特許 7176801 変換方法、変換剤、ローヤルゼリー組成物の製造方法、及びラクトバチルス属細菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-14

(45)【発行日】2022-11-22

(54)【発明の名称】変換方法、変換剤、ローヤルゼリー組成物の製造方法、及びラクトバチルス属細菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20221115BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20221115BHJP

   C12P 7/6409 20220101ALI20221115BHJP

   A23L 33/00 20160101ALI20221115BHJP

   A23L 21/20 20160101ALI20221115BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z ZNA

C12N1/20 A

C12P7/6409

A23L33/00

A23L21/20

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021540969

(86)(22)【出願日】2020-08-19

(86)【国際出願番号】 JP2020031319

(87)【国際公開番号】W WO2021033726

(87)【国際公開日】2021-02-25

【審査請求日】2021-09-03

(31)【優先権主張番号】P 2019152210

(32)【優先日】2019-08-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-03106

(73)【特許権者】

【識別番号】598162665

【氏名又は名称】株式会社山田養蜂場本社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100211199

【弁理士】

【氏名又は名称】原田 さやか

(72)【発明者】

【氏名】板谷 颯

(72)【発明者】

【氏名】八巻 礼訓

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／２２１８４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／１０８３４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０１０９２３４６（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０９４０２１８２（ＣＮ，Ａ）

【文献】J. Vet. Med. Sci., 2014, Vol.76, No.4, pp.491-498

【文献】Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2018, Vol.68, pp.703-708

【文献】Database GenBank, [online], Accession No. AB777202 <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB777202> 2014.05.01, [検索日2020.10.02] Definition: Lactobacillus sp. DAT705 gene for 16S ribosomal RNA,partial sequence

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を１０－ヒドロキシ－２－デセン酸と反応させることを含む、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する方法。

【請求項2】

１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を、ローヤルゼリー中の１０－ヒドロキシ－２－デセン酸と反応させることを含む、ローヤルゼリー組成物の製造方法。

【請求項3】

１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を含む、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸から１０－ヒドロキシデカン酸への変換剤。

【請求項4】

ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）。

【請求項5】

１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有する、請求項４に記載の細菌。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変換方法、変換剤、ローヤルゼリー組成物の製造方法、及びラクトバチルス属細菌に関する。

【背景技術】

【0002】

１０－ヒドロキシ－２－デセン酸及び１０－ヒドロキシデカン酸は、天然のローヤルゼリーに含まれる成分である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】国際出願第２０１６／１７０９５９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ローヤルゼリーに含まれる成分によるいくつかの生理活性は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸よりも１０－ヒドロキシデカン酸において高いことが確認されている（例えば特許文献１）。１０－ヒドロキシ－２－デセン酸の存在は、１０－ヒドロキシデカン酸による生理活性を阻害する場合もある。

【0005】

本発明の一側面は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換することができる方法及び変換剤を提供することを目的とする。また、本発明の別の一側面は、１０－ヒドロキシデカン酸含有量が高められたローヤルゼリー組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明の別の一側面は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を高効率で１０－ヒドロキシデカン酸に変換することができるラクトバチルス属細菌を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一側面は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス属細菌を１０－ヒドロキシ－２－デセン酸と反応させることを含む、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する方法を提供する。

【0007】

上記製造方法において、ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・プランタルム、又は配列番号１若しくは２で特定される塩基配列に対して９５％以上の相同率を示す１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有する細菌であることが好ましい。

【0008】

本発明の別の一側面は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス属細菌を、ローヤルゼリー中の１０－ヒドロキシ－２－デセン酸と反応させることを含む、ローヤルゼリー組成物の製造方法を提供する。

【0009】

上記製造方法において、ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・プランタルム、又は配列番号１若しくは２で特定される塩基配列に対して９５％以上の相同率を示す１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有する細菌であることが好ましい。

【0010】

本発明の更に別の一側面は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス属細菌を含む、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸から１０－ヒドロキシデカン酸への変換剤を提供する。

【0011】

上記変換剤において、ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・プランタルム、又は配列番号１若しくは２で特定される塩基配列に対して９５％以上の相同率を示す１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有する細菌であることが好ましい。

【0012】

本発明の更にまた別の一側面は、配列番号１又は２で特定される塩基配列に対して９９％以上の相同率を示す１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス属細菌を提供する。

【0013】

上記ラクトバチルス属細菌は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するものであってよい。

【発明の効果】

【0014】

本発明の一側面によれば、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換することができる方法及び変換剤を提供することができる。また、本発明の別の一側面によれば、１０－ヒドロキシデカン酸含有量が高められたローヤルゼリー組成物を提供することができる。本発明の更に別の一側面によれば、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を高効率で１０－ヒドロキシデカン酸に変換することができるラクトバチルス属細菌を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書において、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸は、ｔｒａｎｓ－１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を指し、「１０－ＨＤＡ」とも表記される。本明細書において、１０－ヒドロキシデカン酸は「１０ＨＤＡＡ」とも表記される。

