特許 7175907 ジペプチドを含む培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-11

(45)【発行日】2022-11-21

(54)【発明の名称】ジペプチドを含む培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20221114BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20221114BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20221114BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALI20221114BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20221114BHJP

   C12N 5/12 20060101ALI20221114BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20221114BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221114BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221114BHJP

   C07K 5/072 20060101ALN20221114BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12N5/074

C12N5/077

C12N5/0793

C12N5/09

C12N5/12

C12P19/04

C12P21/08

C12P21/02 A

C07K5/072

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019548005

(86)(22)【出願日】2018-03-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-26

(86)【国際出願番号】 EP2018055197

(87)【国際公開番号】W WO2018162353

(87)【国際公開日】2018-09-13

【審査請求日】2020-12-17

(31)【優先権主張番号】102017203908.6

(32)【優先日】2017-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】519414848

【氏名又は名称】エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110002538

【氏名又は名称】弁理士法人あしたば国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フリードヘルム メルツ

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス カラウ

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ヘルマン

(72)【発明者】

【氏名】ギュンター クナウプ

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１９６９４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１２－２３９４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１５６４７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】PLoS One，2015年，Vol.10, No.3, e0120450，pp.1-10

【文献】AMB Express.，2016年，Vol.6, No.48，pp.1-12

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのジペプチドを含み、前記ジペプチドが、アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を含み、
前記ジペプチドは、前記培地中に０．１ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在する
哺乳動物細胞用培地。

【請求項2】

前記ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎである、
請求項１記載の哺乳動物細胞用培地。

【請求項3】

前記培地は、少なくとも１つの炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１つの無機塩、緩衝剤および／または少なくとも１つのビタミンをさらに含む、
請求項１又は請求項２に記載の哺乳動物細胞用培地。

【請求項4】

前記媒体は、成長因子を含まない、
請求項１乃至３のいずれかに記載の哺乳動物細胞用培地。

【請求項5】

前記培地は、液体形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態、またはタブレットの形態である、
請求項１乃至４のいずれかに記載の哺乳動物細胞用培地。

【請求項6】

前記細胞培地は、無血清培地または既知組成培地である、
請求項１乃至５のいずれかに記載の哺乳動物細胞用培地。

【請求項7】

前記培地は、使用時の前記培地の濃度に対し、２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍または１０倍の濃縮形態である、
請求項１乃至６のいずれかに記載の哺乳動物細胞用培地。

【請求項8】

哺乳動物細胞を培養するための請求項１乃至７のいずれかに記載の培地の使用。

【請求項9】

前記細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞およびハイブリドーマ細胞からなるリストから選択される、
請求項８記載の使用。

【請求項10】

哺乳動物細胞を培養するためのアスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を含むジペプチドの使用であって、
前記ジペプチドは、培地中に０．１ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在する
ジペプチドの使用。

【請求項11】

細胞培養産物を製造する方法であって、
－前記細胞培養産物を製造することが可能な哺乳動物細胞を提供する工程と、
－前記細胞と、請求項１乃至７のいずれかに記載の培地とを接触させる工程と、
－前記培地または前記細胞から前記細胞培養産物を得る工程と、
を含む方法。

【請求項12】

前記細胞培養産物は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、多糖、抗体、モノクローナル抗体、成長因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子および酵素からなる群から選択される、
請求項１１記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体工学による製造工程に関する。より特定的には、本発明は、生体工学による製造工程に使用するために改良された培地、このような改良された培地を使用する工程、および改良された培地を用いる工程から得られた産物に関する。

【背景技術】

【0002】

生体工学による工程は、生物学的製剤の製造に広く用いられている。これらの工程は、典型的には、培養された細胞による成長および産物生成にとって許容される条件下での培地中の細胞の培養を伴う。生体工学による製造に有用な細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、および動物由来または植物由来の細胞である。

【0003】

動物細胞培養物は、生体産物、例えば、治療用タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたは他の生体分子、例えば、治療用多糖の製造に使用されてきた。このような細胞培養工程において、動物細胞は、通常は所望な産物を産生するように遺伝的に改変され、細胞増殖および産物生成のための液体培地、固体培地または半固体培地の中で培養される。細胞培養物の顕著な利点の１つは、動物細胞および植物細胞が、一次産物の翻訳後改変（例えば、フォールディング）およびポリペプチドの翻訳後改変を行うことができるという事実である。

【0004】

生体工学による製造工程において、特に、動物細胞培養物において、細胞培養条件の制御および最適化は、細胞増殖および産物生成にとって重要である。決定的要因の１つは、培地組成である。最終的な細胞培養産物の濃度および品質は、培地組成に大きく依存する。動物細胞および植物細胞の培養物は、必要な栄養組成物および培養条件という観点で、特に要求が厳しい。必要な栄養素は、炭素、窒素およびエネルギーの基本的な供給源、例えば、糖およびアンモニアを含むだけではなく、必須アミノ酸およびビタミンなどのもっと複雑な栄養素も必要とされる場合がある。この理由のため、広範囲にわたる栄養素を動物細胞に与えるため、動物細胞培地への複雑な栄養組成物（例えば血清）の追加が用いられてきた。しかし、規制および安全性の問題と、血清の入手可能源の多様性を伴う問題によって、産業は、工業的な細胞培養工程から血清および他の非既知組成培地を除外することに対する努力を強いられてきた。しかし、無血清培地中で成長した細胞培養物は、多くは、栄養失調を示す。この理由のため、細胞培養物中の満足な成長およびタンパク質生成に必要な、複雑な培地の栄養構成要素と、その最適濃度を特定するために多くの努力がはらわれてきた。

