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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-18
(45)【発行日】2022-11-29
(54)【発明の名称】遺伝子改変不完全変態昆虫の作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221121BHJP
A01K 67/033 20060101ALN20221121BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/09 Z ZNA
A01K67/033 501
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2017196367
(22)【出願日】2017-10-06
(65)【公開番号】P2019068762
(43)【公開日】2019-05-09
【審査請求日】2020-09-18
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520484287
【氏名又は名称】株式会社グリラス
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】三戸 太郎
(72)【発明者】
【氏名】渡辺 崇人
【審査官】原 大樹
(56)【参考文献】
【文献】SCIENTIFIC REPORT，2015年，Vol.5, No.15885，p.1-9
【文献】日本分子生物学会年会プログラム・要旨集，2013年，Vol.36th，3P-0026
【文献】Journal of Insect Physiology，2017年01月，Vol.98，p.245-257
【文献】SCIENTIFIC REPORT，2014年，Vol.4, No.6545，p.1-7
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ０１Ｋ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、不完全変態昆虫の卵に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡを注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌであり、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌであり、不完全変態昆虫がコオロギ科に属する昆虫である、方法。
【請求項2】
ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、不完全変態昆虫の卵に、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、不完全変態昆虫がコオロギ科に属する昆虫である、方法。
【請求項3】
約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ドナーベクターがレポーター遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、遺伝子改変不完全変態昆虫の作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
昆虫は発生様式の違いから、完全変態類と不完全変態類に大別される。ショウジョウバエ等の完全変態類はモデル動物として研究が進んでいるが、不完全変態類については遺伝子機能解析の技術が確立されておらず、それほど研究がなされてない。不完全変態昆虫の発生および再生の研究およびその商業的利用のため、不完全変態昆虫の遺伝子改変技術が求められている。
【0003】
ゲノム編集は、人工ヌクレアーゼにより標的とするゲノム部位を特異的に改変する技術であり、不完全変態昆虫ではＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたノックアウトコオロギの作成が報告されている。しかしながら、遺伝子改変個体の応用を考えると、その効率や経済性は十分でなく、さらなる改善が求められている。また、不完全変態昆虫の内在遺伝子の解析やタンパク質生産システムとしての利用のため、ノックイン系統の作製が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Awata H, Watanabe T, Hamanaka Y, Mito T, Noji S, Mizunami M., Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports 5:15885, 2015
【文献】渡辺崇人，三戸太郎，大内淑代，野地澄晴，コオロギにおけるＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた遺伝子改変（今すぐ始めるゲノム編集 ＴＡＬＥＮ＆ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の必須知識と実験プロトコール，山本卓編，実験医学（別冊），羊土社，２０１４，１４９～１５８頁）
【文献】渡辺崇人，松岡佑児，野地澄晴，三戸太郎，フタホシコオロギにおけるゲノム編集（進化するゲノム編集技術，真下知士，城石俊彦監修，エヌ・ティー・エス，２０１５，２０１－２０７頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、遺伝子改変不完全変態昆虫の作製のための改良方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、ある態様において、以下を提供する：
ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡを注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、および／またはゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌである、方法。
ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡを注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、および／またはゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌである、方法。
【0007】
本発明は、さらなる態様において、以下を提供する：
ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。
ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。
【発明の効果】
【0008】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子改変不完全変態昆虫の作製において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナーベクターの量を低減することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図6】図６は、Ｕｂｘ遺伝子座へのＧＦＰ遺伝子のノックイン実験の結果を示す。「ｂｒｉｇｈｔ」は明視野観察、「ＧＦＰ」はＧＦＰ蛍光、「ｍｅｒｇｅ」は両者を重ね合わせた結果である（以下の図において同じ）。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書において、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。すなわち、例えば、「約２０～３０」は、「２０±１０％～３０±１０％」を含むものとする。
【0011】
本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集により遺伝子改変不完全変態昆虫を作製するものである。本発明の方法は、エンドヌクレアーゼであるＣａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９ｍＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質を標的配列へ動員するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを使用する。本明細書における「遺伝子改変」には、遺伝子のノックアウトおよびノックインが含まれる。
【0012】
