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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-21
(45)【発行日】2022-11-30
(54)【発明の名称】処理方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/88 20060101AFI20221122BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221122BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221122BHJP
C02F 3/34 20060101ALI20221122BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221122BHJP
【ＦＩ】
C12N9/88 ZNA
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C02F3/34 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2018191198
(22)【出願日】2018-10-09
(65)【公開番号】P2020058275
(43)【公開日】2020-04-16
【審査請求日】2021-06-03
(73)【特許権者】
【識別番号】000006655
【氏名又は名称】日本製鉄株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100175802
【弁理士】
【氏名又は名称】寺本 光生
(74)【代理人】
【識別番号】100134359
【弁理士】
【氏名又は名称】勝俣 智夫
(74)【代理人】
【識別番号】100188592
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 洋
(72)【発明者】
【氏名】福島 寿和
(72)【発明者】
【氏名】加藤 敏朗
(72)【発明者】
【氏名】末永 光
(72)【発明者】
【氏名】宮崎 健太郎
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１０－１８７５７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－３０１７１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－２５０６９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】DATABASE Uniport KB, accession no. S4YXT4, entry version 23 [online]，2018年06月20日，[2022年4月5日検索]，https://www.uniprot.org/uniprot/S4YXT4.txt?version=23
【文献】DATABASE Uniport KB, accession no. X0QPF0, entry version 19 [on line]，2018年06月20日，[2022年4月5日検索]，https://www.uniprot.org/uniprot/X0QPF0.txt?version=19
【文献】DATABASE Uniport KB, accession no. A0A0W1RRF4, entry version 12 [on line]，2017年11月22日，[2022年4月5日検索]，https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0W1RRF4.txt?version=12
【文献】Bioresource Technology，2017年，Vol.238，p.582-588
【文献】Acta Cryst.，2015年，F71，p.471-476
【文献】Bioresource Technology，2017年，Vol.253，p.105-111
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／８８
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｃ０２Ｆ ３／３４
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＤＤＢＪ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
チオシアンを含有する被処理水と、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質であるシアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程を有する処理方法。（ａ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
【請求項2】
前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、配列番号５３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号５４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、検出試薬を用いて前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有する、請求項１に記載の処理方法。
【請求項3】
前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（５）、（７）、（９）、（１１）及び（１３）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（１５）、（１７）、（１９）、（２１）及び（２３）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、検出試薬を用いて、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有する、請求項１に記載の処理方法。
（５）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１３）配列番号１３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１５）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１７）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１９）配列番号１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２１）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２３）配列番号１４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
【請求項4】
前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、配列番号５３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号５４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、検出試薬を用いて前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を定量する定量工程を有する、請求項１に記載の処理方法。
【請求項5】
前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（５）、（７）、（９）、（１１）及び（１３）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（１５）、（１７）、（１９）、（２１）及び（２３）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、検出試薬を用いて、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を定量する定量工程を有する、請求項１に記載の処理方法。
（５）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１３）配列番号１３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１５）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１７）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１９）配列番号１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２１）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２３）配列番号１４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
【請求項6】
更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する第二検出工程を有する請求項２又は３に記載の処理方法。
【請求項7】
前記硫化カルボニル経路に係る遺伝子が、チオシアン分解酵素遺伝子である請求項６に記載の処理方法。
【請求項8】
前記チオシアンを含有する被処理水が、コークス炉から排出された安水である請求項１～７のいずれか一項に記載の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シアン酸分解酵素、検出試薬、検出方法、定量方法、及び処理方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コークス炉排水（安水）は物理化学的処理の後、生物学的水処理方法である活性汚泥法によって、排水基準であるＣＯＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｍａｎｄ）成分が処理され、放流される。安水中のチオシアン酸［チオシアン酸イオン（ＳＣＮ－）として存在］はＣＯＤ成分であるため、処理が求められるが、処理が不安定になりがちである。チオシアン酸イオンの生分解には、硫化カルボニル（ＣＯＳ）を経てチオシアン酸イオンが分解されるＣＯＳ経路が知られている。ＣＯＳ経路のチオシアン分解微生物は既に分離されており（特許文献１）、チオシアン分解酵素の遺伝子配列もデータベースに登録されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特許第４６７２８１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、硫化カルボニルは温室効果ガスのため、硫化カルボニルの発生を抑えつつチオシアン酸イオンを分解することが望ましい。
チオシアン酸イオンの生分解には２つの経路があり、一方はシアン酸イオン（ＯＣＮ－）を経るシアン酸経路にて、もう一方が硫化カルボニル（ＣＯＳ）を経る硫化カルボニル経路にて、チオシアン酸イオンが分解されることが知られていた（図１）。発明者らは、このことに着想を得て、活性汚泥におけるチオシアン酸イオンの分解においても、シアン酸経路を経た分解が可能であると考えた。しかし、これまでに、硫化カルボニル経路でチオシアン酸イオンを分解する微生物の検出方法は報告されているが、シアン酸経路によりチオシアン酸イオンを分解する微生物を検出する方法はない。
チオシアン酸イオンの生分解には２つの経路があり、一方はシアン酸イオン（ＯＣＮ－）を経るシアン酸経路にて、もう一方が硫化カルボニル（ＣＯＳ）を経る硫化カルボニル経路にて、チオシアン酸イオンが分解されることが知られていた（図１）。発明者らは、このことに着想を得て、活性汚泥におけるチオシアン酸イオンの分解においても、シアン酸経路を経た分解が可能であると考えた。しかし、これまでに、硫化カルボニル経路でチオシアン酸イオンを分解する微生物の検出方法は報告されているが、シアン酸経路によりチオシアン酸イオンを分解する微生物を検出する方法はない。
【0005】
本発明は、前述した事情に鑑みてなされたものであって、シアン酸分解酵素、検出試薬、検出方法、定量方法、及び処理方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、前記課題を解決するべく鋭意検討した結果、新たにシアン酸分解酵素を同定し、本発明を完成させるに至った。
また、シアン酸分解酵素を有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、上記課題を解決するための手段として、以下の構成を採用する。
また、シアン酸分解酵素を有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、上記課題を解決するための手段として、以下の構成を採用する。
【0007】
［１］以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質であるシアン酸分解酵素。
（ａ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
［２］以下の（Ｉ）～（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する検出試薬。
（Ｉ）前記［１］に記載のシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）前記［１］に記載のシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
［３］シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）及び（２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（３）及び（４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、前記［２］に記載の検出試薬。
（１）配列番号５３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
［４］前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（５）～（１４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（１５）～（２４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、前記［２］に記載の検出試薬。
（５）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号１１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１３）配列番号１３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１４）配列番号１３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１５）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１６）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１７）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１８）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１９）配列番号１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２０）配列番号１０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２１）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２２）配列番号１２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２３）配列番号１４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２４）配列番号１４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
［５］前記［２］～［４］のいずれか一つに記載の検出試薬を用いて、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出方法。
［６］前記［２］～［４］のいずれか一つに記載の検出試薬を用いて、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を定量する定量方法。
［７］シアン酸と、前記［１］に記載のシアン酸分解酵素と、を含む混合相を形成させ、前記シアン酸分解酵素により前記シアン酸を分解させる処理工程を有する処理方法。
［８］チオシアンを含有する被処理水と、シアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程と、
前記シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するシアン酸経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程と、を有する処理方法。
［９］前記シアン酸経路に係る遺伝子が、シアン酸分解酵素遺伝子である前記［８］に記載の処理方法。
［１０］前記微生物が、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するチオシアン分解能を有する微生物である前記［８］又は［９］に記載の処理方法。
［１１］更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する第二検出工程を有する前記［８］～［１０］の何れか一つに記載の処理方法。
［１２］前記硫化カルボニル経路に係る遺伝子が、チオシアン分解酵素遺伝子である前記［１１］に記載の処理方法。
［１３］チオシアンを含有する被処理水と、前記［１］に記載のシアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程を有する処理方法。
［１４］前記［２］～［４］のいずれか一つに記載の検出試薬を用いて前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有する、前記［１３］に記載の処理方法。
［１５］前記チオシアンを含有する被処理水が、コークス炉から排出された安水である前記［８］～［１４］のいずれか一つに記載の処理方法。
（ａ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
［２］以下の（Ｉ）～（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する検出試薬。
（Ｉ）前記［１］に記載のシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）前記［１］に記載のシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
