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特許7177767ビタミンＤをアッセイするための方法および組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-15

(45)【発行日】2022-11-24

(54)【発明の名称】ビタミンＤをアッセイするための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20221116BHJP

G01N 33/553 20060101ALI20221116BHJP

G01N 33/545 20060101ALI20221116BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20221116BHJP

C07K 16/44 20060101ALN20221116BHJP

C07K 16/42 20060101ALN20221116BHJP

C07K 17/02 20060101ALN20221116BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 H

G01N33/553

G01N33/545 A

G01N33/543 545S

C07K16/44

C07K16/42

C07K17/02

【請求項の数】 31

(21)【出願番号】P 2019504959

(86)(22)【出願日】2017-07-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-10-10

(86)【国際出願番号】 US2017044504

(87)【国際公開番号】W WO2018023066

(87)【国際公開日】2018-02-01

【審査請求日】2019-05-09

(31)【優先権主張番号】62/368,940

(32)【優先日】2016-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519027464

【氏名又は名称】ダイアザイムラボラトリーズ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】ユアン，チョン－シェン

(72)【発明者】

【氏名】サイダ，ファクリベン

【審査官】大瀧真理

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２７３０２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／１２９６５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／００６３９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５１０４１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１７００４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００４／０１３２１０４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１２２９７２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平０９－３１８６２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００２／０７９７８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１１／０１０６７３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、２．５から６．９の範囲の酸性ｐＨのバッファ、ならびに粒子に結合させたかまたは個別にコンジュゲートさせた、少なくとも２種の抗体とを接触させるステップであって、該抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、少なくとも別の該抗体（または第２の抗体）が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、ステップ、ならびに
ｂ）該抗体と該ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、該試料中の該ビタミンＤ部分のレベルおよび／または量を決定するステップ
を含み、
該方法が、粒子増強免疫比濁法を使用する均質アッセイとして実行され、１０％またはそれより低い該決定されたビタミンＤ部分のレベルおよび／または量の精度またはＣＶを３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌで実現するように実行され、ここで、該精度またはＣＶは、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）ＥＰ５－Ａ２指針に従い評価される、方法。

【請求項2】

前記抗体と前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価する前に、天然ビタミンＤ結合タンパク質を前記試料から除去するステップを含まず、かつ／または洗浄ステップを含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

洗浄ステップを含まない、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料と、前記ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能な酸性ｐＨのバッファを含む単一反応混合物、および粒子上に個別にコンジュゲートさせた少なくとも２種の抗体とを接触させ、一方の抗体または第１の抗体が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記試料、前記酸性ｐＨのバッファ、および粒子上にコンジュゲートさせた抗体を含む、最終反応混合物のｐＨが、３．０から１３の範囲である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

被験体の前記ビタミンＤ部分の状態を評価するのに使用され、前記試料が、該被験体から得られたかつ／または該被験体に由来する生物学的試料である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記ビタミンＤ部分が、２５（ＯＨ）Ｄ２、２５（ＯＨ）Ｄ３、または２５（ＯＨ）Ｄ２と２５（ＯＨ）Ｄ３とを合わせたものである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記酸性ｐＨのバッファが、酢酸ナトリウムバッファ、もしくはクエン酸ナトリウムバッファ、もしくはリン酸バッファ、これらの組合せ、または前記酸性ｐＨの範囲で緩衝機能を有する任意のバッファである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記酸性バッファの前記ｐＨが、４．０から５．５の範囲にある、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記抗体が少なくとも２種のモノクローナル抗体であり、一方の抗体または第１の抗体が前記ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、請求項１から９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記抗体が、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組合せである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記第１の抗体が２５（ＯＨ）Ｄに特異的に結合し、前記第２の抗体が該第１の抗体と２５（ＯＨ）Ｄとの間で形成された複合体に特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記第１の抗体および前記第２の抗体を、粒子に個別にコンジュゲートさせ、アッセイ手順で単一の組合せ試薬として使用するまたは２種の個別の試薬として使用する、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記酸性ｐＨバッファが、塩、ポリマー、および／または界面活性剤であって、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質（複数可）から３０分未満の短期間内で部分的にもしくは全体的に解離させるものを含有する、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記塩、ポリマー、および／または界面活性剤が、前記酸性ｐＨバッファに、またはアッセイ手順で前記酸性ｐＨバッファと混合するのに使用される個別の試薬溶液に含まれる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記粒子またはナノ粒子が、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリメチルナフタレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリビニルナフタレン、スチレンのコポリマー、アクリル酸ジビニルベンゼン、ナフタレン、炭素６０、磁性ビーズ、金、銀、シリカ、二酸化ケイ素、二酸化クロム、および／または二酸化チタンを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

ナノ粒子を使用して実行される、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

ラテックス粒子が使用され、粒度（直径）が３０ｎｍから５００ｎｍの範囲である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

磁性粒子が使用され、粒度（直径）が５００ｎｍから２，０００ｎｍの範囲である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記第１の抗体および前記第２の抗体がラテックス粒子上にコーティングされている、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記アッセイが、３０分またはそれよりも短い時間内で完了する、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記アッセイが、一般的な化学分析器または臨床化学分析器で実行される、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記アッセイが、アッセイプロセスでまたはその前またはその最中で前記試料からビタミンＤ結合タンパク質もいかなる基質も物理的に除去する必要なしに、均質フォーマットで実行される、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記アッセイが、６０分またはそれよりも短い時間内で完了する、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

試料中のビタミンＤ部分をアッセイするためのキットであって、
ａ）２．５から６．９の範囲の酸性ｐＨのバッファ、
ｂ）粒子に個別にコンジュゲートさせた、少なくとも２種の抗体であって、該抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、少なくとも別の該抗体（または第２の抗体）が、該試料中に存在する場合、該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成される複合体に対して特異的結合親和性を有する、抗体
を含み、
該キットは、該試料中の該ビタミンＤ部分のレベルおよび／または量を決定するためのものであり、１０％またはそれより低い該決定されたビタミンＤ部分のレベルおよび／または量の精度またはＣＶを３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌで実現するように構成されており、ここで、該精度またはＣＶは、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）ＥＰ５－Ａ２指針に従い評価される、
キット。

【請求項26】

前記少なくとも２種の抗体と前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、前記試料中の前記ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するための手段をさらに含む、請求項２５に記載のキット。

【請求項27】

１）塩、ポリマー、および／または界面活性剤を含有する２．５から６．９の範囲の酸性ｐＨのバッファを含む、第１のアッセイ試薬、ならびに
２）粒子またはナノ粒子上に個別にコンジュゲートさせた少なくとも２種の抗体を含む第２のアッセイ試薬であって、１種の抗体または第１の抗体が２５（ＯＨ）Ｄに対して特異的結合親和性を有し、別の抗体または第２の抗体が該第１の抗体と該２５（ＯＨ）Ｄとの間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、第２のアッセイ試薬
を含む、請求項２５に記載のキット。

【請求項28】

請求項２７に記載のキットを使用して、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）試料と前記第１のアッセイ試薬との混合物を形成し、ある期間にわたって該混合物をインキュベートし、その後、前記第２のアッセイ試薬を該混合物に添加するステップ、および
ｂ）該反応混合物の光学変化を測定し、一組の２５（ＯＨ）Ｄ較正物質を使用することによって、該試料中の２５（ＯＨ）Ｄの量を定量するステップ
を含む、方法。

【請求項29】

試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）該試料と、２．５から６．９の範囲の酸性ｐＨのバッファを含む第１の試薬とを接触させて、該試料中の該ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させるステップ、
ｂ）ステップａ）からの該試料中の該ビタミンＤ部分と、該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する第１の抗体でコーティングされた粒子を含む第２の試薬とを接触させて、ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体を形成するステップ、ならびに
ｃ）該ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体と、シグナル発生部分または分子で標識された第２の抗体を含む第３の試薬とを接触させて、該ビタミンＤ部分と、該第１の抗体と、シグナル発生部分または分子で標識された該第２の抗体との間で複合体を形成するステップ、ならびに
ｄ）該ビタミンＤ部分と、該第１の抗体と、該第２の抗体との間の該複合体からのシグナルを評価して、該試料中の該ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップ
を含み、
該方法は、該試料と、該ビタミンＤ部分を該試料中のその結合タンパク質から分離する非競合置換剤とを接触させるステップを含まない、
方法。

【請求項30】

前記シグナル発生部分または分子が、アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびフルオレシンからなる群から選択され、前記粒子が磁性粒子である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、２．５から６．９の範囲の酸性ｐＨのバッファ、ならびに少なくとも２種の抗体とを接触させるステップであって、該抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、かつマイクロタイタープレートの固体表面に結合されており、少なくとも別の該抗体（または第２の抗体）が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有し、かつシグナル発生部分で標識される、ステップ、ならびに
ｂ）該抗体と、該ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、該試料中の該ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップ
を含み、
該方法は、該試料と、該ビタミンＤ部分を該試料中のその結合タンパク質から分離する非競合置換剤とを接触させるステップを含まない、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月２９日に出願された米国仮出願第６２／３６８，９４０号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照によって組み込まれる。

【0002】

本発明は、一般に、ビタミンＤ検出の分野に関する。詳細には、本発明は、生体液などの試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための、新規な方法およびキットを提供する。

【背景技術】

【0003】

ビタミンＤは、ステロイド様の脂溶性プロホルモンである。ビタミンＤには、Ｄ２（エルゴカルシフェロール）およびＤ３（コレカルシフェロール）の２つの主な形がある。ビタミンＤ３は、紫外線に曝された際に、身体によって製造することができる。ビタミンＤ３およびビタミンＤ２は共に、肝臓および腎臓におけるそれらの代謝を通して、活性ホルモン１，２５－ジヒドロキシビタミンＤに変換される。

【0004】

ビタミンＤ３は、日光（紫外線）に曝すことによって皮膚内で合成されると共に、主に魚肝油および卵黄に由来する食事から得られる。ビタミンＤ２は、主に栄養補助食品から得られ、ビタミンＤ欠乏に関する米国で唯一の処方薬はビタミンＤ２で作製される。ビタミンＤ３またはＤ２は、肝臓によって２５（ＯＨ）Ｄに代謝され、次いで腎臓によって１，２５（ＯＨ）２Ｄに変換される。２５（ＯＨ）ビタミンＤは、体内のビタミンＤのレベルを反映する主要な循環型であるが、１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤは、最も生物学的に活性な形である。