【0005】

細胞培養物へのアミノ酸の供給は、成長速度および産生に大きな影響があることが知られている。グルタミンは、培養した細胞にとって重要な炭素源、窒素源およびエネルギー源であるため、通常、細胞培地に使用される。動物細胞培養物の最適な成長に必要なグルタミンの量は、他のアミノ酸の量より３倍から１０倍多いことが示された（Ｅａｇｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２－３７）。しかし、栄養素としてのグルタミンは、加熱するとピログルタメートとアンモニアが生成するため、加熱滅菌条件などの高温で水に溶解したときは不安定である（Ｒｏｔｈら、１９８８、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４（７）：６９６－９８）。この理由のため、多くは、グルタミンの代わりにグルタメートが細胞培地で使用される（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、５２、Ｓａｄｅｔｔｉｎら編集、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ、２００６）。他のグループは、グルタミン含有ジペプチド、例えば、アラニル－グルタミンまたはグリコシル－グルタミンを細胞培地に加えることによって、ピログルタメートおよびアンモニアなどの望ましくない物質の生成を避けようと試みてきた（Ｒｏｔｈら（１９８８）、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４（７）：６９６－９８）。他のグループは、加熱滅菌条件でさらに安定化させるために、ジペプチドをアシル化することを提案している。ＵＳ ５，５３４，５３８号は、Ｎ－アシルジペプチド、および加熱滅菌した経腸または非経口栄養産物におけるその使用を記載する。

【0006】

Ｆｒａｎｅｋら（２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８、１５５－１５８；ＵＳ ２００４／００７２３４１号）は、無血清培地中のマウス細胞株に対する効果について、種々の合成オリゴペプチド（オリゴ－Ｇｌｙ、オリゴ－Ａｌａ）をスクリーニングした。Ｆｒａｎｅｋらは、単一のアミノ酸および試験ペプチドは、培地の性能を顕著に変えなかったが、トリグリシン、テトラグリシンおよびペンタグリシンと、トリアラニンおよびテトラアラニンは、生存細胞密度および細胞生存率を向上させたことを報告した。

【0007】

ＷＯ ２０１１／１３３９０２号は、ジペプチドを含む細胞培地を開示し、ここで、ジペプチドは、水への溶解度が低いアミノ酸を含み、この場合にはチロシンおよびシステインを含む。システインは、水への溶解度が低いではなく、反応性チオール基の存在に起因して、不安定でもある。この著者らは、ジペプチドにチロシンおよびシステインを組み込むことによって、アミノ酸の溶解度および安定性の問題を軽減することができることを見出した。この著者らは、得られた細胞培地の貯蔵寿命の向上も見出した。一実施形態では、ジペプチドの残りのアミノ酸（システインでもなく、チロシンでもない）は、アスパラギンである。

【0008】

ＷＯ ２０１２／０１９１６０号は、動物細胞培養物を開示しており、産生段階中に、無血清培地にＴｙｒおよびＨｉｓを含有するジペプチドを追加する。ＴｙｒおよびＨｉｓを含有するジペプチドの添加が、成長および産物生成に及ぼす望ましい効果が記載されている。

【0009】

ＥＰ ０２２０３７９号およびＤＥ３５３８３１０号は、細胞培地におけるグルタミン含有ジペプチドおよびトリペプチドの使用を開示する。グルタミンは、高温でグルタミンが不安定であることに基づく問題を避けるために、ジペプチドの形態で加えられる。グルタミン含有ジペプチドは、温度に敏感ではないグルタミン源として使用される。

【0010】

ＪＰ６１２７１９８５号は、ジペプチドＸｘｘ－Ｌ－グルタミンを含む、動物細胞にとって有用な培地を開示し、ここで、Ｘｘｘは、グリシン、Ｄ／Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－セリン、Ｌ－リシンまたはＬ－フェニルアラニンである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】ＵＳ ２００４／００７２３４１号

【文献】ＷＯ ２０１１／１３３９０２号

【文献】ＷＯ ２０１２／０１９１６０号

【文献】ＥＰ ０２２０３７９号

【文献】ＤＥ３５３８３１０号

【文献】ＪＰ６１２７１９８５号

【非特許文献】

【0012】

【文献】Ｅａｇｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２－３７

【文献】Ｒｏｔｈら、１９８８、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４（７）：６９６－９８

【文献】Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、５２、Ｓａｄｅｔｔｉｎら編集、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ、２００６

【文献】Ｒｏｔｈら（１９８８）、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４（７）：６９６－９８

【文献】Ｆｒａｎｅｋら、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８、１５５－１５８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

上述の従来技術に記載される細胞培地は、特定の細胞培養工程では満足のいく性能および特性を与えているものの、従来技術の培地は、まだ最適なものとはいえない。生体工学による製造工程において、良好な成長および産物生成を促進するさらに改良された培地が依然として必要である。

【0014】

既知の培地の上述の欠点は、本発明によって対処される。本発明は、添付の独立項の用語によって定義される。本発明の好ましい実施形態は、従属項によって定義される。

【0015】

したがって、本発明は、少なくとも１つのジペプチドを含み、このジペプチドが、アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を含む、培地、好ましくは、細胞培地に関する。

【0016】

本発明はさらに、細胞、好ましくは、植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための本発明の培地の使用に関する。