不完全変態昆虫とは、蛹を経ずに幼虫が直接成虫に変態する昆虫を意味する。不完全変態昆虫としては、限定はされないが、コオロギ、バッタ、イナゴ（バッタ目）、カマキリ（カマキリ目）、ゴキブリ、シロアリ（ゴキブリ目）、セミ、サシガメ、トコジラミ（カメムシ目）、トンボ（トンボ目）、アザミウマ（アザミウマ目）等が挙げられる。好ましくは、不完全変態昆虫は、バッタ目に属する昆虫である。バッタ目に属する昆虫としては、キリギリス亜目、好ましくはコオロギ上科、より好ましくはコオロギ科、さらにより好ましくはコオロギ亜科、さらにより好ましくはコオロギ属に属する昆虫；および、バッタ亜目、好ましくはバッタ上科、より好ましくはバッタ科またはイナゴ科に属する昆虫が例示される。ある態様において、不完全変態昆虫は、バッタ目キリギリス亜目、好ましくはコオロギ上科、より好ましくはコオロギ科、さらにより好ましくはコオロギ亜科、さらにより好ましくはコオロギ属に属する昆虫である。
【0013】
Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来するものである。ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌には、アエロピュルム属（Aeropyrum）、ピュロバクルム属（Pyrobaculum）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、アルカエオグロブス属（Archaeoglobus）、ハロアーキュラ属（Halocarcula）、メタノバクテリウム属（Methanobacteriumn）、メタノコックス属（Methanococcus）、メタノサルキナ属（Methanosarcina）、メタノピュルス属（Methanopyrus）、ピュロコックス属（Pyrococcus）、ピクロフィルス属（Picrophilus）、テルモプラズマ属（Thermoplasma）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アクウィフェクス属（Aquifex）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、クロロビウム属（Chlorobium）、サーマス属（Thermus）、バシラス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、アゾアルカス属（Azoarcus）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、デスルフォビブリオ属（Desulfovibrio）、ジオバクター属（Geobacter）、マイクロコッカス属（Micrococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ウォリネラ属（Wolinella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エスケリキア属（Escherichia）、レジオネラ属（Legionella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、パスツレラ属（Pasteurella）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、ザントモナス属（Xanthomonas）、エルシニア属（Yersinia）、トレポネーマ属（Treponema）およびテルモトガ属（Thermotoga）などに属する細菌が含まれる。好ましくは、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲニス（Streptococcus pyogenes）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、より好ましくはストレプトコッカス・ピオゲニスに由来するものである。
【0014】
ある実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１の配列に約８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性とヌクレアーゼ活性とを有するタンパク質である。好ましくは、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0015】
Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有していればよく、その具体的配列は特に限定されない。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、通常、２５００ｂｐ～４０００ｂｐ程度である。ある実施形態において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、配列番号２の配列に約８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、ｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性とヌクレアーゼ活性とを有するＣａｓ９タンパク質をコードする。好ましくは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、または、配列番号２のヌクレオチド配列からなる。
【0016】
配列同一性は、配列を最適にアライメントした場合に、２つの配列において同一である残基の割合を意味する。従って、例えば、９０％の同一性とは、最適にアライメントされた２つの配列において９０％の残基が同一であることを意味する。配列のアライメントおよび同一性の計算の方法は当業者に周知であり、例えば、ＢＬＡＳＴ等のプログラムを利用することができる。
【0017】
Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、所望のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、得ることができる。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされているインビトロ転写用ベクターは市販されており、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲニスのＣａｓ９タンパク質を発現するpMLM3613、pMJ920（Addgene社）などが挙げられる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
【0018】
Ｃａｓ９タンパク質は直後にＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列を有するＤＮＡ配列に結合する。ゲノム上の標的配列は、その配列の直後にＰＡＭ配列を有する配列であればよく、特に限定されない。ＰＡＭ配列はＣａｓ９タンパク質に依存し、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲニス由来のＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列はＮＧＧである。その他の例として、ナイセリア・メニンギティディス：ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ストレプトコッカス・サーモフィラス：ＮＮＡＧＡＡ、トレポネーマ・デンティコラ：ＮＡＡＡＡＣなどが挙げられる。これらの配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかの塩基を示す。標的配列は、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい。標的配列の選択および／またはｇＲＮＡの設計に利用できる数々のツール、および、バイオインフォマティックスにより予想された様々な種の様々な遺伝子についての標的配列のリストを利用することができ、例えば、引用により本明細書の一部とするFeng Zhang lab's Target Finder、Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools: Cas-OFFinder、CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes、CRISPR Optimal Target Finder などが挙げられる。
【0019】
gＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を標的配列に動員する役割を果たす。本明細書において、ｇＲＮＡとは、ｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）とｔｒａｃｒＲＮＡ（Trans-activating crRNA）が融合した人工１本鎖ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間にリンカー配列が存在してもよい。
【0020】
ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡの配列特異性を担い、標的配列またはそれに相補的な配列を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質結合能力を担い、ｃｒＲＮＡの一部と相補的に結合してヘアピン構造を形成し、この構造がＣａｓ９に認識され、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体が形成される。ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は細菌の種によって異なるが、上記のＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌のものであってよい。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラのｔｒａｃｒＲＮＡを使用できる。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９タンパク質と同じ細菌の種に由来する。
【0021】
ｇＲＮＡは、通常、１００ｂｐ程度である。ｇＲＮＡは、所望のｇＲＮＡの配列を有するＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。また、ｇＲＮＡの標的配列以外の配列を含むインビトロ転写用ベクターが利用可能であり、これに標的配列のオリゴヌクレオチドを合成して挿入し、インビトロ転写することによっても、得ることができる。そのようなベクターには、例えば、Addgene社から購入できる、pDR274、pUC57-sgRNA expression vector、pCFD1-dU6:1gRNA、pCFD2-dU6:2gRNA pCFD3-dU6:3gRNA、pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs、pRB17、pMB60、SP6-sgRNA-scaffold、pT7-gRNA、DR274、pUC57-Simple-gRNA backbone、および、Origene社から購入できるpT7-Guide-IVTが含まれる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
【0022】
ゲノム上の標的配列に対するｇＲＮＡ（本明細書中、ゲノム用ｇＲＮＡと称する）とＣａｓ９ｍＲＮＡとを卵に注入すると、Ｃａｓ９ｍＲＮＡから発現したＣａｓ９タンパク質によるゲノムの二本鎖切断が誘導される。この二本鎖切断が非相同性末端結合（本明細書中、ＮＨＥＪとも記載する）により修復される際に数塩基の欠失または追加が生じると、標的遺伝子がノックアウトされる。
【0023】
ゲノムに導入する所望の配列とＣａｓ９タンパク質の標的配列とを含むドナーベクターと、ドナーベクター中の標的配列に対するｇＲＮＡ（本明細書中、ドナーベクター用ｇＲＮＡと称する）とを、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡに加えて用いることにより、所望の配列をゲノムに導入することができる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、ゲノム用ｇＲＮＡ、ドナーベクター、ドナーベクター用ｇＲＮＡを卵に注入すると、Ｃａｓ９タンパク質によりゲノムとドナーベクターが切断され、ゲノムとドナーベクターの間で生じる非相同性末端結合により、ドナーベクターがゲノム上の二本鎖切断部位に導入される。
【0024】
本明細書において、「ノックイン不完全変態昆虫」とは、ドナーベクターにより所望の配列がゲノムに導入された不完全変態昆虫をいう。本明細書において、「ノックアウト不完全変態昆虫」とは、ゲノム上の標的遺伝子が破壊された不完全変態昆虫を意味するが、ドナーベクターにより所望の配列がゲノムに導入された不完全変態昆虫、すなわちドナーベクターにより所望の配列がゲノムに導入された結果ゲノム上の遺伝子が破壊された昆虫は含まれない。よって、本発明のノックアウト不完全変態昆虫の作製方法は、卵にドナーベクターおよびドナーベクター用ｇＲＮＡを注入することは含まない。
【0025】
ドナーベクターは、通常、３，０００ｂｐ～１００，０００ｂｐ、好ましくは３，０００ｂｐ～５０，０００、より好ましくは３，０００ｂｐ～１０，０００ｂｐである。ドナーベクターは、ゲノムに導入する所望の配列と、Ｃａｓ９タンパク質の標的配列とを含む。標的配列は、所望の配列を導入する昆虫のゲノム上に存在しない配列であればよく、使用するＣａｓ９タンパク質に応じて適宜選択される。
【0026】
ある実施形態において、ドナーベクターはレポーター遺伝子の配列を含む。レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ等の蛍光遺伝子やＧａｌ４、Ｔｅｔ等の誘導遺伝子が挙げられる。ドナーベクターは、コオロギの細胞質に特異的に発現するコオロギアクチンプロモーター（Ｇｂ’ａｃｔ）、コオロギの眼に特異的に発現する３ｘＰ３プロモーター、高温処理により遺伝子発現の制御が可能になるｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ プロモーター等のプロモーターを含みうる。レポーター遺伝子を導入することにより、ノックイン個体を容易に選別することができる。また、発現を観察したい遺伝子のイントロン領域にレポーター遺伝子を導入すると、不完全変態昆虫のエンハンサートラップ系統を作製することができる。
【0027】
ノックアウト不完全変態昆虫の作製方法において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび／またはゲノム用ｇＲＮＡの濃度は、約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、好ましくは約３００ｐｇ／μｌ－約７０ｎｇ／μｌ、より好ましくは約４００ｐｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、さらにより好ましくは約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである。
【0028】
ノックアウト不完全変態昆虫の作製方法の一実施形態においては、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が、約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、好ましくは約３００ｐｇ／μｌ－約７０ｎｇ／μｌ、より好ましくは約４００ｐｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、さらにより好ましくは約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである。この実施形態において、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度は任意に決定でき、例えば、約１００ｐｇ／μｌ－約５００ｎｇ／μｌ（例えば、約５００ｎｇ／μｌ）、約１００ｐｇ／μｌ－約３００ｎｇ／μｌ、約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、約３００ｐｇ／μｌ－約７０ｎｇ／μｌ、約４００ｐｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、または約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである。
【0029】
ノックアウト不完全変態昆虫の作製方法の一実施形態においては、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度が、約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、好ましくは約３００ｐｇ／μｌ－約７０ｎｇ／μｌ、より好ましくは約４００ｐｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、さらにより好ましくは約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである。この実施形態において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度は任意に決定でき、例えば、約１００ｐｇ／μｌ－約５００ｎｇ／μｌ（例えば、約５００ｎｇ／μｌ）、約１００ｐｇ／μｌ－約３００ｎｇ／μｌ、約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、約３００ｐｇ／μｌ－約７０ｎｇ／μｌ、約４００ｐｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、または約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである。