【0005】

日光への不十分な曝露または食事もしくは補助食品からの低い摂取量は、ビタミンＤ欠乏を引き起こし得る。ビタミンＤ欠乏は骨石灰化を損ない、くる病を子供に引き起こし、骨軟化症を成人に引き起こし、骨粗しょう症に寄与し得る。最近の研究は、ビタミンＤ欠乏が、がん、心血管疾患、糖尿病、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、薬効、および原因を問わない死亡率にも結び付けられることを示している。

【0006】

ビタミンＤに関する典型的な正常または十分な範囲は、約３０～１００ｎｇ／ｍＬである。約１０～３０ｎｇ／ｍＬのビタミンＤのレベルは、欠乏していると見なされる。１０ｎｇ／ｍＬ未満のビタミンＤのレベルは、ひどく欠乏していると見なされる。１５０ｎｇ／ｍＬよりも多いビタミンＤのレベルは、有毒と見なされる。

【0007】

様々なビタミンＤのアッセイは、当技術分野で公知である。例えば、様々なビタミンＤのアッセイは、米国特許第５，８２１，０２０号、第７，０８７，３９５Ｂ１号、第７，４８２，１６２Ｂ２号、第７，９６４，３６３Ｂ２号、第８，１３３，６９４Ｂ２号、米国特許公開第２００４／０１３２１０４Ａ１号、およびＷＯ２０１２／０９１５６９Ａ１に開示される。
生体液などの試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための信頼できる、感度が高く特異的な方法、特に、均質アッセイとして実行することができかつ／または典型的な臨床検査室の環境にある自動化臨床化学分析器に適する方法が、依然として求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】米国特許第５，８２１，０２０号明細書

【文献】米国特許第７，０８７，３９５号明細書

【文献】米国特許第７，４８２，１６２号明細書

【文献】米国特許第７，９６４，３６３号明細書

【文献】米国特許第８，１３３，６９４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００４／０１３２１０４号明細書

【文献】国際公開第２０１２／０９１５６９号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

一態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファおよび／または酸性ｐＨのバッファ、ならびに表面（複数可）または粒子に結合させた、例えば個別に結合させた少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体とを接触させるステップであって、１種の抗体、例えば１種のモノクローナル抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、別の抗体、例えば別のモノクローナル抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、ステップ、ならびにｂ）前記特異的抗体と前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、前記試料中の前記ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップを含む、方法を提供する。必要に応じて、抗体は、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる。

【0010】

別の態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファおよび／または酸性ｐＨのバッファ、ならびに少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体とを接触させるステップであって、前記抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）がビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、かつ固体表面、例えばマイクロタイタープレートまたは粒子の固体表面に結合されており、少なくとも別の前記抗体（または第２の抗体）が前記第１の抗体と前記ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有し、かつシグナル発生部分で標識される、ステップ、ならびにｂ）前記抗体、例えば前記特異的抗体と、前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、前記試料中の前記ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップを含む、方法を提供する。必要に応じて、抗体は、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる。

【0011】

さらに別の態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするためのキットであって、ａ）ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファ、および／または酸性ｐＨのバッファ；ｂ）表面またはラテックス粒子などの粒子に結合させた、例えば個別に結合させた少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体であって、１種の抗体、例えば１種のモノクローナル抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に結合する親和性を有し、別の抗体、例えば別のモノクローナル抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に結合する親和性を有する、抗体を含む、キットを提供する。

【0012】

さらに別の態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）前記試料と、酸性ｐＨのバッファを含む第１の試薬とを接触させて、前記試料中の前記ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させるステップ；ｂ）ステップａ）からの前記試料中の前記ビタミンＤ部分と、前記ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する第１の抗体でコーティングされた粒子、例えば磁性粒子を含む第２の試薬とを接触させて、ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体を形成するステップ；ならびにｃ）前記ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体と、シグナル発生分子で標識された第２の抗体を含む第３の試薬とを接触させて、前記ビタミンＤ部分と、前記第１の抗体複合体と、シグナル発生部分または分子で標識された前記第２の抗体との間で複合体を形成するステップ；ならびにｄ）前記ビタミンＤ部分と、前記第１の抗体と、前記第２の抗体との間の前記複合体からの前記シグナルを評価して、前記試料中のビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、シグナル発生部分または分子は、アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびフルオレシン（fluoresin）からなる群から選択される。

【0013】

さらに別の態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための反応混合物であって、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファ、および／または酸性ｐＨのバッファと；表面（複数可）またはラテックス粒子などの粒子に結合させた、例えば個別に結合させた少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体とを含み、１種の抗体、例えば１種のモノクローナル抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に結合する親和性を有し、別の抗体、例えば別のモノクローナル抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に結合する親和性を有する、反応混合物を提供する。

【0014】

一部の実施形態では、第１の抗体は、表面（複数可）または磁性粒子などの粒子上にコーティングすることができ、別の抗体または第２の抗体は、酵素（例えば、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼ）などのシグナル発生分子、またはアクリジニウムエステル、イソルミノールなどの化学発光シグナル発生分子、またはフルオレセインおよび緑色蛍光タンパク質などの蛍光分子で標識することができる。反応混合物におけるビタミンＤ部分の存在下、第２の抗体は、試料からのビタミンＤ部分と、表面（複数可）または粒子上にコーティングされた第１の抗体との間で形成された複合体に結合して、複合体、例えば「サンドイッチ」複合体（第１の抗体－ビタミンＤ－第２の抗体）を形成し、表面（複数可）または粒子上に形成された「サンドイッチ」の量は、試料中のビタミンＤ部分の量に比例し、第２の抗体分子上に標識されるシグナル発生分子からのシグナルを検出することによって定量的に評価することができる。

【0015】

一部の実施形態では、少なくとも２種の抗体を同じ粒子もしくは表面または同じタイプの粒子（複数可）または表面に結合させることができる。他の実施形態では、少なくとも２種の抗体は、異なる粒子もしくは表面または異なるタイプの粒子もしくは表面に結合させることができる。

