特許 7181082 分子パージバルブを有するグルコース代謝

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-21

(45)【発行日】2022-11-30

(54)【発明の名称】分子パージバルブを有するグルコース代謝

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20221122BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221122BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221122BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221122BHJP

   C12P 7/50 20060101ALI20221122BHJP

   C12P 7/26 20060101ALI20221122BHJP

   C12P 19/32 20060101ALI20221122BHJP

   C12P 7/16 20060101ALI20221122BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/90 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/04 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/92 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/06 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20221122BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20221122BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

C12P7/50

C12P7/26

C12P19/32 B

C12P7/16

C12N15/09 Z

C12N15/09 ZNA

C12N9/12

C12N9/90

C12N9/04 D

C12N9/92

C12N9/10

C12N9/16 Z

C12N9/16 B

C12N9/06 Z

C12N9/02

C12N9/24

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2018502808

(86)(22)【出願日】2016-07-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-07-26

(86)【国際出願番号】 US2016043260

(87)【国際公開番号】W WO2017015429

(87)【国際公開日】2017-01-26

【審査請求日】2019-07-18

(31)【優先権主張番号】62/195,142

(32)【優先日】2015-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ボウイ，ジェームズ，ユー．

(72)【発明者】

【氏名】コーマン，タイラー，ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ジノース，ポール，エイチ．

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／１５３０３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１１／０９００５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】OPGENORTH, P. H. et al.，A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance，Nature Communications，2014年，Vol.5，Article number: 4113

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基質をアセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、又はアセチル-CoAに変換する複数の酵素的工程を含む、組換えの代謝経路の無細胞システムであって、該経路が補助因子の不均衡な産生及び利用を含み、該経路が該補助因子をリサイクルする非天然の経路を含み、該非天然の経路が、(i)NADP⁺を利用する酵素、(ii)該酵素の変異体であって、NAD⁺を利用する変異体、及び(iii)NADH/NADPHオキシダーゼを含み、(i)の酵素がグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ及び／又は6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼであり、該経路がグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ及び6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを含むペントースリン酸経路の酵素を含む、無細胞システム。

【請求項2】

前記NADH/NADPHオキシダーゼが配列番号18と少なくとも90%同一の配列を含み、NADH/NADPHオキシダーゼ活性を有する、請求項1に記載の組換えの無細胞システム。

【請求項3】

前記経路が以下:
(i)グルコースをグルコース-6-リン酸に変換すること、
(ii)グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換すること、
(iii)6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換すること、
(iv)6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換すること、
(v)リブロース-5-リン酸をキシルロース-5-リン酸に変換すること、
(vi)キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸及びアセチルリン酸に変換すること、
(vii)フルクトース-6-リン酸からアセチルリン酸及びエリトロース-4-リン酸(E4P)を産生すること、
(viii)グリセルアルデヒド-3-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸に変換すること又はその逆、
(ix)グリセルアルデヒド-3-リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸をフルクトース-1,6-ビスリン酸に変換すること、並びに
(x)フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸及びポリリン酸に変換すること
を行う、請求項1に記載の無細胞システム。

【請求項4】

以下の酵素:
(a)ホスホケトラーゼ(F/Xpk又はXfp)、
(b)トランスアルドラーゼ(Tal)、
(c)トランスケトラーゼ(Tkt)、
(d)リボース-5-リン酸イソメラーゼ(Rpi)、
(e)リブロース-5-リン酸エピメラーゼ(Rpe)、
(f)トリオースリン酸イソメラーゼ(Tpi)、
(g)フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(Fba)、
(h)グルコキナーゼ(Glk)、
(i)グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf)、
(j)6-ホスホ-グルコノラクトナーゼ(pgl)、
(k)6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)、
(l)ホスホグルコイソメラーゼ(Pgi)、及び
(m)ホスホフルクトキナーゼ(pfk)
を含む、請求項1に記載の無細胞システム。

【請求項5】

経路の酵素が微生物中で発現され、続いて微生物が溶解されて、経路の酵素を含む無細胞調製物が作製される、請求項1に記載の無細胞システム。

【請求項6】

前記微生物が原核生物又は真核生物である、請求項5に記載の無細胞システム。

【請求項7】

前記微生物が酵母である、請求項6に記載の無細胞システム。

【請求項8】

前記微生物が原核生物である、請求項6に記載の無細胞システム。

【請求項9】

前記微生物が大腸菌微生物である、請求項8に記載の無細胞システム。

【請求項10】

前記経路が、ヌクレオシド三リン酸又は二リン酸をヌクレオシド二リン酸又は一リン酸にそれぞれ変換する酵素を含む、請求項1に記載の無細胞システム。

【請求項11】

前記経路がATP又はGTPをリサイクルする、請求項10に記載の無細胞システム。

【請求項12】

前記経路がヌクレオシド三リン酸加水分解活性を有するポリペプチドを含む、請求項10に記載の無細胞システム。

【請求項13】

前記ポリペプチドがMnmE、FtsZ、及びMcrBCからなる群から選択される、請求項12に記載の無細胞システム。

【請求項14】

前記MnmEポリペプチドが、配列番号34又は36と少なくとも90%同一の配列を含み、三リン酸加水分解活性を有する、請求項13に記載の無細胞システム。

【請求項15】

前記FtsZポリペプチドが、配列番号38と少なくとも90%同一の配列を含み、三リン酸加水分解活性を有する、請求項13に記載の無細胞システム。

【請求項16】

前記McrBCが、配列番号40と少なくとも90%同一の配列を含み、三リン酸加水分解活性を有する、請求項13に記載の無細胞システム。

【請求項17】

前記経路がグルコースからアセチル-coAを産生する、請求項1に記載の無細胞システム。

【請求項18】

前記経路が以下：
(a)配列番号19と少なくとも90%同一の配列を有し、グルコースをグルコース-6-リン酸に変換するグルコキナーゼ、
(b)配列番号22又は24と少なくとも90%同一であり、グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、
(c)配列番号18と少なくとも90%同一の配列を有し、NAD(P)HをNAD(P)⁺に変換するNAD(P)Hオキシダーゼ、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一の配列を有し、6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換する6-ホスホグルコノラクトナーゼ、
(e)配列番号27と少なくとも90%同一の配列を有し、6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換する6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、
(f)配列番号6と少なくとも90%同一の配列を有し、リブロース-5-リン酸をキシルロース-5-リン酸に変換するリブロース-5-リン酸エピメラーゼ、
(g)配列番号8と少なくとも90%同一の配列を有し、リブロース-5-リン酸をリボース-5-リン酸に変換するリボース-5-リン酸イソメラーゼ、
(h)配列番号2又は55と少なくとも90%同一の配列を有し、(1)キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸に及び/又は(2)フルクトース-6-リン酸をエリトロース-4-リン酸に変換するキシルロース-5-リン酸/フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ、
(i)配列番号57と少なくとも90%同一であり、フルクトース-6-リン酸をグルコース-6-リン酸に変換するグルコース-6-リン酸イソメラーゼ、
(j)配列番号20、52又は53と少なくとも90%同一であり、フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸に変換するホスホフルクトキナーゼ、
(k)配列番号16又は51と少なくとも90%同一であり、グリセルアルデヒド-3-リン酸をフルクトース-1,6-ビス-リン酸に及び/又はフルクトース-1,6-ビス-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸に変換するフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ、
(l)配列番号14と少なくとも90%同一であり、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸に変換するトリオースリン酸イソメラーゼ、
(m)配列番号10と少なくとも90%同一であり、エリトロース-4-リン酸及びフルクトース-6-リン酸を含む基質からセドヘプツロース-7-リン酸を産生するトランスアルドラーゼ、
(n)配列番号12と少なくとも90%同一であり、(1)セドヘプツロース-7-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸からのリボース-5-リン酸及びキシルロース-5-リン酸;並びに/又は(2)キシルロース-5-リン酸及びエリトロース-4-リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸及びフルクトース-6-リン酸、を含む代謝物を産生するトランスケトラーゼ、並びに
(o)配列番号56と少なくとも90%同一であり、アセチルリン酸をアセチル-CoAに変換するホスホトランスアセチラーゼ
を含む、請求項17に記載の無細胞システム。

【請求項19】

n-ブタノール、n-ヘキサノール、ヘキサン酸、アセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシブチリル-CoA、及び/又はPhBの産生のための酵素を更に含み得る、請求項18に記載の無細胞システム。

【請求項20】

AtoB、Hbd、Crt、Ter、BktB、及びAdhEからなる群から選択される1種以上の酵素を更に含む、請求項19に記載の無細胞システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年7月21日に出願された米国仮出願第62/195,142号の優先権を主張する。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国エネルギー省によって授与された契約番号第DE-AR0000556号の下で、政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【0003】

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、Sequencelisting_ST25.txtと名付けたファイルとして提供され、2016年7月21日に作成され、サイズは273Kbである。配列表の電子フォーマット内の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

本開示は、好適な基質を本開示の酵素調製物と接触させることにより化学物質を産生するための組成物、経路及び方法を提供する。

【背景技術】

【0005】

ピルビン酸は、細胞増殖、並びに脂肪酸、ポリケチド、アミノ酸、イソプレノイド、及びアルコールを含む複数の細胞構成成分及び産物の生合成の両方の鍵となる中心代謝物である。典型的には、エムデン-マイヤーホフ-パルナス(EMP)経路、エントナー-ドドゥロフ(ED)経路及びそれらの変化形が使用され、ピルビン酸の酸化的脱炭酸反応によって糖からアセチル-CoAを産生する。同様に、CBB、RuMP、及びDHA経路は、C₁化合物、例えばCO₂及びメタノールを取り込み、糖リン酸及びピルビン酸を合成し、次いでピルビン酸の脱炭酸反応によってアセチル-CoAを産生する。したがって、C₁取り込みのために糖-リン酸依存的経路を使用する全ての従属栄養生物及び独立栄養生物において、アセチル-CoAはピルビン酸の酸化的脱炭酸反応に由来する。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、基質をアセチルリン酸、ピルビン酸、又はアセチル-CoAに変換する複数の酵素的工程を含む、組換えの、人工的な、又は操作された代謝経路であって、経路が補助因子の不均衡な産生及び利用を含み、経路が補助因子をリサイクルする非天然のパージバルブ経路を含み、パージバルブ経路が、複数の酵素的工程の1つ以上において補助因子を使用して代謝物を中間体又は産物に変換する酵素を含む、組換えの、人工的な、又は操作された代謝経路を提供する。一実施形態では、補助因子は酸化/還元補助因子である。更なる実施形態では、酸化/還元補助因子はNAD⁺/NADH、NADP⁺/NADPH又はFAD⁺/FADHである。先に記載のいずれかの更なる実施形態では、第一の補助因子はNAD⁺/NADHを含み、第二の補助因子はNADP⁺/NADPHを含む。別の実施形態では、第一の補助因子はADP/ATPを含み、第二の補助因子は異なるヌクレオチド三リン酸(例えば、GDP/GTP、CDP/CTP、又はTDP/TTP)を含む。先に記載のいずれかの更なる実施形態では、パージバルブ経路はNADHオキシダーゼを含む。更なる実施形態では、NADHオキシダーゼはNoxE又はその相同体である。更なる実施形態では、NADHオキシダーゼは配列番号18と少なくとも50%同一の配列を含む。別の実施形態では、経路は以下の反応を行う:(i)グルコースをグルコース-6-リン酸に変換する;(ii)グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換する;(iii)6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換する;(iv)6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換する;(v)リブロース-5-リン酸をキシルロース-5-リン酸に変換する;(vi)キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸及びアセチルリン酸に変換する;(vii)フルクトース-6-リン酸からアセチルリン酸及びエリトロース-4-リン酸(E4P)を産生する;(viii)グリセルアルデヒド-3-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸に変換する又はその逆;(ix)グリセルアルデヒド-3-リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸をフルクトース-1,6-ビスリン酸に変換する;並びに(x)フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸及びポリリン酸に変換する。更なる実施形態では、経路は以下の酵素を含む:(a)ホスホケトラーゼ(F/Xpk又はXfp);(b)トランスアルドラーゼ(Tal);(c)トランスケトラーゼ(Tkt);(d)リボース-5-リン酸イソメラーゼ(Rpi);(e)リブロース-5-リン酸エピメラーゼ(Rpe);(f)トリオースリン酸イソメラーゼ(Tpi);(g)フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(Fba);(h)グルコキナーゼ(Glk);(i)グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf);(j)6-ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl);(k)6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd);(l)ホスホグルコイソメラーゼ(Pgi);及び(m)ホスホフルクトキナーゼ(pfk)。先に記載の実施形態のいずれかの別の実施形態では、経路は無細胞システムである。更に別の実施形態では、経路は微生物中で操作され、発現される。更なる実施形態では、微生物は原核生物又は真核生物である。更なる実施形態では、微生物は酵母である。更なる実施形態では、微生物は原核生物である。更なる実施形態では、微生物は大腸菌(E.coli)微生物由来である。別の実施形態では、パージバルブ経路は、ヌクレオシド三リン酸又は二リン酸をそれぞれヌクレオシド二リン酸又は一リン酸に変換する酵素を含む。更なる実施形態では、パージバルブ経路はATPをリサイクルする。別の実施形態では、経路はグルコースからアセチル-coAを産生する。更なる実施形態では、経路は無細胞システムであり、以下を含む:(a)配列番号19と少なくとも85%同一の配列を有し、グルコースをグルコース-6-リン酸に変換するグルコキナーゼ;(b)配列番号22又は24と少なくとも85%同一であり、グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ;(c)配列番号18と少なくとも85%同一の配列を有し、NAD(P)HをNAD(P)⁺に変換するNAD(P)Hオキシダーゼ;(d)配列番号26と少なくとも85%同一の配列を有し、6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換する6-ホスホグルコノラクトナーゼ;(e)配列番号27と少なくとも85%同一の配列を有し、6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換する6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ;(f)配列番号6と少なくとも85%同一の配列を有し、リブロース-5-リン酸をキシルロース-5-リン酸に変換するリブロース-5-リン酸エピメラーゼ;(g)配列番号8と少なくとも85%同一の配列を有し、リブロース-5-リン酸をリボース-5-リン酸に変換するリボース-5-リン酸イソメラーゼ;(h)配列番号2又は55と少なくとも85%同一の配列を有し、(1)キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸に及び/又は(2)フルクトース-6-リン酸をエリトロース-4-リン酸に変換するキシルロース-5-リン酸/フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ;(i)配列番号57と少なくとも85%同一であり、フルクトース-6-リン酸をグルコース-6-リン酸に変換するグルコース-6-リン酸イソメラーゼ;(j)配列番号20、52又は53と少なくとも85%同一であり、フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸に変換するホスホフルクトキナーゼ;(k)配列番号16又は51と少なくとも85%同一であり、グリセルアルデヒド-3-リン酸をフルクトース-1,6-ビス-リン酸に及び/又はフルクトース-1,6-ビス-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸に変換するフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ;(l)配列番号14と少なくとも85%同一であり、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸に変換するトリオースリン酸イソメラーゼ;(m)配列番号10と少なくとも85%同一であり、エリトロース-4-リン酸及びフルクトース-6-リン酸を含む基質からセドヘプツロース-7-リン酸を産生するトランスアルドラーゼ;(n)配列番号12と少なくとも85%同一であり、(1)セドヘプツロース-7-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸からのリボース-5-リン酸及びキシルロース-5-リン酸;並びに/又は(2)キシルロース-5-リン酸及びエリトロース-4-リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸及びフルクトース-6-リン酸を含む代謝物を産生するトランスケトラーゼ;及び(o)配列番号56と少なくとも85%同一であり、アセチルリン酸からアセチル-CoAに変換するホスホトランスアセチラーゼ。更なる実施形態では、無細胞システムは、n-ブタノール、n-ヘキサノール、ヘキサン酸、アセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシブチリル-CoA、及び/又はPhBの産生のための酵素を更に含み得る。更なる実施形態では、経路は、AtoB、Hbd、Crt、Ter、BktB、及びAdhEからなる群から選択される1種以上の酵素を更に含む。一実施形態では、作動中にグルコース2分子がサイクルに入り、グルコキナーゼの作用によってATP2分子を消費して、グルコース-6-リン酸(G6P)に変換される。次いでサイクルの第一相は酸化の分岐を通過し、G6P2分子がキシルロース-5-リン酸(X5P)2分子に分解し、このプロセス中にNAD(P)H 4分子を産生する。サイクルの第二相では、ビフィドバクテリウムシャントからのX5Pホスホケトラーゼ(Xfp)は、X5P 2分子をアセチルリン酸2分子及びグリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P) 2分子に分ける。アセチルリン酸は、続いてホスホトランスアセチラーゼ(Pta)によってアセチル-CoAに変換され、次いで更なる化学物質(例えば、PHB、n-ブタノール、n-ヘキサノール等)の産生のための炭素ビルディングブロックとして使用されるが、G3Pは第三相でリサイクルされる。第三相では、解糖系の酵素を使用して、G3P 2分子(インプットG6P 2分子から)がフルクトースビスリン酸アルドラーゼ(Fba)によってフルクトース-1,6-ビスリン酸(FBP)へと縮合され、次いでリサイクルされてG6Pへと戻り、ホスホフルクトキナーゼB(PfkB)の逆反応を介するプロセス中にATP 1分子を作製する。効率的なATPリサイクルPfkBの同定を本明細書に記載する。産生されたATPは、次いでグルコキナーゼによって消費され、グルコースの別の分子をG6Pとしてサイクルに入れ、サイクルを完了する。全体として、PBGサイクルは、各グルコース分子につきアセチル-CoA 2分子、NAD(P)H 4分子、及び0個のATPを産生し、CO₂の放出により炭素の理論的なモル収率66.6%をもたらす。NAD(P)Hレベルを制御する2つのパージバルブ及び(ii)Xfp酵素の複特異性（promiscuity）を説明する代謝物サルベージ経路が含まれる。

