胞を得るためのリューカフェレーシス、ＦＡＣＳｏｒｔ装置を使用することにより、細胞を単離する／得る方法、手作業により、又は極微操作装置を使用することにより、生細胞を保有する、新鮮な生検標本から、生細胞又は死細胞を採取する方法を含む（例えば、Dudley、Immunother.、26 (2003)、332-342；Robbins、Clin. Oncol.、29 (2011)、917-924；又はLeisegang、J. Mol. Med.、86 (2008)、573-58を参照されたい）。本明細書の「新鮮な患者生検」という用語は、外科的手段又は他の任意の公知の手段により、対象から摘出された組織（好ましくは、腫瘍組織）のほか、腫瘍細胞株、又は腫瘍組織／腫瘍細胞に由来する（単離）細胞を指す。その後、Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、単離された／得られた細胞を、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用することにより、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用することにより、培養及び拡大することもでき、かつ／又は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及びインターロイキン２（ＩＬ－２）を使用することにより、培養及び拡大することもできる（例えば、Dudley、Immunother.、26 (2003)、332-342又はDudley、Clin. Oncol.、26 (2008)、5233-5239を参照されたい）。

【0125】

後続の工程では、当該技術分野で公知の方法により、細胞（例えば、Ｔ細胞）を、人工的に改変する／遺伝子改変する／これに形質導入する（例えば、Lemoine、J Gene Med、6 (2004)、374-386を参照されたい）。当該技術分野では、細胞（例えば、Ｔ細胞）に形質導入するための方法が公知であり、限定せずに述べると、核酸又は組換え核酸を形質導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法、又はリポソーム法を含む。形質導入される核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製；型番１１６６８０２７）を使用することにより、従来通り、高度に効率的に形質導入することができる。ベクターを使用する場合、ベクターは、プラスミドベクター（すなわち、ウイルスベクターではないベクター）である限りにおいて、上述の核酸と同じ形で形質導入することができる。本発明の文脈では、細胞（例えば、Ｔ細胞）に形質導入するための方法は、レトロウイルス又はレンチウイルスによるＴ細胞への形質導入のほか、ｍＲＮＡトランスフェクションを含む。「ｍＲＮＡトランスフェクション」は、この場合、本発明の融合タンパク質など、目的のタンパク質を、形質導入される細胞内で、一過性に発現させることが、当業者に周知である方法を指す。略述すると、細胞を、エレクトロポレーションシステム（例えば、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄなど）を使用することにより、本発明の融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションすることができ、その後、上記で記載した、標準的な細胞（例えば、Ｔ細胞）培養プロトコール（Zhaoら、Mol Ther.、13 (1) (2006)、151-159を参照されたい）により培養することができる。本発明の形質導入細胞は、Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、レンチウイルス、又は、最も好ましくは、レトロウイルスによる、Ｔ細胞への形質導入により作出される。

【0126】

この文脈では、当該技術分野では、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Clayら、J. Immunol.、163 (1999)、507-513）、ＬＺＲＳ－ｉｄ３－ＩＨＲＥＳ（Heemskerkら、J. Exp. Med.、186 (1997)、1597-1602）、ＦｅＬＶ（Neilら、Nature、308 (1984)、814-820）、ＳＡＸ（Kantoffら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83 (1986)、6563-6567）、ｐＤＯＬ（Desiderio、J. Exp. Med.、167 (1988)、372-388）、Ｎ２（Kasidら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87 (1990)、473-477）、ＬＮＬ６（Tiberghienら、Blood、84 (1994)、1333-1341）、ｐＺｉｐＮＥＯ（Chenら、J. Immunol.、153 (1994)、3630-3638）、ＬＡＳＮ（Mullenら、Hum. Gene Ther.、7 (1996)、1123-1129）、ｐＧ１ＸｓＮａ（Taylorら、J. Exp. Med.、184 (1996)、2031-2036）、ＬＣＮＸ（Sunら、Hum. Gene Ther.、8 (1997)、1041-1048）、ＬＸＳＮ（Sunら、Hum. Gene Ther.、8 (1997)、1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardoら、Blood、90 (1997)、952-957）、ＨＭＢ－Ｈｂ－Ｈｕ（Vieillardら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94 (1997)、11595-11600）、ｐＭＶ７（Cochloviusら、Cancer Immunol. Immunother.、46 (1998)、61-66）、ｐＳＴＩＴＣＨ（Weitjensら、Gene Ther、5 (1998)、1195-1203）、ｐＬＺＲ（Yangら、Hum. Gene Ther.、10 (1999)、123-132）、ｐＢＡＧ（Wuら、Hum. Gene Ther.、10 (1999)、977-982）、ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Gilhamら、J. Immunother.、25 (2002)、139-151）、ｐＬＧＳＮ（Engelsら、Hum. Gene Ther.、14 (2003)、1155-1168）、ｐＭＰ７１（Engelsら、Hum. Gene Ther.、14 (2003)、1155-1168）、ｐＧＣＳＡＭ（Morganら、J. Immunol.、171 (2003)、3287-3295）、ｐＭＳＧＶ（Zhaoら、J. Immunol.、174 (2005)、4415-4423）、又はｐＭＸ（de Witteら、J. Immunol.、181 (2008)、5128-5136）など、Ｔ細胞に形質導入するのに適するレトロウイルスベクターが公知である。本発明の文脈では、細胞（例えば、Ｔ細胞）に形質導入するのに適するレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ－ＳＩＮレンチウイルスベクター（Hottaら、Nat Methods.、6 (5) (2009)、370-376）、ｐ１５６ＲＲＬ－ｓｉｎＰＰＴ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Campeauら、PLoS One、4 (8) (2009)、e6529）、ｐＣＭＶＲ８．７４（Ａｄｄｇｅｎｅ型番２２０３６）、ＦＵＧＷ（Loisら、Science、295 (5556) (2002)、868-872）、ｐＬＶＸ－ＥＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅ型番６４３６８）、ｐＬＶＥ（Brungerら、Proc Natl Acad Sci U S A、111 (9) (2014)、E798-806）、ｐＣＤＨ１－ＭＣＳ１－ＥＦ１（Huら、Mol Cancer Res.、7 (11) (2009)、1756-1770）、ｐＳＬＩＫ（Wangら、Nat Cell Biol.、16 (4) (2014)、345-356）、ｐＬＪＭ１（Solomonら、Nat Genet.、45 (12) (2013)、1428-30）、ｐＬＸ３０２（Kangら、Sci Signal.、6 (287) (2013)、rs13）、ｐＨＲ－ＩＧ（Xieら、J Cereb Blood Flow Metab.、33 (12) (2013)、1875-85）、ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ型番６２０５３）、ｐＬＳ（Miyoshiら、J Virol.、72 (10) (1998)、8150-8157）、ｐＬＬ３．７（Lazebnikら、J Biol Chem.、283 (7) (2008)、11078-82）、ＦＲＩＧ（Raissiら、Mol Cell Neurosci.、57(2013)、23-32）、ｐＷＰＴ（Ritz-Laserら、Diabetologia.、46 (6) (2003)、810-821）、ｐＢＯＢ（Marrら、J Mol Neurosci.、22(1-2)(2004)、5-11）、又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ型番２７９７６）である。

【0127】

本発明の、形質導入されたＴ細胞／Ｔ細胞は、それらの天然の環境外の、制御された条件下で増殖させることが好ましい。特に、「－を培養すること」という用語は、多細胞の真核生物に由来する（好ましくは、ヒト患者に由来する）細胞（例えば、本発明の形質導入細胞）を、インビトロにおいて増殖させることを意味する。細胞の培養とは、細胞を、それらの元の組織供給源から隔てて、生存状態に保つ実験室法である。本明細書に、本発明の形質導入細胞は、前記形質導入された細胞内又は細胞上における、本発明の融合タンパク質の発現を可能とする条件下で培養する。当該技術分野では、導入遺伝子（すなわち、本発明の融合タンパク質）の発現を可能とする条件が一般に公知であり、例えば、アゴニスト性の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体ならびにインターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などのサイトカインの添加を含む。培養された形質導入細胞内の、本発明の融合タンパク質の発現の後、形質導入細胞を、培養物（すなわち、培地）から回収する（すなわち、再抽出する）。

【0128】

本発明にはまた、本発明の方法により得ることができる、本発明の核酸分子によりコードされる融合タンパク質を発現させる、形質導入細胞も包摂される。

【0129】

さらに、本発明は、本発明の、三価の二重特異性抗体分子、又は上記で開示した方法により得られる／作製される、三価の二重特異性抗体分子を含む薬学的組成物／医薬を提供する。本発明の文脈では、前記組成物は、任意選択で、担体、安定剤、及び／又は賦形剤による、適切な製剤をさらに含む薬学的組成物である。

【0130】

本発明に従い、「医薬」という用語は、「薬学的組成物」という用語と互換的に使用され、患者、好ましくは、ヒト患者への投与のための組成物に関する。本発明の文脈では、この医薬／薬学的組成物は、Ｔ細胞、最も好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した／得た患者に投与されるものとする。本発明の文脈では、患者とは、ヒト患者を指す。さらに、本発明の文脈では、この患者は、疾患を患い、この場合、前記疾患は、悪性疾患、とりわけ、上皮由来、内皮由来、若しくは中皮由来のがん／癌腫、又は血液がんである。本発明の文脈では、がん／癌腫は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、Ｂリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（メラノーマ）、泌尿生殖器がん、例えば、精巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、及び甲状腺がん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫、若しくは骨肉腫など、他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。

【0131】

好ましい実施態様では、薬学的組成物／医薬は、非経口投与、経皮投与、管腔内投与、動脈内投与、髄腔内投与、又は組織若しくは腫瘍への直接的注射のための、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子を含む。本発明の文脈では、組成物／医薬は、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子であって、本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与される、三価の二重特異性抗体分子を含む。本発明の文脈では、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子を含む薬学的組成物／医薬は、本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与され、この場合、前記Ｔ細胞は、処置される対象から得られた。

【0132】

「組合せで」という用語の使用は、治療レジメンの成分を、対象に投与する順序を制約するものではない。したがって、本明細書で記載される薬学的組成物／医薬は、本発明の融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の投与の前、これと同時、又はこの後における、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子の投与を包摂する。本明細書で使用される「組合せで」はまた、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子の投与と、本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与とのタイミングも制約するものではない。したがって、２つの成分を、同時に／共時的に投与しない場合、投与は、１分間、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、若しくは７２時間、又は当業者によりたやすく決定され、かつ／又は本明細書で記載される、任意の適する時間差だけ隔てることができる。

【0133】

本発明の文脈では、「組合せで」という用語はまた、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子と、融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞とを、対象への投与の前に、併せてプレインキュベートする状況も包摂する。したがって、２つの成分は、投与の前に、例えば、１分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、若しくは１時間にわたり、又は当業者によりたやすく決定される、任意の適切な時間にわたりプレインキュベートすることができる。別の好ましい実施態様では、本発明は、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子と、本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞とを投与された同時に／共時的に投与する治療レジメンに関する。本発明の文脈では、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子は、融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞を投与した後で投与することができる。

【0134】

さらに、本明細書で使用される「組合せで」は、開示される治療レジメンを、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子及び融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、間を置かない連続的な投与（すなわち、２つの成分のうちの一方の投与の後、間に他のいかなる処置プロトコールの投与及び／又は実施も伴わずに、他方の投与を行う（一定の時間間隔の後に））に制約するものではない。したがって、本治療レジメンはまた、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子及び融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞との、別個の投与であって、疾患又はこの症候の処置又は防止に必要であり、かつ／又は適する、１又は複数の処置プロトコールで隔てられた投与も包摂する。このような介在する処置プロトコールの例は、疼痛用医薬の投与、化学療法の投与、疾患又はこの症候の手術による対処を含むがこれらに限定されない。したがって、本明細書で開示される治療レジメンは、疾患又はこの症候の処置又は防止に適する処置プロトコールを伴わずに、１つの処置プロトコール、又は１つを超える処置プロトコールと併せて、本明細書で規定される三価の二重特異性抗体分子、及び本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の投与を包摂する。

【0135】

前記薬学的組成物／医薬を、点滴又は注射を介して、患者に投与することが、特に想定される。本発明の文脈では、規定された融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞を、点滴又は注射を介して、患者に投与するものとする。適切な組成物／医薬の投与は、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、又は皮内投与という、異なる形で行うことができる。

