【図1-1】 Daudi細胞（A～F）およびJurkat細胞（G～I）に対する二重特異性CD3xCD20抗体の結合。（A）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARおよびIgG1-7D8の結合、（B）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEARおよびIgG1-2F2の結合、（C）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEARおよびIgG1-RTXの結合、（D）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEARおよびIgG1-11B8の結合、（E）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEARおよびIgG1-GA101の結合、（F）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR（およびIgG1-7D8）の結合。示されているデータは、2回の代表的実験に関する（A～Eは一方により、Fはもう一方による）、フローサイトメトリーによって測定した、Daudi細胞に対する結合の蛍光強度の幾何平均（geometric mean）（幾何平均（geomean））（A～E）および蛍光強度の中央値（F）である。（G）bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR（huCLB-T3/4x7D8）、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR（huCLB-T3/4x2F2）、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-GA101-FEAR（huCLB-T3/4xGA101）、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR（huCLB-T3/4x11B8）および単一特異性二価IgG1-7D8-FEARのDaudi細胞に対する結合、（H）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEARおよび単一特異性二価IgG1-huCD3-H1L1-FEALのJurkat細胞に対する結合、（I）bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-GA101-FEAR、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-RTX-FEAR、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2C6-FEAR、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxb12-FEARおよび単一特異性二価IgG1-huCLB-T3/4-FEALのJurkat細胞に対する結合。示されているデータは、1回の代表的実験の、フローサイトメトリーによって測定した蛍光強度の中央値である。

【図1-2】 図1-1の説明を参照のこと。

【図1-3】 図1-1の説明を参照のこと。

【図1-4】 図1-1の説明を参照のこと。

【図1-5】 図1-1の説明を参照のこと。

【図2】 bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（CD3xCD20）の、T細胞およびB細胞に対する濃度依存的同時結合。二重特異性抗体bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（CD3xCD20）の、血液中のB細胞およびT細胞に対する同時結合を、フローサイトメトリーによって分析した。示されているデータは1回の代表的実験による。示されているデータは、CD4／CD19またはCD8／CD19フローサイトメトリードットプロットの右上象限内のイベントの数によって測定した、二重陽性（CD19およびCD4［A］またはCD19およびCD8［B］）イベントの数である。塗りつぶし記号および白抜き記号は、異なる健常ドナーによるデータを示している。IgG1-2F2（2F2、CD20特異的）およびbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR（CD3xb12、CD3特異的）を陰性対照抗体として含めた。

【図3-1】 ヒトB細胞リンパ腫およびB細胞白血病の細胞株における、CD3xCD20二重特異性抗体によるインビトロでの細胞傷害性の誘導。（A）Daudi細胞を、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（CD3x7D8）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR（CD3x11B8）、単一特異性CD20抗体IgG1-7D8（7D8）、IgG1-7D8-FEAR（7D8-FEAR；不活性Fc領域を有する）、IgG1-11B8-F405L、またはIgG1-11B8-FEAR（11B8-FEAR；不活性Fc領域を有する）、および二重特異性対照抗体bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR（CD3xb12）と共にインキュベートし、PBMCをエフェクター細胞として用いた。（B）Daudi細胞を、BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（CD3x7D8）、単一特異性CD20抗体IgG1-7D8-FEAR（7D8-FEAR；不活性Fc領域を有する）、およびbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR（CD3xb12）と共にインキュベートし、精製T細胞をエフェクター細胞として用いた。（C～F）Daudi細胞を、2種類のCD3アーム（huCD3-H1L1-FEAL FabアームおよびhuCLB-T3/4-FEAL Fabアーム、それぞれ白抜き記号および塗りつぶし記号によって表されている）ならびに4種類のCD20アーム：7D8（BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARおよびBsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR；［C］）、11B8（BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEARおよびBsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR；［D］）、GA101（BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEARおよびBsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-GA101-FEAR；［E］）および2F2（BsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEARおよびBsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR；［F］）を基にしたCD3xCD20二重特異性抗体と共にインキュベートした。（G～M）種々のB細胞株を標的細胞として用い、表記の通りの抗体と共にインキュベートした。CD3xCD20二重特異性抗体は、huCD3-H1L1-FEAL Fabアームおよび種々のCD20 Fabアーム（7D8、11B8、2F2、GA101またはRTX）を表記の通りに含んだ。CD3のみの抗体はIgG1-huCD3-H1L1であった。精製T細胞をエフェクター細胞として用いた。（N）Daudi細胞を、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（CD3x7D8）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR（CD3x2C6）、およびbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR（CD3xb12）と共にインキュベートし、精製T細胞をエフェクター細胞として用いた。示されているデータは、3つのウェルの特異的溶解率（％）の平均値±S.Dであり、各群に関するデータは1回の代表的実験から得た。