【0007】

本開示は、図面、配列、及び説明を参照して本明細書に実質的に記載されるように本発明を提供する。一実施形態では、本開示は、図1A-Bに記載したようなin vitro又は組換えin vivo経路を提供する。

【0008】

本開示の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。

【0009】

本明細書に組込まれる、及び本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示の1つ以上の実施形態を例示し、詳細な説明と共に、本発明の原理及び実行を説明するために機能する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】本開示の代謝経路を示す図である。(A)本開示のペントース-ビフィド-解糖系(PGB)経路の概要を示す。(B)本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(C)NAD(P)H及びATPパージバルブシステムを含む本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(D)PBG経路の概要を示す(リン酸は略して「P」で示す)。PBGサイクルは、ペントースリン酸経路、ビフィドバクテリウムシャント、及び解糖系経路の初めの半分からの構成要素からなる。PBGサイクルは、アセチル-CoAを産生し、それはPHBバイオプラスチックへの変換のためのPHB経路に入る。Xfp酵素は二重特異性を有し、フルクトース-6-リン酸に作用して望ましくない副産物エリトロース-4-リン酸を産生するため、サルベージ経路が加えられ、エリトロース-4-リン酸をサイクルへ再進入させる。PBGサイクルは、NAD(P)Hレベルを維持するために使用される、星印で強調した2つのパージバルブを用いる。

【図1B】本開示の代謝経路を示す図である。(A)本開示のペントース-ビフィド-解糖系(PGB)経路の概要を示す。(B)本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(C)NAD(P)H及びATPパージバルブシステムを含む本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(D)PBG経路の概要を示す(リン酸は略して「P」で示す)。PBGサイクルは、ペントースリン酸経路、ビフィドバクテリウムシャント、及び解糖系経路の初めの半分からの構成要素からなる。PBGサイクルは、アセチル-CoAを産生し、それはPHBバイオプラスチックへの変換のためのPHB経路に入る。Xfp酵素は二重特異性を有し、フルクトース-6-リン酸に作用して望ましくない副産物エリトロース-4-リン酸を産生するため、サルベージ経路が加えられ、エリトロース-4-リン酸をサイクルへ再進入させる。PBGサイクルは、NAD(P)Hレベルを維持するために使用される、星印で強調した2つのパージバルブを用いる。

【図1C】本開示の代謝経路を示す図である。(A)本開示のペントース-ビフィド-解糖系(PGB)経路の概要を示す。(B)本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(C)NAD(P)H及びATPパージバルブシステムを含む本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(D)PBG経路の概要を示す(リン酸は略して「P」で示す)。PBGサイクルは、ペントースリン酸経路、ビフィドバクテリウムシャント、及び解糖系経路の初めの半分からの構成要素からなる。PBGサイクルは、アセチル-CoAを産生し、それはPHBバイオプラスチックへの変換のためのPHB経路に入る。Xfp酵素は二重特異性を有し、フルクトース-6-リン酸に作用して望ましくない副産物エリトロース-4-リン酸を産生するため、サルベージ経路が加えられ、エリトロース-4-リン酸をサイクルへ再進入させる。PBGサイクルは、NAD(P)Hレベルを維持するために使用される、星印で強調した2つのパージバルブを用いる。

【図1D】本開示の代謝経路を示す図である。(A)本開示のペントース-ビフィド-解糖系(PGB)経路の概要を示す。(B)本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(C)NAD(P)H及びATPパージバルブシステムを含む本開示のグルコース分解経路の概要を示す。(D)PBG経路の概要を示す(リン酸は略して「P」で示す)。PBGサイクルは、ペントースリン酸経路、ビフィドバクテリウムシャント、及び解糖系経路の初めの半分からの構成要素からなる。PBGサイクルは、アセチル-CoAを産生し、それはPHBバイオプラスチックへの変換のためのPHB経路に入る。Xfp酵素は二重特異性を有し、フルクトース-6-リン酸に作用して望ましくない副産物エリトロース-4-リン酸を産生するため、サルベージ経路が加えられ、エリトロース-4-リン酸をサイクルへ再進入させる。PBGサイクルは、NAD(P)Hレベルを維持するために使用される、星印で強調した2つのパージバルブを用いる。

【図2A-1】本開示の例示的なパージバルブ設計及びシステムを示す図である。

【図2A-2】本開示の例示的なパージバルブ設計及びシステムを示す図である。

【図2A-3】本開示の例示的なパージバルブ設計及びシステムを示す図である。

【図2A-4】本開示の例示的なパージバルブ設計及びシステムを示す図である。

【図2B】本開示の例示的なパージバルブ設計及びシステムを示す図である。

【図3】本開示の経路の設計及び開発の概略を示す図である。

【図4】本開示の経路の設計及び開発の概略を示す図である。

【図5】パージバルブシステムを使用したグルコースから産物への変換に関して得たデータを示す図である。

【図6】アセチルリン酸及びアセチル-CoAを様々な化学物質及びバイオ燃料に変換するための更なる酵素及び経路を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用する場合、単数形「a」、「and」及び「the」は、文脈により他にはっきりと示さない限り、複数形の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド(a polynucleotide)」という言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド(the polypeptide)」という言及は、1つ以上のポリペプチドへの言及を含む等である。

【0012】

他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料は、開示した方法及び組成物の実施において使用され得るが、例示的な方法、装置及び材料が本明細書に記載される。

【0013】

また、「又は」の使用は、他に述べない限り「及び/又は」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含む(including)」は、交換可能であり、限定することを意図しない。

【0014】

様々な実施形態の記載が用語「含む(comprising)」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例では、実施形態は言葉「本質的に～からなる」又は「～からなる」を使用して代わりに記載され得ることを理解するであろうと更に理解される。

【0015】

上述及び本文において考察されている任意の公開物は、本出願の出願日より前にそれらが開示されたものとしてのみ提供される。本明細書のいずれの記載も、本発明者らが先の開示のためにそのような開示に先行する権利がないと承認するものと解釈されるべきではない。

【0016】

in vitroでの自己調節合成生化学経路のアセンブリーは、バイオマスからの低価値/大容量の化学製品の高収率産生の代替触媒として大きな可能性を有している。本開示は、合成生化学と呼ばれる、in vitro及びin vivoでの代謝工学を提供し、ここで中心代謝の解糖系経路は解体され、次いで高収率で有用な化合物を産生し得る同化経路によりin vitroで再構築される。記載した合成生化学システムでは、解糖系からの還元当量、ATP、及び炭素が同化経路を通して送られ、グルコースからアセチルリン酸、ピルビン酸、及びアセチル-CoAを産生する。in vitro経路の実行には、NAD⁺及びNADP⁺特異的酵素(すなわち野生型及び/又は変異型)、並びにNADHオキシダーゼ、NoxEからなる分子パージバルブを使用し、連続的な炭素フラックスを可能にしながら適切なNADP⁺/NADPH補助因子均衡を維持する。このパージバルブ概念は中心代謝における他のNAD(P)H生成工程に容易に移すことができる(例えば、図2参照)。同様に、ATPパージバルブシステムはADPを再生するのに利用され得る。図1CはGTPアーゼ酵素を利用する1つのそのような経路を示す。

【0017】

一般概念を図3及び4に概略的に図示する。この一般概念は、図4において、(i)補助因子均衡を含む、異化及び同化経路を設計すること、(ii)適切な酵素を選択すること(例えば、クローニング、発現及び単離)、並びに(iii)酵素を補助因子及び基質と混合し、反応を行うものとして特徴付けられる。

【0018】

本開示は、グルコース又は他の好適な炭素源からのピルビン酸又はアセチル-CoAの産生のための方法及び組成物(無細胞システムを含む)を提供する。

【0019】

図1A～Dに示した経路では、例えばグルコース(Glu)はインプット分子であり、これはグルコキナーゼ(Glk)(例えば、配列番号19で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)を使用してグルコース-6-リン酸(G6P)に変換される。G6Pは、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf又はその変異型;例えば、配列番号22、23及び24参照)によって6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換される。Zwf酵素の1種又は組合せが使用され得る。一実施形態では、NADP⁺を補助因子として使用する野生型Zwfが使用される。別の実施形態では、NAD⁺を補助因子として使用する変異型Zwf(mZwf:例えば、A47D変異を有する;配列番号24参照)が使用される。更に別の実施形態では、ZwfとmZwfの組合せが使用される。NAD⁺を優先的に使用する変異型Zwfが使用される場合、NADHを特異的に酸化するがNADPHは酸化しない水生成NADHオキシダーゼ(NoxE;例えば、配列番号18で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)を含む分子パージバルブが、NADHをリサイクル(「パージ」)するために使用され得る。6-ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl;例えば、配列番号26で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)は、6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換する。次いで、6-ホスホ-D-グルコン酸は6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd;例えば、配列番号27で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)又はその変異型によって、CO₂の放出と共に、リブロース-5-リン酸に変換される。Gnd酵素の1種又は組合せが使用され得る。一実施形態では、補助因子としてNADP⁺を使用する野生型Gndが使用される。別の実施形態では、補助因子としてNAD⁺を使用する変異型Gnd(mGnd;例えば、配列番号27の配列と比較してN33D/R34Y/K38L変異を有する、及び配列番号28で提供される)が使用される。更に別の実施形態では、GndとmGndの組合せが使用される。NAD⁺を優先的に使用する変異型Gndが使用される場合、NADHを特異的に酸化するがNADPHは酸化しない水生成NADHオキシダーゼ(NoxE)を含む分子パージバルブが、NADHをリサイクル(「パージ」)するために使用され得る。次いで、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ(Rpe;例えば、配列番号6で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)は、リブロース-5-リン酸からキシルロース-5-リン酸の形成を触媒する。ホスホケトラーゼ(フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ、Fpk、又はキシルロース-5-リン酸ホスホケトラーゼ、Xpk(Xfpとしても公知)のいずれか;又は二機能性のF/Xpk)が使用され、キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド(glyceralde)-3-リン酸に、又はフルクトース-6-リン酸をエリトロース-4-リン酸に変換し、一方でアウトプットとしてアセチルリン酸(AcP)を生成する。キシルロース-5-リン酸及びエリトロース-4-リン酸は、トランスケトラーゼ(tkt;例えば、配列番号12で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)によっても代謝され得る。経路はトランスアルドラーゼ(talB;例えば、配列番号10で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)及びリブロース-5-リン酸イソメラーゼ(RpiA;例えば、配列番号8で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)を含み得る。この第一の経路は、グルコースからアセチル-CoAを産生する。

