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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-14
(45)【発行日】2022-11-22
(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の誘導方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20221115BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20221115BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/0789
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019134543
(22)【出願日】2019-07-22
(65)【公開番号】P2021016356
(43)【公開日】2021-02-15
【審査請求日】2021-05-27
(73)【特許権者】
【識別番号】500409219
【氏名又は名称】学校法人関西医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】保坂 直樹
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－２５０７１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／１４３５２９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
Ｃ１２Ｎ ５／０７８９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
人工多能性幹細胞から誘導した胸腺上皮細胞と、造血幹細胞を含む細胞集団を共培養する工程を含む、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の誘導方法であって、前記造血幹細胞を含む細胞集団が、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１陽性細胞を実質的に含まない誘導方法であって、
前記実質的に含まないとは、前記造血幹細胞を含む細胞集団において、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１の発現量がフローサイトメトリ法、及びＲＴ－ＰＣＲ法による検出において検出限界以下であることを示す、
前記誘導方法。
【請求項2】
前記造血幹細胞を含む細胞集団が、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１陽性細胞をネガティブセレクションにより除去した細胞集団である、請求項１に記載の誘導方法。
【請求項3】
前記共培養がインターロイキン２及びインターロイキン７の存在下で行われる、請求項１又は２に記載の誘導方法。
【請求項4】
前記胸腺上皮細胞が、人工多能性幹細胞をアクチビンＡと、塩化リチウムとの存在下で培養する第１の工程と、アクチビンＡと、塩化リチウムと、ＦＧＦ８との存在下で培養する第２の工程と、塩化リチウムと、ＦＧＦ７と、ＦＧＦ１０と、ＢＭＰ４との存在下で培養する第３の工程と、を含む方法により誘導されたものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の誘導方法。
【請求項5】
前記共培養が、無血清培地を使用して行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の誘導方法。
【請求項6】
前記Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞が、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞治療の適用対象者と免疫学的な適合性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書には、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の誘導方法が開示される。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞（以下、「γδＴ細胞」と称する場合がある）は、免疫担当細胞の一種であり、癌や感染症に有効であることが報告されている。近年、このようなＴ細胞受容体γδ陽性細胞の特性を生かした治療法に関する臨床研究が進められている（非特許文献１～３）。
また、特許文献１及び２には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞受容体γδ陽性細胞を増殖させる方法が記載されている。
特許文献３には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胸腺上皮細胞を多能性幹細胞から分化誘導させる方法が記載されている。
また、特許文献１及び２には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞受容体γδ陽性細胞を増殖させる方法が記載されている。
特許文献３には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胸腺上皮細胞を多能性幹細胞から分化誘導させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特許５５２４０５６号公報
【文献】特開２０１１－２５０７１１号公報
【文献】国際公開第２０１０／１４３５２９号
【非特許文献】
【0004】
【文献】ガンマ・デルタＴ細胞療法、医療法人社団聖有会内藤メディカル・クリニック、Ｗｅｂページｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｏｃｔｏｒ－ｎａｉｔｏ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｉｔｙ／ｇｄｔ．ｈｔｍｌ、２０１８年６月５日
【文献】ガンマ・デルタＴ細胞療法、医療法人社団聖有会滉志会瀬田クリニックグループ、Ｗｅｂページｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊ－ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ｃｏｍ／ｇｄｔ／、２０１８年６月５日
【文献】ゾレドロン酸誘導γδＴ細胞を用いた免疫療法、慶應義塾大学病院、Ｗｅｂページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｓｐ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ａｂｏｕｔ／ｙａｋｕｗａｒｉ／ｓｅｎｓｈｉｎ／ｓｅｎｓｈｉｎ１３．ｈｔｍｌ、２０１８年６月５日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記特許文献１及び２に記載の方法は、患者末梢血から採取したｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞受容体γδ陽性細胞を増殖させる方法である。Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の供給源を患者本人に依存した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖回数が制限されるという問題がある。また、化学療法及び／又は放射線療法を受けた患者、免疫抑制剤の投与を受けた患者、骨髄移植施行直後の患者では、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞自体の数が減少しているため、治療に必要な細胞数を確保することが困難であるといった問題がある。
さらに、従来行われているＴ細胞受容体γδ陽性細胞の増殖方法は、培養を行う際に培地に動物血清を使用しており、感染症のリスクが高い等の問題もある。
さらに、従来行われているＴ細胞受容体γδ陽性細胞の増殖方法は、培養を行う際に培地に動物血清を使用しており、感染症のリスクが高い等の問題もある。
【0006】
本発明は、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞を単に増殖させるだけでなく、骨髄細胞からＴ細胞受容体γδ陽性細胞を分化誘導することを一課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、Ｔ細胞の分化に必要な支持細胞である胸腺上皮細胞（以下、「ＴＥＣ」と称する場合がある）を、人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」と称する場合がある）から分化させ、骨髄細胞と共培養することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞受容体γδ陽性細胞させることができることを見出した。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