［３］シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）及び（２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（３）及び（４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、前記［２］に記載の検出試薬。
（１）配列番号５３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
［４］前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（５）～（１４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（１５）～（２４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備える、前記［２］に記載の検出試薬。
（５）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号１１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１３）配列番号１３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１４）配列番号１３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１５）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１６）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１７）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１８）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１９）配列番号１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２０）配列番号１０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２１）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２２）配列番号１２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２３）配列番号１４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２４）配列番号１４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
［５］前記［２］～［４］のいずれか一つに記載の検出試薬を用いて、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出方法。
［６］前記［２］～［４］のいずれか一つに記載の検出試薬を用いて、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を定量する定量方法。
［７］シアン酸と、前記［１］に記載のシアン酸分解酵素と、を含む混合相を形成させ、前記シアン酸分解酵素により前記シアン酸を分解させる処理工程を有する処理方法。
［８］チオシアンを含有する被処理水と、シアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程と、
前記シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するシアン酸経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程と、を有する処理方法。
［９］前記シアン酸経路に係る遺伝子が、シアン酸分解酵素遺伝子である前記［８］に記載の処理方法。
［１０］前記微生物が、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するチオシアン分解能を有する微生物である前記［８］又は［９］に記載の処理方法。
［１１］更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する第二検出工程を有する前記［８］～［１０］の何れか一つに記載の処理方法。
［１２］前記硫化カルボニル経路に係る遺伝子が、チオシアン分解酵素遺伝子である前記［１１］に記載の処理方法。
［１３］チオシアンを含有する被処理水と、前記［１］に記載のシアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程を有する処理方法。
［１４］前記［２］～［４］のいずれか一つに記載の検出試薬を用いて前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有する、前記［１３］に記載の処理方法。
［１５］前記チオシアンを含有する被処理水が、コークス炉から排出された安水である前記［８］～［１４］のいずれか一つに記載の処理方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明のシアン酸分解酵素によれば、シアン酸の分解が可能である。
本発明の検出試薬によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子又は遺伝子産物の検出が可能である。
本発明の検出方法によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の検出が可能である。
本発明の定量方法によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の定量が可能である。
本発明の処理方法によれば、シアン酸の分解が可能である。
本発明の処理方法によれば、被処理水がチオシアンを含有する場合、シアン酸分解酵素を有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能である。
本発明の検出試薬によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子又は遺伝子産物の検出が可能である。
本発明の検出方法によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の検出が可能である。
本発明の定量方法によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の定量が可能である。
本発明の処理方法によれば、シアン酸の分解が可能である。
本発明の処理方法によれば、被処理水がチオシアンを含有する場合、シアン酸分解酵素を有する微生物を利用して、チオシアンを含有する被処理水を処理可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】チオシアンの分解に関与する反応経路を説明する図である。
【図2】実施例で用いた、生物処理装置の構成を示す模式図である。
【図3】実施例において取得された、生物処理装置での亜硝酸生成速度の結果を示す図である。
【図4】実施例において取得された、生物処理装置でのチオシアン除去速度の結果を示す図である。
【図5】実施例において取得された、シアン酸分解に係る候補遺伝子１を含む系統樹である。
【図6】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図7】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図8】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図9】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図10】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図11】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図12】実施例において生物処理装置から取得されたサンプルに含まれる、各遺伝子の割合を運転日数ごとに示すグラフである。
【図13】実施例において生物処理装置から取得されたサンプルに含まれる、各遺伝子の割合を活性汚泥ごとに示すグラフである。
【図14】実施例で用いた、馴養装置の構成を示す模式図である。
【図15】実施例において取得された、馴養装置におけるチオシアン濃度の推移の結果を示す図である。
【図16】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図17】実施例において生物処理装置から取得されたサンプルに含まれる、各遺伝子の割合を運転日数ごとに示すグラフである。
【図18】実施例において生物処理装置から取得されたサンプルに含まれる、各遺伝子の割合を活性汚泥ごとに示すグラフである。
【図19】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図20】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図21】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図22】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図23】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図24】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図25】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図26】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図27】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図28】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図29】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図30】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図31】実施例において生物処理装置から取得されたサンプルに含まれる、各遺伝子の割合を運転日数ごとに示すグラフである。
【図32】実施例において生物処理装置から取得されたサンプルに含まれる、各遺伝子の割合を活性汚泥ごとに示すグラフである。
【図33】実施例において設計したプライマーセットを使用して得られた検量線である。
【図34】実施例においてシアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の包括定量値と個別定量の合計値との相関性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書においては、図１に示すようなチオシアン酸イオンの分解について、チオシアン酸イオン（ＳＣＮ－）のことを、単に「チオシアン」ということがあり、シアン酸イオン（ＯＣＮ－）のことを、単に「シアン酸」ということがある。
【0011】
≪シアン酸分解酵素≫
以下、実施形態のシアン酸分解酵素について説明する。
実施形態のシアン酸分解酵素は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
以下、実施形態のシアン酸分解酵素について説明する。
実施形態のシアン酸分解酵素は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質
【0012】
前記（ａ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたシアン酸分解酵素１のアミノ酸配列である。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号２で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【0013】
前記（ａ）において、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたシアン酸分解酵素２のアミノ酸配列である。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号４で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【0014】
前記（ａ）において、配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたシアン酸分解酵素３のアミノ酸配列である。配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号１８で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【0015】
前記（ａ）において、配列番号１９で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたシアン酸分解酵素４のアミノ酸配列である。配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号２０で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【0016】
前記（ａ）において、配列番号２１で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたシアン酸分解酵素５のアミノ酸配列である。配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号２２で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【0017】
前記（ａ）において、配列番号２３で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例で取得されたシアン酸分解酵素６のアミノ酸配列である。配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号２４で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【0018】
実施形態のシアン酸分解酵素は、シアン酸分解酵素活性を有するタンパク質である限りにおいて、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列に対して変異を有するものであってよく、前記（ｂ）のタンパク質、及び（ｃ）のタンパク質であってもよい。
【0019】
前記（ｂ）のタンパク質において、１又は複数個とは、例えば、１～３０個であってもよく、１～２０個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。
【0020】
前記（ｃ）のタンパク質において、アミノ酸配列の配列同一性は９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９６％以上であってもよく、９７％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の配列同一性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース上で提供されるＢＬＡＳＴ検索により求めることができる。
【0021】
（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質は、シアン酸分解酵素活性を有する。シアン酸分解酵素活性とは、シアン酸又はシアン酸イオンを分解する活性であり、図１に示す通り、シアン酸又はシアン酸イオンを、カルバミン酸又はカルバミン酸イオンへと分解する活性であってよい。シアン酸分解酵素の候補タンパク質がシアン酸分解酵素活性を有することは、当該候補タンパク質の機能を解析することにより判断でき、例えば、後述の実施例に示す方法により判断できる。具体的には、本来はシアン酸分解能を有していない微生物に、シアン酸分解酵素の候補タンパク質の遺伝子を導入し、シアン酸分解酵素の候補タンパク質を発現させる。そして、当該微生物がシアン酸分解能を獲得した場合、当該候補タンパク質はシアン酸分解酵素であると判断できる。
【0022】
当該実施形態に係るシアン酸分解酵素は、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、また、当該シアン酸分解酵素をコードする遺伝子を用いて、公知のタンパク質発現系によって製造することもできる。また、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列に対して変異を有するシアン酸分解酵素は、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列基づき、公知のアミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて製造することもできる。
【0023】
当該実施形態に係るシアン酸分解酵素は、シアン酸の分解に使用することができ、排水処理や物質製造など種々の反応に用いることができる。
【0024】
≪検出試薬≫
以下、実施形態の検出試薬について説明する。
実施形態の検出試薬は、以下の（Ｉ）～（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
（Ｉ）本発明に係るシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）本発明に係るシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
以下、実施形態の検出試薬について説明する。
実施形態の検出試薬は、以下の（Ｉ）～（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
（Ｉ）本発明に係るシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩ）本発明に係るシアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列と相補的な塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＩＶ）前記（ＩＩ）の部分配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｖ）前記（Ｉ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ＶＩ）前記（ＩＩ）の部分配列との配列同一性が９０％以上の塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0025】
本明細書における「遺伝子」とは、ゲノム上のシアン酸分解酵素の転写産物に対応するタンパク質コード領域の他に、イントロン、非翻訳領域、及び隣接した転写調節領域を含んでもよい。隣接した転写調節領域としては、プロモーターが挙げられる。ここでのシアン酸分解酵素の「遺伝子産物」としては、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体が挙げられる。
【0026】
実施形態の検出試薬におけるシアン酸分解酵素の遺伝子とは、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。
