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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-18
(45)【発行日】2022-11-29
(54)【発明の名称】経口投与用の皮膚用保湿機能剤
(51)【国際特許分類】
A61K 8/37 20060101AFI20221121BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20221121BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20221121BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20221121BHJP
C12P 1/04 20060101ALN20221121BHJP
C12P 7/62 20220101ALN20221121BHJP
【ＦＩ】
A61K8/37
A61Q19/00
A61K8/99
A61K8/9789
C12P1/04 Z
C12P7/62
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2018238165
(22)【出願日】2018-12-20
(65)【公開番号】P2020100574
(43)【公開日】2020-07-02
【審査請求日】2021-11-19
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ＭＤＰＩ ＡＧ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ２０１８，１０（１２），１８５８
(73)【特許権者】
【識別番号】302054936
【氏名又は名称】株式会社光英科学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002446
【氏名又は名称】特許業務法人アイリンク国際特許商標事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100076163
【弁理士】
【氏名又は名称】嶋 宣之
(72)【発明者】
【氏名】徳留 嘉寛
(72)【発明者】
【氏名】玉根 強志
【審査官】相田 元
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－１１４８０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－２０２１３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－２８７５４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平０８－５１１０１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／０９１９８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００８－２４６１８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｋ ３１／２２５
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トリリノレインを有効成分とする経口投与用の皮膚用保湿機能剤。
【請求項2】
豆乳を培地にして生産され、上記トリリノレインが含有された乳酸菌生産物質からなる請求項１に記載の経口投与用の皮膚用保湿機能剤。
【請求項3】
上記乳酸菌生産物質は、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、
Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス(Lactobacillus brevis)、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、
Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム(Enterococcus faecium)、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）の１６菌種のいずれかであって共棲培養可能な複数の乳酸菌を培養した培養液からなる請求項２に記載の経口投与用の皮膚用保湿機能剤。
【請求項4】
上記乳酸菌生産物質は、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ヘルベティカスを第１グループ、
Ｅ．フェシウムおよびＬ．アシドフィラスを第２グループ、
Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーを第３グループ、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスを第４グループ、
Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスを第５グループ、
Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．パラカゼイを第６グループ、
Ｂ．アドレセンティス単体を第７グループ、
Ｌ．デルブリッキィおよびＬ．ガセリーを第８グループ、
Ｌ．デルブリッキィ単体を第９グループ、
Ｅ．フェシウム、Ｌ．ジェンセニイ、Ｌ．パラカゼイおよびＬ．ブレビスを第１０グループ、
Ｌ．アシドフィラス単体を第１１グループ、
Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーを第１２グループ、
Ｌ．パラカゼイ単体を第１３グループ、
Ｌ．ガセリー、Ｅ．フェシウムおよびＢ．ビフィダムを第１４グループ、
Ｂ．ロンガム、Ｓ．サーモフィラスおよびＥ．フェシウムを第１５グループ、
Ｌ．ガセリーを単体で第１６グループ、
Ｌ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィラスを第１７グループ、
Ｌ．ガセリー、Ｌ．ラクチス、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムを第１８グループ、
Ｌ．ガセリー、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．ブルガリクスを第１９グループ、
Ｌ．ラクチスを単体で第２０グループ、
Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムを第２１グループ、
Ｌ．ラモナウサスを単体で第２２グループ、
Ｌ．カゼイを単体で第２３グループ、
Ｂ．ロンガムを単体で第２４グループとし、
それぞれのグループ毎の培養液のうち、上記第１，２グループ同士、上記第３，４グループ同士、上記第５，６グループ同士、上記第７，８グループ同士、上記第９，１０グループ同士、上記第１１，１２グループ同士、上記第１３，１４グループ同士、上記第１５，１６グループ同士、上記第１７，１８グループ同士、上記第１９，２０グループ同士、上記第２１，２２グループ同士、上記第２３，２４グループ同士で１次培養し、
上記第１，２グループと上記第３，４グループ、上記第５，６グループと上記第７，８グループ、上記第９，１０グループと上記第１１，１２グループ、上記第１３，１４グループと上記第１５，１６グループ、上記第１７，１８グループと上記第１９，２０グループ、上記第２１，２２グループと上記第２３，２４グループ同士とで２次培養し、
上記２次培養後の各２次培養液を混合した混合液を用いて３次培養した培養液からなる請求項２に記載の経口投与用の皮膚用保湿機能剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この発明は、皮膚の保湿機能を高めるための皮膚用保湿機能剤に関する。
【背景技術】
【0002】
表皮の水分量が低減すると、皮膚のバリア機能が低下してアトピー性皮膚炎を起こしたりするなど、様々な不具合が発生することは知られている。そのため、表皮からの水分の蒸発を抑制するために皮膚表面に軟膏などの外用剤を塗布することが行なわれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１５－２２９６４３号公報
【文献】特開２０１６－０２３１７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
上記のような外用剤は、皮膚表面を覆って表皮層から外部への水分の通過を物理的に遮断するのであって、皮膚の保湿機能を向上させるものではなかった。
このような外用剤は、表皮を覆うことでその機能を発揮するので、カバー状態を保つために頻繁に広範囲に塗布しなければならない。そのため、塗布の手間がかかるだけでなく、べたつきなどの不快感を与えることもあった。
また、経口などによって体内に取り込んで効果を発揮する皮膚用保湿機能剤も種々提案されているが、安定した効果が得られるものは少なかった。
この発明は、手軽にかつ確実に、皮膚の保湿機能を向上させることができる皮膚用保湿機能剤を提供することである。
このような外用剤は、表皮を覆うことでその機能を発揮するので、カバー状態を保つために頻繁に広範囲に塗布しなければならない。そのため、塗布の手間がかかるだけでなく、べたつきなどの不快感を与えることもあった。
また、経口などによって体内に取り込んで効果を発揮する皮膚用保湿機能剤も種々提案されているが、安定した効果が得られるものは少なかった。
この発明は、手軽にかつ確実に、皮膚の保湿機能を向上させることができる皮膚用保湿機能剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
第１の発明の経口投与用の皮膚用保湿機能剤には、トリリノレインが含まれていればよく、例えばトリリノレイン以外の機能性物質や担体、賦形剤、添加剤等が含まれていてもよい。上記機能性物質としては、ビタミンやアミノ酸などが考えられる。
【0006】
第２の発明の経口投与用の皮膚用保湿機能剤には、豆乳を培地にした乳酸菌生産物質が含まれる。