【0016】

［変換方法］
本発明の一側面は、１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換する方法（以下、単に「変換方法」ともいう。）に関する。該変換方法は、１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換する能力を有するラクトバチルス属細菌を１０－ＨＤＡと反応させることを含む。該ラクトバチルス属細菌と１０－ＨＤＡとを反応させることにより、１０－ＨＤＡの少なくとも一部を１０ＨＤＡＡに変換することができる。したがって本実施形態に係る変換方法は、該ラクトバチルス属細菌と１０－ＨＤＡとを反応させることにより１０ＨＤＡＡを生成する方法ということもできる。

【0017】

（ラクトバチルス属細菌）
本実施形態に係る変換方法において用いられるラクトバチルス属細菌は、１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換する能力を有するものであればよい。ラクトバチルス属細菌は、好気条件及び嫌気条件のいずれでも培養可能なものであることが好ましい。ラクトバチルス属細菌は、グルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、セロビオース及びラクチュロースからなる群から選ばれる１種以上の糖に対して資化性を示すものであることが好ましく、グルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、セロビオース及びラクチュロースに対して資化性を示すものであることがより好ましい。

【0018】

１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換する能力を有するラクトバチルス属細菌は、例えば、様々な環境から採取したラクトバチルス属細菌を単離し、それぞれの細菌を１０－ＨＤＡを含む培地中で培養し、１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能を評価し、変換能を有するものを選択して得ることができる。

【0019】

１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能は、例えば、１０－ＨＤＡを含む培地で細菌を培養することにより評価することができる。具体的には例えば、次の方法で評価することができる。１０－ＨＤＡを含む培地にサンプルを添加し、培養器中で適切な条件下（例えば３０～３７℃、ＭＲＳ培地）で培養する。得られた培養液の上清を採取する。培養液上清に含まれる１０－ＨＤＡ及び１０ＨＤＡＡの濃度を高速液体クロマトグラフィーによって測定する。培養前後の１０－ＨＤＡ及び１０ＨＤＡＡの濃度に基づき、変換能を評価する。

【0020】

本実施形態に係る変換方法において用いられるラクトバチルス属細菌は、１０－ＨＤＡを約０．１８％の濃度になるように添加したＭＲＳ液体培地（ｐＨ６．５）を用いて３５℃で１２０時間培養した後に培養液中に検出される１０ＨＤＡＡ量が、培養前に添加した１０－ＨＤＡ量の５質量％以上であるものであってよく、１０質量％以上、２０質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、９７質量％以上、９８質量％以上又は９９質量％以上であるものであることが好ましい。

【0021】

上述の方法で採取したサンプルから単離した細菌の同定、及び性質等の解析は、公知の種々の同定試験方法又は市販の同定キットを用いて行うことができる。また、１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を解析し、相同性検索等により細菌の同定を行うことができる。

【0022】

本実施形態に係る変換方法において用いられるラクトバチルス属細菌は、配列番号１又は２で特定される塩基配列に対して９５％以上の相同率を示す１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することが好ましい。このようなラクトバチルス属細菌は、１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能が高いため好ましい。ラクトバチルス属細菌の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、配列番号１又は配列番号２で特定される塩基配列に対する相同率が、９５％以上であってよく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．９％以上であることが好ましい。相同率は１００％であってもよい。

【0023】

本実施形態に係る変換方法において用いられるラクトバチルス属細菌は、例えば、ラクトバチルス・パニサピウム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓａｐｉｕｍ）であってもよい。ラクトバチルス・パニサピウムとしては、後述の実施例に示すＱＢ３－１－４、ＱＢ３－１－９、ＱＢ３－１－１０、ＱＢ３－２－４（これら４株を総称して「ラクトバチルス・パニサピウムＭ２株」とも称する。）又はＱＢ９－１－６（「ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株」とも称する。）であることが好ましい。これらの菌株は、１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能が極めて高いため好ましい。

【0024】

ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６として独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に寄託されており、入手可能である。

【0025】

本実施形態に係る変換方法において用いられるラクトバチルス属細菌は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株に対してＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）値が９８．３％以上であるものであってもよく、ＡＮＩ値が９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上のものであってもよい。ＡＮＩ値はＡＮＩ解析によりＡＮＩ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｖｅ－ｏｍｉｃｓ．ｃｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ａｎｉ／ｉｎｄｅｘ）を用いて算出することができる。

【0026】

本実施形態に係る変換方法において用いられるラクトバチルス属細菌は、例えば、ラクトバチルス・プランタルムであってもよい。ラクトバチルス・プランタルムとしては例えば、ラクトバチルス・プランタルムｂ２４０（ＦＥＲＭ ＢＰ－１００６５）であってよい。

【0027】

（基質）
本実施形態に係る変換方法における基質としては、合成又は単離された１０－ＨＤＡを単独で用いてもよく、１０－ＨＤＡ含有組成物を用いてもよい。１０－ＨＤＡ含有組成物としては、例えばローヤルゼリーであってよい。

【0028】

本実施形態に係る変換方法における基質としてのローヤルゼリーは、例えば生ローヤルゼリーであってよく、生ローヤルゼリーに処理を施したローヤルゼリー処理物であってもよい。生ローヤルゼリーは、例えば、常法に従い養蜂産品として入手することができる。