【0030】
ノックアウト不完全変態昆虫の作製方法のある好ましい実施形態においては、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度およびゲノム用ｇＲＮＡの濃度がいずれも、約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、好ましくは約３００ｐｇ／μｌ－約７０ｎｇ／μｌ、より好ましくは約４００ｐｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、さらにより好ましくは約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである。
【0031】
ノックイン不完全変態昆虫の作製方法では、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌ、好ましくは約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌ、好ましくは約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、好ましくは約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、好ましくは約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を不完全変態昆虫の卵に注入する。
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌ、好ましくは約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌ、好ましくは約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、好ましくは約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌ、好ましくは約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を不完全変態昆虫の卵に注入する。
【0032】
ノックイン不完全変態昆虫の作製方法の一実施形態においては、約２．５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、約２．５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、約５ｎｇ／μｌのドナーベクター、および約５ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡを注入する。別の実施形態においては、約２５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、約２５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、約５０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および約５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡを注入する。
【0033】
不完全変態昆虫の卵への注入は、当業界で知られる方法により行うことができる。例えば、注入するＣａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡ、並びに場合によりドナーベクターおよびドナーベクター用ｇＲＮＡを、水またはＴＥバッファー（10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA）などの溶媒に溶解し、この溶液をガラスキャピラリーに充填して、スライドグラス上に並べミネラルオイル等のオイルで覆った卵、あるいはアガロースゲル上に並べＰＢＳ等の緩衝液で覆った卵に注入する。注入は、アガロースゲル上で行うことが好ましい。注入される溶液の量は、通常、約２～５μｌである。
【0034】
卵への注入は、通常、産卵後１５時間以内、好ましくは１０時間以内に行う。例えば、注入は、産卵直後～産卵後１０時間、産卵直後～産卵後６時間、または産卵直後～産卵後４時間の時点で行う。ある実施形態において、注入は、産卵後１～２時間、３～４時間、５～６時間、または９～１０時間の時点で行う。
【0035】
注入溶液を注入後、卵を適切な温度（例えば、約２８～３０℃）でインキュベートして孵化させ、幼虫を適切な温度（例えば、約２８～３０℃）で所望の発育段階まで飼育する。このようにして生じた不完全変態昆虫から、任意の選択方法により、所望の遺伝子改変を含む不完全変態昆虫を選択することができる。例えば、終齢幼虫の段階で雄と雌にわけ、それぞれの幼虫から生じた成虫を野生型の成虫と交配させることにより、ヘテロ変異体（Ｇ１）を得ることができる。次いで、ヘテロ変異体同士を交配すると、所望の遺伝子改変を含むホモ個体およびヘテロ個体（Ｇ２）を得ることができる。所望の遺伝子改変を含むことは、例えば、体色や形態などの標的遺伝子に対応する幼虫または成虫の表現型により、確認することができる。また、導入遺伝子の発現を確認することにより、例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を導入した場合は蛍光を観察することにより、確認することができる。
【0036】
本発明の方法によれば、効率よく遺伝子改変不完全変態昆虫を得ることができる。本発明の方法により得られた遺伝子改変不完全変態昆虫は、内在遺伝子発現のリアルタイムモニターや、有用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ生産システムの構築に応用可能である。
【0037】
本発明の例示的態様を以下に示す。
１．ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡを注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、および／またはゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌである、方法。
２．Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌであり、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌである、請求項１に記載の方法。
３．Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌであり、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである、前記１に記載の方法。
４．ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。
５．約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入する、前記４に記載の方法。
６．ドナーベクターがレポーター遺伝子を含む、前記５に記載の方法。
１．ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびゲノム用ｇＲＮＡを注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌ、および／またはゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌである、方法。
２．Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌであり、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約１００ｐｇ／μｌ－約１００ｎｇ／μｌである、請求項１に記載の方法。
３．Ｃａｓ９ｍＲＮＡの濃度が約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌであり、ゲノム用ｇＲＮＡの濃度が約５００ｐｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌである、前記１に記載の方法。
４．ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２ｎｇ／μｌ－約３０ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約４ｎｇ／μｌ－約６０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入すること；および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。
５．約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのゲノム用ｇＲＮＡ、