実施形態の検出試薬において、前記（Ｉ）と（ＩＩ）のポリヌクレオチドは、シアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列、又は該部分配列と相補的な配列を含んでいるので、前記シアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物とハイブリダイズすることで、これらの存在を検出できる。
ポリヌクレオチド同士のハイブリダイズは、完全に相補的な配列同士でなくとも生じることが知られている。そのため、前記（Ｉ）又は（ＩＩ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする限りにおいて、ポリヌクレオチドは変異を有するものであってよい。実施形態の検出試薬が含んでもよいポリヌクレオチドとしては、例えば、前記（ＩＩＩ）～（ＶＩ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
実施形態の検出試薬において、前記（Ｉ）と（ＩＩ）のポリヌクレオチドは、シアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物の塩基配列の部分配列、又は該部分配列と相補的な配列を含んでいるので、前記シアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物とハイブリダイズすることで、これらの存在を検出できる。
ポリヌクレオチド同士のハイブリダイズは、完全に相補的な配列同士でなくとも生じることが知られている。そのため、前記（Ｉ）又は（ＩＩ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする限りにおいて、ポリヌクレオチドは変異を有するものであってよい。実施形態の検出試薬が含んでもよいポリヌクレオチドとしては、例えば、前記（ＩＩＩ）～（ＶＩ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
【0027】
上記において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【0028】
前記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の配列において、１又は複数個とは、例えば、１～３０個であってもよく、１～２０個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。
【0029】
前記（Ｖ）及び（ＶＩ）の配列において、塩基配列の配列同一性は９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。塩基配列の配列同一性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース上で提供されるＢＬＡＳＴ検索により求めることができる。
【0030】
実施形態の検出試薬が有するポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブとして使用することができる。実施形態の検出試薬が有するポリヌクレオチドの長さは、プライマー又はプローブとして使用可能な長さであればよく、用途により適切な長さを適宜選択できる。検出試薬がプローブである場合、プローブの長さは、例えば、１０～５００塩基であってよく、２０～２００塩基であってよく、５０～１００塩基であってよい。検出試薬がプライマーである場合、プライマーの長さは、例えば、１０～４０塩基であってよく、１８～３５塩基であってよく、２０～２５塩基であってよい。当該ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【0031】
実施形態の検出試薬がプライマーである場合、実施形態の検出試薬は、前記（Ｉ）、（ＩＩＩ）、及び（Ｖ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドと、前記（ＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＶＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。
【0032】
実施形態の検出試薬が有するポリヌクレオチドは、ＤＮＡが好ましく、ＤＮＡと同様の機能を有するものであれば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
【0033】
＜プライマーセット＞
【0034】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（１）及び（２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（３）及び（４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（１）配列番号５３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１）配列番号５３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0035】
配列番号５３及び５４で表される塩基配列は、配列番号１、３、１７、１９、２１及び２３で表される塩基配列に共通して存在する部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（１）～（４）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含む、６種類のシアン酸分解酵素の遺伝子を同時に増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該全てのシアン酸分解酵素の遺伝子を同時に検出可能である。
【0036】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（１）及び／又は（２）のポリヌクレオチドと、（３）及び／又は（４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
当該ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
（１）及び／又は（２）のポリヌクレオチドと、（３）及び／又は（４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
当該ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【0037】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（５）～（１４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（１５）～（２４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（５）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号１１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１３）配列番号１３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１４）配列番号１３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１５）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１６）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１７）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１８）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１９）配列番号１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２０）配列番号１０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２１）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２２）配列番号１２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２３）配列番号１４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２４）配列番号１４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６）配列番号５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（８）配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（９）配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１１）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）配列番号１１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１３）配列番号１３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１４）配列番号１３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１５）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１６）配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１７）配列番号８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１８）配列番号８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１９）配列番号１０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２０）配列番号１０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２１）配列番号１２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２２）配列番号１２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２３）配列番号１４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２４）配列番号１４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0038】
配列番号５～１４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（５）～（２４）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号１で表されるシアン酸分解酵素の遺伝子を増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該シアン酸分解酵素の遺伝子を検出可能である。
【0039】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（５）及び／又は（６）のポリヌクレオチドと、（１５）及び／又は（１６）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（７）及び／又は（８）のポリヌクレオチドと、（１７）及び／又は（１８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（９）及び／又は（１０）のポリヌクレオチドと、（１９）及び／又は（２０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（１１）及び／又は（１２）のポリヌクレオチドと、（２１）及び／又は（２２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（１３）及び／又は（１４）のポリヌクレオチドと、（２３）及び／又は（２４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
（５）及び／又は（６）のポリヌクレオチドと、（１５）及び／又は（１６）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（７）及び／又は（８）のポリヌクレオチドと、（１７）及び／又は（１８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（９）及び／又は（１０）のポリヌクレオチドと、（１９）及び／又は（２０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（１１）及び／又は（１２）のポリヌクレオチドと、（２１）及び／又は（２２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（１３）及び／又は（１４）のポリヌクレオチドと、（２３）及び／又は（２４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
【0040】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（２５）及び（２６）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（２７）及び（２８）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（２５）配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２６）配列番号１５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２７）配列番号１６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２８）配列番号１６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２５）配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２６）配列番号１５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２７）配列番号１６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２８）配列番号１６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0041】
配列番号１５及び１６で表される塩基配列は、配列番号４で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（２５）～（２８）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号３で表されるシアン酸分解酵素の遺伝子を増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該シアン酸分解酵素の遺伝子を検出可能である。
【0042】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（２５）及び／又は（２６）のポリヌクレオチドと、（２７）及び／又は（２８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
（２５）及び／又は（２６）のポリヌクレオチドと、（２７）及び／又は（２８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【0043】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（２９）～（３４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（３５）～（４０）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（２９）配列番号２５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３０）配列番号２５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３１）配列番号２７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３２）配列番号２７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３３）配列番号２９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３４）配列番号２９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３５）配列番号２６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３６）配列番号２６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３７）配列番号２８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３８）配列番号２８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３９）配列番号３０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４０）配列番号３０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２９）配列番号２５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３０）配列番号２５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３１）配列番号２７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３２）配列番号２７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３３）配列番号２９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３４）配列番号２９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３５）配列番号２６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３６）配列番号２６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３７）配列番号２８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３８）配列番号２８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３９）配列番号３０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４０）配列番号３０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0044】