なお、上記乳酸菌生産物質にはトリリノレインが含まれるが、この乳酸菌生産物質中のトリリノレインが、第１の発明のトリリノレインの適正量を保持していれば、それをもって第１の発明のトリリノレインとしてもよい。
また、乳酸菌生産物質内のトリリノレインが適正量を保持していないときには、乳酸菌生産物質内のトリリノレインと、当該乳酸菌生産物質とは別のトリリノレインとの合計したものを第１の発明におけるトリリノレインとすることができる。
なお、上記乳酸菌生産物質にはトリリノレインが含まれるが、この乳酸菌生産物質中のトリリノレインが、第１の発明のトリリノレインの適正量を保持していれば、それをもって第１の発明のトリリノレインとしてもよい。
また、乳酸菌生産物質内のトリリノレインが適正量を保持していないときには、乳酸菌生産物質内のトリリノレインと、当該乳酸菌生産物質とは別のトリリノレインとの合計したものを第１の発明におけるトリリノレインとすることができる。
【0007】
第３の発明の皮膚用保湿機能剤は、１６種の乳酸菌の中から選択された共棲培養可能な複数の菌を用いて生成される。１６種の乳酸菌のなかには共棲培養が可能なものが多く、それらの組み合わせを何組も作り出し、組み合わせごとに共棲培養をくり返すことができる。このように共棲培養を繰り返すことによって、乳酸菌生産物質をより多く生産することができる。乳酸菌生産物質の生産量が多くなれば、その分トリリノレインの生成量も多くなる。また、乳酸菌生産物質の生産量が多くなれば、トリリノレイン以外の保湿機能性分の生産量も多くなる。
なお、上記１６種の乳酸菌のうち共棲培養が可能な組み合わせは種々あり、そのなかで適正な組み合わせを選択すればよい。
なお、上記１６種の乳酸菌のうち共棲培養が可能な組み合わせは種々あり、そのなかで適正な組み合わせを選択すればよい。
【0008】
第４の発明の皮膚用保湿機能剤は、１６種の乳酸菌を用いて１次培養から３次培養まで培養したので、各乳酸菌が活性化され、トリリノレインを含んだより多くの乳酸菌生産物質を得ることができる。
【発明の効果】
【0009】
この発明によれば、トリリノレインが皮膚の保湿機能を発揮して例えばアトピー性皮膚炎などの乾燥肌に対する保湿効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】この発明の乳酸菌生産物質を生成するための共棲培養の順序を示した図である。
【図2】保湿効果確認実験に用いるマウスの群を示した表である。
【図3】経表皮水分損失量に関する実験結果を示すグラフである。
【図4】角層水分量に関する実験結果を示すグラフである。
【図5】乳酸菌による豆乳の発酵時間とトリリノレイン量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
この発明の皮膚用保湿機能剤の一実施形態を以下に説明する。
この実施形態では、以下に示す１６種の乳酸菌を種々組み合わせて２４のグループを作成し、これらグループで１次～３次共棲培養を行ない、最終培養液を滅菌して皮膚用保湿機能剤とするものである。
この実施形態では、以下に示す１６種の乳酸菌を種々組み合わせて２４のグループを作成し、これらグループで１次～３次共棲培養を行ない、最終培養液を滅菌して皮膚用保湿機能剤とするものである。
【0012】
上記１６種の乳酸菌は、Ｌ．アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、Ｌ．ブレビス（Lactobacillus brevis）、Ｌ．ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）、Ｌ．パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp． paracasei）、Ｌ．ガセリー（Lactobacillus gasseri）、Ｌ．ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp．bulgaricus）、Ｌ．ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、Ｌ．カゼイ（Lactobacillus casei subsp． casei）、Ｌ．ラモナウサス（Lactobacillus rhamnosus）、Ｌ．デルブリッキィ（Lactobacillus delbrueckii subsp． delbrueckii）、Ｓ．サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、Ｅ．フェシウム（Enterococcus faecium）、Ｌ．ラクチス（Lactococcus lactis）、Ｂ．ロンガム（Bifidobacterium longum）、Ｂ．ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｂ．アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）である。
【0013】
そして、グループ作成プロセスでは、上記乳酸菌を、２４のグループに分け、それらをグループ毎に継代培養するが、そのグループ分けは図１に示す通りである。
なお、図１は、上記グループ作成プロセスから、３次培養プロセスまでの各プロセスを示した図である。そして、図中の「Ｎｏ．」はグループ番号である。