【0136】

本発明の薬学的組成物／医薬は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。当該技術分野では、適切な薬学的担体の例が周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、多様な種類の湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、対象に、適切な用量で投与することができる。投与量レジメンは、主治医及び臨床因子により決定されるであろう。医療技術分野で周知の通り、任意の１人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与回数及び投与経路、全般的な健康状態、及び共時的に投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。一般に、薬学的組成物の定期的な投与としてのレジメンは、１日当たり１μｇ－５ｇの単位の範囲内にあるものとする。しかし、連続注入により好ましい投与量は、１時間当たり体重１キログラム当たり、０．０１μｇ－２ｍｇ、好ましくは、０．０１μｇ－１ｍｇ、より好ましくは、０．０１μｇ－１００μｇ、なおより好ましくは、０．０１μｇ－５０μｇの範囲であることが可能であり、最も好ましくは、０．０１μｇ－１０μｇの単位でありうるであろう。本明細書では、特に好ましい投与量を列挙する。進行は、定期的な評価によりモニタリングすることができる。投与量は、変動するであろうが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい投与量は、約１０^６－１０^１２コピーのＤＮＡ分子である。本発明の組成物は、局所投与することもでき、全身投与することもできる。投与は一般に、非経口投与、例えば、静脈内投与であるが、ＤＮＡはまた、例えば、内部又は外部の標的部位への微粒子銃送達により、標的部位に方向付けて投与することもでき、動脈内の部位に、カテーテルにより、標的部位に方向付けて投与することもできる。非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液又は滅菌非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなど、注射用の有機エステルである。水性担体は、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン、又は生理食塩水／食塩水及び緩衝媒を含む懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、補液及び栄養補充物、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づく電解質補充液など）などを含む。防腐剤、及び、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなど、他の添加剤もまた存在しうる。加えて、本発明の薬学的組成物は、好ましくは、ヒト由来の、例えば、血清アルブミン又は免疫グロブリンなどの、タンパク質性担体を含みうるであろう。薬学的本発明の組成物は、タンパク質性二重特異性抗体コンストラクト、又はこれをコードする核酸分子又はベクター（本明細書で記載される）に加えて、薬学的組成物の、目的の使用に応じて、さらなる、生物学的に活性の薬剤も含みうることが想定される。このような薬剤は、消化器系に作用する薬物、細胞分裂抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を防止する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、循環系に作用する薬物、及び／又は当該技術分野で公知のＴ細胞共刺激分子又はサイトカインなどの薬剤でありうるであろう。

【0137】

本発明の組成物／医薬の投与に可能な適応は、悪性疾患、とりわけ、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん（メラノーマ）、泌尿生殖器がん、例えば、卵巣がん、精巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がんなどの上皮がん／上皮癌、肺がん、胃がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、及び甲状腺がん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫、若しくは骨肉腫など、他の腫瘍性疾患である。

【0138】

本発明は、さらに、他の化合物、例えば、細胞増殖又は細胞刺激のために、免疫エフェクター細胞に、活性化シグナルを提供することが可能な分子を伴う、共投与プロトコールを想定する。前記分子は、例えば、Ｔ細胞の、さらなる一次活性化シグナル（例えば、さらなる共刺激分子：Ｂ７ファミリーの分子、Ｏｘ４０Ｌ、４．１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１）、又はインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）など、さらなるサイトカインでありうる。

【0139】

上記で記載した、本発明の組成物はまた、任意選択で、検出のための手段及び方法をさらに含む、診断用組成物でもありうる。

【0140】

本明細書で提示される、三価で二重特異性の結合性分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）はまた、それらを、液体相でも活用することができ、固体相担体に結合させることもできる、イムノアッセイにおける使用にも適する。本発明のポリペプチドを活用しうるイムノアッセイの例は、直接的フォーマット又は間接的フォーマットの、競合的イムノアッセイ又は非競合的イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫測定アッセイ）、及びウェスタンブロットアッセイである。

【0141】

本発明の、三価で二重特異性の結合性分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）は、多くの異なる担体に結合することが可能であり、前記ポリペプチドに特異的に結合した細胞を単離するのに使用することができる。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロース及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトを含む。本発明の目的では、担体の性質は、可溶型の場合もあり、不溶型の場合もあり、例えば、ビーズでありうる。

【0142】

当業者に公知の、多くの異なる標識及び標識付けする方法が存在する。本発明で使用しうる標識の種類の例は、酵素、放射性同位元素、コロイド状金属、蛍光性化合物、化学発光化合物、及び生物発光化合物を含む。

【0143】

本発明の最も好ましい実施態様では、医薬としての使用のための、本発明の、三価で二重特異性の抗体コンストラクト／分子が想定される。本発明の文脈では、医薬としての使用のための三価の二重特異性抗体分子であって、本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、三価の二重特異性抗体分子が記載される。前記医薬は、悪性疾患、とりわけ、上皮由来、内皮由来、若しくは中皮由来のがん／癌腫、又は血液のがん／癌腫を処置するための方法において援用することができる。本発明の文脈では、がん／癌腫は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、Ｂリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（メラノーマ）、泌尿生殖器がん、例えば、精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、及び甲状腺がん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫、若しくは骨肉腫など、他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。

【0144】

さらに、本発明の文脈では、悪性疾患を処置するための方法における使用のための、（ｉ）Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合する、第１の結合ドメイン、（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメインを含む、本明細書で記載される三価の二重特異性抗体分子であって、本明細書で規定される融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、三価の二重特異性抗体分子が想定される。

【0145】

さらに、本発明の文脈では、悪性疾患を処置するための方法であって、（ｉ）Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合する、第１の結合ドメイン、（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び（ｉｉｉ）Ｔ細胞内又はＴ細胞上で天然に存在しない、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインに結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメインを含む、本発明の、三価の二重特異性抗体分子の、それを必要とする対象への投与を含み、前記三価の二重特異性抗体分子が、前記対象に由来する、形質導入されたＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、本明細書で規定される融合タンパク質を含むＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与される方法が想定される。本発明の文脈では、がん／癌腫は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、Ｂリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（メラノーマ）、泌尿生殖器がん、例えば、精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、及び甲状腺がん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫、若しくは骨肉腫など、他の腫瘍性疾患からなる群から選択される。

【0146】

さらに、本発明に従い、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭ（腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんを処置するための方法において使用することができる。したがって、本発明の文脈では、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭを指向する／これに結合する／これと相互作用する２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つの結合ドメインを含む、三価の二重特異性抗体分子を、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんを処置するための方法において使用することができる。本発明の代替的な実施態様では、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭを指向する／これに結合する／これと相互作用する１つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、２つの結合ドメインを含む、三価の二重特異性抗体分子を、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんを処置するための方法において使用することができる。本発明の文脈では、ＥｐＣＡＭ、好ましくは、ヒトＥｐＣＡＭに対する、１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｃｒｉｐｔｏを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む、三価の二重特異性抗体分子を、胃腸がん、例えば、胃腸由来の腺癌の処置において使用することができる。本明細書で記載される、ＨＥＲ１、好ましくは、ヒトＨＥＲ１を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインと、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインとを含む、三価の二重特異性抗体分子を、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんを処置するための方法において使用することができる。ＨＥＲ２、好ましくは、ヒトＨＥＲ２を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＨＥＲ３、好ましくは、ヒトＨＥＲ３を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＣＤ２０、好ましくは、ヒトＣＤ２０を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＣＤ２２、好ましくは、ヒトＣＤ２２を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＣＤ３３、好ましくは、ヒトＣＤ３３を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＣＡ１２－５、好ましくは、ヒトＣＡ１２－５を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくは、ヒトＨＬＡ－ＤＲを指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＭＵＣ－１、好ましくは、ヒトＭＵＣ－１を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。Ａ３３、好ましくは、ヒトＡ３３を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＰＳＭＡ、好ましくは、ヒトＰＳＭＡを指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。トランスフェリン受容体、好ましくは、ヒトトランスフェリン受容体を指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。ＣＡ－ＩＸ、好ましくは、ヒトＣＡ－ＩＸを指向する／これに結合する／これと相互作用する１つ又は２つの結合ドメインを含み、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない、本明細書で規定される、融合タンパク質の細胞外ドメイン、すなわち、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインのうちの１つを指向する／これに結合する／これと相互作用する、１つ又は２つの結合ドメインを含む分子又はコンストラクト（すなわち、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体分子）を、胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんを処置するための方法において使用することができる。

【0147】

本発明はまた、疾患、上皮由来、内皮由来、若しくは中皮由来のがん、及び／又は血液がんなどの悪性疾患を処置するための方法にも関する。このような疾患は、とりわけ、食道がん、胃がん、結腸がん、小腸がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、脳のがん、腎臓がん、精巣がん、皮膚がん、白血病、及び／又はリンパ腫であり、
方法は、形質導入されたＴ細胞の、対象への投与を含む。本発明の文脈では、前記対象は、ヒトである。

【0148】

本発明の文脈では、疾患を処置するための方法であって、
（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、対象から単離する工程と；
（ｂ）前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に、本明細書の上記で記載した融合タンパク質を形質導入する工程と；
（ｃ）形質導入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、前記対象に投与する工程と
を含む方法が記載される。

【0149】

本発明の文脈では、前記形質導入されたＴ細胞、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、前記対象に、静脈内注入により投与する。

【0150】

さらに、本発明は、疾患を処置するための方法であって、
（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、対象から単離する工程と；
（ｂ）前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に、本明細書の上記で記載した融合タンパク質を形質導入する工程と；
（ｃ）前記単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に、Ｔ細胞受容体を共形質導入する工程と；
（ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体により拡大する工程と；
（ｅ）形質導入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞を、前記対象に投与する工程と
を含む方法を提供する。

【0151】

本発明は、単離されたＴ細胞上に天然に存在する（腫瘍）抗原が、本明細書で記載される、三価の二重特異性抗体が、１つ又は２つの結合ドメインを介して結合する腫瘍抗原と同一であることを確認するための方法により解析される単離Ｔ細胞に関する。本発明の文脈では、Ｔ細胞内及び／又はＴ細胞上で天然に存在しない／天然に発現しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を導入することにより、本明細書で規定される融合タンパク質を含む、単離された／得られたＴ細胞を、人工的に改変する。本発明の文脈では、単離された／得られたＴ細胞の人工的な改変は、本明細書で記載される形質導入法に関する。したがって、本発明の文脈では、処置される対象は、本明細書の上記で記載される、腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原を有することにより特徴を明らかにされる疾患を患うことにより特徴を明らかにされる対象に関する。本発明の文脈では、処置される対象から得られた／単離された、形質導入されたＴ細胞の投与は、静脈内注入により実施されるであろう。

【0152】

さらなる実施態様では、本発明は、疾患を処置するための方法であって、
（ａ）患者から切除された腫瘍から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する工程と；
（ｂ）ＴＩＬを培養し、これらに、本明細書の上記で記載した融合タンパク質を形質導入する工程と；
（ｃ）機能的な腫瘍認識アッセイに基づき、ＴＩＬ培養物を選択する工程と；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体により、ＴＩＬを拡大する工程と；
（ｅ）形質導入されたＴＩＬを、前記対象に投与する工程と
を含む方法に関する。

【0153】

「機能的な腫瘍認識」アッセイという用語は、ＴＩＬの、自家腫瘍細胞、例えば、患者の腫瘍細胞、又はＨＬＡ型が同一な細胞株との共培養を意味する。リードアウトは、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性（ＬＤＨ、カルセインの放出）である。さらなるリードアウトは、サイトカイン分泌、細胞内サイトカインの存在についてのＴ細胞フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでありうるであろう。

【0154】

上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体による、ＴＩＬなど、Ｔ細胞の拡大工程）はまた、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）など、（刺激性）サイトカインの存在下で実施することもできる。本発明の文脈では、上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体による、ＴＩＬなど、Ｔ細胞の拡大工程）はまた、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）及び／又はインターロイキン２１（ＩＬ－２１）の存在下で実施することもできる。

【0155】

加えて、処置のための方法はまた、本発明の、三価の二重特異性抗体の投与も含みうる。前記三価の二重特異性抗体は、形質導入されたＴ細胞を、投与する前に、これと同時に、又はこの後で投与することができる。本発明の文脈では、形質導入されたＴ細胞の投与は、静脈内注入により実施されるであろう。本発明の文脈では、この形質導入されたＴ細胞を、処置される対象から単離する／得る。

【0156】

これらの実施態様及び他の実施態様は、本発明の記載及び実施例により開示及び包摂される。本発明に従い援用される抗体、方法、使用、及び化合物のうちのいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば、電子デバイスを使用して、公開のライブラリー及びデータベースから検索することができる。例えば、インターネット上で利用可能な公開データベースである「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ下で活用することができる。当業者には、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／など、さらなるデータベース及びアドレスが公知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍを使用して、もまた得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0157】