【0008】
項１．人工多能性幹細胞から誘導した胸腺上皮細胞と、造血幹細胞を含む細胞集団を共培養する工程を含む、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の誘導方法であって、前記造血幹細胞を含む細胞集団が、白血球マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１陽性細胞を実質的に含まない、
誘導方法。
項２．前記造血幹細胞を含む細胞集団が、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１陽性細胞をネガティブセレクションにより除去した細胞集団である、項１に記載の誘導方法。
項３．前記共培養がインターロイキン２及びインターロイキン７の存在下で行われる、項１又は２に記載の誘導方法。
項４．前記胸腺上皮細胞が、人工多能性幹細胞をアクチビンＡと、塩化リチウムとの存在下で培養する第１の工程と、アクチビンＡと、塩化リチウムと、ＦＧＦ８との存在下で培養する第２の工程と、塩化リチウムと、ＦＧＦ７と、ＦＧＦ１０と、ＢＭＰ４との存在下で培養する第３の工程と、を含む方法により誘導されたものである、項１～３のいずれか一項に記載の誘導方法。
項５．前記共培養が、無血清培地を使用して行われる、項１～４のいずれか一項に記載の誘導方法。
項６．前記Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞が、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞治療の適用対象者と免疫学的な適合性を有する、項１～５のいずれか一項に記載の誘導方法。
誘導方法。
項２．前記造血幹細胞を含む細胞集団が、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１陽性細胞をネガティブセレクションにより除去した細胞集団である、項１に記載の誘導方法。
項３．前記共培養がインターロイキン２及びインターロイキン７の存在下で行われる、項１又は２に記載の誘導方法。
項４．前記胸腺上皮細胞が、人工多能性幹細胞をアクチビンＡと、塩化リチウムとの存在下で培養する第１の工程と、アクチビンＡと、塩化リチウムと、ＦＧＦ８との存在下で培養する第２の工程と、塩化リチウムと、ＦＧＦ７と、ＦＧＦ１０と、ＢＭＰ４との存在下で培養する第３の工程と、を含む方法により誘導されたものである、項１～３のいずれか一項に記載の誘導方法。
項５．前記共培養が、無血清培地を使用して行われる、項１～４のいずれか一項に記載の誘導方法。
項６．前記Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞が、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞治療の適用対象者と免疫学的な適合性を有する、項１～５のいずれか一項に記載の誘導方法。
【発明の効果】
【0009】
Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】in vitroでのTECの分化誘導方法の概略を示す。
【図2】in vitroでの分化誘導されているTECの細胞像を示す。
【図3】Aは、in vitroでの分化誘導されているTECの細胞数を示す。Bは、in vitroでの分化誘導されているTECの遺伝子発現を示す。
【図4】iPS細胞のCD45のcongenic typeを示す。
【図5】HSC-eBMC（造血幹細胞濃縮骨髄細胞）の精製の概要を示す。
【図6】BMCとHSC-eBMCにおけるCD34、CD117(c-kit)の発現を示す。
【図7】BMCとHSC-eBMCにおけるCD45.1及びTCRγδ、 TCRβの発現を示す。
【図8】IL-2／IL-７の存在下でのTECとHSC-eBMCの共培養の細胞像を示す。
【図9】TECとHSC-eBMCの共培養による誘導リンパ球数の変化を示す。
【図10】誘導リンパ球におけるCD45.1 とCD45.2の発現を示す。
【図11】１群の誘導リンパ球におけるCD45.1陽性γδT細胞の割合を示す。
【図12】誘導リンパ球内CD45.1陽性細胞におけるアネキシンV陽性apoptotic及び陰性non-apoptotic（live）細胞のFACS profileによる同定法を示す。
【図13】CD45.1陽性non-apoptotic細胞におけるT、B、及びNK細胞マーカーの発現を示す図である。
【図14】CD45.1陽性non-apoptotic細胞におけるCD3とTCRγδ及びTCRβの発現を示す図である。
【図15】1群、2群の誘導リンパ球におけるCD3の遺伝子発現を示す図である。
【図16】1群、2群の誘導リンパ球におけるTCRγδのレパトア遺伝子発現を示す図である。
【図17】ソーティングによるCD45.1陽性-γδT細胞の精製方法のスキームを示す。
【図18】ソーティングによって精製されたCD45.1陽性-γδT細胞の形態を示す。
【図19】ソーティングによって精製されたCD45.1陽性-γδT細胞のCD45のcongenic typeの解析結果を示す。
【図20】CD45.2陽性マウスに移植されたCD45.1陽性-γδT細胞を示す。
【図21】誘導されたγδＴ細胞の白血病への効果を示す。（A）無処置群（n=16）、誘導リンパ球移植群（n=10）、及び抗TCRγδ抗体で前処理した誘導リンパ球移植群(n=10)の生存率、（B）無処置及び誘導リンパ移植マウスの典型的な肉眼解剖像を示す。
【図22】無処置（上段）及び誘導リンパ球移植（下段）マウスの典型的な肝臓、肺、腎臓、及び脾臓の組織像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書に開示されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）γδ陽性細胞の誘導方法は、人工多能性幹細胞から誘導した胸腺上皮細胞と、造血幹細胞を含む細胞集団を共培養する工程を含む。
【0012】
１．人工多能性幹細胞からの胸腺上皮細胞の誘導
（１）人工多能性幹細胞
本明細書において、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）とは、体細胞をリプログラミングすることにより、多能性を獲得された細胞である限り制限されない。
（１）人工多能性幹細胞
本明細書において、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）とは、体細胞をリプログラミングすることにより、多能性を獲得された細胞である限り制限されない。
【0013】
体細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ等の哺乳動物である限り制限されない。好ましくは、体細胞は、後述する造血幹細胞を含む細胞集団と、同じ動物種であることが好ましい。より好ましくは、体細胞は、後述する造血幹細胞を含む細胞集団とジェノタイプ、表面マーカーのフェノタイプ等で識別可能であり得る。
【0014】
人工多能性幹細胞は、公知の方法により製造することができる。例えば、体細胞がマウス由来である場合、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＶＯＬ．４ ＮＯ．１２ ２００９）、マウスｉＰＳ細胞の改良型樹立方法（ＣｉＲＡ Ｍ＆Ｍ， ２００８年７月１７日公開）等に記載の方法により人工多能性幹細胞を製造することができる。また、体細胞がヒト由来である場合、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｕｎｅ， ２００９ （０１ Ｊｕｎｅ ２００９， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／９７８０４７０１５１８０８．ｓｃ０４ａ０２ｓ９）、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ＣｉＲＡ Ｍ＆Ｍ， ２００９年３月５日公開）、Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｎｄｅｒ ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ （ＣｉＲＡ＿Ｆｆ－ｉＰＳＣ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿Ｅｎｇ＿ｖ１４０３１０、２０１４年３月１１日公開）、エピソーマルベクターを用いたヒトｉＰＳ細胞樹立方法（ＣｉＲＡ Ｍ＆Ｍ， ２０１１年４月４日公開）、エピソーマルベクターを用いた末梢血からのｉＰＳ細胞樹立方法（ＣｉＲＡ Ｍ＆Ｍ， ２０１３年１月１０日公開）等に記載の方法により、人工多能性幹細胞を製造することができる。