すなわち、第１グループはＥ．フェシウムおよびＬ．ヘルベティカスで構成し、第２グループは、Ｅ．フェシウムおよびＬ．アシドフィラスで構成している。第３グループはＥ．フェシウムおよびＬ．ガセリーで構成し、第４グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスで構成している。
なお、図１は、上記グループ作成プロセスから、３次培養プロセスまでの各プロセスを示した図である。そして、図中の「Ｎｏ．」はグループ番号である。
すなわち、第１グループはＥ．フェシウムおよびＬ．ヘルベティカスで構成し、第２グループは、Ｅ．フェシウムおよびＬ．アシドフィラスで構成している。第３グループはＥ．フェシウムおよびＬ．ガセリーで構成し、第４グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスで構成している。
【0014】
第５グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラスおよびＬ．ブレビスで構成し、第６グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．パラカゼイで構成し、第７グループは、Ｂ．アドレセンティス単体で構成している。
第８グループは、Ｌ．デルブリッキィおよびＬ．ガセリーで構成し、第９グループはＬ．デルブリッキィ単体で構成し、第１０グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．ジェンセニイ、Ｌ．パラカゼイおよびＬ．ブレビスで構成し、第１１グループは、Ｌ．アシドフィラス単体で構成している。
第８グループは、Ｌ．デルブリッキィおよびＬ．ガセリーで構成し、第９グループはＬ．デルブリッキィ単体で構成し、第１０グループは、Ｅ．フェシウム、Ｌ．ジェンセニイ、Ｌ．パラカゼイおよびＬ．ブレビスで構成し、第１１グループは、Ｌ．アシドフィラス単体で構成している。
【0015】
第１２グループは、Ｅ．フェシウムおよびＬ．ガセリーで構成し、第１３グループは、Ｌ．パラカゼイ単体で構成し、第１４グループは、Ｌ．ガセリー、Ｅ．フェシウムおよびＢ．ビフィダムで構成し、第１５グループは、Ｂ．ロンガム、Ｓ．サーモフィラスおよびＥ．フェシウムで構成している。第１６グループは、Ｌ．ガセリー単体で構成し、第１７グループは、Ｌ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィラスで構成している。
【0016】
第１８グループは、Ｌ．ガセリー、Ｌ．ラクチス、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムで構成し、第１９グループは、Ｌ．ガセリー、Ｓ．サーモフィラスおよびＬ．ブルガリクスで構成し、第２０グループは、Ｌ．ラクチス単体で構成し、第２１グループは、Ｌ．ガセリーおよびＥ．フェシウムで構成し、第２２グループは、Ｌ．ラモナウサス単体で構成し、第２３グループは、Ｌ．カゼイ単体で構成し、第２４グループは、Ｂ．ロンガム単体で構成している。
【0017】
上記のようにした各グループを継代培養するとともに、それら培養液のうち、第１，２グループ同士、第３，４グループ同士、第５，６グループ同士、第７，８グループ同士、第９，１０グループ同士、第１１，１２グループ同士、第１３，１４グループ同士、第１５，１６グループ同士、第１７，１８グループ同士、第１９，２０グループ同士、第２１，２２グループ同士、第２３，２４グループ同士で共棲培養する。このプロセスが、図１中の（１）～（１２）に示す、この発明の１次培養プロセスである。
【0018】
さらに、図１の（１３）～（１８）の２次培養プロセスで、上記第１，２グループと第３，４グループ、第５，６グループと第７，８グループ、第９，１０グループと第１１，１２グループ、第１３，１４グループと第１５，１６グループ、第１７，１８グループと第１９，２０グループ、第２１，２２グループと第２３，２４グループ同士とで共棲培養をする。
さらに、図１の（１９）の３次培養プロセスで、上記２次培養後の各グループの２次培養液を混合して、共棲培養するのが３次培養プロセスである。
さらに、図１の（１９）の３次培養プロセスで、上記２次培養後の各グループの２次培養液を混合して、共棲培養するのが３次培養プロセスである。
【0019】
なお、上記グループ作成プロセスで作成した各グループの乳酸菌は次のようにして継代培養したものである。すなわち、各グループのそれぞれの乳酸菌は、それらを継代培養した場合にも、共棲状態を維持できることを予測しながら集合させたものである。
複数の乳酸菌が共棲状態を維持するとは、複数の種類の乳酸菌が同時に存在し、それぞれが活性を維持する共棲状態が存在することで、一方が、他方に影響を及ぼしたり、一方だけが生き残ったりする状態ではない。
複数の乳酸菌が共棲状態を維持するとは、複数の種類の乳酸菌が同時に存在し、それぞれが活性を維持する共棲状態が存在することで、一方が、他方に影響を及ぼしたり、一方だけが生き残ったりする状態ではない。
【0020】