約２．５ｎｇ／μｌ－約２５ｎｇ／μｌのドナーベクター用ｇＲＮＡ、
約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのドナーベクター、および
約５ｎｇ／μｌ－約５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡ
を注入する、前記４に記載の方法。
６．ドナーベクターがレポーター遺伝子を含む、前記５に記載の方法。
【0038】
以下の実施例は、如何なる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【0039】
１．ノックアウト不完全変態昆虫の作製
（１）ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの導入量と変異導入効率との関係
不完全変態昆虫においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりゲノム編集を行うための実験条件を評価するため、Ｇ０における変異導入効率に対するｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度の影響を検討した。
Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ｐＭＬＭ３６１３プラスミド（Addgene社）を制限酵素ＰｍｅＩで直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて合成した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡの配列を配列番号２に示す。ｇＲＮＡは、ｖｅｒｍｉｌｉｏｎ遺伝子を標的として作製した（標的配列：ＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＧ（配列番号３））。ｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、Ｏｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＧ（配列番号４）とＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡ（配列番号５）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。
濃度は、５００ｎｇ／μｌから希釈して、ｇＲＮＡは５０ｐｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは５ｐｇ／μｌを下限とした。ｇＲＮＡの濃度検討の際に用いるＣａｓ９ｍＲＮＡ、およびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度検討の際に用いるｇＲＮＡは、それぞれ５００ｎｇ／μｌとした。溶媒はTris-EDTAバッファーを用いた。
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡは、フタホシコオロギの卵（産卵後５時間以内）に、以下の方法によりインジェクションした。
（１）フィラメント入りガラスキャピラリーをMicropipette puller （P-1000IVF, Sutter Instruments）を用いてインジェクション針とした。
（２）できた針をMicropipette grinder （EG-44, Narishige）を用いて針先が２０度となるように削った。
（３）０．７ｍｍ幅Ｘ０．５ｍｍ深さの突起が付いたプラスチック板を、９ｃｍシャーレ中の２０ｍＬの熱した１％アガロース液に浮かべ、その後冷まして、コオロギ卵を並べる溝をもったアガロース板を作成した。
（４）コオロギ卵を１時間かけて採卵し、２０ｍｌの１ＸＰＢＳ（５０Ｕ／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍストレプトマイシン含有）で満たしたアガロース板の溝に並べた。
（５）条件をinjection pressure; 5-10 psi、injection time; 0.1 sec に設定し，コオロギ卵の後方にインジェクションした。
１週間後、インジェクションした卵１個ずつからゲノム抽出を行い，SURVEYOR nuclease assayにより変異導入された卵の割合を算出した。
（１）ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの導入量と変異導入効率との関係
不完全変態昆虫においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりゲノム編集を行うための実験条件を評価するため、Ｇ０における変異導入効率に対するｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度の影響を検討した。
Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ｐＭＬＭ３６１３プラスミド（Addgene社）を制限酵素ＰｍｅＩで直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて合成した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡの配列を配列番号２に示す。ｇＲＮＡは、ｖｅｒｍｉｌｉｏｎ遺伝子を標的として作製した（標的配列：ＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＧ（配列番号３））。ｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、Ｏｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＧ（配列番号４）とＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡ（配列番号５）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。
濃度は、５００ｎｇ／μｌから希釈して、ｇＲＮＡは５０ｐｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは５ｐｇ／μｌを下限とした。ｇＲＮＡの濃度検討の際に用いるＣａｓ９ｍＲＮＡ、およびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度検討の際に用いるｇＲＮＡは、それぞれ５００ｎｇ／μｌとした。溶媒はTris-EDTAバッファーを用いた。
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡは、フタホシコオロギの卵（産卵後５時間以内）に、以下の方法によりインジェクションした。
（１）フィラメント入りガラスキャピラリーをMicropipette puller （P-1000IVF, Sutter Instruments）を用いてインジェクション針とした。
（２）できた針をMicropipette grinder （EG-44, Narishige）を用いて針先が２０度となるように削った。
（３）０．７ｍｍ幅Ｘ０．５ｍｍ深さの突起が付いたプラスチック板を、９ｃｍシャーレ中の２０ｍＬの熱した１％アガロース液に浮かべ、その後冷まして、コオロギ卵を並べる溝をもったアガロース板を作成した。
（４）コオロギ卵を１時間かけて採卵し、２０ｍｌの１ＸＰＢＳ（５０Ｕ／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍストレプトマイシン含有）で満たしたアガロース板の溝に並べた。
（５）条件をinjection pressure; 5-10 psi、injection time; 0.1 sec に設定し，コオロギ卵の後方にインジェクションした。
１週間後、インジェクションした卵１個ずつからゲノム抽出を行い，SURVEYOR nuclease assayにより変異導入された卵の割合を算出した。
【0040】
図１に示すように、ｇＲＮＡは、５００ｐｇ／μｌ－５００ｎｇ／μｌで高い変異導入が見られた。Ｃａｓ９ｍＲＮＡでも、５００ｐｇ／μｌ－５００ｎｇ／μｌで高い変異導入が見られ、５０ｐｇ／μｌにおいても変異を検出することができた。
【0041】
（２）ｇＲＮＡの導入量と体細胞ノックアウト効率及び孵化率との関係
Ｇ０におけるｌａｃｃａｓｅ２遺伝子の表現型であるクチクラの白色化を指標として、体細胞ノックアウト効率および孵化率に対するｇＲＮＡの導入量の影響を調べた。
