(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-11
(45)【発行日】2022-11-21
(54)【発明の名称】免疫原性変異体ペプチドスクリーニングプラットフォーム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6809 20180101AFI20221114BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20221114BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221114BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221114BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221114BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221114BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221114BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221114BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221114BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221114BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20221114BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20221114BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALN20221114BHJP
C12Q 1/683 20180101ALN20221114BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221114BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6809 Z ZNA
A61K39/00 H
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P37/04
A61K45/00
A61K48/00
A61P43/00 121
G01N33/53 D
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6883 Z
C12Q1/683 Z
C12N15/12
【請求項の数】
33
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020182268
(22)【出願日】2020-10-30
(62)【分割の表示】P 2017513786の分割
【原出願日】2015-09-10
(65)【公開番号】P2021040632
(43)【公開日】2021-03-18
【審査請求日】2020-11-26
(31)【優先権主張番号】62/048,742
(32)【優先日】2014-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ドゥラマーレ， レリア
(72)【発明者】
【氏名】ラパダス， パトリック
(72)【発明者】
【氏名】メルマン， イラ
(72)【発明者】
【氏名】ヤーダヴ， マヘーシュ
(72)【発明者】
【氏名】ジュンジュンワラ， スジット
(72)【発明者】
【氏名】リル， ジェニー
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５３０９４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／０１２０５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１５９６４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Cancers，2011年，Vol.3，p.4191-4211
【文献】Mol. Immunol.，2013年05月18日，Vol56，p.81-90，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3686981/参照
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列に変異を有する、変異体コード配列の第１のセットを得ること、（ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列と、変異体コード配列によりコードされるペプチドがＭＨＣ分子に結合する能力の予測とに基づいて、第１のセットから変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及び
（ｃ）変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することであって、免疫原性変異体コード配列を選択することが変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、免疫原性を予測することがＭＨＣ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露に基づく、選択すること、
を含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、
個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法。
【請求項2】
免疫原性を予測することがペプチド内の変異アミノ酸の位置にさらに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
変異アミノ酸が４～６位内にある、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
免疫原性を予測することが、ＭＨＣ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露にさらに基づく、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
免疫原性を予測することが、ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合親和性にさらに基づく、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
免疫原性を予測することが、ペプチドを含むペプチド前駆体のタンパク質レベルにさらに基づく、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
免疫原性を予測することが、ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベルにさらに基づく、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
免疫原性を予測することが、免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率にさらに基づく、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
免疫原性を予測することが、ペプチド前駆体の発現のタイミングにさらに基づく、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
免疫原性を予測することが、ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性にさらに基づく、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
免疫原性を予測することが、ペプチドにおける芳香族残基の含有量にさらに基づく、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
免疫原性を予測することが、野生型残基と比較したときの変異アミノ酸の特性にさらに基づく、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
免疫原性を予測することが、ペプチド前駆体の性質にさらに基づく、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
疾患ががんである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、変異体コード配列の第１のセットを得ることが、全ゲノムシークエンシングを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
トランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから変異体コード配列の第２のセットを選択することが、トランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列を選択することを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣＩ）である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
個体における疾患組織から疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定するためのシステムであり、１以上のプロセッサにより実行されるように構成された１以上のアルゴリズムを保存するメモリを含み、
１以上のアルゴリズムが、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定するための指示であって、
（ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列に変異を有する、変異体コード配列の第１のセットを得ること、
（ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列と、変異体コード配列によりコードされるペプチドがＭＨＣ分子に結合する能力の予測とに基づいて、第１のセットから変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及び
（ｃ）変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することであって、免疫原性変異体コード配列を選択することが変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、免疫原性を予測することがＭＨＣ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露に基づく、選択すること、
を含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する指示を含む、
システム。
【請求項19】
免疫原性を予測することがペプチド内の変異アミノ酸の位置にさらに基づく、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
変異アミノ酸が４～６位内にある、請求項１９に記載のシステム。
【請求項21】
免疫原性を予測することが、ＭＨＣ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露にさらに基づく、請求項１８～２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項22】
免疫原性を予測することが、ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合親和性にさらに基づく、請求項１８～２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項23】
免疫原性を予測することが、ペプチドを含むペプチド前駆体のタンパク質レベルにさらに基づく、請求項１８～２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項24】
免疫原性を予測することが、ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベルにさらに基づく、請求項１８～２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項25】
免疫原性を予測することが、免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率にさらに基づく、請求項１８～２４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項26】
免疫原性を予測することが、ペプチド前駆体の発現のタイミングにさらに基づく、請求項１８～２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項27】
免疫原性を予測することが、ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性にさらに基づく、請求項１８～２６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項28】
免疫原性を予測することが、ペプチドにおける芳香族残基の含有量にさらに基づく、請求項１８～２７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項29】
免疫原性を予測することが、野生型残基と比較したときの変異アミノ酸の特性にさらに基づく、請求項１８～２８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項30】
免疫原性を予測することが、ペプチド前駆体の性質にさらに基づく、請求項１８～２９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項31】
トランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから変異体コード配列の第２のセットを選択することが、トランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列を選択することを含む、請求項１８～３０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項32】
ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣＩ）である、請求項１８～３１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項33】
疾患ががんである、請求項１８～３２のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１４年９月１０日出願の米国特許仮出願第６２／０４８７４２号の優先権を主張し、その全内容すべてがあらゆる目的のため本明細書に参照により援用される。
本出願は、２０１４年９月１０日出願の米国特許仮出願第６２／０４８７４２号の優先権を主張し、その全内容すべてがあらゆる目的のため本明細書に参照により援用される。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出の内容は、その全内容が本明細書に参照により援用される：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０２７６００ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１５年９月９日、サイズ：６ＫＢ）。
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出の内容は、その全内容が本明細書に参照により援用される：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０２７６００ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１５年９月９日、サイズ：６ＫＢ）。
【0003】
本開示は、免疫療法を開発するのに有用な変異体ペプチドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
細胞媒介性免疫に関与する細胞傷害性Ｔリンパ球（細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＤ８ Ｔ細胞）は、細胞表面上のペプチドエピトープ又は抗原をスキャンすることにより細胞の健常性の変化をモニタリングする。ペプチドエピトープは、細胞タンパク質に由来し、細胞が現在の細胞プロセスの証拠を提示することを可能にするディスプレイ機構として寄与する。ネイティブ及び非ネイティブタンパク質（それぞれ、自己及び非自己と呼ばれることが多い）の両方が、ペプチドエピトープ提示のためにプロセシングされる。ほとんどの自己ペプチドが、天然タンパク質代謝回転及び欠陥リボソーム産物に由来する。非自己ペプチドは、ウイルス及び細菌感染、疾患、並びにがんなどの事象の過程で生成したタンパク質に由来しうる。
【0005】
ヒト腫瘍は、顕著な数の体細胞変異を担持することを特徴とする。したがって、変異を含有するペプチドの発現は、適応免疫系により非自己ネオエピトープとして認識できる。非自己抗原の認識の際、細胞傷害性Ｔ細胞は、免疫応答を引き起こし、非自己ネオエピトープをディスプレイする細胞のアポトーシスをもたらす。細胞傷害性Ｔ細胞適応免疫は高度に特異的な機構であり、感染細胞、疾患細胞、及びがん性細胞を除去するための効率的な手段である。免疫原性エピトープを同定することには大きな治療的価値がある。なぜなら、ワクチン接種を介した免疫原性エピトープへの曝露は、所望の細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を引き起こすために使用できるからである。免疫原性エピトープの役割が科学界及び医学界で知られて数十年が経過したが、効果的な抗腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞応答を駆動する抗原の同定は、ほとんど未知のままである。エピトープ提示及び細胞傷害性Ｔ細胞活性化に伴う複雑さが、それらの発見及び治療的使用を難しくしてきた。
【0006】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、細胞傷害性Ｔ細胞に対するペプチドエピトープ提示を担っている。ヒトにおいて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子をコードする遺伝子座である。ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）タンパク質をコードする。典型的には８～１１アミノ酸長であるペプチドが、逆平行ベータシートの上に位置する２つのアルファヘリックスにより形成される溝との相互作用を通じてＭＨＣＩ分子と結合する。ペプチド－ＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）分子のプロセシング及び提示は、ａ）タンパク質のプロテアーゼ媒介性消化、ｂ）抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）により媒介される小胞体（ＥＲ）内へのペプチド輸送、ｃ）新規合成ＭＨＣＩ分子を使用したｐＭＨＣＩの形成、及びｄ）細胞表面へのｐＭＨＣＩの輸送を含む一連の連続的段階を伴う。
【0007】
細胞表面上で、ｐＭＨＣＩは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用する。複雑なｐＭＨＣＩ－ＴＣＲ相互作用に続いて、非自己抗原の同定が、関連酵素、共受容体、アダプター分子、及び転写因子により媒介される一連の生化学的事象を通じた細胞傷害性Ｔ細胞活性化をもたらしうる。活性化細胞傷害性Ｔ細胞は、増殖し、同定された免疫原性ペプチドエピトープに特異的なＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞集団を生成する。同定された非自己エピトープに対するＴＣＲ特異性を有するＴ細胞の増幅は、活性化非自己エピトープをディスプレイする細胞の免疫媒介性アポトーシスをもたらす。
【0008】
免疫系を活性化させるための免疫原性エピトープの使用は、現在、がん治療における使用のために研究されている。がん細胞が正常組織に由来する一方で、体細胞変異はがんプロテアソームにおける多数の変化をもたらす。その結果、得られるＭＨＣＩ提示ペプチドエピトープは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はネオエピトープと呼ばれ、正常及びがん組織間での細胞傷害性Ｔ細胞分化を可能にする。近年の研究は、変異体ペプチドが、ＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞により非自己として認識されるエピトープとして寄与しうることを確証したが、以来、変異体ネオエピトープはほとんど記述されてこなかった。
【0009】
ペプチドベースの免疫療法の使用は、所望の細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するペプチドエピトープの選択に左右される。具体的には、腫瘍抗原は、２つのカテゴリーに分類できる。すなわち、腫瘍関連自己抗原（たとえば、がん－精巣抗原、分化抗原）及び共有又は患者特有の変異体タンパク質に由来する抗原である。胸腺における自己抗原の提示は高アビディティＴ細胞の除去をもたらしうるので、変異体新抗原は、免疫原性がより高い可能性が高い。このような免疫療法用エピトープの開発は困難な探究であり、有効なエピトープの同定に有用な効率的な方法は、まだ開発されていない。
【0010】