上記各乳酸菌グループは、様々な菌の組み合わせの中から、共棲可能な組み合わせを選択することによって形成している。
また、上記２４のグループを構成する乳酸菌の中には、同時に複数のグループに属する菌種も有る。これは、３次培養プロセスまでの共棲培養の過程で共棲状態が維持されることを考慮して菌種を組み合わせたためである。また、同一種の乳酸菌でも、株が異なるものも含まれている。
また、上記２４のグループを構成する乳酸菌の中には、同時に複数のグループに属する菌種も有る。これは、３次培養プロセスまでの共棲培養の過程で共棲状態が維持されることを考慮して菌種を組み合わせたためである。また、同一種の乳酸菌でも、株が異なるものも含まれている。
【0021】
そして、各乳酸菌グループの培養培地は、日水製薬株式会社製のＧＡＭ半流動高層培地、ＢＬ寒天培地あるいは変法ＧＡＭ寒天培地からなる３種類の培地を、乳酸菌に応じて使い分けるとともに、これらの培地において、３２〔℃〕で１２時間培養した。その後、３７〔℃〕で１２時間培養し、さらに４０〔℃〕で２４時間培養した。グループ化した乳酸菌を上記のようにして継代培養するとともに、その培養液を５〔℃〕で冷蔵保存しておいた。
【0022】
このようにして乳酸菌のグループを継代培養するとともに、グループ毎に同定をしたが、その同定試験は社団法人日本食品分析センターに依頼した。そして、その同定試験の概要は、各グループの検体を寒天平板培地に直接接種・培養し、優勢に生育した形状の異なる集落を釣菌してグループ毎に乳酸菌を分離し、この分離菌について形態観察、生理的性状試験および菌体内ＤＮＡのＧＣ含有量の測定を行い、次の文献を参考に同定したものである。
【0023】
１．Sneath,P．H．A.,Mair,N．S.,Sharpe,M．Ｅ． and Holt,J．G． ： “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” Vol．2, （1986） Williams & Wilkins．
２．Holt,J．G., Krieg,N．R., Sneath,P．H．A., Staley,J．T． and Williams,S．T． ： “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”Ninth Edition（1994）Williams & Wilkins．
３．光岡知足：“腸内菌の世界”,（1984）叢文社．
４．辨野義巳：微生物6,3-14（1990）．
５．厚生省生活衛生局監修：“食品衛生検査指針-微生物編-”（1990）日本食品衛生協会．
６．Schleifer,K．H． and Kilpper-Balz,R. : Int.J.Syst.Bacteriol.,34,31-34（1984）．
２．Holt,J．G., Krieg,N．R., Sneath,P．H．A., Staley,J．T． and Williams,S．T． ： “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”Ninth Edition（1994）Williams & Wilkins．
３．光岡知足：“腸内菌の世界”,（1984）叢文社．
４．辨野義巳：微生物6,3-14（1990）．
５．厚生省生活衛生局監修：“食品衛生検査指針-微生物編-”（1990）日本食品衛生協会．
６．Schleifer,K．H． and Kilpper-Balz,R. : Int.J.Syst.Bacteriol.,34,31-34（1984）．
【0024】
上記同定の結果、図１に示す１６種の菌とその菌株とが特定され、それらが各グループ内で共棲状態を維持していることが確認された。
上記のようにして継代培養した２４のグループのうち、図１で隣り合うグループの乳酸菌を合わせて（１）～（１２）の１次培養プロセスの共棲培養を行なった。そして、この１次培養プロセスでは、日水製薬株式会社製のＧＡＭ半流動高層培地、ＢＬ寒天培地あるいは変法ＧＡＭ寒天培地からなる３種類の培地を、１次培養用培地として使用するとともに、これら１次培養用培地を、乳酸菌に応じて使い分けた。
上記のようにして継代培養した２４のグループのうち、図１で隣り合うグループの乳酸菌を合わせて（１）～（１２）の１次培養プロセスの共棲培養を行なった。そして、この１次培養プロセスでは、日水製薬株式会社製のＧＡＭ半流動高層培地、ＢＬ寒天培地あるいは変法ＧＡＭ寒天培地からなる３種類の培地を、１次培養用培地として使用するとともに、これら１次培養用培地を、乳酸菌に応じて使い分けた。
【0025】
上記３種類のいずれかの１次培養用培地に対して、グループ化した乳酸菌を添加して１次培養を行なったが、例えば、上記のようにグループ化した乳酸菌の培地が、流動性が高い培地の場合であって、しかも、ビフィドバクテリウム菌属の菌を含んでいる場合には、１次共棲培養用培地に対して１～１０〔％（w/w）〕の乳酸菌を添加した。ビフィドバクテリウム菌属の菌を含んでいないグループの場合には、同じく１次培養用培地に対して１～１０〔％（w/w）〕の乳酸菌を添加した。
【0026】
なお、上記１次培養用培地に対して乳酸菌を添加する場合に、図１の乳酸菌１～２４の乳酸菌グループの培地が、固形性の高い培地の場合には、白金耳でつり上げた１回の量を１次培養用培地に添加した。