ｌａｃｃａｓｅ２遺伝子を標的としてｇＲＮＡを作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、上記１（１）と同じものを用いた。ｇＲＮＡは、ｌａｃｃａｓｅ２遺伝子を標的として作製した（標的配列：ＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＡ（配列番号６））。ｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、Ｏｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＡ（配列番号７）とＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣ（配列番号８）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。ｇＲＮＡの導入量は、５０ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、５０ｎｇ／μｌまたは５００ｎｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの導入量は５００ｎｇ／μｌとした。
Ｇ０におけるｌａｃｃａｓｅ２遺伝子の表現型であるクチクラの白色化を指標として、体細胞ノックアウト効率および孵化率に対するｇＲＮＡの導入量の影響を調べた。
ｌａｃｃａｓｅ２遺伝子を標的としてｇＲＮＡを作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、上記１（１）と同じものを用いた。ｇＲＮＡは、ｌａｃｃａｓｅ２遺伝子を標的として作製した（標的配列：ＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＡ（配列番号６））。ｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、Ｏｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＡ（配列番号７）とＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣ（配列番号８）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。ｇＲＮＡの導入量は、５０ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、５０ｎｇ／μｌまたは５００ｎｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡの導入量は５００ｎｇ／μｌとした。
【0042】
図２の左のグラフはｇＲＮＡの導入量と体細胞ノックアウトを示す個体の割合を示し、右のグラフはｇＲＮＡの導入量と孵化率との関係を示す。体細胞ノックアウトを示す個体の割合は、５００ｎｇ／μｌの個体群で８５％と最も高く、濃度が減少するにつれて低下したが、５００ｐｇ／μｌまで濃度を下げても変異個体が得られることが分かった。孵化はいずれの濃度でも見られ、特に５ｎｇ／μｌと５００ｐｇ／μｌでそれぞれ６７％、６３％と高い孵化率を示した。
【0043】
（３）ｇＲＮＡ濃度と体細胞ノックアウト範囲との関係
上記１（２）の各ｇＲＮＡの濃度での体細胞ノックアウトの生じた範囲を比較するために、画像解析ソフトウェアImageJにより、クチクラが白色化した領域の割合を算出した。
まず、個体の画像を白黒化し、胴体を枠線で囲み、白黒化画像の黒色の部分を赤色に表示して、枠線内の赤色の面積を測定した。その後、枠線内の全体の面積を測定し、計算により白色化領域の割合を算出した。
上記１（２）の各ｇＲＮＡの濃度での体細胞ノックアウトの生じた範囲を比較するために、画像解析ソフトウェアImageJにより、クチクラが白色化した領域の割合を算出した。
まず、個体の画像を白黒化し、胴体を枠線で囲み、白黒化画像の黒色の部分を赤色に表示して、枠線内の赤色の面積を測定した。その後、枠線内の全体の面積を測定し、計算により白色化領域の割合を算出した。
【0044】
図３に示すように、５００ｎｇ／μｌ、５０ｎｇ／μｌではそれぞれで２７．９％、３２．６％で、高効率で変異が導入されていた。５ｎｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌでは１２．０％、４．０％であった。
【0045】
（４）ｇＲＮＡおよびＣａｓ９導入の時期と変異導入効率との関係
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡをコオロギ卵へ導入する時期の検討を行った。
ｇＲＮＡは、Ｕｂｘ遺伝子またはａｂｄ－Ａ遺伝子を標的として作製した（Ｕｂｘ標的配列：ＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣ（配列番号９）、ａｂｄ－Ａ標的配列：ＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡ（配列番号１０））。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、上記１（１）と同じものを用いた。それぞれのｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、ＵｂｘＯｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣ（配列番号１１）とＵｂｘＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣ（配列番号１２）、ａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡ（配列番号１３）とａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＴＴＧＣ（配列番号１４）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度はそれぞれ、５００ｎｇ／μｌおよび１０００ｎｇ／μｌとした。
コオロギ卵を１時間かけて採集したのち、１時間後（１ｈ）、３時間後（３ｈ）、５時間後（５ｈ）、９時間後（９ｈ）に、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡをコオロギ卵へ注入した。その後、採卵から４８時間後の時点でゲノムＤＮＡを抽出し、それぞれの標的（オンターゲット）およびオフターゲット領域をＰＣＲ増幅し、次世代シークエンサー MiSeq（イルミナ社）を用いたアンプリコンシークエンス解析を行って、それぞれのＰＣＲ増幅断片中の変異導入されたＤＮＡの割合をCRISPRessoにより解析した。
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡをコオロギ卵へ導入する時期の検討を行った。
ｇＲＮＡは、Ｕｂｘ遺伝子またはａｂｄ－Ａ遺伝子を標的として作製した（Ｕｂｘ標的配列：ＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣ（配列番号９）、ａｂｄ－Ａ標的配列：ＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡ（配列番号１０））。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、上記１（１）と同じものを用いた。それぞれのｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、ＵｂｘＯｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣ（配列番号１１）とＵｂｘＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣ（配列番号１２）、ａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ１：ＴＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡ（配列番号１３）とａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＴＴＧＣ（配列番号１４）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡの濃度はそれぞれ、５００ｎｇ／μｌおよび１０００ｎｇ／μｌとした。
コオロギ卵を１時間かけて採集したのち、１時間後（１ｈ）、３時間後（３ｈ）、５時間後（５ｈ）、９時間後（９ｈ）に、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡをコオロギ卵へ注入した。その後、採卵から４８時間後の時点でゲノムＤＮＡを抽出し、それぞれの標的（オンターゲット）およびオフターゲット領域をＰＣＲ増幅し、次世代シークエンサー MiSeq（イルミナ社）を用いたアンプリコンシークエンス解析を行って、それぞれのＰＣＲ増幅断片中の変異導入されたＤＮＡの割合をCRISPRessoにより解析した。
【0046】