【0029】

ローヤルゼリー処理物としては、生ローヤルゼリーを濃縮又は希釈したローヤルゼリー濃縮物又は希釈物、生ローヤルゼリーを乾燥させて粉末化したローヤルゼリー粉末、生ローヤルゼリーをタンパク質分解酵素で処理した酵素分解ローヤルゼリー、生ローヤルゼリーをエタノール等の有機溶媒で抽出したローヤルゼリーエタノール抽出物等のローヤルゼリー有機溶媒抽出物などが挙げられる。ローヤルゼリー処理物は複数の処理が施されたものであってもよい。ローヤルゼリーは酵素分解及び粉末化された酵素分解ローヤルゼリー粉末であることが好ましい。酵素分解ローヤルゼリー粉末を用いると、より高い生理活性を得ることができ、また、アレルギー性が低減されているため好ましい。

【0030】

ローヤルゼリー濃縮物は、例えば、生ローヤルゼリーから水分を除去することにより得ることができる。ローヤルゼリー希釈物は、例えば、生ローヤルゼリーに水分を添加することにより得ることができる。

【0031】

ローヤルゼリー粉末は、例えば、凍結乾燥及び噴霧乾燥等の本技術分野における公知の方法により生ローヤルゼリーを粉末化することにより得ることができる。また、凍結乾燥又は噴霧乾燥後に粉砕機（例えば、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル、ジェットミル）により粉砕してローヤルゼリー粉末を得てもよい。

【0032】

酵素分解ローヤルゼリーは、例えば、生ローヤルゼリーをタンパク質分解酵素で処理することで得ることができる。タンパク質分解酵素としては、例えば、エンドペプチダーゼ作用を有する酵素、エキソペプチダーゼ作用を有する酵素、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有する酵素が挙げられる。タンパク質分解酵素としては、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の少なくとも一方を有している酵素であればよく、少なくともエンドペプチダーゼ作用を有する酵素が好ましく、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方の作用を有する酵素がより好ましい。ここで、エンドペプチダーゼ作用は、非末端のアミノ酸のペプチド結合を分解する作用であり、エキソペプチダーゼ作用は、末端のアミノ酸のペプチド結合を分解する作用である。

【0033】

タンパク質分解酵素には、エキソペプチダーゼ作用のみを有する酵素、エンドペプチダーゼ作用のみを有する酵素、エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有する酵素が存在する。エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有する酵素は、エンドペプチダーゼ作用の方が強い場合には、「エンドペプチダーゼ作用を有する酵素」とし、エキソペプチダーゼ活性の方が強い場合には、「エキソペプチダーゼ作用を有する酵素」とし、エキソペプチダーゼ作用とエンドペプチダーゼ作用が同等又はほぼ同等の場合には、「エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有する酵素」とする。なお、同等又はほぼ同等とは、エキソペプチダーゼ作用に対するエンドペプチダーゼ作用の割合（活性比）が、０．８倍～１．２倍であることを意味する。

【0034】

エンドペプチダーゼ作用を有する酵素としては、例えば、動物由来のエンドペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン等）、植物由来のエンドペプチダーゼ（例えば、パパイン等）、又は乳酸菌、酵母、カビ、枯草菌若しくは放線菌等の微生物由来のエンドペプチダーゼが挙げられる。エンドペプチダーゼ作用を有する酵素のより具体的な例としては、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）産生ペプチダーゼ（商品名：オリエンターゼ２２ＢＦ、ヌクレイシン）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）産生ペプチダーゼ（商品名：アルカラーゼ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）産生ペプチダーゼ（商品名：プロテアーゼＳ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）産生ペプチダーゼ（商品名：ニュートラーゼ）、バチルス属産生ペプチダーゼ（商品名：プロタメックス）を挙げることができる。

【0035】

エキソペプチダーゼ作用を有する酵素としては、例えば、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、又は乳酸菌、アスペルギルス属菌若しくはリゾープス属菌等の微生物由来のエキソペプチダーゼが挙げられる。エキソペプチダーゼ作用を有する酵素のより具体的な例としては、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ）産生ペプチダーゼ（商品名：ウマミザイムＧ、Ｐｒｏｍｏｄ １９２Ｐ、Ｐｒｏｍｏｄ １９４Ｐ、スミチームＦＬＡＰ）、アスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）産生ペプチダーゼ（商品名：Ｓｔｅｒｎｚｙｍｅ Ｂ１５０２４）、アスペルギルス属産生ペプチダーゼ（商品名：コクラーゼＰ）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）産生ペプチダーゼ（商品名：ペプチダーゼＲ）を挙げることができる。

【0036】

エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有する酵素としては、例えば、パンクレアチン、ペプシン等が挙げられる。エンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方の作用を有する酵素のより具体的な例としては、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）産生ペプチダーゼ（商品名：アクチナーゼＡＳ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ）産生ペプチダーゼ（商品名：プロテアーゼＡ、フレーバーザイム、プロテアックス）、アスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）産生ペプチダーゼ（商品名：プロテアーゼＰ）を挙げることができる。