【0016】

一部の実施形態では、本発明の方法およびキットは、参照によりそれら出願の全体が組み込まれる米国特許出願第１３／７０７，５１４号および第１４／１６９，１１８号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１３８３１号に記述されかつ／または権利が主張された方法およびキットの、選択された要素または特色を使用しまたは組み込むことができる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファおよび／または酸性ｐＨのバッファ、ならびに表面（複数可）または粒子、例えばナノ粒子に結合させた、例えば個別にコンジュゲートさせた少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体とを接触させるステップであって、該抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、少なくとも別の該抗体（または第２の抗体）が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有し、必要に応じて該抗体が該ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる、ステップ、ならびに
ｂ）該抗体、例えば該特異的抗体と該ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、該試料中の該ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記抗体と前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価する前に、天然ビタミンＤ結合タンパク質を前記試料から除去するステップを含まず、かつ／または洗浄ステップを含まない、項目１に記載の方法。
（項目３）
均質アッセイとして実行される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記試料と、前記ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能な酸性ｐＨのバッファを含む単一反応混合物、および粒子、例えばナノ粒子上に個別にコンジュゲートさせたペア抗体とを接触させ、一方の抗体または第１の抗体が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記試料、前記酸性ｐＨバッファ、および粒子、例えばナノ粒子上にコンジュゲートさせた抗体を含む、最終反応混合物のｐＨが、約３．０から約１３、好ましくは約５．５から約８．５の範囲である、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
被験体の前記ビタミンＤ部分の状態を評価するのに使用され、前記試料が、該被験体から得られたかつ／または該被験体に由来する生物学的試料である、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ビタミンＤ部分が、２５（ＯＨ）Ｄ２、２５（ＯＨ）Ｄ３、または２５（ＯＨ）Ｄ２と２５（ＯＨ）Ｄ３とを合わせたものである、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記酸性ｐＨバッファが、酢酸ナトリウムバッファ、もしくはクエン酸ナトリウムバッファ、もしくはリン酸バッファ、これらの組合せ、または該酸性ｐＨ範囲で緩衝機能を有する任意のバッファである、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記酸性バッファの前記ｐＨが、約２．５から約６．９の範囲にある、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体がペアモノクローナル抗体であり、一方の抗体または第１の抗体が前記ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記抗体が、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組合せである、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記第１の抗体が２５（ＯＨ）Ｄに特異的に結合し、前記第２の抗体が該第１の抗体と２５（ＯＨ）Ｄとの間で形成された複合体に特異的に結合する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記第１の抗体および前記第２の抗体を、粒子、例えばナノ粒子に個別にコンジュゲートさせ、アッセイ手順で単一の組合せ試薬として使用するまたは２種の個別の試薬として使用する、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記酸性ｐＨバッファが、塩、ポリマー、および／または界面活性剤であって、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質（複数可）から短期間内（例えば、３０分未満）で部分的にもしくは全体的に解離させるものを含有する、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記塩、ポリマー、および／または界面活性剤が、前記酸性ｐＨバッファに、または前記アッセイ手順で前記酸性ｐＨバッファと混合するのに使用される個別の試薬溶液に含まれる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記粒子、例えばナノ粒子が、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリメチルナフタレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリビニルナフタレン、スチレンのコポリマー、アクリル酸ジビニルベンゼン、ナフタレン、炭素６０、磁性ビーズ、金、銀、シリカ、二酸化ケイ素、二酸化クロム、および／または二酸化チタンを含む、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
粒子増強免疫混濁度測定法、粒子増強免疫比濁法、または磁性粒子（ビーズ）をベースにしたイムノアッセイ法を使用して実行される、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
ラテックス粒子が使用され、粒度（直径）が約３０ｎｍから約５００ｎｍの範囲である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
磁性粒子が使用される場合、前記粒度（直径）は約５００ｎｍから約２，０００ｎｍの範囲であってよく、必要に応じて前記第１の抗体は該磁性粒子上にコーティングされ、前記第２の抗体は、アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはフルオレシン、または緑色タンパク質などの化学発光または蛍光シグナル発生分子で標識され、さらに必要に応じて、前記アッセイが、１つまたは２つの洗浄ステップを伴う不均質フォーマットで実行される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記アッセイが、１つまたは複数の相分離ステップを伴う不均質アッセイである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記アッセイが、３０分またはそれよりも短い時間内で完了する、項目１から２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記アッセイが、一般的な化学分析器または臨床化学分析器で実行される、項目１から２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記アッセイが、該アッセイプロセスでまたはその前またはその最中で前記試料からビタミンＤ結合タンパク質などのいかなる基質も物理的に除去する必要なしに、均質フォーマットで実行される、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記アッセイが、６０分またはそれよりも短い時間内で完了する、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
試料中のビタミンＤ部分をアッセイするためのキットであって、
ａ）ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファ、および／または酸性ｐＨのバッファ、
ｂ）表面（複数可）または粒子、例えばラテックス粒子に結合させた、例えば個別にコンジュゲートさせた少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体であって、該抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、少なくとも別の該抗体（または第２の抗体）が、該試料中に存在する場合、該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成される複合体に対して特異的結合親和性を有し、必要に応じて該抗体が該ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる、抗体
を含む、キット。
（項目２６）
前記少なくとも２種の抗体と前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、前記試料中の前記ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するための手段をさらに含む、項目２５に記載のキット。
（項目２７）
１）塩、ポリマー、および／または界面活性剤を含有する酸性ｐＨのバッファを含む、第１のアッセイ試薬、ならびに
２）粒子、例えばナノ粒子上に個別にコンジュゲートさせたペア抗体を含む第２のアッセイ試薬であって、１種の抗体または第１の抗体が２５（ＯＨ）Ｄに対して特異的結合親和性を有し、別の抗体または第２の抗体が該第１の抗体と該２５（ＯＨ）Ｄとの間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、第２のアッセイ試薬
を含む、項目２５に記載のキット。
（項目２８）
項目２５から２７のいずれかに記載のキットを使用して、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）試料と前記第１のアッセイ試薬との混合物を形成し、ある期間にわたって該混合物をインキュベートし、その後、前記第２のアッセイ試薬を該混合物に添加するステップ、および
ｂ）該反応混合物の光学変化を測定し、一組の２５（ＯＨ）Ｄ較正物質を使用することによって、該試料中の２５（ＯＨ）Ｄの量を定量するステップ
を含む、方法。
（項目２９）
項目２５から２７のいずれかに記載のキットを使用して、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）該試料と、マイクロタイタープレート上にコーティングされた前記第１の抗体とを、前記第１のアッセイ試薬の存在下で接触させ、ある期間にわたって混合物をインキュベートするステップ、ならびに
ｂ）シグナル伝達分子（例えば、ＨＲＰ）で標識された前記第２の抗体を添加するステップ、ならびに
ｃ）インキュベーションおよび洗浄ステップ（複数可）後、シグナル強度および較正曲線に基づいて、該試料中の該ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップ
を含む、方法。
（項目３０）
試料中のビタミンＤ部分をアッセイするためのキットであって、
ａ）酸性ｐＨのバッファ、
ｂ）該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する第１の抗体でコーティングされた粒子、例えば磁性粒子、
ｃ）アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはフルオレシンから選択されるシグナル発生分子で標識された第２の抗体、
ｄ）化学発光または蛍光シグナル発生に必要とされる基質（複数可）溶液および／またはスターター
を含む、キット。
（項目３１）
前記基質（複数可）溶液および／またはスターターをさらに含む、項目３０に記載のキット。
（項目３２）
シグナル検出前に相分離ステップ（複数可）および／または洗浄ステップ（複数可）を伴う、不均質アッセイ用に構成された、項目３０または３１に記載のキット。
（項目３３）
項目３０から３２のいずれかに記載のキット、ならびに化学発光または蛍光シグナル発生に必要とされる基質（複数可）溶液および／またはスターターを含む、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための製品。
（項目３４）
前記別の抗体（第２の抗体）が、前記抗体の１種（または前記第１の抗体）によって結合されていない前記ビタミンＤ部分上のエピトープに特異的に結合する、項目１から２４のいずれかに記載の方法、または項目２５から２７および項目３０から３２のいずれかに記載のキット。
（項目３５）
前記別の抗体（第２の抗体）が、前記抗体の前記１種（または前記第１の抗体）に結合しまたは特異的に結合する、項目１から２４のいずれかに記載の方法、または項目２５から２７および項目３０から３２のいずれかに記載のキット。
（項目３６）
試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）該試料と、酸性ｐＨのバッファを含む第１の試薬とを接触させて、該試料中の該ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させるステップ、
ｂ）ステップａ）からの該試料中の該ビタミンＤ部分と、該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する第１の抗体でコーティングされた粒子、例えば磁性粒子を含む第２の試薬とを接触させて、ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体を形成するステップ、ならびに
ｃ）該ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体と、シグナル発生部分または分子で標識された第２の抗体を含む第３の試薬とを接触させて、該ビタミンＤ部分と、該第１の抗体と、シグナル発生部分または分子で標識された該第２の抗体との間で複合体を形成するステップ、ならびに
ｄ）該ビタミンＤ部分と、該第１の抗体複合体と、該第２の抗体との間の該複合体からの該シグナルを評価して、該試料中の該ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップ
を含む、方法。
（項目３７）
前記シグナル発生部分または分子が、アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびフルオレシンからなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、
ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファおよび／または酸性ｐＨのバッファ、ならびに少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体とを接触させるステップであって、該抗体の少なくとも１種（または第１の抗体）が該ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、かつ固体表面、例えばマイクロタイタープレートまたは粒子の固体表面に結合されており、少なくとも別の該抗体（または第２の抗体）が該第１の抗体と該ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有し、かつシグナル発生部分で標識される、ステップ、ならびに
ｂ）該抗体、例えば該特異的抗体と、該ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、該試料中の該ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップ
を含む、方法。
（項目３９）
前記抗体が、前記ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる、項目３８に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ＡＵ６８０分析器でラテックス増強イムノアッセイ法を使用する総２５（ＯＨ）Ｄアッセイの、例示的なまたは典型的な較正曲線を示す。

【0018】

【図2】図２は、ＡＵ６８０分析器でラテックス粒子増強イムノアッセイ法を使用する総２５（ＯＨ）Ｄアッセイの、例示的なまたは典型的な線形曲線を示す。

【0019】

【図3】図３は、市販の化学発光イムノアッセイ法（ＤｉａＳｏｒｉｎアッセイ）と比較した、ラテックス増強イムノアッセイ法を使用する総２５（ＯＨ）Ｄアッセイの例示的なまたは典型的な方法の比較データを示す。

【0020】

【図4】図４は、ゴールドスタンダード法、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法と比較した、ラテックス粒子増強イムノアッセイ法を使用する総２５（ＯＨ）Ｄアッセイの、例示的なまたは典型的な方法の比較データを示す。

【0021】

【図5】図５は、磁性粒子をベースにしたイムノアッセイ検出法を使用する総２５（ＯＨ）Ｄアッセイの、例示的なまたは典型的な較正曲線を示す。

【0022】

【図6】図６は、市販の化学発光イムノアッセイ法と比較した、磁性粒子をベースにしたイムノアッセイ検出法を使用する総２５（ＯＨ）Ｄアッセイの、例示的なまたは典型的な方法の比較データを示す。

【0023】

【図7】図７は、例示的な線形試験結果を示す。

【0024】

【図8】図８は、例示的な方法の比較結果を示す。

【0025】

【図9】図９は、例示的なマトリックス比較の結果（Ｋ２－ＥＤＴＡ対血清）を示す。

【0026】

【図10】図１０は、例示的なマトリックス比較の結果（Ｋ３－ＥＤＴＡ対血清）を示す。

【0027】

【図11】図１１は、例示的なマトリックス比較の結果（Ｋ２－Ｌｉ－ヘパリン対血清）を示す。

【0028】

【図12】図１２は、例示的な方法の比較結果（対ＲｏｃｈｅＶＤアッセイ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

限定のためではなく、開示を明瞭にするために、本発明の詳細な記述を以下のサブセクションに分ける。
Ａ．定義

【0030】

他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許、出願、公開出願、および他の刊行物は、それらの全体が参照により組み込まれる。このセクションで述べる定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載される定義と相反しておりまたはその他の点で矛盾している場合、このセクションで述べる定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義よりも優先する。

【0031】

本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。

【0032】

本明細書で使用される「ビタミンＤ部分」は、カルシウムおよびホスフェートの腸吸収に関与する脂溶性セコステロイドの群である、ビタミンＤファミリーの全てのメンバーまたは形を指す。例示的なビタミンＤの形には、ビタミンＤ_１、Ｄ_２（エルゴカルシフェロール）、Ｄ_３（コレカルシフェロール）、Ｄ_４、およびＤ_５が含まれる。例示的なビタミンＤ部分には、カルシフェジオール（ＩＮＮ）、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール、または２５－ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄと省略される）としても公知のものであり；かつ人のビタミンＤ状態を決定するのに血清中で測定される特異的ビタミンＤ代謝物である、カルシジオール、ならびに、ビタミンＤの生物学的に活性な形であるカルシトリオールも含まれる。一部の実施形態では、「ビタミンＤ部分」は、２５－ヒドロキシビタミンＤ（Ｄ２およびＤ３形を含む２５（ＯＨ）Ｄと省略される）を指す。

【0033】

本明細書で使用される「抗体」は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特異的抗体、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構造（modified configuration）も含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、結合試薬、例えば抗体の特異性であって、定義された分析物または標的、例えばビタミンＤ部分に優先的に結合するような特異性を指す。他の潜在的な標的の存在下、特定の分析物または標的の結合試薬または抗体による認識は、そのような結合の１つの特徴である。一部の実施形態では、分析物に特異的に結合する結合試薬は、試験がなされる試料中の他の１つまたは複数の干渉部分との結合を回避する。

【0034】

「ビタミンＤ結合タンパク質」は、ｇｃ－グロブリン（群特異的成分）としても公知である。一部の実施形態では、「ビタミンＤ結合タンパク質」は、アルブミンファミリーのビタミンＤ結合タンパク質を指す。「ビタミンＤ結合タンパク質」は、しばしば、血漿、腹水、脳脊髄液中、および／または多くの細胞型の表面に見出される。「ビタミンＤ結合タンパク質」は、しばしばビタミンＤおよびその代謝物に結合し、それらをｉｎｖｉｖｏで標的組織に輸送する。ヒトにおける例示的な「ビタミンＤ結合タンパク質」は、ＧＣ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、「ビタミンＤ結合タンパク質」は、当技術分野で公知のビタミンＤ結合タンパク質、例えば、ウェブサイト：https://en.wikipedia.org/wiki/Albuminに記述されるビタミンＤ結合タンパク質を指す。

【0035】

一部の実施形態では、「腹水」は、ウェブサイト：https://en.wikipedia.org/wiki/Ascitesで記述されるように使用される。一部の実施形態では、「脳脊髄液」は、ウェブサイト：https://en.wikipedia.org/wiki/Cerebrospinal_fluidで記述されるように使用される。

【0036】

本明細書で使用される「評価する」という用語は、試料に存在する分析物の量または濃度に関する絶対値を得るという意味で、また指標、比、パーセンテージ、視覚的なまたは他の値であって試料中の分析物のレベルを示すものを得るという意味で、定量的および定性的な決定を含むものとする。評価は、直接的または間接的であってもよく、実際に検出される化学種は、当然ながら分析物そのものである必要はなく、例えばその誘導体またはさらにいくつかの物質であってもよい。