免疫原性ペプチドエピトープの同定及び検証に多大な時間とコストがかかることが、有効なペプチドベースのがんワクチン接種の開発を妨げてきた。免疫原性エピトープの同定に伴う問題をさらに複雑にしているのは、がん細胞における変異の順列が多くの場合、患者特有であることである。変異体ネオエピトープの発見には、患者の腫瘍浸潤リンパ球の、その患者の腫瘍エクソーム配列からの情報に基づいて構築されたライブラリーからの抗原を認識する能力についての、労力のかかるスクリーニングが必要である。代わりに、変異体ネオエピトープは、質量分析により検出できる。しかしながら、変異体配列は検出を免れてきた。なぜなら、患者特有の変異体を含有しない公的プロテオームデータベースの使用では、それらの同定ができないからである。ペプチド－ＭＨＣＩ結合性又はペプチド免疫原性などの予測アルゴリズムの使用は、パーソナライズされた免疫原性エピトープの同定に応用される可能性がある。しかし、がん細胞内に含有される膨大な数の体細胞変異及び発現レベル変化は、高スループット免疫原性スクリーニングには大きすぎる規模の予測される免疫原性エピトープをもたらす。さらに、予測されるエピトープの貧弱な免疫原性の証拠により、現行の方法の有用性に対する疑問が喚起されている。
【0011】
当該技術分野で、ペプチドベースの免疫療法における使用に好適な免疫原性エピトープを同定する必要がある。具体的には、当該技術分野で、ペプチドベースのがん治療における使用のための免疫原性エピトープを同定する必要がある。さらに、当該技術分野で、パーソナライズされた遺伝子及び／又はプロテオーム解析に基づく免疫原性エピトープの予測のための、高スループット法が必要である。
【0012】
本明細書において引用されるすべての参考文献が、参照によりここに具体的に援用される。
【発明の概要】
【0013】
一態様における本出願は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列のセットを提供すること、及びｂ）変異体コード配列のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列によりコードされるペプチドの、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、及びｄ）エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含む。
【0014】
いくつかの実施態様において、上述の方法のうちの任意のものによれば、方法は、ｉ）疾患組織からＭＨＣＩ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｉｉ）ＭＨＣＩ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｉｉｉ）ＭＨＣＩ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、免疫原性変異体コード配列と相関させることをさらに含む。
【0015】
別の態様における本出願は、ａ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｂ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｃ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法を提供する。
【0016】
いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列によりコードされるペプチドの、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、ｄ）疾患組織からＭＨＣＩ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｅ）ＭＨＣＩ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｆ）ＭＨＣＩ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第３のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの免疫原性を予測することをさらに含み、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドは、変異アミノ酸を含む。
【0017】
免疫原性を予測する工程を含む上述の方法のうちの任意のものによれば、免疫原性を予測することが、以下のパラメーター、ｉ）ＭＨＣＩ分子に対するペプチドの結合親和性、ｉｉ）ペプチドを含有するペプチド前駆体のタンパク質レベル、ｉｉｉ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベル、ｉｖ）免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率、ｖ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現のタイミング、ｖｉ）ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性、ｖｉｉ）ペプチド内の変異アミノ酸の位置、ｖｉｉｉ）ＭＨＣＩ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露、ｉｘ）ＭＨＣＩ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露、ｘ）ペプチドにおける芳香族残基の含有量、ｘｉ）野生型残基と比較したときの変異アミノ酸の特性、及びｘｉｉ）ペプチド前駆体の性質のうちの１つ又は複数に基づく。いくつかの実施態様において、免疫原性を予測することは、ＨＬＡタイピング解析にさらに基づく。
【0018】
いくつかの実施態様において、疾患組織からＭＨＣＩ分子に結合した複数のペプチドを得る工程を含む上述の方法のうちの任意の１つによれば、ＭＨＣＩに結合したペプチドは、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体を疾患組織から単離し、ペプチドをＭＨＣＩから溶出することにより得られる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体の単離は、免疫沈降法により実施される。いくつかの実施態様において、免疫沈降法は、ＭＨＣＩに特異的な抗体を使用して実施される。いくつかの実施態様において、単離ペプチドは、質量分析に供する前にクロマトグラフィーによりさらに分離される。
【0019】
いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットを得る工程を含む上述の方法のうちの任意の１つによれば、変異体コード配列の第１のセットを得ることは、ｉ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体配列が基準試料と比較して配列に差異を有する、変異体配列の第１のセットを得ること、及びｉｉ）変異体配列の第１のセットから変異体コード配列を同定することを含む。
【0020】
いくつかの実施態様において、上述の方法のうちの任意のものによれば、本方法は、同定された疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの配列に基づいて、ペプチドを合成することをさらに含む。いくつかの実施態様において、上述の方法のうちの任意のものによれば、本方法は、同定された疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの配列に基づいて、ペプチドをコードする核酸を合成することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、合成されたペプチドを免疫原性についてインビボで試験することをさらに含む。
【0021】
いくつかの実施態様において、上述の方法のうちの任意のものによれば、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、上述の方法のうちの任意のものによれば、個体はヒトである。
【0022】
別の態様における本出願はまた、本明細書に記載の方法のうちの任意のものにより同定される疾患特異的変異体ペプチド又は疾患特異的変異体ペプチドの組成物を提供する。いくつかの実施態様において、組成物は、２つ以上の本明細書に記載の疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを含む。いくつかの実施態様において、組成物は、アジュバントをさらに含む。
【0023】
さらに別の態様における本出願はまた、個体に、本明細書に開示の疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定するための方法のうちの任意のものを用いて同定された疾患特異的変異体ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含む、個体における疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、個体は、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドが同定されたのと同じ個体である。
【0024】
本出願はまた、少なくとも１つの疾患特異的ペプチド又はこのような疾患特異的ペプチドの前駆体を含む免疫原性組成物を提供し、前記疾患特異的ペプチドは、本明細書に記載の方法のうちの任意のものにより同定される。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、複数の疾患特異的ペプチドを含む。
【0025】
本出願はまた、疾患特異的ペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む免疫原性組成物を提供し、前記疾患特異的ペプチドは、本明細書に記載の方法のうちの任意のものにより同定される。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、それぞれが少なくとも１つの疾患特異的ペプチドをコードする複数の核酸を含む。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上のうちの任意の数）の疾患特異的ペプチドをコードする核酸を含む。
【0026】
さらに別の態様における本出願はまた、本明細書に記載の任意の免疫原性組成物を投与することを含む、疾患を有する個体における免疫応答を刺激する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、別の薬剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、他の薬剤は、免疫調節剤である。いくつかの実施態様において、他の薬剤は、チェックポイントタンパク質である。いくつかの実施態様において、他の薬剤は、ＰＤ－１のアンタゴニスト（たとえば、抗ＰＤ１抗体）である。いくつかの実施態様において、他の薬剤は、ＰＤ－Ｌ１のアンタゴニスト（たとえば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）である。
【0027】
さらに別の態様における本出願はまた、ａ）上述の同定方法のうちの任意の１つにより、個体における疾患組織から疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定すること、ｂ）同定された疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの配列に基づいて、ペプチド又はペプチドをコードする核酸を含む組成物を製造すること、ｃ）組成物を個体に投与することを含む、疾患を有する個体における免疫応答を刺激する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、ＰＤ－１アンタゴニスト（たとえば、抗ＰＤ１抗体）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト（たとえば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）を個体に投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】免疫原性ペプチド同定の例示的方法を示す図である。
【図2】Ａは、ＭＣ－３８細胞株のＭＨＣ分子上に提示されたエピトープとして同定された同定遺伝子の分布を、測定されたｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｍｏｄｅｌ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ（ＲＰＫＭ）に対して示す図である。Ｂは、ＴＲＡＭＰ－Ｃ１細胞株のＭＨＣ分子上に提示されたエピトープとして同定された同定遺伝子の分布を、測定されたＲＰＫＭに対して示す図である。
【図3】ＭＨＣ分子に結合したペプチドの構造モデル化を示す図である。
【図4A-B】Ａは、選択ペプチドで免疫化された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。Ｂは、脾臓及び腫瘍におけるデキストラマー陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図4C-D】Ｃは、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＣＤ４５Ｔ細胞の測定値を腫瘍体積に対して示す図である。Ｄは、全ＣＤ８ ＴＩＬ集団及びＡｄｐｇｋ陽性ＣＤ８ ＴＩＬ集団における、腫瘍特異的ＣＤ８ ＴＩＬ共発現ＰＤ－１及びＴＩＭ－３のパーセンテージを示す図である。
【図5A-B】Ａは、ＭＣ－３８腫瘍細胞での腫瘍チャレンジ後に、コントロール及び免疫原性ワクチンで処置されたマウスの腫瘍体積、並びにワクチン接種後のＡｄｐｇｋ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。矢印は、単一の動物からの測定値を示す。Ｂは、脾臓及び腫瘍におけるペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図5C-D】Ｃは、ＣＤ４５発現Ｔ細胞及びＣＤ８発現Ｔ細胞として測定された、腫瘍における生細胞のパーセンテージを示す図である。Ｄは、ワクチン接種後の全ＣＤ８ Ｔ細胞集団におけるＡｄｇｐｋ特異的ＣＤ８ ＴＩＬ共発現ＰＤ－１及びＴＩＭ－３のパーセンテージを示す図である。
【図5E】ワクチン接種後のＰＤ－１及びＴＩＭ－３表面発現のレベルを示す図である。
【図5F】ワクチン接種後の腫瘍及び脾臓におけるＩＦＮ－γ発現ＣＤ８及びＣＤ４ ＴＩＬのパーセンテージを示す図である。
【図5G】ワクチン接種後の腫瘍体積の測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本出願は、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定するための高効率スクリーニングプラットフォームを提供する。配列ベースの変異体同定法を、免疫原性予測及び／又は質量分析と組み合わせることにより、本明細書に記載の方法は、個体の疾患組織（たとえば腫瘍細胞）からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの強力で効率的な同定を可能にする。これらのペプチド又はヌクレオチドベースの前駆体（たとえば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、様々な異なる用途、たとえばワクチンの開発、変異体ペプチド特異的治療剤（たとえば抗体治療剤又はＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）ベースの治療剤）の開発、並びにＴ細胞応答の動態及び分布のモニタリングのためのツールの開発に有用でありうる。たとえば、個々のペプチド又はペプチドの集合を、比較結合親和性測定を行うために利用でき、又は、ＭＨＣマルチマーフローサイトメトリーにより抗原特異的Ｔ細胞応答を測定するために多量体化できる。本明細書に記載の方法は、オーダーメイド医療の文脈において特に有用であり、疾患個体から同定された変異体ペプチドを、その個体を治療するための治療剤（たとえば、ペプチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡベースのワクチン）を開発するために使用できる。
【0030】
したがって、一態様における本出願は、配列ベースの変異体同定法を免疫原性予測と組み合わせることによる、個体の疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法を提供する。
【0031】
別の態様において、本出願は、配列ベースの変異体同定法を質量分析と組み合わせることによる、個体の疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法を提供する。
【0032】
また提供されるのは、本明細書に記載の方法のために有用なキット及びシステムである。さらに含まれるのは、ペプチド、このようなペプチドを提示する細胞、及び同定されたこのようなペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物である。
【0033】
定義
本開示において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」はまた、特に、内容上明示されない限り、それらが指示する用語の複数形を包含する。本明細書における「約」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に向けられた変動を含む（及び記載する）。たとえば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本開示において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」はまた、特に、内容上明示されない限り、それらが指示する用語の複数形を包含する。本明細書における「約」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に向けられた変動を含む（及び記載する）。たとえば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【0034】
本明細書に記載の発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様から「なる」及び／又は「本質的になる」ことを含むことが理解される。
【0035】
本明細書において使用する「疾患特異的変異体ペプチド」は、疾患組織に存在するが、正常組織には存在しない、少なくとも１つの変異アミノ酸を含むペプチドを指す。「疾患特異的免疫原性変異体ペプチド」は、個体において免疫応答を引き起こすことが可能な疾患特異的変異体ペプチドを指す。疾患特異的変異体ペプチドは、たとえば、タンパク質における異なるアミノ酸をもたらす非同義変異（たとえば、点突然変異）；終止コドンが修飾又は除去されて、新規腫瘍特異的配列をＣ末端に有するより長いタンパク質の翻訳をもたらす、リードスルー変異；成熟ｍＲＮＡ内のイントロンの包含をもたらし、それゆえユニーク腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；２つのタンパク質の接合点において腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質をもたらす、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；及び、新規腫瘍特異的タンパク質配列を有する新しいオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異又は欠失から生じうる。たとえば、Ｓｅｎｓｉ及びＡｎｉｃｈｉｎｉ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，ｖ．１２，５０２３－５０３２を参照のこと。
【0036】
本明細書において使用する「変異体コード配列」は、基準試料における配列と比較して差異を有する配列を指し、配列差異は、変異体コード配列に含有されるか、又はそれによりコードされるアミノ酸配列の変化をもたらす。変異体コード配列は、コードされたアミノ酸配列のアミノ酸変化をもたらす変異を有する核酸配列でありうる。代わりに、変異体コード配列は、アミノ酸変異を含有するアミノ酸配列でありうる。
【0037】
「発現変異体コード配列」は、個体の疾患組織に発現する変異体コード配列を指す。
【0038】
ペプチドを「コードする」核酸配列は、ペプチドのコード配列を含有する核酸を指す。ペプチドを「コードする」アミノ酸配列は、ペプチドの配列を含有するアミノ酸配列を指す。
【0039】
「エピトープ変異体コード配列」は、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合するか、又は結合すると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列を指す。
【0040】
「免疫原性変異体コード配列」は、免疫原性であると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列を指す。
【0041】
本明細書において使用する「疾患組織」という用語は、個体における疾患と関連する組織を指し、複数の細胞を含む。「疾患組織試料」は、疾患組織の試料を指す。
【0042】
本明細書において使用する「ペプチド前駆体」は、目的のペプチドを含む個体の疾患組織に存在するポリペプチドを指す。たとえば、ペプチド前駆体は、免疫プロテアソームによりプロセシングされて目的のペプチドをもたらしうる、疾患組織に存在するポリペプチドであってもよい。
【0043】
免疫原性変異体ペプチドを同定する方法
態様における本出願の方法は、配列特異的変異体同定法を、免疫原性予測法と組み合わせる。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、及びｂ）変異体コード配列の第１のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、疾患組織においてネオエピトープとして寄与する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、変異体コード配列のセットは、１、１０、１００、１，０００、又は１０，０００よりも多くの異なる変異体コード配列を含む。いくつかの実施態様において、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、及びｂ）変異体コード配列の第１のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、選択する工程は、以下の１つ又は複数（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のうちの任意の数）のパラメーター、ｉ）ＭＨＣＩ分子に対するペプチドの結合親和性、ｉｉ）ペプチドを含有するペプチド前駆体のタンパク質レベル、ｉｉｉ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベル、ｉｖ）免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率、ｖ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現のタイミング、ｖｉ）ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性、ｖｉｉ）ペプチド内の変異アミノ酸の位置、ｖｉｉｉ）ＭＨＣＩ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露、ｉｘ）ＭＨＣＩ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露、ｘ）ペプチドにおける芳香族残基の含有量、ｘｉ）野生型残基と比較したときの変異アミノ酸の特性（たとえば、荷電から疎水性への変化、又はその逆）、及びｘｉｉ）ペプチド前駆体の性質に基づいて、ペプチドの免疫原性を予測することを含む。