【0020】

第二の又は更なる経路では、グリセルアルデヒド-3-リン酸はアセチル-CoAに更に変換され得る。例えば、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gap、Tdh)は、グリセルアルデヒド-3-リン酸を1,3-ビスホスホ-グリセリン酸に変換する。一実施形態では、Gap又はTdh酵素はノックアウトされ、所望の方向での代謝物及び補助因子のフラックスを促進し得る。あるいはまた、Gap酵素の1種又は組合せが使用され得る。一実施形態では、補助因子としてNAD⁺を使用する野生型Gap(例えば、配列番号29参照)又はP188D変異を含む変異型gap(配列番号29の配列と比較して、また配列番号31に示す)が使用される。別の実施形態では、補助因子としてNADP⁺を使用する変異型gap(mGap;例えば、D34A/L35R/T35K変異を有する;配列番号29の配列と比較して、また配列番号30に示す)が使用される。更に別の実施形態では、gapとmGapの組合せが使用される。NAD⁺を優先的に使用する野生型gap又はP118D変異型gapが使用される場合、NADHを特異的に酸化するがNADPHは酸化しない水生成NADHオキシダーゼ(NoxE)を含む分子パージバルブが、NADHをリサイクル(「パージ」)するために使用され得る。1,3-ビス-グリセリン酸は、3-ホスホグリセリン酸(3-PG)及びATPを産生する、1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3-BPG)からADPへのリン酸基の可逆的転移を触媒するホスホグリセリン酸キナーゼ(EC2.7.2.3)(PGK;例えば、配列番号32で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)によって変換され得る。ATPのための分子パージバルブは、例えばGTPアーゼ又は他の酵素(配列番号34、36、38、40、若しくは42で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)を使用してADPをリサイクルするために存在し得る。次いで、3-ホスホ-グリセリン酸は、ホスホグリセリン酸ムターゼ(pgm;例えば、配列番号27で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)によって2-ホスホグリセリン酸に変換され得る。次いで、エノラーゼ(eno;例えば、配列番号44で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)は、2-ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸(PEP)に変換し得る。ピルビン酸キナーゼ(pyk;例えば、配列番号45、46、及び47で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)はPEPをピルビン酸に変換する。ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC;例えば、配列番号48で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)は、ピルビン酸をアセチルアルデヒドに変換し、これは次いでプロプリオンアルデヒド(proprionaldehyde)デヒドロゲナーゼ(PduP;例えば、配列番号49で提供される、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)の作用によってアセチル-CoAに変換され得る。あるいはまた、ピルビン酸オキシダーゼ(Pox;例えば、配列番号58、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)が、ピルビン酸をアセチルリン酸に変換するために使用され得る。あるいはまた、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH;配列番号59～63で提供される、すなわちPDH複合体、又はそれと少なくとも80%同一であるその相同体若しくは変異体)が、ピルビン酸を直接アセチル-CoA及びNADHに変換するために使用され得る。PDH酵素の1種又は組合せが使用され得る。一実施形態では、NAD⁺を補助因子として使用する野生型PDHが使用される。別の実施形態では、NADP⁺を補助因子として使用する変異型PDH(mPDH;例えば、G185A/G189A/E203V/M204R/F205K/D206H/P210R変異を有する;例えば、参照により本明細書に組込まれるBocanegraら、Biochemistry、32(11):2737～2740頁、1993参照;配列番号64)が使用される。更に別の実施形態では、PDHとmPDHの組合せが使用される。NAD⁺を優先的に使用する野生型gap又はP118D変異型gapが使用される場合、NADHを特異的に酸化するがNADPHは酸化しない水生成NADHオキシダーゼ(NoxE)を含む分子パージバルブが、NADHをリサイクル(「パージ」)するために使用され得る。

【0021】

いくつかの実施形態では、ADPは制限的補助因子であり、ADPを再生するためにATPパージバルブを用いることができる。この実施形態では、GTPアーゼがADPをリサイクルするために使用され得る。この例は、図1Cに図示する。本実施形態では、大腸菌由来のMnmEによってコードされる酵素(又はその相同体又は変異体)が使用され得る。例えば、配列番号34、36、38、40、及び42は、ATP蓄積のためのパージバルブとして役立ち得る様々な酵素を提供する。

【0022】

AcPは、アセチルトランスフェラーゼ(Pta、Pta変異体又はその相同体)によってアセチル-CoAに、又は酢酸キナーゼ(Ack、Ack変異体又はその相同体)によって酢酸に変換され得る。ピルビン酸又はアセチル-CoAはアルコールに変換され得る。更なるATP又は還元力が提供される場合、アセチル-CoAは脂肪酸又は他の産物に変換され得る。

【0023】

in vitro及びin vivoシステムの両方が、本明細書において企図され、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、及びアセチル-CoAの産生のための強くて有効な代謝経路を提供する。したがって、本開示は、アセチルリン酸及びアセチル-CoAの産生のための無細胞(in vitro)経路及び組換え微生物経路の両方を提供する。

【0024】

本開示は、基質としてピルビン酸又はアセチル-CoAを使用する、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、アセチル-CoA、並びに化学物質及びバイオ燃料を産生するin vitroの方法を提供する。本開示の実施形態では、無細胞調製物は例えば3つの方法を通して作製され得る。一実施形態では、本明細書の他の場所により完全に記載されるように、経路の酵素は、購入され、好適な緩衝液中で混合され、好適な基質が添加され、アセチルリン酸及び/又はピルビン酸又はグリセルアルデヒド-3-リン酸及び/又はアセチル-CoA産生に好適な条件下でインキュベートされる。別の実施形態では、経路の1種以上の酵素をコードする1種以上のポリヌクレオチドが、酵素が発現する条件下で1種以上の微生物にクローニングされる。続いて、細胞は溶解され、細胞由来の1種以上の酵素を含む溶解した調製物は好適な緩衝液及び基質(及び経路の1種以上の更なる酵素)と組み合わされ、基質からアセチルリン酸及び/又はピルビン酸又はグリセルアルデヒド-3-リン酸又はアセチル-CoAを産生する。あるいは、酵素は溶解した調製物から単離され、次いで適切な緩衝液中で組換えられ得る。更に別の実施形態では、購入した酵素と発現した酵素の組合せが適切な緩衝液中の経路を提供するために使用される。

【0025】

例えば、in vitroシステムを構築するため、全ての酵素は市販のものを購入するか又はアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、活性を試験し、正しく選択した反応緩衝液中で一緒に混合する。システムは少なくとも13種の酵素を含み得る:Fpk/Xpk(Xfpとしても公知)、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ(Fba)、トリオースリン酸イソメラーゼ(Tpi)、リブロース-5-リン酸 3-エピメラーゼ(Rpe)、リボース-5-リン酸イソメラーゼ(Rpi)、トランスケトラーゼ(Tkt)、ホスホグルコイソメラーゼ(Pgi)、トランスアルドラーゼ(Tal)、ホスホフルクトキナーゼ(pfk)、グルコキナーゼ(glk)、ホスホグルコノラクトナーゼ(pgl)、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(gnd)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)、及びNADHオキシダーゼ(noxE)。アセチルリン酸の濃度は、終点比色ヒドロキサム酸法を使用して測定する。このin vitroシステムを使用して、10mM量のグルコース(Glu)は、室温で1.5時間後、化学量論量のAcp(誤差範囲内)に完全に変換される。

【0026】

産生を酢酸まで更に拡大するため、Ackをin vitroシステムに添加する。Ackが添加される場合、ATP均衡を維持するためにホスホフルクトキナーゼを含むことが有用である。ADP(酢酸キナーゼの基質)は再生されるため、触媒量のみが必要である。

【0027】

本開示はまた、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、アセチル-CoA及び/又はそれら由来の産物の産生のための、上記の酵素的経路(例えば、図1に示す経路)を含む、代謝工学的に操作された生合成経路を含む組換え生物も提供する。

【0028】

一実施形態では、本開示は、親微生物と比較して少なくとも1つの標的酵素の発現が上昇した、又は親生物には見出されない酵素をコードする組換え微生物を提供する。別の又は更なる実施形態では、微生物は、所望の代謝物の産生に必要な代謝物と競合する又は望まない産物を産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の低減、破壊、又はノックアウトを含む。組換え微生物は、例えば、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、及び/又はアセチル-CoAの産生のための生合成経路に関与する少なくとも1種の代謝物を産生する。一般に、組換え微生物は、標的酵素を含む少なくとも1つの組換え代謝経路を含み、競合的な生合成経路における酵素の活性又は発現の低減を更に含み得る。経路は、例えばアセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、及び/又はアセチル-CoAの産生における、基質又は代謝の中間体を改変するために作用する。標的酵素は、好適な生物源由来のポリヌクレオチドによってコードされ、発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌又は酵母源由来であり、本開示の「組換え」微生物に組換え操作で入れられた遺伝子を含む。

【0029】

本明細書で使用する場合、酵素の「活性」は、代謝物をもたらす反応を触媒する、すなわち、「機能する」その能力の尺度であり、反応の代謝物が産生される速度として表され得る。例えば、酵素活性は、単位時間あたりに又は単位酵素あたりに産生された代謝物の量(例えば濃度又は重量)として、又は親和性若しくは解離定数によって表され得る。

【0030】

用語「生合成経路」は、「代謝経路」とも呼ばれ、1つの化学種を別のものに変換する(変える)ための同化又は異化生化学反応のセットを指す。遺伝子産物は、それらが並行して又は連続して同じ基質に作用し、同じ産物を産生し、又は同じ基質と代謝最終産物の間の代謝中間体(すなわち、代謝物)に作用する若しくはそれを産生する場合、同じ「代謝経路」に属する。本開示は、所望の産物又は中間体の産生のための生合成経路又は代謝工学的に操作された経路を有するin vitroシステム及び組換え微生物を提供する。

【0031】

本明細書で使用する場合、用語「代謝工学的に操作された」又は「代謝工学」は、微生物において、所望の代謝物、例えばアセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、及び/又はアセチル-CoA、高級アルコール、又は他の化学物質などを産生するための、生合成遺伝子、オペロン関連遺伝子、及びそのようなポリヌクレオチドの制御エレメントの合理的な経路設計、並びにアセンブリーを含む。「代謝工学的に操作された」は、所望の経路をもたらす中間体と競合する競合代謝経路の低減、破壊、又はノックアウトを含む、遺伝子工学及び適切な培養条件を使用した転写、翻訳、タンパク質の安定性及びタンパク質の機能性の制御及び最適化による代謝フラックスの最適化を更に含み得る。生合成遺伝子は、宿主にとって外来のものであるか、又は変異誘発、組換え、及び/若しくは内在性宿主細胞における異種発現制御配列との関連で改変されるかによって、宿主微生物と異種のものであってよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドが宿主生物にとって異種遺伝子である場合、ポリヌクレオチドはコドン最適化され得る。

【0032】

したがって、in vitro生合成経路は、所望の中間体の産生をもたらす緩衝システムへの酵素の導入によって産生される。緩衝システムは、全ての所望の酵素を含む単一流体緩衝液であってよく、又はそれぞれ酵素のセット又はサブセットを含む複数の流体緩衝液を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイスは、アセチルリン酸及び/又はピルビン酸及び/又はグリセルアルデヒド-3-リン酸及び/又はアセチル-CoAの産生のための生合成経路における酵素のセットをそれぞれ含有する複数の反応ウェルを含み得る。基質(中間体を含み得る)は、産物又は更なる中間体を産生する様々なチャネル及びウェルを通って流れる。本明細書に記載するように、酵素は、販売業者から購入する、微生物から発現されたものを精製する、又は微生物から発現されたものを精製しない。更に、生合成経路はin vitro酵素反応と、経路中の酵素のサブセットを発現する全細胞(例えば、原核生物及び/又は真核生物)の組合せを含み、微生物は、それぞれがin vitroシステムからの代謝物を利用又はin vitroシステムへ代謝物を提供し得ることが企図されている。

【0033】

「酵素」は、典型的には完全に又は大部分が、多かれ少なかれ特異的に1つ以上の化学又は生化学反応を触媒又は促進するタンパク質又はポリペプチドを構成するアミノ酸からなる任意の物質を意味する。

【0034】

本明細書において交換可能に使用される用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって一緒に連結されるアミノ酸と呼ばれる化学的ビルディングブロックの1つ以上の鎖を含む。タンパク質又はポリペプチドは酵素として機能し得る。

【0035】

「天然」又は「野生型」のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、又は細胞は、その一次配列が天然に生じるタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、又は細胞を意味する。「天然」又は「野生型」タンパク質は、「組換え発現」されてもよい。

【0036】

「代謝物」は、代謝によって産生された任意の基質、又は所望の代謝物、化学物質、アルコール、又はケトンを生じる特定の代謝プロセスに必要な又は加わる基質、を指す。代謝物は、代謝の出発材料(例えば、炭水化物、糖リン酸、ピルビン酸等)、中間体(例えば、アセチル-coA)、又は最終産物(例えば、1-ブタノール)である有機化合物であってよい。代謝物は、より複雑な分子を構築するために使用でき、又はより単純なものに分解され得る。中間代謝物は他の代謝物から合成され、おそらくより複雑な基質を作製するために使用され、又はより単純な化合物へと分解され、多くの場合化学エネルギーの放出を伴う。