【0017】

本発明の別の態様は、細胞培養産物を製造する方法であって、（ｉ）前記細胞培養産物を製造することが可能な細胞を提供する工程と、（ｉｉ）前記細胞と本発明の培地とを接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記培地または前記細胞から前記細胞培養産物を得る工程と、を含む、方法に関する。

【0018】

本発明の好ましい実施形態は、以下の発明を実施するための形態にさらに詳細に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明のさまざまな量のジペプチドを含む細胞培地を使用する種々の培養物における、時間経過に伴う生存細胞密度を示す。

【図2】本発明のさまざまな量のジペプチドを含む細胞培地を使用する種々の培養物における、時間経過に伴う細胞生存率を示す。

【図3】本発明のさまざまな量のジペプチドを含む細胞培地を使用する細胞培養物から得られた相対的な産物濃度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

「培地」は、本発明によれば、栄養素を含有する液体培地または固体培地であると理解すべきであり、この培地は、培養物中の細胞に栄養を与え、生命を維持し、および／または産物生成を補助するのに適している。培養した細胞は、本発明によれば、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞、および／または植物細胞、例えば、藻類であってもよい。典型的には、培地は、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、少なくとも１つのエネルギー源、脂質および微量元素を与え、これらは全て、細胞が生命を維持し、成長および／産物生成を維持するのに必要である。培地は、ホルモンおよび成長因子を含め、最小速度を超えて成長および／または生存を向上させる構成要素も含んでいてもよい。培地は、好ましくは、細胞の生命を維持し、成長および／産物生成を維持するｐＨおよび塩濃度を有する。培地は、本発明によれば、好ましくは、細胞培養物の生命および増殖の維持に必要な全ての栄養素を含む。好ましい培地は、既知組成培地である。

【0021】

「既知組成培地」は、本発明によれば、細胞抽出物、細胞加水分解物またはタンパク質加水分解物を含まない培地である。好ましい既知組成培地は、未知の組成の構成要素を含まない。当業者には一般的に理解されているように、既知組成培地は、通常、動物由来の構成要素を含まない。好ましくは、既知組成培地の全ての構成要素は、既知の化学構造を有する。好ましい既知組成培地は、無血清培地である。他の好ましい既知組成培地は、合成培地である。既知組成培地以外の培地は、「複雑な」培地と呼ばれる。

【0022】

「細胞培地」は、動物細胞および／または植物細胞の生命、増殖および／または産物生成を維持するのに適した培地であると理解すべきである。

【0023】

「栄養素」は、本発明によれば、生存し、成長するために細胞が必要とする化学化合物または物質である。栄養素は、好ましくは、環境から細胞によって取り込まれる。栄養素は、「有機栄養素」および「無機栄養素」であってもよい。有機栄養素としては、炭水化物、脂肪、タンパク質（またはこれらのビルディングブロック、例えばアミノ酸）およびビタミンが挙げられる。無機栄養素は、無機化合物であり、例えば、栄養素のミネラルおよび微量元素である。「必須栄養素」は、細胞が合成することができず、そのため、培地によって細胞に与えられなければならない栄養素である。

【0024】

「細胞培養産物」は、本発明によれば、細胞培養物中の細胞によって産生される任意の有用な生体化合物であると理解すべきである。本発明の好ましい細胞培養産物は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、治療用多糖類、例えば、ヘパリン、抗体、例えば、モノクローナル抗体、成長因子、インターロイキン、ペプチドホルモン、および酵素である。

【0025】

「アミノ酸」は、本発明との関連において、それぞれのアミノ酸に特有の側鎖と共に、アミノ官能基（－ＮＨ_２）とカルボン酸官能基（－ＣＯＯＨ）とを含む分子であると理解すべきである。本発明の好ましいアミノ酸は、α－アミノ酸であり、特に、以下のような２０種類の「天然アミノ」酸である。
アラニン （Ａｌａ／Ａ）
アルギニン （Ａｒｇ／Ｒ）
アスパラギン （Ａｓｎ／Ｎ）
アスパラギン酸 （Ａｓｐ／Ｄ）
システイン （Ｃｙｓ／Ｃ）
グルタミン酸 （Ｇｌｕ／Ｅ）
グルタミン （Ｇｌｎ／Ｑ）
グリシン （Ｇｌｙ／Ｇ）
ヒスチジン （Ｈｉｓ／Ｈ）
イソロイシン （Ｉｌｅ／Ｉ）
ロイシン （Ｌｅｕ／Ｌ）
リシン （Ｌｙｓ／Ｋ）
メチオニン （Ｍｅｔ／Ｍ）
フェニルアラニン （Ｐｈｅ／Ｆ）
プロリン （Ｐｒｏ／Ｐ）
セリン （Ｓｅｒ／Ｓ）
トレオニン （Ｔｈｒ／Ｔ）
トリプトファン （Ｔｒｐ／Ｗ）
チロシン （Ｔｙｒ／Ｙ）
バリン （Ｖａｌ／Ｖ）

【0026】

本発明との関連において、「天然アミノ酸」との表現は、上に列挙した２０種類のアミノ酸のＬ形態およびＤ形態の両方を含むと理解すべきである。しかし、Ｌ形態が好ましい。一実施形態では、「アミノ酸」との用語は、これらのアミノ酸の類似体または誘導体も含む。

【0027】

「遊離アミノ酸」は、本発明によれば、遊離形態で（すなわち、他の分子に共有結合していない）アミノ官能基およびその（α－）カルボキシル官能基を有するアミノ酸、例えば、ペプチド結合を生成しないアミノ酸であると理解される。遊離アミノ酸はまた、塩として、または水和物形態で存在していてもよい。オリゴペプチドの一部として、またはオリゴペプチド中のアミノ酸について言及する場合、遊離アミノ酸は、生化学およびペプチド生合成の既知の機構にしたがって、それぞれのアミノ酸から誘導されるそれぞれのオリゴペプチド構造のその部分を指すと理解すべきである。