【0037】

本明細書で使用される「試料」という用語は、分析物アッセイが望まれる分析物を含有し得るどんなのものでも指す。試料は、生体液または生体組織などの生物学的試料であってもよい。生体液の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘膜、羊水などが含まれる。生体組織は、通常は特定の種類の細胞と、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、またはウイルス構造の構造材料の１種を形成するそれらの細胞間物質とが一緒になった凝集体であり、結合組織、上皮組織、筋肉組織、および神経組織が含まれる。生体組織の例には、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈、および個別細胞（複数可）も含まれる。

【0038】

本明細書で使用される「血液試料」は、全血試料またはそれに由来する血漿もしくは血清画分を指す。好ましくは、血液試料は、全血またはそれに由来する血漿もしくは血清画分などのヒト血液試料を指す。血液試料は、ヘモグロビン分子からの酸化的干渉をなくしまたは有意に低減させるために、実質的に全てのヘモグロビン（即ち、赤血球）を除去することによって、アッセイ前に前処理されることも好ましい。

【0039】

本明細書で使用される「全血」という用語は、分画されておらず細胞および流体の両方の成分を含有する血液試料を指す。本明細書で使用される「全血」は、凝血する前に試験がなされる新たに採血された血液、あるいは従来通り採血された血液試料であって、バキュテナー内に採血され得るもの、および、例えばリチウム－ヘパリン、ＥＤＴＡなどの抗凝固薬を含有し得るもの、または通常の臨床検査の過程でそこに１種もしくは複数種の他の標準臨床剤を添加し得るものを指す。

【0040】

本明細書で使用される「実質的に全てのヘモグロビンが除去された」という文言は、ヘモグロビンからの酸化的干渉をなくしまたは有意に低減させるように、試料中の全てのヘモグロビン含有赤血球の好ましくは少なくとも約５０％、６０％、または７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、９０％、または９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９、または１００％が除去された、血液試料を指す。

【0041】

本明細書で使用される「血漿」という用語は、全血の非細胞成分の流体を指す。使用される分離方法に応じて、血漿は、細胞成分を完全に含まなくてもよく、または様々な量の血小板および／もしくは少量の他の細胞成分を含有してもよい。血漿は、フィブリノゲンなどの様々な凝血因子を含むので、「血漿」という用語は、以下に述べる「血清」とは区別される。

【0042】

本明細書で使用される「血清」という用語は、全ヒト血清などの全哺乳動物血清を指す。さらに、本明細書で使用される「血清」は、そこから凝血因子（例えば、フィブリノゲン）が除去された血漿を指す。

【0043】

本明細書で使用される「流体」という用語は、流れることができる任意の組成物を指す。したがって流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形をとる、組成物を包含する。

【0044】

本明細書で使用される「疾患」または「障害」という用語は、例えば感染または遺伝的欠陥から生じ、同定可能な症状により特徴付けられる、生物の病理学的状態を指す。

【0045】

本明細書で使用される「接触する」は、２種またはそれよりも多くの成分を接触させることを意味する。「接触する」は、全ての成分を流体または半流体の混合物中で混合することによって、実現することができる。「接触する」は、１種または複数種の成分が、固体組織区分または基質などの固体表面の１種または複数種の他の成分と接触するときに実現することもできる。

【0046】

本明細書で使用される「比較する」という用語は、一般に、２つまたはそれよりも多くの値の間の類似性または相違を記述するために検査することを意味する。好ましくは、「比較する」は、例えば１つの値を別の値から差し引き、２つの値の比を計算し、１つの値の別の値に対するパーセンテージを計算し、またはこれらのタイプの計算を組み合わせて単一の数値を生成するなどの、定量的比較を指す。本明細書で使用される「比較する」は、さらに、ヒトによって行われる比較、コンピュータまたは他のプロセッサによって行われる比較、およびヒトとコンピュータまたは他のプロセッサとを組み合わせて行われる比較を指す。

【0047】

本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなること」および／または「から本質的になること」を含むと理解される。

【0048】

本発明の他の目的、利点、および特色は、添付図面と併せて解釈される以下の明細書から明らかにされよう。
Ｂ．ビタミンＤ部分をアッセイするための方法

【0049】

一態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、酸性ｐＨのバッファ、粒子または表面（複数可）、例えばラテックス粒子に結合させた、例えば個別に結合させた少なくとも２種の抗体、例えば少なくとも２種のモノクローナル抗体とを接触させるステップであって、抗体の１種または第１の抗体が前記ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、別の抗体または第２の抗体が第１の抗体と前記ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、ステップ；ならびにｂ）前記少なくとも２種の抗体と前記ビタミンＤ部分との間でまたは間で形成された複合体、例えば前記２種のモノクローナル抗体と前記ビタミンＤ部分との間のサンドイッチ複合体の形成に起因して、結合、例えば粒子の凝集の程度を評価して、前記試料中の前記ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップを含む、方法を提供する。必要に応じて、抗体は、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる。一部の実施形態では、少なくとも２種の抗体は、同じ粒子もしくは表面、または同じタイプの粒子（複数可）もしくは表面に結合させることができる。他の実施形態では、少なくとも２種の抗体は、異なる粒子もしくは表面に、または異なるタイプの粒子もしくは表面に結合させることができる。

【0050】

【0051】

一部の実施形態では、本発明の方法は、特異的抗体とビタミンＤ部分との間の結合を評価するステップの前に、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質などのタンパク質を試料から除去するステップ（例えば、米国特許第５，８２１，０２０号を参照されたい）を含まない。他の実施形態では、本発明の方法は、いかなる洗浄ステップも含まない。

【0052】

本発明の方法は、任意の適切なアッセイフォーマットで実行することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、均質アッセイとして実行される。他の実施形態では、本発明の方法は、不均質アッセイとして実行される。

【0053】

試料は、単一ステップにおいてまたは複数のステップ、例えば２もしくは３つのステップにおいて、酸性ｐＨのバッファおよび２種の抗体、例えば２種のモノクローナル抗体であって、粒子、例えばラテックス粒子上に個別にコーティングされたものと接触することができる。例示的な複数のステップの接触順序は以下の通りであり得る：１）酸性ｐＨのバッファ、２種の前記モノクローナル抗体で個別にコーティングされたラテックス粒子の添加前にある期間にわたってインキュベートするステップ；２）酸性ｐＨのバッファ、第１の抗体でコーティングされたラテックス粒子、前記第２の抗体でコーティングされたラテックス粒子の添加前にある期間にわたりインキュベートするステップ。

【0054】

試料、酸性ｐＨバッファ、２種の特異的抗体で個別にコーティングされた粒子、例えばラテックス粒子を含む、最終反応混合物におけるｐＨは、任意の適切な値または範囲にすることができる。一部の実施形態では、試料、酸性ｐＨバッファ、およびラテックス粒子を含む最終反応混合物におけるｐＨは、２．５またはそれよりも高い。他の実施形態では、試料、酸性ｐＨバッファ、およびラテックス粒子を含む最終反応混合物におけるｐＨは、１３またはそれよりも低い。さらに他の実施形態では、試料、酸性ｐＨバッファ、およびラテックス粒子を含む最終反応混合物におけるｐＨは、約２．５から約１３の範囲にあり、例えば約２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、または１３である。

【0055】

一部の実施形態では、本発明の方法は、試料と、シクロデキストリン、サリチル酸ナトリウム、およびＮａＯＨを含むビタミンＤ放出組成物、例えば米国特許第７，０８７，３９５Ｂ１号に開示されたビタミンＤ放出組成物とを接触させるステップを含まない。

【0056】

一部の実施形態では、本発明の方法は、ＷＯ２０１２／０９１５６９Ａ１に開示されたステップなど、ビタミンＤ結合タンパク質から２５（ＯＨ）ビタミンＤを放出するために、試料と、パーフルオロアルキル酸またはその塩とを接触させるステップを含まない。

【0057】

一部の実施形態では、本発明の方法は、米国特許第７，９６４，３６３Ｂ２号に開示されたステップなど、試料中のビタミンＤ結合タンパク質を消化するために、試料と、エンドタンパク質分解活性およびエキソタンパク質分解活性（exoproteolytic activity）を持つセリンプロテアーゼとを接触させるステップを含まない。

【0058】

本発明の方法は、任意の適切な目的のために使用することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、被験体におけるビタミンＤ部分の状態を評価するのに使用することができ、試料は、被験体から得られるかつ／または被験体に由来する生物学的試料である。本発明の方法は、任意の適切な被験体、例えば哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、ヒト、または実験用動物で、ビタミンＤ部分の状態を評価するのに使用することができる。

【0059】

本発明の方法は、任意の適切な試料中でビタミンＤ部分をアッセイするために使用することができる。一部の実施形態では、試料は、生体液、例えば全血、血漿、血清、または尿である。

【0060】

本発明の方法は、試料中の任意の適切なビタミンＤ部分をアッセイするために使用することができる。一部の実施形態では、ビタミンＤ部分は、ビタミンＤ_３、ビタミンＤ_２、ビタミンＤ代謝物、または１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ_３［１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３］である。他の実施形態では、ビタミンＤ部分は、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）、例えば２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、または２５（ＯＨ）Ｄ２および２５（ＯＨ）Ｄ３を合わせたものである。

【0061】

任意の酸性ｐＨバッファを、本発明の方法で使用することができる。一部の実施形態では、酸性ｐＨバッファは、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、もしくはリン酸、または酸性ｐＨ範囲で緩衝機能を有する他のバッファとすることができる。

【0062】

他の実施形態では、抗体は２５（ＯＨ）Ｄに特異的に結合し、抗体は２５（ＯＨ）Ｄの複合体に特異的に結合し、第１の抗体は任意の適切な形をとることができる。例えば、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはＦａｂ断片もしくは一本鎖抗体などの抗体の断片を、使用することができる。さらに他の実施形態では、米国特許公開第２０１１／００９７７３３Ａ１号に開示された例示的な抗体を使用することができる。

【0063】

任意の適切な粒子を、本発明の粒子をベースにしたアッセイフォーマットに使用することができる。一部の実施形態では、粒子は、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリメチルナフタレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリビニルナフタレン、スチレンのコポリマー、アクリル酸ジビニルベンゼン、ナフタレン、炭素６０、磁性ビーズ、金、銀、シリカ、二酸化ケイ素、二酸化クロム、および／または二酸化チタンを含む。他の実施形態では、粒子はナノ粒子である。ナノ粒子は、任意の適切なサイズまたは直径を有することができる。例えばナノ粒子は、約３０ｎｍから約５００ｎｍの範囲の任意の直径、例えば約３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、または５００ｎｍを有することができる。