【0037】

代謝工学的に「操作された」又は「改変された」微生物は、選択した宿主又は親微生物に遺伝物質を導入し、それにより微生物の細胞生理学及び生化学を改変又は変更することによって作製される。遺伝物質の導入により、親微生物は新しい特性、例えば、新しい又は大量の細胞内代謝物を産生する能力を獲得する。例示的な実施形態では、親微生物への遺伝物質の導入は、アセチルリン酸、ピルビン酸、及び/若しくはアセチル-CoAを産生する新しい若しくは改変された能力、又は操作されていない微生物と比較して異なるレベルでそのような代謝物を産生する新しい又は改変された能力をもたらす。親微生物に導入された遺伝物質は、アセチルリン酸及び/又はアセチル-CoAの産生のための生合成経路に含まれる1つ以上の酵素をコードする遺伝子又は遺伝子の一部を含み、これらの遺伝子の発現及び/又は発現の制御のための更なるエレメント、例えばプロモーター配列も含み得る。

【0038】

操作された又は改変された微生物は、宿主又は親微生物への遺伝物質の導入の代わりに又は加えて、微生物の細胞生理学及び生化学を変える遺伝子又はポリヌクレオチドの分解、欠失、又はノックアウトも含み得る。遺伝子又はポリヌクレオチドの低減、分解又はノックアウトによって、微生物は新しい、又は改善された特性(例えば、新しい又は大量の細胞内代謝物を産生する能力、所望の経路を通る代謝物のフラックスを改善する能力、及び/又は望ましくない副産物の産生を減らす能力)を獲得する。これは、破壊された細胞調製物が使用されるin vitroシステムの調製に特に関係し得る。そのような調製物において、酵素を含む競合経路のノックアウト又は破壊は有用であり得る。

【0039】

「親微生物」は、組換え微生物を生成するために使用される細胞を指す。用語「親微生物」は、天然に生じる細胞、すなわち遺伝子改変されていない「野生型」細胞を指す。用語「親微生物」は、更なる操作のために「親」として役立つ細胞も指す。

【0040】

例えば、野生型微生物は遺伝子改変され、ホスホケトラーゼなどの第一の標的酵素を発現又は過剰発現することができる。この微生物は、次に、第三の標的酵素、例えばトランスアルドラーゼを発現又は過剰発現するように改変された微生物の作製において、親微生物として機能し得る。次に、微生物は、例えばトランスケトラーゼ及びリボース-5-リン酸イソメラーゼを発現又は過剰発現するように改変され、それらは更に、第三の標的酵素、例えばリブロース-5-リン酸エピメラーゼを発現又は過剰発現するように改変され得る。

【0041】

したがって、親微生物は、連続する遺伝子改変事象の参照細胞として機能する。各改変事象は、1種以上の核酸分子を参照細胞に導入することによって達成され得る。導入は、1種以上の標的酵素の発現若しくは過剰発現、又は1種以上の標的酵素の低減若しくは除去を促進する。用語「促進する」は、例えば親微生物のプロモーター配列などの遺伝子改変を通して、標的酵素をコードする内在性ポリヌクレオチドの活性化を包含することが理解される。用語「促進する」は更に、標的酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドの親微生物への導入を包含することが理解される。

【0042】

その相同体、変異体、断片、関連融合タンパク質、又は機能的等価物を含む、代謝物の生成に有用な酵素(例えば、ホスホケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ、フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ等の酵素)をコードするポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞、例えば細菌又は酵母細胞などにおけるそのようなポリペプチドの発現を指示する組換え核酸分子に使用される。本方法において有用なポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列を本明細書に記載する。核酸分子のコードされた活性を変更しない配列の添加、例えば非機能性又は非コード配列の添加などは、基礎の核酸の保存的な変異であることが理解される。

【0043】

上述のポリヌクレオチドは「遺伝子」を含み、上述の核酸分子は「ベクター」又は「プラスミド」を含むことが理解される。例えば、ホスホケトラーゼをコードするポリヌクレオチドは、Fpk遺伝子若しくはその相同体、又はXpk遺伝子若しくはその相同体、又は二官能性F/Xpk遺伝子若しくはその相同体を含み得る。したがって、用語「遺伝子」は、「構造遺伝子」とも呼ばれ、1種以上のタンパク質又は酵素の全て又は一部を含み、制御(非転写)DNA配列、例えば遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター領域又は発現制御エレメントなどを含み得る、アミノ酸の配列を含む特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。遺伝子の転写領域は、イントロン、5'-非翻訳領域(UTR)、及び3'-UTR、並びにコード配列を含む非翻訳領域を含み得る。

【0044】

用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、又は「組換え核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)及び、該当する場合、リボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドを指す。

【0045】

遺伝子又はポリヌクレオチドに関する用語「発現」は、遺伝子又はポリヌクレオチドの転写及び、該当する場合、生じたmRNA転写物のタンパク質又はポリペプチドへの翻訳を指す。したがって、文脈から明らかであるように、タンパク質又はポリペプチドの発現はオープンリーディングフレームの転写及び翻訳から生じる。

【0046】

当業者は、遺伝子コードの縮重性により、そのヌクレオチド配列の異なる様々なコドンが所与のアミノ酸をコードするために使用され得ることを認識するであろう。上述の生合成酵素又はポリペプチドをコードする特定のポリヌクレオチド又は遺伝子配列は、単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照され、本開示は、本開示の方法で利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質と同じアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意の配列のポリヌクレオチドを含む。同様に、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性の喪失又は著しい喪失なく、そのアミノ酸配列における1つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容し得る。本開示は、アミノ酸配列の変更を有するそのようなポリペプチドを含み、本明細書に示したDNA配列によってコードされるアミノ酸配列は、本開示の好ましい実施形態を単に例示するものである。本開示の方法は、改変されたポリペプチドが必要な又は所望の活性を有するかどうか調べるための方法を記載する。

【0047】

本開示は、本明細書の他の場所で詳細に記載されるように、1種以上の標的酵素をコードする組換えDNA発現ベクター又はプラスミドの形態のポリヌクレオチドを提供する。一般に、そのようなベクターは、宿主微生物の細胞質内で複製するか、宿主微生物の染色体DNAへと組み込まれるかのいずれかであり得る。いずれの場合にも、ベクターは、安定ベクター(すなわち、選択圧のみであっても、多数回の細胞分裂にわたってベクターが存在したままである)又は一過性ベクター(すなわち、細胞分裂の回数が増加すると宿主微生物によりベクターが徐々に失われる)であってよい。本開示は、単離された(例えば、純粋ではないが、天然には見出されない量及び/又は濃度で調製物中に存在する)、及び精製された(例えば、夾雑物を実質的に含まない、又は対応するDNAと共に天然に見出される物質を実質的に含まない)形態のDNA分子を提供する。

【0048】

本開示のポリヌクレオチドは、鋳型としてcDNA、mRNA、又は代わりにゲノムDNA、及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準的なPCR増幅技術及び以下の実施例の節で記載される手順に従って増幅され得る。そのように増幅した核酸は、適切なベクターにクローニングされ、DNA配列分析によって特徴付けられ得る。更に、ヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば自動DNA合成装置の使用によって調製され得る。

【0049】

本明細書に記載の酵素に相同なポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子は、1つ以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に1つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を導入することによって作製され得ることも理解される。変異は、部位特異的変異誘発及びPCR媒介変異誘発など、標準的な技術によってポリヌクレオチドに導入され得る。非保存的なアミノ酸置換を作製するのに望ましい位置と対照的に、いくつかの位置では保存的なアミノ酸置換を作製することが好ましい。

【0050】

当業者によって理解されるように、特定の宿主においてその発現を増強するためにコード配列を改変することは有利であり得る。遺伝子コードは、64個の可能なコドンが重複しているが、ほとんどの生物は、典型的にはこれらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も多く利用されるコドンは適合コドンと呼ばれ、多くは利用されないものはまれな又は低使用コドンとして分類される。コドンは、宿主の好ましいコドン使用を反映して置換され、そのプロセスは時に、「コドン最適化」又は「種のコドンバイアスのための制御」と呼ばれる。

【0051】

特定の原核又は真核宿主に好まれるコドンを含有する最適化コード配列(Murrayら、(1989) Nucl. Acids Res. 17:477～508頁も参照)が調製され、例えば、翻訳速度を増加し、又は、例えば、非最適化配列から産生された転写物と比較して、より長い半減期など所望の特性を有する組換えRNA転写物を産生し得る。翻訳停止コドンも、宿主の好みを反映するように改変され得る。例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)及び哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれUAAとUGAである。単子葉植物の典型的な停止コドンはUGAであり、一方で昆虫及び大腸菌は一般的に停止コドンとしてUAAを使用する(Dalphinら、(1996) Nucl. Acids Res. 24: 216～218頁)。植物での発現のためのヌクレオチド配列を最適化する方法論は、例えば米国特許第6,015,891号及びそこに引用される参考文献に提供される。

【0052】

用語「組換え微生物」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に使用され、内在性ポリヌクレオチドを発現若しくは過剰発現するように、又はベクターに含まれるものなど、非内在性配列を発現するように遺伝子改変された微生物を指す。ポリヌクレオチドは、一般に、上述のように所望の代謝物を産生するための代謝経路に含まれる標的酵素をコードするが、活性又は転写の制御に必要なタンパク質因子も含み得る。したがって、本明細書に記載の組換え微生物は、親微生物によって先に発現又は過剰発現されていない標的酵素を発現又は過剰発現するように遺伝子改変されている。用語「組換え微生物」及び「組換え宿主細胞」は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の子孫又は可能な子孫を指すことが理解される。

【0053】

用語「基質」又は「好適な基質」は、酵素の作用によって別の化合物へと変換される又は変換されることが意図される任意の物質又は化合物を指す。この用語は、単一の化合物だけでなく、溶液、混合物、及び少なくとも1つの基質、又はその誘導体を含有する他の材料などの、化合物の組合せも含む。更に、用語「基質」は、出発材料としての使用に好適な炭素源を提供する化合物だけでなく、本明細書に記載の代謝工学的に操作された微生物と関連する経路において使用される中間体及び最終産物代謝物も包含する。本明細書に記載の経路に関して、出発材料は、限定はされないが、グルコース、フルクトース、又は他のバイオマス糖等を含む任意の好適な炭素源であってよい。これらの出発材料は、図1に示すような経路に入る好適な糖又は糖リン酸に代謝され得る。

【0054】

「形質転換」は、ベクターが宿主細胞に導入されるプロセスを指す。形質転換(又は形質導入、又はトランスフェクション)は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃(又は微粒子銃による送達)、又はアグロバクテリウムによる形質転換を含むいくつかの手段のいずれか1つによって達成され得る。

【0055】

「ベクター」は通常、生物、細胞、又は細胞成分間で増幅及び/又は移動され得るポリヌクレオチドを指す。ベクターは、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、及び、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工染色体)、及びPLAC(植物人工染色体)などの人工染色体を含み、それらは「エピソーム」、すなわち自律的に複製し、又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。ベクターは、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内にDNAとRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリ-リジン-コンジュゲートDNA又はRNA、ペプチドコンジュゲートDNA又はRNA、リポソームコンジュゲートDNA等であってもよく、それらは天然ではエピソームではなく、1種以上の上記のポリヌクレオチド構築物を含む生物、例えばアグロバクテリウム又は細菌などであり得る。

【0056】

発現ベクターの様々な構成成分は、ベクター、及びベクターが複製又は発現を駆動しようとする宿主細胞の意図する使用によって様々であってよい。大腸菌、酵母、ストレプトマイセス(Streptomyces)、及び他の一般に使用される細胞における、遺伝子の発現及びベクターの維持に好適な発現ベクターの構成成分は、広く知られており、市販されている。例えば、発現ベクターへの包含に好適なプロモーターは、真核又は原核宿主微生物で機能するものを含む。プロモーターは、宿主微生物の増殖に対して発現の制御を可能にする、又は化学的若しくは物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにする制御配列を含み得る。大腸菌及び特定の他の細菌宿主細胞では、生合成酵素、抗生物質耐性を付与する酵素、及びファージタンパク質の遺伝子由来のプロモーターが使用され、例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、マルトース、トリプトファン(trp)、ベータ-ラクタマーゼ(bla)、バクテリオファージラムダPL、及びT5プロモーターを含み得る。更に、合成プロモーター、例えばtacプロモーター(全体が参照により本明細書に組込まれる米国特許第4,551,433号)も使用され得る。大腸菌発現ベクターでは、pUC、p1P、p1、及びpBRからなど、大腸菌の複製起点を含むことが有用である。

【0057】

したがって、組換え発現ベクターは少なくとも1つの発現システムを含有し、発現システムは、適合性の宿主細胞におけるコード配列の発現を引き起こすように作動するプロモーター及び場合により停止配列に作動可能に連結した遺伝子コード配列の少なくとも一部からなる。宿主細胞は、本開示の組換えDNA発現ベクターによる形質転換によって、染色体外エレメントとして又は染色体に組込まれた発現システム配列を含有するように改変される。

【0058】

本開示は、アセチルリン酸合成、アセチル-CoA生合成又はそれら由来の他の代謝物に関与する1種以上の生合成遺伝子又はポリヌクレオチドの異種発現の方法、及び本方法において有用な組換えDNA発現ベクターを提供する。したがって、本開示の範囲内に含まれるのは、そのような核酸を含む組換え発現ベクターである。

【0059】

本明細書で提供する組換え微生物は、好適な炭素基質、例えばグルコース、フルクトース、又は他のバイオマス糖等からの、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、及び/又はアセチル-CoA又はそれら由来の他の代謝物の産生のための経路又は産生のための酵素的調製物に含まれる複数の標的酵素を発現し得る。