【0028】

「成長因子」は、本発明によれば、細胞成長、増殖および細胞分化を刺激することができる任意の天然に存在する物質であると理解すべきである。好ましい成長因子は、タンパク質またはステロイドホルモンの形態である。本発明の一実施形態によれば、「成長因子」との表現は、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦを含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびＴＧＦαおよびＴＧＦβを含むトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、サイトカイン、例えば、インターロイキン１、２、６、顆粒球刺激因子、および白血病阻止因子（ＬＩＦ）からなるリストから選択される成長因子に関連するものであると解釈すべきである。

【0029】

「オリゴペプチド」は、本発明によれば、２個から２０個のアミノ酸からなるペプチド化合物であると理解すべきである。本発明のより好ましいオリゴペプチドは、２－１０アミノ酸、２－６アミノ酸、２－５アミノ酸、２－４アミノ酸、または２－３アミノ酸からなるオリゴペプチドである。本発明の最も好ましいオリゴペプチドは、ジペプチドである。

【0030】

「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに共有結合した少なくとも２つのアミノ酸を含む分子であると理解すべきである（Ｒ^１－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ^２）。

【0031】

「Ｘｘｘ」との表現は、アミノ酸と組み合わせて本明細書で使用される場合、本明細書で上に列挙した任意の天然アミノ酸を指すと理解すべきである。

【0032】

「Ｎアシル化」との表現は、ある化学化合物（例えば、アミノ酸）について言及する場合、Ｎアシル化化合物が、その化合物の窒素官能基にアシル基が付加することによって改変されていることを意味すると理解すべきである。好ましくは、アシル基は、アミノ酸のα－アミノ基に付加される。

【0033】

栄養組成物、培地、細胞培地などの「滅菌形態」は、前記組成物、培地、細胞培地などに生命体が何ら存在しないことを規定すると理解すべきである。

【0034】

「固体培地」は、本発明との関連において、任意の非液体培地または非気体培地であると理解すべきである。本発明の好ましい固体培地は、ゲル様培地であり、例えば、寒天、カラギーナンまたはゼラチンである。

【0035】

「細胞の継代」（細胞の継代培養または分割としても知られる）は、本発明との関連において、少数の細胞を新しい培養容器に移すことを意味すると理解される。細胞は、長期間にわたる高い細胞密度に関連する老化を避けるために、規則的に分割する場合には、さらに長い時間培養してもよい。懸濁培養物は、数個の細胞を含む少量の培養物を大容積の新しい培地で希釈して、容易に継代される。

【0036】

本発明は、一般的に、培地、好ましくは、細胞培地であって、この培地が、少なくとも１つのジペプチドを含み、このジペプチドが、アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を含む、培地に関する。

【0037】

本願発明者らは、この種の培地が、従来の細胞培地と比較して優れた特性を有することを見出した。本発明の培地が、同じ量の関連するアミノ酸を含むが、遊離アミノ酸の形態で含む細胞培地に対して、細胞培養物の生存細胞密度および細胞生存率を増加させることが可能であることが、本願発明者らによって見出された。従来の細胞培地中に同じ量のアミノ酸が存在するという事実にもかかわらず、細胞生存率および細胞数は、遊離アミノ酸を本発明のＡｓｎ含有ジペプチドに置き換えると、増加する。

【0038】

本発明の好ましいジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎ（Ｌ－グルタミニル－Ｌ－アスパラギン）である。本発明の別の好ましいジペプチドは、Ａｓｎ－Ｇｌｎ（Ｌ－アスパラギニル－Ｌ－グルタミン）である。

【0039】

好ましい実施形態では、ジペプチドは、Ｎアシル化されていない。Ｎアシル化は、特定のジペプチドの熱安定性を向上させることが知られている。しかし、Ｎアシル化ジペプチドは、生存細胞密度および生存率の悪化も引き起こし得ることがわかっている。

【0040】

一実施形態では、培地は、さらに、少なくとも１つの炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１つの無機塩、緩衝剤および／または少なくとも１つのビタミンを含む。特に好ましい実施形態では、培地は、少なくとも１つの炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１つの無機塩、緩衝剤および少なくとも１つのビタミンの全てを含む。

【0041】

本発明のさらなる一実施形態では、培地は、成長因子を含まない。この実施形態によれば、本発明のジペプチドは、培養物中の細胞の成長および／または増殖を促進するために、成長因子の代わりに使用されてもよい。本発明の別の実施形態では、培地は、脂質を何ら含まない。

【0042】

本発明の別の実施形態によれば、培地は、液体形態、ゲル、粉末、顆粒、ペレットの形態、またはタブレットの形態である。

【0043】

好ましい実施形態では、本発明の培地は、既知組成培地または無血清培地である。例えば、本発明のジペプチドは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）のＣＨＯＭＡＣＳ ＣＤ培地、ＬＯＮＺＡ（バーゼル、スイス）から入手可能なＰｏｗｅｒＣＨＯ－２ ＣＤ培地、ＰＡＡの抗ＣＨＯ Ｐ培地（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、パシング、オーストリア）、ＳＡＦＣから入手可能なＥｘ－Ｃｅｌｌ ＣＤ ＣＨＯ培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（ウォルサム、ＵＳＡ）のＳＦＭ４ＣＨＯ培地およびＣＤＭ４ＣＨＯ培地に追加されてもよい。本発明のジペプチドはまた、ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＵＳＡ）にも追加されてもよい。しかし、本発明は、上述の培地の追加に限定されない。