【0064】

本発明の方法は、任意の適切なアッセイフォーマットで使用することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、粒子増強免疫混濁度測定法（immunoturbidimetric method）を使用して実行される。例えば、米国特許第４，７０３，０１８号を参照されたい。他の実施形態では、本発明の方法は、粒子増強免疫比濁法（immunonephelometric method）を使用して実行される。例えば、米国特許第４，６９０，９０６号を参照されたい。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、磁性粒子（ビーズ）をベースにしたイムノアッセイ法を使用して実行される。例えば、Yuら、Journal of Immunological Methods、２１８巻（１～２号）：１～８頁（１９９８年）を参照されたい。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、粒子をベースにした免疫凝集アッセイ法を使用して実行される。例えば、Wangら、Clinical Chemistry、５２巻（１１号）：２０６５～２０７１頁（２００６年）を参照されたい。

【0065】

一部の実施形態では、磁性粒子のサイズは、５００から２０００ナノメートルの範囲であってよく、好ましくは８００～１５００ナノメートルの範囲であってよい。

【0066】

一部の実施形態では、磁性粒子は第１の抗体とコンジュゲートさせ、第２の抗体は、アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼなどのシグナル伝達分子とコンジュゲートさせる。

【0067】

一部の実施形態では、ビタミンＤアッセイは、２ステップ化学発光イムノアッセイフォーマットを使用して行われる。試料を酸性ｐＨバッファと接触させ、その後、インキュベーション期間を経た後に、粒子、例えば磁性粒子上にコンジュゲートさせた抗体を添加する。インキュベーション後、粒子、例えば磁性粒子を洗浄バッファで１～３回洗浄し、バッファに再懸濁した後に、シグナル伝達分子で標識された第２の抗体を添加する。インキュベーション後、磁性粒子を再び洗浄し、バッファに再懸濁した後に、化学発光反応に必要とされる基質を添加する。

【0068】

一部の実施形態では、ビタミンＤアッセイは、１ステップ化学発光イムノアッセイフォーマットを使用して行われる。試料を、酸性ｐＨバッファ、第１の抗体でコーティングされた粒子、例えば磁性粒子、およびシグナル伝達分子で標識された第２の抗体と、同時に接触させる。インキュベーション期間の後、粒子、例えば磁性粒子をバッファで１～３回洗浄し、バッファに再懸濁した後に、化学発光反応に必要とされる基質を添加する。

【0069】

一部の実施形態では、本発明の方法は、均質アッセイフォーマットを使用して実行される。他の実施形態では、本発明の方法は、不均質アッセイフォーマットを使用して実行される。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、サンドイッチアッセイフォーマットまたは競合アッセイフォーマットを使用して実行される。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のフォーマットを使用して実行される。

【0070】

任意の適切な均質アッセイフォーマットを使用することができる。一部の実施形態では、均質アッセイは、米国特許公開第２００４／０１３２１０４Ａ１号または米国特許第８，１３３，６９４Ｂ２号に開示された粒子分離ステップおよび洗浄ステップなどの相分離ステップまたは洗浄ステップなしに、単一反応混合物において実行される。

【0071】

本発明の方法は、任意の適切な反応時間で実行することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、約６０分またはそれよりも短い、例えば約５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分、または１分である、合計アッセイ時間を有する。例えば本発明の方法は、開始から、例えば試料および／または試薬（複数可）の添加から、シグナル読出し時間までが、約６０分またはそれよりも短い、例えば約５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分、または１分である、アッセイ時間を有することができる。

【0072】

本発明の方法は、任意の適切な分析機器上で実行することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、一般的な化学分析器または臨床化学分析器、例えば、Ｒｏｃｈｅ、日立、ＭｏｄｕｌａｒＰ、Ｃｏｂａｓシリーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ／ＯｌｙｍｐｕｓＡＵシリーズ、ＢｅｃｋｍａｎＳｙｎｃｈｒｏｎ、およびＤＸＣシリーズ、またはＡｂｂｏｔＡｒｃｈｉｔｅｃｔシリーズからの一般的な化学分析器または臨床化学分析器上で実行される。

【0073】

本発明の方法は、任意の適切な精度を実現するように実行することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、約３０％またはそれよりも低い、例えば約３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも低い精度またはＣＶを実現するように実行することができる。例えば本発明の方法は、約３０ｎｇ／ｍｌまたはそれよりも低い、例えば約３０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、またはそれよりも低いビタミンＤ部分のレベルに関して、約５％またはそれよりも低い、例えば約５％、４％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％またはそれよりも低い精度またはＣＶを実現するように実行することができる。別の例では、本発明の方法は、約１００ｎｇ／ｍｌまたはそれよりも低い、例えば約１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、またはそれよりも低いビタミンＤ部分のレベルに関し、約１０％またはそれよりも低い、例えば約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４．０％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、またはそれよりも低い精度またはＣＶを実現するように実行することができる。
Ｃ．ビタミンＤ部分をアッセイするためのキットおよびその使用

【0074】

別の態様では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするためのキットであって、ａ）ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファ、および／または酸性ｐＨのバッファ（Ｒ１）；ｂ）少なくとも２種の抗体でコーティングされた、例えば個別にコーティングされた、表面（複数可）または粒子、例えばラテックス粒子（Ｒ２）を含み、抗体の１種または第１の抗体は、ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、別の抗体または第２抗体は、第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、キットを提供する。必要に応じて、抗体は、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる。一部の実施形態では、少なくとも２種の抗体は、同じ粒子または同じタイプの粒子（複数可）もしくは表面（複数可）に結合させることができる。他の実施形態では、少なくとも２種の抗体は、異なる粒子もしくは表面、または異なるタイプの粒子もしくは表面に結合させることができる。

【0075】

酸性ｐＨの任意の適切なバッファは、本発明のキットで使用することができる。一部の実施形態では、酸性ｐＨバッファは、酢酸ナトリウムバッファまたはクエン酸ナトリウムバッファまたはリン酸バッファである。

【0076】

ビタミンＤ部分に特異的に結合する一方の抗体または第１の抗体、および第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に特異的に結合する他方の抗体または第２の抗体を含む任意の適切な抗体の組合せを使用することができる。任意の適切な形にある抗体を使用することができる。例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、Ｆａｂ断片もしくは一本鎖抗体などの抗体の断片を使用することができる。さらに他の実施形態では、米国特許公開第２０１１／００９７７３３Ａ１号に開示された例示的な抗体を使用することができる。

【0077】

本発明のキットは、任意の追加の適切な試薬または成分を含むことができる。一部の実施形態では、本発明のキットはさらに、特異的抗体とビタミンＤ部分との間の結合を評価して、試料中のビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するための手段を含む。

【0078】

本発明のキット内の試薬または成分は、任意の適切な様式または形で製剤化しまたは配置構成する（arranged）ことができる。一部の実施形態では、本発明のキットは、下記の試薬：（１）酸性ｐＨのバッファを含む第１のアッセイ試薬（Ｒ１）；（２）表面（複数可）または粒子、例えばラテックス粒子上にコーティングされた、例えば個別にコーティングされた２種の特異的抗体を含む、第２のアッセイ試薬（Ｒ２）を含み、一方の抗体または第１の抗体は、ビタミンＤ部分に対して親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体は、第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して親和性を有する。

【0079】

上記キットは、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法で使用することができ、この方法は、ａ）試料と第１のアッセイ試薬との混合物を形成し、混合物を、ある期間にわたりインキュベートし、その後、第２のアッセイ試薬（例えば、特異的抗体でコーティングされたラテックス粒子）を混合物に添加するステップ；およびｂ）反応混合物の光学変化を測定し、一組のビタミンＤ部分、例えば一組の２５（ＯＨ）Ｄ較正物質を使用することによって、試料中のビタミンＤ部分、例えば２５（ＯＨ）Ｄの量を定量するステップを含む。

【0080】

さらに他の実施形態では、本発明のキットは、（１）酸性ｐＨのバッファを含む第１のアッセイ試薬、（２）ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する固定化抗体を含む固体表面、および（３）固定化抗体と試料ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して結合親和性を有する抗体を含む検出試薬を含む。本発明のキットは、適切な洗浄試薬をさらに含むことができる。アッセイ手順は、異なる試薬添加の間に洗浄ステップを含んでいてもよい。

【0081】

さらに別の実施形態では、本発明のキットは、（１）酸性ｐＨのバッファを含む第１のアッセイ試薬；および（２）ビタミンＤ部分に対して親和性を有する抗体でコーティングされた表面（複数可）または粒子、例えば磁性粒子；および（３）化学発光に必要とされるシグナル伝達分子で標識された抗体；および（４）化学発光反応を開始するのに必要とされる１種または複数種の基質（スターター）を含む。このキットは、較正物質、対照、希釈バッファおよび／または洗浄バッファをさらに含有してもよい。

【0082】

さらに別の実施形態では、本発明は、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）前記試料と、酸性ｐＨのバッファを含む第１の試薬とを接触させて、その結合タンパク質から前記試料中の前記ビタミンＤ部分を解離させるステップ；ｂ）ステップａ）からの前記試料中の前記ビタミンＤ部分と、前記ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する第１の抗体でコーティングされた粒子、例えば磁性粒子を含む第２の試薬とを接触させて、ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体を形成するステップ；ならびにｃ）前記ビタミンＤ部分／第１の抗体複合体と、シグナル発生部分または分子で標識された第２の抗体を含む第３の試薬とを接触させて、前記ビタミンＤ部分と、前記第１の抗体と、シグナル発生部分または分子で標識された前記第２の抗体との間で複合体を形成するステップ；ならびにｄ）前記ビタミンＤ部分と、前記第１の抗体複合体と、前記第２の抗体との間の前記複合体からの前記シグナルを評価して、前記試料中のビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップを含む、方法を提供する。必要に応じて、抗体は、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる。一部の実施形態では、シグナル発生分子は、アクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびフルオレシンからなる群から選択される。

【0083】

上記キットは、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）試料および第１のアッセイ試薬の混合物を形成し、ある期間にわたり混合物をインキュベートするステップ；ならびにｂ）混合物と、ビタミンＤ部分との結合に特異的な第１の抗体でコーティングされた表面（複数可）または粒子、例えば磁性粒子とを接触させるステップ；ならびにｃ）ある期間にわたりインキュベートした後に続く、洗浄ステップ；ならびにｄ）表面（複数可）または粒子、例えば磁性粒子を再懸濁し、表面（複数可）または粒子、例えば磁性粒子上の第１の抗体と、試料ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に特異的であり、化学発光のためにシグナル伝達分子で標識された第２の抗体に接触させるステップ；ならびにｅ）インキュベーション期間後に続く、別の洗浄ステップを含み、表面（複数可）または磁性粒子を、化学発光反応を誘発させるスターターまたは基質と混合する、方法で使用することができる。化学発光強度（ＲＬＵ）を検出して、試料中のビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定する。