態様における本出願の方法は、配列特異的変異体同定法を、免疫原性予測法と組み合わせる。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、及びｂ）変異体コード配列の第１のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、疾患組織においてネオエピトープとして寄与する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、変異体コード配列のセットは、１、１０、１００、１，０００、又は１０，０００よりも多くの異なる変異体コード配列を含む。いくつかの実施態様において、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、及びｂ）変異体コード配列の第１のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、選択する工程は、以下の１つ又は複数（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のうちの任意の数）のパラメーター、ｉ）ＭＨＣＩ分子に対するペプチドの結合親和性、ｉｉ）ペプチドを含有するペプチド前駆体のタンパク質レベル、ｉｉｉ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベル、ｉｖ）免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率、ｖ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現のタイミング、ｖｉ）ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性、ｖｉｉ）ペプチド内の変異アミノ酸の位置、ｖｉｉｉ）ＭＨＣＩ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露、ｉｘ）ＭＨＣＩ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露、ｘ）ペプチドにおける芳香族残基の含有量、ｘｉ）野生型残基と比較したときの変異アミノ酸の特性（たとえば、荷電から疎水性への変化、又はその逆）、及びｘｉｉ）ペプチド前駆体の性質に基づいて、ペプチドの免疫原性を予測することを含む。
【0044】
いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットは、まずフィルタリングされ、ＭＨＣ分子と結合すると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列（「エピトープ変異体コード配列」と呼ばれる）のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが、免疫原性の予測に基づく選択に供される。このような実施態様において、本方法は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及びｃ）エピトープ変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含んでいてもよく、選択する工程は、エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及びｃ）エピトープ変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0045】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、及びｂ）変異体コード配列の第１のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、全ゲノムシークエンシングにより得られる。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、全エクソームシークエンシングにより得られる。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、標的化ゲノム又はエクソームシークエンシングにより得られる。たとえば、疾患組織及び／又は基準試料におけるゲノム配列は、プローブのセット（たとえば、疾患関連遺伝子に特異的なプローブ）によりまず富化でき、その後、変異体同定のためにプロセシングされる。いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットは、まずフィルタリングされ、エピトープ変異体コード配列のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが、免疫原性の予測に基づく選択に供される。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及びｃ）エピトープ変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0046】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、及びｂ）変異体コード配列の第１のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、トランスクリプトーム配列は、全トランスクリプトームＲＮＡ－Ｓｅｑシークエンシングにより得られる。いくつかの実施態様において、転写配列は、標的化トランスクリプトームシークエンシングにより得られる。たとえば、疾患組織及び／又は基準試料におけるＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列は、プローブのセット（たとえば、疾患関連遺伝子に特異的なプローブ）によりまず富化でき、その後、変異体同定のためにプロセシングされる。いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットは、まずフィルタリングされ、エピトープ変異体コード配列のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが、免疫原性の予測に供される。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）エピトープ変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及びｃ）変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。
【0047】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及びｃ）発現変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、発現変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、及びｃ）発現変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、発現変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。
【0048】
いくつかの実施態様において、発現変異体コード配列の第２のセットは、フィルタリングされ、エピトープ変異体コード配列のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが、免疫原性の予測に供される。したがって、たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列の第２のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、及びｄ）エピトープ変異体コード配列の第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列の第２のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、及びｄ）エピトープ変異体コード配列の第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、エピトープ変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0049】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法により同定される疾患特異的免疫原性変異体ペプチドは、変異体コード配列情報を、ＭＨＣ分子と物理的に結合したペプチドの情報と相関させることにより、さらに検証される。本方法は、たとえば、疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、免疫原性変異体コード配列であると予測されるペプチドと相関させることをさらに含みうる。質量分析及び相関法を、下の項にさらに記載する。
【0050】
別の態様において、配列特異的変異体同定法を質量分析と組み合わせる方法が提供される。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｂ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｃ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣに結合した複数のペプチドは、ＭＨＣ／ペプチド複合体を（たとえば免疫沈降法により）疾患組織から単離し、ＭＨＣからペプチドを溶出することにより得られる。いくつかの実施態様において、ペプチドは、タンデム質量分析に供される。いくつかの実施態様において、質量分析ベースのシークエンシングは、ペプチドを質量分析に供すること、及び、質量分析スペクトルを基準スペクトル（たとえば、基準試料における配列によりコードされる推定タンパク質の仮定の質量分析スペクトル）と比較することを含む。いくつかの実施態様において、質量分析配列情報は、相関工程前に、ペプチド長及び／又はアンカーモチーフの存在によりフィルタリングされる。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0051】
いくつかの実施態様において、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｃ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｄ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、変異体コード配列の第１のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットは、フィルタリングされ、ＭＨＣ分子と結合すると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列（本明細書において以下では「エピトープ変異体コード配列」と呼ばれる）のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが相関分析に供される。このような実施態様において、本方法は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第２のセットと相関させ、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第２のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0052】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｃ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｄ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、変異体コード配列の第１のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、全ゲノムシークエンシングにより得られる。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、全エクソームシークエンシングにより得られる。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、標的化ゲノム又はエクソームシークエンシングにより得られる。たとえば、疾患組織及び／又は基準試料におけるゲノム配列は、プローブのセット（たとえば、疾患関連遺伝子に特異的なプローブ）によりまず富化でき、その後、変異体同定のためにプロセシングされる。
【0053】
いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットは、フィルタリングされ、ＭＨＣ分子と結合すると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列（本明細書において以下では「エピトープ変異体コード配列」と呼ばれる）のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが免疫原性の予測に供される。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第２のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。
【0054】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｃ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｄ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、変異体コード配列の第１のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、トランスクリプトーム配列は、全トランスクリプトームＲＮＡ－Ｓｅｑシークエンシングにより得られる。いくつかの実施態様において、トランスクリプトーム配列は、標的化トランスクリプトームシークエンシングにより得られる。たとえば、疾患組織及び／又は基準試料におけるＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列は、プローブのセット（たとえば、疾患関連遺伝子に特異的なプローブ）によりまず富化でき、その後、変異体同定のためにプロセシングされる。いくつかの実施態様において、変異体コード配列の第１のセットは、フィルタリングされ、エピトープ変異体コード配列のより小さなセットを得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが、免疫原性の予測に供される。たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第２のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。
【0055】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、発現変異体コード配列の第２のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、発現変異体コード配列の第２のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。
【0056】
いくつかの実施態様において、発現変異体コード配列の第２のセットは、フィルタリングされ、エピトープ変異体コード配列のより小さなセットが得ることができ、次に、変異体コード配列のより小さなセットが、免疫原性の予測に供される。したがって、たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列の第２のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、ｄ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｅ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｆ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第３のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列の第２のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、ｄ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｅ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｆ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第３のセットと相関させることを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0057】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の質量分析ベースの方法により同定される疾患特異的免疫原性変異体ペプチドは、ペプチドの免疫原性を予測することによりさらに選択される。いくつかの実施態様において、選択する工程は、以下の１つ又は複数（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のうちの任意の数）のパラメーター、ｉ）ＭＨＣＩ分子に対するペプチドの結合親和性、ｉｉ）ペプチドを含有するペプチド前駆体のタンパク質レベル、ｉｉｉ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベル、ｉｖ）免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率、ｖ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現のタイミング、ｖｉ）ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性、ｖｉｉ）ペプチド内の変異アミノ酸の位置、ｖｉｉｉ）ＭＨＣＩ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露、ｉｘ）ＭＨＣＩ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露、ｘ）ペプチドにおける芳香族残基の含有量、及びｘｉ）ペプチド前駆体の性質に基づいて、ペプチドの免疫原性を予測することを含む。
【0058】
したがって、たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｂ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｃ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列に変異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列のセットと相関させ、変異体コード配列の第２のセットを得ること、及びｄ）変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列の第２のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列のセットを得ること、ｂ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｃ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、変異体コード配列の第１のセットと相関させ、変異体コード配列の第２のセットを得ること、及びｅ）変異体コード配列の第２のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列の第２のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、ｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第２のセットと相関させ、変異体コード配列の第３のセットを得ること、及びｆ）変異体コード配列の第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、変異体コード配列の第３のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）変異体コード配列の第１のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第１のセットからエピトープ変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列のセットと相関させ、変異体コード配列の第３のセットを得ること、及びｆ）変異体コード配列の第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、変異体コード配列の第３のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0059】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、発現変異体コード配列の第２のセットと相関させ、変異体コード配列の第３のセットを得ること、及びｆ）変異体コード配列の第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列の第３のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｄ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｅ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、発現変異体コード配列の第２のセットと相関させ、変異体コード配列の第３のセットを得ること、及びｆ）変異体コード配列の第３のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、変異体コード配列の第３のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0060】