配列番号１５～３０で表される塩基配列は、配列番号１８で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（２９）～（４０）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号１７で表されるシアン酸分解酵素の遺伝子を増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該シアン酸分解酵素の遺伝子を検出可能である。
【0045】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（２９）及び／又は（３０）のポリヌクレオチドと、（３５）及び／又は（３６）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（３１）及び／又は（３２）のポリヌクレオチドと、（３７）及び／又は（３８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（３３）及び／又は（３４）のポリヌクレオチドと、（３９）及び／又は（４０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
（２９）及び／又は（３０）のポリヌクレオチドと、（３５）及び／又は（３６）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（３１）及び／又は（３２）のポリヌクレオチドと、（３７）及び／又は（３８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（３３）及び／又は（３４）のポリヌクレオチドと、（３９）及び／又は（４０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
【0046】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（４１）～（４６）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（４７）～（５２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（４１）配列番号３１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４２）配列番号３１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４３）配列番号３３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４４）配列番号３３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４５）配列番号３５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４６）配列番号３５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４７）配列番号３２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４８）配列番号３２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４９）配列番号３４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５０）配列番号３４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５１）配列番号３６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５２）配列番号３６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４１）配列番号３１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４２）配列番号３１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４３）配列番号３３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４４）配列番号３３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４５）配列番号３５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４６）配列番号３５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４７）配列番号３２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４８）配列番号３２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４９）配列番号３４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５０）配列番号３４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５１）配列番号３６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５２）配列番号３６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0047】
配列番号３１～３６で表される塩基配列は、配列番号２０で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（４１）～（５２）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号１９で表されるシアン酸分解酵素の遺伝子を増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該シアン酸分解酵素の遺伝子を検出可能である。
【0048】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（４１）及び／又は（４２）のポリヌクレオチドと、（４７）及び／又は（４８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（４３）及び／又は（４４）のポリヌクレオチドと、（４９）及び／又は（５０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（４５）及び／又は（４６）のポリヌクレオチドと、（５１）及び／又は（５２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
（４１）及び／又は（４２）のポリヌクレオチドと、（４７）及び／又は（４８）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（４３）及び／又は（４４）のポリヌクレオチドと、（４９）及び／又は（５０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（４５）及び／又は（４６）のポリヌクレオチドと、（５１）及び／又は（５２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【0049】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（５３）～（５８）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（５９）～（６４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（５３）配列番号３７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５４）配列番号３７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５５）配列番号３９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５６）配列番号３９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５７）配列番号４１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５８）配列番号４１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５９）配列番号３８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６０）配列番号３８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６１）配列番号４０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６２）配列番号４０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６３）配列番号４２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６４）配列番号４２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５３）配列番号３７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５４）配列番号３７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５５）配列番号３９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５６）配列番号３９で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５７）配列番号４１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５８）配列番号４１で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（５９）配列番号３８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６０）配列番号３８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６１）配列番号４０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６２）配列番号４０で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６３）配列番号４２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６４）配列番号４２で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0050】
配列番号３７～４２で表される塩基配列は、配列番号２２で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（５３）～（６４）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号２１で表されるシアン酸分解酵素の遺伝子を増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該シアン酸分解酵素の遺伝子を検出可能である。
【0051】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（５３）及び／又は（５４）のポリヌクレオチドと、（５９）及び／又は（６０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（５５）及び／又は（５６）のポリヌクレオチドと、（６１）及び／又は（６２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（５７）及び／又は（５８）のポリヌクレオチドと、（６３）及び／又は（６４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
（５３）及び／又は（５４）のポリヌクレオチドと、（５９）及び／又は（６０）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（５５）及び／又は（５６）のポリヌクレオチドと、（６１）及び／又は（６２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（５７）及び／又は（５８）のポリヌクレオチドと、（６３）及び／又は（６４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【0052】
実施形態の検出試薬は、前記シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出可能なプライマー機能を有する組み合わせで、以下の（６５）～（７０）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び以下の（７１）～（７６）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを備えてもよい。
（６５）配列番号４３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６６）配列番号４３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６７）配列番号４５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６８）配列番号４５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６９）配列番号４７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７０）配列番号４７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７１）配列番号４４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７２）配列番号４４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７３）配列番号４６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７４）配列番号４６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７５）配列番号４８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７６）配列番号４８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６５）配列番号４３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６６）配列番号４３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６７）配列番号４５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６８）配列番号４５で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（６９）配列番号４７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７０）配列番号４７で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７１）配列番号４４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７２）配列番号４４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７３）配列番号４６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７４）配列番号４６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７５）配列番号４８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７６）配列番号４８で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0053】
配列番号４３～４８で表される塩基配列は、配列番号２４で表される塩基配列の部分配列、又は当該部分配列と相補的な配列である。これら（６５）～（７６）のポリヌクレオチドの組み合わせによれば、例えば、配列番号２３で表されるシアン酸分解酵素の遺伝子を増幅可能であり、増幅産物を検出することで、当該シアン酸分解酵素の遺伝子を検出可能である。
【0054】
検出試薬が備えるポリヌクレオチドの、好ましい組み合わせとしては、
（６５）及び／又は（６６）のポリヌクレオチドと、（７１）及び／又は（７２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（６７）及び／又は（６８）のポリヌクレオチドと、（７３）及び／又は（７４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（６９）及び／又は（７０）のポリヌクレオチドと、（７５）及び／又は（７６）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
（６５）及び／又は（６６）のポリヌクレオチドと、（７１）及び／又は（７２）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（６７）及び／又は（６８）のポリヌクレオチドと、（７３）及び／又は（７４）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、
（６９）及び／又は（７０）のポリヌクレオチドと、（７５）及び／又は（７６）のポリヌクレオチドとの組み合わせ、を例示できる。
検出試薬が備えるポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づき、化学的合成又は公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【0055】
前記（２）、（４）、（６）、（８）、（１０）、（１２）、（１４）、（１６）、（１８）、（２０）、（２２）、（２４）、（２６）、（２８）、（３０）、（３２）、（３４）、（３６）、（３８）、（４０）、（４２）、（４４）、（４６）、（４８）、（５０）、（５２）、（５４）、（５６）、（５８）、（６０）、（６２）、（６４）、（６６）、（６８）、（７０）、（７２）、（７４）及び（７６）のポリヌクレオチドにおいて、１又は複数個とは、例えば、１～５個であってもよく、１～４個であってもよく、１～３個であってもよく、１～２個であってもよい。また、これらポリヌクレオチドの３’末端から２塩基には塩基の欠失、置換及び付加が存在しないことが好ましい。