【0044】

他の好ましい実施形態では、培地は、使用時の培地の濃度に対し、２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍または１０倍の濃縮形態（体積／体積）の液体培地である。これにより、濃縮培地をそれぞれの体積の滅菌水で単純に希釈することによって、「すぐに使える」培地を調製することができる。本発明の培地のこのような濃縮形態は、例えば、供給バッチ培養工程で培地に加えることによって使用することもできる。

【0045】

本発明の培地は、好ましくは、持続的な成長および産物生成に必要な全ての栄養素を含む。培地、特に細胞培地を調製する処方は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、ＯｅｚｔｕｅｒｋおよびＷｅｉ－Ｓｈｏｕ Ｈｕ編集、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ ２００６を参照）。種々の培地は、種々の供給源から市販されている。

【0046】

本発明の培地は、好ましくは、炭水化物源を含む。細胞培地に使用される主な炭水化物はグルコースであり、通常は５ｎＭから２５ｎＭ追加される。これに加え、任意のヘキソース、例えば、ガラクトース、フルクトースまたはマンノース、または組み合わせを使用してもよい。

【0047】

培地は、さらに、典型的には、必須アミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｙ、Ｖａｌ）と特定の非必須アミノ酸も少なくとも含む。非必須アミノ酸は、典型的には、細胞株がそのアミノ酸を合成することができない場合、または細胞株が、最大成長を維持するのに十分な量のそのアミノ酸を産生することができない場合に、細胞培地に含まれる。これに加え、哺乳動物細胞は、主なエネルギー源としてグルタミンも使用することができる。グルタミンは、多くは、他のアミノ酸よりも高濃度で含まれる（２ｍＭ－８ｍＭ）。しかし、前述したとおり、グルタミンは、自然に分解してアンモニアを生成し、特定の細胞株は、毒性であるアンモニアをより早く産生する場合がある。

【0048】

本発明の培地は、好ましくは、塩を含む。塩は、等張状態を維持し、浸透圧の不均衡を防ぐために、細胞培地に加えられる。本発明の培地の浸透圧は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであるが、多くの細胞株は、この値の約１０％変動またはもっと高い値に耐えることができる。ある種の昆虫細胞培養物の浸透圧は、３００ｍＯｓｍ／ｋｇより高い傾向があり、この浸透圧は、３００ｍＯｓｍ／ｋｇより０．５％、１％、２％から５％、５％－１０％、１０％－１５％、１５％－２０％、２０％－２５％、２５％－３０％高くてもよい。細胞培地中で最も一般的に使用される塩としては、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｌ^－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^３－およびＨＣＯ_３ ^－（例えば、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４）が挙げられる。

【0049】

培地には、他の無機元素が存在していてもよい。他の無機元素としては、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｖａ、Ｓｅ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｇ、ＳｉおよびＮｉが挙げられる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。これらは、ＣａＣｌ_２、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４などの塩形態、およびセレン、バナジウムおよび亜鉛などの微量元素のイオンの形態で与えられてもよい。これらの無機塩および微量元素は、例えば、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ）から商業的に得てもよい。

【0050】

本発明の培地は、好ましくは、ビタミン類を含む。ビタミン類は、典型的には、補因子として細胞に使用される。各細胞株のビタミン要求は、大きく変動するが、一般的に、細胞培地が血清をほとんど含まないか、または全く含まない場合、または細胞が高密度で成長する場合には、余分のビタミンが必要となる。本発明の培地中に存在する好ましい例示的なビタミンとしては、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ニコチンアミド、Ｄ－Ｃａ^＋＋－パントテン酸塩、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、Ａ、Ｂ_６、Ｂ_１２、Ｃ、Ｄ_３、Ｅ、Ｋおよびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）が挙げられる。

【0051】

本発明の培地は、血清も含んでいてもよい。血清は、凝固血の上清である。血清の構成要素としては、接着因子、微量栄養素（例えば、微量元素）、成長因子（例えば、ホルモン、プロテアーゼ）、および保護要素（例えば、抗毒素、酸化防止剤、抗タンパク分解酵素）が挙げられる。血清は、ヒト、ウシまたはウマの血清を含め、種々の動物源から入手可能である。本発明の細胞培地に含まれる場合、血清は、典型的には、５％－１０％（体積）の濃度で加えられる。好ましい細胞培地は、無血清である。

【0052】

血清非存在下、または血清減少培地中で細胞成長を促進するために、以下の１つ以上のポリペプチドを細胞本発明の培地に加えてもよい。例えば、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦを含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびＴＧＦαおよびＴＧＦβを含むトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、任意のサイトカイン、例えば、インターロイキン１、２、６、顆粒球刺激因子、白血病阻止因子（ＬＩＦ）など。

【0053】

しかし、本発明の培地は、上に列挙した成長因子をどれも含んでいなくてもよい。本発明のこの態様によれば、本発明のジペプチドは、細胞の増殖を促進するために任意の成長因子の代わりに用いられる。言い換えると、本発明のこの態様によれば、本発明のジペプチドの存在によって、成長因子の存在が不必要になる。

