ホーム > 特許ランキング > 株式会社ニッポンジーン
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-21
(45)【発行日】2022-11-30
(54)【発明の名称】改変型ＤＮＡポリメラーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20221122BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221122BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221122BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221122BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221122BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20221122BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221122BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20221122BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N9/12
C12N15/63 Z
C12Q1/6844 Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022523570
(86)(22)【出願日】2021-12-24
(86)【国際出願番号】 JP2021048076
【審査請求日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】P 2020216600
(32)【優先日】2020-12-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000135162
【氏名又は名称】株式会社ニッポンジーン
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】浅野 志津子
(72)【発明者】
【氏名】國谷 亮太
(72)【発明者】
【氏名】峯岸 恭孝
(72)【発明者】
【氏名】牧 文典
(72)【発明者】
【氏名】伊澤 真樹
(72)【発明者】
【氏名】米田 祐康
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１５－１５６８５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－１３６１８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０９０６８４（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／５４
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ９／１２
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｑ １／６８４４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｍｇ2+存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方がリジン、アルギニンおよびヒスチジンから選択される正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項2】
配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５のみにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ2+存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項3】
配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５のみにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ2+存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項4】
配列番号５に記載のアミノ酸配列のさらに位置６８３にアミノ酸置換を有し、位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項5】
位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋである、請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項6】
（ａ）核酸鋳型、請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ2+を含む反応液を用意すること、および（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させること
を含む、核酸増幅方法。
【請求項7】
前記(ａ)において、前記反応液が他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
（ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることをさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
核酸増幅反応がワンステップＲＴ－ＰＣＲである、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む、核酸増幅のための組成物。
【請求項11】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ2+を含む、核酸増幅のためのキット。
【請求項12】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸を含む、発現ベクターまたは宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２５日出願の特願２０２０－２１６６００の優先権を主張し、その全記載は、本明細書に特に開示として援用される。
本発明は、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、当該ＤＮＡポリメラーゼを用いる、核酸増幅方法に関する。
本出願は、２０２０年１２月２５日出願の特願２０２０－２１６６００の優先権を主張し、その全記載は、本明細書に特に開示として援用される。
本発明は、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、当該ＤＮＡポリメラーゼを用いる、核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【0002】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、逆転写反応によりＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、次にＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅する反応である。ＲＴ－ＰＣＲは、発現遺伝子の検出、クローニングやシーケンシングのためのｃＤＮＡテンプレート作成などのほか、ＲＮＡウイルスの検出（例えば、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）診断のためのＰＣＲ検査）に利用されている。ＲＴ－ＰＣＲは、典型的には、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応を別々の反応系で実施し、ＲＮＡからｃＤＮＡ合成（逆転写）をまず行い、そのｃＤＮＡの一部を別のチューブに取り、ＰＣＲによって増幅する。ワンステップＲＴ－ＰＣＲでは、ＲＮＡからｃＤＮＡ合成（逆転写）とその後のＰＣＲが同一の反応チューブ中で進行する。ワンステップＲＴ－ＰＣＲの利点の一つは、操作手順の簡略化によるばらつきの低減とコンタミネーションの抑制である。
【0003】
ワンステップＲＴ－ＰＣＲには、１酵素型と２酵素型が開発されている。２酵素型では、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応をそれぞれ別の酵素が担い、例えばレトロウイルス由来の逆転写酵素（ＲＴ）と熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの混合物が用いられる（ＷＯ１９９４／００８０３２および特許第５１９１０４１号公報、これらの文献の全記載は、参照により本明細書に援用される。）。
【0004】
１酵素型では、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応を１つの酵素が担う。１酵素型では、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応の両方に優れた性能を発揮する酵素の選択や開発に課題がある。例えば、最も汎用されている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼは、逆転写活性が弱く、その改変体でも逆転写活性が十分ではない例が多い。Ｔａｑポリメラーゼと同じく熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈポリメラーゼは、逆転写活性を持ち、その逆転写活性はＭｎ２＋存在下で強く、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応活性はＭｇ２＋存在下で強いという特徴がある（T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991) この文献の全記載は、参照により本明細書に援用される。）。Myers et al. 1991は、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、逆転写反応をＭｎ２＋存在下で行い、逆転写反応後にＭｇ２＋存在下でＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応を実施するＲＴ－ＰＣＲを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
逆転写活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）を、ワンステップＲＴ－ＰＣＲに用いる場合、反応液中に含まれる２価カチオンの種類により、逆転写活性またはＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応活性のいずれかが十分に発揮されないため、例えば、逆転写反応の後に、ＰＣＲのためにＭｇ２＋を含む反応液を添加するという工程が必要である。操作手順をより簡略化するためには、逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応活性を同じ種類の２価カチオン存在下で発揮する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼやＭｇ２＋の存在下で逆転写活性を発揮する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが求められていた。
よって、本発明の課題は、逆転写活性を有する新規の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ改変体を提供することである。
よって、本発明の課題は、逆転写活性を有する新規の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ改変体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の位置７４４および７４５に変異導入して作成した改変型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｍｇ２＋存在下で逆転写活性を有することを見出した。さらに、Ｍｇ２＋存在下の核酸増幅反応において、本発明の改変型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ鋳型およびＤＮＡ鋳型から、それぞれ良好に核酸を増幅することを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。
【0007】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼ。
［２］ 位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである、
［１］に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［３］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、
位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
［４］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３にアミノ酸置換を有する、［１］から［３］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［５］ 位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙである、［４］に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［６］ （ａ）核酸鋳型、［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること、および
（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させること
を含む、核酸増幅方法。
［７］ 前記(ａ)において、前記反応液が他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、［６］に記載の方法。
［８］ （ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることをさらに含む、［６］または［７］に記載の方法。
［９］ 核酸増幅反応がワンステップＲＴ－ＰＣＲである、［６］から［８］のいずれか一に記載の方法。
［１０］ ［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む、組成物。
［１１］ ［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む、キット。
［１２］ ［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
［１３］ ［１２］に記載の核酸を含む、発現ベクターまたは宿主細胞。
［１４］ Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、位置６８３がリジン、ロイシンまたはチロシンに置換され、かつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼ。
［１５］ 位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙであり、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである、
［１４］に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［１６］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３、７４４および７４５にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、
位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋであり、
位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
［１］ Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼ。
［２］ 位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである、
［１］に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［３］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、