【0015】
人工多能性幹細胞は、セルバンク等から入手してもよい。例えば、理化学研究所バイオリソース研究センター細胞材料開発室からは、ヒト由来の人工多能性幹細胞（ＨＰＳ０００３、ＨＰＳ０００９、ＨＰＳ００２９、ＨＰＳ０２２３等）、マウス由来人工多能性幹細胞（ＡＰＳ０００１、ＡＰＳ０００２、ＡＰＳ０００３、ＡＰＳ０００４、ＡＰＳ０００５、ＡＰＳ０００６、ＡＰＳ０００７等）及びウサギ由来の人工多能性幹細胞（ＡＰＳ０００８、ＡＰＳ０００９、ＡＰＳ０００１０、ＡＰＳ０００１１等）等を入手することができる。
【0016】
（２）人工多能性幹細胞の維持方法
人工多能性幹細胞を維持するための培養方法は、公知の方法にしたがって行ってもよい。
人工多能性幹細胞を維持するための培養方法は、公知の方法にしたがって行ってもよい。
【0017】
分化誘導前の人工多能性幹細胞は、例えば、ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等を基本培地として、２－メルカプトエタノール、グルタマックス、抗生物質、ＬＩＦ、マウス胎生線維芽細胞（ＭＥＦ）の培養上清を添加した維持培地により維持することができる。人工多能性幹細胞の維持は、ディッシュ又はシャーレは、細胞接触面を、あらかじめゼラチン等でコーティングしておくことが好ましい。
【0018】
分化誘導前の人工多能性幹細胞の維持培地として、具体的には、０．１ｍＭ程度の２－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ程度のグルタマックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌ程度のペニシリン－５０ｍｇ／ｍｌ程度のストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％程度のＥＳ ｇｒａｄｅウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１０３ ユニット／ｍｌ程度のＬＩＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）加ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）にてＭＥＦを培養した上清とを１：１に混合した培地を使用することができる。
購入した分化誘導前の人工多能性幹細胞は、未分化性を維持するため液体窒素に保存されている。解凍後の細胞は、洗浄後、１０ｃｍディッシュあたり２～４×１０５個程度となるように播種することができる。細胞の継代の際には０．２５％ トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でディッシュから解離させて、人工多能性幹細胞を回収することができる。
購入した分化誘導前の人工多能性幹細胞は、未分化性を維持するため液体窒素に保存されている。解凍後の細胞は、洗浄後、１０ｃｍディッシュあたり２～４×１０５個程度となるように播種することができる。細胞の継代の際には０．２５％ トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でディッシュから解離させて、人工多能性幹細胞を回収することができる。
【0019】
人工多能性幹細胞は、３７℃程度、ＣＯ２濃度５％程度に維持した湿式インキュベーター内で、上記維持培地で維持し得る。はじめの継代から、２日から４日程度、好ましくは３日程度維持し得る。
【0020】
（３）胸腺上皮細胞の誘導
人工多能性幹細胞からの胸腺上皮細胞の誘導方法は、少なくとも、
アクチビンＡと、塩化リチウムとの存在下で培養する第１の工程と、
アクチビンＡと、塩化リチウムと、ＦＧＦ８との存在下で培養する第２の工程と、
塩化リチウムと、ＦＧＦ７と、ＦＧＦ１０と、ＢＭＰ４との存在下で培養する第３の工程とを含む。
人工多能性幹細胞からの胸腺上皮細胞の誘導方法は、少なくとも、
アクチビンＡと、塩化リチウムとの存在下で培養する第１の工程と、
アクチビンＡと、塩化リチウムと、ＦＧＦ８との存在下で培養する第２の工程と、
塩化リチウムと、ＦＧＦ７と、ＦＧＦ１０と、ＢＭＰ４との存在下で培養する第３の工程とを含む。
【0021】
第１の工程において、人工多能性幹細胞を分化誘導するための分化誘導基本培地として、例えばＳ－Ｃｌｏｎｅ ＳＦ－０３ （エーディア株式会社、三光純薬、東京、日本；以下、「ＳＦ－０３」と称する）培地、ＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、ＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ（共にＡＨＳ 味の素ヘルシーサプライ株式会社）等の培地を使用することができる。マウス由来の人工多能性幹細胞を分化誘導する場合にはＳＦ－０３培地を使用することが好ましい。また、ヒト由来の人工多能性幹細胞を分化誘導する場合にはＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、ＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ等の培地を使用することが好ましい。
【0022】
第１の工程において、人工多能性幹細胞は、分化誘導基本培地に、例えば２－メルカプトエタノール、塩化リチウム、アクチビンＡを加えた第１の誘導培地を使用することができる。この場合２－メルカプトエタノールは、終濃度で０．０１ｍＭ～１ｍＭ程度、好ましくは０．０５ｍＭ～０．５ｍＭ程度、より好ましくは０．０８～０．５ｍＭ程度、さらに好ましくは０．１ｍＭ程度添加することができる。塩化リチウムは、終濃度で０．０５ｍＭ～１０ｍＭ程度、好ましくは１ｍＭ～８ｍＭ程度、より好ましくは４ｍＭ～６ｍＭ程度、さらに好ましくは５ｍＭ程度添加することができる。アクチビンＡは、終濃度で１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは８ｎｇ／ｍｌ～１２ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。アクチビンＡは、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から入手することができる。
【0023】
人工多能性幹細胞は、分化誘導時に分化誘導基本培地に、例えばＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ、以下、「Ｒｈｏ結合キナーゼ」ともいう）阻害剤を添加してもよい。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えばＹ－２７６３２（和光純薬工業、２５３－００５１１）を例示することができる。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤の添加量は、例えば終濃度で０．５ｍＭ～５０ｍＭ程度、好ましくは１ｍＭ～２０ｍＭ程度、より好ましくは５ｍＭ～１５ｍＭ程度、さらに好ましくは１０ｍＭ程度である。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは分化誘導基本培地としてＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、ＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ等の培地を使用する際に添加することができる。
【0024】
人工多能性幹細胞を培養するためのディッシュ又はシャーレは、細胞接触面を、あらかじめＩＶ型コラーゲン溶液か、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１ Ｅ８：ニッピ、８９２００１／８９２００２）、ビトロネクチン溶液等を使用してコーティングしておくことが好ましい。
【0025】
ＳＦ－０３培地を使用する場合、０．１ｍｇ／ｍｌ～０．３ｍｇ／ｍｌ程度のＩＶ型コラーゲン溶液を使用して、ディッシュ又はシャーレの細胞接触面をコーティングすることができる。コーティング方法は公知である。例えば、ＩＶ型コラーゲン溶液をディッシュ又はシャーレ内に添加し、上澄み液を回収後常温で３０分～１時間静置し、細胞培養用の培地で洗浄することにより使用できる。ＩＶ型コラーゲンは、例えば新田ゼラチン（大阪、日本）から入手することができる。
【0026】
ＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、又はＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ培地を使用する場合、ディッシュ又はシャーレの細胞接触面は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１はコーティングしておくことが好ましい。Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１ Ｅ８は、コート量が：０．５μｇ／ｃｍ２程度となるように、ディッシュ又はシャーレに添加し後、３７℃程度、ＣＯ２濃度５％程度に維持した湿式インキュベーターで、例えば１時間以上静置した後、Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１ Ｅ８を捨て、細胞培養用の培地で洗浄することにより行うことができる。