いくつかの実施態様において、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを提供すること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列の第２のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、ｄ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｅ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｆ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第３のセットと相関させ、変異体コード配列の第４のセットを得ること、及びｇ）変異体コード配列の第４のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程が、変異体コード配列の第４のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する、個体における疾患組織からの疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する方法が提供される。いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて、各変異体コード配列が基準試料と比較して配列の差異を有する、個体における疾患組織の変異体コード配列の第１のセットを得ること、ｂ）個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて、第１のセットから発現変異体コード配列の第２のセットを選択すること、ｃ）発現変異体コード配列の第２のセットによりコードされるペプチドの、ＭＨＣ分子（たとえば、ＭＨＣクラスＩ分子、又はＭＨＣＩ）と結合する能力予測に基づいて、第２のセットからエピトープ変異体コード配列の第３のセットを選択すること、ｄ）個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合した複数のペプチドを得ること、ｅ）ＭＨＣ結合ペプチドを質量分析ベースのシークエンシングに供すること、及びｆ）ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、エピトープ変異体コード配列の第３のセットと相関させ、変異体コード配列の第４のセットを得ること、及びｇ）変異体コード配列の第４のセットから免疫原性変異体コード配列を選択することを含み、選択する工程は、変異体コード配列の第４のセットによりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含み、そのことにより、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定する。いくつかの実施態様において、本方法は、機能解析により疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを検証することをさらに含む。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。いくつかの実施態様において、個体は、ヒト個体（たとえば、がんを有するヒト個体）である。
【0061】
本明細書においてまた提供されるのは、本明細書に記載の方法のうちの任意１つにより得られる疾患特異的免疫原性変異体ペプチドである。疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを、たとえば、疾患を治療するための組成物（たとえば、ワクチン組成物）を製造するために使用できる。代わりに、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを、変異体ペプチド特異的治療剤、たとえば治療抗体を製造するために使用できる。
【0062】
本明細書に記載の方法は、オーダーメイド医療の文脈において特に有用であり、本明細書に記載の方法のうちの任意の１つにより得られる疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドが、同じ個体のための治療剤（たとえばワクチン又は治療抗体）を開発するために使用される。したがって、たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体において疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを同定すること、及びｂ）ペプチドを合成すること、及びｃ）ペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）個体から疾患組織試料を得ること、ｂ）個体において疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを同定すること、及びｃ）ペプチドを合成すること、及びｄ）ペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）個体において疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを同定すること、ｂ）変異体ペプチドを特異的に認識する抗体（又はＴＣＲアナログ、たとえば可溶性ＴＣＲ）を製造すること、及びｃ）ペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）個体から疾患組織試料を得ること、ｂ）個体において疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを同定すること、ｃ）変異体ペプチドを特異的に認識する抗体（又はＴＣＲアナログ、たとえば可溶性ＴＣＲ）を製造すること、及びｄ）ペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、同定工程は、配列特異的変異体同定法を免疫原性予測法と組み合わせる。いくつかの実施態様において、同定工程は、配列特異的変異体同定法を質量分析と組み合わせる。本明細書に記載の疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドの任意の同定する方法を、本明細書に記載の治療方法のために使用できる。
【0063】
変異体コード配列を得る
様々な実施態様における本明細書に記載の方法は、変異体コード配列を提供すること及び／又は得ることを含む。変異体コード配列は、一般に、たとえば、個体の疾患組織試料におけるゲノム又はＲＮＡ配列をシークエンシングし、配列を基準試料から得られるものと比較することにより得ることができる。
様々な実施態様における本明細書に記載の方法は、変異体コード配列を提供すること及び／又は得ることを含む。変異体コード配列は、一般に、たとえば、個体の疾患組織試料におけるゲノム又はＲＮＡ配列をシークエンシングし、配列を基準試料から得られるものと比較することにより得ることができる。
【0064】
いくつかの実施態様において、疾患組織は血液である。いくつかの実施態様において、疾患組織は固形組織（たとえば固形腫瘍）である。いくつかの実施態様において、疾患組織は細胞（たとえば、血中の循環がん細胞）の集合である。いくつかの実施態様において、疾患組織はリンパ球の集合である。いくつかの実施態様において、疾患組織は白血球の集合である。いくつかの実施態様において、疾患組織は上皮細胞の集合である。いくつかの実施態様において、疾患組織は結合組織である。いくつかの実施態様において、疾患組織は生殖細胞及び／又は多能性細胞の集合である。いくつかの実施態様において、疾患組織は芽細胞の集合である。
【0065】
好適な疾患組織試料には、腫瘍組織、腫瘍と隣接する正常組織、腫瘍とは遠位の正常組織、又は末梢血リンパ球が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、疾患組織試料は腫瘍組織である。いくつかの実施態様において、疾患組織試料は、がん細胞、たとえばがん細胞（たとえば、膵臓がん細胞）の微細針吸引又はで腹腔鏡検査により得られたがん細胞（たとえば、膵臓がん細胞）を含有する生検である。いくつかの実施態様において、生検細胞は、ペレットへと遠心され、固定され、解析前にパラフィン中に埋め込まれる。いくつかの実施態様において、生検細胞は、解析前に急速冷凍される。
【0066】
いくつかの実施態様において、疾患組織試料は、循環転移がん細胞を含む。いくつかの実施態様において、疾患組織試料は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を血液から分別することにより得ることができる。さらなる実施態様において、ＣＴＣは、原発腫瘍から分離され、体液中を循環する。さらなる実施態様において、ＣＴＣは、原発腫瘍から分離され、血流中を循環する。さらなる実施態様において、ＣＴＣは転移の指標である。いくつかの実施態様において、ＣＴＣは膵臓がん細胞である。いくつかの実施態様において、ＣＴＣは結腸直腸がん細胞である。いくつかの実施態様において、ＣＴＣは非小細胞肺癌細胞である。
【0067】
差異は、個体における疾患組織のゲノム配列に基づいて同定できる。たとえば、ゲノムＤＮＡは、個体における疾患組織から得られ、配列解析に供されうる。次に、このようにして得られた配列を、基準試料から得られたものと比較できる。いくつかの実施態様において、疾患試料は、全ゲノムシークエンシングに供される。いくつかの実施態様において、疾患試料は、全エクソームシークエンシングに供され、すなわち、ゲノム配列中のエクソンのみがシークエンシングされる。いくつかの実施態様において、ゲノム配列は、基準試料との比較前に特異的配列について「富化」される。たとえば、特異的プローブを、配列解析に供する前に、特定の所望の配列（たとえば、疾患特異的配列）を富化するために設計できる。全ゲノムシークエンシング、全エクソームシークエンシング、及び標的化シークエンシングの方法は、当該技術分野で知られており、たとえば、Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．等，Ａｃｃｕｒａｔｅ ｗｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，ｖ．４５６，５３－５９；Ｃｈｏｉ，Ｍ．等，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００９，ｖ．１０６（４５），１９０９６－１９１０１；及びＮｇ，Ｓ．Ｂ．等，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ １２ ｈｕｍａｎ ｅｘｏｍｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２００９，ｖ．４６１，２７２－２７６において報告されており、これらは参照によりここに援用される。
【0068】
いくつかの実施態様において、差異は、個体における疾患組織のトランスクリプトーム配列に基づいて同定される。たとえば、全又は部分トランスクリプトーム配列（たとえばＲＮＡ－Ｓｅｑ等の方法による）は、個体における疾患組織から得られ、配列解析に供されうる。次に、このようにして得られた配列を、基準試料から得られたものと比較できる。いくつかの実施態様において、疾患試料は、全トランスクリプトームＲＮＡ－Ｓｅｑシークエンシングに供される。いくつかの実施態様において、トランスクリプトーム配列は、基準試料との比較前に特異的配列について「富化」される。たとえば、特異的プローブを、配列解析に供する前に、特定の所望の配列（たとえば、疾患特異的配列）を富化するために設計できる。全トランスクリプトームシークエンシング及び標的化シークエンシングの方法は、当該技術分野で知られており、たとえば、Ｔａｎｇ，Ｆ．等，ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ ｗｈｏｌｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，ｖ．６，３７７－３８２；Ｏｚｓｏｌａｋ，Ｆ．，ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ａｄｖａｎｃｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１１，ｖ．１２，８７－９８；Ｇｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ等，Ｇｌｏｂａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ ｐａｉｒｓ ｂｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｅｎｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，ｖ．２６，９４１－９４６；及びＷａｎｇ，Ｚ．等，ＲＮＡ－Ｓｅｑ：ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００９，ｖ．１０，ｐ．５７－６３において報告されている。いくつかの実施態様において、トランスクリプトームシークエンシング手法は、ＲＮＡポリ（Ａ）ライブラリー、マイクロアレイ解析、並列シークエンシング、超並列シークエンシング、ＰＣＲ、及びＲＮＡ－Ｓｅｑを含むが、これらに限定されない。ＲＮＡ－Ｓｅｑは、トランスクリプトームの一部、又は実質的に全部をシークエンシングするための高スループット手法である。簡潔に述べれば、単離されたトランスクリプトーム配列集団が、一方又は両方の末端にアダプターが結合されたｃＤＮＡ断片のライブラリーに変換される。増幅の有無にかかわらず、次に、各ｃＤＮＡ分子を解析し、典型的には３０～４００塩基対の、短いストレッチの配列情報を得る。次に、配列情報のこれらの断片は、基準ゲノム、基準転写物とアラインされるか、又は新規に組み合わされて、転写物の構造（すなわち転写境界）及び／又は発現のレベルを明らかにする。
【0069】
疾患組織における配列が得られると、それを、基準試料における対応する配列と比較できる。疾患組織における核酸配列を、基準試料における対応する配列とアラインすることにより、配列比較を核酸レベルで実行できる。次に、コードされるアミノ酸に１つ又は複数の変化をもたらす配列差異が同定される。代わりに、アミノ酸レベルで配列比較を実行でき、すなわち、核酸配列をまずインシリコでアミノ酸配列に変換し、そのあとに比較を実施する。
【0070】
いくつかの実施態様において、疾患組織からの配列と基準からのものとの比較は、当該技術分野で公知の手法、たとえばマニュアルアラインメント、ＦＡＳＴ－Ａｌｌ（ＦＡＳＴＡ）、及びＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）により完了できる。ＢＬＡＳＴにより完了される配列比較は、疾患配列の入力及び基準配列の入力を必要とする。ＢＬＡＳＴは、まず、２配列間の短配列一致を同定すること、すなわちシーディングと呼ばれるプロセスにより、疾患配列を基準データベースと比較する。配列一致が見つかると、スコアリングマトリックスを使用して、配列アラインメントの拡張が実施される。
【0071】
いくつかの実施態様において、基準試料は、マッチされた疾患のない組織試料である。本明細書において使用する「マッチされた」疾患のない組織試料は、疾患組織と同じ又は類似した組織タイプから選択されるものである。いくつかの実施態様において、マッチされた疾患のない組織及び疾患組織は、同じ個体に由来してもよい。いくつかの実施態様における本明細書に記載の基準試料は、同じ個体からの疾患のない試料である。いくつかの実施態様において、基準試料は、異なる個体（たとえば、疾患を有しない個体）からの疾患のない試料である。いくつかの実施態様において、基準試料は、異なる個体の集団から得られる。いくつかの実施態様において、基準試料は、ある生物体と関連づけられる公知の遺伝子のデータベースである。いくつかの実施態様において、基準試料は、ある生物体と関連づけられる公知の遺伝子と、マッチされた疾患のない組織試料からのゲノム情報との組合せであってもよい。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、アミノ酸配列における点突然変異をコードするか、又は含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、アミノ酸欠失又は挿入をコードするか、又は含んでいてもよい。
【0072】
いくつかの実施態様において、変異体コード配列のセットは、ゲノム配列に基づいてまず同定される。次に、この初期セットがさらにフィルタリングされ、トランスクリプトームシークエンシングデータベースにおける変異体コード配列の存在（したがって、「発現」とみなされる）に基づいて、発現変異体コード配列のより狭いセットを得ることができる。いくつかの実施態様において、変異体コード配列のセットは、トランスクリプトームシークエンシングデータベースを通じたフィルタリングにより、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０倍、又はそれ以上の倍数で低減される。
【0073】
いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異（たとえば、点突然変異）から得られる配列である。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、終止コドンが修飾又は除去されて、新規腫瘍特異的配列をＣ末端に有するより長いタンパク質の翻訳をもたらす、リードスルー変異から得られる配列である。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、成熟ｍＲＮＡ内のイントロンの包含をもたらし、それゆえユニーク腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異から得られる配列である。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、２つのタンパク質の接合点において腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質をもたらす、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）から得られる配列である。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、新規腫瘍特異的タンパク質配列を有する新しいオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異又は欠失から得られる配列である。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、１を超える変異から得られる配列である。いくつかの実施態様において、変異体コード配列は、１を超える変異機構から得られる配列である。
【0074】
エピトープ変異体コード配列を得る
いくつかの実施態様における本明細書に記載の変異体コード配列は、フィルタリングされ、ＭＨＣ分子と結合すると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列（「エピトープ変異体コード配列」）のより小さなセットが得られる。いくつかの実施態様において、変異体コード配列のセットは、ＭＨＣ結合性予測プロセスを通じたフィルタリングにより、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００倍、又はそれ以上の倍数で低減される。
いくつかの実施態様における本明細書に記載の変異体コード配列は、フィルタリングされ、ＭＨＣ分子と結合すると予測されるペプチドをコードする変異体コード配列（「エピトープ変異体コード配列」）のより小さなセットが得られる。いくつかの実施態様において、変異体コード配列のセットは、ＭＨＣ結合性予測プロセスを通じたフィルタリングにより、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００倍、又はそれ以上の倍数で低減される。
【0075】
変異体コード配列によりコードされるペプチドのＭＨＣ（たとえばＭＨＣＩ）結合能は、予測アルゴリズム、たとえばＮＥＴＭＨＣにより評価できる。簡潔に述べれば、ＮＥＴＭＨＣは、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＩＥＤＢ）からの親和性データ及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩからの溶出データの両方を使用した定量的ペプチドデータ上で訓練されたアルゴリズムである。８から１４アミノ酸の間の長さのペプチドについて、ＭＨＣＩ結合性を予測できる。ＮＥＴＭＨＣは、５５のＭＨＣ対立遺伝子（４３ヒト及び１２非ヒト）からの９アミノ酸長のアミノ酸配列上で訓練されたプレディクター（predictors）を使用する。より短い入力配列の予測を可能にするため、ＮＥＴＭＨＣは、８アミノ酸長のアミノ酸配列を仮想的に拡張する。９アミノ酸長よりも長い入力配列については、ＮＥＴＭＨＣは、入力配列内に含有されるあらゆる９アミノ酸長のアミノ酸配列を生成する。次にＮＥＴＭＨＣは、訓練された人工ニューラルネットワーク及び位置特異的スコアリングマトリックスを使用して、ＭＨＣ結合性を予測する。
【0076】
免疫原性変異体コード配列を選択する