【0054】

他の実施形態では、細胞培地は、ポリペプチド（すなわち、２０を超えるアミノ酸を含むペプチド）を含まない。

【0055】

１種類以上の脂質も、細胞本発明の培地に加えてもよい。例えば、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸および／または１２、１４、１６、１８、２０または２４炭素原子の脂肪酸（それぞれの炭素原子は分岐しているか、分岐していない）、リン脂質、レシチン（ホスファチジルコリン）およびコレステロール。これらの脂質の１つ以上が、無血清培地に追加剤として含まれてもよい。ホスファチジン酸およびリゾホスファチジン酸は、特定の足場依存性細胞、例えば、ＭＤＣＫ、マウス上皮および他の腎臓細胞株の成長を刺激し、一方、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシトールは、無血清培地においてヒト線維芽細胞の成長を刺激する。エタノールアミンおよびコレステロールは、特定の細胞株の成長を促進することも示されてきた。特定の実施形態では、細胞培地は、脂質を含まない。

【0056】

１種類以上の輸送タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはトランスフェリンも、細胞培地に加えることができる。輸送タンパク質は、特定の栄養素または微量元素の輸送を補助することができる。ＢＳＡは、典型的には、脂質（例えば、水溶液に不溶性のリノール酸およびオレイン酸）の輸送体として使用される。これに加え、ＢＳＡは、特定の金属（例えば、Ｆｅ、ＣｕおよびＮｉ）の輸送体としても機能することができる。タンパク質を含まない製剤では、ＢＳＡの非動物由来代替物（例えば、シクロデキストリン）を脂質輸送体として使用してもよい。

【0057】

１種類以上の接着タンパク質、例えば、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロネクチンも、基質への足場依存性細胞の接着を促進しやすくするために、細胞培地に加えることができる。

【0058】

細胞培地は、場合により、１種類以上の緩衝剤を含んでいてもよい。適切な緩衝剤としては、限定されないが、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］－ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、重炭酸塩、および細胞培養用途に使用するのに適した他の緩衝剤が挙げられる。適切な緩衝剤は、培養する細胞に対する実質的な細胞毒性がなく、緩衝能を与えるものである。適切な緩衝剤の選択は、細胞培養分野における通常の技術の範囲内である。

【0059】

細胞が凝集するのを防ぎ、懸濁物中の細胞の成長を促進するために、多価アニオン性または多価カチオン性の化合物を培地に加えてもよい。

【0060】

好ましい実施形態では、培地は、液体形態である。しかし、培地は、固体培地であってもよく、例えば、ゲル様培地、例えば、寒天、カラギーンまたはゼラチンを含有する培地であってもよい。

【0061】

好ましくは、培地は、滅菌形態である。

【0062】

本発明の好ましい実施形態では、ＡｓｎおよびＧｌｎを含有するジペプチドは、培地中に、０．０１ｇ／ｌ－２０ｇ／ｌ、または０．１ｇ／ｌ－１０ｇ／ｌ、または０．５ｇ／ｌ－５ｇ／ｌの濃度で存在する。本発明の他の好ましい実施形態では、ＡｓｎおよびＧｌｎを含有するジペプチドは、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭまたは１ｍＭより高い濃度で存在する。ＡｓｎおよびＧｌｎを含有するジペプチドが５０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭまたは２ｍＭより低い濃度で存在する培地も好ましい。好ましくは、ＡｓｎおよびＧｌｎを含有するジペプチドは、培地中に、０．０１ｍＭ－４０ｍＭ、または０．１ｍＭ－２０ｍＭ、または０．１ｍＭ－１０ｍＭ、または０．５ｍＭ－１０ｍＭ、または１ｍＭ－１０ｍＭ、または１ｍＭ－８ｍＭ、または１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在する。非常に好ましい一実施形態では、ジペプチドの濃度は、１ｍＭ－６ｍＭであり、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎである。

【0063】

上述の濃度は、非濃縮培地中の濃度、すなわち、実際の培養物中に存在する濃度として与えられる。濃縮培地は、Ｘ倍高い濃度を有していてもよい。

【0064】

特定の実施形態では、本発明の細胞培地は、ＡｓｎおよびＧｌｎを含有するジペプチドと遊離Ａｓｎの両方を含む。ある好ましい実施形態では、ＡｓｎおよびＧｌｎを含有するジペプチドは、市販の培地に、例えば、既知組成細胞培地または複雑な細胞培地に加えられる。

【0065】

本発明の培地は、濃縮形態であってもよい。本発明の培地は、例えば、２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍の濃縮形態であってもよい（細胞の成長および産物生成を補助する濃度に対して）。このような濃縮培地は、水性溶媒（例えば水）を用いて濃縮培地を希釈することによって使用するための培地を調製するのに有用である。このような濃縮培地は、バッチ培養で使用されてもよいが、有利には、例えば、培養中に細胞によって消費された栄養素を補充するために、濃縮した栄養組成物が、進行中の細胞培養に加えられる供給バッチ培養または連続培養にも使用される。

【0066】

本発明の他の実施形態では、培地は、乾燥形態、例えば、乾燥粉末の形態、または顆粒の形態、またはペレットの形態、またはタブレットの形態であってもよい。

【0067】

本発明はまた、細胞を培養するための本発明の培地の使用に関する。本発明の別の態様は、細胞培養産物を製造するための本発明の培地の使用に関する。

【0068】

本発明の好ましい実施形態は、動物細胞または植物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞を培養するための本発明の培地の使用に関する。特定の実施形態では、培養される細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞およびハイブリドーマ細胞である。本発明の好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞およびハイブリドーマ細胞である。本発明の最も好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の特に好ましいＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞およびＣＨＯ ＤＰ１２細胞である。