そして、上記のように乳酸菌を添加した１次培養用培地が３７〔℃〕でｐＨ値が４．６になるまで約６～１２時間、乳酸菌を培養した。これが１次培養プロセスである。
なお、上記１６菌種のうちビフィドバクテリウム菌属に属する菌は、Ｂ．ロンガム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．アドレセンティスである。
そして、上記のように乳酸菌を添加した１次培養用培地が３７〔℃〕でｐＨ値が４．６になるまで約６～１２時間、乳酸菌を培養した。これが１次培養プロセスである。
なお、上記１６菌種のうちビフィドバクテリウム菌属に属する菌は、Ｂ．ロンガム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．アドレセンティスである。
【0027】
２次培養プロセスは、図１に示す（１３）～（１８）のプロセスである。
この２次培養プロセスでは、２次培養用培地として豆乳にブドウ糖０．５〔％（w/w）〕、酵母エキス０．４〔％（w/w）〕を添加した。
この２次培養用培地に、上記１次培養プロセスが終了した乳酸菌を１次培養用培地ごと投入し、３７〔℃〕でｐＨ値が４．５５になるまで約６～１０時間培養を行なう。上記１次培養用培地の投入量は１～１０〔％（w/w）〕である。
なお、図１の（１３）～（１８）のプロセスそれぞれで、上記２次培養用培地を用いるが、その２次培養用培地や添加要素は、どの乳酸菌グループについても全て同じにした。
この２次培養プロセスでは、２次培養用培地として豆乳にブドウ糖０．５〔％（w/w）〕、酵母エキス０．４〔％（w/w）〕を添加した。
この２次培養用培地に、上記１次培養プロセスが終了した乳酸菌を１次培養用培地ごと投入し、３７〔℃〕でｐＨ値が４．５５になるまで約６～１０時間培養を行なう。上記１次培養用培地の投入量は１～１０〔％（w/w）〕である。
なお、図１の（１３）～（１８）のプロセスそれぞれで、上記２次培養用培地を用いるが、その２次培養用培地や添加要素は、どの乳酸菌グループについても全て同じにした。
【0028】
また、図１に（１９）で示す３次培養プロセスでも、３次培養用培地として豆乳にブドウ糖０．５〔％（w/w）〕、酵母エキス０．４〔％（w/w）〕を添加した。このようにした３次培養用培地に、２次培養が終了した全ての乳酸菌を２次培養用培地ごと投入した。このとき、投入する２次培養用培地は、３次培養用培地に対して１～１０〔％（w/w）〕である。
そして、３２〔℃〕で２４時間し、次に４０〔℃〕で４８時間、さらに３７〔℃〕で４８時間培養した。
そして、３２〔℃〕で２４時間し、次に４０〔℃〕で４８時間、さらに３７〔℃〕で４８時間培養した。
【0029】
上記のようにして３次培養プロセスを終了した乳酸菌と培地とからなる最終培養液を、８５〔℃〕以上で加熱して滅菌した。このように滅菌された最終培養液がこの発明の乳酸菌生産物質であり、この実施形態ではこれを皮膚用保湿機能剤とする。
【0030】
［保湿機能確認実験］
そして、この実施形態の乳酸菌生産物質からなる皮膚用保湿機能剤の効果を確認するためにマウスを用いて実験を行なった。その実験をいかに説明する。
この実験に用いたマウスは、ヘアレスマウス(Ｈｏｓ：ＨＲ－１，雄性，４週齢)である。
このマウスを、図２の表に示すように、コントロール群、乳酸菌生産物質投与群、標準トリリノレイン投与群及び抽出トリリノレイン投与群からなる各投与群とノーマル群とに分け、各群に５匹のマウスを用いた。
そして、この実施形態の乳酸菌生産物質からなる皮膚用保湿機能剤の効果を確認するためにマウスを用いて実験を行なった。その実験をいかに説明する。
この実験に用いたマウスは、ヘアレスマウス(Ｈｏｓ：ＨＲ－１，雄性，４週齢)である。
このマウスを、図２の表に示すように、コントロール群、乳酸菌生産物質投与群、標準トリリノレイン投与群及び抽出トリリノレイン投与群からなる各投与群とノーマル群とに分け、各群に５匹のマウスを用いた。
【0031】
上記ノーマル群は、標準飼料ＭＲストック（日本農産製）を給餌し、何も投与しない群である。
一方、各投与群は、飼料ＨＲ－ＡＤ（星野飼育所製）を６週間給餌した後に、各投与物（図２参照）を１日０．３〔ｍｌ〕ずつ経口投与する群である。なお、上記飼料ＨＲ－ＡＤは、その給餌によって乾燥肌状態を誘発する飼料である。
一方、各投与群は、飼料ＨＲ－ＡＤ（星野飼育所製）を６週間給餌した後に、各投与物（図２参照）を１日０．３〔ｍｌ〕ずつ経口投与する群である。なお、上記飼料ＨＲ－ＡＤは、その給餌によって乾燥肌状態を誘発する飼料である。
【0032】
そして、各投与群に投与する投与物の詳細は次のとおりである。
コントロール群への投与物は、エタノール１０〔％（w/w）〕を含む生理食塩水である。
また、上記乳酸菌生産物質投与群に投与する乳酸菌生産物質は、上記した３次培養プロセスで生成された乳酸菌生産物質に１０〔％（w/w）〕のエタノールを添加したものである。この乳酸菌生産物質には、約１〔％（w/w）〕のトリリノレインが含まれている。上記乳酸菌生産物質中のトリリノレインは、Ｂｉｏ ＲＡＤ社の分析装置「Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｘ ＸＲＳ＋システム」によってトリリノレインの純品と比較することで確認している。