いくつかの実施態様における本明細書において提供される方法は、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含む、免疫原性変異体コード配列を選択することをさらに含む。免疫原性の予測は、たとえば、ペプチド及び対応するペプチド前駆体の１つ又は複数のパラメーターを検討し、ペプチドが免疫原性である可能性を予測するプロセス（たとえば、インシリコプロセス）により実施できる。これらのパラメーターには、ｉ）ＭＨＣＩ分子に対するペプチドの結合親和性、ｉｉ）ペプチドを含有するペプチド前駆体のタンパク質レベル、ｉｉｉ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベル、ｉｖ）免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率、ｖ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現のタイミング、ｖｉ）ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性、ｖｉｉ）ペプチド内の変異アミノ酸の位置、ｖｉｉｉ）ＭＨＣＩ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露、ｉｘ）ＭＨＣＩ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露、ｘ）ペプチドにおける芳香族残基の含有量、及びｘｉ）ペプチド前駆体の性質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、免疫原性は、本明細書に記載の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のパラメーターに基づく。
いくつかの実施態様における本明細書において提供される方法は、変異体コード配列によりコードされる変異アミノ酸を含むペプチドの免疫原性を予測することを含む、免疫原性変異体コード配列を選択することをさらに含む。免疫原性の予測は、たとえば、ペプチド及び対応するペプチド前駆体の１つ又は複数のパラメーターを検討し、ペプチドが免疫原性である可能性を予測するプロセス（たとえば、インシリコプロセス）により実施できる。これらのパラメーターには、ｉ）ＭＨＣＩ分子に対するペプチドの結合親和性、ｉｉ）ペプチドを含有するペプチド前駆体のタンパク質レベル、ｉｉｉ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベル、ｉｖ）免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率、ｖ）ペプチド前駆体をコードする転写物の発現のタイミング、ｖｉ）ＴＣＲ分子に対するペプチドの結合親和性、ｖｉｉ）ペプチド内の変異アミノ酸の位置、ｖｉｉｉ）ＭＨＣＩ分子に結合したときのペプチドの溶媒曝露、ｉｘ）ＭＨＣＩ分子に結合したときの変異アミノ酸の溶媒曝露、ｘ）ペプチドにおける芳香族残基の含有量、及びｘｉ）ペプチド前駆体の性質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、免疫原性は、本明細書に記載の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のパラメーターに基づく。
【0077】
いくつかの実施態様において、ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合親和性が、免疫原性を予測するために使用される。ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合親和性は、ｐＭＨＣの安定性を予測するものでありえ、これはひいては、ｐＭＨＣの持続的な提示を可能にしうるのであり、したがって、免疫細胞との潜在的相互作用のための細胞表面曝露を増加させる。結合親和性は、当該技術分野で公知の手法、たとえばＲａｎｋＰｅｐ、ＭＨＣＢｅｎｃｈ、ｎＨＬＡＰｒｅｄ、ＳＶＭＨＣ、ＮＥＴＭＨＣｐａｎ、及びＰＯＰＩを使用して予測でき、これらは、人工ニューラルネットワーク、平均相対結合性マトリックス、定量的マトリックス、及び安定化マトリックス法等の方法に基づく。いくつかの実施態様において、ＭＨＣに対するペプチドの結合親和性は、公知のアンカー位置に位置する特定のアミノ酸残基（ＭＨＣ結合に関与するアミノ酸）の存在に基づく。いくつかの実施態様において、ペプチドの各残基が、結合へのその貢献度について評価される。いくつかの実施態様において、解析システムが、ＭＨＣと結合すると知られているペプチドで訓練される。いくつかの実施態様において、ペプチド－ＭＨＣ分子の結合エネルギーが算出される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣに結合するペプチドの予測親和性を評価するために、結合閾値、たとえばＩＣ５０値＜５００ｎＭが使用される。
【0078】
いくつかの実施態様において、疾患組織におけるペプチド前駆体の発現レベルが、免疫原性を予測するために使用される。いくつかの実施態様において、タンパク質レベルが生化学的に（たとえばウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ）測定される。いくつかの実施態様において、タンパク質レベルは、公知の定量的質量分析法により測定できる。Ｌａ Ｇｒｕｔａ等により実証されたとおり、疾患組織におけるペプチド前駆体の高発現レベルは、予測される免疫原性と相関させられうる。記述されたとおり、エピトーププロセシング経路内に供給される、より大量のペプチド前駆体の利用可能性は、エピトープ提示及び免疫原性応答の増加と正の相関があった（La Gruta, N. L.等, A virus-specific CD8+ T cell immunodominance hierarchy determined by antigen dose and precursor frequencies, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, v.103, 994-999、参照によりここに援用する）。
【0079】
いくつかの実施態様において、疾患組織におけるペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベルを、免疫原性を予測するために使用できる。いくつかの実施態様において、ＲＮＡ発現レベルはＲＴ－ＰＣＲにより測定される。いくつかの実施態様において、ＲＮＡ発現レベルは配列解析により測定される。上で議論したとおり、エピトーププロセシング経路のため、ペプチド前駆体の利用可能性を増加させることは、前記ペプチド前駆体から得られる前記エピトープと関連づけられる免疫原性応答と、正の相関がある。さらに、ｍＲＮＡレベルとタンパク質量との間の正の相関が観察されている（Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ，Ｓ．等，Ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，ｖ．４２５，７３７－７４１、参照によりここに援用する）。したがって、疾患組織におけるペプチド前駆体をコードする転写物の発現レベルを、免疫原性を予測するために使用できる。
【0080】
いくつかの実施態様において、免疫プロテアソームによるペプチド前駆体のプロセシング効率が、免疫原性を予測するために使用される。本明細書において使用するペプチド前駆体の「プロセシング効率」は、原料アミノ酸配列（すなわち、より大きなペプチド又はタンパク質）が、ＭＨＣＩ分子との結合前に、発現、翻訳、転写、消化、輸送、及び任意のさらなるプロセシングを受ける効率を指す。「免疫プロテアソーム」は、エピトープ形成という最終的な目的のために、ペプチド及び／又はタンパク質前駆体を、小さなアミノ酸配列へと酵素的に消化するプロテアーゼの集合である。たとえば、Ｃｈｅｎ等により実証されたとおり、免疫プロテアソームのエピトープ前駆体を生成する能力は、免疫原性と直接相関する（Chen, W.等, Immunoproteasomes shape immunodominance hierarchies of antiviral CD8+ T cell repertoire and presentation of viral antigens, The Journal of Experimental Medicine, 2001, v.193, 1319-1326、参照によりここに援用する）。エピトーププロセシングに関与する段階についての知識を、得られたエピトープの免疫原性を予測するために使用できる。特に、免疫プロテアソームに関する研究は、それがＭＨＣエピトープの製造において効率的であり、免疫プロテアソーム機構の理解が、免疫原性ペプチドの予測を容易にするだろうことを示唆する。
【0081】
いくつかの実施態様において、ペプチド前駆体の発現のタイミングを、免疫原性を予測するために使用できる。疾患進行の比較的早期に発現したタンパク質は、ＭＨＣエピトープとして提示される可能性がより高い（Moutaftsi, M.等, A consensus epitope prediction approach identifies the breadth of murine T CD8+-cell responses to vaccina virus, Nature Biotechnology, 2006, v.24, 817-819、参照によりここに援用する）。いくつかの実施態様において、疾患組織の比較分析を、遺伝子産物の時間的発現パターンを決定するために使用できる。いくつかの実施態様において、時間的発現パターンの推定は、他の同定される発現遺伝子産物と比較して、早期の時点で大量に提示される発現遺伝子産物の同定を可能にしうる。
【0082】
いくつかの実施態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とのペプチドエピトープの結合親和性を、免疫原性を予測するために使用できる。ＴＣＲとのペプチドエピトープの結合親和性を予測する方法は、当該技術分野で知られており、たとえば、Ｔｕｎｇ，Ｃ．－Ｗ．等，ＰＯＰＩＳＫ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅｓ ａｎｄ ｓｔｒｉｎｇ ｋｅｒｎｅｌｓ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１１，ｖ．１２，４４６において報告されており、これを参照によりここに援用する。
【0083】
いくつかの実施態様において、ペプチドにおける変異アミノ酸の位置が、免疫原性を予測するために使用される。ペプチドエピトープは、２つの異なるアンカー位置で、ＭＨＣＩ分子と結合する。アンカー位置間の間隔は、エピトープペプチド配列により測定して、アンカー位置を占めるアミノ酸を含まずに、約６～７アミノ酸により分離されている。２つのＭＨＣＩアンカー位置間のアミノ酸の間隔、すなわち、４～６位のアミノ酸における変異は、免疫原性応答と正の相関がある可能性がより高いことが報告されている（Calis, J. J. A.等, Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity, PLOS Computational Biology, 2013, v.9, 1-13、参照によりここに援用する）。アミノ酸の配列位置は、１番の配列位置カウントを末端アミノ酸について開始することにより決定される。
【0084】
いくつかの実施態様において、ＭＨＣ提示エピトープ上に提示されるペプチドの構造特性により、免疫原性を予測できる。ＭＨＣ結合ペプチドの構造評価は、インシリコ３次元解析及び／又はタンパク質ドッキングプログラムにより実行できる。ｐＭＨＣ分子の構造を予測する方法は当該技術分野で知られており、たとえば、Ｍａｒｔｉ－Ｒｅｎｏｍ，Ｍ．Ａ．等，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０００，ｖ．２９，２９１－３２５、Ｃｈｉｖｉａｎ，Ｄ．等，Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ－ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，ｖ．３４，ｅ１１２、及びＭｃＲｏｂｂ，Ｆ．Ｍ．等，Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｏｃｋｅｔｉｎｇ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，２０１０，ｖ．５０，６２６－６３７において報告されており、これらは参照によりここに援用される。たとえばＲｏｓｅｔｔａアルゴリズムから取得される、ＭＨＣ分子と結合するときの予測されるエピトープ構造の使用は、エピトープがＭＨＣ分子と結合するときの前記エピトープのアミノ酸残基の溶媒曝露度を評価するために使用できる。この情報を、ペプチドの免疫原性と実質的に相関させうる。たとえば、Ｐａｒｋ等により記述されたとおり、変異アミノ酸残基が野生型配列と比較してさらなる溶媒曝露を示す変異体ペプチドは、免疫原性の増加と正の相関がある（Park, M.-S.等., Accurate structure prediction of peptide-MHC complexes for identifying highly immunogenic antigens, Molecular Immunology, 2013, v.56, 81-90、参照によりここに援用する）。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ複合体上に提示されたときのペプチド全体の溶媒曝露が、免疫原性を予測するために使用される。いくつかの実施態様において、ペプチド上の変異アミノ酸の溶媒曝露が、免疫原性を予測するために使用される。
【0085】
いくつかの実施態様において、ペプチドにおける大きな及び／又は芳香族残基のエピトープ含有量を、免疫原性を予測するために使用できる。Ｃａｌｉｓ等は、エピトープアミノ酸配列内の大きな及び／又は芳香族のアミノ酸残基の存在と、免疫原性との間の連関を観察した。具体的には、フェニルアラニン及びイソロイシン含有量は、エピトープ免疫原性と正の相関があることが報告された。上で議論したとおり、変異アミノ酸の位置及び構造評価の両方を、エピトープ免疫原性を予測するために使用できる。この議論に加えて、エピトープの４～６位内の大きな及び／又は芳香族残基が、大きな溶媒曝露度を有すると予測できることが仮定された。
【0086】
いくつかの実施態様において、ペプチド前駆体の性質を、変異体コードアミノ酸配列の免疫原性を予測するために使用できる。たとえば、疾患組織が腫瘍であるとき、がんと関連することが知られているペプチド前駆体配列が、免疫原性を予測するときに有用でありうる。しかしながら、がんと直接関連づけられないタンパク質からのペプチド前駆体配列もまた、たとえば、変異したとき、本発明の方法内で有用でありうる。
【0087】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の少なくとも２つ（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のうちの少なくとも任意の１つ）のパラメーターを、ペプチドの免疫原性を予測するために使用できる。いくつかの実施態様において、第１の予測評価を、変異体コードアミノ酸配列のセットを選択するために使用でき、それは続いて、第２の予測評価によりプロセシングされ、エピトープ免疫原性の累積予測をもたらす。エピトープ免疫原性を予測するために複数回の評価を使用できることは、本開示の一部として意図されている。代わりに、複数のパラメーターが並列的に評価され、様々なパラメーターの評価に基づく合成スコアが得られる。たとえば、パラメーターのそれぞれについてスコアを算出でき、各パラメーターにパーセンテージ重みを割り当てることができる。次に、合成スコアを、評価されたパラメーターのそれぞれのスコア及びパーセンテージ重みに基づいて算出できる。並列パラメーター評価と組み合わされた連続評価の組合せもまた使用できる。
【0088】
変異体コード配列における所定の差異について、様々な長さの複数の重複する推定変異体ペプチドを生成できる。一実施態様において、これらの複数の重複する推定変異体ペプチドは、免疫原性に基づいて順位付けされ、これは、本明細書に記載の１つ又は複数の解析を包含しうる。加えて、推定変異体ペプチドの順位付けは、順位付けプロセスを実行する者の好みに応じて、免疫原性決定に含めることができるか又は別個の解析と考えられる、当該技術分野で周知の任意の１つ又は複数の手段により達成できる。このような手段のいくつかの非限定的な例には、前駆体タンパク質の存在量、プロセシングの効率も含めたプロセシングされたプロテオーム内のペプチドの存在量、ペプチド－ＭＨＣＩ複合体内のペプチドの存在量が含まれる。可能な順位付け解析のさらなる例には、ペプチドの結合親和性、ペプチド－ＭＨＣＩ複合体の安定性、及び自己ペプチドとのペプチドの類似性又は差異性が含まれるが、これらに限定されない。代わりに、ペプチドを、当業者に周知であるか又は本明細書に記載されているこれら又は他の特性を測定する、質量分析法から生成されたデータとの相関に基づいて順位付けできる。いくつかの代表的な特性には、免疫原性を増加させる大きな又は芳香族のアミノ酸の存在又は非存在、及び、これらのアミノ酸がペプチド内に見出される特定の位置が含まれ、それらのアミノ酸に与えられる免疫原性の影響の好ましさは、ペプチドの中間の位置、たとえばペプチド４～６に見出される（たとえば、Calis等 PLOS, 9(10):e1003266 (2013)を参照のこと）。
【0089】
いくつかの実施態様において、免疫原性の予測は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）タイピング解析をさらに含む。ＭＨＣの多因性ゆえに、すべての人が、少なくとも３つの異なる抗原提示ＭＨＣクラスＩ分子及び３つ（又はときに４つ）のＭＨＣクラスＩＩ分子をその細胞に発現する。実際、ほとんどの人の細胞上に発現する異なるＭＨＣ分子の数は、ＭＨＣの極端な多型及びＭＨＣ遺伝子産物の共優性発現ゆえに、より多くなる。いくつかのヒトＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子の２００を超える対立遺伝子が存在し、各対立遺伝子は、集団内に相対的に高い頻度で存在する。それゆえ、個体の両方の相同染色体上の対応するＭＨＣ遺伝子座が同じ対立遺伝子を有する確率はわずかしかなく、ほとんどの個体がＭＨＣ遺伝子座についてヘテロ接合である。単一の染色体上に見出されるＭＨＣ対立遺伝子の特定の組合せは、ＭＨＣハプロタイプとして知られている。ＭＨＣ対立遺伝子の発現は共優性であり、ある遺伝子座の両方の対立遺伝子のタンパク質産物が細胞に発現し、両方の遺伝子産物がＴ細胞に抗原を提示可能である。したがって、各遺伝子座上の広範な多型は、個体に発現する異なるＭＨＣ分子の数を二倍にする可能性を有し、そのことにより、多因性を通じてすでに存在する多様性を増加させる（たとえば、概観については、Janeway’s Immunobiology, Murphy, Kenneth編, Garland Science, New York, NY (2011)を参照のこと）。ＨＬＡタイピングは、先行技術において公知のいくつかの方法のうちの任意の１つ、たとえばＤＮＡベースの組織適合性アッセイを使用して達成できる。当該技術分野における方法の特定の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物がさらに解析されるもの、たとえばＰＣＲ－ＲＦＬＰ（制限断片長多型）、ＰＣＲ－ＳＳＯ（配列特異的オリゴヌクレオチド）、ＰＣＲ－ＳＳＰ（配列特異的プライマー）、及びＰＣＲ－ＳＢＴ（配列ベースタイピング）法を含む。したがって、目的のペプチドの提示に関与する特定の遺伝子多型タイプを決定することにより、変異体ペプチドの免疫原性についてのさらなる情報を提供できる。
【0090】
ＭＨＣ分子に結合したペプチドを得る
いくつかの実施態様における本明細書において提供される方法は、個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合したペプチドを得ることを含む。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、免疫親和性法により単離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにより単離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、免疫親和性アフィニティークロマトグラフィーにより単離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、免疫沈降法により単離される。
いくつかの実施態様における本明細書において提供される方法は、個体の疾患組織からＭＨＣ分子に結合したペプチドを得ることを含む。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、免疫親和性法により単離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにより単離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、免疫親和性アフィニティークロマトグラフィーにより単離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、免疫沈降法により単離される。
【0091】
いくつかの実施態様において、抗ＭＨＣ抗体が、ＭＨＣ／ペプチド分子を捕捉するために使用される。いくつかの実施態様において、任意選択的に異なる親和性及び／又は結合特性を有する、複数の抗ＭＨＣ抗体を、ＭＨＣ／ペプチド複合体を捕捉するために使用できる。好適な抗体には、ＨＬＡクラスＩに特異的なモノクローナル抗体Ｗ６／３２、及びＨＬＡ－Ａ２に特異的なモノクローナル抗体ＢＢ７．２が含まれるが、これらに限定されない。
【0092】
いくつかの実施態様において、ＭＨＣ／ペプチド複合体をまず単離でき、ＭＨＣ結合ペプチドを続いてＭＨＣ分子から分離する。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、酸溶出によりＭＨＣ分子から分離される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ分子からのＭＨＣ結合ペプチドの酸媒介性分離は、インタクトな細胞全体で、任意選択的に溶解細胞及び／又は細胞残余物の存在下で実施できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、酸性ｐＨを有するバッファーへのｐＭＨＣの曝露後に、ＭＨＣ分子から分離できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、弱酸溶出（ＭＡＥ）によりＭＨＣ分子から分離できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、細胞外表面の弱酸溶出（ＭＡＥ）により、ＭＨＣ分子から分離できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、ｐＭＨＣ分子の変性により、ＭＨＣ分子から分離できる。