【0027】
以下、本明細書において細胞培養のために使用されるディッシュ又はシャーレは、上記コーティングを行ったものを意図する。
【0028】
第１の工程の培養条件は、３７℃程度、ＣＯ２濃度５％程度に維持した湿式インキュベーター内で２日～５日程度、好ましくは４日程度である。
【0029】
第２の工程は、第１の工程で使用した第１の誘導培地を、以下に説明する第２－１の誘導培地、あるいは第２－２の誘導培地に置き換え、引き続き人工多能性幹細胞を培養することにより行うことができる。
【0030】
第２－１の誘導培地は、ＳＦ－０３培地等の分化誘導基本培地に、第１の誘導培地と同濃度の２－メルカプトエタノール、塩化リチウムを加えとともに、アクチビンＡを加え、さらに線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）を添加することにより調製することができる。アクチビンＡは、終濃度で０．０５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは３ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。ＦＧＦ８は、終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは２ｎｇ／ｍｌ～８ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。
【0031】
第２－２の誘導培地は、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、又はＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ培地の分化誘導基本培地に第１の誘導培地と同様にＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を加え、さらに、第２－１の誘導培地を使用する場合と同様の濃度でアクチビンＡとＦＧＦ８を添加することにより調製することができる。
【0032】
第２の工程の培養条件は、３７℃程度、ＣＯ２濃度５％程度に維持した湿式インキュベーター内で２日～５日程度、好ましくは４日程度である。
【0033】
第３の工程は、第２－１の誘導培地を第３－１の誘導培地に置き換える、あるいは第２－２の誘導培地を第３－２の誘導培地に置き換え、引き続き人工多能性幹細胞を培養することにより行うことができる。
【0034】
第３－１の誘導培地は、ＳＦ－０３培地等の分化誘導基本培地に、第１の誘導培地と同濃度の２－メルカプトエタノール、塩化リチウムを加え、さらに線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）及び骨形成因子４（ＢＭＰ４）を添加することにより調製することができる。ＦＧＦ７は、終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。ＦＧＦ１０は、終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。ＢＭＰ４は、終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。
【0035】
第３－２の誘導培地は、例えばＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、又はＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ培地等の分化誘導基本培地に第１の誘導培地と同様にＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を加え、さらに、第３－１の誘導培地を使用する場合と同様の濃度でＦＧＦ７と、ＦＧＦ１０と、ＢＭＰ４を添加することにより調製することができる。
【0036】
第３の工程の培養条件は、３７℃程度、ＣＯ２濃度５％程度に維持した湿式インキュベーター内で少なくとも７日程度、好ましくは７日～２０日程度、より好ましくは７日～１４日程度である。
【0037】
このような誘導方法により、人工多能性幹細胞から、胸腺上皮細胞を誘導することができる。誘導された胸腺上皮細胞は、多能性幹細胞転写因子マーカーであるＮａｎｏｇを実質的に発現しておらず、胸腺器官形成に関わるＦｏｘｎ１、Ｈｏｘａ３、Ｐａｘ１、Ｐａｘ９と、機能に関わるＦＧＦＲ２、ＡＩＲＥ及び上皮性マーカーであるＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣＤ）、Ｋ５、Ｋ８、及びＰｌｅｔ－１よりなる群から選択される少なくとも一種のマーカーを発現していることが好ましい。ここで、「実質的に発現していない」とは、フローサイトメトリ法やＲＴ－ＰＣＲ法によりマーカーの発現量が検出限界以下と判断できる場合をいう。
【0038】
ここで、人工多能性幹細胞から胸腺上皮細胞を誘導する際には、培地に動物血清あるいは動物血漿を添加しないことが好ましい。動物血清等の添加を避けることにより、プリオン病等の感染症のリスクを低減することが可能となる。
【0039】
上記の方法で調製された胸腺上皮細胞は、以下のＴ細胞受容体γδ陽性細胞を分化誘導のために使用することができる。
【0040】
２．Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の分化誘導方法
本実施形態は、造血幹細胞を含む細胞集団から、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞を分化誘導する方法を含む。
本実施形態は、造血幹細胞を含む細胞集団から、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞を分化誘導する方法を含む。
【0041】
（１）造血幹細胞を含む細胞集団
造血幹細胞を含む細胞集団には、例えば、骨髄から採取された細胞集団、臍帯血から採取された細胞集団等を含み得る。造血幹細胞を含む細胞集団は、セルバンク、骨髄バンク、臍帯血バンク等から入手してもよい。
造血幹細胞を含む細胞集団には、例えば、骨髄から採取された細胞集団、臍帯血から採取された細胞集団等を含み得る。造血幹細胞を含む細胞集団は、セルバンク、骨髄バンク、臍帯血バンク等から入手してもよい。
【0042】
造血幹細胞を含む細胞集団は、造血幹細胞から誘導されるＴ細胞受容体γδ陽性細胞の使用目的に応じた動物種から採取することができる。特に、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞を移植に使用する場合には、移植の適用者（レシピエント）と免疫学的に適合することが好ましい。免疫学的に適合するとは、移植治療を中止しなければならない重篤な拒絶反応をレシピエントの体内で起こさないことをいう。拒絶反応には、レシピエントの免疫系が移植されたＴ細胞受容体γδ陽性細胞を拒絶する反応、及び移植されたＴ細胞受容体γδ陽性細胞による対レシピエント反応を含み得る。
【0043】
免疫学的に適合するとは、例えば、６種類のＨＬＡ抗原の内、５抗原以上一致することをいう。
造血幹細胞を含む細胞集団は、採取された骨髄又は臍帯血をそのまま使用してもよいが、造血幹細胞の含有割合が高くなるように富化して使用する方が得られるγδ陽性Ｔ細胞の純度は高くなる。
造血幹細胞を含む細胞集団は、採取された骨髄又は臍帯血をそのまま使用してもよいが、造血幹細胞の含有割合が高くなるように富化して使用する方が得られるγδ陽性Ｔ細胞の純度は高くなる。
【0044】
造血幹細胞の富化は、公知の方法にしたがって行うことができる。例えば、セルソーター、又は磁気ビーズ等を使用して、少なくともＣＤ３４或いはＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）を発現する細胞を採取する方法を挙げることができる。また、磁気ビーズ等を使用して、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１を発現する細胞をネガティブセレクション等により除去することで、造血幹細胞の富化を行ってもよい。言い換えると、造血幹細胞を含む細胞集団は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７１、Ｂ２２０、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ－１、及びＮＫ１．１陽性細胞を実質的に含まないことが好ましい。ここで、「実質的に含まない」とは、前記表面マーカーの陽性細胞を意図的に残さないことを意味する。好ましくは、「実質的に含まない」とは、フローサイトメトリ法やＲＴ－ＰＣＲ法によりマーカーの発現量が検出限界以下と判断できる場合をいう。