位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
［４］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３にアミノ酸置換を有する、［１］から［３］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［５］ 位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙである、［４］に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［６］ （ａ）核酸鋳型、［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること、および
（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させること
を含む、核酸増幅方法。
［７］ 前記(ａ)において、前記反応液が他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、［６］に記載の方法。
［８］ （ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることをさらに含む、［６］または［７］に記載の方法。
［９］ 核酸増幅反応がワンステップＲＴ－ＰＣＲである、［６］から［８］のいずれか一に記載の方法。
［１０］ ［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む、組成物。
［１１］ ［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む、キット。
［１２］ ［１］から［５］のいずれか一に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
［１３］ ［１２］に記載の核酸を含む、発現ベクターまたは宿主細胞。
［１４］ Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、位置６８３がリジン、ロイシンまたはチロシンに置換され、かつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼ。
［１５］ 位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙであり、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである、
［１４］に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
［１６］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３、７４４および７４５にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、
位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋであり、
位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、
位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである、
ＤＮＡポリメラーゼ。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。実施例１で変異を導入したアミノ酸配列の位置７４４と７４５のアミノ酸残基ＥＡを太字と囲み線で示す。さらに、実施例７で変異を導入したアミノ酸配列の位置６８３のアミノ酸残基Ｅを太字と囲み線で示す。
【図2】図２は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＡ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２を添加した場合と、ＭｎＣｌ２を添加した場合の、λＤＮＡの一部５２０ｂｐを増幅させたＰＣＲの結果を示す。図中の番号は、野生型および改変型ポリメラーゼの種類を表す。１：ＥＡ（野生型）、２：ＲＡ、３：ＥＲ、４：ＲＲ、５：ＫＫ。ラダーマーカーは、１００ｂｐごとのＤＮＡラダーである。
【図3A】図３Ａは、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＡ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、β-actinの一部７３４ｂｐを増幅させたＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図中の番号は、野生型および改変型ポリメラーゼの種類を表す。１：ＥＡ（野生型）、２：ＲＡ、３：ＥＲ、４：ＲＲ、５：ＫＫ。ラダーマーカーは、１００ｂｐごとのＤＮＡラダーである。
【図3B】図３Ｂは、抗体を添加しない場合（抗体なし）と、添加しない場合（抗体あり）における、増幅の違いを示す。酵素は、改変型ＲＲと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの組合せ（ＲＲ＋ＷＴ）、改変型ＫＫと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの組合せ（ＫＫ＋ＷＴ）および改変型ＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）を用いた。鋳型の量は、酵素ごとに、左側レーンから０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇおよび１００ｎｇである。
【図4-1】図４－１から４－６は、実施例４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系での、各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＭｇＣｌ２存在下、抗Ｔａｑ抗体存在下のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線および検量線である。図４－１は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）を用いたリアルタイムＰＣＲの増幅曲線である。
【図5-1】図５－１から５－５は、実施例５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系での、各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＭｇＣｌ２存在下のＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線および検量線である。図５－１は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）を用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線である。
【図6-1】図６－１から６－３は、実施例５のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系での、各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＭｎＣｌ２存在下のＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線である。図６－１は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）を用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線である。
【図7-1】図７－１から７－５は、実施例６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系での、各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＭｇＣｌ２存在下、抗Ｔａｑ抗体存在下のＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線および検量線である。図７－１は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）を用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線である。
【図8-1】図８－１から８－３は、実施例６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系での、各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＭｎＣｌ２存在下、抗Ｔａｑ抗体存在下のＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線である。図８－１は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）を用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線である。
【図9】図９は、ＭｇＣｌ２存在下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系のＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。鋳型の増幅鎖長は６７ｂｐである。用いたＤＮＡポリメラーゼは、以下の通りである。ＫＫ：改変型ＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＫ＋ＷＴ：改変型ＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの組合せ、ＫＫＫ＋ＷＴ：改変型ＫＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの組合せ。図中、ＮＴＣは陰性対照を、Ｐｏｓｉは鋳型としてスパイクサンプルからの抽出した精製ＲＮＡを用いたことを、ＭはｐＵＣ１９／ＭｓｐＩ ｄｉｇｅｓｔを意味する。
【図10】図１０は、ＭｇＣｌ２存在下、β-actinの一部７３４ｂｐを増幅させたＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。ＫＫＫ：改変型ＫＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを単独で用いた場合（－）、および改変型ＫＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとの組合せ（＋）。ＬＫＫ：改変型ＬＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを単独で用いた場合（－）、および改変型ＬＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとの組合せ（＋）。ＹＫＫ：改変型ＹＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを単独で用いた場合（－）、および改変型ＹＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとの組合せ（＋）。ラダーマーカーは、１００ｂｐごとのＤＮＡラダーである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【0010】
＜改変型ＤＮＡポリメラーゼ＞
（位置７４４および７４５におけるアミノ酸置換）
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性（逆転写活性）を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む。
（位置７４４および７４５におけるアミノ酸置換）
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性（逆転写活性）を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む。
【0011】
本発明は、逆転写活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。逆転写活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７由来のＤＮＡポリメラーゼ、後記する実施例に記載のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＭ７２株由来のＤＮＡポリメラーゼやＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）などが挙げられるがこれらに限定されない。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの逆転写活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、以下のａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で提供されている：ＨＢ８株 ＢＡＡ０６０３３．１またはＨＢ２７株 ＡＡＳ８１０３８．１。これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、以下のａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号で提供されている：ＨＢ８株 Ｄ２８８７８．１およびＨＢ２７株 ＡＥ０１７２２１．１（６７１１２２～６７３６２６）。逆転写活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書中、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼと記載する）である。野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性はＭｎ２＋存在下で強く、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応活性はＭｇ２＋存在下で強い。Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’のエキソヌクレオチド分解性プルーフリーディング活性を欠く。
【0012】
上記の通り、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性はマンガンイオン存在下で強く、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応活性はマグネシウムイオン存在下で強い。後記する実施例３に示すように、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施したＲＴ－ＰＣＲでは、マグネシウムイオンを含む反応液とマンガンイオンを含む反応液のいずれを用いても、核酸増幅反応産物のバンドは確認できなかった。これは、マグネシウムイオンを含む反応液中ではＲＮＡ依存性逆転写反応がほとんど起こらなかったためであると考えられる。また、マグネシウムイオンを含む反応液中では、逆転写反応によりｃＤＮＡが合成されていても、ｃＤＮＡからＤＮＡの増幅がほとんど起こっておらず、バンドとして見えるレベルまで増幅されていないためと考えられる。一方、本発明者らは、驚くべきことに、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用して、マグネシウムイオンを含む反応液中で行ったＲＴ－ＰＣＲにより、バンドとして確認可能な増幅産物が生じること、すなわちＲＮＡ鋳型からＤＮＡを増幅できることを見出した。これは、上記の改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼが、マグネシウムイオンを含む反応液において、逆転写活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するためであると考えられる。
【0013】