【0093】
いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に、さらにプロセシングできる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に濃縮できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に精製できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に分画できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に富化できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に、さらに酵素的に消化できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドが含有されうるバッファーを、質量分析ベースのシークエンシング前に交換できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に標識できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に共有結合的に標識できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に酵素的に標識できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析ベースのシークエンシング前に化学的に標識できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを標識し、質量分析ベースのシークエンシング中のイオン化増強を可能にしうる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを標識し、質量分析ベースのシークエンシング中の定量を可能にしうる。いくつかの実施態様において、単離ＭＨＣ結合ペプチドは、複数のソース及び／又は富化手順に由来してもよく、任意選択的に、質量分析ベースのシークエンシング前に集合的にプールされてもよい。
【0094】
質量分析ベースのペプチドシークエンシング
本明細書に記載の方法におけるＭＨＣ分子に結合したペプチドは、質量分析シークエンシングに供される。本明細書において使用する「質量分析ベースのシークエンシング」は、質量分析の使用によりペプチド及び／又はタンパク質のアミノ酸配列を同定する手法を指す。質量分析計は、個別のイオン化分子の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を測定可能な機器であり、研究者が、未知の化合物を同定すること、公知の化合物を定量すること、並びに分子の構造及び化学特性を解明することを可能にする。本明細書において提供される方法は、ＭＨＣＩ分子に結合したペプチドエピトープの配列情報を得るために使用できる。いくつかの実施態様において、ペプチドエピトープの全配列を決定できる。いくつかの実施態様において、ペプチドエピトープの部分配列を決定できる。いくつかの実施態様において、ペプチドは、タンデム質量分析、たとえばタンデムクロマトグラフィー質量分析（たとえばＬＣ－ＭＳ又はＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）に供される。
本明細書に記載の方法におけるＭＨＣ分子に結合したペプチドは、質量分析シークエンシングに供される。本明細書において使用する「質量分析ベースのシークエンシング」は、質量分析の使用によりペプチド及び／又はタンパク質のアミノ酸配列を同定する手法を指す。質量分析計は、個別のイオン化分子の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を測定可能な機器であり、研究者が、未知の化合物を同定すること、公知の化合物を定量すること、並びに分子の構造及び化学特性を解明することを可能にする。本明細書において提供される方法は、ＭＨＣＩ分子に結合したペプチドエピトープの配列情報を得るために使用できる。いくつかの実施態様において、ペプチドエピトープの全配列を決定できる。いくつかの実施態様において、ペプチドエピトープの部分配列を決定できる。いくつかの実施態様において、ペプチドは、タンデム質量分析、たとえばタンデムクロマトグラフィー質量分析（たとえばＬＣ－ＭＳ又はＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）に供される。
【0095】
いくつかの実施態様において、試料を単離して機器上にロードすることにより質量分析が開始される。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドを、質量分析前にクロマトグラフィー処理できる。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーである。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーである。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、質量分析計内への導入前に、クロマトグラフィー分離でき、同時に濃縮できる。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィー分離はオンラインであってもよく、クロマトグラフィー源から溶出するペプチドは、質量分析計内に直接進入する。いくつかの実施態様において、クロマトグラフィー分離はオフラインであってもよい。いくつかの実施態様において、オフラインクロマトグラフィー分離は、単離ＭＨＣ結合ペプチドを分画するために使用できる。オフラインクロマトグラフィー分離は、典型的には、質量分析試料の分離及び／又は分画を伴い、得られた分離及び／又は分画試料はクロマトグラフィー系を出る際に、質量分析計内に直接導入されない。
【0096】
いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、公知の質量分析イオン化法（たとえば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、エレクトロスプレーイオン化、及び／又はナノエレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化）を使用してシークエンシングできる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドは、質量分析計の外側で、内側で、及び／又はそれに進入する際に、イオン化できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドの陽イオンを、質量分析計において分析できる。続いて、イオンは、それらの質量対電荷比に従い、磁場への曝露を介して分離される。いくつかの実施態様において、セクター型機器が使用され、イオンは、イオンの質量対電荷比と直接相関する、機器の磁場を通過する際のイオンの軌道の偏向の強度に従い定量される。他の実施態様において、イオン質量対電荷比は、イオンが四重極を通過する際に、又は３次元若しくはリニアイオントラップ若しくはオービトラップにおける、又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計の磁場におけるそれらの運動に基づいて、測定される。機器は、各イオンの相対存在量を記録し、それは、元の試料の化学、分子及び／又は同位体組成を決定するために使用される。いくつかの実施態様において、飛行時間型機器が使用され、電場を利用し、その電位を通じてイオンを加速させ、各イオンが検出器に到達するのにかかる時間を測定する。この手法は、各イオンの運動エネルギーが同一であるよう、各イオンの電荷が均一であることに依存する。このシナリオにおける速度に影響する唯一の変数は質量であり、より軽いイオンがより速い速度で移動し、結果としてより早く検出器に到達する。得られたデータを強度対質量対電荷比（intensity vs. mass-to-charge ratio）のマススペクトル又はヒストグラムで表し、ピークはイオン化化合物又は断片を表す。
【0097】
マススペクトルデータは、タンデム質量分析により得ることができる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドのペプチドシークエンシングのための情報を取得するための質量分析取得法は、データ依存的であってもよい。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドのペプチドシークエンシングのための情報を取得するための質量分析取得法は、データ独立的であってもよい。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドのペプチドシークエンシングのための情報を取得するための質量分析取得法は、測定された正確な質量分析に基づいていてもよい。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドのペプチドシークエンシングのための情報を取得するための質量分析取得法は、ペプチドマスフィンガープリンティングであってもよい。本発明において有用なマススペクトルデータは、ペプチドマスフィンガープリンティングにより得ることができる。ペプチドマスフィンガープリンティングは、タンパク質分解性消化により生成されたペプチドの混合物のスペクトルから観察された質量をデータベースに入力し、観察された質量を、公知のタンパク質の消化から生じた断片の予測された質量とインシリコで相関させることを伴う。試料質量に対応する公知の質量は、公知のタンパク質が試験された試料中に存在する証拠を提供する。
【0098】
いくつかの実施態様において、タンデム質量分析は、ペプチドイオンを気体と衝突させ、（たとえば、衝突により付与された振動エネルギーにより）断片化するプロセスを含む。断片化プロセスは、タンパク質に沿って様々な部位のペプチド結合において破断した切断産物をもたらす。観察された断片の質量を、多くの与えられたペプチド配列のうちの１つのための予測された質量のデータベースとマッチングでき、タンパク質の存在を予測できる。いくつかの実施態様において、質量分析取得法は、断片化法（たとえば、衝突誘起解離、パルス化Ｑ解離、高エネルギー衝突解離、電子移動解離、及び電子移動解離、赤外多光子解離）を利用できる。
【0099】
いくつかの実施態様において、質量分析計から取得されるデータは、ペプチド配列を同定するために使用できる。いくつかの実施態様において、探索アルゴリズム（たとえば、ＳＥＱＵＥＳＴ及びＭａｓｃｏｔ）を、ペプチド配列を取得マススペクトルに割り当てるために使用できる。いくつかの実施態様において、割り当てられたペプチド配列は、約５％未満の偽発見率を有していてもよい。いくつかの実施態様において、割り当てられたペプチド配列は、約１％未満の偽発見率を有していてもよい。いくつかの実施態様において、割り当てられたペプチド配列は、約０．５％未満の偽発見率を有していてもよい。いくつかの実施態様において、データベースは、探索アルゴリズムにより、ペプチド配列を取得スペクトルに割り当てるために使用できる。いくつかの実施態様において、探索アルゴリズムにより、ペプチド配列を取得スペクトルに割り当てるために使用されるデータベースは、生物体の公知の配列のデータベースであってもよい。いくつかの実施態様において、探索アルゴリズムにより、ペプチド配列を取得スペクトルに割り当てるために使用されるデータベースは、生物体の公知のタンパク質のデータベースであってもよい。いくつかの実施態様において、探索アルゴリズムにより、ペプチド配列を取得スペクトルに割り当てるために使用されるデータベースは、生物体の公知のゲノム配列のデータベースであってもよい。いくつかの実施態様において、探索アルゴリズムにより、ペプチド配列を取得スペクトルに割り当てるために使用されるデータベースは、疾患組織から得られた配列情報を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、探索アルゴリズムにより、ペプチド配列を取得スペクトルに割り当てるために使用されるデータベースは、疾患のない組織から得られた配列情報を含んでいてもよい。
【0100】
いくつかの実施態様において、スペクトルに割り当てられた配列は、アルゴリズムによる正確な断片イオン割当てを確証するために、マニュアルで検証できる。いくつかの実施態様において、合成ペプチド標準を、アルゴリズム割当て配列を確証するために使用できる。いくつかの実施態様において、ＭＨＣ結合ペプチドから生成されたスペクトルを、ペプチド標準から生成されたスペクトルと比較できる。たとえば、比較は、基準に対する疾患組織ソースから取得されたスペクトルのｍ／ｚ値に基づく、断片イオンのパターン、及び任意選択的に断片存在量又は強度のマッチングを伴っていてもよい。いくつかの実施態様において、マニュアルの検証は、完全ペプチド配列の配列割当てを確証できる。いくつかの実施態様において、マニュアルの検証は、ペプチド配列の部分セグメントの配列割当てを確証できる。
【0101】
質量分析及びゲノムデータの相関
いくつかの実施態様における本明細書において提供される方法は、ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、変異体コード配列のセットと相関させ、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定することを含む。たとえば、ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析配列を、予測された疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの集団をさらに選択するために使用できる。いくつかの実施態様において、質量分析ベースのエピトープ同定は、ゲノムベースの免疫原性エピトープ同定及び／又は予測を補足できる。いくつかの実施態様において、質量分析ベースのエピトープ同定は、ゲノムベースの免疫原性エピトープ同定及び／又は予測を確証できる。
いくつかの実施態様における本明細書において提供される方法は、ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析由来配列情報を、変異体コード配列のセットと相関させ、疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを同定することを含む。たとえば、ＭＨＣ結合ペプチドの質量分析配列を、予測された疾患特異的免疫原性変異体ペプチドの集団をさらに選択するために使用できる。いくつかの実施態様において、質量分析ベースのエピトープ同定は、ゲノムベースの免疫原性エピトープ同定及び／又は予測を補足できる。いくつかの実施態様において、質量分析ベースのエピトープ同定は、ゲノムベースの免疫原性エピトープ同定及び／又は予測を確証できる。
【0102】
質量分析から得られたデータは、疾患組織のゲノム及び／又はトランスクリプトーム配列解析に基づく免疫原性ペプチド予測と相関させうる。一般に、質量分析ベースのシークエンシングから同定されたアミノ酸配列は、予測された免疫原性ペプチドのアミノ酸配列と比較され、部分配列アラインメントを含む領域が見出される。いくつかの実施態様において、質量分析を介して同定されたペプチドは、予測された免疫原性ペプチドの配列と正確に一致する配列である。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列の長さは、質量分析を介して同定されたペプチドと、予測された免疫原性ペプチドのものとの間で変化してもよい。たとえば、質量分析を介して同定されたペプチドは、予測された免疫原性ペプチドと比較して、ペプチドのＣ及び／又はＮ末端に修飾（amended）された追加のアミノ酸を含有していてもよい。代わりに、変異アミノ酸を含む質量分析を介して同定されたペプチドは、予測された免疫原性ペプチドと比較して、Ｃ及び／又はＮ末端上により少ないアミノ酸を有していてもよい。これらの例示的実施態様において、変異アミノ酸及び変異アミノ酸を囲む配列は、質量分析を介して同定されたペプチド及び免疫原性と予測されたペプチドの両方で同じでなければならない。いくつかの実施態様において、質量分析ベースの配列を免疫原性ペプチド予測と相関させることから得られる結果は、予測された免疫原性配列を、質量分析ベースのシークエンシングを介してＭＨＣ分子により物理的に提示されると確証される配列とマッチングするものである。
【0103】
いくつかの実施態様において、取得される質量分析配列同定を、ペプチド長によりさらにフィルタリングできる。たとえば、いくつかの実施態様において、質量分析により同定されるＭＨＣ結合ペプチドの集団を、８又は９アミノ酸の長さである同定されたペプチド配列しか含まないように、さらにフィルタリングできる。
【0104】
免疫原性変異体ペプチドの機能検証
本明細書に記載の方法により同定される疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを、機能研究によりさらに検証できる。たとえば、ペプチドを、標的化免疫応答（たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介されるもの）を活性化する能力に基づいて合成及び試験できる。いくつかの実施態様において、ペプチドは、化学的に合成される。いくつかの実施態様において、ペプチドは、組換え法により合成される。いくつかの実施態様において、ペプチドは、ペプチド前駆体分子をまず発現させ、次にそれが（たとえば免疫プロテアソームにより）プロセシングされて、目的のペプチドを生成することにより合成される。合成されたペプチドは、機能解析に供される前に、さらなる精製に供されうる。
本明細書に記載の方法により同定される疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを、機能研究によりさらに検証できる。たとえば、ペプチドを、標的化免疫応答（たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介されるもの）を活性化する能力に基づいて合成及び試験できる。いくつかの実施態様において、ペプチドは、化学的に合成される。いくつかの実施態様において、ペプチドは、組換え法により合成される。いくつかの実施態様において、ペプチドは、ペプチド前駆体分子をまず発現させ、次にそれが（たとえば免疫プロテアソームにより）プロセシングされて、目的のペプチドを生成することにより合成される。合成されたペプチドは、機能解析に供される前に、さらなる精製に供されうる。
【0105】
いくつかの実施態様において、合成の予測された疾患特異的免疫原性ペプチドが、細胞傷害性Ｔ細胞応答について試験するためにインビトロで使用される。いくつかの実施態様において、合成の予測された疾患特異的免疫原性ペプチドが、細胞傷害性Ｔ細胞応答について試験するためにインビボで使用される。
【0106】
いくつかの実施態様において、疾患特異的ペプチドの免疫原性は、マウスの免疫化により試験できる。いくつかの実施態様において、疾患特異的ペプチドの免疫原性は、免疫化後にＣＤ８ Ｔ細胞応答を測定することにより試験できる。いくつかの実施態様において、ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣＩ／ペプチド特異的デキストラマーを使用して測定できる。いくつかの実施態様において、疾患特異的ペプチドの免疫原性は、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）を解析することにより試験できる。
【0107】
いくつかの実施態様において、特異的エピトープ及び／又は細胞表面タンパク質の存在を測定できる。いくつかの実施態様において、ワクチン接種に由来するエピトープの存在を測定できる。いくつかの実施態様において、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を測定できる。いくつかの実施態様において、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）を測定できる。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３（ＴＩＭ－３）を測定できる。いくつかの実施態様において、特異的タンパク質及び／又はエピトープを発現する細胞傷害性Ｔ細胞を測定できる。いくつかの実施態様において、特異的エピトープをディスプレイする細胞傷害性Ｔ細胞を測定できる。
【0108】
いくつかの実施態様において、疾患特異的ペプチドの免疫原性は、まず樹状細胞においてペプチドを発現させ、次に、Ｔ細胞により認識される提示抗原の能力について試験することにより、試験できる。いくつかの実施態様において、樹状細胞は患者から得られ、疾患特異的ペプチドが前記患者において同定されている。いくつかの実施態様において、疾患特異的ペプチドの免疫原性は、まずＢリンパ球においてペプチドを発現させ、次に、Ｔ細胞により認識される提示抗原の能力について試験することにより、試験できる。いくつかの実施態様において、Ｂリンパ球は患者から得られ、疾患特異的ペプチドが前記患者において同定されている。たとえば、米国特許第８３４９５５８号を参照のこと。
【0109】
免疫原性ペプチドの組成物
本開示は、疾患特異的免疫原性ペプチドを同定する方法を提供する。免疫原性ペプチドを、標的化免疫応答（たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介されるもの）を活性化する能力に基づいて同定できる。いくつかの実施態様において、同定された疾患特異的免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を、薬学的に許容される組成物を開発するために使用できる。いくつかの実施態様において、組成物は、合成疾患特異的免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、合成疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、２つ以上の疾患特異的免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、２つ以上の疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、２つ以上の疾患特異的免疫原性ペプチドは、２つ以上のユニークエピトープに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化させてもよい。