【0045】
（２）Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞の分化誘導
上記２．（１）で取得した造血幹細胞を含む細胞集団を、上記１．（３）に記載の方法で誘導された胸腺上皮細胞と共培養することで、γδ受容体陽性Ｔ細胞を誘導する。
上記１で誘導された胸腺上皮細胞が付着したディッシュ又はシャーレに、上記２．（１）で採取した造血幹細胞を含む細胞集団を添加し、共培養を開始する。胸腺上皮細胞と造血幹細胞を含む細胞集団の細胞数の割合は、３０：１～３：１程度、好ましくは１５：１～５：１程度とすることが好ましい。
上記２．（１）で取得した造血幹細胞を含む細胞集団を、上記１．（３）に記載の方法で誘導された胸腺上皮細胞と共培養することで、γδ受容体陽性Ｔ細胞を誘導する。
上記１で誘導された胸腺上皮細胞が付着したディッシュ又はシャーレに、上記２．（１）で採取した造血幹細胞を含む細胞集団を添加し、共培養を開始する。胸腺上皮細胞と造血幹細胞を含む細胞集団の細胞数の割合は、３０：１～３：１程度、好ましくは１５：１～５：１程度とすることが好ましい。
【0046】
共培養を行うための培地には、第１の誘導培地と同濃度の２－メルカプトエタノールを添加したＳＦ－０３培地か、第１の誘導培地と同濃度の２－メルカプトエタノールとＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加したＳｔｅｍＦｉｔ（商標）Ｂａｓｉｃ０２、又はＳｔｅｍＦｉｔ（商標）ＡＫ０２Ｎ培地に、さらにインターロイキン２（ＩＬ－２）及びインターロイキン７（ＩＬ－７）を添加することが好ましい。ＩＬ－２は、終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。ＩＬ－７は、終濃度で０．５ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。ＩＬ－２及びＩＬ－７を添加することにより、γδ受容体陽性Ｔ細胞を分化誘導できるだけでなく、γδ受容体陽性Ｔ細胞の細胞数を増やすことができる。
【0047】
共培養は、胸腺上皮細胞に造血幹細胞を含む細胞集団を添加してから、３７℃程度、ＣＯ２濃度５％程度に維持した湿式インキュベーター内で、少なくとも７日程度、好ましくは７日～２１日程度、より好ましくは７日～１４日程度行うことができる。
胸腺上皮細胞と造血幹細胞を含む細胞集団とを共培養することにより、少なくとも共培養開始から７日目からγδ受容体陽性Ｔ細胞を確認することができる。
胸腺上皮細胞と造血幹細胞を含む細胞集団とを共培養することにより、少なくとも共培養開始から７日目からγδ受容体陽性Ｔ細胞を確認することができる。
【0048】
共培養により、分化誘導された細胞が、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞であるか否かは、Ｔ細胞受容体γδの発現をフローサイトメトリ法、又はＲＴ－ＰＣＲ法により確認することができる。
【0049】
さらに得られたγδ受容体陽性Ｔ細胞は、セルソーター、磁気ビーズ、パンニング等の手法により精製することができる。特に、胸腺上皮細胞を誘導した人工多能性幹細胞がｃ－ｍｙｃ ｃＤＮＡを導入して製造された細胞である場合には、発がん性を避ける点から、得られたγδ受容体陽性Ｔ細胞を精製することが好ましい。
【0050】
上記方法により得られたＴ細胞受容体γδ陽性細胞は、腫瘍や感染症を治療又は予防するための免疫療法に使用することができる。
【0051】
ここで、造血幹細胞を含む細胞集団からγδ受容体陽性Ｔ細胞を誘導する際には、培地に動物血清あるいは動物血漿を添加しないことが好ましい。言い換えると、Ｔ細胞受容体γδ陽性細胞を分化するための培地は、無血清培地であることが好ましい。動物血清等の添加を避けることにより、プリオン病等の感染症のリスクを低減することが可能となる。
【実施例】
【0052】
以下に実施例を示して本開示の具体的な内容を説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
【0053】
なお、本実施例における動物実験は、関西医科大学動物実験委員会の審査および学長の承認を得て行った。C57BL/6マウスは、清水実験材料株式会社（静岡、日本）から購入した。また、CD45.1 congenic B6マウスは、RIKENバイオリソースセンター（RIKEN BRC、茨城、日本）から購入した。
【0054】
１．人工多能性幹細胞からの胸腺上皮細胞の誘導
（１）胸腺上皮細胞の分化誘導
図１に概要を示す。マウス人工多能性幹細胞（iPS細胞：APS0001）はRIKEN BRCから購入した。iPS細胞を培養するための基本培地としてSF-03 (三光純薬、東京、日本)培地を使用した。2×105個のiPS細胞は、0.1 mM ２－メルカプトエタノール(2ME)と、5 mM塩化リチウム (SIGMA、St Louis, MO, USA)と、10 ng/ml アクチビンＡ (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)を加えたSF-03培地 10 mlで4日間 、0.1～0.3 mg/ml IV型コラーゲン（新田ゼラチン、大阪、日本）をコーティングした10 cmディッシュで培養した。その後、0.1 mM 2ME、5 mM塩化リチウム、4 ng/ml Fibroblast growth factor (FGF) 8 (R&D systems)及び5 ng/mlアクチビンＡを加えたSF-03培地に置き換え3日間培養した。続いて、0.1mM 2ME、 5 mM塩化リチウム, 20 ng/ml FGF7 (R&D systems)、10 ng/ml FGF10 (R&D systems) 及び10 ng/ml bone morphogenetic protein (BMP)4 (R&D systems)を加えたSF-03培地に置き換え、計3週間培養を続けた。このプロトコールでは、14日目以降にTECとして使用できるようになった。細胞の特性を観察するため、37℃で0.25% トリプシン-EDTA (GIBCO, Grand Island, NY, USA)で2分間接着細胞を処理して細胞を回収した。
（１）胸腺上皮細胞の分化誘導
図１に概要を示す。マウス人工多能性幹細胞（iPS細胞：APS0001）はRIKEN BRCから購入した。iPS細胞を培養するための基本培地としてSF-03 (三光純薬、東京、日本)培地を使用した。2×105個のiPS細胞は、0.1 mM ２－メルカプトエタノール(2ME)と、5 mM塩化リチウム (SIGMA、St Louis, MO, USA)と、10 ng/ml アクチビンＡ (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)を加えたSF-03培地 10 mlで4日間 、0.1～0.3 mg/ml IV型コラーゲン（新田ゼラチン、大阪、日本）をコーティングした10 cmディッシュで培養した。その後、0.1 mM 2ME、5 mM塩化リチウム、4 ng/ml Fibroblast growth factor (FGF) 8 (R&D systems)及び5 ng/mlアクチビンＡを加えたSF-03培地に置き換え3日間培養した。続いて、0.1mM 2ME、 5 mM塩化リチウム, 20 ng/ml FGF7 (R&D systems)、10 ng/ml FGF10 (R&D systems) 及び10 ng/ml bone morphogenetic protein (BMP)4 (R&D systems)を加えたSF-03培地に置き換え、計3週間培養を続けた。このプロトコールでは、14日目以降にTECとして使用できるようになった。細胞の特性を観察するため、37℃で0.25% トリプシン-EDTA (GIBCO, Grand Island, NY, USA)で2分間接着細胞を処理して細胞を回収した。
【0055】
（２）分化の確認