本明細書中、「Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し」という記載は、マグネシウムイオンを含む反応液中で、ＤＮＡポリメラーゼが逆転写反応を触媒し、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡが合成されることを意味する。前記反応液はマンガンイオンを実質的に含まず、逆転写反応はマグネシウムイオンの作用に依ることが意図される。ＤＮＡポリメラーゼがＭｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有することは、例えば２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２の組成下で、トリチウム化チミジンを用いて、ポリアデニル酸を鋳型としてペンタデカチミジル酸をプライマーとして、ヒートブロックなどにより６５℃、１０分間の等温反応を実施し、ポリチミジル酸の合成を液体シンチレーションシステムＬＳＣ－６１０１（アロカ株式会社）を用いて検出することにより検証することができる。あるいは、実施例３の条件で、２ｍＭのＭｇＣｌ２存在下、例えばマウスβアクチンをマウスの腎臓から抽出精製したトータルＲＮＡを鋳型としてマウスβアクチン増幅用プライマー（配列番号１６および１７）を用いて、サーマルサイクラーによりＲＴ－ＰＣＲを実施し、反応終了後反応液の一部をゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下で目的ＤＮＡ断片の増幅の有無を確認することにより検証することができる。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で野生型と同程度のＤＮＡポリメラーゼ活性を有していてもよいし、野生型と比較して低下したＤＮＡポリメラーゼ活性を有していてもよい。あるいは、少なくともＭｇ２＋存在下では、ＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていてもよい。
【0014】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、(i)配列番号５に記載のアミノ酸配列または(ii)配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列の位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換された改変型ＤＮＡポリメラーゼである。(ii)配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列において、欠失や挿入によりアミノ酸残基の位置にずれが生じる場合は、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５に対応する位置の２つのアミノ酸残基の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換された改変型ＤＮＡポリメラーゼである。本明細書に記載の配列番号５のアミノ酸配列は、ＨＢ２７株のＤＮＡポリメラーゼＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡＳ８１０３８．１と同一である。配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列には、例えばＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼやＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）が含まれる。
【0015】
配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質の位置７４４および７４５は、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端からそれぞれ７４４番目および７４５番目のアミノ酸である。配列番号５に記載のアミノ酸配列において、７４４番目および７４５番目の改変前(野生型)のアミノ酸はそれぞれグルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）およびアラニン（Ａ、Ａｌａ）である。改変前のアミノ酸をアミノ酸の位置を示す数字の左側（頭）に記載して、Ｅ７４４およびＡ７４５と表記することができる。正電荷を持つアミノ酸は、例えば、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）である。
【0016】
本発明の実施態様の一つでは、改変型ＤＮＡポリメラーゼは、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲまたはＥ７４４Ｈであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲまたはＡ７４５Ｈである。Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４ＲおよびＥ７４４Ｈという記載は、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から７４４番目のグルタミン酸が、それぞれリジン、アルギニンおよびヒスチジンに置換されていることを表す。同様に、Ａ７４５Ｋ、Ａ７４５ＲおよびＡ７４５Ｈという記載は、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から７４５番目のアラニンが、それぞれリジン、アルギニンおよびヒスチジンに置換されていることを表す。これは、改変前のアミノ酸をアミノ酸の位置を示す数字の左側（頭）に記載し、改変後のアミノ酸をアミノ酸の位置を示す数字の右側（後ろ）に記載したものである。配列番号５のアミノ酸配列の位置７４４および７４５におけるアミノ酸置換は、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｋ、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｒ、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｈ、Ｅ７４４ＲおよびＡ７４５Ｋ、Ｅ７４４ＲおよびＡ７４５Ｒ、Ｅ７４４ＲおよびＡ７４５Ｈ、Ｅ７４４ＨおよびＡ７４５Ｋ、Ｅ７４４ＨおよびＡ７４５Ｒ、またはＥ７４４ＨおよびＡ７４５Ｈのいずれかを選択することができる。配列番号５のアミノ酸配列の位置７４４および７４５におけるアミノ酸置換は、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｋ、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｒ、Ｅ７４４ＲおよびＡ７４５Ｋ、またはＥ７４４ＲおよびＡ７４５Ｒのいずれかを選択することが好ましく、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５ＫまたはＥ７４４ＲおよびＡ７４５Ｒのいずれかを選択することがより好ましい。
【0017】
本発明のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有する限り、配列番号５のアミノ酸配列の位置７４４および７４５におけるアミノ酸置換のほかにも、配列番号５に記載のアミノ酸配列と比較して変異を有していてもよく、そのような変異は人工的に導入された改変であってもよいし、または改変型ＤＮＡポリメラーゼが由来する野生型ＤＮＡポリメラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７とは異なる種や株に由来することに起因する変異であってもよい。本発明のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有する限り、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して任意のアミノ酸配列同一性を有することができるが、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。アミノ酸配列同一性の値は、位置７４４および７４５における置換を含めて計算することができる。置換アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【0018】
本発明のＤＮＡポリメラーゼに追加で導入可能な変異や修飾としては、限定されないが、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼのＮ末端領域を欠損させ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失活させる変異(Arakawa et al., DNA Research 3, 87-92, 1996. この文献の全記載は、参照により本明細書に援用される。)や、シングルストランドＤＮＡバインディングプロテイン、例えばＲＢ６９ＳＳＢをリンカーでＤＮＡポリメラーゼに連結する修飾(Sun et al., Proteins 2006 Oct 1;65(1):231-8, doi: 10.1002/prot.21088. この文献の全記載は、参照により本明細書に援用される。)、ダブルストランドＤＮＡバインディングプロテイン、例えばＳｓｏ７ｄをＤＮＡポリメラーゼに連結し、ポリメラーゼがＤＮＡ鎖から滑り落ちないようにし、連続的な合成能を向上させる修飾（Wang et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 3 1197-1207, DOI: 10.1093/nar/gkh271, この文献の全記載は、参照により本明細書に援用される。）などを挙げることができる。
【0019】
特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである。特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列にアミノ酸置換Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｋを有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列にアミノ酸置換Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｒを有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列にアミノ酸置換Ｅ７４４ＲおよびＡ７４５Ｋを有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。これらの態様において、位置７４４および７４５以外の位置のアミノ酸残基は、配列番号５に記載のアミノ酸配列のネイティブのアミノ酸残基であってもよい。
【0020】
（位置６８３におけるアミノ酸置換）
別の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３に更なるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質の位置６８３は、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から６８３番目のアミノ酸である。配列番号５に記載のアミノ酸配列において、６８３番目の改変前（野生型）のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）である。位置６８３のアミノ酸残基は、位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼの逆転写反応に影響を与えないアミノ酸残基で置換され得る。また、この置換は、位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写活性を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ連鎖活性を低下させるものであってもよい。位置６８３グルタミン酸を、例えば、リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）に置換することができるが、これらに限定されない。
別の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３に更なるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質の位置６８３は、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から６８３番目のアミノ酸である。配列番号５に記載のアミノ酸配列において、６８３番目の改変前（野生型）のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）である。位置６８３のアミノ酸残基は、位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼの逆転写反応に影響を与えないアミノ酸残基で置換され得る。また、この置換は、位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写活性を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ連鎖活性を低下させるものであってもよい。位置６８３グルタミン酸を、例えば、リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）に置換することができるが、これらに限定されない。
【0021】
本発明者らは、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３における更なるアミノ酸置換が、本発明の位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ連鎖活性を低下させることを見出した。配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３における更なるアミノ酸置換に有する本発明のＤＮＡポリメラーゼは、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用することができる。他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないか、または逆転写活性が低い酵素を選択することができる。他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＭｇ２＋存在下での逆転写活性を有しない組換えＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなど）またはそれらの組合せから選択することができる。他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることで、より精度よく標的を検出することができる。
【0022】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性（逆転写活性）を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置６８３がリジン、ロイシンまたはチロシンに置換され、かつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む。本発明のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有する限り、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して任意のアミノ酸配列同一性を有することができるが、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。アミノ酸配列同一性の値は、位置６８３、７４４および７４５における置換を含めて計算することができる。
【0023】
本発明の実施態様の一つでは、改変型ＤＮＡポリメラーゼは、位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙである。Ｅ６８３Ｋ、Ｅ６８３ＬまたはＥ６８３Ｙという記載は、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から６８３番目のグルタミン酸が、それぞれリジン、ロイシンおよびチロシンに置換されていることを表す。これは、改変前のアミノ酸をアミノ酸の位置を示す数字の左側（頭）に記載し、改変後のアミノ酸をアミノ酸の位置を示す数字の右側（後ろ）に記載したものである。配列番号５のアミノ酸配列の位置６８３は、位置７４４および７４５におけるアミノ酸置換と組み合わせて、例えばＥ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｌ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｈ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｒ、またはＥ６８３Ｙ／Ｅ７４４Ｈ／Ａ７４５Ｈのいずれかから選択することができる。なお、例えば「Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｋ」の「／」は、「および」を意味し、具体的には「Ｅ６８３ＫおよびＥ７４４ＫおよびＡ７４５Ｋ」である。配列番号５のアミノ酸配列の位置６８３、７４４および７４５におけるアミノ酸置換は、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｋ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５Ｒ、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｋ、またはＥ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｒのいずれかを選択することが好ましく、Ｅ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｋ／Ａ７４５ＫまたはＥ６８３Ｋ／Ｅ７４４Ｒ／Ａ７４５Ｒのいずれかを選択することがより好ましい。