【0060】

「バイオマス由来の糖」は、限定はされないが、グルコース、スクロース、セロビオース、マンノース、キシロース、及びアラビノースなどの分子を含む。用語「バイオマス由来の糖」は、通常微生物によって使用される1～7個の炭素の好適な炭素基質、例えば限定はされないが、全てがD又はL形態のいずれかであるグルコース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース、及びマンノースを含む三～七炭糖、又は三～七炭糖の組合せ、例えばグルコース及びフルクトース、及び/又は、限定はされないが、2-ケト-L-グロン酸、イドン酸(IA)、グルコン酸(GA)、6-ホスホグルコン酸、2-ケト-D-グルコン酸(2KDG)、5-ケト-D-グルコン酸、2-ケトグルコン酸リン酸、2,5-ジケト-L-グロン酸、2,3-L-ジケトグロン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸(EA)、及びD-マンノン酸を含む六炭糖の酸を包含する。

【0061】

セルロース及びリグノセルロースの供給原料及び廃棄物、例えば農作物残渣、木材、林業廃棄物、製紙からの廃泥、並びに都市及び産業廃棄物などは、化学物質、プラスチック、燃料、及び供給物の産生のための潜在的に大きな再生可能な供給原料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを含む炭水化物ポリマーからなる、セルロース及びリグノセルロースの供給原料及び廃棄物は、様々な化学的、機械的、及び酵素的手段によって通常処理され、主に六炭糖及び五炭糖を放出し得る。これらの糖は、次いで本明細書に記載の経路に「供給」され得る。

【0062】

本開示は、1つ以上の異種ポリヌクレオチドの発現若しくは過剰発現、又は1つ以上の天然のポリヌクレオチドの過剰発現、又は(i)グルコースからのグルコース-6-リン酸の産生を触媒するポリペプチド(一実施形態では、ポリリン酸を使用する);(ii)フルクトース-6-リン酸からのアセチルリン酸及びエリトロース-4-リン酸(E4P)の産生を触媒するポリペプチド;(iii)リブロース-5-リン酸からキシルロース-5-リン酸への変換を触媒するポリペプチド;(iv)キシルロース-5-リン酸をG3P及びアセチルリン酸に変換するポリペプチド;(v)グリセルアルデヒド-3-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)に変換するポリペプチド;(vi)ジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸をフルクトース-1,6-ビスリン酸に変換するポリペプチド;(vii)グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換するポリペプチド;(viii)NADHをNAD⁺に酸化するポリペプチド;(ix)6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換するポリペプチド;並びに(x)6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換するポリペプチド、を含む酵素的in vitroシステムを実証する。

【0063】

したがって、本開示は、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、アセチル-CoA、及び/又はそれらに由来する他の代謝物を産生するシステム及び組換え微生物であって、システム又は微生物がNADHをNAD⁺に酸化する酵素を含み、グルコキナーゼ(Glk又はポリリン酸依存的グルコキナーゼを含む、その変異体若しくは相同体)、ホスホケトラーゼ(例えば、Fpk、Xpk、若しくはFpk/Xpk、又はその変異体若しくは相同体)、トランスアルドラーゼ(例えば、Tal又はその変異体)、トランスケトラーゼ(例えば、Tkt又はその変異体若しくは相同体)、リボース-5-リン酸イソメラーゼ(例えば、Rpi又はその変異体若しくは相同体)、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ(例えば、Rpe又はその変異体若しくは相同体)、トリオースリン酸イソメラーゼ(例えば、Tpi又はその変異体若しくは相同体)、フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(例えば、Fba又はその変異体若しくは相同体)、ホスホグルコイソメラーゼ(例えば、Pgi又はその変異体若しくは相同体)、並びに任意のそれらの組合せのうちの1種以上などの標的酵素を更に含む、システム及び組換え微生物を提供する。更に、微生物は、親微生物と比較して、基質としてアセチル-CoAを優先的に使用するアルコール/アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えば、adhE遺伝子)の発現の破壊、欠失、又はノックアウトを含み得る。いくつかの実施形態では、更なるノックアウトは、乳酸デヒドロゲナーゼ(例えば、ldh)及びfrdBCのノックアウトを含み得る。他の実施形態では、gapA、eda、edd及びmgsAの1つ以上の発現又は活性のノックアウト又は低減が実施され、微生物の他の解糖系経路を除く。ノックアウトされ得る又は発現を低減され得る他の酵素は、Fbp、glpX、pfkAB、並びにその相同体及び変異体を含む。

【0064】

前述の酵素の1種以上(全てではない)を有するサブシステム又は生物が利用でき、次いで経路の残りの酵素メンバーを含む生物又は他のサブシステムと組み合わされ得ることが認識されるであろう。以下により完全に記載するように、本開示のシステム又は微生物は、アセチルリン酸産物からアセチル-CoAに拡張する（extend）更なる酵素を更に含み、これは次いで、例えばブタノール、イソブタノール、2-ペンタノン等を産生するように拡張され得る。

【0065】

先に記載したように、本開示を通して記載した標的酵素は通常代謝物を産生する。更に、本開示を通して記載される標的酵素は、ポリヌクレオチドによってコードされる。例えば、フルクトース-6-ホスホケトラーゼはFpk遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Fpk遺伝子は、フルクトース-6-ホスホケトラーゼ活性を有する好適な酵素をコードする好適な核酸配列を提供する任意の生物源に由来し得る。

【0066】

したがって、一実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、グルコキナーゼ(Glk、ポリリン酸依存的グルコキナーゼ又はその相同体若しくは変異体)を含む。この発現は、アセチルリン酸、アセチル-coA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。Glkは、G.ステアロサーモフィルス(G. stearothermophilus)(配列番号19)に由来し得る。別の実施形態では、操作されたGlkの変異体が、それがグルコキナーゼ活性を有し、グルコースをグルコース-6-リン酸に変換し得る限り使用され得る。そのような操作された変異体は、部位特異的変異誘発、定方向進化等によって得られ得る。したがって、本開示内に含まれるのは、配列番号19の配列に対して少なくとも85～99%同一であり、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドである。

【0067】

別の又は更なる実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ホスホフルクトキナーゼ(Pfk、ポリリン酸依存的Pfk、又はその相同体若しくは変異体)の発現を含む。この発現は、アセチルリン酸、アセチル-coA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。Pfkは、G.ステアロサーモフィルス(配列番号20)に由来し得る。別の実施形態では、操作されたPfkの変異体が、それがホスホフルクトキナーゼ活性を有し、フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸に変換し得る限り使用され得る。そのような操作された変異体は、部位特異的変異誘発、定方向進化等によって得られ得る。したがって、本開示内に含まれるのは、配列番号20に記載した配列に対して少なくとも85～99%同一であり、ホスホフルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドである(例えば、配列番号52～53参照)。

【0068】

別の又は更なる実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ホスホケトラーゼ(例えば、Xpk、Fpk、又はXfp)を含む。この発現は、本明細書において上記及び下記に記載したように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための他の酵素の発現又は過剰発現と組み合わされ得る。ホスホケトラーゼは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)を含む様々な生物に由来し得る。

【0069】

ホスホケトラーゼ酵素(F/Xpk又はXfp)は、キシルロース-5-リン酸若しくはフルクトース-6-リン酸からのアセチルリン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸若しくはエリトロース-4-リン酸の形成を触媒する。

【0070】

先の記載に加えて、用語「ホスホケトラーゼ」又は「F/Xpk」又は「Xfp」は、キシルロース-5-リン酸若しくはフルクトース-6-リン酸からのアセチルリン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸若しくはエリトロース-4-リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号2に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号2と91%同一性を有するガードネレラ・バジナリス(Gardnerella vaginalis) 409-05 ref|YP_003373859.1|、配列番号2と89%同一性を有するビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve) ref|ZP_06595931.1|、配列番号2と55%同一性を有するセルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi) ATCC 484 YP_004452609.1、配列番号2と50%同一性を有するメチロモナス・メタニカ(Methylomonas methanica) YP_004515101.1、及び配列番号2と49%同一性を有するサーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus) BP-1 NP_681976.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0071】

別の又は更なる実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、リブロース-5-リン酸エピメラーゼを含む。この酵素は、本明細書において上記及び下記に記載するように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。酵素は、リブロース-5-リン酸を含む基質からキシルロース-5-リン酸を含む代謝物を産生する。リブロース-5-リン酸エピメラーゼは、Rpe遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。Rpe遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。

【0072】

先の記載に加えて、用語「リブロース-5-リン酸エピメラーゼ」又は「Rpe」は、リブロース-5-リン酸からのキシルロース-5-リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号6に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号6と99%同一性を有するシゲラ・ボイディ(Shigella boydii) ATCC 9905 ZP_11645297.1、配列番号6と87%同一性を有するシュワネラ・ロイヒカ(Shewanella loihica) PV-4 YP_001092350.1、配列番号6と75%同一性を有するニトロソコッカス・ハロフィラス(Nitrosococcus halophilus) Nc4 YP_003526253.1、配列番号6と72%同一性を有するラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha) JMP134、及び配列番号6と51%同一性を有するシネココッカス(Synechococcus sp.) CC9605 YP_381562.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0073】

別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、リボース-5-リン酸イソメラーゼを含む。この酵素は、本明細書において上記及び下記に記載するように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。酵素は、リボース-5-リン酸を含む基質からリブロース-5-リン酸を含む代謝物を産生する。リボース-5-リン酸イソメラーゼは、Rpi遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。Rpi遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。

【0074】

先の記載に加えて、用語「リボース-5-リン酸イソメラーゼ」又は「Rpi」は、リボース-5-リン酸からのリブロース-5-リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号8に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号8と74%同一性を有するビブリオ・シナロエンシス(Vibrio sinaloensis) DSM 21326 ZP_08101051.1、配列番号8と72%同一性を有するアエロモナス・メディア(Aeromonas media) WS ZP_15944363.1、配列番号8と48%同一性を有するサーモシネココッカス・エロンガタスBP-1、配列番号8と42%同一性を有するラクトバチルス-スエビカス(Lactobacillus suebicus) KCTC 3549 ZP_09450605.1、及び配列番号8と37%同一性を有するホモサピエンス(Homo sapiens) AAK95569.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0075】

別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、トランスアルドラーゼを含む。この酵素は、本明細書において上記及び下記に記載するように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。酵素は、エリトロース-4-リン酸及びフルクトース-6-リン酸を含む基質からセドヘプツロース-7-リン酸を含む代謝物を産生する。トランスアルドラーゼは、Tal遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。Tal遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。

【0076】

先の記載に加えて、用語「トランスアルドラーゼ」又は「Tal」は、エリトロース-4-リン酸及びフルクトース-6-リン酸からのセドヘプツロース-7-リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号10に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号10と30%同一性を有するビフィドバクテリウム・ブレーベ DSM 20213 ZP_06596167.1、配列番号10と67%同一性を有するホモサピエンスAAC51151.1、配列番号10と57%同一性を有するシアノセイス(Cyanothece sp.) CCY0110 ZP_01731137.1、配列番号10と57%同一性を有するラルストニア・ユートロファJMP134 YP_296277.2、及び配列番号10と59%同一性を有する枯草菌(Bacillus subtilis) BEST7613 NP_440132.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0077】

別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、トランスケトラーゼを含む。この酵素は、本明細書において上記及び下記に記載するように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、(i)セドヘプツロース-7-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸からのリボース-5-リン酸及びキシルロース-5-リン酸、及び/又は(ii)キシルロース-5-リン酸及びエリトロース-4-リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸及びフルクトース-6-リン酸、を含む代謝物を産生する。トランスケトラーゼは、Tkt遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。Tkt遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。

【0078】

先の記載に加えて、用語「トランスケトラーゼ」又は「Tkt」は、(i)セドヘプツロース-7-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸からのリボース-5-リン酸及びキシルロース-5-リン酸、及び/又は(ii)キシルロース-5-リン酸及びエリトロース-4-リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸及びフルクトース-6-リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号12に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号12と65%同一性を有する髄膜炎菌(Neisseria meningitidis) M13399 ZP_11612112.1、配列番号12と41%同一性を有するビフィドバクテリウム・ブレーベ DSM 20213 ZP_06596168.1、配列番号12と66%同一性を有するラルストニア・ユートロファ JMP134 YP_297046.1、配列番号12と56%同一性を有するシネココッカス・エロンガタス PCC 6301 YP_171693.1、及び配列番号12と54%同一性を有する枯草菌BEST7613 NP_440630.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0079】

別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、トリオースリン酸イソメラーゼを含む。この酵素は、本明細書において上記及び下記に記載するように、アセチルリン酸、ピルビン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。酵素は、グリセルアルデヒド-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸を含む代謝物を産生する。トリオースリン酸イソメラーゼは、Tpi遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。Tpi遺伝子又はポリヌクレオチドは、G.ステアロサーモフィルス及び大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。

【0080】

先の記載に加えて、用語「トリオースリン酸イソメラーゼ」又は「Tpi」は、グリセルアルデヒド-3-リン酸からのジヒドロキシアセトンリン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号14に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号14と45%同一性を有するラット(Rattus norvegicus) AAA42278.1、配列番号14と45%同一性を有するホモサピエンスAAH17917.1、配列番号14と40%同一性を有する枯草菌BEST7613 NP_391272.1、配列番号14と40%同一性を有するシネココッカス・エロンガタス PCC 6301 YP_171000.1、及び配列番号14と98%同一性を有するチフス菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str.) AG3 ZP_06540375.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0081】

別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼを含む。この酵素は、本明細書において上記及び下記に記載するように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれら由来の他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、ジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸を含む基質からフルクトース-1,6-ビスリン酸を含む代謝物を産生する。フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼは、Fba遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。Fba遺伝子又はポリヌクレオチドは、G.ステアロサーモフィルス及び大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。