【0037】

生ローヤルゼリーをタンパク質分解酵素で処理する際の反応条件（タンパク質分解酵素の使用量、反応時の温度、ｐＨ、反応時間等）は、使用するタンパク質分解酵素の種類等に応じて、適宜設定すればよい。具体的な反応条件として、例えば、タンパク質分解酵素としてエンドペプチダーゼ作用とエキソペプチダーゼ作用の両方を有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬株式会社）を用いる場合、タンパク質分解酵素の使用量はローヤルゼリー１００ｇあたり１ｇ、反応時の温度４５～５５℃、ｐＨ８．５～９．５、反応時間２～４時間を例示することができる。

【0038】

ローヤルゼリー有機溶媒抽出物は、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、アセトン等の有機溶媒を溶媒として生ローヤルゼリーを抽出することで得ることができる。抽出時間は、原料として用いられる生ローヤルゼリーの形態、溶媒の種類及び量、抽出の際の温度及び攪拌条件等に応じて適宜設定することができる。抽出後、ろ過、遠心分離等により固形分を除去してもよい。また、抽出された溶液をそのまま用いてもよいし、当該溶液から溶媒を除去して、濃縮液又は粉末として用いてもよい。ローヤルゼリー有機溶媒抽出物としては、ローヤルゼリーエタノール抽出物であることが好ましい。

【0039】

ローヤルゼリーは、市販されているものを用いてもよい。ローヤルゼリーの具体例としては、例えば、ローヤルゼリーＦＤ末（株式会社中原）、ローヤルゼリーエキスＳＦ（松浦薬業株式会社）、脱蛋白ローヤルゼリー粉末Ｆ（丸善製薬株式会社）、脱蛋白ローヤルゼリーエキス（アピ株式会社）等が挙げられる。

【0040】

基質としての１０－ＨＤＡとラクトバチルス属細菌とを反応させることにより、１０－ＨＤＡの少なくとも一部を１０ＨＤＡＡに変換することができる。１０－ＨＤＡとラクトバチルス属細菌との反応は、例えば、上記ラクトバチルス属細菌を１０－ＨＤＡの共存下で培養することにより、又は予め培養して用意したラクトバチルス属細菌と１０－ＨＤＡを含む媒体とを混合することにより行うことができる。具体的には例えば、前培養したラクトバチルス属細菌を、１０－ＨＤＡ含有培地で培養（本培養）することにより、１０－ＨＤＡの少なくとも一部が変換することにより生じた１０ＨＤＡＡを含む培養液を得ることができる。

【0041】

ラクトバチルス属細菌の培養は、例えば、各ラクトバチルス属細菌の培養に適した一般的な条件で行うことができる。培養温度は例えば、２５～４０℃であってよく、好ましくは３０～３８℃である。培地のｐＨは例えば５～８であってよく、好ましくは６～７である。前培養の培養時間は、例えば１２～６０時間であってよい。１０－ＨＤＡ含有培地での本培養の培養時間は、例えば６０～３００時間であってよく、９０～１８０時間が好ましく、１００～１３０時間がより好ましい。

【0042】

ラクトバチルス属細菌の培養は、好気条件であってもよく、嫌気条件であってもよい。より効率的に１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換する観点から、培養は嫌気条件で行うことが好ましい。

【0043】

ラクトバチルス属細菌を培養するための培地としては、ラクトバチルス属細菌培養に一般的に用いられる、炭素源、窒素源、無機塩類等の栄養成分を含む各種の培地を用いることができる。ラクトバチルス属細菌に適した培地としては、例えば、ＭＲＳ培地が挙げられる。本培養用の培地としては、これらの培地に１０－ＨＤＡ又は１０－ＨＤＡ含有組成物を添加したものを用いることができる。また、本培養用の培地としては、ローヤルゼリー等の１０－ＨＤＡ含有組成物を、適宜水又は緩衝液等の溶媒で希釈したものを用いてもよい。

【0044】

本培養に用いる１０－ＨＤＡ含有培地における１０－ＨＤＡの濃度は、例えば、０．００１～５質量％であってよく、０．０１～１質量％であることが好ましく、０．０５～０．２質量％であることがより好ましい。

【0045】

本培養に用いる１０－ＨＤＡ含有培地として、ローヤルゼリー含有培地を用いる場合は、培地全量に対するローヤルゼリー濃度（固形分）は０．１～２０質量％であってよく、０．２～１０質量％であることが好ましく、０．５～３．５質量％であることがより好ましい。本培養用の培地としてローヤルゼリー含有培地を用いる場合は、培地におけるローヤルゼリー濃度が低いほどより効率的に１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換できる傾向がある。

【0046】

１０－ＨＤＡとラクトバチルス属細菌との反応により生成した１０ＨＤＡＡは、例えば、培養液から菌体を分離して上清を回収し、必要に応じて濃縮、精製等の処理を行って回収することができる。１０ＨＤＡＡを含む培養液は、そのまま食品、化粧品、医薬品、医薬部外品等の製品に用いてもよい。