図４に示すように、どちらの遺伝子においても１ｈにおける変異導入割合が最も高く、９ｈへかけて段階的に効率が低下するという傾向を示した。また、オフターゲット領域では、いずれのサンプルでもほとんど変異導入が確認されなかった。増幅断片中の変異導入された部位を解析したところ、遺伝子間で傾向は異なるものの、それぞれの遺伝子で導入時期による変異導入の傾向の差はなかった。
【0047】
２．ノックイン不完全変態昆虫の作製
（１）ＮＨＥＪによるノックイン
ドナーベクターとして、pＵＣ５７ベクター（２７１０bp）にｅＧＦＰ遺伝子をコオロギアクチンプロモーターの下流に組み込んだもの（５６２５ｂｐ（配列番号１５））を作製した。前記プロモーターの上流には、ＤｓＲｅｄ由来の短い配列をベイト（bait）として組み込んだ。また、Ｕｂｘ遺伝子、ａｂｄ－Ａ遺伝子、および前記ベイトを標的とするｇＲＮＡをそれぞれ作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、上記１（１）と同じものを用いた。ベイトのｇＲＮＡはＤｓＲｅｄ遺伝子を標的とした（ＤｓＲｅｄ標的配列；ＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＣ（配列番号１６））。ベイトｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ１；ＴＡＧＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣ（配列番号１７）、ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ２；ＡＡＡＣＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴ（配列番号１８）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。Ｕｂｘ遺伝子およびａｂｄ－Ａ遺伝子に対するそれぞれのｇＲＮＡは上記１（４）と同じものを用いた。
ゲノム用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター（１００ｎｇ／μｌ）、およびＣａｓ９ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を混合し、コオロギの卵（採卵後５時間以内）に注入した。
（１）ＮＨＥＪによるノックイン
ドナーベクターとして、pＵＣ５７ベクター（２７１０bp）にｅＧＦＰ遺伝子をコオロギアクチンプロモーターの下流に組み込んだもの（５６２５ｂｐ（配列番号１５））を作製した。前記プロモーターの上流には、ＤｓＲｅｄ由来の短い配列をベイト（bait）として組み込んだ。また、Ｕｂｘ遺伝子、ａｂｄ－Ａ遺伝子、および前記ベイトを標的とするｇＲＮＡをそれぞれ作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、上記１（１）と同じものを用いた。ベイトのｇＲＮＡはＤｓＲｅｄ遺伝子を標的とした（ＤｓＲｅｄ標的配列；ＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＣ（配列番号１６））。ベイトｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）をＢｓａＩで直鎖化し、ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ１；ＴＡＧＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣ（配列番号１７）、ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ２；ＡＡＡＣＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴ（配列番号１８）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて、ｇＲＮＡを合成した。Ｕｂｘ遺伝子およびａｂｄ－Ａ遺伝子に対するそれぞれのｇＲＮＡは上記１（４）と同じものを用いた。
ゲノム用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター（１００ｎｇ／μｌ）、およびＣａｓ９ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を混合し、コオロギの卵（採卵後５時間以内）に注入した。
【0048】
図５に、ノックイン実験の概略を示す。Ｃａｓ９タンパク質によりドナーベクターと標的ゲノムＤＮＡが同時に切断される。切断された断面は細胞内修復経路のＮＨＥＪにより結合するが、その際、一定の割合で標的ゲノムＤＮＡとドナーベクターの断面の結合が起こり、標的ゲノム中にドナーベクターがノックインされる。ＮＨＥＪにより修復される際には、どの断面が結合するかはランダムであるため、ドナーベクターは２種類の方向でノックインされうる。
【0049】
得られたＧ０世代の成虫を野生型と交配し、Ｇ１世代の卵を得た。図６は、Ｕｂｘ遺伝子を標的とするｇＲＮＡを用いた実験の結果を示す。Ｕｂｘ発現領域でＧＦＰ発現を示す系統が得られた。
【0050】
前記のＧ１世代で得られた蛍光を発する個体（ヘテロ接合体）同士を掛け合わせ、Ｇ２世代の卵を得た。その結果、約２５％のＧ２個体において強いＧＦＰ発現が観察され，約５０％の個体でＧ１個体と同程度のＧＦＰ発現が観察された。約２５％の個体では蛍光は観察されなかった。図７は、Ｇ２世代の卵のＧＦＰ発現を示す。強いＧＦＰ発現が観察された個体では、Ｕｂｘノックアウトのホモ接合体の表現型を示しており、ノックインによりＵｂｘ遺伝子が破壊されたと考えられる。
【0051】
表１は、遺伝子ノックイン効率を示す。生殖細胞への変異伝搬効率は、aｂｄ－Ａでは２５％および５０％、Ｕｂｘでは約５％であった。他の遺伝子座に対するｇＲＮＡも作製し、同様に実験したところ、ノックインに成功した（データ提示せず）。変異伝搬効率は様々であったが、実用上十分な効率であった。
【表1】
【0052】
（２）標的特異的エンハンサートラップ法
ａｂｄ－Ａ遺伝子のイントロンを標的とするｇＲＮＡを設計し、標的特異的エンハンサートラップ法を行った。
図８に、標的特異的エンハンサートラップ法の概要を示す。この方法では、上記と同様に、ドナーベクター、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、ドナーベクター用ｇＲＮＡ、およびゲノム用ｇＲＮＡを用いるが、ゲノム用ｇＲＮＡを標的遺伝子の上流およびイントロンに対して作製する。これにより、ドナーベクターがノックインされても標的遺伝子には影響がなく、その機能を破壊することなく、エンハンサー活性をドナーベクターのＧＦＰ蛍光により可視化することができる。
ａｂｄ－Ａ遺伝子のイントロンを標的とするｇＲＮＡを設計し、標的特異的エンハンサートラップ法を行った。
図８に、標的特異的エンハンサートラップ法の概要を示す。この方法では、上記と同様に、ドナーベクター、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、ドナーベクター用ｇＲＮＡ、およびゲノム用ｇＲＮＡを用いるが、ゲノム用ｇＲＮＡを標的遺伝子の上流およびイントロンに対して作製する。これにより、ドナーベクターがノックインされても標的遺伝子には影響がなく、その機能を破壊することなく、エンハンサー活性をドナーベクターのＧＦＰ蛍光により可視化することができる。
【0053】
ａｂｄ－Ａ遺伝子のイントロンを標的とする２種類のｇＲＮＡ（標的配列＃１：ＧＣＴＣＧＣＧＧＴＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＴ（配列番号１９）、＃２：ＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣ（配列番号２０））を用いて得たＧ０個体の表現型を、上記１（４）で使用したａｂｄ－Ａ遺伝子のエクソンを標的とするｇＲＮＡを用いて得たＧ０個体と比較した。それぞれのｇＲＮＡ転写用ベクターは、ｐＤＲ２７４改変プラスミド（直鎖化したｐＤＲ２７４プラスミド（Addgene社）に改変ｏｌｉｇｏ１：ＡＡＡＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧ（配列番号２１）、改変ｏｌｉｇｏ２：ＣＴＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡ（配列番号２２）を組み込んだもの）をＢｓａＩで直鎖化し、＃１Ｏｌｉｇｏ１：ＡＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＴ（配列番号２３）と＃１Ｏｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＧＡＧ（配列番号２４）、＃２Ｏｌｉｇｏ１：ＡＴＡＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣ（配列番号２５）と＃２Ｏｌｉｇｏ２：ＡＡＡＣＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＧＡＡＡＴＡＧＧＣ（配列番号２６）のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをＤｒａＩにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine（Thermo Fisher社）を用いて転写し、ｇＲＮＡを合成した。ドナーベクター、ドナーベクター用ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡは、上記２（１）と同じものを用いた。