【0082】

先の記載に加えて、用語「フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ」又は「Fba」は、ジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸を含む基質からのフルクトース-1,6-ビスリン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号16に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。更なる相同体は、配列番号16と26%同一性を有するシネココッカス・エロンガタス PCC 6301 YP_170823.1、配列番号16と80%同一性を有するビブリオ・ニグリパルクリチュード(Vibrio nigripulchritudo) ATCC 27043 ZP_08732298.1、配列番号16と76%同一性を有するメチロミクロビウム・アルバム(Methylomicrobium album) BG8 ZP_09865128.1、配列番号16と25%同一性を有する蛍光菌(Pseudomonas fluorescens) Pf0-1 YP_350990.1、及び配列番号16と24%同一性を有するメチロバクテリウム・ノデュランス(Methylobacterium nodulans) ORS 2060 YP_002502325.1を含む。前述のアクセッション番号と関連する配列は、参照により本明細書に組込まれる。

【0083】

設計において、アセチル-CoAからのNAD(P)Hの化学量論的な産生を効果的に分離する合成生化学「パージバルブ」を開発した(例えば、図1参照)。この目的のために、NADP⁺を利用する野生型酵素、NAD⁺を利用する変異体の両方、及びNADHを特異的に酸化するがNADPHは酸化しない水生成NADHオキシダーゼ(NoxE)の混合物が利用された。この代謝ノードを用いることにより、自己調節的に過剰な還元等価物が消失した。

【0084】

例えば、本システムは酵素のコアセットを含み、所望の化学物質又はバイオ燃料の合成のための「パージバルブ」を含む。パージバルブシステムは、代謝物の1つのセット(例えば、第一の炭素源)を第二の代謝物(例えば、所望の化学製品)へと変換する任意のin vitroシステムと組合せて利用され得る。そのような例では、パージバルブシステムは補助因子の均衡をとるために利用され得る。例えば、グルコース-6-リン酸の6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンへの変換において利用可能なNADP⁺の利用時に、システムは停止し、更なる代謝物は作製されないであろう。しかしながら、本開示のパージバルブシステムでは、パージバルブは減少する等価物を酸化して、それにより産生を維持し得る。

【0085】

一実施形態では、in vitroシステムにおける使用のためのパージバルブは、NADHデヒドロゲナーゼ及びNADPHデヒドロゲナーゼの双方、並びにNADH又はNADPHオキシダーゼの組合せを含む。他のデヒドロゲナーゼの対が使用され得ることに留意すべきである。

【0086】

先に記載の全ての実施形態において、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、NADHオキシダーゼ(NoxE)を含む。NADHオキシダーゼは、NoxE遺伝子、ポリヌクレオチド、又はその相同体によってコードされ得る。NoxE遺伝子又はポリヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラクティス(L. Lactis) (例えばアクセッション番号YP_007507681参照)を含む様々な微生物に由来し得る。

【0087】

先の記載に加えて、用語「NADHオキシダーゼ」又は「NoxE」は、NADHをNAD⁺に酸化することができるタンパク質を指し、それらは、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出して、配列番号18に対して少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ以上の配列類似性を共有する。

【0088】

更に、また上述したように、代謝物の生成に有用な酵素の相同体は、本明細書で提供する微生物及び方法によって包含される。第一のファミリー又は種の元の酵素又は遺伝子に関して使用される用語「相同体」は、第二のファミリー又は種の異なる酵素又は遺伝子を指し、それらは機能、構造、又はゲノム分析によって第一のファミリー又は種の元の酵素又は遺伝子に相当する第二のファミリー又は種の酵素又は遺伝子であると決定される。ほとんどの場合、相同体は、機能、構造、又はゲノムの類似性を有するであろう。遺伝子プローブ及びPCRを使用して、酵素又は遺伝子の相同体が容易にクローニングされ得る技術が公知である。相同体としてクローニングした配列の同一性は、機能的アッセイを使用して及び/又は遺伝子のゲノムマッピングによって確かめられ得る。

【0089】

タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、第二のタンパク質に「相同性」を有する、又は「相同」である。或いは、2つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二のタンパク質に相同性を有する。(したがって、用語「相同タンパク質」は、2つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するように定義される)。

【0090】

本明細書で使用する場合、2つのタンパク質(又はタンパク質の領域)は、アミノ酸配列が少なくとも約30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一性を有する場合、実質的に相同である。2つのアミノ酸配列、又は2つの核酸配列の同一性の割合を決定するため、配列は、最適な比較目的のためにアラインされる(例えば、ギャップは、最適なアライメントのため、第一及び第二のアミノ酸又は核酸配列の一方又は双方に導入され、非相同配列は、比較目的のためには無視され得る)。一実施形態では、比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、典型的には少なくとも40%、より典型的には少なくとも50%、更により典型的には少なくとも60%、及び更により典型的には少なくとも70%、80%、90%、100%である。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを次いで比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である(本明細書で使用する場合、アミノ酸又は核酸「同一性」はアミノ酸又は核酸「相同性」と等価である)。2つの配列間の同一性の割合は、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

【0091】

「相同」が、タンパク質又はペプチドに関して使用される場合、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸置換で異なっていることが多いことが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖(R基)を持つ別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変更しないであろう。保存的置換によって2つ以上のアミノ酸配列が互いに異なる場合、配列同一性の割合又は相同性の程度は、置換の保存的性質に合わせて上方調整され得る。この調整を行う手段は当業者には周知である(例えば、参照により本明細書に組込まれるPearsonら、1994参照)。

【0092】

配列同一性％とも呼ばれ得るポリペプチドの配列相同性は、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Genetics Computer Group (GCG)、University of Wisconsin, Biotechnology Center、910 University Avenue、Madison、Wis. 53705の配列解析ソフトウェアパッケージを参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及び他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して類似の配列をマッチングする。例えば、GCGは「Gap」及び「Bestfit」などのプログラムを含み、それらはデフォルトのパラメーターを用いて使用され、異なる種の生物からの、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の相同ポリペプチドなど、近縁のポリペプチド間の配列相同性又は配列同一性を決定し得る。例えば、GCG Version 6.1参照。

【0093】

分子配列を、異なる生物からの多くの配列を有するデータベースと比較するのに使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムBLAST(Altschul, 1990; Gish, 1993; Madden, 1996; Altschul, 1997; Zhang, 1997)、特にblastp又はtblastn(Altschul, 1997)である。BLASTpの典型的なパラメーターは: Expectation value: 10 (デフォルト); Filter: seg (デフォルト); Cost to open a gap: 11 (デフォルト); Cost to extend a gap: 1 (デフォルト); Max. alignments: 100 (デフォルト); Word size: 11 (デフォルト); No. of descriptions: 100 (デフォルト); Penalty Matrix: BLOWSUM62である。

【0094】

多くの異なる生物からの配列を含むデータベースを検索する場合、典型的にはアミノ酸配列を比較する。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当技術分野で公知のblastp以外のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、FASTA、GCG Version 6.1のプログラムを使用して比較され得る。FASTAは、クエリーと検索配列の間の最高のオーバーラップの領域のアライメント及び配列同一性の割合を提供する(Pearson, 1990、参照により本明細書に組込まれる)。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性の割合は、参照により本明細書に組込まれるGCG Version 6.1で提供される、そのデフォルトのパラメーター(word size 2及びPAM250 scoring matrix)を用いてFASTAを使用して決定され得る。

【0095】

いくつかの例では、「アイソザイム」は、同じ機能的変換/反応を行うが、構造が類似しておらず、典型的には「相同」ではないと決定されるものに使用され得る。例えば、glpxはfbpのアイソザイムであり、tktBはtktAのアイソザイムであり、talAはtalBのアイソザイムであり、rpiBはrpiAのアイソザイムである。

【0096】

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電の極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。以下の6つの群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：1)セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リシン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アラニン(A)、バリン(V)、及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。

【0097】

本開示は、組換え微生物の生成又は本明細書に記載の酵素システムに有用な、様々な遺伝子、相同体、及び変異体のアクセッション番号を提供する。更に、図1A～Bに記載した本開示の実施に有用な様々な酵素の配列もまた提供する。当業者は、本明細書で提供する任意の及び全ての配列は、1～10個の保存的アミノ酸置換(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10、及びいくつかの場合ではそれ以上)によって変えられ得ることを認識するであろう。本明細書で提供する配列を使用してBLAST検索を実施することにより、本明細書の配列と80～99%同一(例えば、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%同一)であり、所望の活性を有する配列が同定されることが更に理解されるであろう。本明細書に記載の相同体及び変異体は、例示であり、非限定的であることが理解されるべきである。更なる相同体、変異体及び配列は、ワールドワイドウェブ上でアクセス可能な、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)を含む様々なデータベースを使用して、当業者が入手可能である。

【0098】

本明細書で提供する組換え微生物の増殖及び維持に好適な培養条件が公知である。当業者は、そのような条件は各微生物の要求に適応するように改変され得ることを認識するであろう。アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、アセチル-CoA、又は限定はされないが、1-ブタノール、n-ヘキサノール、2-ペンタノン及び/又はオクタノール産物を含むそれら由来の他の代謝物の産生に有用な適切な培養条件は、培養培地のpH、イオン強度、栄養素の含量等の条件；温度；酸素/CO₂/窒素含量；湿度；光及び宿主微生物又は酵素システム、例えば、微生物又は酵素の代謝作用による化合物の産生を可能にする他の培養条件を含む。適切な培養条件は、宿主細胞として役立ち得る微生物に関して周知である。

【0099】

微生物の範囲は、化学成分(例えば、アセチル-CoA、ピルビン酸、G3P、n-ブタノール、n-ヘキサノール、オクタノール及びその他)の産生に好適な組換え代謝経路、又はその一部を含むように改変され得ることが理解される。様々な微生物が、本明細書で提供する組換え微生物における使用に好適な標的酵素をコードする遺伝材料の「供給源」として機能し得ることも理解される。

【0100】

用語「微生物」は、古細菌、細菌、及び真核生物ドメインからの原核及び真核微生物種を含み、後者は酵母及び糸状菌、原虫、藻類、又は高等原生生物を含む。用語「微生物細胞」及び「微生物（microbes）」は、用語「微生物」と交換可能に使用される。

【0101】

用語「原核生物」は、当技術分野において認識され、核又は他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は通常2つのドメイン、細菌及び古細菌のどちらかに分類される。古細菌ドメインと細菌ドメインの生物間の決定的な違いは、16SリボソームRNAのヌクレオチド塩基配列における基本的な違いに基づく。

【0102】

用語「古細菌」は、典型的には通常ではない環境で見出され、リボソームタンパク質の数及び細胞壁のムラミン酸の欠如を含むいくつかの基準によって残りの原核生物から区別されるメンドシクテス門の生物のカテゴリー分類を指す。ssrRNA分析に基づいて、古細菌は2つの系統的に異なる群:クレン古細菌門(Crenarchaeota)及びユリ古細菌門(Euryarchaeota)からなる。それらの生理学に基づき、古細菌は3つの型:メタン生成菌(メタンを産生する原核生物)、高度好塩菌(非常に高い塩[NaCl]濃度で生育できる原核生物)、及び超(高度)好熱菌(非常に高い温度で生育する原核生物)に組織化できる。細菌からそれらを区別する古細菌の特性(例えば、細胞壁のムレインがない、エステル結合膜脂質等)を統一するほかに、これらの原核生物は、それらの特定の生息場所にそれらを適応させる独特な構造又は生化学的な性状を示す。クレン古細菌門は主に高度好熱菌の硫黄依存性原核生物からなり、ユリ古細菌門はメタン菌及び高度好塩菌を含有する。

【0103】

「細菌」又は「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下に示す少なくとも11個の異なる群を含む:(1)グラム陽性(グラム+)細菌、これには2つの主な細分がある:(1)高G+C群(放線菌(Actinomycete)、マイコバクテリア(Mycobacteria)、ミクロコッカス(Micrococcus)、その他、(2)低G+C群(桿菌(Bacillus)、クロストリジウム菌(Clostridia)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、ブドウ球菌(Staphylococci)、連鎖球菌(Streptococci)、マイコプラズマ(Mycoplasmas));(2)プロテオバクテリア(Proteobacteria)、例えば紫色光合成+非光合成グラム陰性細菌(最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む);(3)シアノバクテリア(Cyanobacteria)、例えば酸素性光栄養生物;(4)スピロヘータ(Spirochetes)及び関連種;(5)プランクトミセス(Planctomyces);(6)バクテロイデス(Bacteroides)、フラボバクテリア(Flavobacteria);(7)クラミジア(Chlamydia);(8)緑色硫黄細菌(Green sulfur bacteria);(9)緑色非硫黄細菌(Green non-sulfur bacteria)(嫌気性光栄養生物も);(10)放射線抵抗性小球菌及び近縁種;並びに(11)テルモトガ(Thermotoga)及びテルモシフォ サーモフィルス(Thermosipho thermophiles)。

【0104】

「グラム陰性細菌」は、球菌、非腸溶杆体、及び腸溶杆体を含む。グラム陰性細菌の属としては、例えば、ナイセリア(Neisseria)属、スピリルム(Spirillum)属、パスツレラ(Pasteurella)属、ブルセラ(Brucella)属、エルシニア(Yersinia)属、フランシセラ(Francisella)属、へモフィルス(Haemophilus)属、ボルデテラ(Bordetella)属、大腸菌(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、赤痢菌(Shigella)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、プロテウス(Proteus)属、ビブリオ(Vibrio)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バクテロイデス(Bacteroides)属、酢酸菌(Acetobacter)属、好気菌(Aerobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、窒素固定菌(Azotobacter)属、スピリルム(Spirilla)属、セラチア(Serratia)属、ビブリオ(Vibrio)属、根粒菌(Rhizobium)属、クラミジア(Chlamydia)属、リケッチア(Rickettsia)属、トレポネーマ(Treponema)属、及び紡錘菌(Fusobacterium)属が挙げられる。

【0105】

「グラム陽性細菌」は、球菌、非芽胞性杆体、及び芽胞性杆体を含む。グラム陽性細菌の属としては、例えば、放線菌(Actinomyces)属、桿菌属、クロストリジウム(Clostridium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エリシペロスリクス(Erysipelothrix)属、乳酸桿菌、リステリア(Listeria)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ミキソコッカス(Myxococcus)属、ノカルジア(Nocardia)属、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、連鎖球菌(Streptococcus)属、及びストレプトマイセス属が挙げられる。