【0084】

本発明の反応混合物またはキットは、任意の適切な様式または手法で製剤化または配置構成することができる。一部の実施形態では、本発明の反応混合物またはキットは、単相または均質相に含有される。他の実施形態では、本発明の反応混合物またはキットは、複相（不均質アッセイ）、例えば２または３相に含有される。

【0085】

必要に応じて、上記キットおよび方法における抗体は、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質とは異なる。

【0086】

本発明のキットは、任意の適切な反応時間内で実行されるように構成することができる。一部の実施形態では、本発明のキットは、約６０分またはそれよりも短い、例えば約５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分、または１分である、合計アッセイ時間を有するように構成することができる。例えば本発明のキットは、開始から、例えば試料および／または試薬（複数可）の添加から、シグナル読出し時間までが、約６０分またはそれよりも短い、例えば約５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分、または１分である、アッセイ時間を有するように構成することができる。

【0087】

本発明のキットは、任意の適切な精度が実現するように構成することができる。一部の実施形態では、本発明のキットは、約３０％またはそれよりも低い、例えば約３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも低い精度またはＣＶを実現するように構成することができる。例えば本発明のキットは、約３０ｎｇ／ｍｌまたはそれよりも低い、例えば約３０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、またはそれよりも低いビタミンＤ部分のレベルに関して、約５％またはそれよりも低い、例えば約５％、４％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％またはそれよりも低い精度またはＣＶを実現するように構成することができる。別の例では、本発明のキットは、約１００ｎｇ／ｍｌまたはそれよりも低い、例えば約１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、またはそれよりも低いビタミンＤ部分のレベルに関し、約１０％またはそれよりも低い、例えば約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４．０％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、またはそれよりも低い精度またはＣＶを実現するように構成することができる。
Ｄ．例示的な実施形態

【0088】

一部の実施形態では、本発明は、試料、例えば血液試料中の総２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ２５（ＯＨ）Ｄ濃度を決定するための方法、例えば均質法または不均質法であって、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＢＰ）からの２５（ＯＨ）Ｄの解離、解離した［２５（ＯＨ）Ｄ］または遊離２５（ＯＨ）Ｄと、２種のモノクローナル抗体との、抗体－ビタミンＤ－抗体複合体を形成する結合、および試料中の２５（ＯＨ）Ｄの検出が、相分離ステップまたは洗浄ステップが関与することなく単一反応混合物において実施される、方法を提供する。

【0089】

実施形態で特に有利なのは、著しく短い合計アッセイ時間（しばしば、均質アッセイフォーマットで＜１３分）と、その使用者に優しい均質アッセイフォーマットであって、試料の前処理または相分離／洗浄ステップの必要性をなくし、アッセイを、臨床検査室で日常的に使用される一般的な化学分析器での使用に容易に適応されるものである。

【0090】

一部の実施形態では、本発明は、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤの量を決定するために、血液または血液成分の試料をアッセイする方法であって、ａ）試料と、２５（ＯＨ）Ｄをその結合タンパク質から解離させることが可能な酸性ｐＨのバッファとを混合するステップ；ｂ）ラテックス粒子上に個別にコーティングされた２種のモノクローナル抗体を添加するステップであって、一方の抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して特異的に親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的に親和性を有する、ステップ；およびｃ）単一反応混合物で、試料中の２５（ＯＨ）Ｄの濃度を決定するステップを含み、ビタミンＤ結合タンパク質が試料から除去されず相分離ステップまたは洗浄ステップが関与していない、方法を提供する。

【0091】

一部の実施形態では、酸性ｐＨバッファが、適切な量の塩、ポリマー、例えばＰＥＧ１００ｋ、および界面活性剤を含有する酢酸ナトリウムバッファである。酸性バッファのｐＨは、２．５から６．５に範囲にわたり得る。酸性ｐＨバッファは、クエン酸ナトリウムバッファもしくはリン酸バッファまたは酸性ｐＨ範囲で緩衝機能を有する他のバッファとすることもできる。

【0092】

一部の実施形態では、ラテックス粒子は、３０ｎｍから５００ｎｍ、好ましくは１２０ｎｍから３６０ｎｍの直径サイズを有する。

【0093】

一部の実施形態では、試料は、全血、血漿、血清、および尿を含むがこれらに限定されない生体液である。

【0094】

一部の実施形態では、２５（ＯＨ）Ｄの濃度は、２５（ＯＨ）Ｄ３および２５（ＯＨ）Ｄ２を含む２５（ＯＨ）Ｄの全濃度を含む。

【0095】

一部の実施形態では、２５（ＯＨ）Ｄ決定の均質法のアッセイフォーマットは、粒子増強免疫混濁度測定法である。他の実施形態では、２５（ＯＨ）Ｄ決定の均質法のアッセイフォーマットは、粒子増強免疫比濁法である。さらに他の実施形態では、２５（ＯＨ）Ｄ決定のアッセイフォーマットは、不均質磁性粒子（ビーズ）をベースにしたイムノアッセイ法である。

【0096】

一部の実施形態では、２５（ＯＨ）Ｄ決定の不均質法のアッセイフォーマットは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法である。

【0097】

任意の適切な抗体を使用することができる。一部の実施形態では、抗体はポリクローナルである。他の実施形態では、抗体はモノクローナルである。

【0098】

任意の適切な粒子を使用することができる。一部の実施形態では、粒子は、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリメチルナフタレン、炭素６０、スチレンのコポリマー、アクリル酸、ナフタレン、磁性粒子、金、銀、シリカ、二酸化ケイ素、二酸化クロム、および二酸化チタンで作製された粒子を含むがこれらに限定されないナノ粒子である。

【0099】

一部の実施形態では、本発明は、試料中の２５（ＯＨ）Ｄを決定するためのキットであって、（１）２５（ＯＨ）Ｄをその結合タンパク質から解離させることが可能な酸性ｐＨのバッファ；および（２）２種のモノクローナル抗体で個別にコーティングされたラテックス粒子であって、一方の抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して結合親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して結合親和性を有する、ラテックス粒子を含む、２種の試薬を含む、キットを提供する。例示的なアッセイでは、血漿または血清などの試料が酸性ｐＨバッファと混合され、短期間にわたりインキュベートされ、その後、ラテックス粒子にコンジュゲートさせた抗体を含有する第２の試薬が添加される。試料中の２５（ＯＨ）Ｄ濃度は、反応混合物の光学変化を測定し、一組の２５（ＯＨ）Ｄ較正物質を使用することによって定量される。

【0100】

一部の実施形態では、本発明は、試料中の２５（ＯＨ）Ｄを決定するためのキットであって、（１）２５（ＯＨ）Ｄをその結合タンパク質から解離させる（部分的にまたは全体的に）ことが可能な酸性ｐＨのバッファ；および（２）粒子上に個別にコンジュゲートさせた２種の抗体を含有する試薬であって、一方の抗体がビタミンＤ部分に対して結合親和性を有し、他方の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して結合親和性を有する、試薬を含む、２種の試薬を含む、キットを提供する。例示的なアッセイでは、血漿または血清などの試料は、酸性ｐＨバッファと混合され、短期間にわたりインキュベートされ、その後、粒子上にコーティングされた抗体を含有する第２の試薬が添加される。試料中の２５（ＯＨ）Ｄ濃度は、反応混合物の光学変化を測定し、一組の２５（ＯＨ）Ｄ較正物質を使用することによって定量される。

【0101】

一部の実施形態では、本発明は、試料中の２５（ＯＨ）Ｄを決定するためのキットであって、酸性ｐＨバッファを含む解離溶液を含有するキットを提供する。このキットは、２５（ＯＨ）Ｄ決定用のマイクロタイタープレートを備えたＥＬＩＳＡフォーマットで使用することができる。

【0102】

一部の実施形態では、例示的なビタミンＤアッセイは、化学発光または蛍光シグナル伝達分子に連結された磁性粒子を使用する。ビタミンＤアッセイ法は、ビタミンＤ部分に対して結合親和性を有する１種のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でコーティングされた磁性粒子を使用し、化学発光検出分子で標識されかつ磁性粒子上にコーティングされた抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して結合親和性を有する別の抗体を使用する。インキュベーションおよび洗浄ステップ後、試料中のビタミンＤ濃度は、化学発光のシグナル強度（ＲＬＵ）および較正曲線に基づいて決定される。

【0103】

一部の実施形態では、例示的なビタミンＤアッセイには、当技術分野におけるビタミンＤアッセイに勝る、ある特定の利点がある。例示的な利点には、下記の１つまたは複数が含まれる：高速または最速のビタミンＤアッセイ（約１０分またはそれよりも短時間で得られる）；一般的な化学分析器用の汎用ビタミンＤアッセイ；液体安定性の、すぐ使用できる２種の試薬の系；液体安定性の較正物質および対照；自動化または完全自動化；前処理または前希釈ステップを必要としない；２５－ＯＨビタミンＤ２および２５－ＯＨビタミンＤ３の等しい認識；臨床化学分析器で高スループットが容易にできる；ならびに／またはＮＩＳＴＳＲＭ９７２に対して追跡可能である。さらなる例示的な利点には、下記の１つまたは複数が含まれる：高速試験時間（１０分未満）；ビタミンＤに関する使用者に優しいアッセイである、２つの試薬フォーマット；および／または全ての規模の臨床検査室において最も一般的に使用される機器である、多くのもしくは全ての自動化臨床化学分析器に適合可能なアッセイフォーマット。一部の実施形態では、これらの利点は、真の日常の臨床検査として例示的なビタミンＤアッセイを使用することを可能にする。

【0104】

本発明は、下記の例示的な実施形態によってさらに例示される。

【0105】

１．試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）ビタミンＤ部分を含有しまたは含有することが疑われる試料と、ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファおよび／または酸性ｐＨのバッファ、ならびに２種またはそれよりも多くの抗体とを接触させるステップであって、少なくとも１種の抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して特異的に結合親和性を有し、別の抗体（第２の抗体）が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して結合親和性を有する、ステップ；ならびにｂ）前記特異的抗体と前記ビタミンＤ部分との間の結合を評価して、前記試料中の前記ビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するステップを含む、方法。酸性ｐＨのバッファは、任意の適切な塩、ポリマー、および／または界面活性剤を含むことができる。