【0047】

［ローヤルゼリー組成物の製造方法］
本実施形態の一側面は、１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換する能力を有するラクトバチルス属細菌を、ローヤルゼリー中の１０－ＨＤＡと反応させることを含む、ローヤルゼリー組成物の製造方法に関する。当該製造方法により得られるローヤルゼリー組成物においては、原料のローヤルゼリーよりも、１０－ＨＤＡの濃度が低減され、１０ＨＤＡＡの濃度が高められている。そのため、上記製造方法によって、１０ＨＤＡＡに基づく各種生理活性効果が高められたローヤルゼリー組成物を得ることができる。このようなローヤルゼリー組成物は、１０ＨＤＡＡに基づく生理活性を期待して摂取する際の摂取量を低減することができるため好ましい。

【0048】

本実施形態に係るローヤルゼリー組成物の製造方法は、上述の変換方法において、基質としてローヤルゼリーを用いることにより行うことができる。基質として用いるローヤルゼリーの具体的な実施態様は、上述の変換方法において述べたローヤルゼリーと同様の態様を適用できる。基質としてのローヤルゼリーは、生ローヤルゼリー又は酵素分解ローヤルゼリーであることが好ましい。

【0049】

本実施形態に係るローヤルゼリー組成物の製造方法によって得られるローヤルゼリー組成物は、１０ＨＤＡＡを含む。得られるローヤルゼリー組成物は、その他に例えば、残存１０－ＨＤＡ、タンパク質、炭水化物、脂質、灰分、遊離アミノ酸、ビタミン、ミネラル等のローヤルゼリー由来成分を含んでいてよい。また、得られるローヤルゼリー組成物は、例えば、上述のラクトバチルス属細菌の菌体（生菌体又は死菌体）、培養に用いた培地に由来する成分等の、ローヤルゼリーに由来しない成分を含んでいてもよい。

【0050】

上記製造方法によって得られるローヤルゼリー組成物における１０ＨＤＡＡ含有量は、ローヤルゼリー組成物の固形分全量に対して、例えば、１．１質量％超であってよく、１．２質量％以上、１．５質量％以上、２．０質量％以上、２．５質量％以上、３．０質量％以上、３．５質量％以上、４．０質量％以上、４．５質量％以上、５．０質量％以上、５．５質量％以上、６．０質量％以上、６．５質量％以上、７．０質量％以上、８．０質量％以上、又は１０．０質量％以上であってよい。１０ＨＤＡＡ含有量は、ローヤルゼリー組成物の固形分全量に対して、例えば、５０質量％以下、又は１０質量％以下であってもよい。

【0051】

上記製造方法によって得られるローヤルゼリー組成物における１０－ＨＤＡ含有量は、ローヤルゼリー組成物の固形分全量に対して、例えば、７．０質量％以下であってよく、６．０質量％以下、５．０質量％以下、４．０質量％以下、３．５質量％以下、３．０質量％以下、２．５質量％以下、２．０質量％以下、１．５質量％以下、１．２質量％以下、１．０質量％以下、０．８質量％以下、０．５質量％以下、０．３質量％以下、０．２質量％以下、０．１質量％以下、０．０１質量％以下、又は０．００１質量％以下であってよい。上記ローヤルゼリー組成物は、１０－ＨＤＡを含有しない、すなわち１０－ＨＤＡ含有量が０質量％であってもよい。

【0052】

上記製造方法によって得られるローヤルゼリー組成物は、医薬品、医薬部外品、食品組成物又は化粧品等の製品としてそのまま用いられてもよく、医薬品、医薬部外品、食品組成物又は化粧品等の製品の一成分として用いられてもよい。ローヤルゼリー組成物を含む製品は、例えば、製品の製造工程における中間製品に、上述の方法で得られたローヤルゼリー組成物を添加することにより得ることができる。

【0053】

医薬品、医薬部外品又は食品組成物の一成分としてローヤルゼリー組成物を用いる場合、医薬品、医薬部外品又は食品組成物は、ローヤルゼリー組成物以外の成分として、例えば、薬学的に許容される成分（例えば、賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤）、食品として許容される成分（例えば、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤）を含んでいてもよい。

【0054】

ローヤルゼリー組成物を含む製品は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよく、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤等を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末剤（散剤）、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤（使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液若しくは電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む）等の剤形であってもよい。これらの各種製剤は、例えば、上述の方法により得られたローヤルゼリー組成物と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。

【0055】

上述の方法により得られるローヤルゼリー組成物を食品組成物として又は食品組成物の一成分として用いる場合、該食品組成物は、食品の３次機能、すなわち体調調節機能が強調されたものであることが好ましい。食品の３次機能が強調された製品としては、例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品を挙げることができる。

【0056】

食品組成物としては例えば、コーヒー、ジュース及び茶飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、並びに、日本酒、洋酒、果実酒及びハチミツ酒等の酒などの飲料；カスタードクリーム等のスプレッド；フルーツペースト等のペースト；チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ及びプリン等の洋菓子；大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ及び羊羹等の和菓子；アイスクリーム、アイスキャンデー及びシャーベット等の氷菓；カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等の調理済みの食品；ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料及びスープの素等の調味料などが挙げられる。