【0024】
特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置６８３、７４４および７４５にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋであり、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである。特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列にアミノ酸置換Ｅ６８３Ｋ、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｋを有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列にアミノ酸置換Ｅ６８３Ｋ、Ｅ７４４ＫおよびＡ７４５Ｒを有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列にアミノ酸置換Ｅ６８３Ｋ、Ｅ７４４ＲおよびＡ７４５Ｋを有するアミノ酸配列を含む、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。これらの態様において、位置６８３、７４４および７４５以外の位置のアミノ酸残基は、配列番号５に記載のアミノ酸配列のネイティブのアミノ酸残基であってもよい。
【0025】
本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用した核酸増幅反応の効率は、標準的なサンプルを用いて、希釈系列実験を実施することにより評価することができる。例えば検量線の傾きから増幅効率値（ＰＣＲ効率）を求めることができる。ＰＣＲ効率は、段階希釈した核酸量をＸ軸、核酸量に対応するＣｔ値をＹ軸として、結果をプロットした検量線の傾き（ｓｌｏｐｅ）より、以下の式１により求めることができる。
（式１）
ＰＣＲ効率（％）＝（１０［－１／Ｓｌｏｐｅ］－１）×１００
ＰＣＲ効率は、８０～１２０％が適正範囲とされ、良好な反応では９０から１００％になる。検量線の直線性は、相関係数（Ｒ２値）で評価され、その値が０．９８以上であることが望ましい。
（式１）
ＰＣＲ効率（％）＝（１０［－１／Ｓｌｏｐｅ］－１）×１００
ＰＣＲ効率は、８０～１２０％が適正範囲とされ、良好な反応では９０から１００％になる。検量線の直線性は、相関係数（Ｒ２値）で評価され、その値が０．９８以上であることが望ましい。
【0026】
本発明は、上記の改変ＤＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片をコードする核酸を提供する。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼに関して機能的断片とは、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有する断片である。さらに、本発明は、改変ＤＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片をコードする核酸を含む、発現ベクターまたは宿主細胞を提供する。
【0027】
本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、限定されないが、例えばサーマス属の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号４）に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。サーマス属の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＨＢ８株やＨＢ２７株、もしくは天然から単離されてサーマス属に属すると同定された株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、既知のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列に基づいて合成したプライマーを用いてＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅することにより得ることができる。別の方法では、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＨＢ８株やＨＢ２７株、もしくは天然から単離されてサーマス属に属すると同定された株から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、既知のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。
【0028】
本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼおよびその断片は、公知の方法を用いて、改変ＤＮＡポリメラーゼまたはその断片をコードするＤＮＡを発現させることにより製造することができる。発現ベクターは、使用する宿主細胞にあわせて適宜選択することができる。これらの発現ベクターには、公知の方法（制限酵素を利用する方法等）で、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼおよびその断片をコードする核酸を挿入することができる。本発明に係る発現ベクターは、さらに、ポリメラーゼ遺伝子の発現を調節するプロモーター、複製起点、選択マーカー遺伝子等を含むことができる。プロモーターおよび複製起点は、宿主細胞とベクターの種類によって適宜選択することができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２（例えば、実施例で使用しているｐＥＴ１５ｂなど）、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０）を使用することができる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌などの原核細胞や、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞（サッカロミセス属、アスペルギルス属等）といった真核細胞を用いることができる。宿主生物としては、例えば、動物個体、植物個体、カイコを用いることができる。
【0029】
ＤＮＡポリメラーゼを、公知の方法に基づいて、宿主細胞または宿主生物を、各細胞や生物に適した条件で培養し、産生させることができる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、寒天培地に播種し、生じたコロニーをＬＢにアンピシリンとクロラムフェニコールを添加した液体培地で６００ｎｍにおける吸光度が約０．５になるまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに４時間培養し、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを産生させることができる。菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭ イミダゾールに懸濁し、酵素的または物理的に（例えば超音波により）破砕し、遠心分離後、上清を８０℃で熱処理した後、遠心分離し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７５２４８０２）、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７１１５４０１）、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７０４０７０１）を用いて精製し、最後に保存緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴ、０．０９５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に置換し、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。
【0030】
＜核酸増幅方法＞
本発明の核酸増幅方法は、以下の工程を含む。
（ａ）核酸鋳型、上記の改変型ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること、および
（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させること。
本発明の核酸増幅方法は、以下の工程を含む。
（ａ）核酸鋳型、上記の改変型ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること、および
（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させること。
【0031】
本発明の核酸増幅方法で使用するＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性（逆転写活性）を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼであり、上記の＜改変型ＤＮＡポリメラーゼ＞の項に記載のものを使用することができる。
【0032】
本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下で、ＲＮＡ依存性逆転写活性によりＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ合成し、次にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によりＤＮＡを増幅することができるので、本発明の核酸増幅方法は、ＲＮＡを鋳型とする場合に、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応とを一つの反応系（すなわち、同一の反応液内で）行うことができる。本発明の核酸増幅方法は、ＰＣＲ法、またはＲＴ－ＰＣＲ法であり、好ましくはワンステップＲＴ－ＰＣＲ法である。本発明の核酸増幅方法は、定性または定量的結果を得るために使用することができる。核酸鋳型は、ＤＮＡ鋳型、ＲＮＡ鋳型またはそれらの混合物である。
【0033】
「（ａ）核酸鋳型、上記の改変型ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること」により、核酸鋳型と本発明のＤＮＡポリメラーゼがＭｇ２＋の存在下で互いに接触可能な状態になればよく、例えば、反応チューブに入れられたＭｇ２＋含有反応液に核酸鋳型とＤＮＡポリメラーゼを添加することにより実施することができるが、これに限定されない。反応液は、核酸増幅反応に必要な試薬を含むことができ、そのような試薬の例は、核酸鋳型と本発明のＤＮＡポリメラーゼのほかに、ｄＮＴＰ、プライマー、プローブ、２価カチオン、１価イオンおよび緩衝液であり、具体的には、２価カチオンはマグネシウムイオンであり、１価のイオンはアンモニウムイオン、カリウムイオンまたはそれらの混合物である。反応液は、必要に応じて、トレハロースなどの糖類、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０(登録商標)やＢｒｉｊ３５のような非イオン界面活性剤、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体（抗Ｔａｑ抗体または抗Ｔｔｈ抗体など）を更に含むことができる。抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を反応液に添加することにより、特異性や感度の向上という効果が得られると考えられる（特開２００８－１７７８７号公報, この文献の全記載は、参照により本明細書に援用される。）。
【0034】
反応液はマンガンイオンを実質的に含まないことが好ましい。特定の理論に限定されるものではないが、マンガンイオンがマグネシウムイオンと競合し、逆転写活性が阻害される可能性があるためである。マンガンイオンを実質的に含まないとは、マンガンイオンを全く含まないか、または極微量のマンガンイオンを含んでいてもよいことを意味する。
【0035】
上記反応液はマグネシウムイオン源として、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。反応液中のマグネシウムイオン濃度は、０．１～１００ｍＭまたは０．５～５０ｍＭの範囲であり、好ましくは１～１０ｍＭの範囲であり、より好ましくは１～８ｍＭの範囲であり、さらにより好ましくは２～６ｍＭの範囲である。マグネシウムイオン濃度が上記の範囲のいずれかであれば、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応が生じると考えられるが、特に２～６ｍＭの範囲であれば、逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応が良好に生じる。
【0036】
プライマーは、ＲＴ－ＰＣＲを実施する場合は、ＲＮＡ鋳型の一部または全部を増幅するように設計されたアンチセンス配列を有するプライマー（アンチセンスプライマー）と、配列特異的なセンスプライマーの組合せである。アンチセンスプライマーは、逆転写反応によるｃＤＮＡ合成のプライマーとなり、鋳型配列に特異的なプライマー、ｍＲＮＡのポリＡテイルに結合するオリゴｄＴプライマー、またはランダムヘキサマープライマーなどのランダムプライマーなどを用いることができる。ｃＤＮＡ合成の後に続くＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応では、配列特異的センスプライマーがフォワードプライマーとして働き、リバースプライマーは、逆転写反応で使われたアンチセンスプライマーが使用されるか、またはアンチセンスプライマーの結合部位から上流に位置する配列にハイブリダイズする別のアンチセンスプライマーが使用される。プライマーは、ＰＣＲを実施する場合は、これに限定されないが、例えば核酸鋳型の一部または全部を増幅するように設計された配列特異的センスプライマーやアンチセンスプライマーであってもよい。
【0037】
「（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させること」は、例えば、核酸鋳型、改変型ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＴ－ＰＣＲに必要な試薬を含む反応液を、逆転写反応およびＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応に適した温度サイクルに供して、プライマーにより核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させることである。核酸増幅に適した温度サイクルの条件は、鋳型となる核酸の種類や塩基配列の特性、増幅する長さ、プライマー配列等によって変わるが、当業者は条件を適宜設定することができる。核酸増幅方法がＲＴ－ＰＣＲ法であるとき、例えば、温度サイクルは、（１）逆転写反応のためのインキュベーション、および（２）ＰＣＲのための温度サイクルを含むことができる。（１）逆転写反応のためのインキュベーションは、少なくとも初回のｃＤＮＡの合成が起こるための温度と時間で行えばよく、例えば、１～１００℃の範囲のいずれかの温度で１秒以上インキュベーションすればよい。より詳細には、１０～９０℃、２０～９０℃、３０～９０℃、４０～９０℃、４５～８５℃、５０～８０℃、５５～７５℃または６０～７０℃の範囲のいずれかの温度において、１秒以上１２０分以下、または１秒以上６０分以下の範囲の任意の時間、実施することができる。なお、逆転写反応のためのインキュベーションは必ずしも必要ではないと考えられる。本発明者らは、実験的に逆転写時間を０秒（設定しない）でもワンステップＲＴリアルタイムＰＣＲで増幅が認められることを確認している。これは、次に記載するＰＣＲのための温度サイクルの間に、例えば第二の温度の段階で逆転写反応が起こるためであると考えられる。（２）ＰＣＲのための温度サイクルは、例えば、９０℃～９７℃の変性温度および５０℃～７０℃の第二の温度の２段階の温度変化（ラウンド）を、２０～５０回（サイクル）行うことができる。場合により、ＰＣＲのための温度サイクルは、伸長温度（６０～７５℃）を加えた３段階の温度変化で実施することもできる。３段階の温度変化で実施する場合は、一般的には、伸長温度を第二の温度よりも高温に設定する。当業者は、各ラウンドの保持時間を適宜設定することができる。各ラウンドの保持時間は例えば、１秒以上５分以下、１秒以上３分以下、または１秒以上６０秒以下の範囲の任意の時間に設定することができる。核酸増幅方法がＰＣＲ法であるとき、上記の（２）ＰＣＲのための温度サイクルを実施することができ、必要であれば、ＰＣＲのための温度サイクルに先立って、変性のためのプレインキュベーションを、例えば９０～９７℃で、１０秒から１５分行うことができる。