【図1A】形質導入されたＴ細胞と、腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）か、又は腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させない（ＥｐＣＡＭ－）、マウス膵臓がん腫瘍細胞（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）との共培養 融合タンパク質であるＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４２（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））の活性化を介する、形質導入されたＴ細胞の活性化を実証するために、Ｔ細胞に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質を形質導入した（本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）。形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））を伴うか、又は伴わずに、腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）膵臓がん（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）細胞、又は腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させない（ＥｐＣＡＭ－）膵臓がん（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）細胞と共に、１０：１の比で、１２時間にわたりインキュベートした。加えて、それぞれの濃度の、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」を伴うＥ３ Ｔ細胞を、３７℃で、ＰＢＳ中に２０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）により、３０分間にわたり前処理して、非特異的結合をブロックした。当業者には、本明細書では、ＦＣＳである、過剰量のポリクローナルタンパク質の添加により、本明細書では、抗体である、施されるタンパク質の非特異的結合を防止する手段として、ブロッキングの概念が周知である。ネガティブコントロールとして、非シグナル伝達マーカー抗原を形質導入したＴ細胞を使用した。Ｔ細胞の活性化を、ＥＬＩＳＡを使用するＩＮＦ－γ分泌として測定した。結果は、抗原陰性腫瘍細胞を上回る、抗原陽性（ＥｐＣＡＭ＋）細胞に対する、腫瘍細胞の認識の増強を示す。四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」は、Ｅ３ Ｔ細胞を、膵臓がん（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）細胞に動員し、ＥｐＣＡＭを発現させる腫瘍細胞に対して、特異的にリダイレクトされたＴ細胞の活性化を誘導する。ＥＧＦＲを形質導入されたＴ細胞内では、活性化を検出できなかった。これらの結果は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質を使用して、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」を介する、Ｔ細胞の活性化を誘発しうることを指し示す。しかし、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」の存在下におけるＴ細胞の活性化はまた、四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」の腫瘍標的の非存在下でも生じることから、Ｔ細胞の非特異的活性化が指し示される。図１における「ブロッキングされた」という用語は、非特異的Ｔ細胞の活性化の程度について評価するために、ＦＣＳでブロッキングされたプレート上で、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体と共に、共インキュベートする条件を指す。この条件下で、活性化が存在するならば、方向付けられていないＴ細胞の架橋から生じているはずである。「Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ」という用語は、非特異的な（腫瘍を指向しない）活性化及び溶解について評価するために、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体及びＥｐＣＡＭ－腫瘍細胞と共に共インキュベートする条件を指す。「Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ－ＥｐＣＡＭ」という用語は、特異的（腫瘍上の）活性化及び溶解について評価するために、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体及びＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞と共に共インキュベートする条件を指す。

【図1B】形質導入されたＴ細胞と、腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）か、又は腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させない（ＥｐＣＡＭ－）、マウス膵臓がん腫瘍細胞（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）との共培養 融合タンパク質であるＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４２（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））の活性化を介する、形質導入されたＴ細胞の活性化を実証するために、Ｔ細胞に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質を形質導入した（本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）。形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））を伴うか、又は伴わずに、腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）膵臓がん（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）細胞、又は腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させない（ＥｐＣＡＭ－）膵臓がん（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）細胞と共に、１０：１の比で、１２時間にわたりインキュベートした。加えて、それぞれの濃度の、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」を伴うＥ３ Ｔ細胞を、３７℃で、ＰＢＳ中に２０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）により、３０分間にわたり前処理して、非特異的結合をブロックした。当業者には、本明細書では、ＦＣＳである、過剰量のポリクローナルタンパク質の添加により、本明細書では、抗体である、施されるタンパク質の非特異的結合を防止する手段として、ブロッキングの概念が周知である。ネガティブコントロールとして、非シグナル伝達マーカー抗原を形質導入したＴ細胞を使用した。Ｔ細胞の活性化を、ＥＬＩＳＡを使用するＩＮＦ－γ分泌として測定した。結果は、抗原陰性腫瘍細胞を上回る、抗原陽性（ＥｐＣＡＭ＋）細胞に対する、腫瘍細胞の認識の増強を示す。四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」は、Ｅ３ Ｔ細胞を、膵臓がん（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）細胞に動員し、ＥｐＣＡＭを発現させる腫瘍細胞に対して、特異的にリダイレクトされたＴ細胞の活性化を誘導する。ＥＧＦＲを形質導入されたＴ細胞内では、活性化を検出できなかった。これらの結果は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質を使用して、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」を介する、Ｔ細胞の活性化を誘発しうることを指し示す。しかし、四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」の存在下におけるＴ細胞の活性化はまた、四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」の腫瘍標的の非存在下でも生じることから、Ｔ細胞の非特異的活性化が指し示される。図１における「ブロッキングされた」という用語は、非特異的Ｔ細胞の活性化の程度について評価するために、ＦＣＳでブロッキングされたプレート上で、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体と共に、共インキュベートする条件を指す。この条件下で、活性化が存在するならば、方向付けられていないＴ細胞の架橋から生じているはずである。「Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ」という用語は、非特異的な（腫瘍を指向しない）活性化及び溶解について評価するために、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体及びＥｐＣＡＭ－腫瘍細胞と共に共インキュベートする条件を指す。「Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ－ＥｐＣＡＭ」という用語は、特異的（腫瘍上の）活性化及び溶解について評価するために、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体及びＥｐＣＡＭ－腫瘍細胞と共に共インキュベートする条件を指す。

【図2】形質導入されたＴ細胞と、腫瘍細胞との共培養における、二重特異性抗体のタイトレーション 図１に関して上記で記載した実験の設定に基づき、四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））の濃度を変動させる実験を実施した。二重特異性抗体分子（ｂｓＡｂ）を、１ｎｇ／ｍＬ－１μｇ／ｍＬでタイトレーションすることにより、ＥＬＩＳＡにより測定される、ＩＦＮ－γの分泌量の増大を見ることができた。ＥｐＣＡＭ特異的Ｔ細胞の活性化及び非特異的Ｔ細胞の活性化のいずれも、用量依存的であることが見出された。

【図3】プレートに結合した三価の二重特異性抗体によるＴ細胞の活性化の、四価の二重特異性抗体と対比した比較 ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））；本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）を形質導入されたＴ細胞、又は野生型（ＷＴ）Ｔ細胞を、漸増濃度で、プレート上のコーティングに使用されるか、又はＴ細胞培養物に添加される、（ｉ）四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））、（ｉｉ）三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２２（タンパク質）及び２１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、図９ならびに表１及び２も参照されたい）、又は（ｉｉｉ）ポジティブコントロールとしてのセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、４８時間にわたり刺激した。第１の条件では、アッセイプレートを、抗体でコーティングし、第２の条件では、抗体を、可溶性形態で、Ｔ細胞に添加した。ＩＦＮ－γの放出は、ＥＬＩＳＡにより決定した。結果は、コーティング条件下にある、全ての抗体による、Ｅ３を形質導入されたＴ細胞の、同等な活性化を示す。図３における「ブロッキングされた」という用語は、非特異的Ｔ細胞の活性化の程度について評価するために、ＦＣＳでブロッキングされたプレート上で、形質導入されたＴ細胞を、四価の二重特異性抗体と共に、共インキュベートする条件を指す。この条件下で、活性化が存在するならば、方向付けられていないＴ細胞の架橋から生じているはずである。

【図4】可溶型で三価の二重特異性抗体と共にインキュベートされた、形質導入Ｔ細胞の活性化の、可溶型で四価の二重特異性抗体と対比した比較 可溶性条件下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））；本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）を形質導入されたＴ細胞の非特異的活性化について探索するために、図３で記載される試料を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡにおいて、希釈せずに使用した。四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））は、Ｔ細胞に対する、２つの結合部位に潜在的に起因して、Ｔ細胞の非特異的活性化を示す。これは、２つのＴ細胞の間の架橋をもたらすことが可能であり、これにより、細胞によるＩＦＮ－γの分泌をもたらしうる。逆に、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２２（タンパク質）及び２１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、図９ならびに表１及び２も参照されたい）により、この非特異的活性化は、１つのＥＧＦＲへの結合部位の喪失を介して消失する。

【図5】抗体濃度の関数としての、表面抗原への結合の用量依存性についての解析 四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））、及び三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２２（タンパク質）及び２１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、図９ならびに表１及び２も参照されたい）により、抗体価数の、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ）））を形質導入されたＴ細胞の表面飽和に対する影響に対処するため、細胞を、漸増濃度の、四価又は三価のｂｓＡｂ（１０ｎｇ／ｍＬ；１００ｎｇ／ｍＬ；５００ｎｇ／ｍＬ；１μｇ／ｍＬ；５μｇ／ｍＬ；１０μｇ／ｍＬ；２０μｇ／ｍＬ；２５μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーを介する二次抗体（ＦＩＴＣ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ：１０９－０９６－０９７）染色により、表面飽和を決定した。四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、ＥＧＦＲに対する、さらなる結合部位に好適な、低濃度における高度な飽和（三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）と比較した、曲線の左方シフト）を示す。

【図6】抗体濃度の関数としての、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）により媒介される、形質導入されたＴ細胞による、ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞に対する、リダイレクトされた溶解能の、四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）と対比した比較 両方の抗体の細胞傷害性の潜在力を比較するために、ｂｓＡｂを（それぞれ、三価又は四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を）プレロードされたＴ細胞であって、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ）））；本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）を形質導入されたＴ細胞を、腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させる膵臓がん細胞（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）と共に、９時間にわたり共培養した。殺滅の有効性を、腫瘍細胞のＬＤＨ放出により測定した。抗体（濃度を、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、又は６２．５ｎｇ／ｍｌとする）は、ＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）膵臓がん細胞に対する、ほぼ同一な溶解能を有する。しかし、低濃度（すなわち、３１．２５ｎｇ／ｍｌ又は１５．６３ｎｇ／ｍｌの濃度）では、三価ｂｓＡｂは、ＥｐＣＡＭ＋がん細胞に対する細胞傷害効果の、四価の二重特異性抗体分子と比較した増大により特徴を明らかにされる。

【図7】抗体濃度の関数としての、三価の二重特異性抗体により媒介される、形質導入されたＴ細胞による、ＥｐＣＡＭ－腫瘍細胞に対する、非特異的溶解能の、四価の二重特異性抗体と対比した比較 ＥｐＣＡＭを発現させない（ＥｐＣＡＭ－）膵臓がん細胞（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ）を、ｂｓＡｂ（三価又は四価の二重特異性抗体）をプレロードされたＴ細胞と共に、９時間にわたり共培養した。溶解能は、ＬＤＨ放出により決定した。高抗体濃度では（すなわち、２５０ｎｇ／ｍｌ又は６２．５ｎｇ／ｍｌの抗体濃度では）、四価二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」は、低抗体濃度と共に低下する、バックグラウンドの非特異的溶解を示す。逆に、各被験濃度の、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２２（タンパク質）及び２１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、図９ならびに表１及び２も参照されたい）は、バックグラウンドの非特異的溶解を示さない。四価ｂｓＡｂについて示される、非特異的な標的細胞の溶解は、三価ｂｓＡｂにより消失する。したがって、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（配列番号２３３）と、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））；「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）を形質導入されたＴ細胞との組合せは、ＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）膵臓がん細胞を、特異的に溶解させる。

【図8】融合タンパク質の概観 Ｉｇリーダー配列（配列番号２０６）、Ｃｒｉｐｔｏの細胞外ドメイン（配列番号６２）、ＣＤ８のヒンジドメイン（配列番号６４（マウス）及び７４（ヒト））、ならびにＣＤ２８（配列番号５６（マウス）及び６８（ヒト））及びＣＤ３ｚ（配列番号５８（マウス）及び７０（ヒト））のシグナル伝達共刺激ドメインから構成される、Ｃｒｉｐｔｏ融合タンパク質（配列番号４６（マウス）及び１２０（ヒト））。ＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメイン（配列番号７６）、ＣＤ２８の膜貫通アンカリングドメイン（配列番号５４（マウス）及び６６（ヒト））、ＣＤ２８（配列番号５６（マウス）及び６８（ヒト））及びＣＤ３ｚ（配列番号５８（マウス）及び７０（ヒト））のシグナル伝達共刺激ドメインから構成される、ＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメイン（配列番号７６）、ＣＤ２８の膜貫通アンカリングドメイン（配列番号５４（マウス）及び６６（ヒト））、ＣＤ２８（配列番号５６（マウス）及び６８（ヒト））及びＣＤ３ｚ（配列番号５８（マウス）及び７０（ヒト））のシグナル伝達共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ｚのシグナル伝達刺激ドメイン（配列番号５８（マウス）又は７０（ヒト））から構成される、ＥＧＦＲｖＩＩＩ融合タンパク質（配列番号４２（マウス）及び４８（ヒト））。代替的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメイン（配列番号７６）、ＣＤ２８の膜貫通アンカリングドメイン（配列番号５４（マウス）及び６６（ヒト））、ＣＤ２８シグナル伝達共刺激ドメイン（配列番号５６（マウス）及び６６（ヒト））及び４－１－ＢＢ（配列番号６０（マウス）又は７２（ヒト））及びＣＤ３ｚのシグナル伝達共刺激ドメイン（配列番号５８（マウス）又は７０（ヒト））から構成される、ＥＧＦＲｖＩＩＩ融合タンパク質（配列番号４４（マウス）及び５０（ヒト））。