なお、乳酸菌生産物質にエタノールを添加したのは、上記乳酸菌生産物質が雑菌によって腐敗することを防止するためである。
コントロール群への投与物は、エタノール１０〔％（w/w）〕を含む生理食塩水である。
また、上記乳酸菌生産物質投与群に投与する乳酸菌生産物質は、上記した３次培養プロセスで生成された乳酸菌生産物質に１０〔％（w/w）〕のエタノールを添加したものである。この乳酸菌生産物質には、約１〔％（w/w）〕のトリリノレインが含まれている。上記乳酸菌生産物質中のトリリノレインは、Ｂｉｏ ＲＡＤ社の分析装置「Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｘ ＸＲＳ＋システム」によってトリリノレインの純品と比較することで確認している。
なお、乳酸菌生産物質にエタノールを添加したのは、上記乳酸菌生産物質が雑菌によって腐敗することを防止するためである。
【0033】
標準トリリノレイン投与群への投与物は、東京化成製のトリリノレイン１〔％（w/w）〕及びエタノール１０〔％（w/w）〕を含む生理食塩水である。
抽出トリリノレイン投与群への投与物は、上記乳酸菌生産物質から抽出したトリリノレイン１〔％（w/w）〕及びエタノール１０〔％（w/w）〕を含む生理食塩水である。なお、この抽出トリリノレインは、上記乳酸菌生産物質を凍結乾燥して得られた粉末からエーテルで脂質分を抽出して分画して得たものである。
抽出トリリノレイン投与群への投与物は、上記乳酸菌生産物質から抽出したトリリノレイン１〔％（w/w）〕及びエタノール１０〔％（w/w）〕を含む生理食塩水である。なお、この抽出トリリノレインは、上記乳酸菌生産物質を凍結乾燥して得られた粉末からエーテルで脂質分を抽出して分画して得たものである。
【0034】
そして、ノーマル群及び各投与群のマウスについて、経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）及び角層水分量を測定した。測定は、投与物の投与開始前は１週間ごとに行ない、投与開始後は毎日行なった。
【0035】
［実験結果］
この実験結果を図３，４のグラフに示す。
図３は、各群のマウスの経表皮水分損失量の測定結果を示したグラフである。
このグラフから、給餌前に１０〔ｇ／ｍ２／ｈ〕前後だった経表皮水分損失量が、飼料ＨＲ－ＡＤ給餌によって６週間後には３０〔ｇ／ｍ２／ｈ〕まで上昇して乾燥肌状態になっていることが分かる。その後、各投与物を経口投与すると、コントロール群以外の投与群のマウスで経表皮水分損失量の減少が確認できた。
この実験結果を図３，４のグラフに示す。
図３は、各群のマウスの経表皮水分損失量の測定結果を示したグラフである。
このグラフから、給餌前に１０〔ｇ／ｍ２／ｈ〕前後だった経表皮水分損失量が、飼料ＨＲ－ＡＤ給餌によって６週間後には３０〔ｇ／ｍ２／ｈ〕まで上昇して乾燥肌状態になっていることが分かる。その後、各投与物を経口投与すると、コントロール群以外の投与群のマウスで経表皮水分損失量の減少が確認できた。
【0036】
つまり、乳酸菌生産物質投与群、標準トリリノレイン投与群、抽出トリリノレイン投与群で、保湿機能が発揮され乾燥肌状態が改善された。
この保湿機能の効果は乳酸菌生産物質投与群で最も大きく、続く標準トリリノレイン投与群と抽出トリリノレイン投与群はほぼ同等の効果であった。
この保湿機能の効果は乳酸菌生産物質投与群で最も大きく、続く標準トリリノレイン投与群と抽出トリリノレイン投与群はほぼ同等の効果であった。
【0037】
上記の結果から、投与物中のトリリノレインが、経表皮水分損失量を減少させる保湿機能を発揮することがわかった。
また、標準トリリノレイン投与群及び抽出トリリノレイン投与群に比べて乳酸菌生産物質投与群の経表皮水分損失量を減少させる保湿効果が大きいことから、上記乳酸菌生産物質には、トリリノレイン以外にも経表皮水分損失量を減少させる物質、すなわち保湿機能物質が含まれていると推測できる。
また、標準トリリノレイン投与群及び抽出トリリノレイン投与群に比べて乳酸菌生産物質投与群の経表皮水分損失量を減少させる保湿効果が大きいことから、上記乳酸菌生産物質には、トリリノレイン以外にも経表皮水分損失量を減少させる物質、すなわち保湿機能物質が含まれていると推測できる。
【0038】
また、図４はマウスの角層水分量の測定結果を示したグラフである。
このグラフから、給餌前には６０以上あった角層水分量が、飼料ＨＲ－ＡＤの給餌によって６週間で約３０まで減少して乾燥肌状態になっていることが分かる。その後、乳酸菌生産物質投与群では投与１０日目から緩やかに角層水分量が上昇し、５０程度まで回復した。
このグラフから、給餌前には６０以上あった角層水分量が、飼料ＨＲ－ＡＤの給餌によって６週間で約３０まで減少して乾燥肌状態になっていることが分かる。その後、乳酸菌生産物質投与群では投与１０日目から緩やかに角層水分量が上昇し、５０程度まで回復した。
【0039】
一方、標準トリリノレイン投与群、抽出トリリノレイン投与群の角層水分量は、コントロール群と比べてやや上昇したが、著しい上昇ではなかった。
このことからも、上記乳酸菌生産物質にはトリリノレインとともに、角層水分量を回復させる保湿機能物質が含まれていると推測できる。