【0106】

２．特異的抗体とビタミンＤ部分との間の結合を評価する前に、ビタミンＤ部分に関して天然ビタミンＤ結合タンパク質を除去するステップを含まない、実施形態１の方法。

【0107】

３．洗浄ステップを含まない、実施形態１または２の方法。

【0108】

４．均質アッセイとして実行される、実施形態１～３のいずれかの方法。

【0109】

５．試料を、酸性ｐＨのバッファと、２種の抗体で個別にコーティングされたラテックス粒子とを含む単一反応混合物に接触させ、一方の抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して結合親和性を有し、他方の抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して結合親和性を有する、実施形態１～４のいずれかの方法。

【0110】

６．試料と、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩および／または３－（アセトニルベンジル）－４－ヒドロキシクマリンとを接触させるステップを含まない、実施形態１～５のいずれかの方法。

【0111】

７．試料と、ビタミンＤ部分を試料中のその結合タンパク質から分離する非競合置換剤とを接触させるステップを含まない、実施形態１～５のいずれかの方法。

【0112】

８．最終反応混合物（酸性ｐＨバッファに試料を加えラテックス粒子を加えたもの）のｐＨが３．０またはそれよりも高い、実施形態１～７のいずれかの方法。

【0113】

９．試料、酸性ｐＨバッファ、およびラテックス粒子を含む最終反応混合物のｐＨが、１３またはそれよりも低い、実施形態１～８のいずれかの方法。

【0114】

１０．試料と、シクロデキストリン、サリチル酸ナトリウム、およびＮａＯＨを含むビタミンＤ放出組成物とを接触させるステップを含まない、実施形態１～９のいずれかの方法。

【0115】

１１．２５（ＯＨ）ＤをビタミンＤ結合タンパク質から放出するのに、試料と、パーフルオロアルキル酸、またはその塩とを接触させるステップを含まない、実施形態１～１０のいずれかの方法。

【0116】

１２．試料中のビタミンＤ結合タンパク質を消化するのに、試料と、エンドタンパク質分解活性およびエキソタンパク質分解活性を持つセリンプロテアーゼとを接触させるステップを含まない、実施形態１～１１のいずれかの方法。

【0117】

１３．被験体におけるビタミンＤ部分の状態を評価するのに使用され、試料が被験体から得られかつ／または被験体に由来する生物学的試料である、実施形態１～１２のいずれかの方法。

【0118】

１４．被験体が哺乳動物である、実施形態１３の方法。

【0119】

１５．哺乳動物がヒトである、実施形態１４の方法。

【0120】

１６．試料が生体液である、実施形態１３～１５のいずれかの方法。

【0121】

１７．生体液が、全血、血漿、血清、および尿からなる群から選択される、実施形態１６の方法。

【0122】

１８．ビタミンＤ部分が、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ_３、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ_２、ビタミンＤ代謝物、または１，２５－ジヒドロキシ－ビタミンＤ_３（１，２５－（ＯＨ）_２Ｄ_３）である、実施形態１～１７のいずれかの方法。

【0123】

１９．ビタミンＤ代謝物が、２５－ヒドロキシ－ビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）である、実施形態１８の方法。

【0124】

２０．２５（ＯＨ）Ｄが２５（ＯＨ）Ｄ３である、実施形態１９の方法。

【0125】

２１．２５（ＯＨ）Ｄが２５（ＯＨ）Ｄ２である、実施形態１９の方法。

【0126】

２２．２５（ＯＨ）Ｄが、２５（ＯＨ）Ｄ２および２５（ＯＨ）Ｄ３を合わせたものである、実施形態１９の方法。

【0127】

２３．酸性ｐＨバッファが、適切な量の、ＮａＣｌなどの塩、ＰＥＧ１００ｋなどのポリマー、およびＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を含有する酢酸ナトリウムバッファである、実施形態１～２２のいずれかの方法。酸性ｐＨバッファは、クエン酸ナトリウムバッファ、もしくはリン酸バッファ、またはこれらの組合せとすることもできる。

【0128】

２４．酸性バッファのｐＨが、２．５から６．５、好ましくは４．０から５．５の範囲である、実施形態２３の方法。

【0129】

２５．モノクローナル抗体が、ビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有する少なくとも１種の抗体または第１の抗体を持ち、第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する別の抗体または第２の抗体を持つものである、実施形態１～２４のいずれかの方法。

【0130】

２６．１種の抗体または第１の抗体が、２５（ＯＨ）Ｄ３または２５（ＯＨ）Ｄ２に特異的に結合する、実施形態２５の方法。

【0131】

２７．１種の抗体または第２の抗体が、第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に特異的に結合する、実施形態２５の方法。

【0132】

２８．抗体がモノクローナル抗体である、実施形態２５～２７の方法。

【0133】

２９．抗体が、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組合せである、実施形態２５～２７の方法。

【0134】

３０．粒子増強免疫混濁度測定法を使用して実行される、実施形態１～２９のいずれかの方法。

【0135】

３１．粒子増強免疫比濁法を使用して実行される、実施形態１～２９のいずれかの方法。

【0136】

３２．磁性粒子（ビーズ）をベースにしたイムノアッセイ法を使用して実行される、実施形態１～２９のいずれかの方法。

【0137】

３３．粒子が、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリメチルナフタレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリビニルナフタレン、スチレンのコポリマー、アクリル酸ジビニルベンゼン、ナフタレン（naphathalene）、炭素６０、磁性ビーズ、金、銀、シリカ、二酸化ケイ素、二酸化クロム、および／または二酸化チタンを含む、実施形態３０～３３のいずれかの方法。

【0138】

３４．粒子がナノ粒子である、実施形態３０～３３のいずれかの方法。

【0139】

３５．ナノ粒子が、約３０ｎｍから約５００ｎｍの範囲の直径を有する、実施形態３４の方法。

【0140】

３６．均質アッセイフォーマットまたは不均質アッセイフォーマットを使用して実行される、実施形態１～３５のいずれかの方法。

【0141】

３７．サンドイッチアッセイフォーマットまたは競合アッセイフォーマットを使用して実行される、実施形態１～３６のいずれかの方法。

【0142】

３８．相分離ステップまたは洗浄ステップなしで単一反応混合物において実行される均質アッセイである、実施形態１～３７のいずれかの方法。

【0143】

３９．均質フォーマットに関する合計アッセイ時間が３０分未満、典型的には１５分未満であり、不均質アッセイフォーマットに関する合計アッセイ時間が６０未満、典型的には４５分未満である、実施形態１～３８のいずれかの方法。

【0144】

４０．一般的な化学分析器または臨床化学分析器で実行される、実施形態１～３９のいずれかの方法。

【0145】

４１．一般的な化学分析器または臨床化学分析器には、限定するものではないがＲｏｃｈｅ、日立、ＭｏｄｕｌａｒＰ、Ｃｏｂａｓシリーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ／ＯｌｙｍｐｕｓＡＵシリーズ、ＢｅｃｋｍａｎＳｙｎｃｈｒｏｎおよびＤＸＣシリーズ、またはＡｂｂｏｔＡｒｃｈｉｔｅｃｔシリーズが含まれる、実施形態４０の方法。

【0146】

４２．試料中のビタミンＤ部分をアッセイするためのキットであって、ａ）ビタミンＤ部分をその結合タンパク質から解離させることが可能なバッファおよび／または酸性ｐＨのバッファ；ならびにｂ）少なくとも２種の抗体でコーティングされた、例えば個別にコーティングされた粒子、例えばラテックス粒子であって、その１種または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して特異的結合親和性を有し、別の抗体または第２の抗体が第１の抗体とビタミンｄ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、粒子を含む、キット。

【0147】

４３．ビタミンＤ部分と、ラテックス粒子上にコーティングされた抗体との間の結合を評価して、試料中のビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を決定するための手段をさらに含む、実施形態４２のキット。

【0148】

４４．試薬：（１）塩、ポリマー、および界面活性剤を含有する酸性ｐＨのバッファを含む第１のアッセイ試薬；（２）少なくとも２種の抗体でコーティングされたラテックス粒子の懸濁液含む、第２のアッセイ試薬であって、一方の抗体または第１の抗体がビタミンＤ部分に対して結合親和性を有し、他方の抗体または１種もしくは複数種の第２の抗体が第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する、試薬を含む、実施形態４３のキット。

【0149】

４５．（１）酸性ｐＨのバッファを含む第１のアッセイ試薬；および（２）ビタミンＤ部分またはその類似体に特異的に結合する、固定化された抗体を含有するマイクロタイタープレートウェルを含む、実施形態４４のキット。

【0150】

４６．実施形態４４のキットを使用して、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）混合物に第２のアッセイ試薬を添加する前に、ある期間にわたり、試料、第１のアッセイ試薬の混合物を形成するステップ；およびｂ）反応混合物の光学変化を測定し、一組の２５（ＯＨ）Ｄ較正物質を使用することによって、試料中の２５（ＯＨ）Ｄの量を定量するステップを含む、方法。

【0151】

４７．実施形態４５のキットを使用して、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）試料および第１のアッセイ試薬の混合物をマイクロタイタープレートのウェル内に形成し、ある期間にわたって混合物をインキュベートするステップ；ならびにｂ）混合物と、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された第２の抗体とを接触させ、ある期間にわたりインキュベートするステップを含み、ｃ）洗浄ステップ後、ＨＲＰ基質をマイクロタイタープレートのウェルに添加し、色を発現させて、試料中のビタミンＤ部分の存在、不在、および／または量を定量する、方法。

【0152】

４８．キットを使用する、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法は、酸性ｐＨのバッファ；ビタミンＤ部分に特異的に結合する抗体または第１の抗体でコーティングされた磁性粒子、およびシグナル伝達分子で標識されかつ磁性粒子上にコーティングされた第１の抗体とビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する第２の抗体とを含み、シグナル伝達分子がアクリジニウムエステル、イソルミノール、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、フルオレシン、またはシグナル検出に一般に使用される任意の他の化学発光もしくは蛍光をベースにしたシグナル分子である、試薬からなる。

【0153】

４９．実施形態４８のキットを使用する、試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）試料、酸性ｐＨバッファ、および第１の抗体でコーティングされた磁性粒子の混合物を形成し、ある期間にわたってインキュベートするステップ；ｂ）磁性粒子を洗浄し、シグナル伝達分子で標識されかつ磁性粒子上にコーティングされた第１の抗体と試料ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する第２の抗体を添加し、その後、あるインキュベーション期間を経るステップ；ｃ）磁性粒子を洗浄し、化学発光または蛍光検出の方法によるシグナル検出に必要である場合には基質（スターター）を添加するステップを含む、方法。