【図9】三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」の概括的構造 三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」を含む／これらからなる配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）の概括的構造。ｍｕＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲｖＩＩＩの可変ドメインを、それぞれのレシピエント哺乳動物用の発現ベクターにあらかじめ挿入された定常鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質の発現を、ＣＭＶプロモーターにより駆動し、合成のポリＡシグナル配列を、コード配列（ＣＤＳ）の３’端に置く。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。分子は、懸濁液中で増殖するＣＨＯ細胞に、哺乳動物用の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。一過性のトランスフェクションは、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において行った。細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「軽鎖（ＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ＶＨ－ＣＫ－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「交差軽鎖（ＶＬ－ＣＨ１）」）の比でトランスフェクトした。濾過された上清を、精製まで、４℃に保った。分泌タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１つ－２つのサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程により、細胞培養物上清から精製した。精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数で除した、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。

【図9A】最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ－ＳＤＳ解析により解析した（右）。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従い使用した。分子の凝集物含有量は、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ解析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を、２５℃の、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で使用して解析した。全ての分子の、最終的な品質は、良好であり、モノマーの含有量は、≧９６％であった。分子１及び２は、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２２（タンパク質）及び２１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）であって、インビトロバッチ（分子１）内で作製されるか、又はインビボバッチ（分子２）内で作製された、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子を指す。ｍｕＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子の作製及び精製についての概要：

【図9B】最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ－ＳＤＳ解析により解析した（右）。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従い使用した。分子の凝集物含有量は、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ解析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を、２５℃の、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で使用して解析した。全ての分子の、最終的な品質は、良好であり、モノマーの含有量は、≧９６％であった。分子１及び２は、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」（配列番号２２（タンパク質）及び２１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」（配列番号２４（タンパク質）及び２３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」（配列番号２６（タンパク質）及び２５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」（配列番号２８（タンパク質）及び２７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）であって、インビトロバッチ（分子１）内で作製されるか、又はインビボバッチ（分子２）内で作製された、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子を指す。ｍｕＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子の作製及び精製についての概要：

【表1】

【図10】三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」の概括的構造 三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」を含む／これらからなる配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）の概括的構造。ＭＳＬＮ／ＥＧＦＲｖＩＩＩの可変ドメインを、それぞれのレシピエント哺乳動物用の発現ベクターにあらかじめ挿入された定常鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質の発現を、ＭＰＳＶプロモーターにより駆動し、合成のポリＡシグナル配列を、ＣＤＳの３’端に置く。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「軽鎖（ＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ＶＨ－ＣＫ－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「交差軽鎖（ＶＬ－ＣＨ１）」）の比でトランスフェクトした。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度で、アジ化ナトリウムを添加した。溶液を、精製まで、４℃に保った。分泌タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１つ－２つのサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程により、細胞培養物上清から精製した。

【図10A】最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ－ＳＤＳ解析により解析した（右）。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従い使用した。分子の凝集物含有量は、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ解析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を、２５℃の、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で使用して解析した。全ての分子の、最終的な品質は、良好であり、モノマーの含有量は、≧９６％であった。分子１は、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」（配列番号２（タンパク質）及び１（ＤＮＡ））、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」（配列番号４（タンパク質）及び３（ＤＮＡ））、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」（配列番号６（タンパク質）及び５（ＤＮＡ））、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」（配列番号８（タンパク質）及び７（ＤＮＡ））を含む／これらからなる配列番号２３５；また、図１０ならびに表３及び４も参照されたい）を指す。ＭＳＬＮ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子の作製及び精製についての概要：

【表2】

三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」を含む／これらからなる配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）についてのＣＥ－ＳＤＳ解析：ゲル電気泳動について、タンパク質標準物質、非還元条件下のタンパク質、及び還元条件下のタンパク質を示す。右側のグラフは、非還元条件下及び還元条件下のタンパク質の蛍光を示す。

【図10B】純度を決定するための、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）についての解析的サイズ排除クロマトグラフィー解析。

【図11】三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」の概括的構造 三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（プラスミド／ベクターである、「ＭＲ１．１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＨ－Ｃｋ－（Ｇ４Ｓ）２ ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１６６２１」（配列番号２０７に示されたＤＮＡ配列によりコードされる配列番号２０８）、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」（配列番号２１０（タンパク質）及び２０９（ＤＮＡ））、「ＭＣＳＰ ＭＬ２ ＶＬ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１６６１９」（配列番号２１２（タンパク質）及び２１１（ＤＮＡ））、及び「ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＹＲＦ，ｐＥＴＲ１６６１８」（配列番号２１４（タンパク質）及び２１３（ＤＮＡ）））を含む／これらからなる配列番号２３４；また、表５及び６も参照されたい）の概括的構造。

【図11A】三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（配列番号２３４；また、表５及び６も参照されたい）についてのＣＥ－ＳＤＳ解析：ゲル電気泳動について、タンパク質標準物質、非還元条件下のタンパク質、及び還元条件下のタンパク質を示す。

【図12】腫瘍抗原であるＥｐＣＡＭを発現させる（ＥｐＣＡＭ＋）マウスがん腫瘍細胞（Ｂ１６ＥｐＣＡＭ腫瘍モデル及び４Ｔ１腫瘍モデル）の、四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））、及び三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）との共培養 二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）についての用量反応曲線を決定するために、四価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない））、及び三価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）の両方を、一対一でタイトレーションし、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出により、細胞傷害性を測定した。

【図12A】こうして、Ｂ１６ＥｐＣＡＭ腫瘍モデルでは、それぞれの抗体の用量の低下と共に、細胞傷害性の低下を観察することができる。さらに、いずれの抗体フォーマットも、十分かつ同等な腫瘍細胞の殺滅を示す。

【図12B】こうして、４Ｔ１腫瘍モデルでは、それぞれの抗体の用量の低下と共に、細胞傷害性の低下を観察することができる。さらに、いずれの抗体フォーマットも、十分かつ同等な腫瘍細胞の殺滅を示す。

【図13】Ｐａｎｃ０２－ＥｐＣＡＭ腫瘍細胞に対する、Ｅ３を形質導入されたマウスＴ細胞による、殺滅機構を決定する、リアルタイム細胞傷害アッセイ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ）））（「Ｅ３」と称する）を形質導入されたＴ細胞の殺滅能は、ＦａｓＬブロッキング抗体（ＣＤ１７８（Ｆａｓリガンド）モノクローナル抗体、クローンＭＦＬ３（型番１６－５９１１－８５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で、腫瘍細胞とＴ細胞との間の、ＦａｓＬ－Ｆａｓ間相互作用をブロックすることにより損われうる。ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ測定器を使用することにより、この知見を、図１３に示す。デバイスは、接着性細胞の数に依存する、時間経過にわたる、妨害の大きさの変化を測定する。融合タンパク質であるＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ）））の活性化とは対照的に、ＥｐＣＡＭ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲＥｐｃａｍ；配列番号２４９（タンパク質）及び２４８（ＤＮＡ））を形質導入されたＴ細胞は、ＦａｓＬブロッキング抗体の存在下でもなお、腫瘍細胞の溶解を誘導することが可能である。ＰａｎｃＯＶＡＥｐＣＡＭ条件とは、腫瘍細胞だけを伴う条件を指す。Ｔ細胞条件とは、Ｔ細胞だけを伴う条件を指す。ＣＡＲＥｐＣＡＭを伴う条件とは、ＣＡＲＥｐＣＡＭ（配列番号２４９（タンパク質）及び２４８（ＤＮＡ）））を形質導入されたＴ細胞の、ＰａｎｃＯＶＡ－ＥｐＣＡＭとの共培養を指す。

【図14】濃度を変動させる、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）を使用する抗体結合アッセイ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４７（ＤＮＡ）によりコードされる配列番号４８（タンパク質））（本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」と称する）のヒトバージョンを形質導入されたＴ細胞を、ｂｓＡｂ濃度を１．０ｇ／ｍｌとする、三価の二重特異性抗体である「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）により、４８時間にわたり刺激した。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂは、Ｅ３を形質導入されたＴ細胞を、特異的に刺激するが、完全長Ｅ３コンストラクトを欠くＴ細胞（Ｅ３ｄｅｌ（配列番号２４７（タンパク質）及び２４６（ＤＮＡ）））及びＵＴ）は、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂの存在下で刺激されない。このＴ細胞の刺激は、そのＦｃ様部分を介する、Ｅ３－ｂｓＡｂの、プレートへの結合に条件付けられるので、可溶型Ｅ３－ｂｓＡｂは、Ｅ３を形質導入されたＴ細胞を刺激しない。Ｅ３ｄｅｌが、細胞内ドメインを欠く、Ｅ３の切除型であるのに対し、ＵＴは、非形質導入Ｔ細胞を指す。

【図15】組換えメソテリン（ＭＳＬＮ）による刺激：組換えメソテリンの存在下における、形質導入されたＴ細胞と、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）との共培養 ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４７（ＤＮＡ）によりコードされる配列番号４８（タンパク質））（「Ｅ３ Ｔ細胞」又は「Ｅ３」と称する）のヒトバージョンを形質導入されたＴ細胞を、ｂｓＡｂ濃度を１．０ｇ／ｍｌとする、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）により、４８時間にわたり刺激した。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂは、Ｅ３ Ｔ細胞を、特異的に刺激するが、完全長Ｅ３コンストラクトを欠くＴ細胞（Ｅ３ｄｅｌ（配列番号２４７（タンパク質）及び２４６（ＤＮＡ）））及びＵＴ）は、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂ（可溶型）及び組換えメソテリン（５μｇ／ｍｌの濃度まで、ウェルをコーティングする）の存在下で刺激されない。コントロールは、Ｔ細胞（Ｅ３ Ｔ細胞対非形質導入Ｔ細胞対Ｅ３ｄｅｌコンストラクトを形質導入したＴ細胞）であった。Ｅ３ｄｅｌが、細胞内ドメインを欠く、Ｅ３の切除型であるのに対し、ＵＴは、非形質導入Ｔ細胞を指す。

【図16】ＨＥＫ２９３－ＦＬＩＰｉｎ－ＭＳＬＮ Ｅ３を形質導入されたヒトＴ細胞の共培養 ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４７（ＤＮＡ）によりコードされる配列番号４８（タンパク質））（「Ｅ３ Ｔ細胞」又は「Ｅ３」と称する）のヒトバージョンを形質導入されたＴ細胞を、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂの濃度を１．０ｇ／ｍｌとする、三価の二重特異性抗体である「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）により、４８時間にわたり刺激した。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂは、Ｅ３ Ｔ細胞を、特異的に刺激するが、完全長Ｅ３コンストラクトを欠くＴ細胞（Ｅ３ｄｅｌ（配列番号２４７（タンパク質）及び２４６（ＤＮＡ）））及びＵＴ）は、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂ（可溶型）及びＨＥＫ２９３－ＦＬＰｉｎ－ＭＳＬＮ細胞（ＨＥＫ２９３）の存在下で刺激されない。これは、アッセイを、単一クローン（Ｃ１２）により設定した場合のほか、ポリクローナル設定の場合にも観察された。ＵＴは、非形質導入Ｔ細胞を指す。ＢｓＡｂは、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）だけを伴う条件を指す。共培養は、エフェクター対標的比を、１０：１として、４８時間にわたり行った。腫瘍細胞は、共培養の６時間前に播種し、Ｔ細胞には、共培養の３０分前に、ｂｓＡｂを、プレロードした（ｂｓＡｂ濃度：１μｇ／ｍｌ）。Ｅ３ｄｅｌが、細胞内ドメインを欠く、Ｅ３の切除型であるのに対し、ＵＴは、非形質導入Ｔ細胞を指す。