【0056】
当該実施形態に係る検出試薬によれば、シアン酸分解酵素の遺伝子若しくは該遺伝子産物を精度よく検出することができる。
【0057】
≪検出方法≫
実施形態の検出方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する方法である。
実施形態の検出方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を検出する方法である。
【0058】
実施形態の検出試薬が有するポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブとして使用することができる。プライマー又はプローブを用いたシアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の検出方法は、特に制限されず、各種方法に適用可能である。例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、マイクロアレイ、シーケンス解析等の各種方法が挙げられる。
【0059】
実施形態の検出方法は、上記実施形態のプライマーセットを用いて、分析対象物からシアン酸分解酵素の遺伝子の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により増幅された増幅産物を検出する工程と、を有する。
【0060】
増幅反応としては、ＰＣＲ法が挙げられる。増幅産物の検出は、例えば、アガロースゲル電気泳動等により、遺伝子断片の増幅産物を観察することにより行ってもよい。また、ＳＹＢＲグリーン等のインターカレーター色素の存在下で遺伝子増幅反応を行い、インターカレーター色素の蛍光を検出することにより行ってもよい。
【0061】
当該実施形態に係る検出方法により、前記増幅産物が検出された場合には、前記分析対象物にシアン酸分解酵素の遺伝子が存在すると判定できる。また、前記分析対象物にシアン酸分解酵素の遺伝子が存在するとの判定により、前記分析対象物にシアン酸分解酵素の遺伝子を有する微生物が存在すると判断することも可能となる。
【0062】
また、当該実施形態に係る検出方法のうち下記（１）及び（２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び下記（３）及び（４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを用いることにより、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含む、６種類のシアン酸分解酵素の遺伝子を同時に検出できる。また、前記分析対象物におけるシアン酸分解酵素の遺伝子が存在することの判定により、前記分析対象物に存在する配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含むシアン酸分解酵素の遺伝子を有する微生物が存在すると一度に判断することも可能となる。
【0063】
（１）配列番号５３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0064】
≪定量方法≫
実施形態の定量方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を定量する方法である。
実施形態の定量方法は、上記実施形態の検出試薬を用いて、シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物を定量する方法である。
【0065】
実施形態の定量方法は、上記実施形態のプライマーセットを用いて、分析対象物からシアン酸分解酵素の遺伝子の増幅反応を行う工程と、前記増幅反応により増幅された増幅産物を検出する工程と、検出された前記増幅産物の量から、分析対象物に含まれる前記遺伝子の量を定量する工程と、を有する。
遺伝子の量の定量は、例えば、増幅産物に対応する遺伝子のコピー数と、蛍光強度の相関関係を利用した検量線を予め用意することにより、蛍光強度から遺伝子のコピー数を定量できる。
遺伝子の量の定量は、例えば、増幅産物に対応する遺伝子のコピー数と、蛍光強度の相関関係を利用した検量線を予め用意することにより、蛍光強度から遺伝子のコピー数を定量できる。
【0066】
当該実施形態に係る定量方法によれば、前記増幅産物を定量することで、前記分析対象物に含まれるシアン酸分解酵素の遺伝子のコピー数を定量できる。また、前記分析対象物におけるシアン酸分解酵素の遺伝子のコピー数から、前記分析対象物に存在するシアン酸分解酵素の遺伝子を有する微生物の数を推定することも可能となる。
【0067】
また、当該実施形態に係る定量方法のうち上記（１）及び（２）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチド、及び上記（３）及び（４）からなる群から選ばれる少なくとも一種のポリヌクレオチドを有するプライマーセットを用いることにより、配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含む、６種類のシアン酸分解酵素の遺伝子を同時に定量できる。また、前記分析対象物におけるシアン酸分解酵素の遺伝子のコピー数から、前記分析対象物に存在する配列番号１、３、１７、１９、２１又は２３で表されるアミノ酸配列含むシアン酸分解酵素の遺伝子を有する微生物の数を一度に推定することも可能となる。
【0068】
（１）配列番号５３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）配列番号５３で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（３）配列番号５４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（４）配列番号５４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
【0069】
≪処理方法≫
＜第１実施形態＞
本実施形態の処理方法は、シアン酸と、上記実施形態のシアン酸分解酵素と、を含む混合相を形成させ、前記シアン酸分解酵素により前記シアン酸を分解させる処理工程を有する。上記実施形態のシアン酸分解酵素は、シアン酸分解酵素活性を有するので、シアン酸とシアン酸分解酵素が反応し、シアン酸が分解される。
シアン酸としては、シアン酸塩であってもよく、シアン酸イオンであってもよい。シアン酸塩としては、シアン酸アンモニウム等が挙げられる。
＜第１実施形態＞
本実施形態の処理方法は、シアン酸と、上記実施形態のシアン酸分解酵素と、を含む混合相を形成させ、前記シアン酸分解酵素により前記シアン酸を分解させる処理工程を有する。上記実施形態のシアン酸分解酵素は、シアン酸分解酵素活性を有するので、シアン酸とシアン酸分解酵素が反応し、シアン酸が分解される。
シアン酸としては、シアン酸塩であってもよく、シアン酸イオンであってもよい。シアン酸塩としては、シアン酸アンモニウム等が挙げられる。
【0070】
当該実施形態に係る処理方法によれば、本発明に係るシアン酸分解酵素を用いることで、シアン酸の分解が可能である。
【0071】
＜第２実施形態＞
（処理工程）
本実施形態の処理方法は、チオシアンを含有する被処理水と、シアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程を有する。
（処理工程）
本実施形態の処理方法は、チオシアンを含有する被処理水と、シアン酸分解酵素を有する微生物とを含む混合相を形成させ、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解する処理工程を有する。
【0072】
チオシアンを含有する被処理水としては、各種工場排水が挙げられ、コークス炉から排出された安水が好ましい。
【0073】
チオシアンを含有する被処理水と、シアン酸分解酵素を有する微生物とを混合させ、これらを含む混合相を形成させる。例えば、シアン酸分解酵素を有する微生物を含んだ活性汚泥が溜められた処理槽に、チオシアンを含有する被処理水を導入すると、前記混合相が形成される。
【0074】
被処理水に含まれるチオシアンとしては、チオシアン酸塩であってもよく、チオシアン酸イオンであってもよい。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が挙げられる。
【0075】
被処理水に含まれるチオシアンは、分解されてシアン酸となる。生成されたシアン酸は、シアン酸分解酵素を有する微生物により分解される。
【0076】
被処理水に含まれるチオシアンのシアン酸への分解は、混合相に含まれる微生物によりなされてもよい。シアン酸分解酵素を有する前記微生物が、チオシアンのシアン酸への分解と、シアン酸の分解の両方の分解能を有してもよい。すなわち、シアン酸分解酵素を有する前記微生物が、シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するチオシアン分解能を有する微生物であってよい。
【0077】
処理工程は、嫌気的条件下で行われてもよいが、好気的条件下で行われることが好ましい。
【0078】
（検出工程）
本実施形態の処理方法は、前記シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するシアン酸経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有する。
本実施形態の処理方法は、前記シアン酸を経由して前記チオシアンを分解するシアン酸経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有する。
【0079】
チオシアンの分解には、図１に示すとおり、シアン酸を経由してチオシアンを分解するシアン酸経路と、硫化カルボニルを経由してチオシアンを分解する硫化カルボニル経路がある。
【0080】
シアン酸経路は、図１に示すとおり、チオシアンが、シアン酸及びカルバミン酸を経由して二酸化炭素とアンモニアへと分解される経路である。シアン酸経路に係る遺伝子としては、当該経路に係る反応に関与する酵素の遺伝子が挙げられ、未知の酵素の遺伝子であってもよく、シアン酸分解酵素遺伝子が好ましい。
【0081】
実施形態の処理方法におけるシアン酸分解酵素は、シアン酸分解酵素活性を有する。シアン酸分解酵素は「EC 4.2.1.104」が付与されている。シアン酸分解酵素活性とは、シアン酸又はシアン酸イオンを分解する活性であり、図１に示す通り、シアン酸又はシアン酸イオンを、カルバミン酸又はカルバミン酸イオンへと分解する活性であってよい。
【0082】
実施形態の処理方法におけるシアン酸分解酵素としては、例えば上記≪シアン酸分解酵素≫で例示したものが挙げられる。シアン酸分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の検出には、上記実施形態の検出試薬を用いてもよく、例えば＜検出方法・定量方法＞で例示した方法により実施することができる。
なお、本実施形態の検出工程では、遺伝子産物として、タンパク質を検出してもよい。タンパク質の検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の種々の方法が採用できる。
なお、本実施形態の検出工程では、遺伝子産物として、タンパク質を検出してもよい。タンパク質の検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の種々の方法が採用できる。
【0083】
本実施形態の処理方法は、検出工程として、更に、硫化カルボニルを経由して前記チオシアンを分解する硫化カルボニル経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する第二検出工程を有してもよい。
【0084】
硫化カルボニル経路は、図１に示すとおり、チオシアンが、硫化カルボニルを経由して二酸化炭素と硫化水素へと分解される経路である。硫化カルボニル経路に係る遺伝子としては、当該経路に係る反応に関与する酵素の遺伝子が挙げられ、未知の酵素の遺伝子であってもよく、硫化カルボニル分解酵素遺伝子であってもよく、チオシアン分解酵素遺伝子であってもよい。
【0085】
実施形態の処理方法におけるチオシアン分解酵素は、チオシアン分解酵素活性を有する。チオシアン分解酵素は「EC 3.5.5.8」が付与されている。チオシアン分解酵素活性とは、チオシアン又はチオシアン酸イオンを分解する活性であり、図１に示す通り、チオシアン又はチオシアン酸イオンを、硫化カルボニルへと分解する活性であってよい。
【0086】
チオシアン分解酵素の候補タンパク質がチオシアン分解酵素活性を有することは、当該候補タンパク質の機能を解析することにより判断できる。例えば、本来はチオシアン分解能を有していない微生物に、チオシアン分解酵素の候補タンパク質の遺伝子を導入し、チオシアン分解酵素の候補タンパク質を発現させる。そして、当該微生物がチオシアン分解能を獲得した場合、当該候補タンパク質はチオシアン分解酵素であると判断できる。
【0087】
チオシアン分解酵素の遺伝子又は該遺伝子産物の検出は、シアン酸分解酵素の場合と同様の方法により行うことができる。例えば、実施例に記載の方法により行うことができる。
【0088】
遺伝子又は該遺伝子産物の検出対象は、前記混合相であってよく、前記混合相からサンプリングして得られたサンプルであってよい。サンプルからの核酸又はタンパク質の抽出方法は公知の方法により行うことができる。サンプリングは、処理工程の開始前や終了後に行ってもよいが、処理工程での処理状況を把握するとの観点から、処理工程の途中で行うことが好ましい。
検出工程は、処理工程と別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。検出工程は、処理工程において経時的に行ってもよい。
検出工程は、処理工程と別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。検出工程は、処理工程において経時的に行ってもよい。
【0089】
当該実施形態に係る処理方法によれば、シアン酸経路に係る遺伝子又は該遺伝子産物を検出する検出工程を有することで、処理水に含まれる微生物のシアン酸経路の存在や活性化状況を把握することが可能となる。また、処理水におけるシアン酸経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量を把握することが可能となる。
【0090】
従来、チオシアンを含む排水の処理において、硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物が分離されていたため、当該微生物に関する情報を得ることで、チオシアンの処理状況を把握や制御が試みられてきた。
【0091】
今回、発明者らは、チオシアンを含む排水の処理において、シアン酸経路によるチオシアンの分解が生じていることを見出した。さらにシアン酸経路が硫化カルボニル経路よりも、優勢となり得ることを見出した。
【0092】
当該実施形態に係る処理方法によれば、処理水に含まれる微生物のシアン酸経路の存在や活性化状況、シアン酸経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量をモニタリングすることができるので、シアン酸経路によるチオシアンの処理が向上するよう処理条件をコントロールでき、シアン酸経路によるチオシアンの処理効率を向上させることができる。
【0093】
硫化カルボニルは温室効果ガスのため、硫化カルボニルの発生を抑えつつチオシアンを分解することが望ましい。
当該実施形態に係る処理方法によれば、シアン酸経路に係るモニタリングに加え、処理水に含まれる微生物の硫化カルボニル経路の存在や活性化状況、硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量をモニタリングすることで、例えば、硫化カルボニル経路よりも、シアン酸経路によるチオシアンの処理が向上するよう処理条件をコントロールでき、硫化カルボニルの発生を制御しつつ、チオシアンの処理を行うことができる。
当該実施形態に係る処理方法によれば、シアン酸経路に係るモニタリングに加え、処理水に含まれる微生物の硫化カルボニル経路の存在や活性化状況、硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物の存在や量をモニタリングすることで、例えば、硫化カルボニル経路よりも、シアン酸経路によるチオシアンの処理が向上するよう処理条件をコントロールでき、硫化カルボニルの発生を制御しつつ、チオシアンの処理を行うことができる。
【実施例】
【0094】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0095】
〔実施例１〕
（１）生物学的排水処理プロセスの運転、水質分析、分解速度算出および微生物試料の採取
特開2016-112556号公報に記載の方法に沿って微生物サンプルを得て、工業用水と自然海水とを体積比２：３で混合して得られた溶媒中に、表１に示す溶質を表１に示す濃度で溶解し、人工排水（被処理水）を調製した。
（１）生物学的排水処理プロセスの運転、水質分析、分解速度算出および微生物試料の採取
特開2016-112556号公報に記載の方法に沿って微生物サンプルを得て、工業用水と自然海水とを体積比２：３で混合して得られた溶媒中に、表１に示す溶質を表１に示す濃度で溶解し、人工排水（被処理水）を調製した。
【0096】
【表1】
【0097】
また、図２に示すように、１つの槽内で生物処理領域２０ａと沈降領域２０ｂとが隔壁２３により互いに隔てられていると共にこの隔壁２３の下方で互いに連通する構造を有する一体型の生物処理装置２０（処理槽）を用意し、生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内に１０ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍの大きさのスポンジ担体２１〔流動担体（関東イノアック製ＡＱ－１）〕を体積比で２０％（ｖ／ｖ）となるように投入した。
【0098】
このようにして準備された生物処理装置２０内にそれぞれ上記の被処理水２４を流入させると共に微生物植種源として活性汚泥を投入し、スポンジ担体２１に微生物を定着させる微生物馴致処理（第１段処理）時には、被処理水２４の水理学的滞留時間が２４時間となるように流入させた。また、各生物処理装置２０内の被処理水２４に空気曝気２２を行って好気性流動床を形成させ、微生物の馴致を行った。
【0099】
この生物学的処理の運転開始後、すぐにチオシアン酸イオンの除去が認められたが、徐々にｐＨの低下傾向が認められ、また、チオシアン酸イオンの除去が不安定であったので、運転開始後６９日目から５質量％－水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５付近に調整しながら処理を継続し、チオシアン酸イオンの除去率が９８％以上で安定した段階で微生物馴致処理（第１段処理）を終了した。この微生物馴致処理（第１段処理）の終了時には亜硝酸イオンが増加していた。
【0100】
この微生物馴致処理（第１段処理）の終了後、各生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の処理水についてチオシアン酸イオン濃度と亜硝酸イオン濃度とを測定してチオシアン酸イオン及び亜硝酸イオンのモニタリングを行なった。
また、各生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の処理水のｐＨを測定してｐＨ値のモニタリング行いながら、運転開始後９０日目より領域内の水理学的滞留時間が１８時間となるように被処理水２４の流入量を増やし（第２段処理）、また、運転開始後１１１日目より領域内の水理学的滞留時間が１２時間となるように被処理水２４の流入量を更に増やし（第３段処理）、更に、運転開始後１１８日目より領域内の水理学的滞留時間が８時間となるように被処理水２４の流入量を更に増やし（第４段処理）、最終的に１７５日目まで運転を継続した。