【0069】

細胞と、本発明の細胞培地とを接触させることを含む、細胞を培養する方法も、本発明の範囲に含まれる。本発明の一実施形態では、細胞を培養する方法は、細胞の培養を補助する条件下で細胞と基本培地とを接触させることと、前記基本細胞培地に本発明の濃縮培地を追加することと、を含む。好ましい実施形態では、基本培地に、１日より多い日数、濃縮供給物または濃縮培地を追加する。

【0070】

本発明の別の態様は、本発明の培地を製造する方法であって、前記培地が、少なくとも１つの本発明のジペプチドを含む方法に関する。本発明の培地を製造する方法は、本発明のジペプチドを培地に追加する少なくとも１つの工程を含む。同様に、本発明の一態様は、細胞培地を製造するための本発明のＡｓｎ含有ジペプチドの使用に関する。

【0071】

本発明の別の態様は、培地を改変する方法であって、前記培地の改変が、前記培地への本発明の少なくとも１つのジペプチドの添加を含む、方法に関する。

【0072】

本発明の別の態様は、液体培地を製造する方法であって、前記方法が、本発明の固体培地を例えば乾燥粉末の形態で、または顆粒の形態で、またはペレットの形態で、またはタブレットの形態で提供することと、前記固体培地を水性媒体、例えば水に溶解することと、を含む方法に関する。

【0073】

本発明の別の態様は、細胞を培養するための培地における本発明のジペプチドの使用に関する。本発明の別の態様は、細胞培養のための本発明のジペプチドの使用に関する。

【0074】

本発明はまた、細胞培養産物を製造する方法であって、（ｉ）前記細胞培養産物を製造することが可能な細胞を提供する工程と、（ｉｉ）前記細胞と本発明の培地とを接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記培地または前記細胞から前記細胞培養産物を得る工程と、を含む方法に関する。同様に、本発明は、細胞培養産物を製造するための本発明のジペプチドの使用に関する。

【0075】

好ましい方法では、細胞培養産物は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、多糖、例えば、ヘパリン、抗体、モノクローナル抗体、成長因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子または酵素である。

【0076】

本発明の細胞を培養する好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－Ａｓｎであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、Ｇｌｎ－ＡｓｎまたはＡｓｎ－Ｇｌｎであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、１ｍＭ－６ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、０．５ｍＭ－１０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、ＣＨＯ細胞またはハイブリドーマ細胞である。本発明の細胞を培養する別の好ましい方法、または細胞を培養するためのジペプチドの使用において、ジペプチドは、２－５アミノ酸長であり、ＴｙｒまたはＣｙｓを含まないＡｓｎ含有ジペプチドであり、ジペプチドは、０．１ｍＭ－２０ｍＭの濃度で存在し、細胞は、哺乳動物細胞である。

【0077】

本発明の細胞の培養は、バッチ培養、供給バッチ培養または連続培養で行うことができる。

【実施例】

【0078】

実施例１：Ｌ－グルタミニル－Ｌ－アスパラギンの合成
２７．８ｇのトリエチルアミンを、アセトン３５０ｍｌ中、７０ｇのベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミン（ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒ ２６５０－６４－８、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡから入手可能）に加えた。この溶液を－１０℃まで冷却し、３１．６ｇの塩化ピバロイル（Ｓｉｇｍａ）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、次いで、３９．６ｇのＬ－アスパラギン、１９．０ｇの水酸化カリウム８５％および４１．３ｇの炭酸カルシウムの水３５０ｍｌの溶液に加えた。室温（２０℃）まで加熱し、３００ｍｌのＨ_２Ｏで希釈した。ｐＨ２になるまでＨＣｌ（濃）を加えた。得られた固体を濾過し、水およびアセトンで洗浄し、真空下で乾燥させた。６５．２ｇのベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－アスパラギンを、無色結晶の形態で得た。融点は、２０２℃－２０４℃であった。

【0079】

^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．６９（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｍ，１Ｈ），２．１４（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），４．５２（ｍ，１Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），６．６４（ｄ，２Ｈ），７．２８（ｄ，２Ｈ），７．３７（ｍ，５Ｈ），７．４３（ｍ，１Ｈ），８．０９（ｍ，１Ｈ）。

【0080】

次いで、２０．０ｇのベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－アスパラギンを水５００ｍｌに懸濁させた。１．０ｇのＰｄ／Ｃ触媒（５％Ｐｄ充填）を加え、２０℃－３０℃、５ｂａｒで１４時間、水和させた。４０℃－４５℃になるまで熱を加え、濾過によって触媒を除去した。ロータリーエバポレータ中、濾液を真空下で濃縮した。残渣を１００ｍｌのＥｔＯＨと混合した。得られた固体を濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させた。１２．９ｇのＬ－グルタミニル－Ｌ－アスパラギンを、無色結晶の形態で得た。融点は、２０２℃－２０４℃であった。

【0081】

^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ＋ＨＣｌ）：２．０５（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｍ，２Ｈ），２．６９（ｍ，２Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），８．４６（ｓ，３Ｈ），８．９６（ｍ，１Ｈ）。

【0082】

実施例２：細胞培養物に対するＧｌｎ－Ａｓｎの効果
抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｓｕｂｃｌｏｎｅ ＤＧ４４；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、ＵＳＡ）に対するＧｌｎ－Ａｓｎジペプチドの効果を、一時一事法（ＯＦＡＴ）による分析を用いて観察した。