【図17】Ｓｕｉｔ－ＯＥ－ＭＳＬＮ刺激アッセイ：ＭＳＬＮを過剰発現させる膵臓細胞株を使用して、前記腫瘍細胞の存在下又は非存在下におけるＴ細胞の条件的刺激について、三価の二重特異性抗体である「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）の効率を調べた メソテリン（ＭＳＬＮ）を過剰発現させる膵臓細胞株（図中では、「Ｓｕｉｔｓ００７ＯＥ」と称する）の存在下又は非存在下において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ３８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４７（ＤＮＡ）によりコードされる配列番号４８（タンパク質））（本明細書の以下では、「Ｅ３ Ｔ細胞」又は「Ｅ３」と称する）のヒトバージョンを形質導入したＴ細胞を、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂの濃度を１．０ｇ／ｍｌとする、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）により、４８時間にわたり刺激した。「Ｓｕｉｔｓ００７ＯＥ」という用語は、膵臓細胞株を指す。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂは、Ｅ３ Ｔ細胞を、特異的に刺激するが、完全長Ｅ３コンストラクトを欠くＴ細胞（Ｅ３ｄｅｌ（配列番号２４７（タンパク質）及び２４６（ＤＮＡ）））及びＵＴ）は、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂ（可溶型）及びＳｕｉｔｓ００７ＯＥの存在下で刺激されない。アッセイは、腫瘍細胞に対するエフェクター対標的比を、１９：１として実施した。腫瘍細胞は、共培養の６時間前に播種し、Ｔ細胞には、共培養の３０分前に、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」ｂｓＡｂを、プレロードした（ｂｓＡｂ濃度：１μｇ／ｍｌ）。結果は、がん細胞を認識し、活性化させる、方法の能力を裏付ける。Ｅ３ｄｅｌが、細胞内ドメインを欠く、Ｅ３の切除型であるのに対し、ＵＴは、非形質導入Ｔ細胞を指す。

【実施例】

【0158】

以下の実施例により、本発明を例示する。

【0159】

実施例１： 四価の二重特異性抗体である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない）））の調製
四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖（リーダー配列を伴わない）及び配列番号２３０（重鎖（リーダー配列を伴わない）））を、国際公開第２０１３／１１３６１５号の実施例１、２、及び４で記載されているクローニング方法により調製した。以下の実施例では、概念実証として、例示的に、一方のアーム上の、ｄｅｌ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号２３２（タンパク質）及び２３１（核酸（ＤＮＡ）））に対する２つの抗原結合部位／抗原結合ドメインと、他方のアーム上の、（マウス）ＥｐＣＡＭ（配列番号８３（核酸（ＤＮＡ））及び８４（タンパク質））に対する２つの抗原結合部位／抗原結合ドメインとを伴う、四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９及び２３０）を、国際公開第２０１３／１１３６１５号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例４に沿って構築した。

【0160】

実施例２： 三価の二重特異性抗体の調製
２．１ 三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、プラスミド／ベクターである「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」を含む／これらからなる配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）の調製
本実施例では、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、プラスミド／ベクターである「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」を含む／これらからなる配列番号２３３；表１及び２も参照されたい）を調製した。その概略的例示を、図９に示す；古典的フォーマットである、ｍｕＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ ２＋１ ＩｇＧ（配列番号２３３；表１及び２も参照されたい）。ｍｕＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲｖＩＩＩの可変ドメインを、それぞれのレシピエント哺乳動物用の発現ベクターにあらかじめ挿入された定常鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質の発現を、ＣＭＶプロモーターにより駆動し、合成のポリＡシグナル配列を、ＣＤＳの３’端に置く。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。分子は、懸濁液中で増殖するＣＨＯ細胞に、哺乳動物用の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。一過性のトランスフェクションは、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において行った。細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「軽鎖（ＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ＶＨ－ＣＫ－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「交差軽鎖（ＶＬ－ＣＨ１）」）の比でトランスフェクトした。濾過された上清を、精製まで、４℃に保った。分泌タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１つ－２つのサイズ除外クロマトグラフィー工程により、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０ ｐＨ７．５ ２５ｍｌで平衡化させたＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０ ｐＨ７．５、少なくとも１０カラム容積で洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０ ｐＨ２．５ ２０カラム容積（勾配０％－１００％）中で溶出させた。１０分の１濃度の２ＭのトリスｐＨ １０．５を添加することにより、タンパク質溶液を中和した。２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で平衡化させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に、標的タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）で、４ｍｌの最大容積に濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィー後の解析作業のために、単一の画分内の分子の純度及び分子量は、還元剤の非存在下におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥと、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を伴う染色とにより解析した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（４－１２％のビス－トリス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、又は３－８％のトリス酢酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示書に従い使用した。精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数で除した、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ－ＳＤＳ解析により解析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従い使用した（図９Ａ、９Ｂ）。分子の凝集物含有量は、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ解析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を、２５℃の、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で使用して解析した（図９Ｂ）。全ての分子の、最終的な品質は、良好であり、モノマーの含有量は、≧９６％であった。以下の表７は、ｍｕＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子の作製及び精製についてまとめる。表７中の分子１及び２は、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥｐＣＡＭ」（プラスミド／ベクターである、プラスミド／ベクターである「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ｍｕＥｐＣＡＭ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１４９５３」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１４９５１」、「ＶＬ ＥｐＣＡＭ Ｇ．８．８ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１４８８２」、及び「ＶＨ ｍｕＥｐＣＡＭ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１４９４０」を含む／これらからなる配列番号２３３；また、表１及び２も参照されたい）であって、インビトロバッチ（分子１）内で作製されるか、又はインビボバッチ（分子２）内で作製された、三価の二重特異性抗体分子を指す。
表7:

【0161】

２．２ 三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＣＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」を含む／これらからなる配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）の調製
本実施例では、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＣＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」を含む／これらからなる配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）を調製した（その概略的例示を、図１０に示す；古典的フォーマットである、ＭＳＬＮ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ ２＋１ ＩｇＧ（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい））。ＭＳＬＮ／ＥＧＦＲｖＩＩＩの可変ドメインを、それぞれのレシピエント哺乳動物用の発現ベクターにあらかじめ挿入された定常鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質の発現を、ＭＰＳＶプロモーターにより駆動し、合成のポリＡシグナル配列を、ＣＤＳの３’端に置く。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「軽鎖（ＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ＶＨ－ＣＫ－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「交差軽鎖（ＶＬ－ＣＨ１）」）の比でトランスフェクトした。濾過された上清を、精製まで、４℃に保った。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ－グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含有する無血清ＥｘＣｅｌｌ培地中で培養した。６００ｍｌのＴｕｂｅ Ｓｐｉｎフラスコ（最大作業容積：４００ｍＬ）内の作製のために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞８億個を、Ｇ４１８を伴わないトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞８億個を、２１０×ｇで、５分間にわたり遠心分離した。上清を、６ｍＭのＬ－グルタミンを含有する、４０ｍｌの、あらかじめ加温されたＣＤ－ＣＨＯ培地により置きかえた。発現ベクターを、４００μｇのＤＮＡ総量まで、６ｍＭのＬ－グルタミンを含有する、４０ｍｌのＣＤ－ＣＨＯ培地と混合した。１０８０μのｌＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を添加した後で、混合物を、１５秒間にわたりボルテックスし、その後、室温で１０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのＴｕｂｅ Ｓｐｉｎフラスコに移し、５％のＣＯ_２雰囲気を伴うインキュベーター内、３７℃で、３時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、３２０ｍｌのＥｘＣｅｌｌ＋６ｍＭのＬ－グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ＋３ｇ／ｌのグルコース培地を添加し、細胞を、７％のＦｅｅｄ７をフィードする前に、２４時間にわたり培養した。６－７日間後、培養上清を、２１０×ｇ（Ｓｉｇｍａ ８Ｋ遠心分離機）で、２０－３０分間にわたる遠心分離による精製のために回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度で、アジ化ナトリウムを添加した。溶液を、精製まで、４℃に保った。分泌タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１つ－２つのサイズ除外クロマトグラフィー工程により、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０ ｐＨ７．５ ２５ｍｌで平衡化させたＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０ ｐＨ７．５、少なくとも１０カラム容積で洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０ ｐＨ２．５ ２０カラム容積（勾配０％－１００％）中で溶出させた。１０分の１濃度の２ＭのトリスｐＨ １０．５を添加することにより、タンパク質溶液を中和した。２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で平衡化させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に、標的タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）で、４ｍｌの最大容積に濃縮した。最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ－ＳＤＳ解析により解析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従い使用した（図１０Ｂ）。分子の凝集物含有量（ＨＭＷ）は、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ解析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を、２５℃の、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で使用して解析した（図１０Ａ）。表８中の分子１は、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（プラスミド／ベクターである、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＣＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＶＬ ＭＳＬＮ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１５４４３」、及び「ＶＨ ＭＳＬＮ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＲＹＦ，ｐＥＴＲ１５６６７」を含む／これらからなる配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）であって、上記で記載した三価の二重特異性抗体分子を指す。全ての分子の、最終的な品質は、良好であり、モノマーの含有量は、≧９６％であった。以下の表８は、ＭＳＬＮ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子の作製及び精製についてまとめる。
表8:

【0162】

２．３ 三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（プラスミド／ベクターである、「ＭＲ１．１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＨ－Ｃｋ－（Ｇ４Ｓ）２ ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１６６２１」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＭＣＳＰ ＭＬ２ ＶＬ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１６６１９」、及び「ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＹＲＦ，ｐＥＴＲ１６６１８」を含む／これらからなる配列番号２３４；また、表５及び６も参照されたい）の調製
本実施例では、三価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（プラスミド／ベクターである、「ＭＲ１．１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＨ－Ｃｋ－（Ｇ４Ｓ）２ ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１６６２１」、「ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＬ ＣＨ１，ｐＥＴＲ１５６５６」、「ＭＣＳＰ ＭＬ２ ＶＬ Ｃｋ ＲＫ，ｐＥＴＲ１６６１９」、及び「ＭＣＳＰ Ｍ４－３ ＶＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｈｏｌｅ ＰＧ ＬＡＬＡ ＨＹＲＦ，ｐＥＴＲ１６６１８」を含む／これらからなる配列番号２３４；また、表５及び６も参照されたい）を調製した（その概略的例示を、図１１に示す；古典的フォーマットである、ＭＣＳＰ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ ２＋１ ＩｇＧ（配列番号２３４；また、表５及び６も参照されたい））。ＭＣＳＰ／ＥＧＦＲｖＩＩＩの可変ドメインを、それぞれのレシピエント哺乳動物用の発現ベクターにあらかじめ挿入された定常鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質の発現を、ＭＰＳＶプロモーターにより駆動し、合成のポリＡシグナル配列を、ＣＤＳの３’端に置く。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。分子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３－ＥＢ細胞に、哺乳動物用の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「軽鎖（ＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ＶＨ－ＣＫ－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「交差軽鎖（ＶＬ－ＣＨ１）」）の比でトランスフェクトした。濾過された上清を、精製まで、４℃に保った。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ－グルタミンと、２５０ｍｇ／ｌＧ４１８とを含有する無血清ＥｘＣｅｌｌ培地中で培養した。６００ｍｌのＴｕｂｅ Ｓｐｉｎフラスコ（最大作業容積：４００ｍＬ）内の作製のために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞８億個を、Ｇ４１８を伴わないトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、８億細胞を、２１０×ｇで、５分間にわたり遠心分離した。上清を、６ｍＭのＬ－グルタミンを含有する、４０ｍｌの、あらかじめ加温されたＣＤ ＣＨＯ培地により置きかえた。発現ベクターを、４００μｇのＤＮＡ総量まで、６ｍＭのＬ－グルタミンを含有する、４０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地と混合した。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を添加した後で、混合物を、１５秒間にわたりボルテックスし、その後、室温で１０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのＴｕｂｅ Ｓｐｉｎフラスコに移し、５％のＣＯ_２雰囲気を伴うインキュベーター内、３７℃で、３時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、３２０ｍｌのＥｘＣｅｌｌ＋６ｍＭのＬ－グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．２５ｍＭのＶＰＡ＋３ｇ／ｌのグルコース培地を添加し、細胞を、１２％のＦｅｅｄ７をフィードする前に、２４時間にわたり培養した。６－７日間後、培養上清を、２１０×ｇ（Ｓｉｇｍａ ８Ｋ遠心分離機）で、２０－３０分間にわたる遠心分離による精製のために回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度で、アジ化ナトリウムを添加した。溶液を、精製まで、４℃に保った。分泌タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーに続く、１つ－２つのサイズ除外クロマトグラフィー工程により、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５ ２５ｍｌで平衡化させたプロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、少なくとも１０カラム容積で洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０ ２０カラム容積（勾配０％－１００％）中で溶出させた。０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ８．０（１：１０）を添加することにより、タンパク質溶液を中和した。２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ｐＨ ６．０で平衡化させたＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓ２００、１２０ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に、標的タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）で、４ｍｌの最大容積に濃縮した。最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ－ＳＤＳ解析により解析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従い使用した。分子の凝集物含有量は、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ解析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を、２５℃の、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で使用して解析した。全ての分子の、最終的な品質は、良好であり、モノマーの含有量は、≧９８％であった。以下の表９は、三価二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）「ＢｓＡｂ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＣＳＰ」（配列番号２３４）分子の作製及び精製についてまとめる。
表9:

【0163】

実施例３： 融合タンパク質のクローニング及び発現
３．１ 融合タンパク質である、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ）））、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号４４（タンパク質）及び４３（ＤＮＡ）））、及びＣｒｉｐｔｏ－ＣＤ２８－４－ＣＤ３ｚ（配列番号４６（タンパク質）及び４５（ＤＮＡ）））のクローニング
ＥＧＦＲｖＩＩＩ融合タンパク質及びＣｒｉｐｔｏ融合タンパク質を、重複伸長ＰＣＲ及びレトロウイルスｐＭＰ７１ベクターへの組換え発現クローニングにより作出した（Schambachら、Mol Ther 2 (5) (2000)、435-45；欧州特許第０９５５３７４号（Ｂ１））。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（配列番号４１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる））の構築は、ＰＣＲ増幅により行った。増幅は、４つの工程で行った：まず、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを、以下のプライマー：５’－ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧ－３’（配列番号１０３；ＥＧＦＲｖＩＩＩＮｏｔＩｆｗｄ）と、５’－ＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＣ－３’（配列番号１０４；ＥＧＦＲｔｍ ＣＤ２８ｉｚ ｒｅｖ）を使用することにより、ＣＤ２８細胞内ドメインについての部分的な重複と共に増幅した。同時に、マウスＣＤ２８の細胞内ドメインを、以下のプライマー：５’－ＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡ－３’（配列番号１０５；ＥＧＦＲｔｍ ＣＤ２８ｉｚ ｆｗｄ）と、５’－ＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡ－３’（配列番号１０６；ＣＤ２８ｉｎ／ＣＤ３ゼータ ｒｅｖ）とを使用することにより、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ膜貫通ドメイン及びマウスＣＤ３ｚドメインについての部分的な重複と共に増幅した。第３の反応工程では、マウスＣＤ３ｚを、以下のプライマー：５’－ＴＴＧＣＡＧＣＧＴＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１０７；ＣＤ３ゼータ／ＣＤ２８ｆｗｄ）と、５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣ－３’（配列番号１０８；ＣＤ３ゼータＥｃｏＲＩｒｅｖ）を使用することにより、マウスＣＤ２８細胞内ドメインについての部分的な重複と共に増幅した。第４の最終工程では、全ての産物を、ＥＧＦＲｖＩＩＩプライマー（５’－ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧ－３’；配列番号１０３；ＥＧＦＲｖＩＩＩＮｏｔＩｆｗｄ）と、ＣＤ３ｚプライマー（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣ－３’；ＣＤ３ゼータＥｃｏＲＩｒｅｖ（配列番号１０８））とを使用する増幅鋳型として使用した。

【0164】

Ｃｒｉｐｔｏ融合タンパク質では、クローニングを、以下の通り、５つの工程で行った：まず、ヒト融合タンパク質を、以下のプライマー：５’－ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣ－３’（配列番号１０９；Ｌｅａｄｅｒ＿ＮｏｔＩ＿ｆｗｄ）と、５’－ＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣ－３’（配列番号１１０；ＬｅａｄｅｒＣｒｉｐｔｏＩｓｏｒｅｖ）により増幅した。ＩｇＫリーダー配列と、ヒトＣｒｉｐｔｏとの重複は、以下のプライマー：５’－ＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＴＴＴ－３’（配列番号１１１；ＬｅａｄｅｒＣｒｉｐｔｏＩｓｏｆｗｄ）と、５’－ＣＡＧＣＡＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＧＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＧＧＧＴＡＧＡＡＡ－３’（配列番号１１２；Ｃｒｉｐｔｏ ＣＤ８ａｅｘ ｒｅｖ）により行った。その後、ヒトＣｒｉｐｔｏと、マウスＣＤ８との重複は、以下のプライマー：５’－ＴＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧ－３’（配列番号１１３；ＣｒｉｐｔｏＣＤ８ａｅｘ ｆｗｄ）と、５’－ＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＡＡ－３’（配列番号１１４；ＣＤ８ｔｍ－ＣＤ２８ｉｚ ｒｅｖ）により行った。その後マウスＣＤ８と、マウスＣＤ２８との重複は、以下のプライマー：５’－ＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡ－３’（配列番号１１５；ＣＤ８ｔｍ－ＣＤ２８ｉｚｆｗｄ）と、５’－ＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡ－３’（配列番号１１６；ＣＤ２８ｉｎ／ＣＤ３ゼータｒｅｖ）により行った。マウスＣＤ２８と、マウスＣＤ３ｚとの重複は、以下のプライマー：５’－ＴＴＧＣＡＧＣＧＴＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１１７；ＣＤ３ゼータ／ＣＤ２８ｆｗｄ）と、５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣ－３’（配列番号１１８；ＣＤ３ゼータＥｃｏＲＩｒｅ）により行った。第５の最終反応では、全ての産物を、以下のプライマー：５’－ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣ－３’（配列番号１０９；Ｌｅａｄｅｒ＿ＮｏｔＩ＿ｆｗｄ）と、５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣ－３’（配列番号１１８；ＣＤ３ゼータＥｃｏＲ１ｒｅｖ）と併せて、鋳型として使用した。

【0165】

増幅の後、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＮｏｔＩ制限酵素による切断、ならびにＤＮＡのライゲーションを使用して、インサートを、ｐＭＰ７１ベクターにライゲーションした。

【0166】

３．２ 融合タンパク質である、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４８（タンパク質）及び４７（ＤＮＡ）））及びＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号５０（タンパク質）及び４９（ＤＮＡ）））のクローニング
３．２．１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ（配列番号４８（タンパク質）及び４７（ＤＮＡ）））
第１の反応では、以下のプライマー：ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｆｗｄ（５’－ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣ－３’（配列番号１２５））と、プライマーであるＥＧＦＲｖＩＩＩ（－ヒトＣＤ２８）ｒｅｖ（５’－ＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＧＣＣＣＡ－３’（配列番号１２６））とを使用することにより、ＣＤ２８についての３’重複を創出した。第２の反応では、プライマー：（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－）ヒトＣＤ２８ｆｗｄ（５’－ＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧ－３’（配列番号１２７））と、ヒトＣＤ３ｚ ｒｅｖ（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１２８））とを使用することにより、ＣＤ２８についての５’重複と、ＣＤ３Ｚについての３’重複とを行った。上記の産物を使用する第３の反応は、プライマーであるＥＧＦＲｖＩＩＩ ｆｗｄ（５’－ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣ－３’（配列番号１２９））と、ヒトＣＤ３ｚ ｒｅｖ（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１３０））とを含んだ。

【0167】

増幅の後、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＮｏｔＩ制限酵素による切断、ならびにＤＮＡのライゲーションを使用して、インサートを、ｐＭＰ７１ベクターにライゲーションした。

【0168】

３．２．２ ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ｚ（配列番号５０（タンパク質）及び４９（ＤＮＡ）））
第１の反応では、以下のプライマー：５’－ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣ－３’（配列番号１３１；ＥＧＦＲｖＩＩＩ）と、５’－ＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＧＣＣＣＡ－３’（配列番号１３２；ヒトＣＤ２８ ｒｅｖ）とを使用することにより、ＣＤ２８についての３’重複を行った。第２の反応では、プライマーである、（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－）ヒトＣＤ２８ ｆｗｄ（５’－ＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧ－３’（配列番号１３３）と、プライマーである、ヒトＣＤ２８（－ヒト４－１－ＢＢ）ｒｅｖ（５’－ＣＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣＧＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡ－３’（配列番号１３４））とを使用することにより、ＥＧＦＲｖ３についての５’重複と、４－１－ＢＢについての３’重複とを、行った。第３の反応では、ＣＤ２８についての５’重複と、ＣＤ３ｚについての３’重複とを、以下のプライマー：（ヒトＣＤ２８－）ヒト４－１－ＢＢ ｆｗｄ（５’－ＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧ－３’（配列番号１３５））と、ヒト４－１－ＢＢ（－ヒトＣＤ３ｚ）ｒｅｖ（５’－ＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＴ－３’（配列番号１３６））とにより行った。第４の反応では、以下のプライマー：（ヒト４－１－ＢＢ－）ヒトＣＤ３ｚ ｆｗｄ（５’－ＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡ－３’（配列番号１３７））と、プライマーである、ヒトＣＤ３ｚ ｒｅｖ（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１３８））とを使用することにより、４－１－ＢＢについての５’重複と、ＣＤ３ｚについての３’重複とを、行った。第４の最終反応では、全ての産物を、５’側リーダープライマーである、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｆｗｄ（５’－ＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣ－３’（配列番号１３９））及びヒトＣＤ３ｚ ｒｅｖ（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１４０））と併せて、鋳型として使用した。

【0169】

増幅の後、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＮｏｔＩ制限酵素による切断、ならびにＤＮＡのライゲーションを使用して、インサートを、ｐＭＰ７１ベクターにライゲーションした。

【0170】

３．２．３ ＣＡＲ１ヒト（Ｃｒｉｐｔｏ－ＣＤ８ａｅｘ／ｔｍ－ＣＤ２８ｉｚ－ＣＤ３ｚ）（配列番号１２０（タンパク質）及び１１９（ＤＮＡ）））
第１の反応では、以下のプライマー：Ｃｒｉｐｔｏ ｆｗｄ（５’－ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣ－３’（配列番号１４１））と、Ｃｒｉｐｔｏ（－ヒトＣＤ８ａ）ｒｅｖ（５’－ＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＧＧＧＴＡＧＡ－３’（配列番号１４２））とを使用することにより、ＣＤ８についての３’重複を行った。第２の反応では、プライマーである、（Ｃｒｉｐｔｏ－） ヒトＣＤ８ａ ｆｗｄ（５’－ＴＣＴＡＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＡＴＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧ－３’（配列番号１４３））と、ヒトＣＤ８ａ（－ヒトＣＤ２８）ｒｅｖ（５’－ＣＴＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧ－３’（配列番号１４４））とを使用することにより、Ｃｒｉｐｔｏについての５’重複及びＣＤ２８についての３’重複を行った。第３の反応では、以下のプライマーである、（ヒトＣＤ８ａ－）ヒトＣＤ２８ ｆｗｄ（５’－ＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１４５））と、ヒトＣＤ３ｚ ｒｅｖ（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１４６））とを使用することにより、ＣＤ８についての５’重複及びＣＤ３ｚについての３’重複を増幅した。第４の最終反応では、以下のプライマー：Ｃｒｉｐｔｏ ｆｗｄ（５’－ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡ－３’（配列番号１４７））と、ヒトＣＤ３ｚ ｒｅｖ（５’－ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ－３’（配列番号１４８））とを使用することにより、全ての産物を、５’側リーダープライマーと併せて、鋳型として使用した。

【0171】

増幅の後、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＮｏｔＩ制限酵素による切断、ならびにＤＮＡのライゲーションを使用して、インサートを、ｐＭＰ７１ベクターにライゲーションした。

【0172】

３．２．４ コンストラクトである、Ｅ３ｄｅｌ（配列番号２４７（タンパク質）及び２４６（ＤＮＡ）））を、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作出し、レトロウイルスｐＭＰ７１ベクターにクローニングした。ＥＧＦＲｖＩＩＩ配列に従い、特異的重複プライマーを、ＳｎａｐＧｅｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅによりデザインした。アニーリング部分の融点は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）製の、オンラインＴｍ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ Ｖ １．８．１により計算した。全てのＰＣＲ反応はもっぱら、ＮＥＢ製のＱ５ポリメラーゼにより実行した。コンストラクトであるＥ３ｄｅｌは、細胞膜内のＥ３ｄｅｌのアンカリングを改善するように、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ膜貫通ドメイン、及び１０細胞内アミノ酸からなる。