また、各生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の処理水のｐＨを測定してｐＨ値のモニタリング行いながら、運転開始後９０日目より領域内の水理学的滞留時間が１８時間となるように被処理水２４の流入量を増やし（第２段処理）、また、運転開始後１１１日目より領域内の水理学的滞留時間が１２時間となるように被処理水２４の流入量を更に増やし（第３段処理）、更に、運転開始後１１８日目より領域内の水理学的滞留時間が８時間となるように被処理水２４の流入量を更に増やし（第４段処理）、最終的に１７５日目まで運転を継続した。
【0101】
この間、第２段処理において領域内の水理学的滞留時間を１８時間に短縮したことにより、チオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持しつつ、亜硝酸イオンの生成の減少傾向が観察され始め、また、第３段処理において領域内の水理学的滞留時間を１２時間に短縮したことにより、チオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持しつつ、亜硝酸イオンの生成をほぼ完全に抑制することができ、更に、第４段処理において領域内の水理学的滞留時間を８時間に短縮した場合にも、亜硝酸イオンの生成を抑制しつつチオシアン酸イオンの除去率を高い値に維持できることを確認した。
【0102】
この実施例１での生物学的処理において、運転日数に対する一日当たりの亜硝酸生成速度およびチオシアン除去速度を式（１）および式（２）に従い算出した。
【0103】
【数1】
【0104】
【数2】
【0105】
運転日数に対する一日当たりの亜硝酸生成速度を図３、チオシアン除去速度を図４に示す。
また、微生物叢解析のため、生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の微生物が付着したスポンジ担体２１を水質分析と同日または±１日程度採取し、－２０℃で冷凍保存した。
また、微生物叢解析のため、生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の微生物が付着したスポンジ担体２１を水質分析と同日または±１日程度採取し、－２０℃で冷凍保存した。
【0106】
（２）ＤＮＡ抽出
生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の微生物が付着したスポンジ担体２１からのＤＮＡ抽出を実施した。
スポンジ担体はチオシアン除去が良好な１２７日目に採取した。スポンジ担体を中央で切断したところ、周辺部が褐色、中心部が黒色であった。この相違がスポンジ内外の環境状態（溶存酸素量）および微生物相の違いを反映している可能性があるため、色の相違に沿ってスポンジ試料を切断・分収した。
スポンジ内部、外部それぞれの切断片を、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン）および細胞破砕装置Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ ２４ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰバイオメディカルズ）を用いてＤＮＡを抽出および精製をおこなった。
生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の微生物が付着したスポンジ担体２１からのＤＮＡ抽出を実施した。
スポンジ担体はチオシアン除去が良好な１２７日目に採取した。スポンジ担体を中央で切断したところ、周辺部が褐色、中心部が黒色であった。この相違がスポンジ内外の環境状態（溶存酸素量）および微生物相の違いを反映している可能性があるため、色の相違に沿ってスポンジ試料を切断・分収した。
スポンジ内部、外部それぞれの切断片を、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン）および細胞破砕装置Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ ２４ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰバイオメディカルズ）を用いてＤＮＡを抽出および精製をおこなった。
【0107】
（３）次世代シーケンサーによる塩基配列決定
抽出したＤＮＡを次世代シーケンサー（Hiseq 2000）を用いて解析することで、塩基配列を決定した。この塩基配列決定は委託（タカラバイオ）により実施した。この結果、スポンジ内側および外側の試料から表２の通りシーケンスデータが得られた。
抽出したＤＮＡを次世代シーケンサー（Hiseq 2000）を用いて解析することで、塩基配列を決定した。この塩基配列決定は委託（タカラバイオ）により実施した。この結果、スポンジ内側および外側の試料から表２の通りシーケンスデータが得られた。
【0108】
【表2】
【0109】
（４）配列アセンブリング
アセンブラーにＭｅｔａ－Ｖｅｌｖｅｔを用いアセンブルを行った。解析は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。
アセンブラーにＭｅｔａ－Ｖｅｌｖｅｔを用いアセンブルを行った。解析は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。
【0110】
（５）チオシアン分解に係る遺伝子候補配列が存在するＣｏｎｔｉｇの選択および機能解析
アセンブリで得たコンティグについて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索を行い、チオシアン分解に係る遺伝子を探索した。この結果、ほとんどのアセンブル条件でチオシアン分解に係るｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ遺伝子と相同性が高い塩基配列が確認できた。
ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅは図１の通り、シアン酸経路のチオシアン分解に関わる。硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物の遺伝子の検出方法は報告されているが、シアン酸経路でチオシアンを分解する微生物の検出方法はまだ報告されていない。その中でスポンジの内側試料を対象にアセンブルを実施し得られたＣｏｎｔｉｇのうち、チオシアン分解に関与し得る遺伝子候補を含有し、且つコンティグ長が最も長いＣｏｎｔｉｇに含まれる配列データを、シアン酸経路でチオシアン分解に係る遺伝子の候補遺伝子１とし、以後の解析に用いた。
配列番号２で表される塩基配列は、候補遺伝子１のＤＮＡの塩基配列である。
アセンブリで得たコンティグについて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索を行い、チオシアン分解に係る遺伝子を探索した。この結果、ほとんどのアセンブル条件でチオシアン分解に係るｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ遺伝子と相同性が高い塩基配列が確認できた。
ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅは図１の通り、シアン酸経路のチオシアン分解に関わる。硫化カルボニル経路でチオシアンを分解する微生物の遺伝子の検出方法は報告されているが、シアン酸経路でチオシアンを分解する微生物の検出方法はまだ報告されていない。その中でスポンジの内側試料を対象にアセンブルを実施し得られたＣｏｎｔｉｇのうち、チオシアン分解に関与し得る遺伝子候補を含有し、且つコンティグ長が最も長いＣｏｎｔｉｇに含まれる配列データを、シアン酸経路でチオシアン分解に係る遺伝子の候補遺伝子１とし、以後の解析に用いた。
配列番号２で表される塩基配列は、候補遺伝子１のＤＮＡの塩基配列である。
【0111】
候補遺伝子１の機能を推定するため、アミノ酸配列のホモロジー検索および蛋白質ドメイン検索を実施した。
まず、候補遺伝子１のコーディング領域の配列をアミノ酸配列に変換した。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子１のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。
まず、候補遺伝子１のコーディング領域の配列をアミノ酸配列に変換した。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子１のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。
【0112】
このアミノ酸配列のホモロジー検索をＢｌａｓｔｐにより実施した。この結果、表３の通り、相同性が高い上位５配列は全てｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅであった。ただし、相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は１００％未満であり、また、相同性が高い上位１０配列データを含め系統樹を作成した結果、図５に示すように、今回、好気性流動床より得られた配列（好気性流動床）は他の配列から分岐しており、新規且つ特異な配列だと判断できた。
【0113】
【表3】
【0114】
加えて、Ｐｆａｍを用いてタンパク質のモチーフ検索を実施した。各種の蛋白質のアミノ酸配列中には、機能的あるいは構造的にひとまとまりの領域が存在し、モチーフと呼ばれる。このモチーフを探索することによって、相同性検索より精度良く酵素の探索を行うことができる場合がある。モチーフ検索の結果、以下の通りｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅを含むｃｙａｎａｔｅ ｌｙａｓｅのドメインが検索された。
・Ｐｆａｍ（タンパク質ドメイン検索）検索
Ｆａｍｉｌｙ： ｃｙａｎａｔｅ＿ｌｙａｓｅ （ＰＦ０２５６０）
・Ｐｆａｍ（タンパク質ドメイン検索）検索
Ｆａｍｉｌｙ： ｃｙａｎａｔｅ＿ｌｙａｓｅ （ＰＦ０２５６０）
【0115】
このように、Ｂｌａｓｔｐ検索によりアミノ酸配列との相同性が確認され、且つドメイン検索によりシアン酸分解に関わるドメインが確認されたため、当該候補遺伝子１がシアン酸分解に係る遺伝子であると判断した。また、用意した人工排水（被処理水）の初期状態では、シアン酸は配合されていないため、当該候補遺伝子１は、シアン酸経由でチオシアン分解に係わっている遺伝子であると判断した。
この、シアン酸経由でチオシアン分解に係る、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、以下、「シアン酸分解酵素１」という。
この、シアン酸経由でチオシアン分解に係る、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、以下、「シアン酸分解酵素１」という。
【0116】
（６）シアン酸経由でチオシアン分解に係るシアン酸分解酵素１の遺伝子を定量するためのプライマーの設計
シアン酸分解酵素１の遺伝子配列に対して、プライマーを設計した。設計したプライマー配列をＢＬＡＳＴ検索することで目的遺伝子のみを定量対象にしているか確認した。
この結果、表４に示す５組のプライマーセットが設計できた。
シアン酸分解酵素１の遺伝子配列に対して、プライマーを設計した。設計したプライマー配列をＢＬＡＳＴ検索することで目的遺伝子のみを定量対象にしているか確認した。
この結果、表４に示す５組のプライマーセットが設計できた。
【0117】
【表4】
【0118】
（７）シアン酸経由でチオシアン分解に係わる遺伝子の定量
シアン酸経由でチオシアンを分解する微生物は、本実施例で同定したシアン酸分解酵素１の遺伝子を保有していると考えられる。また当該遺伝子を定量することで、シアン酸経由でチオシアンを分解する微生物数を定量することができると考えられる。
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素１の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記５組のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図６～１０に示すように、５組全てのプライマーセットで良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図６～１０において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
シアン酸経由でチオシアンを分解する微生物は、本実施例で同定したシアン酸分解酵素１の遺伝子を保有していると考えられる。また当該遺伝子を定量することで、シアン酸経由でチオシアンを分解する微生物数を定量することができると考えられる。
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素１の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記５組のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図６～１０に示すように、５組全てのプライマーセットで良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図６～１０において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
【0119】
（８）硫化カルボニル経由でチオシアン分解に係る遺伝子の定量
硫化カルボニル経由でチオシアンを分解する微生物は分離されており、唯一Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉｏｐａｒｕｓ ＴＨＩ １１５が報告されている。これまでに活性評価されているｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅとしてＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉｏｐａｒｕｓ ＴＨＩ １１５株由来の遺伝子のみ報告がある（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９８． １８０．２５８３－２５８９）。ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅはα、β、γの３つのサブユニットから成るが、このうち、表５に示す、比較的保存残基が多く存在するγサブユニットを標的遺伝子としたｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ 遺伝子（チオシアン分解酵素遺伝子）検出プライマーを設計した。
硫化カルボニル経由でチオシアンを分解する微生物は分離されており、唯一Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉｏｐａｒｕｓ ＴＨＩ １１５が報告されている。これまでに活性評価されているｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅとしてＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉｏｐａｒｕｓ ＴＨＩ １１５株由来の遺伝子のみ報告がある（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９８． １８０．２５８３－２５８９）。ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅはα、β、γの３つのサブユニットから成るが、このうち、表５に示す、比較的保存残基が多く存在するγサブユニットを標的遺伝子としたｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ 遺伝子（チオシアン分解酵素遺伝子）検出プライマーを設計した。
【0120】
【表5】
【0121】
硫化カルボニル経由でチオシアン分解に係るチオシアン分解酵素の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図１１に示す通り良好な検量線が得られた。なお、図１１において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
【0122】
（９）微生物総数の定量
真正細菌の遺伝子数を微生物総数として定量を実施した。定量方法は多くの方法が報告されているため、それら方法から適切なものを用いればよく、例えば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ， ２０１２ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １１３， １４８－１５３で記載されている方法を用いてもよい。
真正細菌の遺伝子数を微生物総数として定量を実施した。定量方法は多くの方法が報告されているため、それら方法から適切なものを用いればよく、例えば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ， ２０１２ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １１３， １４８－１５３で記載されている方法を用いてもよい。
【0123】
（１０）シアン酸経由でチオシアンを分解するチオシアン分解微生物の定量
１）好気性流動床のスポンジ担体付着微生物からのＤＮＡ抽出
生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の微生物が付着したスポンジ担体２１を４分割した後、Ｅｘｔｒａｐ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）を用いてＤＮＡの抽出および精製を行った。ＤＮＡの抽出は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。続いて、精製ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。
１）好気性流動床のスポンジ担体付着微生物からのＤＮＡ抽出
生物処理装置２０の生物処理領域２０ａ内の微生物が付着したスポンジ担体２１を４分割した後、Ｅｘｔｒａｐ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）を用いてＤＮＡの抽出および精製を行った。ＤＮＡの抽出は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。続いて、精製ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。
【0124】
２）コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥中の微生物からのＤＮＡ抽出
コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥を、Ｅｘｔｒａｐ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）を用いてＤＮＡを抽出および精製を行った。ＤＮＡの抽出は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。続いて、精製ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。
コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥を、Ｅｘｔｒａｐ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）を用いてＤＮＡを抽出および精製を行った。ＤＮＡの抽出は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。続いて、精製ＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。
【0125】
上述の１）および２）で抽出したＤＮＡ中の、シアン酸分解酵素１の遺伝子数の定量を実施した。比較のため、硫化カルボニル経由でチオシアン分解するチオシアン分解酵素の遺伝子数の定量も実施した。加えて、採取したスポンジ担体および活性汚泥中の微生物総数は異なるため、サンプル中から得られた全微生物の指標遺伝子数を別途定量し、シアン酸分解酵素１の遺伝子、及びチオシアン分解酵素の遺伝子数の定量値を、全微生物の指標遺伝子数の定量値で除すことで正規化した。なお、本実施例では、全微生物の指標遺伝子として、16S rRNA遺伝子を定量した。
図１２に示すように、運転が進むにつれ、好気性流動床のスポンジ担体付着微生物のシアン酸分解酵素遺伝子数が上昇した。このことから、硫化カルボニル経由のチオシアン分解微生物よりも、シアン酸経由のチオシアン分解微生物が優占したことが示唆された。このため、好気性流動床では、シアン酸経由のチオシアン分解微生物が、排水中のチオシアン除去の大半を担っていたことが分かった。
図１２に示すように、運転が進むにつれ、好気性流動床のスポンジ担体付着微生物のシアン酸分解酵素遺伝子数が上昇した。このことから、硫化カルボニル経由のチオシアン分解微生物よりも、シアン酸経由のチオシアン分解微生物が優占したことが示唆された。このため、好気性流動床では、シアン酸経由のチオシアン分解微生物が、排水中のチオシアン除去の大半を担っていたことが分かった。
【0126】
また、図１３に示すように、活性汚泥中のチオシアン分解微生物についても、すべての試料（Ａ～Ｇ）でシアン酸経由のチオシアン分解微生物が優占した。ここで、７試料中、汚泥Ｇでチオシアン除去の不良が確認された。汚泥Ａ～Ｇは同じ安水を処理しているが、汚泥Ｇ以外の活性汚泥プロセスのチオシアン除去率はほぼ１００％に対して、汚泥Ｇの活性汚泥プロセスは６０％程度しかチオシアンを除去していなかった。汚泥Ｇ中のシアン酸経由のチオシアン分解微生物数は、チオシアン除去が良好な汚泥Ａ～Ｅと比べて１０倍以上少ないものと推定された。すなわち、活性汚泥中に含まれるシアン酸分解酵素遺伝子数とチオシアン分解性能が関係していることが分かり、シアン酸経路に係る遺伝子を検出することで、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
【0127】
［実施例２］
（１）チオシアン分解に係わる遺伝子のＰＣＲクローニングと発現ベクターの構築
上記［実施例１］の工程（５）で得られたシアン酸分解酵素１の直接的な機能検証を実施するため、発現ベクターを構築した。
上記［実施例１］の工程（２）で得られたＤＮＡを、表６のプライマーセットでＰＣＲ増幅することで、シアン酸分解酵素１の遺伝子の上流・下流を含む領域も合わせて増幅した。
（１）チオシアン分解に係わる遺伝子のＰＣＲクローニングと発現ベクターの構築
上記［実施例１］の工程（５）で得られたシアン酸分解酵素１の直接的な機能検証を実施するため、発現ベクターを構築した。
上記［実施例１］の工程（２）で得られたＤＮＡを、表６のプライマーセットでＰＣＲ増幅することで、シアン酸分解酵素１の遺伝子の上流・下流を含む領域も合わせて増幅した。
【0128】
【表6】
【0129】
増幅されたＰＣＲ断片を発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに組み込んだ。得られた発現プラスミドをｐＥＴ２８ａＣＨ２と命名した。
【0130】
（１）シアン酸分解に係わる遺伝子機能検証
上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８ａＣＨ２およびｐＥＴ２８ａを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に導入し、形質転換体を得た。
ｐＥＴ２８ａＣＨ２およびｐＥＴ２８ａを導入した形質転換体をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁し、シアン酸濃度が２ｍＭとなるよう、シアン酸ナトリウム溶液を添加し、室温で反応させた。また、ブランクとして形質転換体を懸濁せず、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中にシアン酸ナトリウム溶液を添加した試料も同様に室温で反応させた。
シアン酸添加直後および反応１０分後のシアン酸をイオンクロマトグラフィーで測定した結果を表７に示す。表７に示すように、ｐＥＴ２８ａＣＨ２の形質転換体のみシアン酸濃度が減少しており、シアン酸を分解していた。なお、表７のｐＥＴ２８ａＣＨ２の培養時間０分のシアン酸濃度が他の試料に比べシアン酸濃度が低いのは、試料採取中の短時間でシアン酸が分解されたためである。この結果より、シアン酸分解酵素１がシアン酸分解に係っていることが実証された。
上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８ａＣＨ２およびｐＥＴ２８ａを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に導入し、形質転換体を得た。
ｐＥＴ２８ａＣＨ２およびｐＥＴ２８ａを導入した形質転換体をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁し、シアン酸濃度が２ｍＭとなるよう、シアン酸ナトリウム溶液を添加し、室温で反応させた。また、ブランクとして形質転換体を懸濁せず、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中にシアン酸ナトリウム溶液を添加した試料も同様に室温で反応させた。
シアン酸添加直後および反応１０分後のシアン酸をイオンクロマトグラフィーで測定した結果を表７に示す。表７に示すように、ｐＥＴ２８ａＣＨ２の形質転換体のみシアン酸濃度が減少しており、シアン酸を分解していた。なお、表７のｐＥＴ２８ａＣＨ２の培養時間０分のシアン酸濃度が他の試料に比べシアン酸濃度が低いのは、試料採取中の短時間でシアン酸が分解されたためである。この結果より、シアン酸分解酵素１がシアン酸分解に係っていることが実証された。
【0131】
【表7】
【0132】
〔実施例３〕
（１）生物学的排水処理プロセスの運転、水質分析、分解速度算出および微生物試料の採取
特開２０１４－２１７３１８号公報に記載の方法に沿って微生物サンプルを得て、脱イオン水と自然海水（千葉県富津市で採水：以下同様）とを体積比１：１．５で混合した混合液を調製した。この混合液１Ｌにつき、表８に示すように、チオシアン酸ナトリウム（チオシアン酸イオン源）、塩化アンモニウム（アンモニウムイオン源）、炭酸水素ナトリウム（炭酸イオン源）、及びリン酸水素二ナトリウム（リン酸イオン源）を溶解させて、チオシアン分解微生物を集積させるための水溶液（集積用水溶液）を作製した。
（１）生物学的排水処理プロセスの運転、水質分析、分解速度算出および微生物試料の採取
特開２０１４－２１７３１８号公報に記載の方法に沿って微生物サンプルを得て、脱イオン水と自然海水（千葉県富津市で採水：以下同様）とを体積比１：１．５で混合した混合液を調製した。この混合液１Ｌにつき、表８に示すように、チオシアン酸ナトリウム（チオシアン酸イオン源）、塩化アンモニウム（アンモニウムイオン源）、炭酸水素ナトリウム（炭酸イオン源）、及びリン酸水素二ナトリウム（リン酸イオン源）を溶解させて、チオシアン分解微生物を集積させるための水溶液（集積用水溶液）を作製した。
【0133】
【表8】
【0134】
図１４はチオシアン分解微生物馴養装置３０の構成の概略を示す模式図である。内径２ｍｍ長さ１００ｃｍの断面が円形のシリコーンチューブ３１を、ペリスタポンプ３２に連結し、その一端を前記作製した集積用水溶液３４の中に入れ、温度２０℃の室内で、集積用水溶液３４を流量１０ｍＬ／ｈでシリコーンチューブ３１の内側に通液した。チューブの出側には容器を設け、チューブから排出されるチューブ通過水３５を回収し、チューブ通過水３５のチオシアン濃度を経時的に分析した。結果を図１５に示す。
【0135】
（２）ＤＮＡ抽出
前記実施例３の工程（１）でチオシアンが除去されたことを確認した後、チューブを切り取り、チューブ内の微生物をボルテックスミキサーにより激しく混合することで、チューブ内の付着微生物を剥離した。
続いて、前記実施例１の工程（２）と同様の操作によりＤＮＡ抽出を実施した。
前記実施例３の工程（１）でチオシアンが除去されたことを確認した後、チューブを切り取り、チューブ内の微生物をボルテックスミキサーにより激しく混合することで、チューブ内の付着微生物を剥離した。
続いて、前記実施例１の工程（２）と同様の操作によりＤＮＡ抽出を実施した。
【0136】
（３）次世代シーケンサーによる塩基配列決定
前記実施例１の工程（３）と同様の操作により塩基配列を決定した。
前記実施例１の工程（３）と同様の操作により塩基配列を決定した。
【0137】
（４）配列アセンブリング
アセンブラーにVelvetを用いた以外は、前記実施例１の工程（４）と同様の操作により配列アセンブリングを実施した。
アセンブラーにVelvetを用いた以外は、前記実施例１の工程（４）と同様の操作により配列アセンブリングを実施した。
【0138】
（５）チオシアン分解に係る遺伝子候補配列が存在するＣｏｎｔｉｇの選択および機能解析
Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが配布しているゲノムのアノテーションツールである、Ａｒｔｅｍｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ａｒｔｅｍｉｓ／）を使用して、各コンティグ中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定した。
次に、全てのＯＲＦについてＢＬＡＳＴＰによる相同性解析を行った。その結果、ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅに相同なＯＲＦが一つヒットした。これをチオシアン分解に係る遺伝子の候補遺伝子２とし、以降の解析に用いた。
配列番号４で表される塩基配列は、候補遺伝子２のＤＮＡの塩基配列である。候補遺伝子２のコーディング領域の塩基配列をアミノ酸配列に変換した。配列番号３で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子２のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。
Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが配布しているゲノムのアノテーションツールである、Ａｒｔｅｍｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ａｒｔｅｍｉｓ／）を使用して、各コンティグ中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定した。
次に、全てのＯＲＦについてＢＬＡＳＴＰによる相同性解析を行った。その結果、ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅに相同なＯＲＦが一つヒットした。これをチオシアン分解に係る遺伝子の候補遺伝子２とし、以降の解析に用いた。
配列番号４で表される塩基配列は、候補遺伝子２のＤＮＡの塩基配列である。候補遺伝子２のコーディング領域の塩基配列をアミノ酸配列に変換した。配列番号３で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子２のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。
【0139】
このアミノ酸配列のホモロジー検索をＢｌａｓｔｐにより実施した。この結果、表９に示す通り、ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅとの高い相同性が確認されたが、相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は１００％未満であり、新規且つ特異な配列だと判断できた。
【0140】
【表9】
【0141】
加えて、Ｐｆａｍを用いてタンパク質のモチーフ検索を実施した。モチーフ検索の結果、以下の通りｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅを含むｃｙａｎａｔｅ ｌｙａｓｅのドメインが検索された。
・Ｐｆａｍ（タンパク質ドメイン検索）検索
ＰＦ０２５６０ （Ｃｙａｎａｔｅ ｌｙａｓｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ）： １
・Ｐｆａｍ（タンパク質ドメイン検索）検索
ＰＦ０２５６０ （Ｃｙａｎａｔｅ ｌｙａｓｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ）： １
【0142】
このように、Ｂｌａｓｔｐ検索によりアミノ酸配列との相同性が確認され、且つドメイン検索によりシアン酸分解に関わるドメインが確認されたため、当該候補遺伝子２がシアン酸分解に係っている遺伝子であると判断した。
この、シアン酸経由でチオシアン分解に係る、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、以下、「シアン酸分解酵素２」という。
この、シアン酸経由でチオシアン分解に係る、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、以下、「シアン酸分解酵素２」という。
【0143】
（６）シアン酸経由でチオシアン分解に係るシアン酸分解酵素２の遺伝子を定量するためのプライマーの設計
前記実施例１の工程（６）と同様の操作によりプライマーを設計した。
この結果、表１０に示す1組のプライマーセットが設計できた。
前記実施例１の工程（６）と同様の操作によりプライマーを設計した。
この結果、表１０に示す1組のプライマーセットが設計できた。
【0144】
【表10】
【0145】
（７）シアン酸経由でチオシアン分解に係る遺伝子の定量
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素２の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記１組のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒の反応を４５サイクル繰り返した。この結果、図１６に示したように、良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図１６において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素２の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記１組のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒の反応を４５サイクル繰り返した。この結果、図１６に示したように、良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図１６において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
【0146】
（８）硫化カルボニル経由でチオシアン分解に係る遺伝子の定量
前記実施例１の工程（８）と同様の操作により実施した。
前記実施例１の工程（８）と同様の操作により実施した。
【0147】
（９）微生物総数の定量
前記実施例１の工程（９）と同様の操作により実施した。
前記実施例１の工程（９）と同様の操作により実施した。
【0148】
（１０）シアン酸経由でチオシアンを分解するチオシアン分解微生物の定量
前記実施例１の工程（１０）と同様の操作により以下の試料からＤＮＡを抽出した。
１）好気性流動床のスポンジ担体付着微生物
２）コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥中微生物
前記実施例１の工程（１０）と同様の操作により以下の試料からＤＮＡを抽出した。
１）好気性流動床のスポンジ担体付着微生物
２）コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥中微生物
【0149】
上述の１）および２）で抽出したＤＮＡ中、シアン酸分解酵素２の遺伝子数の定量を実施した。また、比較のため、前記実施例１の工程（１０）と同じ工程にて、実施例１及び３で構築したプライマーセットにより、シアン酸分解酵素１の遺伝子、シアン酸分解酵素２の遺伝子、チオシアン分解酵素遺伝子、及び全微生物の指標遺伝子の定量を実施し、各分解酵素遺伝子の定量値を全微生物の指標遺伝子数の定量値で除すことで正規化した。
定量の結果、図１７に示すように、本実施例の定量系を構築したシアン酸経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数は、実施例１で定量系を構築したシアン酸経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数よりは少ないものの、硫化カルボニル経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数よりは多いものと推定された。また、図１８に示すように、汚泥Ｇ以外の活性汚泥プロセスのチオシアン除去率はほぼ１００％に対して、汚泥Ｇの活性汚泥プロセスは６０％程度しかチオシアンを除去していなかった。また、チオシアン除去が不良な汚泥Ｇ中の該当微生物数は他汚泥試料に比べて１０倍以上少ないものと推定された。すなわち、活性汚泥中に含まれるシアン酸分解酵素遺伝子数とチオシアン分解性能が関係していることが分かり、シアン酸経路に係る遺伝子を検出することで、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
定量の結果、図１７に示すように、本実施例の定量系を構築したシアン酸経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数は、実施例１で定量系を構築したシアン酸経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数よりは少ないものの、硫化カルボニル経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数よりは多いものと推定された。また、図１８に示すように、汚泥Ｇ以外の活性汚泥プロセスのチオシアン除去率はほぼ１００％に対して、汚泥Ｇの活性汚泥プロセスは６０％程度しかチオシアンを除去していなかった。また、チオシアン除去が不良な汚泥Ｇ中の該当微生物数は他汚泥試料に比べて１０倍以上少ないものと推定された。すなわち、活性汚泥中に含まれるシアン酸分解酵素遺伝子数とチオシアン分解性能が関係していることが分かり、シアン酸経路に係る遺伝子を検出することで、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
【0150】
〔実施例４〕
（１）微生物からのＤＮＡ抽出