【0106】

別の実施形態では、先に述べたように、上記のいずれかの実施形態に記載した組換え生物は、任意の又は全ての酵素的ポリペプチドを発現する条件下で培養され、次いで、培養物が溶解され、又は図1に記載の経路を実行するのに必要な酵素活性を有する無細胞調製物が調製される。

【0107】

先に述べたように、ベクター、プロモーター、及び多くの他の関連課題の使用を含む、本明細書で有用な分子生物学的技術を記載する一般的な文書は、Berger及びKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) ("Berger"); Sambrookら、Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2d ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook")及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業、(1999年に補足された) ("Ausubel")を含み、その各々は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。

【0108】

例えば、本開示の相同な核酸の産生のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβレプリカーゼ増幅法、及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)を含む、in vitro増幅法を通して技術者を導くのに十分なプロトコールの例は、Berger、Sambrook、及びAusubel、並びにMullisら、(1987)米国特許第4,683,202号; Innisら編、(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.) ("Innis"); Arnheim & Levinson (1990年10月1日) C&EN 36～47頁; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81～94頁; Kwohら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173頁; Guatelliら(1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874頁; Lomellら(1989) J. Clin. Chem 35: 1826頁; Landegrenら、(1988) Science 241: 1077～1080頁; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291～294頁; Wu及びWallace (1989) Gene 4:560頁; Barringerら(1990) Gene 89:117頁;並びにSooknanan及びMalek (1995) Biotechnology 13:563～564頁に見出される。

【0109】

in vitroで増幅した核酸のクローニングのための改善された方法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載される。

【0110】

PCRによって大きな核酸を増幅するための改善された方法は、Chengら (1994) Nature 369: 684～685頁及びそこに引用される文献に要約され、ここでは最大40kbのPCR増幅産物が生成される。当業者は、本質的に任意のRNAが、逆転写酵素及びポリメラーゼを使用して、制限分解、PCR増幅及びシーケンシングに好適な2本鎖DNAへと変換され得ることを認識するであろう。例えば、Ausubel、Sambrook及びBerger、上述の全てを参照されたい。

【0111】

無細胞システムが使用される場合、細胞生存のための発現及び代謝フラックスは考慮する必要がある因子でないことは、当業者には明白であり、留意すべきである。むしろ、酵素は、所望の活性を有する任意の酵素であり得る。そのような酵素は当技術分野で容易に同定され、発現/クローニングによって容易に入手可能であり、様々な製造業者から購入され得る。

【0112】

本発明は、以下の実施例に例示され、それらは例示の目的で提供され、限定することを意図しない。

【0113】

[実施例]
in vitroシステムを構築するため、全ての酵素は市販で入手するか又はアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、活性を試験され、適切に選択された反応緩衝液中で一緒に混合される。

【0114】

材料
MillerのLB培地又はMillerのLBアガー(BD Difco社)を、液体又は固体培養培地での細菌株の増殖に使用した。大腸菌BL21Gold(DE3)[B、F-、ompT、hsdSB、(rB-、mB-)、dcm+、Tetr、galλ、(DE3) endA、Hte](Agilent社)を、pETベクターを使用する組換えタンパク質のクローニングと発現の両方のための宿主として使用した。プラスミドpET28a(+)は、Novagen社から購入した。ゲノム又はプラスミドDNAから遺伝子を増幅するために、HotStart Taq Mastermix(Denville社)を使用した。KOD Xtreme DNAポリメラーゼ(Toyobo社)、Taq DNAリガーゼ(MCLab社)、及びT5エキソヌクレアーゼ(Epicenter社)は別々に購入し、アセンブリーマスターミックス(AMM)を作製するために使用し、クローニング21に使用した。ATP、グルコース、コエンザイムA、NADP+、グルタチオン、及びNAD+はSigma社のものである。

【0115】

酵素の略語及びEC番号を表Aに列挙する。

【0116】

【表1】

【0117】

プラスミド構築
PHB酵素の発現プラスミドは、NdeI及びSacI切断部位を使用してpET28aプラスミド骨格から構築され、精製のためにN末端に6×Hisタグを有する構築物を作製した。TktA、TalB、及びRpiAの発現構築物は、ベクターpCAN24にクローニングしたASKAコレクション(RIKEN)からのものである(Kitagawaら、DNA Res. Int. J. Rapid Publ. Rep Genes Genomes、12:291～299頁、2005)。この研究に使用した遺伝子を表Bに列挙する。ポリヒドロキシ酪酸シンターゼ(phaC; HE_610111)をコードする遺伝子は、合成し、pET28a発現ベクターにサブクローニングする前に大腸菌宿主での発現のためにコドン最適化した。

【0118】

【表2】

【0119】

酵素精製
1Lの培養からの細胞を遠心分離によって回収し、150mM Tris pH7.5、100mM NaClに再懸濁した。細胞は、超音波処理により氷上で溶解し、細胞片を4℃で、12,000gの遠心分離によって除去した。次いで上清を5mLのニッケル-ニトリロトリ酢酸(NTA)アガロースと混合し、30分後、スラリーをカラムに充填し、5倍のカラム体積の100mM Tris pH7.5、100mM NaCl、15mMイミダゾールで洗浄した。次いで、酵素を、250mMイミダゾール、100mM Tris pH7.5で溶出した。得られた酵素を、50mM Tris pH7.5、50mM NaClに透析し、4℃で保存した。

【0120】

酵素活性アッセイ
この研究で使用した全ての酵素は、表Bに概説したようにアッセイした。酵素は、最終グルコースをPHB反応条件に反映する50mM Tris緩衝液、pH7.5、5mM MgCl、及び5mM KCl中でアッセイした。NAD(P)H産生又は消費反応の活性は340nmでモニターした。ATP消費酵素の活性は、Zwf及びNADP⁺を用いる対のアッセイを使用して340nmでモニターした。

【0121】

PHB反応への最初のグルコース及び最適化
PHBへのグルコースの自己持続性の生体内分解のための最初の反応は、200μLの最終用量中に50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl、5mM KCl、1mM CoA、0.5mM NAD⁺、0.5mM NADP⁺、50mMグルコース、0.1mMチアミンピロリン酸(thyamine pyrophosphate)、2mMグルタチオン、及び10mM無機リン酸からなる。酵素濃度は表Bに示す。反応はグルコースの添加によって開始され、PHB産生は600nmでの吸光度によって又はGCアッセイを使用してモニターした。

【0122】

ボトルネック酵素を見出し、反応における酵素レベルを最適化するため、本発明者らは単一の酵素の濃度を体系的に減少させ、PHBにおける類似の減少について反応をモニターした。反応は、グルコースからPHBへの最初の生体内変換と同じ緩衝液と補助因子で再構築され、20種のPBG経路の酵素のうち19種は一定に維持し、1つの酵素を5倍から25倍減少させた。これを20種の酵素それぞれについて体系的に行い、10時間後のPHBの蓄積をA₆₀₀によってモニターした。

【0123】

最終の半連続式のグルコースからPHBへの反応及び分析
PHBへのグルコースの自己持続性の半連続式生体内変換のための最初の反応は、200μLの最終体積中に50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl、5mM KCl、1mM CoA、0.5mM NAD⁺、0.5mM NADP⁺、50mMグルコース、0.1mMチアミンピロリン酸、2mMグルタチオン、及び10mM無機リン酸からなるものとした。酵素濃度は表Bに示す。反応はグルコースの添加によって開始され、室温で10時間インキュベートした。PHBは遠心分離によって回収し、上清をピペットにより除き、更なるPhaCを添加して、バイオプラスチックと沈殿したPhaCを置換した。各添加は、PhaCの開始量と同一であった。残りのグルコースは、Megazyme社の酵素結合アッセイ(K-GLOX 04/14)をそれぞれ10時間通した各反応の開始時及び後に測定された。反応は600nmでモニターされ、PHBは各10時間のサイクルの後に定量された。各反応は、三連で設定され、データは残存グルコース及びPHB産物両方の平均及び標準偏差を表す。

【0124】

PHBについてアッセイするため、反応混合物から顆粒を回収し、60℃で4時間乾燥した。乾燥PHBを0.5mLクロロホルム及び0.25mL PHA溶液(85mLメタノール、15mL H₂SO₄,及び0.7g安息香酸)に溶解し、95℃で4時間インキュベートした。反応物は、0.5mLの水で抽出し、1μLの有機相をHP5890 Series IIガスクロマトグラムの0.25ミクロンのHP-Innowaxカラムに注入した。ガスクロマトグラフィー法は、45℃に5分間維持され、次いで275℃まで40分以上かけて上げられる注入温度を使用した。ピーク領域を確かな（authentic）標準と比較し、濃度を定量した。

【0125】

パージバルブのための酵素工学
Zwf及びGnd野生型酵素の両方は、NAD⁺よりもNADP⁺に強い優先度を有する。したがって、酵素は、NADP⁺よりもNAD⁺を好むように「再操作」される必要がある。Zwf及びGndの補助因子特異性を反転させるため、NADP⁺結合ポケットの変異を構造モデルに基づいて設計した。まず、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスからのZwf酵素の相同モデルを、NADPHが結合したリュコノストック・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)からのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの結晶構造に基づいて作製した(参照により本明細書に組込まれる、PDBID 1E7Y参照)。NADPH結合構造を有するモデルの比較は、GsZwfのA47が、リボースの2'位のリン酸から4.0Å以内に来るであろうことを示す。結果として、GsZwfのA47D変異型を作製し、補助因子特異性についてアッセイした。表Bに示す動態パラメーターは、A47D変異が酵素の特異性を逆にすることを示す。特に、野生型GsZwfに関して、kcat/Kmは、NAD⁺よりもNADP⁺の方が14倍高いが、再改変された変異型のkcat/KmはNAD⁺の方がほぼ5倍高い。

【0126】

Gndでは、NADP⁺が結合してはいない、G.ステアロサーモフィルス(GsGnd)からの酵素の結晶構造がある。NADP⁺結合部位をモデル化し、GsGndにおける結合に重要であり得る残基を同定するため、GsGnd構造をヒツジからのNADP⁺結合構造の1PGNとアラインした。NAD⁺依存性レダクターゼとの配列比較並びに2'リン酸への近接に基づいて、NADP⁺を除くため、一連の変異を導入した(R34Y、N33D及びK38L)。R34Y変異は、枯草菌からの二重特異性酵素gntZにおいてR34がYに変更されているために選択し、N33D変異は、NAD⁺依存性デヒドロゲナーゼにおいて保存N33がAspであるために選択した。K38L変異は、NADP⁺のリン酸を立体的に干渉するように設計した。GsGndの三重変異型、N33D/R34Y/K38Lの動力学及び特異性を表Bに示す。野生型Gnd酵素は、NADP⁺にわずかな好みを有するが、三重変異型は十分にNADP⁺(kcat/Km=0.5)を除外し、パージバルブノードに役立つNAD⁺との活性(kcat/Km=1.2)を保持する。

【0127】

ATP生成ホスホフルクトキナーゼの同定
PBG経路の一態様は、フルクトース-1,6-ビスリン酸のフルクトース-6-リン酸への変換中の、ATPの定量的再生成である。類似の反応が、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼによる天然の糖新生で行われるが、それはATPよりも無機リン酸を生成する。通常、Pfkは、F6PからFBPへのATP依存的リン酸化を触媒し、それはEMP経路の主要な調節工程である。Pfkの2つの異なるアイソフォーム、PfkA及びPfkBが様々な生物から同定され、特徴付けられてきたが、逆反応(FBP及びADPからF6P及びATP)はin vivoでは起こらないと通常考えられ、したがって糖新生において非リン酸化Fbpアーゼの使用も起こらないと考えられる。PBG経路を実行する前に、逆反応でATPを効率的に生成するPfk酵素を見出す努力がなされた。PfkA及びPfkBはin vitroで逆反応を触媒できることが報告されており、従って大腸菌のPfkA、大腸菌のPfkB、G.ステアロサーモフィルスのPfk、並びにPEP及びGDPによるアロステリック阻害を消失させるG.ステアロサーモフィルスのPfkの調節変異株(R211A)を含む、複数の酵素をスクリーニングした。このスクリーニングから、大腸菌のPfkBは、PBGサイクルに使用するのに十分高いフラックスでATPを効率的に生成することが見出された。

【0128】

酵素の獲得及び精製
代替法では、6種のタンパク質(Fba、Glk、Zwf、Tpi、Pgi、及びPfk)をSigma-Aldrich社から購入し、他のタンパク質(例えば、Tkt、Tal、Rpe、Rpi)を研究室内で精製する。全ての市販の酵素はSigma Chemical Co. (St. Louis、Mo.)から購入する。ウサギの筋肉はTpi及びFbaの供給源であり、パン酵母はGlk、Zwf、及びPgiの供給源であり、バチルス・ステアロサーモフィルスはPfkの供給源である。

【0129】

全ての市販されていないタンパク質は、N末端の6×ヒスチジンタグと共に高発現プラスミドpQE9(Qiagen社、Chatsworth、CA)に入れ、XL1-Blue(Stratagene社)にクローニングする。同じクローニング株における発現は、細胞が0.4～0.6のODで誘導され、0.1mM IPTGで4時間誘導された場合、高収率をもたらす。精製は、His-Spin Protein Miniprep kit (Zymo Research社、Orange、CA)に記載されたプロトコールに従って行われる。F/Xpkを除く全ての遺伝子配列は、大腸菌のJCL16 gDNAから得られる。特に、rpe、rpiA、tktA、talB、及びackAは、大腸菌からクローニングされる。F/Xpkは、ビフィドバクテリウム・アドレンセンティス(Bifidobacterium adolenscentis)からクローニングされる(ATCC15703 gDNA)。0.5～3ミリグラムのタンパク質が各溶出液から得られ、MINI PROTEAN II (Bio-Rad Laboratories社、Hercules、CA)を使用して、10μLの希釈したタンパク質試料をロードしてSDS-PAGEによって純度を分析することができる。各精製した酵素の活性を確かめるため、いくつかのNADPH関連の対のアッセイシステムが使用される。50mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS) pH7.5、5mM MgCl₂、及び1mM TPPからなる「酵素緩衝液」を使用して、上記の市販の酵素(Glk、Zwf、及びPgi)を使用して、高い活性が確立される。NADPHの産生はノイズが少なく、次いでグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼによるNADHの変性をもたらすため、Zwf関連アッセイが使用される。全ての対のアッセイは、G6Pの形成で終了し、これはグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)によって6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトン(PGL)へと酸化される。