図２にDay4、Day 7、Day 14及びDay 21の分化誘導細胞の位相差顕微鏡像を示す。Day 4では球状をしていたiPS細胞(黒矢印)が、Day７では紡錘形に変化し分化し始めた（白矢印）。以降さらに細胞数が増え、細胞形態も紡錘形の成熟上皮細胞の形態を呈した。Day 14で紡錘形の細胞さらに増殖し、球状の細胞は殆ど見られなかった（黒矢頭）。Day 21では、細胞数はDay 14と比較してやや増殖したが、細胞形態に差は認められなかった（白矢頭）。図３（A）に細胞数の変化を示す。Day 4から細胞が増殖し始め、Day 14から２１でほぼフラットとなった。図３（B）に上記分化誘導においてiPS細胞がTECに分化していることの遺伝子発現（RT-PCR）を示す。方法は、細胞からTrisol (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, USA)を使ってtotal RNAを抽出した。１μgのtotal RNA をランダムプライマー (東洋紡、大阪、日本)を使って逆転写し、cDNAを調製した。PCRに使用したプライマーを表１に示す。PCRは、94 ℃1分、55 ℃15秒、68℃30秒を30サイクル行った。耐熱性DNAポリメラーゼは、Tks Gflex DNA polymerase (タカラ、東京、日本)を使用した。新生仔期胸腺(NT)は陽性対照で、GAPDHは内部標準である。Nanogは未分化胚細胞のマーカーであり、培養１４日以降はごく僅かか殆ど検出されなかった。胸腺器官形成に関わるFoxN1、Hoxa3、Pax1、Pax9、機能に関するFGFR2、AIRE、及び上皮性マーカーであるECD, K5, K8及びplet-1は培養前或いは後から発現し、特に14-21日目にはNT同様ほぼ全ての発現が認められた。CD3はT細胞のマーカーであるが、培養中に発現は見られなかった。これらの結果は以前のiPS細胞からTECへの誘導報告とも殆ど一致する（Inami et al, Immunology and Cell Biology, 2011）。以上の結果から、上記分化誘導によってTECが誘導された事が示された。
図２にDay4、Day 7、Day 14及びDay 21の分化誘導細胞の位相差顕微鏡像を示す。Day 4では球状をしていたiPS細胞(黒矢印)が、Day７では紡錘形に変化し分化し始めた（白矢印）。以降さらに細胞数が増え、細胞形態も紡錘形の成熟上皮細胞の形態を呈した。Day 14で紡錘形の細胞さらに増殖し、球状の細胞は殆ど見られなかった（黒矢頭）。Day 21では、細胞数はDay 14と比較してやや増殖したが、細胞形態に差は認められなかった（白矢頭）。図３（A）に細胞数の変化を示す。Day 4から細胞が増殖し始め、Day 14から２１でほぼフラットとなった。図３（B）に上記分化誘導においてiPS細胞がTECに分化していることの遺伝子発現（RT-PCR）を示す。方法は、細胞からTrisol (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, USA)を使ってtotal RNAを抽出した。１μgのtotal RNA をランダムプライマー (東洋紡、大阪、日本)を使って逆転写し、cDNAを調製した。PCRに使用したプライマーを表１に示す。PCRは、94 ℃1分、55 ℃15秒、68℃30秒を30サイクル行った。耐熱性DNAポリメラーゼは、Tks Gflex DNA polymerase (タカラ、東京、日本)を使用した。新生仔期胸腺(NT)は陽性対照で、GAPDHは内部標準である。Nanogは未分化胚細胞のマーカーであり、培養１４日以降はごく僅かか殆ど検出されなかった。胸腺器官形成に関わるFoxN1、Hoxa3、Pax1、Pax9、機能に関するFGFR2、AIRE、及び上皮性マーカーであるECD, K5, K8及びplet-1は培養前或いは後から発現し、特に14-21日目にはNT同様ほぼ全ての発現が認められた。CD3はT細胞のマーカーであるが、培養中に発現は見られなかった。これらの結果は以前のiPS細胞からTECへの誘導報告とも殆ど一致する（Inami et al, Immunology and Cell Biology, 2011）。以上の結果から、上記分化誘導によってTECが誘導された事が示された。
【0056】
【表1】
【0057】
TECを誘導したiPS細胞が内在性に持つ白血球共通抗原であるCD45遺伝子のcongenic typeをPCRで調べた。PCRは、表１に示すプライマーを用いて行った。CD45.1 (Ly5.1)又はCD45.2 (Ly5.2)に対するプライマーをセンスプライマーとし、Common CD45 (Ly5)プライマーをアンチセンスプライマーとした。細胞からDNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)にてDNAを抽出し、98 ℃ 10秒、55 ℃ 30秒、72 ℃ 1分を30サイクル行った。耐熱性DNAポリメラーゼとして、Ex Taq DNA polymerase (タカラ、東京、日本)を使用した。陽性対照はC57BL/6 CD45.1とCD45.2マウスのそれぞれの脾臓細胞を使用した。
【0058】
図４に結果を示す。iPS細胞はCD45.2 typeである為、CD45 congenic typeをマーカーとすることで、以下の共培養実験において誘導される細胞が、骨髄細胞由来(CD45.1)であるか、マウスiPS細胞由来(CD45.2)であるかを識別することが可能となる。
【0059】
２．iPS細胞から分化した胸腺上皮細胞と骨髄造血幹細胞の共培養
（１）造血幹細胞濃縮骨髄細胞(HSC-eBMC, Hematopoetic Stem Cells-enriched BMC)の精製
図５に示すプロトコールにしたがって、６～８週のC57BL/6 CD45.1マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水に浮遊させた後、70μmのナイロンセルストレーナー(Coring, NY, USA)で濾過した。次にFicoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を使った密度勾配遠心法により、低比重単核細胞分画(<1.077g/mL)を回収した。回収した細胞をlineage maker抗体カクテル (Rat IgG：CD3, CD4, CD8,CD11b, CD71, B220, TER119, Gr-1, NK1.1)(BioLgend and BD Pharmingen, San Diego, USA)と反応させ、２回洗浄後、anti-Rat IgG binding Magnetic Beads (Dynal Inc., Oslo, Norway)と反応させた。上記カクテル抗体とMagnetic Beadsに結合した細胞を磁気的に除去し、結合しなかった細胞、すなわちネガティブセレクションされた細胞をHSC-eBMCとして回収した。
（１）造血幹細胞濃縮骨髄細胞(HSC-eBMC, Hematopoetic Stem Cells-enriched BMC)の精製
図５に示すプロトコールにしたがって、６～８週のC57BL/6 CD45.1マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水に浮遊させた後、70μmのナイロンセルストレーナー(Coring, NY, USA)で濾過した。次にFicoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を使った密度勾配遠心法により、低比重単核細胞分画(<1.077g/mL)を回収した。回収した細胞をlineage maker抗体カクテル (Rat IgG：CD3, CD4, CD8,CD11b, CD71, B220, TER119, Gr-1, NK1.1)(BioLgend and BD Pharmingen, San Diego, USA)と反応させ、２回洗浄後、anti-Rat IgG binding Magnetic Beads (Dynal Inc., Oslo, Norway)と反応させた。上記カクテル抗体とMagnetic Beadsに結合した細胞を磁気的に除去し、結合しなかった細胞、すなわちネガティブセレクションされた細胞をHSC-eBMCとして回収した。
【0060】
回収されたHSC-eBMCが造血幹細胞を含みかつ濃縮されている事を確認するため、HSC-eBMCを回収する前の骨髄細胞（BMC）とHSC-eBMCに対して、CD34抗体とCD117(c-kit)抗体を反応させFACSにより解析した。結果を図６に示す。BMCではCD34とCD117を両方とも発現する陽性は1.1％程度であるが、HSC-eBMCでは30.4％であった。よって造血幹細胞が約30%程濃縮されていることが示された。
【0061】
次に、BMCに含まれる成熟T細胞がHSC-eBMCへ精製するに伴い除去されている事を同様にFACSにて調べた。白血球マーカーとしてCD45.1を使用し、γδ受容体陽性T細胞のマーカーとしてTCRγδを使用し、αβ受容体陽性T細胞のマーカーとしてTCRβを使用した。結果を図７に示す。BMCには、CD45.1及びTCRγδ陽性細胞が2.5％程度、TCRβ陽性細胞が5.7％程度含まれていた。しかしHSC-eBMCではCD45.1を高発現する細胞は殆ど認めず、わずかにCD45.1を低発現するTCRγδ或いはTCRβ陽性細胞がそれぞれ0.4%程見られるのみであった。以上の結果から、HSC-eBMCにはγδ或いはαβ受容体陽性T細胞を含め成熟したリンパ球は殆ど含まれていない事が示唆された。
【0062】
（２）HSC-eBMCとTECの共培養
HSC-eBMCとTECの共培養を以下の４群のパターンで行い、その効果を評価した。培地は0.1ｍM 2MEを加えたSF-03を使用した。（１）－２でiPS細胞から分化させたTECが付着した10 cmディッシュに、HSC-eBMCを１.5×105個となるように播種した。培養は播種した日をDay 0とし、Day 21まで観察した。IL-2とIL-7はPEPROTEC (Rocky Hill, USA)を使用した。誘導リンパ球は回収した後、70μm Pre-separation filter (Mil Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)にて濾過した。