【0038】
本発明の実施態様の一つにおいて、ＲＴ－ＰＣＲ法は、上記の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用することができる。他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないか、または逆転写活性が低い酵素を選択することができる。他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼやＭｇ２＋存在下での逆転写活性を有しない組換えＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなど）またはそれらの組合せから選択することができる。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソ活性がないので、単一酵素では、プローブ法で使用はできないが、一般的なＰＣＲにおいてはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのようなファミリーＡタイプとＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ等のファミリーＢタイプを混ぜることで長鎖ＤＮＡを増幅出来たり、感度が向上したりするといわれており、ＲＮＡを鋳型としたワンステップＲＴ－ＰＣＲでも同様の効果が期待できる。
【0039】
すなわち、本発明は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む核酸増幅方法を提供する。
（ａ）核酸鋳型、改変型ＤＮＡポリメラーゼ、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること、および
（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させることを含み、
ここで、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せから選択され、好ましくは核酸増幅方法がＲＴ－ＰＣＲ法である。
（ａ）核酸鋳型、改変型ＤＮＡポリメラーゼ、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用意すること、および
（ｂ）前記（ａ）の反応液を温度サイクルに供して前記核酸鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させることを含み、
ここで、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せから選択され、好ましくは核酸増幅方法がＲＴ－ＰＣＲ法である。
【0040】
本発明の核酸増幅方法は、（ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることをさらに含むことができる。「（ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすること」は、限定されないが、例えば、インターカレーション法（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素を用いる）、ハイブリダイゼーション法（例えば、Ｆｒｅｔプローブ法、ＴａｑＭａｎプローブ法など）、Ｌｕｘプライマー法などを用いて実施することができる。ハイブリダイゼーション法では、蛍光色素が結合したオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば５’末端にはレポーター蛍光色素がおよび３’末端にはクエンチャー色素がそれぞれ結合した構造を有するものを使用することができ、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＴＡＭＲＡ（登録商標）色素をクエンチャー色素として含むＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブや、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ）を利用することができる。
【0041】
「（ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすること」は、核酸増幅反応の任意の時点で、反応液の蛍光強度を測定し、増幅した核酸量に依存して蛍光強度が増加（あるいは減少）するため、取得した蛍光強度をサイクル数に対してプロットすることで、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすることである。「（ｃ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターすること」により、標的核酸を迅速に検出することができ、増幅率に基づいて試料中に含まれる標的核酸を定量することができる。
【0042】
特定の実施態様では、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用いる核酸増幅方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、方法を提供する。特定の実施態様では、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用いる核酸増幅方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置７４４および７４５の両方にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒである、方法を提供する。これらの実施態様において、核酸増幅反応がＰＣＲまたはワンステップＲＴ－ＰＣＲであってもよい。
【0043】
特定の実施態様では、本発明は、２種以上のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む反応液を用いる核酸増幅方法であって、前記２種以上のDNAポリメラーゼが、少なくとも配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置６８３がリジン、ロイシンまたはチロシンに置換され、かつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼ、および他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、方法が提供される。さらに特定の実施態様では、位置６８３のアミノ酸置換がＥ６８３Ｋであり、位置７４４のアミノ酸置換がＥ７４４ＫまたはＥ７４４Ｒであり、位置７４５のアミノ酸置換がＡ７４５ＫまたはＡ７４５Ｒであることが好ましい。これらの実施態様において、核酸増幅反応がＰＣＲまたはワンステップＲＴ－ＰＣＲであってもよい。
【0044】
本発明は、上記の改変型ＤＮＡポリメラーゼを含む、組成物を提供する。本発明の組成物は、ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲ、好ましくはワンステップＲＴ－ＰＣＲを実施するための組成物であってもよい。本発明の組成物は、上記の改変型ＤＮＡポリメラーゼのほか、緩衝液、糖類、ＥＤＴＡ、非イオン界面活性剤、グリセロール等を含むことができる。さらに、本発明の組成物は、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含むことができ、本発明の組成物は、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せから選択することができる。
【0045】
本発明は、上記改変型のＤＮＡポリメラーゼおよびＭｇ２＋を含む、キットを提供する。本発明のキットは、ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲ、好ましくはワンステップＲＴ－ＰＣＲを実施するためのキットであってもよい。さらに、本発明のキットは、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含むことができ、本発明のキットは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｇ２＋存在下での逆転写活性を有しないＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せから選択することができる。本発明のキットは、水、核酸反応実施のための試薬（例えば、ｄＮＴＰ、プライマー、プローブ、１価イオン（カリウムイオン、アンモニウムイオン）、緩衝液、糖類、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体（抗Ｔｔｈ抗体または抗Ｔａｑ抗体）、核酸反応実施のための指示書、容器、パッケージなどを含むことができる。
【実施例】
【0046】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0047】
（試薬と機器）
実施例では、以下の試薬を用いた。
ベクターｐＥＴ１５ｂ（メルクミリポア、６９６６１）
大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン、３１７－０６２４１）
Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア、７０９５６）
ＬＢ培地用試薬
Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ、２１１７０５）
Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ、２１２７５０）
ＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬、０１８－０１６７５）
アンピシリン（富士フイルム和光純薬、０１４－２３３０２）
クロラムフェニコール（富士フイルム和光純薬、０３０－１９４５２）
ＩＰＴＧ（富士フイルム和光純薬、０９２－０５３２４）
イミダゾール（富士フイルム和光純薬、０９５－０００１５）
λＤＮＡ（ニッポンジーン、３１８－００４１４）
ＭｇＣｌ２（ニッポンジーン、３１０－９０３６１）
ＭｎＣｌ２（富士フイルム和光純薬、１３３－００７２５）
ｄＮＴＰｓ（ニッポンジーン）
０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）
抗Ｔａｑ抗体（ニッポンジーン、３１１－０８２２１）
なお、抗Ｔａｑ抗体は、抗原はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであるが、スクリーニングの過程でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼへの結合も加味して選抜しており、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性も抑制することを確認している。
実施例で使用したプライマーは、ニッポンジーンマテリアルに依頼して合成したものを使用した。
実施例では、以下の試薬を用いた。
ベクターｐＥＴ１５ｂ（メルクミリポア、６９６６１）
大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン、３１７－０６２４１）
Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア、７０９５６）
ＬＢ培地用試薬
Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ、２１１７０５）
Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ、２１２７５０）
ＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬、０１８－０１６７５）
アンピシリン（富士フイルム和光純薬、０１４－２３３０２）
クロラムフェニコール（富士フイルム和光純薬、０３０－１９４５２）
ＩＰＴＧ（富士フイルム和光純薬、０９２－０５３２４）
イミダゾール（富士フイルム和光純薬、０９５－０００１５）
λＤＮＡ（ニッポンジーン、３１８－００４１４）
ＭｇＣｌ２（ニッポンジーン、３１０－９０３６１）
ＭｎＣｌ２（富士フイルム和光純薬、１３３－００７２５）
ｄＮＴＰｓ（ニッポンジーン）
０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）
抗Ｔａｑ抗体（ニッポンジーン、３１１－０８２２１）
なお、抗Ｔａｑ抗体は、抗原はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであるが、スクリーニングの過程でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼへの結合も加味して選抜しており、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性も抑制することを確認している。
実施例で使用したプライマーは、ニッポンジーンマテリアルに依頼して合成したものを使用した。
【0048】
実施例では、以下の機器を用いた。
サーマルサイクラー：2720 Thermal Cycler (ThermoFisher Scientific)
リアルタイムＰＣＲ装置：Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(ThermoFisher Scientific)のRun Mode:Fast 7500
サーマルサイクラー：2720 Thermal Cycler (ThermoFisher Scientific)
リアルタイムＰＣＲ装置：Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(ThermoFisher Scientific)のRun Mode:Fast 7500
【0049】
（実施例１）
発現ベクターの改変
市販のベクターｐＥＴ１５ｂのＮｄｅ１サイトに人工合成したオリゴＤＮＡを挿入し、改変ｐＥＴ１５ｂ２（配列番号１）を作製した。
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼクローニング
東京薬科大学が大分県内の温泉水より単離したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＭ７２株由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８の配列を基に設計した配列番号２および配列番号３のプライマー（表１）を用いてＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅し、上記の改変ｐＥＴ１５ｂ２のＮｄｅ１、Ｓａｌ１サイトにクローニングした。クローニングしたＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のシークエンスを確認すると、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＭ７２株由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７株のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列と一致した（配列番号４）。
ただし、設計したプライマー（配列番号３）はＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８の配列を基にしているため、配列番号４に記載のアミノ酸配列の２５０２番目の塩基配列はＨＢ２７株ではなくＨＢ８株と同じであった。発現する野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号５）を図１に示す。
発現ベクターの改変
市販のベクターｐＥＴ１５ｂのＮｄｅ１サイトに人工合成したオリゴＤＮＡを挿入し、改変ｐＥＴ１５ｂ２（配列番号１）を作製した。
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼクローニング
東京薬科大学が大分県内の温泉水より単離したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＭ７２株由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８の配列を基に設計した配列番号２および配列番号３のプライマー（表１）を用いてＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅し、上記の改変ｐＥＴ１５ｂ２のＮｄｅ１、Ｓａｌ１サイトにクローニングした。クローニングしたＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のシークエンスを確認すると、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＭ７２株由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７株のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列と一致した（配列番号４）。