【0173】

実施例４： Ｔ細胞の形質導入及び細胞傷害性殺滅アッセイ
４．１ 細胞培養物
４．１．１ マウスがん細胞株
マウス膵臓がん細胞株であるＰａｎｃ０２と、オボアルブミンをトランスフェクトされたその対応物である、Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡについては、既に記載されている（Jacobsら、Int J Cancer、128 (4) (2011)、897-907）。Ｐａｎｃ０２細胞株は、発がん物質であるＭｅｔｈｙｃｈｏｌａｎｔｒｅｎ Ａの、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの膵臓への注射であって、発がん性を誘導する注射を介して作出した。Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ－ＥｐＣＡＭは、完全長マウスＥｐＣＡＭ（配列番号８３（核酸（ＤＮＡ））及び８４（タンパク質））を含有するｐＭＸ－ｐｕｒｏ（Kitamuraら、Exp. Hematol.、31 (2003)、1007-1014）の形質導入と、最終濃度を１０μｇ／ｍｌとするピューロマイシンによる選択とにより作出した。パッキング細胞株であるＰｌａｔ－Ｅについては、Ｍｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、７（２０００）、１０６３－６により既に記載されている。全ての細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、１％のペニシリン及びストレプトマイシン（ＰＳ）、ならびに１％のＬ－グルタミン（全て、ＰＡＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ製）を伴うＤＭＥＭ中で培養した。１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び１μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｐｌａｔ－Ｅ培地に添加した。初代マウスＴ細胞（下記の、培養についての２．５節を参照されたい）を、１０％のＦＢＳ、１％のＰＳ、及び１％のＬ－グルタミンを伴うＲＰＭＩ １６４０中で培養した。１％のピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び５０μＭのβ－メルカプトエタノールを、Ｔ細胞培地に添加した。

【0174】

４．１．２ ヒトがん細胞株
ヒト膵臓がん細胞株であるＳＵＩＴ－２については、既に記載されている（Iwamoraら、Jpn J Cancer Res.、78 (1) (1987)、54-62）。ＳＵＩＴ－２細胞株は、ヒト膵臓癌の転移性肝臓腫瘍から導出した。ＳＵＩＴ－２－ＯＥ－ＭＳＬＮは、完全長ヒトＭＳＬＮ（配列番号８３（核酸（ＤＮＡ））及び８４（タンパク質））を含有するｐＭＰ７１－ａｍｐ（Kitamuraら、Exp. Hematol.、31(2003)、1007-1014）の形質導入と、最終濃度を１０μｇ／ｍｌとするアンピシリンによる選択とにより作出した。Ｆｌｐ－ＨＥＫ２９３ヒト胎児性腎臓上皮細胞については、既に記載されている（Thankamonyら、Journal of Biological Chemistry、281 (45) (2006)、34601-34609）。細胞株であるＨＥＫ２９３－ＦＬＰｉｎ－ＭＳＬＮは、完全長ヒトＭＳＬＮ（配列番号８３（核酸（ＤＮＡ））及び８４（タンパク質））を含有するｐＭＰ７１－ａｍｐ（Kitamuraら、Exp. Hematol.、31 (2003)、1007-1014）の形質導入と、最終濃度を１０μｇ／ｍｌとするアンピシリンによる選択とにより作出した。パッキング細胞株であるＰｌａｔ－Ａについては、Ｗｕら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００９（２００９）、９０１０７９により既に記載されている。全ての細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、１％のペニシリン及びストレプトマイシン（ＰＳ）、ならびに１％のＬ－グルタミン（全て、ＰＡＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ製）を伴うＤＭＥＭ中で培養した。１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び１μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｐｌａｔ－Ａ培地に添加した。初代ヒトＴ細胞（下記の、培養についての２．５節を参照されたい）を、２．５％のヒト血清、１％のＰＳ、１％のＬ－グルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム、及び１％の非必須アミノ酸を伴うＶＬＥ ＲＰＭＩ １６４０中で培養した。

【0175】

４．１．３ ヒト膵臓がん細胞株であるＳＵＩＴ－２については、既に記載されている（Iwamoraら、Jpn J Cancer Res. 78 (1) (1987)、54-62）。細胞株は、ＣｅｌｌＢａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ＣＯＤＥ：ＪＣＲＢ１０９４）など、異なるリポジトリーを介して入手可能である。ＳＵＩＴ－２細胞株は、ヒト膵臓癌の転移性肝臓腫瘍から導出した。ＳＵＩＴ－２－ＯＥ－ＭＳＬＮは、完全長ヒトＭＳＬＮ／ＣＡＫ１／ＭＰＦ（ＨＧＮＣＩＤ：ＨＧＮＣ：７３７１（Changら、PNAS.、93 (1) (1996)、136-40）を含有するｐＭＸｓ－ａｍｐ（Kitamuraら、Exp. Hematol.、31(2003)、1007-1014）の形質導入により作出した。ヒトＭＳＬＮは、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡから導出した（Macvilleら、Cancer Res.、59 (1) (1999)、141-50）。ＭＳＬＮ遺伝子は、７１ｋＤａの前駆体タンパク質をコードし、メソテリンと呼ばれる、４０ｋＤａの、グリコシルホスファチジルイノシトールによりアンカリングされた細胞表面タンパク質、及び細胞から放出される、巨核球増強因子と称する、ＮＨ２末端の、３１ｋＤａ断片にさらにプロセシングされる（Hoら、Clin Cancer Res.、13 (5) (2007)、1571-75）。

【0176】

４．２ Ｔ細胞への形質導入
４．２．１ マウスＴ細胞への形質導入
レトロウイルスベクターであるｐＭＰ７１（Schambachら、Mol Ther 2 (5) (2000)、435-45；欧州特許第０９５５３７４号（Ｂ１））を、同種指向性のパッキング細胞株であるＰｌａｔ－Ｅへのトランスフェクションのために使用した。形質導入は、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇら、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、８６（２００８）、５７３－８３；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、８６（２０１２）、１０８６６－１０８６９；印刷中のＫｏｂｏｌｄら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０１４）により記載されている方法に従い実施した。略述すると、パッキング細胞株であるＰｌａｔ Ｅ（Moritaら、Gene Ther、7 (2000)、1063-6により記載されている）を、６ウェルプレート内に播種し、一晩にわたり、７０－８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。１日目に、１６μｇのＤＮＡを、１００ｍＭのＣａＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１２６．７μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と併せて混合した。Ｐｌａｔ－Ｅ細胞を、低血清培地（３％）中で、３０分間にわたり飢餓下に置き、次いで、沈殿したＤＮＡと共に、６時間にわたりインキュベートした。次いで、培地を除去し、培養培地と交換した。２日目に、初代脾細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から採取した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、Ｔ細胞培地中、抗ＣＤ３（クローン１４５－２ｃ１１；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）、及び組換えマウスＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、一晩にわたり刺激した。３日目に、２４ウェルプレートを、１２．５μｇ／ｍｌの組換えレトロネクチン（日本、タカラバイオ株式会社）により、室温で、２時間にわたりコーティングし、２％のウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、３７℃で、３０分間にわたりブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。Ｐｌａｔ Ｅの上清を採取し、フィルター（４０μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を流過させた。次いで、新鮮なＴ細胞培地を、Ｐｌａｔ Ｅ細胞に添加した。１ｍｌの、濾過された上清を、各ウェル内に分配し、４℃で、２時間にわたり、スピノキュレートした。次いで、上清を、２４ウェルプレートから除去した。Ｔ細胞１０^６個を、ウェル１つ当たり１０ＵのＩＬ－２及び４０００００個の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＴ細胞培地１ｍｌ中に播種し、８００ｇ、３２℃で、３０分間にわたりスピノキュレートした。４日目に、Ｐｌａｔ Ｅ上清を、再度採取し、濾過した。１ｍｌを、２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、８００ｇ、３２℃で、９０分間にわたりスピノキュレートした。その後、細胞を、３７℃で、さらに６時間にわたりインキュベートした。１ｍｌの上清を、ＩＬ－２を伴うＴ細胞培地により置きかえた。５日目に、細胞を、採取し、カウントし、１ｍｌ当たり１０ｎｇのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＴ細胞培地中の密度を、１ｍｌ当たりの細胞１０^６個として、再播種した。Ｔ細胞を、細胞解析又は機能アッセイを実施する、１０日目まで、この密度で保った。

【0177】

４．２．２ ヒトＴ細胞への形質導入
レトロウイルスベクターであるｐＭＰ７１（Schambachら、Mol Ther 2 (5) (2000)、435-45；欧州特許第０９５５３７４号（Ｂ１））を、同種指向性のパッキング細胞株であるＰｌａｔ－Ａへのトランスフェクションのために使用した。形質導入は、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇら、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、８６（２００８）、５７３－８３；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、８６（２０１２）、１０８６６－１０８６９；Ｋｏｂｏｌｄら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０１４）により記載されている方法に従い実施した。略述すると、パッキング細胞株であるＰｌａｔ Ａ（Moritaら、Gene Ther、7 (2000)、1063-6により記載されている）を、６ウェルプレート内に播種し、一晩にわたり、７０－８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。１日目に、１８μｇのＤＮＡを、１００ｍＭのＣａＣｌ_２（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と併せて混合した。Ｐｌａｔ－Ａ細胞を、低血清培地（３％）中で、３０分間にわたり飢餓下に置き、次いで、沈殿したＤＮＡと共に、６時間にわたりインキュベートした。次いで、培地を除去し、培養培地と交換した。加えて、２日目に、それらを、抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（それぞれ、クローンＨＩＴ３ａ及びＣＤ２８．２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でコーティングすることにより、６ウェルプレートを、Ｔ細胞用に調製した。２日目に、全血を、健常ドナーから採取した。次いで、密度勾配遠心分離を使用して、ＰＢＭＣを単離した。ＣＤ３^＋細胞の単離は、ヒトＣＤ３マイクロビーズを伴うインキュベーション後に、ＭＡＣＳ ＣＤ３陽性選択キットＬＳカラムプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い実行した。次いで、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、４．１節で記載されている通り、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びβ－メルカプトエタノール（全て、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と、Ｔ細胞培地中に、細胞１０^６個当たり８．２５μｌのヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓとを添加して、一晩にわたり培養した。３日目に、２４ウェルプレートを、１２．５μｇ／ｍｌの組換えレトロネクチン（日本、タカラバイオ株式会社）でコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。４日目に、プレートを、２％のウシ血清アルブミン（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、３７℃で、３０分間にわたりブロッキングし、ＰＢＳ中に２．５％のＨＥＰＥＳで洗浄した。Ｐｌａｔ Ａの上清を採取し、フィルター（４０μｍ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を流過させた。次いで、新鮮なＤＭＥＭ培地を、Ｐｌａｔ Ａ細胞に添加した。１ｍｌの、濾過されたウイルス上清を、各ウェル内に添加し、その後、３２℃で、１時間３０分にわたり、遠心分離した。次いで、上清を、２４ウェルプレートから除去した。関与性のウイルス上清が存在する場合、Ｔ細胞１０^６個を、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びβ－メルカプトエタノールを補充したＴ細胞培地１ｍｌ中に播種した。５日目に、Ｔ細胞に、第２のヒット及び最終的な形質導入ヒット施しながら、４日目のプロトコールを、反復する。６日目に、細胞を、採取し、カウントし、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びβ－メルカプトエタノール（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＴ細胞培地中の密度を、１ｍｌ当たりの細胞１０^６個として、再播種した。次いで、ＦＡＣＳ解析を使用して、Ｔ細胞を、それらの形質導入効率について点検する。形質導入に成功したら、Ｔ細胞を、隔日で、再培養し、１ｍｌ当たりの細胞１０^６個の濃度で維持する。