【0130】

酵素活性及び最適化
NoxEは、340nmでNAD(P)Hの酸化をモニターすることによってアッセイした。アッセイは、100mM tris-HCl pH 7.5、5mM MgCl₂、5mM KCl、及び0.2mM NAD(P)H中で行った。

【0131】

合成生化学システムの最初の試験として、全てのPBG酵素(図1参照)(以下に記載のサルベージ経路を除く)及びPHB生合成経路を、補助因子と混合し、その後、50mMグルコースを添加して反応を開始した。

【0132】

PhaC(PHBシンターゼ)を欠く対照のものと比較して、600nmで明らかな混濁の増加が観察され、PHBが産生されたことが示された。にもかかわらず、最初の試験での速度及び収率は悪かった。

【0133】

PBGサイクルは、Xfpが、X5P及びフルクトース-6-リン酸(F6P)の両方に対してホスホケトラーゼ活性を有することから、複雑である。F6Pとの第二の反応は、行き止まりの産物としてエリトロース-4-リン酸(E4P)を産生することにより潜在的に無駄なトラップを生じるであろう。この問題を解決するため、3つの更なる酵素、トランスケトラーゼA(TktA)、トランスアルドラーゼB(TalB)、及びリボース-5-リン酸イソメラーゼ(RpiA)が非酸化的なペントースリン酸経路から加えられ、E4PはPBGサイクルにフィードバックされる(図1参照)。E4Pサルベージ経路の酵素(TktA、TalB、及びRpiA)が添加される場合、経路を通るフラックスの劇的な増大が観察された。

【0134】

各パージバルブノードの効率が分析され、このシステムを駆動するNADPHレベル及び炭素フラックスを維持するために両方のパージバルブが必要であるかどうか決定した。サルベージ経路を含む、完全なin vitroシステムを、Zwfパージバルブのみ(すなわち、NADP⁺特異的Gnd酵素を除く)、Gndパージバルブのみ、又は両方のいずれかで再構築し、PHB蓄積の速度を評価した。Gndパージバルブを省くと、Gndパージバルブのみ又は両方のパージバルブを同時に使用した場合に得られたフラックスの約半分だけが産生された。PHB産生のGndノードへの依存性は、Gndが、CO₂の放出によって駆動される酸化的ペントースリン酸経路の工程に関与するという事実によるようである。

【0135】

システムにおいて酵素のボトルネックが存在するかどうか決定するため、各酵素の開始量の1/5又は1/25で、他の酵素は一定に維持して経路を体系的に再構築した。ほとんどの酵素に関して、濃度を25倍下げることの影響はほとんどから全くなく、例外はGlk及びXfpであり、これらが潜在的なボトルネックであることを示している。従って、Glk及びXfpの濃度は、したがって最終システムで2倍に増加された。

【0136】

PBG経路の効率及び寿命を評価するため、グルコースの1回の大量の最初のインプットを処理するシステムの能力を調べた。しかしながら、実用上の制約は、使用された1型PHBシンターゼ(PhaC)が、成長するPHB鎖の末端に共有結合を維持するという事実であり、PHBを除去して産生された量を定量的にアッセイする場合に、PhaCも除去された。したがって、システムは半連続的な様式で実行され、規則的な時点でバイオプラスチックが定量的アッセイのために遠心分離によって除去され、次いで新しいPhaCが添加され、反応を進行させた。これらの実験では、PhaC以外の添加はなかった。

【0137】

最適化したシステムの機能及び安定性をモニターするため、PBG経路を使用して、グルコースの1回添加から、60.7又は109.2mMのグルコースをPHBに変換した。反応は、グルコースの添加によって開始し、システム中のフラックスを維持するための補助因子又は代謝物のいずれの添加もなく最長55時間(2.3日)まで続けさせた。反応は600nmでの吸光度によって継続的におおまかにモニターされ得るが、より厳密な定量的評価のため、GCアッセイを使用した。各10時間のサイクルの後、沈殿したPHBをペレットにし、遠心分離によって取り出し、アッセイした。

【0138】

60.7mMグルコースで反応を開始した場合、最初の10時間サイクルでPHBの急速な産生が観察されたが、次いでグルコースが消費されると反応速度は低下した。3回目のサイクルの終わりまでに、単に消費するグルコースがこれ以上ないために反応が停止した。反応により、57±6mM PHB(モノマーの等価物)が産生され、これは収率94%に相当する。

【0139】

システムがより長い期間グルコースを処理できるかどうか見るために、グルコースの初期濃度を109.2mMまで上昇させた。結果は、より高いグルコースの開始濃度で5サイクルの間強い活性を示し、最終的には93.8±6.1mM PHB(モノマー等価物)を提供し、収率86%に相当した。PBGサイクルの最大の生産性は、PHB 0.7g/L/時間であり、システムは室温での全55時間の実行に渡り最大活性の>50%を維持し、力価はグルコース19.7g/LからPHB 9.8g/Lであった。

【0140】

達成された高収率及び高力価は、グルコースが使用され、全ての補助因子が完全にリサイクルされたことを考慮すると特に注目すべきことであるが、in vitroでPHBを産生する他の試みは犠牲的な基質及び高価なビルディングブロックによるものであった。エタノール工業からの経験に基づくと、最大生産のために少しの努力しかなされなかったが、産生値は工業生産20に必要な通常許容される閾値にすでに近いものである(生産性1 g/L/時間及び力価40 g/Lで、収率90%)。

【0141】

ここに提示する添付の配列表は、表Cに記載のタンパク質及び酵素の配列を含む。当業者は、添付の表及び配列表を使用して相同体及び変異体を容易に理解するであろう。例えば、本明細書で同定した任意の配列を使用するBLASTの使用により、配列表に提供した配列と容易に置換され得る更なる配列が同定されるであろう。更に、当業者は図1A～Dの生物学的工程及び反応並びに表Cの酵素を容易に同定し、本開示の反応及び方法を定義及び理解することができる。

【0142】

【表3】

【0143】

本発明のいくつかの実施形態を記載してきた。にもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な改変がなされ得ることが理解されるだろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、以下を提供する。
１． 基質をアセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、又はアセチル-CoAに変換する複数の酵素的工程を含む、組換えの、人工的な、又は操作された代謝経路であって、該経路が補助因子の不均衡な産生及び利用を含み、該経路が該補助因子をリサイクルする非天然のパージバルブ経路を含み、該パージバルブ経路が、複数の酵素的工程の1つ以上において該補助因子を使用して代謝物を中間体又は産物に変換する酵素を含む、組換えの、人工的な、又は操作された代謝経路。
２． 前記補助因子が酸化/還元補助因子である、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
３． 前記酸化/還元補助因子がNAD⁺/NADH、NADP⁺/NADPH又はFAD⁺/FADHである、上記2に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
４． 第一の補助因子がNAD⁺/NADHを含み、第二の補助因子がNADP⁺/NADPHを含む、上記2又は3に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
５． 前記パージバルブ経路がNADHオキシダーゼを含む、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
６． 前記NADHオキシダーゼがNoxE又はその相同体である、上記5に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
７． 前記NADHオキシダーゼが配列番号18と少なくとも50%同一の配列を含む、上記6に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
８． 前記経路が以下:
(i)グルコースをグルコース-6-リン酸に変換すること、
(ii)グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換すること、
(iii)6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換すること、
(iv)6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換すること、
(v)リブロース-5-リン酸をキシルロース-5-リン酸に変換すること、
(vi)キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸及びアセチルリン酸に変換すること、
(vii)フルクトース-6-リン酸からアセチルリン酸及びエリトロース-4-リン酸(E4P)を産生すること、
(viii)グリセルアルデヒド-3-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸に変換すること又はその逆、
(ix)グリセルアルデヒド-3-リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸をフルクトース-1,6-ビスリン酸に変換すること、並びに
(x)フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸及びポリリン酸に変換すること
を行う、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
９． 以下の酵素:
(a)ホスホケトラーゼ(F/Xpk又はXfp)、
(b)トランスアルドラーゼ(Tal)、
(c)トランスケトラーゼ(Tkt)、
(d)リボース-5-リン酸イソメラーゼ(Rpi)、
(e)リブロース-5-リン酸エピメラーゼ(Rpe)、
(f)トリオースリン酸イソメラーゼ(Tpi)、
(g)フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(Fba)、
(h)グルコキナーゼ(Glk)、
(i)グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf)、
(j)6-ホスホ-グルコノラクトナーゼ(pgl)、
(k)6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)、
(l)ホスホグルコイソメラーゼ(Pgi)、及び
(m)ホスホフルクトキナーゼ(pfk)
を含む、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１０． 前記経路が無細胞システムである、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１１． 前記経路が微生物中で操作され、発現される、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１２． 前記微生物が原核生物又は真核生物である、上記11に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１３． 前記微生物が酵母である、上記12に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１４． 前記微生物が原核生物である、上記12に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１５． 前記微生物が大腸菌微生物由来である、上記14に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１６． 前記パージバルブ経路が、ヌクレオシド三リン酸又は二リン酸をヌクレオシド二リン酸又は一リン酸にそれぞれ変換する酵素を含む、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１７． 前記パージバルブ経路がATP又はGTPをリサイクルする、上記16に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１８． 前記パージバルブ経路がヌクレオシド三リン酸加水分解活性を有するポリペプチドを含む、上記16に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
１９． 前記ポリペプチドがMnmE、FtsZ、及びMcrBCからなる群から選択される、上記18に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２０． 前記MnmEポリペプチドが、配列番号34又は36と少なくとも80%同一の配列を含み、三リン酸加水分解活性を有する、上記19に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２１． 前記FtsZポリペプチドが、配列番号38と少なくとも80%同一の配列を含み、三リン酸加水分解活性を有する、上記19に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２２． 前記McrBCが、配列番号40と少なくとも80%同一の配列を含み、三リン酸加水分解活性を有する、上記19に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２３． 前記経路がグルコースからアセチル-coAを産生する、上記1に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２４． 前記経路が無細胞システムであり、
(a)配列番号19と少なくとも85%同一の配列を有し、グルコースをグルコース-6-リン酸に変換するグルコキナーゼ、
(b)配列番号22又は24と少なくとも85%同一であり、グルコース-6-リン酸を6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンに変換するグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、
(c)配列番号18と少なくとも85%同一の配列を有し、NAD(P)HをNAD(P)⁺に変換するNAD(P)Hオキシダーゼ、
(d)配列番号26と少なくとも85%同一の配列を有し、6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトンを6-ホスホ-D-グルコン酸に変換する6-ホスホグルコノラクトナーゼ、
(e)配列番号27と少なくとも85%同一の配列を有し、6-ホスホ-D-グルコン酸をリブロース-5-リン酸に変換する6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、
(f)配列番号6と少なくとも85%同一の配列を有し、リブロース-5-リン酸をキシルロース-5-リン酸に変換するリブロース-5-リン酸エピメラーゼ、
(g)配列番号8と少なくとも85%同一の配列を有し、リブロース-5-リン酸をリボース-5-リン酸に変換するリボース-5-リン酸イソメラーゼ、
(h)配列番号2又は55と少なくとも85%同一の配列を有し、(1)キシルロース-5-リン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸に及び/又は(2)フルクトース-6-リン酸をエリトロース-4-リン酸に変換するキシルロース-5-リン酸/フルクトース-6-リン酸ホスホケトラーゼ、
(i)配列番号57と少なくとも85%同一であり、フルクトース-6-リン酸をグルコース-6-リン酸に変換するグルコース-6-リン酸イソメラーゼ、
(j)配列番号20、52又は53と少なくとも85%同一であり、フルクトース-1,6-ビスリン酸をフルクトース-6-リン酸に変換するホスホフルクトキナーゼ、
(k)配列番号16又は51と少なくとも85%同一であり、グリセルアルデヒド-3-リン酸をフルクトース-1,6-ビス-リン酸に及び/又はフルクトース-1,6-ビス-リン酸をジヒドロキシアセトンリン酸に変換するフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ、
(l)配列番号14と少なくとも85%同一であり、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸に変換するトリオースリン酸イソメラーゼ、
(m)配列番号10と少なくとも85%同一であり、エリトロース-4-リン酸及びフルクトース-6-リン酸を含む基質からセドヘプツロース-7-リン酸を産生するトランスアルドラーゼ、
(n)配列番号12と少なくとも85%同一であり、(1)セドヘプツロース-7-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸からのリボース-5-リン酸及びキシルロース-5-リン酸;並びに/又は(2)キシルロース-5-リン酸及びエリトロース-4-リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸及びフルクトース-6-リン酸、を含む代謝物を産生するトランスケトラーゼ、並びに
(o)配列番号56と少なくとも85%同一であり、アセチルリン酸をアセチル-CoAに変換するホスホトランスアセチラーゼ
を含む、上記23に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２５． 前記無細胞システムが、n-ブタノール、n-ヘキサノール、ヘキサン酸、アセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシブチリル-CoA、及び/又はPhBの産生のための酵素を更に含み得る、上記24に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。
２６． AtoB、Hbd、Crt、Ter、BktB、及びAdhEからなる群から選択される1種以上の酵素を更に含む、上記25に記載の組換えの、人工的な、又は操作された経路。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A-1】

【図2A-2】

【図2A-3】

【図2A-4】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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