【表1】
【0050】
改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの作製
作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを鋳型に、配列番号６～１３のプライマー（表２）を用いて部位特異的変異導入を行った。
作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを鋳型に、配列番号６～１３のプライマー（表２）を用いて部位特異的変異導入を行った。
【表2】
【0051】
変異導入プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生じたコロニーから変異プラスミドを調製し、塩基配列を調べることにより、変異が導入されていることを確認した。変異導入の結果、配列番号５のアミノ酸配列の７４４番目と７４５番目のアミノ酸残基ＥＡがそれぞれＥＲ、ＲＡ、ＲＲ、ＫＫになった改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドが得られた。
【0052】
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの精製
野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよび各改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。生じたコロニーをＬＢにアンピシリンとクロラムフェニコールを添加した液体培地で６００ｎｍにおける吸光度が約０．５になるまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに４時間培養し、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを産生させた。菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭ イミダゾールに懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離後、上清を８０℃で熱処理した後、遠心分離し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７５２４８０２）、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７１１５４０１）、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７０４０７０１）を用いて精製し、最後に保存緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴ、０．０９５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に置換し、各種Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを得た。
野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよび各改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。生じたコロニーをＬＢにアンピシリンとクロラムフェニコールを添加した液体培地で６００ｎｍにおける吸光度が約０．５になるまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに４時間培養し、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを産生させた。菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭ イミダゾールに懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離後、上清を８０℃で熱処理した後、遠心分離し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７５２４８０２）、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７１１５４０１）、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Ｃｙｔｉｖａ １７０４０７０１）を用いて精製し、最後に保存緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴ、０．０９５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に置換し、各種Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを得た。
【0053】
（実施例２）
ＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、λＤＮＡ ５２０ｂｐを増幅させるＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、λＤＮＡ ５２０ｂｐを増幅する０．４μＭのプライマー（配列番号１４および１５）、６０ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）、０．２５μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２５μＬに、１０ｎｇになるようにλＤＮＡを添加し、９５℃、２分の熱変性後、９５℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分の伸長反応を行うＰＣＲ条件で、サーマルサイクラーを用いて行った。
ＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、λＤＮＡ ５２０ｂｐを増幅させるＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、λＤＮＡ ５２０ｂｐを増幅する０．４μＭのプライマー（配列番号１４および１５）、６０ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）、０．２５μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２５μＬに、１０ｎｇになるようにλＤＮＡを添加し、９５℃、２分の熱変性後、９５℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分の伸長反応を行うＰＣＲ条件で、サーマルサイクラーを用いて行った。
【0054】
【表3】
【0055】
図２に結果を示す。ＭｇＣｌ２を添加した場合、すべてのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼでバンドが確認できた。一方、ＭｎＣｌ２を添加した場合、すべてのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼでバンドが確認されなかった。このことから、実施例１で作成した改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）は、野生型（ＷＴ）と同様、ＭｇＣｌ２存在下でＤＮＡポリメラーゼ活性を持つことが確認された。
【0056】
（実施例３）
ＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ－ＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、マウスβ-actin遺伝子の一部領域７３４ｂｐを増幅させるＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ＰＣＲは、マウスの腎臓から抽出精製した１００ｎｇのトータルＲＮＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、マウスβ-actin遺伝子の一部領域７３４ｂｐを増幅する０．４μＭのプライマー（配列番号１６および１７）、６０ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）、０．２５μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２５μＬに、１００ｎｇになるようにマウスＫｉｄｎｅｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを添加し、６５℃、３０分の逆転写反応後、９５℃、２分の熱変性を行い、さらに９５℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、３０秒を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分の伸長反応を行うＰＣＲ条件で、サーマルサイクラーを用いて行った。
ＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ－ＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、マウスβ-actin遺伝子の一部領域７３４ｂｐを増幅させるＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ＰＣＲは、マウスの腎臓から抽出精製した１００ｎｇのトータルＲＮＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、マウスβ-actin遺伝子の一部領域７３４ｂｐを増幅する０．４μＭのプライマー（配列番号１６および１７）、６０ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）、０．２５μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２５μＬに、１００ｎｇになるようにマウスＫｉｄｎｅｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを添加し、６５℃、３０分の逆転写反応後、９５℃、２分の熱変性を行い、さらに９５℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、３０秒を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分の伸長反応を行うＰＣＲ条件で、サーマルサイクラーを用いて行った。
【0057】
【表4】
【0058】
図３は野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ、ＲＲ、ＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で７３４ｂｐを増幅させたＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。ＭｇＣｌ２を添加した場合、２つのアミノ酸に変異を入れた改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ、ＫＫ）のみバンドが確認できた。一方、ＭｎＣｌ２を添加した場合、すべてのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼでバンドが確認されなかった。これは野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼはＭｎ２＋存在下で逆転写活性が働くが、ポリメラーゼ活性はＭｇ２＋存在下でないと働かないため、ｃＤＮＡからＤＮＡの増幅が起こっておらず、バンドとして見えるレベルまで増幅されていない状態であると考えられる。
【0059】
これらの結果から、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の７４４番目と７４５番目のアミノ酸残基を両方置換した改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ、ＫＫ）は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ、アミノ酸残基ＥＡ）にはない、ＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性を有していることが確認された。また、７４４番目と７４５番目のアミノ酸のどちらか一方を置換した改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＡ、ＥＲ）ではバンドが確認されなかったことから、ＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性は、７４４番目と７４５番目のアミノ酸を両方置換することで得られた機能であると推察される。
【0060】
なお、実施例２および３のＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲ反応は、抗Ｔａｑ抗体を添加して行っている。抗Ｔａｑ抗体は、特異性や感度の向上を期待して添加したものである。発明者らは、抗Ｔａｑ抗体を添加しない場合も、実施例２および３と同様の結果が得られたことを確認している。
ＨｅＬａ細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ０．１ｎｇ～１００ｎｇを鋳型に、Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ（ＭｇＣｌ２存在下）でβ－ａｃｔｉｎ遺伝子の一部領域２９５ｂｐを増幅した。ＲＴ－ＰＣＲは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、ヒトβ-actin遺伝子の一部領域２９５ｂｂｐを増幅する０．４μＭのプライマー（５’－ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ－３’（配列番号２３）および５’－ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ－３’（配列番号２４））、６０ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または６５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）（ＷＴ＋ＲＲおよびＷＴ＋ＫＫは１：１で混合）、０．５μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２５μＬに、０．１、１、１０、１００ｎｇになるようにＨｅＬａ細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを添加し、６５℃、１０分の逆転写反応後、９５℃、２分の熱変性を行い、さらに９５℃、３０秒→６０℃、６０秒を４０サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、サーマルサイクラーを用いて行った。その結果、図３Ｂに示すように、反応液に抗体を添加すると、添加しない場合に比べて、鋳型が少なくても、増幅できることが示された。ＰＣＲ時の活性が強いＷＴを添加することで、抗体無しでは若干感度が上昇する。一方、抗体を添加するとＷＴ添加による効果は明確には認められなくなる。
ＨｅＬａ細胞ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ０．１ｎｇ～１００ｎｇを鋳型に、Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ（ＭｇＣｌ２存在下）でβ－ａｃｔｉｎ遺伝子の一部領域２９５ｂｐを増幅した。ＲＴ－ＰＣＲは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、０．５％ ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、ヒトβ-actin遺伝子の一部領域２９５ｂｂｐを増幅する０．４μＭのプライマー（５’－ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ－３’（配列番号２３）および５’－ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ－３’（配列番号２４））、６０ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または６５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）または６０ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）（ＷＴ＋ＲＲおよびＷＴ＋ＫＫは１：１で混合）、０．５μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２５μＬに、０．１、１、１０、１００ｎｇになるようにＨｅＬａ細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを添加し、６５℃、１０分の逆転写反応後、９５℃、２分の熱変性を行い、さらに９５℃、３０秒→６０℃、６０秒を４０サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、サーマルサイクラーを用いて行った。その結果、図３Ｂに示すように、反応液に抗体を添加すると、添加しない場合に比べて、鋳型が少なくても、増幅できることが示された。ＰＣＲ時の活性が強いＷＴを添加することで、抗体無しでは若干感度が上昇する。一方、抗体を添加するとＷＴ添加による効果は明確には認められなくなる。