HSC-eBMCとTECの共培養を以下の４群のパターンで行い、その効果を評価した。培地は0.1ｍM 2MEを加えたSF-03を使用した。（１）－２でiPS細胞から分化させたTECが付着した10 cmディッシュに、HSC-eBMCを１.5×105個となるように播種した。培養は播種した日をDay 0とし、Day 21まで観察した。IL-2とIL-7はPEPROTEC (Rocky Hill, USA)を使用した。誘導リンパ球は回収した後、70μm Pre-separation filter (Mil Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)にて濾過した。
【0063】
TECとIL2及びIL7の組み合わせの群を、以下に示す。
１群：HSC-eBMC＋TEC＋IL-2 20 ng/ml＋IL-7 10 ng/ml
２群：HSC-eBMC＋TEC
３群：HSC-eBMC＋IL-2 20 ng/ml＋IL-7 10 ng/ml
４群：HSC-eBMC
１群：HSC-eBMC＋TEC＋IL-2 20 ng/ml＋IL-7 10 ng/ml
２群：HSC-eBMC＋TEC
３群：HSC-eBMC＋IL-2 20 ng/ml＋IL-7 10 ng/ml
４群：HSC-eBMC
【0064】
図８に３群（HSC-eBMC +IL-2＋IL-7）と１群（HSC-eBMC＋TEC＋IL-2＋IL-7）の細胞の様子を示す。(i)に示す３群ではDay 7では細胞の増殖は殆ど認められなかった（黒矢印）。一方(ii)に示す1群では、Day 7でTECに付着して増殖・浮遊するリンパ球様の細胞が多数誘導された。白矢頭は増殖したTECを示し、黒矢頭は誘導リンパ球を示す。(iii) (iv)にて示すDay 14, 21では誘導リンパ球は次第に減少し、死細胞が増えていった（白矢印）。
【0065】
図９に各群のディッシュ中の誘導リンパ球数の変化を示す。１群はDay 7に著明なの細胞数の増加を認め、その後は徐々に減少した。２群は、１群ほどの細胞数の増加は認めなかったが、３群及び４群と比較して有意な増加が認められた。３群及び４群では細胞数の増加はほとんど認められなかった。
【0066】
以上の結果から、本実験系でリンパ球誘導を誘導させるためには、TECが必要であることが示唆された。さらにIL-2とIL-7を添加することにより、著明に細胞数が増加する事が判明した。
【0067】
次に誘導リンパ球を回収し、CD45のcongenic typeを解析した。図10の上段は、CD45.1及びCD45.2のそれぞれのマウスの脾臓のリンパ球のポピュレーションのFACS解析の結果を示す（陽性対照）。下段は、１群(IL-2及びIL-7プラス)及び２群（IL-2及びIL-7マイナス）の誘導リンパ球の同様の解析結果を示す。縦軸は、D45.1の蛍光強度を示し、横軸はCD45.2の蛍光強度を示す。１群と２群との間で割合に違いはあるものの、CD45.1陽性細胞のみが誘導され、両群ともCD45.2陽性細胞は検出されなかった。このことから誘導リンパ球はiPS細胞由来ではなく、HSC-eBMCに由来すると考えられた。
【0068】
次に１群の誘導リンパ球のリンパ球表面マーカーのFACS解析を行った。表面マーカーとしてCD45.1、TCRγδを使用した。結果を図１１に示す。図１１左は培養前のHSC-eBMC、図１１真ん中は培養７日目の１群の誘導リンパ球、図１１右は陽性対照として胸腺から回収した胸腺細胞を示す。横軸はTCRγδの蛍光強度を示し、縦軸はCD45.1を示す。分画内の数字はリンパ球のパーセントを示す。この解析により、１群の誘導リンパ球には、CD45.1陽性のγδT細胞が多く含まれることが明らかとなった。その割合は全誘導リンパ球中約20％程度であった。
【0069】
一般的に細胞は培養により細胞死(apoptosis)を起こす。これらは最終的にdebrisとなるが、FACSでも認識され非特異反応を呈し解析を難しくする。よってCD45.1陽性かつ生きた（non-apoptotic）細胞中でサブセットを解析する為、以下の方法を行った。図１２に示す通りに（Day 7 誘導リンパ球）、まずCD45.1と側方散乱光のプロット上でCD45.1陽性細胞にゲーティング(Gate 1)を行う。次にGate1の細胞の中で、前方及び側方散乱光のプロットを行う。するとおおよそGate 2-1,Gate 2-2の2つのリンパ球のpopulationが現れる。この２つのpopulationにてapoptosisに陥った細胞が発現するアネキシンVは、Gate2-１が陽性、Gate2-2が陰性となる。よってGate2-2がCD45.1由来のnon-apoptoticなリンパ球となり、以降のリンパ球サブセットの解析はこの細胞集団にて行う（本方法は過去の論文でも報告されている）。
【0070】
図１３にて、CD45.1陽性細胞由来non-apoptotic細胞のT細胞マーカー、B細胞マーカー及びNK細胞マーカーのそれぞれのFACSの解析結果を示す。上段は１群、２群、下段は陽性対象としての胸腺細胞の解析結果を示す。この結果、１群及び２群で誘導されるリンパ球の多くがγδ陽性T細胞であることが示された。特に１群ではγδ陽性T細胞が約54％を占めていた。また他のT細胞のマーカーであるTCRβ,CD4, CD8及びNK細胞のマーカーであるNK1.1, B細胞のマーカーであるB220は殆ど見られなかった。また図には示さないが、Day 14でもほぼ同じ結果であった。以上の結果は、誘導される生きた細胞はほぼγδ陽性T細胞に限定されている事を示している。
【0071】
１群及び２群のCD45.1陽性由来non-apoptoticリンパ球にて、T細胞の活性化機能分子であるCD3の発現をFACSで解析した結果を図１４に示す。上段はTCRγδの解析結果であり、下段はTCRβの解析結果である。また左欄は１群（IL-2及びIL-7プラス）、中欄は２群（IL-2及びIL-7マイナス）、右欄は陽性対照として胸腺細胞を示す。１群では、TCRγδ陽性細胞にてCD3の発現が認められたが、２群では殆ど認められなかった。１、２群ともCD3陽性TCRβ細胞は誘導されない。以上の結果は、機能的なTCRγδ細胞を誘導するのは、IL-2及びIL-7が必要である事を示唆している。
【0072】
図１５に、１群及び２群の誘導リンパ球におけるCD3の遺伝子レベルでの発現をRT-PCRで解析した結果を示す。レーン１はDay 7の1群（IL-2及びIL-7プラス）、レーン2は同様にDay 7の2群（IL-2及びIL-7マイナス）の細胞、レーン3は陽性対照として新生仔期胸腺を示す。結果は1群のみにCD3の発現が見られ、CD3の発現にはIL-2とIL-7が必要である事が遺伝レベルでも確認された。
【0073】
図１７に、RT-PCRで１群（IL-2及びIL-7プラス）及び２群（IL-2及びIL-7マイナス）の誘導リンパ球におけるTCRγδのレパトア解析を行った結果を示す。PCRプライマーは、各TCR Vγ又はVδ遺伝子に対するプライマーをそれぞれセンス側プライマーとし、Commonγ又はCommonδをアンチセンス側プライマーとした。陽性対照として新生仔期胸腺(NT)を使用した。Day 0(培養前のHSC-eBMC)ではVγ或いはδの発現は認められなかったが、１群のDay 7ではVγ1-3, 2, 4, 6と Vδ4, 6, 7、 Day 14ではVγ1-3, 2, 4とVδ4, 5, 7の複数のVγ及びδのレパートリーが検出された。２群でも弱いながら、幾つかのレパートリーが検出された。このことから、HSC-eBMCから分化したγδT細胞は、モノクローナルな細胞集団ではなく、様々なTCRγδのレパートリーを有するポリクローナルな集団であることが示された。
【0074】
３．共培養で得られたγδT細胞の精製
次に、今回誘導されたγδT細胞を精製し形態観察を行った。そのスキームを図１７に示す。はじめに、TECとHSC-eBMCが共培養されているディッシュから誘導リンパ球とTECを回収した。TECはトリプシン-EDTA処理を行い回収した。さらに誘導リンパ球はFITC-抗CD45.1抗体とPerCP Cy5.5抗TCRγδ抗体との２重染色でFACSAriaを使ってソーティングを行い、両陽性細胞を回収し、形態学的な観察を行った。また誘導リンパ球、TEC、及び精製細胞についてRT-PCRによるCD45のcongenic typeの解析も行った。
次に、今回誘導されたγδT細胞を精製し形態観察を行った。そのスキームを図１７に示す。はじめに、TECとHSC-eBMCが共培養されているディッシュから誘導リンパ球とTECを回収した。TECはトリプシン-EDTA処理を行い回収した。さらに誘導リンパ球はFITC-抗CD45.1抗体とPerCP Cy5.5抗TCRγδ抗体との２重染色でFACSAriaを使ってソーティングを行い、両陽性細胞を回収し、形態学的な観察を行った。また誘導リンパ球、TEC、及び精製細胞についてRT-PCRによるCD45のcongenic typeの解析も行った。