【図3-2】 図3-1の説明を参照のこと。

【図3-3】 図3-1の説明を参照のこと。

【図3-4】 図3-1の説明を参照のこと。

【図3-5】 図3-1の説明を参照のこと。

【図3-6】 図3-1の説明を参照のこと。

【図3-7】 図3-1の説明を参照のこと。

【図4】 精製全T細胞（CD3+）、CD4+ T細胞（CD3+ CD8-）およびCD8+ T細胞（CD3+ CD8+）をエフェクター細胞として用いた、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARによる、インビトロでの細胞傷害性の用量依存的誘導。Daudi細胞を、表記の通りの種々のT細胞サブセット、ならびにbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARまたは対照抗体IgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEARおよびIgG1-7D8-FEAR（データは提示せず）の希釈系列と共にインキュベートした。示されているデータは、3つのウェルの腫瘍細胞溶解率（％）の平均値±S.E.M.である（A、B）。

【図5】 Daudi細胞におけるbsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR依存的細胞傷害作用の動態。Daudi細胞を、2例のドナーから単離した精製T細胞の存在下で、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEARと共にインキュベートした（AおよびB）。細胞傷害性を、4、12、24、48および72時間のインキュベーション後（A）、または3、16および24時間のインキュベーション後（B）に評価した。示されているデータは、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEARと共に種々のインキュベーション時間にわたってインキュベートした3つのウェルの細胞の細胞死滅率（％）±S.D.である。AおよびBに示されているデータは、2例のドナーから単離した精製T細胞を用いた2回の独立した実験による。

【図6-1】 種々のエフェクター・標的比での、CD3xCD20二重特異性抗体によるインビトロでの細胞傷害性の誘導の有効性。細胞傷害性アッセイを、種々のCD3xCD20二重特異性抗体および種々のE／T比を用いて行った。CD3xCD20二重特異性抗体には、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（A）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR（B）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR（C）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR（D）およびbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR（E）を含めた。陰性対照として、bsIG1-huCLB-T3/4-FEALxb12-FEARを10：1のE／T比で含めた。示されているデータは、1回の代表的実験について、細胞傷害性アッセイで測定した、3つのウェルの平均溶解率（％）±S.D.である。各線は種々のE／T比（表記の通り）を表している。

【図6-2】 図6-1の説明を参照のこと。

【図6-3】 図6-1の説明を参照のこと。

【図7-1】 NOD-SCIDマウスでのRaji-luc共移植（co-engraftment）モデルにおけるCD3xCD20二重特異性抗体の細胞傷害活性。（A）媒体（PBS）またはbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARを表記の用量で投与したマウスにおける平均腫瘍サイズ。エラーバーはS.E.M.を示している。（B）PBSまたはbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARの投与後の個々のマウスにおける、腫瘍接種後21日目の腫瘍サイズ。21日目のデータの統計分析を、Kruskal Wallis検定（事後検定としてのDunn多重比較）によって行った。**p＜0.01。（C）腫瘍サイズのカットオフを600mm3に設定したKaplan-Meierプロット。bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR投与群とPBSを投与した対照群との間の生存性の差の統計学的有意性を、Mantel Cox分析によって評価した。*p＜0.05、**p＜0.01、n.s. 有意でない。（D）媒体（PBS）またはbsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEARを表記の用量で投与したマウスにおける平均腫瘍サイズ。エラーバーはS.E.M.を示している。（E）種々の投与群の個々のマウスにおける、腫瘍接種後25日目時点での腫瘍サイズ。統計分析は、Kruskal Wallis検定（事後検定としてのDunn多重比較）を用いて行った。（F）腫瘍サイズのカットオフを500mm3に設定したKaplan-Meierプロット。投与群と媒体対照群との間の差の統計学的有意性を、Mantel Cox分析によって分析した。*p＜0.05、**p＜0.01、n.s. 有意でない。（G）媒体（PBS）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARまたはbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEARを表記の用量で投与したマウスにおける平均腫瘍サイズ。エラーバーはS.E.M.を示している。（H）PBSまたはbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARまたはbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEARの投与後の個々のマウスにおける、腫瘍接種後20日目の腫瘍サイズ。20日目のデータの統計分析を、一元配置ANOVA（事後検定としてのTukey多重比較）を用いて行った。*p＜0.05、**p＜0.01。（I）腫瘍サイズのカットオフを500mm3に設定したKaplan-Meierプロット。bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR投与群とPBSを投与した対照群との間の生存性の差の統計学的有意性を、Mantel Cox分析によって評価した。*p＜0.05、**p＜0.01、n.s. 有意でない。