本開示は、疾患特異的免疫原性ペプチドを同定する方法を提供する。免疫原性ペプチドを、標的化免疫応答（たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介されるもの）を活性化する能力に基づいて同定できる。いくつかの実施態様において、同定された疾患特異的免疫原性ペプチドのアミノ酸配列を、薬学的に許容される組成物を開発するために使用できる。いくつかの実施態様において、組成物は、合成疾患特異的免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、合成疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、２つ以上の疾患特異的免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、２つ以上の疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、２つ以上の疾患特異的免疫原性ペプチドは、２つ以上のユニークエピトープに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化させてもよい。
【0110】
いくつかの実施態様において、組成物は、疾患特異的免疫原性ペプチドの前駆体（たとえば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患特異的免疫原性ペプチドの前駆体は、同定された疾患特異的免疫原性ペプチドを生成し、又はそれへと生成されてもよい。いくつかの実施態様において、疾患特異的免疫原性ペプチドの前駆体は、プロドラッグであってもよい。
【0111】
いくつかの実施態様において、疾患特異的免疫原性ペプチドを含む組成物は、薬学的に許容されうる。いくつかの実施態様において、疾患特異的免疫原性ペプチドを含む組成物は、アジュバントをさらに含んでいてもよい。たとえば、変異ペプチドをワクチンとして利用できる（Sahin等, Int. J. Cancer, 78:387-9 (1998); Stumiolo等, Nature Biotechnol, 17:555-61 (1999); Rammensee等, Immunol Rev 188:164-76 (2002);及びHannani等 Cancer J 17:351-358 (2011)を参照のこと）。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的必要性に従い、個別化成分を含有していてもよい。いくつかの実施態様において、ワクチンは、特定の患者において予測された免疫原性ペプチドに特異的であってもよい。いくつかの実施態様において、ワクチンは、１を超える免疫原性ペプチド又はペプチド前駆体を含有する。いくつかの実施態様において、ワクチンにおいて使用されるペプチドの長さは、長さが変化してもよい。いくつかの実施態様において、ペプチドは、約７～５０アミノ酸の長さ（たとえば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２２、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸の長さのうちの任意のもの）である。いくつかの実施態様において、ペプチドは、約８～１２アミノ酸の長さである。いくつかの実施態様において、ペプチドは、約８～１０アミノ酸の長さである。ペプチドをその単離形態で利用できるか、又は代わりに、ペプチドをＭＨＣ単離ペプチドの末端に付加して、より免疫原性が高いと判明しうる「長いペプチド」を生成できる（たとえば、Castle等, Cancer Res 72:1081-1091 (2012)を参照のこと）。いくつかの実施態様において、ペプチドはまたタグ化されていてもよく、又は融合タンパク質であってもよく、又は混成分子であってもよい。いくつかの実施態様において、ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態である。
【0112】
いくつかの実施態様において、ワクチンは核酸ワクチンである。いくつかの実施態様において、核酸は、免疫原性ペプチド又はペプチド前駆体をコードする。いくつかの実施態様において、核酸ワクチンは、免疫原性ペプチド又はペプチド前駆体をコードする配列に隣接する配列を含む。いくつかの実施態様において、核酸ワクチンは、１を超える免疫原性エピトープを含む。いくつかの実施態様において、核酸ワクチンは、ＤＮＡベースのワクチンである。いくつかの実施態様において、核酸ワクチンは、ＲＮＡベースのワクチンである。いくつかの実施態様において、ＲＮＡベースのワクチンは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施態様において、ＲＮＡベースのワクチンは、裸のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施態様において、ＲＮＡベースのワクチンは、修飾ｍＲＮＡ（たとえば、プロタミンを使用して分解から保護されたｍＲＮＡ。修飾５’ＣＡＰ構造を含有するｍＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施態様において、ＲＮＡベースのワクチンは、一本鎖ｍＲＮＡを含む。
【0113】
ポリヌクレオチドは、実質的に純粋でもよく、又は好適なベクター又は送達系に含有されていてもよい。好適なベクター及び送達系には、ウイルス、たとえばアデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス又は１を超えるウイルスの要素を含有するハイブリッドに基づく系が含まれる。非ウイルス送達系には、カチオン性脂質及びカチオン性ポリマー（たとえば、カチオン性リポソーム）が含まれる。いくつかの実施態様において、物理的送達、たとえば「遺伝子銃」を用いたものを使用できる。
【0114】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のペプチドは、変異体ペプチド特異的治療剤、たとえば抗体治療剤を製造するために使用できる。たとえば、変異体ペプチドは、変異体ペプチドを特異的に認識する抗体を産生及び／又は同定するために使用できる。これらの抗体は、治療剤として使用できる。合成短ペプチドが、タンパク質反応性抗体を生成するために使用された。合成ペプチドで免疫化することの利点は、無制限量の純粋安定抗原を使用できることである。この手法は、短ペプチド配列を合成すること、それらを大きな担体分子に連結すること、及び選択した動物をペプチド－担体分子で免疫化することを伴う。抗体の特性は、一次配列情報に依存する。配列及び連結方法を注意深く選択することで、所望のペプチドに対する良好な応答を通常は生成できる。ほとんどのペプチドが、良好な応答を誘発できる。抗ペプチド抗体の利点は、それらを、変異体ペプチドのアミノ酸配列を決定した直後に調製でき、抗体製造のためにタンパク質の特定の領域を特異的に標的化できる点である。変異体ペプチドは高い免疫原性についてスクリーニングされてきたので、得られた抗体が腫瘍設定においてネイティブタンパク質を認識する確率は高い。ワクチンの状況と同様に、ペプチドの長さは、検討すべき別の重要な因子である。近似的に、１０～１５残基のペプチドが、抗ペプチド抗体産生に最適であり、より長いペプチドがより良好である。なぜなら、可能なエピトープの数がペプチド長とともに増加するからである。しかしながら、長いペプチドは、合成、精製、及び担体タンパク質との連結における困難性を増加させる。抗体の質は、ペプチドの質に依存する。ペプチド産物中に含有される副産物は、質の低い抗体をもたらしうる。
【0115】
ペプチド－担体タンパク質連結は、高力価抗体の産生に関与する別の因子である。ほとんどの連結方法は、アミノ酸の反応性官能基、たとえば－ＮＨ２、－ＣＯＯＨ、－ＳＨ及びフェノール性－ＯＨに依存する。部位特異的連結は最良の方法である。抗ペプチド抗体産生において使用される任意の好適な方法は、本発明の方法により同定されるペプチドとともに利用できる。２つのこのような公知の方法は、多重抗原ペプチド系（ＭＡＰｓ）及び脂質コアペプチド（ＬＣＰ法）である。ＭＡＰｓの利点は、コンジュゲーション方法を必要としない点である。担体タンパク質又はリンケージ結合（linkage bond）は、免疫化宿主内に導入されない。欠点の一つは、ペプチドの純度の制御がより難しくなる点である。加えて、ＭＡＰｓは、いくつかの宿主の免疫応答系を迂回できる。ＬＣＰ法は、他の抗ペプチドワクチン系よりも高い力価を提供することが知られており、したがって有利でありうる。
【0116】
本明細書においてまた提供されるのは、本明細書に開示の疾患特異的免疫原性変異体ペプチドを含む単離ＭＨＣ／ペプチド複合体である。このようなＭＨＣ／ペプチド複合体は、たとえば、抗体、可溶型ＴＣＲ、又はＴＣＲアナログを同定するために使用できる。これらの抗体のあるタイプは、ＴＣＲミミックと呼ばれてきた。なぜならそれらは、特定のＨＬＡ環境の文脈において腫瘍関連抗原からのペプチドと結合する抗体だからである。このタイプの抗体は、表面上に複合体を発現する細胞の溶解を媒介するとともに、マウスを複合体を発現する移植がん細胞株から保護することが示されてきた（たとえば、Wittman等, J. of Immunol. 177:4187-4195 (2006)を参照のこと）。ＩｇＧ ｍＡｂｓとしてのＴＣＲミミックの利点の一つは、親和性成熟を実施でき、分子が提示Ｆｃ領域を通じて免疫エフェクター機能と連結される点である。これらの抗体はまた、腫瘍に対する治療用分子、たとえば毒素、サイトカイン、又は薬物製品を標的化するために使用できる。ペプチド、たとえば非ハイブリドーマベースの抗体産生又は結合能を有する抗体断片、たとえばバクテリオファージ上の抗ペプチドＦａｂ分子の産生を使用して、本発明の方法を使用して選択されたものを使用して、他のタイプの分子が開発された。これらの断片はまた、腫瘍送達のための他の治療用分子、たとえば抗ペプチドＭＨＣ Ｆａｂ－イムノトキシンコンジュゲート、抗ペプチドＭＨＣ Ｆａｂ－サイトカインコンジュゲート及び抗ペプチドＭＨＣ Ｆａｂ－薬物コンジュゲートにコンジュゲートできる。
【0117】
免疫原性ワクチンを含む治療の方法
本開示は、免疫原性ワクチンを含む治療の方法を提供する。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に免疫原性ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に免疫原性ペプチドの前駆体を含む有効量の組成物を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、免疫原性ワクチンは、薬学的に許容される疾患特異的免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、免疫原性ワクチンは、疾患特異的免疫原性ペプチドの薬学的に許容される前駆体（たとえば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを特異的に認識する有効量の抗体を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを特異的に認識する有効量の可溶型ＴＣＲ又はＴＣＲアナログを投与することを含んでいてもよい。
本開示は、免疫原性ワクチンを含む治療の方法を提供する。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に免疫原性ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に免疫原性ペプチドの前駆体を含む有効量の組成物を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、免疫原性ワクチンは、薬学的に許容される疾患特異的免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、免疫原性ワクチンは、疾患特異的免疫原性ペプチドの薬学的に許容される前駆体（たとえば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを特異的に認識する有効量の抗体を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、疾患（たとえばがん）のための治療の方法が提供され、これは、個体に疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを特異的に認識する有効量の可溶型ＴＣＲ又はＴＣＲアナログを投与することを含んでいてもよい。
【0118】
いくつかの実施態様において、がんは、カルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮癌がんを含む）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がん（gastric or stomach cancer）（胃腸がんを含む）、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、メラノーマ、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺がん、腎臓又は腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝細胞がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、直腸がん、軟組織肉腫、カポジ肉腫、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症と関連する異常血管増殖、浮腫（たとえば、脳腫瘍と関連するもの）、及びメイグス症候群のうちの任意の１つである。
【0119】
本明細書に記載の方法は、オーダーメイド医療の文脈において特に有用であり、本明細書に記載の方法のうちの任意の１つにより得られる疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドが、同じ個体のための治療剤（たとえばワクチン又は治療抗体）を開発するために使用される。したがって、たとえば、いくつかの実施態様において、ａ）個体において疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを同定すること、及びｂ）ペプチド又はペプチド前駆体を合成すること、及びｃ）ペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）個体において疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドを同定すること、ｂ）変異体ペプチドを特異的に認識する抗体を製造すること、及びｃ）ペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、同定工程は、配列特異的変異体同定法を免疫原性予測法と組み合わせる。いくつかの実施態様において、同定工程は、配列特異的変異体同定法を質量分析と組み合わせる。本明細書に記載の疾患特異的な免疫原性変異体ペプチドの任意の同定する方法を、本明細書に記載の治療方法のために使用できる。いくつかの実施態様において、本方法は、個体から疾患組織の試料を得ることをさらに含む。
【0120】
本明細書において提供される方法は、がんを有すると診断されているか、又は有する疑いのある個体（たとえば、ヒト）を治療するために使用できる。いくつかの実施態様において、個体はヒトであってもよい。いくつかの実施態様において、個体は少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５歳のうちの任意の年齢であってよい。いくつかの実施態様において、個体は男性であってもよい。いくつかの実施態様において、個体は女性であってもよい。いくつかの実施態様において、個体は手術を拒否したことがあってもよい。いくつかの実施態様において、個体は医学的に手術不能であってもよい。いくつかの実施態様において、個体はＴａ、Ｔｉｓ、Ｔｌ、Ｔ２、Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、又はＴ４の臨床病期であってもよい。いくつかの実施態様において、がんは再発性であってもよい。いくつかの実施態様において、個体は、がんと関連づけられる１つ又は複数の症候を示すヒトであってもよい。実施態様のいくつかにおいて、個体は、がんを発症する遺伝的又はそれ以外の素因（たとえば、危険因子を有する）があってもよい。
【0121】
本明細書において提供される方法は、アジュバント設定において実施できる。いくつかの実施態様において、本方法はネオアジュバント設定において実施され、すなわち、本方法は、一次的／決定的治療法の前に実施できる。いくつかの実施態様において、本方法は、以前に治療された個体を治療するために使用される。本明細書において提供される治療の方法のうちの任意のものを、以前に治療されていない個体を治療するために使用できる。いくつかの実施態様において、本方法は、一次選択治療法として使用される。いくつかの実施態様において、本方法は、二次選択治療法として使用される。
【0122】
いくつかの実施態様において、個体に免疫原性ワクチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、個体における既存のがん腫瘍転移（たとえば、肺転移又はリンパ節への転移）の発生率又は負担を低減する方法が提供される。
【0123】
いくつかの実施形態において、個体に免疫原性ワクチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、個体におけるがんの疾患進行時間を延長する方法が提供される。
【0124】
いくつかの実施形態において、個体に免疫原性ワクチンを含む有効量の組成物を投与することを含む、がんを有する個体の生存期間を延長する方法が提供される。
【0125】
いくつかの実施態様において、少なくとも１つ又は複数の化学療法剤を、免疫原性ワクチンを含む組成物に加えて投与できる。いくつかの実施態様において、１つ又は複数の化学療法剤は、異なるクラスの化学療法剤に属していてもよい（が、必ずしもそうではない）。
【0126】
いくつかの実施態様において、ａ）免疫原性ワクチン、及びｂ）免疫調節剤を投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）免疫原性ワクチン、及びｂ）チェックポイントタンパク質のアンタゴニストを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）免疫原性ワクチン、及びｂ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）のアンタゴニスト、たとえば抗ＰＤ－１を投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）免疫原性ワクチン、及びｂ）プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）のアンタゴニスト、たとえば抗ＰＤ－Ｌ１を投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ａ）免疫原性ワクチン、及びｂ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）のアンタゴニスト、たとえば抗ＣＴＬＡ－４を投与することを含む、個体における疾患（たとえば、がん）を治療する方法が提供される。
【実施例】
【0127】
実施例１
この実施例は、免疫原性ペプチドエピトープの予測のための例示的方法を実証する。
この実施例は、免疫原性ペプチドエピトープの予測のための例示的方法を実証する。
【0128】
全エクソームシークエンシングを、ＭＣ－３８及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１マウス腫瘍細胞株上で実施し、腫瘍特異的点突然変異を同定した。コード変異体を基準マウスゲノムに対して呼び出し、ＭＣ－３８及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１において、それぞれ４２８５及び９４９の非同義変異体を同定した。続いて、データをＲＮＡ－Ｓｅｑ解析により遺伝子発現についてフィルタリングし、１２９０及び６７の変異遺伝子がそれぞれＭＣ－３８及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１において発現したことを明らかにした。ＭＣ－３８における１７０の予測されたネオエピトープ及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１腫瘍における６の予測されたネオエピトープを、ＮＥＴＭＨＣ－３．４アルゴリズムを使用して同定した。
【0129】
次に、トランスクリプトーム生成ＦＡＳＴＡデータベースを使用した質量分析が、ＭＣ－３８細胞株により提示された７９７のユニークＨ－２Ｋｂエピトープ及び７２５のユニークＨ－２Ｄｂエピトープ、並びにＴＲＡＭＰ－Ｃ１細胞株により提示された４７７のユニークＨ－２Ｋｂエピトープ及び３３２のユニークＨ－２Ｄｂエピトープを明らかにした。豊富な転写物に由来するペプチドは、ＭＣ－３８（図２Ａ）及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１（図２Ｂ）細胞においてＭＨＣ１により提示される可能性がより高いことを観察した。
【0130】
ＭＣ－３８及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１におけるそれぞれ１２９０及び６７のアミノ酸変化のうち、７（ＭＣ－３８において７及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１において０）だけがＭＨＣＩ上に提示されると、質量分析により見出された（表１）。がん精巣自己抗原ＭＡＧＥ－Ｄ１に由来するエピトープの１つがまた、ＭＣ－３８細胞において質量分析により検出された。これらのペプチドを、正確性を期してマニュアルで検証し、ペプチドの合成的に生成されたバージョンと比較した。これらのネオエピトープのうち１つを除くすべてが、ＭＨＣＩと結合すると予測された（ＩＣ５０＜５００ｎｍ、表１）。野生型（ＷＴ）及び変異転写物の両方が腫瘍細胞により発現し、対応するＷＴペプチドのほとんどもまたＭＨＣＩと結合すると予測されたとはいえ、それらのうち３つしか質量分析により検出されなかった。
【0131】