【0075】
図１８に形態学的な観察結果を示す。上段に示すようにFACSAriaで誘導リンパ球からCD45.1陽性-TCRγδ陽性の細胞（四角枠内）を精製した（左段）。陽性コントロールとして胸腺細胞を使用した（右段）。下段にソーティングされた細胞のギムザ染色像を示す。誘導リンパ球から精製されたCD45.1陽性-TCRγδ陽性細胞は胸腺CD45.1陽性-TCRγδ陽性細胞と同様に、単核リンパ球の形態を呈した。よって誘導されたγδT細胞は、ほぼin vivoで胸腺内で産生されるγδT細胞と同等の細胞と考えられた。
【0076】
図１９にTECとHSC-eBMCが共培養ディッシュから採取された誘導リンパ球、TEC、及びCD45.1陽性-TCRγδ陽性細胞のCD45のcongenic typeのPCRを示す。誘導リンパ球中のDNAは多くはHSC-eBMC由来を示すCD45.1 typeであったが、少量のTEC由来を示すCD45.2 typeも含まれていた。TECはその逆の結果であった。よってこれらの細胞には多少の共培養細胞の残存が含まれるものと考えられた。しかし、精製したCD45.1陽性-TCRγδ陽性T細胞からは、CD45.1 typeのみが検出された。このことからソーティングによりiPS細胞に由来する細胞が完全に除去され、骨髄細胞由来のみの細胞になっている事が示された。
【0077】
４．誘導CD45.1陽性γδT細胞のin vivoでの生着
近年γδ陽性T細胞は、主に癌や感染症のための治療剤として生体内で使用されている。よって上記１及び２の方法に従って誘導されたγδT細胞も生体内で生着するか否かを、誘導リンパ球をCD45.2タイプのマウスに移植する事により調べた。またiPS細胞は、発がんのリスクがあることが報告されている。上の実験でも示されたが誘導リンパ球には少量のiPS由来細胞が含まれている可能性もあるため、腫瘍の発生も併せて副作用も調べた。
近年γδ陽性T細胞は、主に癌や感染症のための治療剤として生体内で使用されている。よって上記１及び２の方法に従って誘導されたγδT細胞も生体内で生着するか否かを、誘導リンパ球をCD45.2タイプのマウスに移植する事により調べた。またiPS細胞は、発がんのリスクがあることが報告されている。上の実験でも示されたが誘導リンパ球には少量のiPS由来細胞が含まれている可能性もあるため、腫瘍の発生も併せて副作用も調べた。
【0078】
（１）方法
レシピエントであるCD45.2タイプのC57BL/6マウスに137Cs 放射線照射蔵置(Gammacell 40 Exactor; MDS Nordion International, Ottawa, ON, Canada)を使用して8 Gyの致死量の放射線を照射し骨髄を死滅させた。ドナーのCD45.2タイプのC57BL6マウスからの大腿骨と脛骨から骨髄細胞を採取し、シングル－セル浮遊液を調製した。放射線照射から5時間後に骨髄細胞1×107個と、iPS細胞から分化したTECとHSC-eBMCを7日間共培養し産生した誘導リンパ球3×106個をレシピエントマウスに移植した。
レシピエントであるCD45.2タイプのC57BL/6マウスに137Cs 放射線照射蔵置(Gammacell 40 Exactor; MDS Nordion International, Ottawa, ON, Canada)を使用して8 Gyの致死量の放射線を照射し骨髄を死滅させた。ドナーのCD45.2タイプのC57BL6マウスからの大腿骨と脛骨から骨髄細胞を採取し、シングル－セル浮遊液を調製した。放射線照射から5時間後に骨髄細胞1×107個と、iPS細胞から分化したTECとHSC-eBMCを7日間共培養し産生した誘導リンパ球3×106個をレシピエントマウスに移植した。
【0079】
（２）結果
図２０に結果を示す。移植から14日目に脾臓、腸管リンパ節、末梢血、胸腺から回収したリンパ球について、抗CD45.1抗体と抗TCRγδ抗体とを使ってFACS解析を行った。移植された宿主マウス由来γδT細胞はCD45.2タイプであるため、抗CD45.1抗体では検出されない。このため、TECとの共培養により誘導されたγδT細胞が生着していれば、図２１の左段にCD45.1陽性かつTCRγδ陽性細胞として検出される。今回の検討では、胸腺以外全てのリンパ系組織にCD45.1陽性細胞が見られ、主に腸管リンパ節にCD45.1陽性γδT細胞が検出された。なお、データとしては示さないが、細胞移植後1ヶ月にもCD45.1陽性γδT陽性が腸管リンパ節に残っていた。逆に、CD45.1陽性TCR陽性βはこの間殆ど見られなかった。また、移植を受けたマウスは少なくとも１０ヶ月以上健康に生存し、明らかな腫瘍の発生や自己免疫疾患等の副作用は認めなかった。
図２０に結果を示す。移植から14日目に脾臓、腸管リンパ節、末梢血、胸腺から回収したリンパ球について、抗CD45.1抗体と抗TCRγδ抗体とを使ってFACS解析を行った。移植された宿主マウス由来γδT細胞はCD45.2タイプであるため、抗CD45.1抗体では検出されない。このため、TECとの共培養により誘導されたγδT細胞が生着していれば、図２１の左段にCD45.1陽性かつTCRγδ陽性細胞として検出される。今回の検討では、胸腺以外全てのリンパ系組織にCD45.1陽性細胞が見られ、主に腸管リンパ節にCD45.1陽性γδT細胞が検出された。なお、データとしては示さないが、細胞移植後1ヶ月にもCD45.1陽性γδT陽性が腸管リンパ節に残っていた。逆に、CD45.1陽性TCR陽性βはこの間殆ど見られなかった。また、移植を受けたマウスは少なくとも１０ヶ月以上健康に生存し、明らかな腫瘍の発生や自己免疫疾患等の副作用は認めなかった。
【0080】
５．誘導したγδT 細胞の白血病への効果
ヒトへの治験でγδT 細胞は癌同様に血液系悪性腫瘍に効果を示しており、誘導されたγδT 細胞の白血病モデルマウスへの効果を調べた。
ヒトへの治験でγδT 細胞は癌同様に血液系悪性腫瘍に効果を示しており、誘導されたγδT 細胞の白血病モデルマウスへの効果を調べた。
【0081】
白血病細胞として、C57BL/6マウス由来T細胞性白血病細胞株であるEL-4細胞を用いた。C57BL/6マウスにEL-4細胞株1×106個を経静脈的に移入した後に、7日間HSC-eBMC と誘導したTECの共培養により産生した誘導リンパ球3×106個同様に移入した。一部の誘導リンパ球はin vitro及びin vivoにてγδT細胞の機能を阻害かつ削除する抗TCRγδ抗体 (GL3: BioLgend、1μg/106 cells)で4℃、10分間処理し、2回リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄後、同様にEL-4細胞を移入されたマウスに移植した。前処理を行う理由は、同数の誘導リンパ球内におけるγδT細胞の影響を調べる為である。以下、無処置群はn=16、誘導リンパ球移植群はn=10、及び抗TCRγδ抗体にて前処理した誘導リンパ球移植群はn=10として実験を行った。
【0082】
結果を図２１に示す（各群の生存率（A）、無処置（50日目、左）及び誘導リンパ移植（42日目、右）マウスの典型的な肉眼解剖像（B））。無処置マウスは、全て50日内に死亡した（図２１（A））。誘導リンパ球を移植したマウスは無処置群に比較し有意に生存率が改善し、約30% は長期（100日以上）に生存した。一方、抗TCRγδ 抗体を前処理した誘導リンパ球を投与した群は、無処置群と差は無かった。無処置群では、典型例にて、肉眼的に肝臓に最も多数の転移を認めた（図２１（B），白矢印）。しかし、誘導リンパ球移植マウスでは、肝臓はほぼ正常だった。さらに、図２２に無処置（上段）マウス及び誘導リンパ球移植マウス（下段）の典型的な肝臓、肺、腎臓、及び脾臓の組織像（HE染色、200倍: 挿入図:腫瘍細胞の拡大図）を示す。無処置マウスにおける組織学的な解析では肝臓だけでなく、肺、腎臓、脾臓にも腫瘍細胞の浸潤が見られた（図２２（B）上段、矢印）。しかし、誘導リンパ球を移植したマウスでは、これらの臓器において腫瘍細胞浸潤は殆ど見られなかった。誘導リンパ球を移植したに関わらず死亡したマウスでは同じく腫瘍の増大が見られた。また抗TCRγδ抗体を前処理した群では、腫瘍細胞のみを移入した群とほぼ同様の腫瘍の増大を認めた(data not shown)。以上の所見は、誘導リンパ球内におけるγδT細胞は、生体内で白血病細胞に一定の効果がある事を示唆している。
【0083】
以上の結果から、今回iPS細胞由来TECとHSC-eBMCの共培養により誘導されたγδT細胞は、移植かつ生着可能な細胞であることが判明した。腫瘍の発生や自己免疫疾患等の目立った副作用も無く、長期間生存した。また、生体内においては白血病へ有効である事も示唆された。本法はヒトの疾患へも応用できる可能性がある。その場合、現在骨髄バンクやiPSバンクが整備されつつあり、これらの細胞を使えば、自らの細胞を使う事なく短期間に治療に使用できる事も考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】