【図7-2】 図7-1の説明を参照のこと。

【図7-3】 図7-1の説明を参照のこと。

【図7-4】 図7-1の説明を参照のこと。

【図7-5】 図7-1の説明を参照のこと。

【図7-6】 図7-1の説明を参照のこと。

【図8-1】 HISマウスでのDaudi-luc異種移植モデルにおけるbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARの抗腫瘍活性。（A）PBS（媒体対照）、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（mAb2）または対照二重特異性抗体bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR（mAb1）を表記の用量レベルで投与した後の、BRGS-HISマウスでのDaudi-luc異種移植モデルにおける平均腫瘍サイズ。腫瘍量は生物発光画像法によって評価した。エラーバーはS.E.M.を示している。（B）統計分析は21日目に行った（Kruskal Wallis検定に続いてDunn多重比較事後検定）。**p＜0.01（C）bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARまたは対照二重特異性抗体bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEARの投与後のDaudi-luc異種移植片担持BRGS-HISマウスにおける、9日目にフローサイトメトリーによって判定した末梢血白血球集団の特性決定。hCD45+細胞の割合（％）は、マウス末梢血における総ヒト白血球の割合（％）を表している。hCD19+の割合（％）、hCD3+の割合（％）、およびhCD3+FSChiの割合（％）は、ヒト白血球集団におけるそれぞれB細胞、T細胞、および活性化T細胞の割合（％）を表している。

【図8-2】 図8-1の説明を参照のこと。

【図9-1】 カニクイザルにおけるbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARの単回投与の効果の試験。種々の用量のbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（0.01、0.1、1、または10mg／kg）を投与されたカニクイザルの末梢血における、経時的なB細胞（CD19+CD21+細胞）数（A）およびT細胞（CD4+＋CD8+細胞）数（B）。-18日目および-11日目は、投与前のB細胞数およびT細胞数を示している。種々の用量のbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（0.01、0.1、1、または10mg／kg）を投与したカニクイザル由来のリンパ節試料における、全リンパ球集団に占める経時的な割合（％）としてのB細胞（C）およびT細胞（D）。種々の用量のbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR（0.01、0.1、1または10mg／kg）を投与したカニクイザルにおける、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、およびTNF-αの血漿中レベル。（E）投与前および最長70日間にわたる投薬後のさまざまな時点の血液試料におけるbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARの薬物動態プロフィール。（F）点線は、k10（クリアランス定数）0.006h-1、Vc（血漿量）40mL・kg-1、および体重3.5kgとした2コンパートメントモデルを用いて、IgG1の予想される薬物動態プロフィールを示している。

【図9-2】 図9-1の説明を参照のこと。

【図9-3】 図9-1の説明を参照のこと。

【図9-4】 図9-1の説明を参照のこと。

【図10】 HEK293F細胞において発現された野生型CD20およびCD20-AxPに対する二重特異性CD3xCD20抗体の結合。HEK293F細胞において発現された野生型CD20（A）およびCD20突然変異型（CD20-AxP）（B）に対する、CD3xCD20二重特異性抗体（bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEAR［huCD3x7D8］、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-7D8-FEAR［huCLB-T3/4x7D8］、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2F2-FEAR［huCD3x2F2］、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-2F2-FEAR［huCLB-T3/4x2F2］、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-11B8-FEAR［huCD3x11B8］、bsIgG1-huCLB-T3/4-FEALxCD20-11B8-FEAR［huCLB-T3/4x11B8］、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-GA101-FEAR［huCD3xGA101］、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-RTX-FEAR［huCD3xRTX］、bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-2C6-FEAR［huCD3x2C6］）の結合を、フローサイトメトリーによって測定した。示されているデータは、1回の代表的実験の平均蛍光強度である。

【図11】 PBMCとbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARとのインキュベーション後のT細胞活性化。健常ドナーPBMCをbsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxCD20-7D8-FEARまたは陽性対照抗体および陰性対照抗体と共にインキュベートし、T細胞集団（CD28+細胞）におけるCD69発現を測定することによって、T細胞活性化を評価した。実験は5例の健常ドナーから単離したPBMCを用いて行った。2例の代表的ドナーに関する結果を示している。