【0061】
（実施例４）
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１ より ＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５０ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）、０．５μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｆ２（配列番号１８）、０．７μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｒ２（配列番号１９）、ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｐ２（配列番号２０）の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＴＡＭＲＡでそれぞれラベルした０．２μＭ ＴａｑＭａｎプローブ、４６ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または１５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）または２５．６ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）、０．１μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２０μＬに、ＴＥ（ｐＨ８．０）およびＮセットＮｏ．２の標的配列を含むプラスミドＤＮＡ（配列番号２１）をＳｓｐＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉで制限酵素処理した陽性コントロールＤＮＡ（Ｎ２セット用）を、５０コピー、５００コピー、５０００コピー、５００００コピーになるように添加し、９５℃、２０秒の熱変性を行い、さらに９５℃、３秒→６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemのRun Mode:Fast 7500を用いて行った。抗Ｔａｑ抗体を添加することにより、特異性や感度の向上という効果が得られると期待できる（特開２００８－１７７８７号公報）。
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１ より ＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５０ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）、０．５μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｆ２（配列番号１８）、０．７μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｒ２（配列番号１９）、ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｐ２（配列番号２０）の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＴＡＭＲＡでそれぞれラベルした０．２μＭ ＴａｑＭａｎプローブ、４６ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または１５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）または２５．６ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）、０．１μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２０μＬに、ＴＥ（ｐＨ８．０）およびＮセットＮｏ．２の標的配列を含むプラスミドＤＮＡ（配列番号２１）をＳｓｐＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉで制限酵素処理した陽性コントロールＤＮＡ（Ｎ２セット用）を、５０コピー、５００コピー、５０００コピー、５００００コピーになるように添加し、９５℃、２０秒の熱変性を行い、さらに９５℃、３秒→６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemのRun Mode:Fast 7500を用いて行った。抗Ｔａｑ抗体を添加することにより、特異性や感度の向上という効果が得られると期待できる（特開２００８－１７７８７号公報）。
【0062】
【表5】
【0063】
反応終了後、Threshold Line:0.5、Baseline:3cycle-15cycleで解析を行い、Ｃｔ値を算出した。各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの添加量は、あらかじめコントロールＤＮＡ ５００コピーを増幅させるリアルタイムＰＣＲを行い、各Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを添加した反応系が同じＣｔ値になるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの量（ＷＴ：４６ｎｇ、ＫＫ：１５ｎｇ、ＲＲ：２５．６ｎｇ）を添加した。
【0064】
図４に、ＭｇＣｌ２存在下、抗Ｔａｑ抗体存在下のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線の検量線を示す。
表６はそれぞれのＣｔ値およびＰＣＲ効率をまとめた結果を示す。
ＤＮＡ鋳型を段階希釈して作成した検量線からＰＣＲ増幅効率を計算した。ＰＣＲ増幅効率は８０から１２０％が適正範囲とされるが、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）と改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）はともに、適正範囲内のＰＣＲ増幅効率を有することが確認された。ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでは、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）と、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）との間に、Ｃｔ値やＰＣＲ効率に大きな差は認められなかった。
表６はそれぞれのＣｔ値およびＰＣＲ効率をまとめた結果を示す。
【表6】
【0065】
（実施例５）
ＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在かつ抗Ｔａｑ抗体を添加しない条件で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１ より ＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５０ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）、０．５μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｆ２（配列番号１８）、０．７μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｒ２（配列番号１９）、ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｐ２（配列番号２０）の５’末端をＦＡＭ、３‘末端をＴＡＭＲＡでそれぞれラベルした０．２μＭ ＴａｑＭａｎプローブ、４６ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または１５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）または２５．６ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）を含む反応液２０μＬに、ＤＷおよびＮセットＮｏ．２の標的配列を含む陽性コントロールＲＮＡ（配列番号２２）を５０コピー、５００コピー、５０００コピーになるように添加し、６５℃、１０分の逆転写反応後、９５℃、２０秒の熱変性を行い、さらに９５℃、３秒→６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemのRun Mode:Fast 7500を用いて行った。反応終了後、Threshold Line:0.5、Baseline:3cycle-15cycleで解析を行い、Ｃｔ値を算出した。
ＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在かつ抗Ｔａｑ抗体を添加しない条件で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１ より ＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５０ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）、０．５μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｆ２（配列番号１８）、０．７μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｒ２（配列番号１９）、ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｐ２（配列番号２０）の５’末端をＦＡＭ、３‘末端をＴＡＭＲＡでそれぞれラベルした０．２μＭ ＴａｑＭａｎプローブ、４６ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または１５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）または２５．６ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）を含む反応液２０μＬに、ＤＷおよびＮセットＮｏ．２の標的配列を含む陽性コントロールＲＮＡ（配列番号２２）を５０コピー、５００コピー、５０００コピーになるように添加し、６５℃、１０分の逆転写反応後、９５℃、２０秒の熱変性を行い、さらに９５℃、３秒→６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemのRun Mode:Fast 7500を用いて行った。反応終了後、Threshold Line:0.5、Baseline:3cycle-15cycleで解析を行い、Ｃｔ値を算出した。
【0066】
ＭｎＣｌ２存在下でのＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲでは、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）のいずれも増幅曲線が立ち上がらなかった（図６）。ＭｇＣｌ２存在下でのＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲでは、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）では増幅曲線が立ち上がらず、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）では５０コピーまで検出された（図５）。
【0067】
表７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系における、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ（ＭｇＣｌ２存在下）について、Ｃｔ値およびＰＣＲ効率をまとめた結果を示す。この結果より、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ、ＫＫ）は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）にはない、ＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性を有しており、ＭｇＣｌ２を含む反応液中でＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲに利用できることが確認された。
ＲＮＡ鋳型を段階希釈して作成した検量線からＰＣＲ増幅効率を計算した。ＰＣＲ増幅効率は８０から１２０％が適正範囲とされるが、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）は、適正範囲内のＰＣＲ増幅効率を有することが確認された。
【表7】
【0068】
（実施例６）
抗Ｔａｑ抗体を添加した条件でのＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ
本実施例では、実施例５と同じ鋳型およびプライマー並びにＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行ったが、抗Ｔａｑ抗体を反応液に添加した点が実施例５とは異なる。
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１に記載のＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５０ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）、０．５μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｆ２（配列番号１８）、０．７μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｒ２（配列番号１９）、ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｐ２（配列番号２０）の５’末端をＦＡＭ、３‘末端をＴＡＭＲＡでそれぞれラベルした０．２μＭ ＴａｑＭａｎプローブ、４６ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または１５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）または２５．６ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）、０．１μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２０μＬに、ＤＷおよびＮセットＮｏ．２の標的配列を含む陽性コントロールＲＮＡ（配列番号２２）を５０コピー、５００コピー、５０００コピー、５００００コピーになるように添加し、６５℃、１０分の逆転写反応後、９５℃、２０秒の熱変性を行い、さらに９５℃、３秒→６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemのRun Mode:Fast 7500を用いて行った。反応終了後、Threshold Line:0.5、Baseline:3cycle-15cycleで解析を行い、Ｃｔ値を算出した。
抗Ｔａｑ抗体を添加した条件でのＭｇＣｌ ２ またはＭｎＣｌ ２ 存在下でＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ
本実施例では、実施例５と同じ鋳型およびプライマー並びにＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行ったが、抗Ｔａｑ抗体を反応液に添加した点が実施例５とは異なる。