【0057】

化粧品の一成分としてローヤルゼリー組成物を用いる場合、化粧品は、ローヤルゼリー組成物以外の成分として、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて含んでいてよい。

【0058】

化粧品には、動物（ヒトを含む）の皮膚、粘膜、体毛、頭髪、頭皮、爪、歯、顔皮、口唇等の部位に適用されるあらゆる化粧品が含まれる。

【0059】

本実施形態に係る化粧品の剤形は、例えば、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水－油２層系、水－油－粉末３層系等であってよい。上記化粧品は、例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パック、マスク、ミスト、ＵＶ予防化粧品等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧品、洗顔料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、石けん、シャンプー、リンス、へアートリートメント、整髪料、へアートニック剤、ヘアミスト、ヘアフォーム、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアスプレー、育毛剤、制汗剤、入浴剤、マウスリンス、口腔化粧品、歯磨剤などであってよい。

【0060】

［変換剤］
本実施形態の一側面は、１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換剤（以下、単に「変換剤」ともいう。）に関する。変換剤は、１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する能力を有するラクトバチルス属細菌を含む。本実施形態に係る変換剤は、上記ラクトバチルス属細菌に加え、上記ラクトバチルス属細菌の培養時に用いられる培地となる少なくとも一部の成分を含んでいてもよい。

【0061】

本実施形態に係る変換剤は、例えば、１０－ＨＤＡを含有する培地に播種して用いることができる。本実施形態に係る変換剤を１０－ＨＤＡ含有培地に播種して、該ラクトバチルス属細菌を１０－ＨＤＡを反応させることにより、１０－ＨＤＡの少なくとも一部を１０ＨＤＡＡに変換する、すなわち１０ＨＤＡＡを生成することができる。また、変換剤が培地成分を含む場合は、変換剤を１０－ＨＤＡ又は１０－ＨＤＡ含有組成物と混合し、必要に応じて更に培地成分を添加して培養することにより、１０－ＨＤＡを１０ＨＤＡＡに変換することができる。

【0062】

本実施形態に係る変換剤において用いられるラクトバチルス属細菌の具体的な実施態様は、上述の変換方法において述べたラクトバチルス属細菌の態様と同様の態様を適用できる。また、本実施形態に係る変換剤に必要に応じて含まれる培地成分、及び変換剤を適用する１０－ＨＤＡ含有培地についても、上述の変換方法における１０－ＨＤＡ含有培地の場合と同様の態様を適用できる。

【実施例】

【0063】

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0064】

各試験例に用いた培地及び培養方法の詳細を以下に示す。

【0065】

［ＭＲＳ平板培地の調製］
蒸留水１６００ｍｌにＭＲＳ８８ｇ及び寒天１９．２ｇを溶解することにより、ＭＲＳ培地を調製した。ＭＲＳ培地を、オートクレーブを用いて１２１℃、２０分間滅菌した後、６０℃で保温した。滅菌したＭＲＳ培地を平板に２０ｍｌずつ投入して冷却することによりＭＲＳ平板培地を作製した。

【0066】

［ＭＲＳ液体培地の調製］
蒸留水２０００ｍｌにＭＲＳ Ｂｒｏｔｈを１１０ｇ添加して撹拌し、得られた混合液を、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間滅菌することにより、ＭＲＳ液体培地を得た。

【0067】

［１０－ＨＤＡ含有ＭＲＳ液体培地の調製］
蒸留水２０００ｍｌにＭＲＳ Ｂｒｏｔｈを１１０ｇ添加して撹拌し、得られた混合液を、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間滅菌した。滅菌後に冷却した混合液に４ｇの１０－ＨＤＡを添加して混合した後、ｐＨを６．５に調整することにより、１０－ＨＤＡ含有ＭＲＳ液体培地を得た。

【0068】

［希釈ローヤルゼリー含有培地の調製］
生ローヤルゼリー（株式会社山田養蜂場）又は酵素分解ローヤルゼリー（粉末）を、固形分が３％（１０倍希釈）又は０．６％（５０倍希釈）となるように滅菌水に添加して混合した。得られた混合液のｐＨを６．５に調整することにより、希釈ローヤルゼリー含有培地を得た。酵素分解ローヤルゼリーとしては、ｐＨ７．８に調整したローヤルゼリー水溶液をプロテアックス（天野エンザイム株式会社）で５０℃、２時間反応させることにより加水分解したものに、結晶セルロース及びローカストビーンガムを添加したものを用いた。

【0069】

［平板培養］
各種菌株を含むグリセロールストックを白金耳でかき取り、上記ＭＲＳ平板培地に播種した。播種したＭＲＳ平板培地を、嫌気培養キット（アネロパック、三菱化学株式会社）を用いて９６時間３５℃の嫌気条件下でインキュベートした。

【0070】

［前培養］
容量１０ｍｌのコニカルチューブに上記ＭＲＳ液体培地を６ｍｌずつ分注した。９６時間培養したＭＲＳ平板培地から、シングルコロニーを白金耳でかき取り、該コニカルチューブに添加した。コニカルチューブに入れた菌株を、３５℃で４８時間、アネロパックを用いて嫌気条件下で、又は好気条件下でインキュベートすることにより、前培養液を得た。