【0154】

５０．実施形態４９のキットを使用して試料中のビタミンＤ部分をアッセイするための方法であって、ａ）試料、酸性ｐＨバッファ、磁性粒子上にコーティングされた第１の抗体、およびシグナル伝達分子で標識されかつ磁性粒子上にコーティングされた第１の抗体と試料ビタミンＤ部分との間で形成された複合体に対して特異的結合親和性を有する第２の抗体の混合物を形成し、ある期間にわたってインキュベートするステップ；ｂ）磁性粒子を洗浄し、化学発光の方法または蛍光法によるシグナル検出に必要である場合には基質を添加するステップを含む、方法。

【0155】

５１．別の抗体（第２の抗体）が、抗体の１種（または第１の抗体）により結合されていないビタミンＤ部分上のエピトープに特異的に結合する、実施形態１～４１のいずれかの方法。

【0156】

５２．別の抗体（第２の抗体）が、抗体の１種（または第１の抗体）に結合しまたは特異的に結合する、実施形態１～４１のいずれかの方法。

【実施例】

【0157】

（実施例１）
２５（ＯＨ）Ｄアッセイキット
本実施例で使用されるラテックス粒子増強イムノアッセイ試薬を、以下に列挙する：
試薬１
０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
１０％ＮａＣｌ
５％塩化コリン０．５ＭＭＥＳ
０．５％糖
０．０４％Ｔｗｅｅｎ２０
０．９％ＰＥＧ１００ｋ
０．０９％ＮａＮ３
試薬２
０．６ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０
０．１％ＢＳＡ
１０％スクロース
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０
０．０５％第１の抗体－ラテックス粒子コンジュゲート
０．０８％第２の抗体－ラテックス粒子コンジュゲート
０．０９％ＮａＮ３
１．ＢｅｃｋｍａｎＡＵ６８０分析器によるアッセイ手順

【化1】

【0158】

試料３μＬを、キュベット内で試薬１１６０μＬと混合し、３７℃で約３．５分間インキュベートした。試薬２４０μＬを混合物に添加し、約４分間インキュベートした。７００ｎｍでの吸光度の変化を、以下のパラメーターシート（表１）に示されるアッセイパラメーターを使用して測定した。

【表1】

１．アッセイ較正曲線（単なる例）

【0159】

２５（ＯＨ）Ｄアッセイキットを、公知の２５（ＯＨ）Ｄ濃度の、血清ベースの較正物質で較正した。較正曲線を図１に示す。

【0160】

２５（ＯＨ）Ｄアッセイキットで首尾よくなされた較正後、対照および直線性標準の試験をした。さらに、患者の血清試料を試験し、結果を、ＦＤＡに認可された市販のビタミンＤアッセイ法（ＤｉａＳｏｒｉｎイムノアッセイ法）ならびに総ビタミンＤの液体クロマトグラフィー－質量分光光度（ＬＣ－ＭＳ）法（ビタミンＤ試験のゴールドスタンダードと見なされる）と比較した。結果を、以下の表１～３および図２～６に示す。
２．結果：

【0161】

アッセイ精度を、以下の表２に示す。

【表2】

【0162】

ＡＵ６８０分析器でのアッセイの直線性を、図２に示す。ＤｉａＳｏｒｉｎＬｉａｓｏｎ法と比較したアッセイの正確度を、図３に示す。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法と比較したアッセイの正確度を、図４に示す。
（実施例２）
２５（ＯＨ）Ｄアッセイキット

【0163】

使用される、磁性粒子をベースにした化学発光イムノアッセイ試薬を、本実施例で列挙する：
試薬１：
０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ４．０
８％ＮａＣｌ
１．２％スクロース
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
０．０９％ＮａＮ３
試薬２：
１×ＰＢＳバッファ、ｐＨ７．４
０．３％ＢＳＡ
０．０４％Ｔｗｅｅｎ２０
０．０９％ＮａＮ３
第１の抗体でコーティングされた０．１ｍｇ／ｍｌの磁性粒子
試薬３：
１×ＰＢＳバッファ、ｐＨ８．０
０．２％ＢＳＡ
０．０４％Ｔｗｅｅｎ２０
１ｕｇ／ｍｌのＡＢＥＩで標識された第２の抗体
ＮａＮ３０．０９％
スターター（基質）：
ａ）５％ＮａＯＨ；ｂ）０．１％過酸化物
洗浄溶液：
０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファおよび界面活性剤。
市販の機器を使用するアッセイ手順：

【0164】

血清試料５ｕｌを、試薬１１８０ｕｌと混合し、５分間インキュベートして、試料中のビタミンＤをその結合タンパク質から解離させた。上記試料／試薬１混合物１００ｕｌを吸引し、試薬２２０ｕｌと混合し、２０分間インキュベートした後、試薬３５０ｕｌを添加する。さらに１０分間インキュベートした後、磁性粒子を、洗浄バッファにより３回洗浄した。基質２００ｕｌを添加し、化学発光強度またはＲＬＵを３秒間読み取った。試料中のビタミンＤ含量を、ＲＬＵに基づいて決定し、較正曲線を、同じアッセイ条件下で確立した。
結果：

【0165】

化学発光検出法の例示的な較正曲線を、図５に示す。アッセイ精度（対照のレベルごとに１０回繰り返す）を、以下の表３に示す。アッセイの正確度に関する、本開示の例示的な方法と市販の既認可方法（predicate method）（イムノアッセイ）との間の比較データを、図６に示す。

【表3】

（実施例３）
分析性能
ａ．精度／再現性

【0166】

例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイ（実施例１におけるラテックス粒子増強イムノアッセイ）の精度を、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）ＥＰ５－Ａ２指針に従い評価した。精度評価を、ＢｅｃｋｍａｎＡＵ６８０化学分析器で行った。研究において、３ロットの試薬を使用した。試薬ロットごとに、１２個の標本を試験した：２個はビタミンＤ対照であり、１０個はビタミンＤヒト血清試料である。ＩＲＢ認可を受けている試験済みの血清試料は、商業的供給元（ＰｒｏｍｅｄＤｘ）から得られ、アッセイのダイナミックレンジを包含した。ＣＬＳＩＥＰ５－Ａ２プロトコールにより推奨されるように、精度試料を、１回の実験当たり二連で、かつ１日当たり２回の実験で、２０日間にわたる作業日で試験した。１個の標本当たりおよび１つの試薬ロット当たり８０個のデータポイントが得られた。

【0167】

試薬の１つの代表的なロットに関して得られた精度結果を、以下の表４にまとめる。

【表4】

ｂ．直線性／アッセイの報告可能な範囲

【0168】

例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイの直線性を、ＣＬＳＩＥＰ６－Ａ指針（定量分析法の直線性の評価；認可済み：２００３年）を使用して評価した。
合格基準

【0169】

測定値対予測値の線形回帰は、１．０±０．０５の勾配および相関係数Ｒ^２＞０．９５を有する。

【0170】

直線性の研究は、ＢｅｃｋｍａｎＡＵ６８０化学分析器で行った。ヒト血清試料に、ビタミンＤ原液をスパイクして、１５６．３ｎｇ／ｍＬの濃度にした（例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイを使用して三連で測定された）。ビタミンＤストック材料は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、モル濃度は、分析証明書により提供された情報を使用して計算した。このように、調製された高試料を低試料で希釈して４．３ｎｇ／ｍＬ（例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイを使用して三連で測定された）にして、合計で１１の直線性レベルを下記の通り作製した：
レベル０１：１．００ｍｌの低試料＋高試料０．００ｍｌ
レベル０２：０．９０ｍｌの低試料＋高試料０．１０ｍｌ
レベル０３：０．８０ｍｌの低試料＋高試料０．２０ｍｌ
レベル０４：０．７０ｍｌの低試料＋高試料０．３０ｍｌ
レベル０５：０．６０ｍｌの低試料＋高試料０．４０ｍｌ
レベル０６：０．５０ｍｌの低試料＋高試料０．５０ｍｌ
レベル０７：０．４０ｍｌの低試料＋高試料０．６０ｍｌ
レベル０８：０．３０ｍｌの低試料＋高試料０．７０ｍｌ
レベル０９：０．２０ｍｌの低試料＋高試料０．８０ｍｌ
レベル１０：０．１０ｍｌの低試料＋高試料０．９０ｍｌ
レベル１１：０．００ｍｌの低試料＋高試料１．００ｍｌ

【0171】

上記調製された直線性のセットを、例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイにおいて三連で、１ロットの試薬を使用して試験した。直線性試験結果を、以下の表５および図７に示す。

【表5】

（実施例４）
比較研究
ａ．既認可デバイスによる方法の比較

【0172】

この方法比較研究のため、個々の血清試料を、例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイ（実施例１のラテックス粒子増強イムノアッセイ）で試験し、既認可デバイス（ＤｉａＳｏｒｉｎＬｉａｉｓｏｎＬＸ）と比較した。血清試料は、商業的供給元、Ｂｉｏｃｈｅｍｅｄから得られ、ＩＲＢ認可を受けたものであった。値をアッセイのダイナミックレンジ外に戻す試料は、除外した。アッセイＡＭＲに及ぶ合計で４０個の不変試料を、正確度の評価に使用した。結果を図８に示す。
ｂ．マトリックス比較

【0173】

抗凝固剤の影響を評価するために、例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤアッセイを使用して、血清、Ｋ_２－ＥＤＴＡ、Ｋ_３－ＥＤＴＡ血漿、およびＬｉ－ヘパリン血漿の対応する組（ｍａｔｃｈｅｄｓｅｔ）の２５－ＯＨビタミンＤ濃度を測定した。この研究で使用される試料は、認定された商業的供給元（ＰｒｏＭｅｄＤｘ，ＬＬＣ）から得た。全ての試験した試料を、商業的供給業者によるＩＲＢ認可プロトコールに従い収集した。試料ごとおよびマトリックスごとに報告された値は、単一の測定から得られた。試験した対応する組の総数は、５４であった。マトリックスごとの、特許請求の範囲に記載される測定範囲を包含するために、７つのスパイク済み患者試料を研究に含めた。結果を図９～１１に示す。
（実施例５）
例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤ化学発光アッセイ

【0174】

例示的なＤｉａｚｙｍｅビタミンＤ化学発光アッセイは、実施例２に記述されたような、３種の試薬：第１の抗体にコンジュゲートさせた磁性ビーズ；抽出バッファ；およびＡＢＥＩ分子（ＩＳＯ－ルミナ）にコンジュゲートさせた第２の抗体から構成される。アッセイ手順を、以下の表６に示す：

【表6】