実施例１で作製した野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよび改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２存在下で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１に記載のＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５０ｍＭ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２または２ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．１×ＲＯＸ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ニッポンジーン）、０．５μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｆ２（配列番号１８）、０．７μＭのプライマーＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｒ２（配列番号１９）、ＮＩＩＤ＿２０１９－ｎＣＯＶ＿Ｎ＿Ｐ２（配列番号２０）の５’末端をＦＡＭ、３‘末端をＴＡＭＲＡでそれぞれラベルした０．２μＭ ＴａｑＭａｎプローブ、４６ｎｇの野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）または１５ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ）または２５．６ｎｇの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ）、０．１μｇの抗Ｔａｑ抗体を含む反応液２０μＬに、ＤＷおよびＮセットＮｏ．２の標的配列を含む陽性コントロールＲＮＡ（配列番号２２）を５０コピー、５００コピー、５０００コピー、５００００コピーになるように添加し、６５℃、１０分の逆転写反応後、９５℃、２０秒の熱変性を行い、さらに９５℃、３秒→６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返すＰＣＲ条件で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemのRun Mode:Fast 7500を用いて行った。反応終了後、Threshold Line:0.5、Baseline:3cycle-15cycleで解析を行い、Ｃｔ値を算出した。
【0069】
ＭｎＣｌ２存在下でのＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲでは、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）のいずれも増幅曲線が立ち上がらなかった（図８）。ＭｇＣｌ２存在下でのＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲでは、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）では増幅曲線が立ち上がらず、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）では５０コピーまで検出された（図７）。
【0070】
表８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出系における、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ（ＭｇＣｌ２存在下）について、Ｃｔ値およびＰＣＲ効率をまとめた結果を示す。この結果より、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ、ＫＫ）は、野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）にはない、ＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性を有しており、ＭｇＣｌ２を含む反応液中でＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲに利用できることが確認された。
ＲＮＡ鋳型を段階希釈して作成した検量線からＰＣＲ増幅効率を計算した。ＰＣＲ増幅効率は８０から１２０％が適正範囲とされるが、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＲＲ）は、適正範囲内のＰＣＲ増幅効率を有することが確認された。
抗Ｔａｑ抗体を添加した条件でも、実施例５と同等の結果が得られたので、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ、ＫＫ）が持つＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性は、抗Ｔａｑ抗体の有無に影響されないことが確認された。
【表8】
抗Ｔａｑ抗体を添加した条件でも、実施例５と同等の結果が得られたので、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＲ、ＫＫ）が持つＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性は、抗Ｔａｑ抗体の有無に影響されないことが確認された。
【0071】
（実施例７）
位置６８３に更なるアミノ酸置換を有する改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ
配列番号５のアミノ酸配列の７４４番目と７４５番目のアミノ酸残基ＥＡのＫＫへの置換に加えて、６８３番目に更に置換を有する改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを作成し、精製した。ＫＫＫ、ＹＫＫ、ＬＫＫ発現ベクターは、東洋紡のキット（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を使って作製した。発現ベクターの作成は、キットの製造元の説明書に従って行い、サイクル数は５サイクルに変更し、プライマーは表９に記載のものを用いた。精製は、実施例１に記載のとおりに行った。
以下において、６８３番目の置換がＫ、Ｌ、Ｙの改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれＫＫＫ、ＬＫＫ、ＹＫＫという。
位置６８３に更なるアミノ酸置換を有する改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ
配列番号５のアミノ酸配列の７４４番目と７４５番目のアミノ酸残基ＥＡのＫＫへの置換に加えて、６８３番目に更に置換を有する改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを作成し、精製した。ＫＫＫ、ＹＫＫ、ＬＫＫ発現ベクターは、東洋紡のキット（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を使って作製した。発現ベクターの作成は、キットの製造元の説明書に従って行い、サイクル数は５サイクルに変更し、プライマーは表９に記載のものを用いた。精製は、実施例１に記載のとおりに行った。
【表9】
【0072】
野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫ、ＫＫＫ）を用いて、ＭｇＣｌ２存在下で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系（国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．９．１に記載のＮセットＮｏ．２（Ｎ２セット））によるＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。装置は、ProFlexTM PCR System（Thermo Fisher scientific）を用いた。
反応液の組成（終濃度）は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、００２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２５０ｍＭ トレハロース、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｘＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ１ｎｇ／ｍｌ（ＫＫ：１ｎｇ／ｍｌ 改変型Ｔｔｈ（ＫＫ）；ＫＫ＋ＷＴ：０．５ｎｇ／ｍｌ 改変型Ｔｔｈ（ＫＫ）＋０．５ｎｇ／ｍｌ 野生型Ｔｔｈ；ＫＫＫ＋ＷＴ：０．５ｎｇ／ｍｌ 改変型Ｔｔｈ（ＫＫＫ＋０．５ｎｇ／ｍｌ 野生型Ｔｔｈ）を含む。鋳型は、不活化コロナウイルスを唾液で１０００倍希釈したサンプルから、ＩＳＯＳＰＩＮ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡを用いて抽出した精製ＲＮＡを用いた。
表１０に示すプライマーを用いた。
ＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲサイクルは以下のとおりである。
反応終了後、反応液について３％アガロース Ｓ／ＴＡＥゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下で目的ＤＮＡ断片の増幅の有無を確認した。
反応液の組成（終濃度）は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、００２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２５０ｍＭ トレハロース、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｘＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ１ｎｇ／ｍｌ（ＫＫ：１ｎｇ／ｍｌ 改変型Ｔｔｈ（ＫＫ）；ＫＫ＋ＷＴ：０．５ｎｇ／ｍｌ 改変型Ｔｔｈ（ＫＫ）＋０．５ｎｇ／ｍｌ 野生型Ｔｔｈ；ＫＫＫ＋ＷＴ：０．５ｎｇ／ｍｌ 改変型Ｔｔｈ（ＫＫＫ＋０．５ｎｇ／ｍｌ 野生型Ｔｔｈ）を含む。鋳型は、不活化コロナウイルスを唾液で１０００倍希釈したサンプルから、ＩＳＯＳＰＩＮ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡを用いて抽出した精製ＲＮＡを用いた。
表１０に示すプライマーを用いた。
【表10】
【0073】
図９に結果を示す。野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）および改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫＫ）を組み合わせて用いた場合（ＷＴ＋ＫＫＫ）には、ゲル電気泳動で鋳型の増幅サイズ６７ｂｐにバンドが確認された。夾雑核酸を多く含む試料（例えば、唾液由来試料から抽出したＲＮＡなど）では、特異性の低下が認められる場合があったが、ＷＴ＋ＫＫＫでは、ゲル電気泳動で非特異的増幅バンドが出現せず、目的の鋳型が増幅された。これは、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＫＫ）では、ＭｇＣｌ２存在下での逆転写活性が維持されているが、ＤＮＡポリメラーゼ活性が低下していることにより、非特異的核酸の増幅が抑制されたためであると考えられる。
【0074】
さらに、改変型ＫＫＫ、ＬＫＫおよびＹＫＫのＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、マウス腎臓から抽出したトータルＲＮＡから、β－ａｃｔｉｎの一部７３４ｂｐを増幅させた。用いたプライマーおよびサイクルは実施例３と同じである。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、２０μＬでおこなった。Ｂｕｆｆｅｒ組成（終濃度）は、以下のとおりである：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ トレハロース、ｄＮＴＰ：各０．２ｍＭ。用いた酵素量は、４０ｎｇである。
図１０は、β－ａｃｔｉｎの一部７３４ｂｐを増幅させたＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。結果として、いずれの改変体も、ＰＣＲ活性が弱まっていることを確認した。改変体ＫＫのＥ６８３変異により、逆転写活性を維持したままＰＣＲ活性が弱まるという特徴を持つ酵素になったことが示唆された。
図１０は、β－ａｃｔｉｎの一部７３４ｂｐを増幅させたＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。結果として、いずれの改変体も、ＰＣＲ活性が弱まっていることを確認した。改変体ＫＫのＥ６８３変異により、逆転写活性を維持したままＰＣＲ活性が弱まるという特徴を持つ酵素になったことが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【0075】
配列番号１：改変ｐＥＴ１５ｂ２
配列番号２および３：Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのクローニングに用いたプライマー
配列番号４：Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列
配列番号５：Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列
配列番号６から１３：改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの作製に用いたプライマー
配列番号１４および１５：λＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号１６および１７：マウスβ-actin遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマー
配列番号１８から２０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系のプライマー
配列番号２１：ＮセットＮｏ．２の標的配列を含むプラスミドＤＮＡ
配列番号２２：ＮセットＮｏ．２の標的配列を含む陽性コントロールＲＮＡ
配列番号２３および２４：ヒトβ-actin遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマー
配列番号２５から２８：改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの作製に用いたプライマー
配列番号２９および３０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系のプライマー
配列番号２および３：Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのクローニングに用いたプライマー
配列番号４：Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの塩基配列
配列番号５：Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列
配列番号６から１３：改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの作製に用いたプライマー
配列番号１４および１５：λＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号１６および１７：マウスβ-actin遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマー
配列番号１８から２０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系のプライマー
配列番号２１：ＮセットＮｏ．２の標的配列を含むプラスミドＤＮＡ
配列番号２２：ＮセットＮｏ．２の標的配列を含む陽性コントロールＲＮＡ
配列番号２３および２４：ヒトβ-actin遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマー
配列番号２５から２８：改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの作製に用いたプライマー
配列番号２９および３０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する検出系のプライマー
【要約】
本発明の課題は、逆転写活性を有する新規熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ改変体を提供することである。本発明によれば、Ｍｇ２＋存在下で逆転写反応を触媒する活性を有し、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有しかつ位置７４４および７４５の両方が正電荷を持つアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼが提供される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図5-5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10】
【配列表】