前記実施例１の工程（１０）と同様の操作により以下試料からＤＮＡを抽出した。
１）好気性流動床のスポンジ担体付着微生物
２）コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥中微生物
（１）微生物からのＤＮＡ抽出
前記実施例１の工程（１０）と同様の操作により以下試料からＤＮＡを抽出した。
１）好気性流動床のスポンジ担体付着微生物
２）コークス炉から排出され、チオシアンを含有する安水を処理する活性汚泥中微生物
【0151】
（２）次世代シーケンサーによる塩基配列決定
上述の２）で抽出したＤＮＡを前記実施例１の工程（３）と同様の操作により塩基配列を決定した。
上述の２）で抽出したＤＮＡを前記実施例１の工程（３）と同様の操作により塩基配列を決定した。
【0152】
（３）配列アセンブリング
アセンブラーにＭｅｔａ－Ｖｅｌｖｅｔ又はＳＰＡｄｅｓを用いアセンブルを行った。解析は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。
アセンブラーにＭｅｔａ－Ｖｅｌｖｅｔ又はＳＰＡｄｅｓを用いアセンブルを行った。解析は委託（Ｊ－Ｂｉｏ２１センター）により実施した。
【0153】
（４）チオシアン分解に係る遺伝子候補配列が存在するＣｏｎｔｉｇの選択および機能解析
前記実施例１の工程（５）と同様の操作によりＢＬＡＳＴＰによる相同性解析を行った。その結果、ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅに相同なＣｏｎｔｉｇが４つ得られた。これらをチオシアン分解に係る遺伝子の候補遺伝子３～６とし、以降の解析に用いた。
配列番号１８で表される塩基配列は、候補遺伝子３のＤＮＡの塩基配列である。配列番号２０で表される塩基配列は、候補遺伝子４の塩基配列である。配列番号２２で表される塩基配列は、候補遺伝子５の塩基配列である。配列番号２４で表される塩基配列は、候補遺伝子６の塩基配列である。
前記実施例１の工程（５）と同様の操作によりＢＬＡＳＴＰによる相同性解析を行った。その結果、ｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅに相同なＣｏｎｔｉｇが４つ得られた。これらをチオシアン分解に係る遺伝子の候補遺伝子３～６とし、以降の解析に用いた。
配列番号１８で表される塩基配列は、候補遺伝子３のＤＮＡの塩基配列である。配列番号２０で表される塩基配列は、候補遺伝子４の塩基配列である。配列番号２２で表される塩基配列は、候補遺伝子５の塩基配列である。配列番号２４で表される塩基配列は、候補遺伝子６の塩基配列である。
【0154】
候補遺伝子３～６のコーディング領域の塩基配列をそれぞれアミノ酸配列に変換した。配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子３のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１９で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子４のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２１で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子５のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２３で表されるアミノ酸配列は、候補遺伝子６のコードするタンパク質のアミノ酸配列である。
【0155】
このアミノ酸配列のホモロジー検索をＢｌａｓｔｐにより実施した。この結果、表１１に示す通り、相同性が高い上位５配列は全てｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅであった。ただし、相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は１００％未満であり、新規且つ特異な配列だと判断できた。
【0156】
【表11】
【0157】
加えて、Ｐｆａｍを用いてタンパク質のモチーフ検索を実施した。モチーフ検索の結果、以下の通りｃｙａｎａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅを含むｃｙａｎａｔｅ ｌｙａｓｅのドメインが検索された。
・Ｐｆａｍ（タンパク質ドメイン検索）検索
Ｆａｍｉｌｙ： Ｃｙａｎａｔｅ＿ｌｙａｓｅ （ＰＦ０２５６０）
・Ｐｆａｍ（タンパク質ドメイン検索）検索
Ｆａｍｉｌｙ： Ｃｙａｎａｔｅ＿ｌｙａｓｅ （ＰＦ０２５６０）
【0158】
このように、Ｂｌａｓｔｐ検索によりアミノ酸配列との相同性が確認され、且つドメイン検索によりシアン酸分解に関わるドメインが確認されたため、当該候補遺伝子３～６がいずれもシアン酸分解に係っている遺伝子であると判断した。
この、シアン酸経由でチオシアン分解に係る、配列番号１７、１９、２１、２３のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、以下、それぞれ「シアン酸分解酵素３」、「シアン酸分解酵素４」、「シアン酸分解酵素５」、「シアン酸分解酵素６」という。
この、シアン酸経由でチオシアン分解に係る、配列番号１７、１９、２１、２３のそれぞれで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、以下、それぞれ「シアン酸分解酵素３」、「シアン酸分解酵素４」、「シアン酸分解酵素５」、「シアン酸分解酵素６」という。
【0159】
（５）シアン酸経由でチオシアン分解に係るシアン酸分解酵素３～６の遺伝子を定量するためのプライマーの設計
前記実施例１の工程（６）と同様の操作により、シアン酸分解酵素３～６の遺伝子配列に対して、プライマーを設計した。設計したプライマー配列をＢＬＡＳＴ検索することで目的遺伝子のみを定量対象にしているか確認した。
この結果、シアン酸分解酵素３～６の遺伝子のそれぞれについて表１２に示す３組のプライマーセットが設計できた。
前記実施例１の工程（６）と同様の操作により、シアン酸分解酵素３～６の遺伝子配列に対して、プライマーを設計した。設計したプライマー配列をＢＬＡＳＴ検索することで目的遺伝子のみを定量対象にしているか確認した。
この結果、シアン酸分解酵素３～６の遺伝子のそれぞれについて表１２に示す３組のプライマーセットが設計できた。
【0160】
【表12】
【0161】
（６）シアン酸経由でチオシアン分解に係る遺伝子の定量
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素３～６の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、各シアン酸分解酵素について、各３組（計１２組）のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図１９～図３０に示すように、１２組全てのプライマーセットで良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図１９～３０において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素３～６の遺伝子の定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、各シアン酸分解酵素について、各３組（計１２組）のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図１９～図３０に示すように、１２組全てのプライマーセットで良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図１９～３０において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
【0162】
（７）硫化カルボニル経由でチオシアン分解に係る遺伝子の定量
前記実施例１の工程（８）と同様の操作により実施した。
前記実施例１の工程（８）と同様の操作により実施した。
【0163】
（８）微生物総数の定量
前記実施例１の工程（９）と同様の操作により実施した。
前記実施例１の工程（９）と同様の操作により実施した。
【0164】
（９）シアン酸経由でチオシアンを分解するチオシアン分解微生物の定量
上記の工程（１）の１）および２）で抽出したＤＮＡ中、シアン酸分解酵素３～６の遺伝子数の定量を実施した。また、比較のため、前記実施例１の工程（１０）と同じ工程にて、実施例１及び３で構築したプライマーセットにより、シアン酸分解酵素１の遺伝子、シアン酸分解酵素２の遺伝子、チオシアン分解酵素遺伝子、及び全微生物の指標遺伝子の定量を実施し、各分解酵素遺伝子の定量値を全微生物の指標遺伝子数の定量値で除すことで正規化した。
定量の結果、図３１に示すように、ほとんどの試料で、シアン酸経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物の方が、硫化カルボニル経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数よりは多いものと推定された。また、図３２に示すように、一部の試料では今回同定したシアン酸分解酵素４が最も多く、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
上記の工程（１）の１）および２）で抽出したＤＮＡ中、シアン酸分解酵素３～６の遺伝子数の定量を実施した。また、比較のため、前記実施例１の工程（１０）と同じ工程にて、実施例１及び３で構築したプライマーセットにより、シアン酸分解酵素１の遺伝子、シアン酸分解酵素２の遺伝子、チオシアン分解酵素遺伝子、及び全微生物の指標遺伝子の定量を実施し、各分解酵素遺伝子の定量値を全微生物の指標遺伝子数の定量値で除すことで正規化した。
定量の結果、図３１に示すように、ほとんどの試料で、シアン酸経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物の方が、硫化カルボニル経由でチオシアン分解するチオシアン分解微生物数よりは多いものと推定された。また、図３２に示すように、一部の試料では今回同定したシアン酸分解酵素４が最も多く、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
【0165】
〔実施例５〕
（１）チオシアン分解に係わる遺伝子のＰＣＲクローニングと発現ベクターの構築
上記実施例４の工程（４）で得られたシアン酸分解酵素３および４の直接的な機能検証を実施するため、発現ベクターを構築した。
上記実施例４の工程（１）で得られたＤＮＡを、表１３に示すプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅することで、シアン酸分解酵素３の遺伝子及びシアン酸分解酵素４の遺伝子の上流・下流を含む領域も合わせて増幅した。
（１）チオシアン分解に係わる遺伝子のＰＣＲクローニングと発現ベクターの構築
上記実施例４の工程（４）で得られたシアン酸分解酵素３および４の直接的な機能検証を実施するため、発現ベクターを構築した。
上記実施例４の工程（１）で得られたＤＮＡを、表１３に示すプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅することで、シアン酸分解酵素３の遺伝子及びシアン酸分解酵素４の遺伝子の上流・下流を含む領域も合わせて増幅した。
【0166】
【表13】
【0167】
増幅されたＰＣＲ断片をそれぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに組み込んだ。得られた発現プラスミドをｐＥＴ２８ａ３、ｐＥＴ２８ａ４と命名した。
【0168】
（２）シアン酸分解に係わる遺伝子機能検証
上記の工程（１）で得られたプラスミドをｐＥＴ２８ａ３及びｐＥＴ２８ａ４を用いて前記実施例１の工程（５）と同様の操作によりシアン酸分解活性を検証した。その結果を表１４に示す。表１４に示すように、シアン酸添加直後にシアン酸が分解されていた。この結果より、シアン酸分解酵素３およびシアン酸分解酵素４がシアン酸分解に係っていることが実証された。
上記の工程（１）で得られたプラスミドをｐＥＴ２８ａ３及びｐＥＴ２８ａ４を用いて前記実施例１の工程（５）と同様の操作によりシアン酸分解活性を検証した。その結果を表１４に示す。表１４に示すように、シアン酸添加直後にシアン酸が分解されていた。この結果より、シアン酸分解酵素３およびシアン酸分解酵素４がシアン酸分解に係っていることが実証された。
【0169】
【表14】
【0170】
〔実施例６〕
（１）シアン酸経由でチオシアン分解に係るシアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子の包括定量するためのプライマーの設計
シアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子配列の共通配列を対象にプライマーを設計した。プライマー設計にはＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓを用いた。設計したプライマー配列をＢＬＡＳＴ検索することで目的遺伝子のみを定量対象にしているか確認した。
この結果、表１５に示す１組のプライマーセットが設計できた。
（１）シアン酸経由でチオシアン分解に係るシアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子の包括定量するためのプライマーの設計
シアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子配列の共通配列を対象にプライマーを設計した。プライマー設計にはＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓを用いた。設計したプライマー配列をＢＬＡＳＴ検索することで目的遺伝子のみを定量対象にしているか確認した。
この結果、表１５に示す１組のプライマーセットが設計できた。
【0171】
【表15】
【0172】
（２）シアン酸経由でチオシアン分解に係る遺伝子の包括定量
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子の包括定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記１組のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図３３に示したように、設計したプライマーセットで良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図３３において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
シアン酸経由でチオシアン分解に係る前記シアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子の包括定量にあたり、リアルタイムＰＣＲを用いて、上記１組のプライマーセットを用いた検量線を作成した。リアルタイムＰＣＲ法反応試薬はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を、リアルタイムＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ＭＲＱ（タカラバイオ）を用いた。ＰＣＲ反応条件は９５℃３０秒のホットスタート反応の後、９５℃５秒、６０℃３０秒の反応を４０サイクル繰り返した。この結果、図３３に示したように、設計したプライマーセットで良好な検量線を得ることができ、定量方法を確立できた。なお、図３３において、ｘとｙの関係式が検量線の式を表す。式中のｙは遺伝子コピー数、ｘはＣｔ値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。
【0173】
（３）シアン酸経由でチオシアンを分解するチオシアン分解微生物の定量
前記実施例１の工程（１０）と同様の操作により前記実施例１の工程（１０）の１）および２）で抽出したＤＮＡ中、シアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子数の包括定量を実施した。また、比較のため、前記実施例１の工程（１０）と同じ工程にて、実施例１、３及び４で構築したプライマーセットにより、シアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子、及び全微生物の指標遺伝子の定量を実施し、各分解酵素遺伝子の定量値を全微生物の指標遺伝子数の定量値で除すことで正規化した。
その結果を、図３４に示す。図３４において、ｘとｙの関係式が回帰直線の式を表す。式中のｙはシアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の包括定量値、ｘはシアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の個別定量の合計値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。定量の結果、シアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の包括定量値と個別定量の合計値とは、有意な正の相関関係が得られた（ｐ＜０．０１）。このため、上記（１）のプライマーセットを用いることで、チオシアン分解微生物を一度の定量操作により包括的に定量できるようになった。すなわち、シアン酸経路に係る遺伝子を一度の操作で包括的に検出または定量することで、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
前記実施例１の工程（１０）と同様の操作により前記実施例１の工程（１０）の１）および２）で抽出したＤＮＡ中、シアン酸分解酵素１および３～６の遺伝子数の包括定量を実施した。また、比較のため、前記実施例１の工程（１０）と同じ工程にて、実施例１、３及び４で構築したプライマーセットにより、シアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子、及び全微生物の指標遺伝子の定量を実施し、各分解酵素遺伝子の定量値を全微生物の指標遺伝子数の定量値で除すことで正規化した。
その結果を、図３４に示す。図３４において、ｘとｙの関係式が回帰直線の式を表す。式中のｙはシアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の包括定量値、ｘはシアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の個別定量の合計値、Ｒ２は相関係数をそれぞれ表す。定量の結果、シアン酸分解酵素１及び３～６の遺伝子の包括定量値と個別定量の合計値とは、有意な正の相関関係が得られた（ｐ＜０．０１）。このため、上記（１）のプライマーセットを用いることで、チオシアン分解微生物を一度の定量操作により包括的に定量できるようになった。すなわち、シアン酸経路に係る遺伝子を一度の操作で包括的に検出または定量することで、チオシアン除去能を判断するための指標となることが示された。
【0174】
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【符号の説明】
【0175】
２０…生物処理装置、２０ａ…生物処理領域、２０ｂ…沈降領域、２１…スポンジ担体、２２…空気曝気、２３…隔壁、２４…被処理水、２５…生物処理装置で処理された処理水、３０…チオシアン分解微生物馴養装置、３１…シリコーンチューブ、３２…ペリスタポンプ、３４…集積用水溶液、３５…チューブ通過水
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】