【0071】

［本培養］
容量１０ｍｌのコニカルチューブに、上記１０－ＨＤＡ含有ＭＲＳ液体培地又は上記希釈ローヤルゼリー含有培地を６ｍｌずつ分注した。該コニカルチューブに、上記前培養液を６０μｌ添加し、３５℃で１２０時間、アネロパックを用いて嫌気条件下で、又は好気条件下でインキュベートした。コントロールとしては、１０－ＨＤＡ又はローヤルゼリーを含まない培地を用いて同様に本培養を行い、培養後に１０ＨＤＡＡが検出されないこと、及び、１０－ＨＤＡを含む培地に前培養液を添加せずに上記条件にて静置後に１０ＨＤＡＡが検出されないことを確認した。

【0072】

［１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能評価］
各種菌株の本培養により得られた培養液の上清を採取した。上清中の１０－ＨＤＡ濃度及び１０ＨＤＡＡ濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。ＨＰＬＣの分析条件は下記のとおりとした。
機器：ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（株式会社島津製作所）
カラム：Ｓｕｎｎｉｅｓｔ Ｃ１８（５μｍ、４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
ガードカラム：Ｓｕｎｎｉｅｓｔ Ｃ１８（５μｍ、４．０ｍｍｉ．ｄ．×１０ｍｍ）
カラムオーブン：４０℃
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：Ａ；ＴＦＡ／超純水＝１／１０００、Ｂ；アセトニトリル
溶出法：２５％Ｂ（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）
注入量：１０μＬ
検出器：１０－ＨＤＡ→ＰＤＡ：２１５ｎｍ、１０ＨＤＡＡ→ＥＬＳＤ：３０℃；ガス圧約３００Ｐａ；Ｇａｉｎ９

【0073】

本培養により得られた培養液上清中に残存した１０－ＨＤＡ量に基づき、１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換率を求めた。１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換率は以下の式により算出した。
変換率（％）＝（１―（上清中に残存した１０－ＨＤＡの濃度／培養開始時の基質に含まれる１０－ＨＤＡの濃度））×１００

【0074】

［試験例１］
ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ３６２株（ＮＩＴＥ Ｐ－０１８３５）及びパン酵母について、それぞれ上記方法により１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能を調べた。本培養の培地として希釈ローヤルゼリー含有培地（１０倍希釈、生ローヤルゼリー）を用いて、好気条件で培養した。ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ３６２及びパン酵母を用いた場合には、培養後の上清に１０ＨＤＡＡは検出されなかった。ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ３６２及びパン酵母には、１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能がないことが示された。

【0075】

［試験例２］
表１に示すラクトバチルス属細菌について、それぞれ上記方法で１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能を調べた。本培養の培地として上記１０－ＨＤＡ含有ＭＲＳ液体培地を用い、好気条件で培養した。得られた培養液の上清中の１０－ＨＤＡ量及び１０ＨＤＡＡを測定し、上清中の１０ＨＤＡＡ濃度が検出未満であったものを変換能なし、上清中に１０ＨＤＡＡが検出されたものを変換能ありと評価した。変換能ありのものについては、上記方法により変換率を測定した。結果を表１に示す。

【0076】

【表1】

【0077】

調べたラクトバチルス属細菌のうち、ラクトバチルス・プランタルムｂ２４０についてのみ、培養液上清中に多量の１０－ＨＤＡが残るものの、一部１０ＨＤＡＡの存在が確認された。ラクトバチルス・プランタルムｂ２４０は、やや弱い変換能を有することが確認された。ラクトバチルス・プランタルムｂ２４０による変換率は２０％であった。

【0078】

［試験例３］
働き蜂、蜂の子、及び女王蜂成虫の腸内から細菌群を採取した。働き蜂腸内から単離された５つの菌株、蜂の子から単離された１つの菌株、及び女王蜂成虫の腸内から単離された９つの菌株を用いて、上記１０－ＨＤＡ含有ＭＲＳ液体培地を用いて嫌気条件でそれぞれ変換能評価を行った。

【0079】

９つの菌株のうち、女王蜂成虫の腸内から単離された５つの菌株（ＱＢ３－１－４、ＱＢ３－１－９、ＱＢ３－１－１０、ＱＢ３－２－４、及びＱＢ９－１－６）を用いると、いずれも培養液上清中の１０－ＨＤＡ濃度は検出限界未満であり、高濃度の１０ＨＤＡＡが検出され、実質的に全量の１０－ＨＤＡが１０ＨＤＡＡに変換されたことが確認された。すなわち変換率は１００％であった。該５つの菌株は、非常に強い変換能を有することが示された。

【0080】

一方、働き蜂腸内から単離された５つの菌株、蜂の子から単離された１つの菌株、及び女王蜂成虫の腸内から単離された残りの４つの菌株では、培養液上清において１０ＨＤＡＡは検出されなかった。１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能が確認されなかったこれら１０の菌株は、Ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）を用いた細菌同定法により、いずれもビフィドバクテリウム属細菌であることが確認された。ビフィドバクテリウム属細菌には１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへの変換能がないことが示唆された。