【0083】

分析は、実質的に同じ培養条件で行われたが、培地中のＧｌｎ－Ａｓｎジペプチドの量を増加させていった一連の細胞培養物における生存細胞密度および細胞生存率の比較に基づいていた。種々の培地におけるＡｓｎ単位およびＧｌｎ単位の合計量（モル基準）を一定に維持するために、遊離グルタミンと遊離アスパラギンのモル濃度を、加えたジペプチドのモル量にしたがって減らした。Ｇｌｎ－Ａｓｎジペプチドの量を増加させていった一連の培地は、種々の量の基本培地（遊離ＡｓｎとＧｌｎを含む）および試験培地（Ａｓｎ－Ｇｌｎジペプチドを含む）を混合することによって調製された。市販の既知組成細胞培地（ＴＣ－４２、ＴｅｕｔｏＣｅｌｌ ＡＧ、ビーレフェルト、ドイツ）は、基本培地の役割を果たした。（任意の他の適切な細胞培地を使用することも可能であった。）試験培地（ＴＣ－４２－ＥＶＯ）は、基本培地と比較して、同じ栄養素濃度を有するが、遊離Ａｓｎの代わりに、試験培地は、等モル量（５．４ｍＭ）のＧｌｎ－Ａｓｎジペプチドを含むように調製された。さらに、試験培地中の遊離Ｇｌｎ濃度は、試験培地中のＧｌｎ単位（すなわち、遊離Ｇｌｎおよびジペプチド－Ｇｌｎ）の合計濃度が、基本培地中の遊離Ｇｌｎ濃度に合うような値に設定された。試験培地中の全ての他の栄養素の濃度は、基本培地中の濃度と同じであった。基本培地は、１４６１．５ｍｇ／ｌの遊離Ｇｌｎと、６１２ｍｇ／ｌの遊離Ａｓｎとを含んでいた。

【0084】

次いで、以下の比率でさまざまな量の試験培地および基本培地を含有する培地を用い、６種類の細胞培養を行った。

【0085】

【表1】

【0086】

全ての培地をｐＨ８．３に設定した。培地の塩分濃度を、ＮａＣｌを用いて２８５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに設定した。全ての培養を、同一の培養条件下（温度、湿度、ｒｐｍ、ＣＯ_２など）、標準的な細胞培養法を用い、ロータリーシェーカー内で行った。細胞培養物の３回の継代を行い、生存細胞密度（ＶＣＤ；１０^６生存細胞／ｍｌ）および細胞生存率（％）を、トリプトファンブルー判定を用い、２個ずつの判定で調べた。

【0087】

培養１番から６番における生存細胞密度［１０^６細胞／ｍｌ］を、以下の図１および表２に示す。最大生存細胞密度（第３継代）と、ジペプチド濃度との相関関係を観察する。最も大きな最大生存細胞密度は、培養１番で、すなわち、全てのＡｓｎがＡｓｎ含有ジペプチドの形態で与えられる培養で得られる。最小の生存細胞密度は、培養６番で、すなわち、Ａｓｎの全てが遊離アミノ酸として与えられる培養で得られる。さらに、長い時間にわたって（１３日目から１８日目まで）、増加した生存細胞密度が維持されることもわかるだろう。したがって、生存細胞密度に対するＡｓｎ含有ジペプチドの望ましい効果が示される。

【0088】

【表2】

【0089】

培養時間全体にわたる細胞生存率［全細胞中の生存細胞％］を、以下の図２および表３に示す。高濃度のＡｓｎ含有ジペプチド（培養１番、２番、３番）を含有する培地を用いて行った培養は、１８日目に比較的高い細胞生存率を示し、一方、培養４番、５番、６番（低濃度のジペプチドを含む）は、実験終了時には、顕著に減少した細胞生存率を示す。したがって、本発明の培地は、細胞培養物における細胞生存率［％］に対して望ましい効果を有する。

【0090】

【表3】

【0091】

産物力価（培養終了時ｔ＝１８時間の抗体濃度、相対単位で）を、以下の図３および表４に示す。一般的に、Ａｓｎ含有ジペプチドを含む全ての培養物で、産物力価の増加が観察される。培養２番および３番（それぞれ８０％および２５％のＡｓｎがジペプチドの形態で存在する）において、産物力価は、１．４倍より多く増加している。顕著に向上した産物力価は、培養１番から４番で、すなわち、ジペプチドのモル濃度が０．８ｍＭ－５．４ｍＭおよびもっと高いときに得られる。

【0092】

【表4】

【0093】

実施例３：Ａｓｎ含有ジペプチドを含む改変ＤＭＥＭ培地の調製
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、多くの異なる哺乳動物細胞の成長を補助するために広く用いられる基本培地である。ＤＭＥＭ中での培養が成功した細胞は、初代線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、ＨＵＶＥＣおよび平滑筋細胞、およびＨｅＬａ、２９３、Ｃｏｓ－７およびＰＣ－１２などの細胞株を含む。本発明の追加されたＤＭＥＭ培地は、市販のＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＤＭＥＭ、高グルコース、ＳＫＵ ４１９６５－０３９番、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）にＧｌｎ－Ａｓｎを加えることによって調製される。培地中のジペプチドの最終濃度は、４．５ｍＭである。

【0094】

実施例４：Ａｓｎ含有ペンタペプチドを含む改変ＤＭＥＭ培地の調製
ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＤＭＥＭ、高グルコース、ＳＫＵ ４１９６５－０３９番、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）に、Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ａｓｎペンタペプチドを追加する。ペンタペプチドの最終濃度は、４．５ｍＭである。

【図1】

【図2】

【図3】