【0178】

４．３ 殺滅アッセイ
オボアルブミン（配列番号２００（タンパク質）及び１９９（ＤＮＡ）））を、安定的に発現させ、ＥｐＣＡＭ（配列番号２０２（タンパク質）及び２０１（ＤＮＡ）））を形質導入された、ＰａｎｃＯＶＡＥｐＣＡＭマウス膵臓がん細胞２０，０００個を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ）））を形質導入されたＴ細胞１００，０００個に、ｂｓＡｂ（三価の二重特異性抗体分子である「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＣＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」（配列番号２（配列番号１に示されたＤＮＡ配列によりコードされる）、又は四価の二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」（配列番号２２９（軽鎖アミノ酸配列）及び２３０（重鎖アミノ酸配列））を、３０分間にわたりプレロードし、腫瘍細胞（Ｐａｎｃ０２－ＯＶＡ－ＥｐＣＡＭ又はＰａｎｃ０２－ＯＶＡ）と共に、８－１２時間（Ｅ：Ｔ＝５：１）にわたり共培養した。製造元の指示書（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルを定量化した。略述すると、ＬＤＨは、乳酸塩の、ピルビン酸塩への酸化により、ＮＡＤ^＋の、ＮＡＤＨ及びＨ^＋への還元を触媒する。次に、ジアホラーゼが、ＮＡＤＨ及びＨ^＋と反応して、４９０ｎｍで吸収するホルマザンへの、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の還元を触媒する。比溶解（％）は、以下の式：
（ＬＤＨ^{ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ}－ＬＤＨ^{ｏｆ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ}－ＬＤＨ^{ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｏｎｌｙ}）／（ＬＤＨ^{ｔｏｔａｌ ｌｙｓｉｓ}－ＬＤＨ^{ｍｉｎｉｍａｌ ｌｙｓｉｓ}－ＬＤＨ^{ｏｆ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ}）×１００％
に従い計算した。

【0179】

４．４ インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）放出アッセイ
９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、４℃で、漸増濃度（０μｇ／ｍＬ；０．１μｇ／ｍＬ；１μｇ／ｍＬ；１０μｇ／ｍＬ）の、四価二重特異性抗体分子である「ＢｓＡｂ ＥｐＣＡＭ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ，ＭＲ１．１」、三価二重特異性抗体分子である「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＭＲ１．１ ＶＨ Ｃｋ ＭＳＬＮ ＣＨ ＣＨ１ ＥＥ Ｆｃ ｋｎｏｂ ＰＧ ＬＡＬＡ，ｐＥＴＲ１５６５５」（配列番号２（タンパク質）及び１（ＤＮＡ）））、又はセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）により、１２時間にわたりコーティングした。ウェルを、３７℃で、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）により、３０分間にわたりブロッキングし、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））（本明細書の以下では、Ｅ３細胞と称する）を伴うＴ細胞０．２５×１０^６個、又は野生型（ＷＴ）Ｔ細胞を、それぞれ、添加した。４８時間後、上清を回収し、ＩＦＮ－γの放出を、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＢＤ）により定量化した。吸光度を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＭｉｃｒｏＷｉｎ ２０００）により測定した。

【0180】

４．５ ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅによる殺滅アッセイ
ＰａｎｃＯＶＡＥｐＣＡＭ腫瘍細胞５０，０００個を、Ｅ－Ｐｌａｔｅ Ｌ８（ＯＬＳ）上に播種し、腫瘍細胞の増殖を、２０時間の時間枠にわたり、２０分間ごとに測定した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））又はＥｐＣａｍ ｓｃＶｆ－ＣＤ３ｚキメラ抗原受容体（ＣＡＲＥｐＣＡＭ；配列番号２４９（タンパク質）及び２４８（ＤＮＡ））を形質導入した、Ｃ５７Ｂｌ６野生型Ｔ細胞５００，０００個を、それぞれ、腫瘍細胞に添加した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））を形質導入したＴ細胞に、既に記載した通り、１μｇ／ｍＬのｂｓＡｂをプレロードした。ＦａｓＬブロッキング条件のために、１０μｇ／ｍＬのＣＤ１７８（Ｆａｓリガンド）モノクローナル抗体（クローン：ＭＦＬ３；型番１６－５９１１－８５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）））、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒａｄｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ウェルに、速やかに添加した。Ｔ細胞の殺滅を、２４時間にわたり、６分ごとに測定した。

【0181】

４．６ 抗体結合アッセイ
ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ融合タンパク質（配列番号４２（タンパク質）及び４１（ＤＮＡ））を形質導入したＴ細胞、１５０μＬ当たりに０．２５×１０^６個を、漸増濃度（１０ｎｇ／ｍＬ；１００ｎｇ／ｍＬ；５００ｎｇ／ｍＬ；１μｇ／ｍＬ；５μｇ／ｍＬ；１０μｇ／ｍＬ；２０μｇ／ｍＬ；２５μｇ／ｍＬ）の、ｂｓＡｂ（ＰＢＳ ５０μＬ中の三重特異性ｂｓＡｂ又は四重特異性ｂｓＡｂ）と共に、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートした。１μＬの二次抗体ＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＦＩＴＣ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ：１０９－０９６－０９７）、又はＣｙ２コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｃｙ２ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ：１１５－２２５－００６）を、添加し、４℃で、３０分間にわたりインキュベートした。ＦＩＴＣ平均蛍光発光強度（ＦＩＴＣ ＭＦＩ）を、フローサイトメトリーにより定量化した。染色は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して解析した。表面飽和は、最大値に対する百分率（ＦＩＴＣ ＭＦＩ^{ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ}／ ＦＩＴＣ ＭＦＩ^{ｈｉｇｈｓｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ}）×１００％として計算した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．１により実施した。

【0182】

４．７ 統計学的解析
統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ｂを使用した。報告される全ての変数は、連続である。実験条件間の差違は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して解析した。個別のマウスについての実験条件を比較するために、マン－ホイットニー検定を使用した。ｐ値＜０．０５を、有意であると考えた。

【0183】

４．８ Ｔ細胞刺激アッセイ
Ｓｕｉｔ－ＯＥ－ＭＳＬＮ腫瘍細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内のＴ細胞培地中に、６時間にわたり播種した。５．５時間後、Ｔ細胞を、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）と共に、３０分間にわたり共インキュベートした。この後、Ｔ細胞／二重特異性抗体コンジュゲートを、腫瘍細胞に添加し、３７℃、５％のＣＯ_２で、４８時間にわたりインキュベートした。この時間の後、上清を回収し、ＩＦＮ－γの放出を、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＢＤ）により定量化した。吸光度を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＭｉｃｒｏＷｉｎ ２０００）により測定した。

【0184】

４．９ 組換えメソテリンによるＴ細胞刺激アッセイ
９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、ヒト組換えメソテリンタンパク質（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）でコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ中に１０％のＦＢＳでブロッキングした。Ｔ細胞を、三価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）分子である「ＢｓＡｂＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＳＬＮ」（配列番号２３５；また、表３及び４も参照されたい）と共に、３０分間にわたり共インキュベートした。この後、Ｔ細胞／二重特異性抗体コンジュゲートを、組換えメソテリンでコーティングされたウェルに添加し、３７℃、５％のＣＯ_２で、４８時間にわたりインキュベートした。この時間の後、上清を回収し、ＩＦＮ－γの放出を、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＢＤ）により定量化した。吸光度を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＭｉｃｒｏＷｉｎ ２０００）により測定した。

【0185】

実施例５： 特定の実施態様の例
本開示の、ある特定の、非限定的な実施態様の例を、以下に列挙する。特に、本発明は、以下の項目に関する。
１．
（Ａ）処置される対象から得られたＴ細胞に形質導入するための、融合タンパク質をコードする核酸分子であって、以下のドメイン：
（１）前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン、
（２）膜貫通アンカリングドメイン、及び
（３）シグナル伝達刺激ドメイン
を有する核酸分子と、
（Ｂ）三価の二重特異性抗体分子であって、
（ｉ）（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む三価の二重特異性抗体分子と
を含むキット。
２．前記融合タンパク質が、少なくとも１つのシグナル伝達共刺激ドメインをさらに含む、項目１のキット。
３．前記膜貫通アンカリングドメインが、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有さない、項目１又は項目２のキット。
４．前記融合タンパク質が、ヒンジドメインをさらに含む、項目１から３のいずれか一項のキット。
５．医薬としての使用のための、
（ｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む、三価の二重特異性抗体分子であって、項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、三価の二重特異性抗体分子。
６．（ｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含み、項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞と組み合わせて投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、三価の二重特異性抗体分子を含む薬学的組成物。
７．悪性疾患を処置するための方法における使用のための、
（ｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む、三価の二重特異性抗体分子であって、項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含む形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与され、前記Ｔ細胞が、処置される対象から得られたものである、三価の二重特異性抗体分子。
８．悪性疾患を処置するための方法であって、
（ｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含む、三価の二重特異性抗体分子の、それを必要とする対象への投与を含み、
前記三価の二重特異性抗体分子が、前記対象に由来する、形質導入されたＴ細胞であり、項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を含むＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与される方法。
９．前記悪性疾患が、上皮由来、内皮由来、又は中皮由来のがん、及び血液がんから選択される、項目７の、三価の二重特異性抗体分子、又は項目８による、悪性疾患を処置するための方法。
１０．腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ－２、ＣＡ－１２－５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ、トランスフェリン受容体、テネイシン、及びＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）からなる群から選択される、項目１から４のいずれか一項のキット、項目６の薬学的組成物、項目５若しくは７の、三価の二重特異性抗体分子、又は項目８若しくは９の方法。
１１． 前記Ｔ細胞内又は前記Ｔ細胞上で天然に存在しない、シグナル伝達受容体の前記細胞外ドメインが、Ｃｒｉｐｔｏ（ｃｒｙｐｔｉｃファミリーのタンパク質）、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ファミリー（非Ｔ細胞）のメンバー、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＴＳＨ－Ｒからなる群から選択される、項目１から４、又は１０のいずれか一項のキット、項目６又は項目１０の薬学的組成物、項目５、７、又は１０のいずれか一項の、三価の二重特異性抗体分子、項目８、９、又は１０のいずれか一項の方法。
１２． 前記形質導入されたＴ細胞が、前記Ｔ細胞上に天然に存在するＴ細胞受容体、及び／又は前記Ｔ細胞に遺伝子導入されたＴ細胞受容体をさらに含む、項目１から４、１０、又は１１のいずれか一項のキット、項目６、１０、又は１１のいずれか一項の薬学的組成物、項目５、７、１０、又は１１のいずれか一項の、三価の二重特異性抗体分子、又は項目８から１１のいずれか一項の方法。
１３． 項目１（Ｂ）及び５から８のいずれか一項において規定された、三価の二重特異性抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
１４． ポリシストロニックである、項目１３のベクター。
１５． 項目１３の前記核酸配列に動作可能に連結された調節配列をさらに含む、項目１３又は項目１４のベクター。
１６． 項目１３から１５のいずれか一項において規定されたベクターで形質転換された宿主細胞。
１７． 項目１（Ｂ）及び５から８のいずれか一項において規定された、三価の二重特異性抗体分子を作製するための方法であって、
（ａ）項目１６において規定された宿主細胞を、項目１（Ｂ）及び５から８のいずれか一項において規定された、三価の二重特異性抗体分子の発現を可能とする条件下で培養することと、
（ｂ）作製された三価の二重特異性抗体分子を培養物から回収することと
を含む方法。
１８．（ｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合する、第１の結合ドメイン、
（ｉｉ）腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する、第２の結合ドメイン、及び
（ｉｉｉ）項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質の細胞外ドメイン（１）に結合するか、又は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する前記腫瘍特異的抗原に結合する、第３の結合ドメイン
を含み、
項目１７の方法により得ることができる、
項目１（Ｂ）及び５から８のいずれか一項の三価の二重特異性抗体分子。
１９． 対象における疾患を処置するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞を、対象から単離する工程と、
（ｂ）前記単離されたＴ細胞に、項目１（Ａ）を特徴とする融合タンパク質を形質導入する工程と、
（ｃ）前記形質導入されたＴ細胞を、前記対象に投与する工程と
を含む方法。
２０． 前記形質導入されたＴ細胞を、前記対象に、静脈内注入により投与する、項目１９の方法。
２１． 形質導入されたＴ細胞に、Ｔ細胞受容体を共形質導入する、項目１９又は項目２０の方法。
２２． 前記形質導入されたＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体により拡大する、項目１９から２１のいずれか一項の方法。
２３． 形質導入されたＴ細胞の拡大を、サイトカイン、好ましくは、インターロイキン２（ＩＬ－２）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の存在下で実施する、項目１９から２２のいずれか一項の方法。
２４． （ｄ）項目１（Ｂ）及び５から８又は１８のいずれか一項において規定された、三価の二重特異性抗体を投与すること
をさらに含む、項目１９から２３のいずれか一項の方法。
２５． 前記三価の二重特異性抗体分子が、形質導入されたＴ細胞の投与の前に、これと同時に、又はこの後で投与される、項目１９から２４のいずれか一項の、疾患を処置するための方法。
２６． 前記疾患が、悪性疾患である、項目１９から２５のいずれか一項の方法。
２７． 前記悪性疾患が、上皮由来、内皮由来、又は中皮由来のがん、及び血液がんから選択される、項目１９から２６のいずれか一項の方法。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図11A】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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