【0081】

［試験例４］
試験例３で強い変換能が確認された上記５つの菌株（ＱＢ３－１－４、ＱＢ３－１－９、ＱＢ３－１－１０、ＱＢ３－２－４、ＱＢ９－１－６）について、下記に示す条件で、１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列解析を行った。
（培養条件）
培地：ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ、ＧＢＲ）＋寒天
培養温度：３７℃
培養時間：４８時間
嫌気培養
（１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析）
ＤＮＡ抽出：アクロモベプチダーゼ（富士フィルム和光純薬株式会社）
ＰＣＲ増幅：Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）
サイクルシークエンス：ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
使用プライマー：ＰＣＲ増幅：９Ｆ，１５１０Ｒ
シークエンス：９Ｆ，５１５Ｆ，１０９９Ｆ，５３．６Ｒ，９２６Ｒ，１５１０Ｒ
シークエンス：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１３０ｘｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
塩基配列決定：ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ２．１（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ）
ＢＬＡＳＴ相同性検索：解析ソフトウェア：ＥＮＫＩ（ＴｅｃｈｎｏＳｕｒｕｇａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｊａｐａｎ）
データベース：国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）

【0082】

５つの菌株のうち、４つの菌株（ＱＢ３－１－４、ＱＢ３－１－９、ＱＢ３－１－１０及びＱＢ３－２－４：Ｍ２株）は、配列番号１の塩基配列を有し、１つの菌株（ＱＢ９－１－６：Ｍ１株）は、配列番号２の塩基配列を有することが確認された。また、これら５つの菌株について、国際塩基配列データベースに対して相同性検索を行った結果、いずれも相同率の高い上位３０塩基配列は実質全てラクトバチルス属に属するものであり、上記５つの菌株はいずれもラクトバチルス属に属することが示された。

【0083】

［試験例５］
ＱＢ９－１－６（Ｍ１株）について、上記１０－ＨＤＡ含有ＭＲＳ液体培地を用いて、嫌気条件下で本培養を行う場合と、好気条件下で本培養を行う場合との変換能評価を比較した。その結果、嫌気培養と好気培養とでは、いずれも変換率は１００％であり、同様の変換能が確認された。

【0084】

［試験例６：ローヤルゼリー試験］
強い変換能が確認されたＱＢ９－１－６（Ｍ１株）について、生ローヤルゼリー又は酵素分解ローヤルゼリーを含む希釈ローヤルゼリー含有培地を用いて、嫌気条件下で変換能を評価した。その結果、１０倍又は５０倍希釈の生ローヤルゼリー又は酵素分解ローヤルゼリーを含む培地では、培養後の上清に一部残存１０－ＨＤＡが検出されるものの、培養前と比べて１０ＨＤＡＡ濃度が増加していることが確認された。基質としてローヤルゼリーを用いた場合でもＱＢ９－１－６株の変換能が発揮されることが確認された。また、１０倍希釈よりも５０倍希釈の方が、より高い割合で１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへ変換されたことが確認された。また、生ローヤルゼリー又は酵素分解ローヤルゼリーを用いた場合で同様の傾向が示された。各条件における変換率を測定した。結果を表２に示す。

【0085】

【表2】

【0086】

ＱＢ９－１－６（Ｍ１株）について、酵素分解ローヤルゼリーを含む１０倍希釈又は５０倍希釈の希釈ローヤルゼリー含有培地を用いて、好気条件下で変換能を評価した。その結果、希釈倍率が高いほどより高い割合で１０－ＨＤＡから１０ＨＤＡＡへ変換されたことが確認された。好気条件下においてもローヤルゼリーの希釈倍率が高い方が変換効率が高いことが示された。

【0087】

［試験例７］
試験例４で用いた５つの菌株を用いて、同一条件にて培養を行った。培地として酵素分解ローヤルゼリー粉末を１０倍希釈で含む希釈ローヤルゼリー含有培地を用い、３５℃で１２０時間、嫌気条件で培養を行った。各菌株の変換率を表３に示す。Ｍ１株の変換率が特に高いことが示された。

【0088】

【表3】

【0089】

［試験例８］
Ｍ１株及びＭ２株について、株式会社テクノスラボにより、ラクトバチルス・パニサピウムの基準株（Ｂｂ２－３^Ｔ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＧＣＡ＿００２９１６９３５）に対するＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析を行った。ＡＮＩ値（相同値）の算出には、ＡＮＩ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｖｅ－ｏｍｉｃｓ．ｃｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ａｎｉ／ｉｎｄｅｘ）を用いた。ＡＮＩ値が９５％以上の場合、同一種と判断される。基準株、Ｍ１株及びＭ２株間でのＡＮＩ値を表４に示す。Ｍ１株及びＭ２株はいずれも基準株とのＡＮＩ値が９５％を超えており、ラクトバチルス・パニサピウムであることが判明した。

【0090】

【表4】

【配列表】

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