ゲノム用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター（１００ｎｇ／μｌ）、およびＣａｓ９ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を混合し、コオロギの卵（採卵後５時間以内）に注入した。
ゲノム用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター用ｇＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）、ドナーベクター（１００ｎｇ／μｌ）、およびＣａｓ９ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を混合し、コオロギの卵（採卵後５時間以内）に注入した。
【0054】
その結果、いずれのｇＲＮＡによっても、Ｇ０個体においてａｂｄ－Ａ発現領域にＧＦＰ蛍光が観察された。図９に代表例を示す。表現型を観察したところ、エクソンに対するｇＲＮＡでは蛍光を発する領域でノックアウト様の表現型を示した（図９、矢頭）が、イントロンに対するｇＲＮＡでは表現型が現れず、遺伝子機能が破壊されていないことが分かった。
【0055】
（３）ドナーベクター、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、およびｇＲＮＡの濃度の検討
ａｂｄ－Ａ遺伝子を標的として、ノックイン実験における注入溶液の濃度検討を行った。
ドナーベクター、ベイトｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡは、上記２（１）と同じものを用いた。ａｂｄ－Ａ遺伝子に対するｇＲＮＡは、上記１（４）と同じものを用いた。
ゲノム用ｇＲＮＡ：１μｇ／μｌ、ドナーベクター用ｇＲＮＡ：１μｇ／μｌ、ドナーベクター：２μｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ：２μｇ／μｌのストック溶液１μｌを４μｌに希釈して、注入溶液（ゲノム用ｇＲＮＡ：２５０ｎｇ／μｌ、ドナーベクター用ｇＲＮＡ：２５０ｎｇ／μｌ、ドナーベクター：５００ｎｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ：５００ｎｇ／μｌ）を調製した。この注入溶液を、１倍、５倍、１０倍、または１００倍希釈して、実験に用いた。ノックインのネガティブコントロールとして、ドナーベクターのみ、注入のネガティブコントロールとして注入なし（Ｎｏ ｉｎｊ．）の実験も行った。
ａｂｄ－Ａ遺伝子を標的として、ノックイン実験における注入溶液の濃度検討を行った。
ドナーベクター、ベイトｇＲＮＡおよびＣａｓ９ｍＲＮＡは、上記２（１）と同じものを用いた。ａｂｄ－Ａ遺伝子に対するｇＲＮＡは、上記１（４）と同じものを用いた。
ゲノム用ｇＲＮＡ：１μｇ／μｌ、ドナーベクター用ｇＲＮＡ：１μｇ／μｌ、ドナーベクター：２μｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ：２μｇ／μｌのストック溶液１μｌを４μｌに希釈して、注入溶液（ゲノム用ｇＲＮＡ：２５０ｎｇ／μｌ、ドナーベクター用ｇＲＮＡ：２５０ｎｇ／μｌ、ドナーベクター：５００ｎｇ／μｌ、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ：５００ｎｇ／μｌ）を調製した。この注入溶液を、１倍、５倍、１０倍、または１００倍希釈して、実験に用いた。ノックインのネガティブコントロールとして、ドナーベクターのみ、注入のネガティブコントロールとして注入なし（Ｎｏ ｉｎｊ．）の実験も行った。
【0056】
表２に産卵後７日目における結果を示す。表２において、「生（奇）」は全生存個体数を示し、正常発生した個体数を括弧外に、形態異常が見られた個体数を括弧内に示す。「光」は正常発生した個体のうち蛍光を発する個体数を、「死」は死んだ個体数を示す。正常発生した個体のうち蛍光が観察された個体は原液で２８％、５倍希釈で３３％、１０倍希釈で８％、１００倍希釈で６％であった。蛍光を発する代表的な個体を図１１に示す。孵化した個体数を表３に示す。表３において、「生」は産卵後７日目の時点で正常発生した生存個体のうち孵化した個体数を、「光」は産卵後１５日目の時点で蛍光を発した個体のうち孵化した個体数を示す。産卵後７日目に生存していた個体のうち孵化した割合は、原液を注入した場合５７％であり、５倍希釈で６０％、１０倍希釈で６５％、１００倍希釈で８７％であった。孵化後２０日で個体の形態を観察した結果を表４に示す。原液を注入した個体群では、形態異常は観察されなかったが、５倍希釈では２５％、１０倍希釈では１４％、１００倍希釈では３５％で形態異常が観察された。これらの結果から、１０倍希釈および１００倍希釈でも遺伝子改変可能であることがわかった。
【0057】
図１２に５倍希釈で得られた形態異常が観察された幼虫の写真を示す。注入なしの個体と比較して、腹部体節の一部が融合している状態が観察された。その後成虫まで育て、野生型の成虫と掛け合わせ、次世代の卵の蛍光を観察した。結果を表５に示す。１日ごとにわけて採卵を行い観察したところ、２日目までに採卵した卵では蛍光は観察されなかったが、３日目以降に採卵した卵では１１％、１３％で蛍光を発する卵が得られた。図１３に５倍希釈から得られた次世代の蛍光を発する卵の写真を示す。胚反転が終了した卵で、胚の腹部において蛍光が観察された。この腹部における蛍光は、ａｂｄ－Ａの発現領域と一致していることから、ドナーベクターは標的ゲノム領域に組み込まれていると考えられる。
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【配列表フリーテキスト】
【0058】
配列番号３：ｖｅｒｍｉｌｉｏｎ遺伝子中の標的配列
配列番号４：Ｏｌｉｇｏ１
配列番号５：Ｏｌｉｇｏ２
配列番号６：ｌａｃｃａｓｅ２遺伝子中の標的配列
配列番号７：Ｏｌｉｇｏ１
配列番号８：Ｏｌｉｇｏ２
配列番号９：Ｕｂｘ遺伝子中の標的配列
配列番号１０：ａｂｄ－Ａ遺伝子中の標的配列
配列番号１１：ＵｂｘＯｌｉｇｏ１
配列番号１２：ＵｂｘＯｌｉｇｏ２
配列番号１３：ａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ１
配列番号１４：ａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ２
配列番号１５：ドナーベクター
配列番号１６：ＤｓＲｅｄ遺伝子中の標的配列
配列番号１７：ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ１
配列番号１８：ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ２
配列番号１９：ａｂｄ－Ａ遺伝子中の標的配列
配列番号２０：ａｂｄ－Ａ遺伝子中の標的配列
配列番号２１：改変Ｏｌｉｇｏ１
配列番号２２：改変Ｏｌｉｇｏ２
配列番号２３：＃１Ｏｌｉｇｏ１
配列番号２４：＃１Ｏｌｉｇｏ２
配列番号２５：＃２Ｏｌｉｇｏ１
配列番号２６：＃２Ｏｌｉｇｏ２
配列番号４：Ｏｌｉｇｏ１
配列番号５：Ｏｌｉｇｏ２
配列番号６：ｌａｃｃａｓｅ２遺伝子中の標的配列
配列番号７：Ｏｌｉｇｏ１
配列番号８：Ｏｌｉｇｏ２
配列番号９：Ｕｂｘ遺伝子中の標的配列
配列番号１０：ａｂｄ－Ａ遺伝子中の標的配列
配列番号１１：ＵｂｘＯｌｉｇｏ１
配列番号１２：ＵｂｘＯｌｉｇｏ２
配列番号１３：ａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ１
配列番号１４：ａｂｄ－ＡＯｌｉｇｏ２
配列番号１５：ドナーベクター
配列番号１６：ＤｓＲｅｄ遺伝子中の標的配列
配列番号１７：ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ１
配列番号１８：ＤｓＲｅｄＯｌｉｇｏ２
配列番号１９：ａｂｄ－Ａ遺伝子中の標的配列
配列番号２０：ａｂｄ－Ａ遺伝子中の標的配列
配列番号２１：改変Ｏｌｉｇｏ１
配列番号２２：改変Ｏｌｉｇｏ２
配列番号２３：＃１Ｏｌｉｇｏ１
配列番号２４：＃１Ｏｌｉｇｏ２
配列番号２５：＃２Ｏｌｉｇｏ１
配列番号２６：＃２Ｏｌｉｇｏ２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】