このことからも、上記乳酸菌生産物質にはトリリノレインとともに、角層水分量を回復させる保湿機能物質が含まれていると推測できる。
【0040】
上記実験結果が示すように、この実施形態の乳酸菌生産物質からなる皮膚用保湿機能剤は、トリリノレイン及びその他の保湿機能成分を含有し、皮膚の保湿機能を改善するものである。
ただし、この発明の皮膚用保湿機能剤としては、トリリノレインが適量含有されていればよく、乳酸菌生産物質は必須要素ではない。標準トリリノレイン投与群及び抽出トリリノレイン投与群でも、経表皮水分損失量を減少させる効果が十分にあることが確認されているからである。
ただし、この発明の皮膚用保湿機能剤としては、トリリノレインが適量含有されていればよく、乳酸菌生産物質は必須要素ではない。標準トリリノレイン投与群及び抽出トリリノレイン投与群でも、経表皮水分損失量を減少させる効果が十分にあることが確認されているからである。
【0041】
［トリリノレイン生成実験］
また、この実施形態の乳酸菌生産物質に含まれるトリリノレイン量と豆乳の発酵時間との関係を確認する実験を行なった。
この実験では、上記した３次培養プロセスと同様の条件で乳酸菌を培養して豆乳を発酵させた。すなわち、培地として豆乳にブドウ糖０．５〔％（w/w）〕、酵母エキス０．４〔％（w/w）〕を添加した。このようにした培地に上記した２次培養プロセスが終了した全ての乳酸菌を培地ごと合わせた培養液を、上記培地に対して３〔％（w/w）〕混合し、最初に３２〔℃〕で２４時間培養し、次に４０〔℃〕で４８時間培養し、さらに３７〔℃〕で４８時間培養した。
また、この実施形態の乳酸菌生産物質に含まれるトリリノレイン量と豆乳の発酵時間との関係を確認する実験を行なった。
この実験では、上記した３次培養プロセスと同様の条件で乳酸菌を培養して豆乳を発酵させた。すなわち、培地として豆乳にブドウ糖０．５〔％（w/w）〕、酵母エキス０．４〔％（w/w）〕を添加した。このようにした培地に上記した２次培養プロセスが終了した全ての乳酸菌を培地ごと合わせた培養液を、上記培地に対して３〔％（w/w）〕混合し、最初に３２〔℃〕で２４時間培養し、次に４０〔℃〕で４８時間培養し、さらに３７〔℃〕で４８時間培養した。
【0042】
そして、上記５日間の培養中に、トリリノレイン量を測定した。図５に示すグラフは、発酵時間ごとの培地中のトリリノレイン量の測定値を示したものである。このグラフにおける発酵時間０日とは、上記培地に乳酸菌として上記３次培養液を３〔％（w/w）〕添加した直後のことである。
その後、温度管理を行なって培地を発酵させる過程で、発酵時間１日、２日、５日の培地中のトリリノレイン量を測定した。この測定結果は図５に示す通りで、トリリノレイン量は発酵時間１日ではほとんど変化はないが、２日で倍以上に増加し５日では２日とほぼ同じであった。
その後、温度管理を行なって培地を発酵させる過程で、発酵時間１日、２日、５日の培地中のトリリノレイン量を測定した。この測定結果は図５に示す通りで、トリリノレイン量は発酵時間１日ではほとんど変化はないが、２日で倍以上に増加し５日では２日とほぼ同じであった。
【0043】
上記のように豆乳の発酵によってトリリノレインが増加することから、豆乳を用いた培地で乳酸菌を培養することで乳酸菌培養物質としてトリリノレインが生成されることが確認できた。
そして、この実施形態のように、複数の乳酸菌を共棲培養することによって乳酸菌の活性を維持し、１次～３次培養プロセスを実行すれば、より多くの乳酸菌生産物質を生成することができる。乳酸菌生産物質の量が多くなれば、それに含まれるトリリノレインや、その他の保湿機能成分の量が多くなるので、有効な皮膚用保湿機能剤を効率的に生産できることになる。
そして、この実施形態のように、複数の乳酸菌を共棲培養することによって乳酸菌の活性を維持し、１次～３次培養プロセスを実行すれば、より多くの乳酸菌生産物質を生成することができる。乳酸菌生産物質の量が多くなれば、それに含まれるトリリノレインや、その他の保湿機能成分の量が多くなるので、有効な皮膚用保湿機能剤を効率的に生産できることになる。
【0044】
この実施形態では、１６種の乳酸菌で、共棲可能な多数のグループを形成しているが、乳酸菌の組み合わせは上記に限らないし、使用する乳酸菌の種類も上記１６種に限定されない。共棲培養によって活性を維持する組み合わせで乳酸菌のグループを形成すれば、活性化した乳酸菌によってより多くの乳酸菌生産物質が生成されることは容易に想定できる。
また、保湿機能を発揮するトリリノレインは乳酸菌生産物質中のものに限らない。ただし、皮膚用保湿機能剤として豆乳培地の乳酸菌生産物質を用いれば、トリリノレインとともにその他の保湿機能物質を同時に含ませることができる。
また、保湿機能を発揮するトリリノレインは乳酸菌生産物質中のものに限らない。ただし、皮膚用保湿機能剤として豆乳培地の乳酸菌生産物質を用いれば、トリリノレインとともにその他の保湿機能物質を同時に含ませることができる。
【産業上の利用可能性】
【0045】
乾燥肌状態を改善して、表皮のバリア機能を回復させることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】