ＭＨＣＩに対するペプチド結合親和性と免疫原性との間に相関があるとはいえ、他の要因もまた寄与する。たとえば、ＴＣＲとの変異アミノ酸の相互作用は、変異ペプチドを「非自己」と認識するために必須である可能性が高い。これは、対応するＷＴペプチドもまたＭＨＣＩ上に提示されるときに特に当てはまる。７つのネオエピトープのうちの５つが、高い結合性予測スコアを示した（ＮＥＴＭＨＣ－３．４によりＩＣ５０＜５０ｎＭ、表１）。他のネオエピトープは、より低い結合性予測スコアを示し、それらの免疫原性がより低いかもしれないことを示唆した。公開されているＨ－２Ｄｂ及びＨ－２Ｋｂの結晶構造及びＲｏｓｅｔｔａベースのアルゴリズムを利用して、ＭＨＣＩと複合した変異体ペプチドのそれぞれをモデル化し、各ネオエピトープにおける変異体残基がＴ細胞受容体と相互作用する可能性を解析した。一般に、ディスプレイされたペプチドのＴＣＲ認識は、ペプチド残基３から７との相互作用により媒介される。高い結合性スコアを有するペプチドのなかでも、Ｒｅｐｓ１及びＡｄｐｇｋにおいてのみ、ペプチドはこの範囲内で変異を有する。構造モデル化はまた、変異された残基が、溶媒接触面に向かって配向され、したがって、免疫原性である良好な可能性を有すると判断されることを予測した（表１及び図３）。他方、Ｉｒｇｑ、Ａａｔｆ、Ｄｐａｇｔ１ネオエピトープにおける変異は、ペプチドのＣ末端近傍に見出され、これはＴＣＲ結合領域の外側に当たる可能性が高く、これらのネオエピトープが免疫原性である可能性が低いことを示唆する（表１及び図３）。
【0132】
次に、変異腫瘍抗原の免疫原性を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、アジュバントと組み合わせた変異エピトープをコードする長いペプチドで免疫化することにより評価し、ＭＨＣＩ／ペプチド特異的デキストラマーを使用してＣＤ８ Ｔ細胞応答を測定した。図４Ａに示すとおり、アジュバントのみの群と比較して、６つのペプチドのうち３つがＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発した。Ｒｅｐｓ１及びＡｄｐｇｋは、構造及び結合親和性予測に基づいて免疫原性であることが予測され、両方が強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発した。非免疫原性であると予測された４つのペプチドのうち、Ｄｐａｇｔ１のみが弱いＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導した。
【0133】
これらの変異ペプチドの免疫原性を、腫瘍の文脈において腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）を解析することにより確証した。Ｒｅｐｓ１、Ａｄｐｇｋ、及びＤｐａｇｔ１に特異的なＴ細胞が、腫瘍床において富化することが観察された（図４Ｂ）。不均一性があったとはいえ、Ａｄｐｇｋ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、３つのうちで最も豊富であり、これは、ＭＣ－３８腫瘍に特異的だった。なぜなら、Ａｄｐｇｋ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は同系ＴＲＡＭＰ－Ｃ１腫瘍において検出されなかったからである。興味深いことに、質量分析により同定された単一のがん精巣自己抗原（ＭＡＧＥ－Ｄ１）に由来するペプチドは、貧弱な免疫原性を示し、ＭＡＧＥ－Ｄ１に特異的なＣＤ８ Ｔ細胞は腫瘍床において検出できなかった（データは示さず）。
【0134】
バルクＴＩＬが通常は、抗腫瘍応答をモニタリングするために解析され、これは真の評価を提供しないことがありうる。なぜなら、ＴＩＬのほんのわずかしか腫瘍特異的でないからである。バルクＴＩＬと比較した抗腫瘍ＴＩＬの頻度及び表現型を、３つの免疫原性ペプチドについてＭＨＣＩ／ペプチド特異的デキストラマーを使用して調べた。腫瘍に浸潤する腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は最初は増加したが、腫瘍がさらに増殖するにつれて減少し、腫瘍における腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度との腫瘍増殖の逆相関を示唆した（図４Ｃ）。興味深いことに、大多数（７６．９±７．１％）の腫瘍特異的ＣＤ８ ＴＩＬが、バルクＴＩＬ（５２．６±３．６％）と比較して、Ｔ細胞消耗のマーカーであるＰＤ－１及びＴＩＭ－３を共発現した（図４Ｄ）。腫瘍特異的ＣＤ８ ＴＩＬはまた、高レベルの表面ＰＤ－１を発現した。
【0135】
ネオエピトープに対して誘導されたＣＤ８ Ｔ細胞が、防御性抗腫瘍免疫を提供できるかどうかを決定するため、健常マウスを変異ペプチドワクチンで免疫化し、続いてＭＣ－３８腫瘍細胞でチャレンジした。アジュバントのみと比較して、ワクチン群のほとんどの動物において、腫瘍増殖が完全に阻害された（図５Ａ）。この実験において腫瘍が増殖した単一の動物は、実際にはワクチンに応答しておらず、変異ペプチドに特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答が防御を付与する可能性を強く支持する（図５Ａ）。
【0136】
次に、ネオエピトープ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を、腫瘍を有するマウスにおいて免疫化時にそれらがさらに増幅されうるかどうかを確認するために評価した。単回の免疫化後、Ａｄｐｇｋ反応性ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度が、無感作健常動物と比較して腫瘍を有するマウスの脾臓において顕著に増加した（図４Ｂ）。腫瘍における全ＣＤ８ ＴＩＬのなかでもＡｄｇｐｋ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の蓄積におけるほぼ３倍の増加もまた観察された（図５Ｂ）。ペプチドワクチン接種はまた、腫瘍におけるＣＤ４５＋細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤全体を増加させ、これは、腫瘍における全生細胞のなかでもネオエピトープ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度のほぼ２０倍の増加をもたらした（図５Ｃ）。
【0137】
さらに、ワクチン接種により誘導されたペプチド特異的細胞の表現型を解析した。ＴＩＭ－３＋ ＰＤ－１＋ Ａｄｇｐｋ特異的ＣＤ８ ＴＩＬの頻度がワクチン接種後に低減し、これらの細胞上のＰＤ－１及びＴＩＭ－３の表面発現もまた低減したことが見出された（図５Ｄ及び図５Ｅ）。これはアジュバント効果でありうる。なぜならそれは、アジュバントのみの群にも見られたからである。この結果は、腫瘍特異的Ｔ細胞が、ワクチン接種後により低い消耗表現型を示すことを示唆し、これは、ワクチン接種された腫瘍におけるＩＦＮ－γ発現ＣＤ８及びＣＤ４ ＴＩＬのより高いパーセンテージによりさらに確証された（図５Ｆ）。
【0138】
最後に、腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞におけるこれらのワクチン誘導された定性的及び定量的変化を、確立された腫瘍の退縮に変換できるかどうかが評価された。このより困難な治療設定においてさえも、ワクチン接種されたマウスは、未処置コントロール又はアジュバントのみの群と比較して、腫瘍増殖の顕著な阻害を示した（図５Ｇ）。したがって、予測されたネオエピトープでの単純なペプチドワクチン接種が、十分なＴ細胞免疫を生成し、以前に確立された腫瘍を拒絶した。
【0139】
方法
ＭＨＣＩペプチドプロファイリングを、Ｈ－２ｂバックグラウンドの２つのマウス細胞株、ＴＲＡＭＰ－Ｃ１（ＡＴＣＣ）及びＭＣ－３８（Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ Ｌｅｉｄｅｎ）のＨ－２Ｋｂ及びＨ－２Ｄｂリガンドームについて実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する細胞を、以前に記述されたとおり調製した。細胞株を調製する方法の完全な記載については、米国特許出願第１３／０８７９４８号及び米国特許出願第１１／００４７４号を参照する。各試料のＭＨＣＩ分子を、２つの異なる抗体を使用して免疫沈降し、Ｈ－２Ｋｂ特異的及びＨ－２Ｄｂ特異的ペプチドをそれぞれ抽出した。ペプチドを、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ系、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により、１８０分勾配を使用して分離した。溶出したペプチドを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてデータ依存取得（ＤＤＡ）により解析した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＴＯＰ３についてＲ＝３０，０００、ＴＯＰ５についてＲ＝６０，０００）における高質量精度のフルスキャン（サーベイスキャン）を含む方法を使用してマススペクトルデータを取得し、５つの最も豊富な前駆体イオン（ＴＯＰ５）についてＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）において、又は、３つの最も豊富な前駆体イオン（ＴＯＰ３）についてＬＴＱにおいてのいずれかで、ＭＳ／ＭＳ（プロファイル）スキャンを続けた。７回の反復された注射及び解析が、試料の各セットについて実施された。
ＭＨＣＩペプチドプロファイリングを、Ｈ－２ｂバックグラウンドの２つのマウス細胞株、ＴＲＡＭＰ－Ｃ１（ＡＴＣＣ）及びＭＣ－３８（Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ Ｌｅｉｄｅｎ）のＨ－２Ｋｂ及びＨ－２Ｄｂリガンドームについて実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する細胞を、以前に記述されたとおり調製した。細胞株を調製する方法の完全な記載については、米国特許出願第１３／０８７９４８号及び米国特許出願第１１／００４７４号を参照する。各試料のＭＨＣＩ分子を、２つの異なる抗体を使用して免疫沈降し、Ｈ－２Ｋｂ特異的及びＨ－２Ｄｂ特異的ペプチドをそれぞれ抽出した。ペプチドを、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ系、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により、１８０分勾配を使用して分離した。溶出したペプチドを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてデータ依存取得（ＤＤＡ）により解析した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＴＯＰ３についてＲ＝３０，０００、ＴＯＰ５についてＲ＝６０，０００）における高質量精度のフルスキャン（サーベイスキャン）を含む方法を使用してマススペクトルデータを取得し、５つの最も豊富な前駆体イオン（ＴＯＰ５）についてＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）において、又は、３つの最も豊富な前駆体イオン（ＴＯＰ３）についてＬＴＱにおいてのいずれかで、ＭＳ／ＭＳ（プロファイル）スキャンを続けた。７回の反復された注射及び解析が、試料の各セットについて実施された。
【0140】
変異体ＭＣ－３８及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１抗原ペプチドの同定に対応する合成ペプチドを、ＬＴＱ－Ｏｒｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で解析し、ＡＤＶＡＮＣＥ源（Ｍｉｃｈｒｏｍ－Ｂｒｕｋｅｒ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用して、１．２ｋＶのスプレー電圧でイオン化した。Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいてｍ／ｚ４００で６０，０００Ｍ／ΔＭの分解能で１つのフルＭＳスキャン（３７５～１６００ｍ／ｚ）からなる方法を使用してマススペクトルデータを取得し、ペプチド断片イオンのＬＴＱにおいてＭＳ／ＭＳ（セントロイド）スキャンを続けた。
【0141】
ＭＣ－３８及びＴＲＡＭＰ－Ｃ１がん細胞株からの１μｇの全ＲＮＡを、ＴｒｕＳｅｑＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ）を使用してＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを生成するために使用した。全ＲＮＡを細胞株から精製し、２００～３００塩基対（ｂｐ）に断片化し、２６０ｂｐの平均長だった。ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーをマルチプレックス化（１レーン当たり２つ）し、ＨｉＳｅｑ ２０００上で製造者の推奨に従いシークエンシングした（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）。
【0142】
約５千万よりも多いペアードエンド（２×１００ｂｐ）シークエンシングリードを、１試料当たり生成した。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｍｅキット（５０Ｍｂ）（Ａｇｌｉｅｎｔ、ＣＡ）を使用して、エクソーム捕捉を実施した。次に、エクソーム捕捉ライブラリーを、ＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）上で、ＨｉＳｅｑシークエンシングキットを使用してシークエンシングした（２００サイクル）。
【0143】
９２９０万のＲＮＡ断片をＭＣ－３８から、６５３０万をＴＲＡＭＰ－Ｃ１からシークエンシングした。エクソームシークエンシングについて、６０００万リードを、各細胞株からシークエンシングした。リードを、ＧＳＮＡＰ（Wu及びNacu, Bioinformatics, 2010, v.26, 873-881）を使用してマウスゲノム（ＮＣＢＩビルド３７又はｍｍ９）にマッピングした。ユニークマッピングされたリードだけをさらなる分析のために維持した。８０６０万のＲＮＡ断片がＭＣ－３８試料において、５７６０万がＴＲＡＭＰ－Ｃ１試料においてユニークマッピングされた。５０９０万のエクソーム断片がＭＣ－３８において、５２００万の断片がＴＲＡＭＰ－Ｃ１においてユニークマッピングされた。マウス遺伝子モデルを得るため、Ｒｅｆｓｅｑマウス遺伝子を、ＧＭＡＰを使用してｍｍ９ゲノムにマッピングし、次に、ゲノム配列を遺伝子モデルを製造するために使用した。
【0144】
エクソーム－ｓｅｑベースの変異体を、ＧＡＴＫ１を使用して呼び出した。１０％以上の対立遺伝子頻度を有する変異体を維持した。変異体に、転写物に対する効果について変異体効果プレディクターツール２を使用してアノテートした。アミノ酸変化を解釈できる変異体のみを維持した。発現の証拠を有する変異体を得るために、エクソームベースの変異体位置を、ＲＮＡ－Ｓｅｑリードアラインメントで差異の証拠について確認した。２つを超えるＲＮＡ－Ｓｅｑリードにより実証され、ＲＮＡ－Ｓｅｑに基づいて１０％以上の対立遺伝子頻度で発現した変異体を維持した。
【0145】
各アミノ酸差異について、変異体全タンパク質配列を生成し、ＬＣ－ＭＳスペクトルを検索するための基準データベースとして寄与する推定タンパク質のセットを形成した。ハプロタイプ情報なしでは、同じタンパク質における複数の差異は、データベースにおいて別個の変異体タンパク質として特徴づけられる。
【0146】
タンデムマススペクトル結果を、連結ターゲットデコイデータベースＵｎｉｐｒｏｔバージョン２０１１＿１２又はマウスタンパク質及び通常の実験室夾雑物、たとえばトリプシンを含むトランスクリプトーム生成ＦＡＳＴＡデータベースに対して、Ｍａｓｃｏｔアルゴリズムバージョン２．３．０２（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を使用したタンパク質データベース検索のために提示した。データを、酵素特異性なし、メチオニン酸化（＋１５．９９５Ｄａ）、及び２０ｐｐｍ前駆イオン質量許容差で検索した。
【0147】
断片イオン質量許容差を、ＬＴＱ又はＯｒｂｉｔｒａｐにおいて取得されたＭＳ／ＭＳデータについて、それぞれ０．８Ｄａ又は０．０５Ｄａで特定した。検索結果を、線形判別アルゴリズム（ＬＤＡ）を使用して、５％の推定ペプチド偽発見率（ＦＤＲ）までフィルタリングした。変異体ペプチド同定のより高い信頼性のため、データを、Ｈ－２Ｋｂデータについて８及びＨ－２Ｄｂについて９のペプチド長か、又は正規表現を用いることのいずれかによりさらにフィルタリングし、以下の十分に特徴を明らかにされたアンカーモチーフ、Ｈ－２Ｋｂ：ＸＸＸＸ［ＦＹ］ＸＸ［ＭＩＬＶ］（配列番号２２）及びＨ－２Ｄｂ：ＸＸＸＸ［Ｎ］ＸＸＸ［ＭＩＬ］（配列番号２３）で、ペプチドを単離した。合成ペプチドを、配列を検証するために生成した。
【0148】
第１のモデルの生成について、ペプチド－ＭＨＣ複合体構造を、変異体ペプチドとモデル構造におけるペプチドとの間の配列類似性に基づいてＰＤＢから選択した。各変異体ペプチドモデルについて、以下のＰＤＢコード、Ｒｅｐｓ１、２ＺＯＬ ４；Ａｄｐｇｋ、１ＨＯＣ ５；Ｄｐａｇｔ１、３Ｐ９Ｌ ６；Ｃｐｎｅ１、１ＪＵＦ７；Ｉｒｇｑ、１ＦＦＮ ８；Ａａｔｆ、１ＢＺ９を使用した。Ｍｅｄ１２ペプチドは、合理的な開始モデルとして使用できる１０アミノ酸長ペプチドと複合した公開されたＨ－２Ｋｂ結晶構造の欠如により、モデル化されなかった。次に、ペプチドを、ＣＯＯＴ １０を使用して変異体形態へと修飾した。次に、これらの第１のモデルを、Ｒｏｓｅｔｔａ ＦｌｅｘＰｅｐＤｏｃｋウェブサーバー１１を使用して最適化し、最高点モデルをディスプレイのために選択した。
【0149】
各ペプチドについての最高点ＦｌｅｘＰｅｐＤｏｃｋモデルもまた調査され、生成された上位１０のモデルについて骨格配置が類似することが見出された。ペプチド－ＭＨＣＩ画像を、Ｐｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用して生成した。
【0150】
年齢マッチングされた６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ＰＢＳ中でアジュバント（５０μｇの抗ＣＤ４０ＡｂクローンＦＪＫ４５プラス１００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））とそれぞれ組み合わせた長いペプチド５０ｍｇを腹腔内注射した。マウスを第０日及び第１４日に免疫化し、最終注射１週間後に、血液又は脾細胞のいずれかを、Ａｇ－特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の検出のために使用した。ペプチド特異的Ｔ細胞を同定するために、細胞をＰＥコンジュゲートデキストラマー（ＭＨＣＩ／ペプチド複合体；Ｉｍｍｕｄｅｘ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で２０分間染色し、続いて、細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＢ２２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ペプチド配列は以下のとおりである。Ｒｅｐｓ１：ＧＲＶＬＥＬＦＲＡＡＱＬＡＮＤＶＶＬＱＩＭＥＬＣＧＡＴＲ（配列番号１）、Ａｄｐｇｋ：ＧＩＰＶＨＬＥＬＡＳＭＴＮＭＥＬＭＳＳＩＶＨＱＱＶＦＰＴ（配列番号２）、Ｄｐａｇｔ１：ＥＡＧＱＳＬＶＩＳＡＳＩＩＶＦＮＬＬＥＬＥＧＤＹＲ（配列番号３）、Ａａｔｆ：ＳＫＬＬＳＦＭＡＰＩＤＨＴＴＭＳＤＤＡＲＴＥＬＦＲＳ（配列番号４）、Ｉｒｇｑ：ＫＡＲＤＥＴＡＡＬＬＮＳＡＶＬＧＡＡＰＬＦＶＰＰＡＤ（配列番号５）、Ｃｐｎｅ１：ＤＦＴＧＳＮＧＤＰＳＳＰＹＳＬＨＹＬＳＰＴＧＶＮＥＹ（配列番号６）、Ｍｅｄ１２：ＧＰＱＥＫＱＱＲＶＥＬＳＳＩＳＮＦＱＡＶＳＥＬＬＴＦＥ（配列番号７）。
【0151】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に、１×１０５のＭＣ－３８腫瘍細胞を皮下移植した。全腫瘍を単離し、コラゲナーゼ及びＤＮＡａｓｅで消化し、ＴＩＬを単離した。ＴＩＬを、（上述のとおり）デキストラマーで染色し、続いて、ＣＤ４５、Ｔｈｙ１．２、ＣＤ４、ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＤ－１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＴＩＭ－３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体で染色した。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を、生細胞上でゲート開閉するために使用した。
【0152】
すべての動物に、ハンクス平衡塩溶液及びフェノールレッドフリーマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中に懸濁された１×１０５のＭＣ－３８細胞を皮下接種（右後側腹部）した。予防研究のため、マウスをアジュバント（５０ｍｇの抗ＣＤ４０プラス１００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ））又は５０μｇのＲｅｐｓ１、Ａｄｐｇｋ及びＤｐａｇｔ１ペプチドをそれぞれ伴うアジュバントで、腫瘍接種の３週前に免疫化した。ペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導を、腫瘍細胞の接種の１日前に血中で測定した。腫瘍を有するマウスにおけるワクチン接種のため、１×１０５のＭＣ－３８腫瘍細胞での接種１０日後（第１０日におよそ１００～１５０ｍｍ３の体積を有する腫瘍のみが研究に含まれた）に、マウスにアジュバント又は５０μｇのＲｅｐｓ１、Ａｄｐｇｋ、及びＤｐａｇｔ１ペプチドをそれぞれ伴うアジュバントを注射した。測定値及び体重を１週間に２回収集した。初期体重の１５％を超える体重減少を示す動物を毎日体重測定し、初期体重の２０％を超えて減少した場合、安楽死させた。
【0153】
有害な臨床的問題を示した動物を、重症度に応じて１日毎まで、より頻繁に観察し、瀕死状態になった場合に安楽死させた。マウスは、腫瘍体積が３，０００ｍｍ３を超えた場合か、又は腫瘍が形成されなかった場合は３カ月後に、安楽死させた。研究全体を通じて、すべてのマウスの臨床観察を１週間に２回実施した。
【0154】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A-B】
【図4C-D】
【図5A-B】
【図5C-D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【配列表】