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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-22
(45)【発行日】2022-12-01
(54)【発明の名称】トルラ酵母由来のβ－グルカン
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20221124BHJP
C08B 37/00 20060101ALI20221124BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16 J
C08B37/00 C
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2018132780
(22)【出願日】2018-07-13
(65)【公開番号】P2020010602
(43)【公開日】2020-01-23
【審査請求日】2021-07-12
(73)【特許権者】
【識別番号】594158150
【氏名又は名称】学校法人君が淵学園
(73)【特許権者】
【識別番号】519127797
【氏名又は名称】三菱商事ライフサイエンス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100160978
【弁理士】
【氏名又は名称】榎本 政彦
(72)【発明者】
【氏名】田丸 俊一
(72)【発明者】
【氏名】福田 雄典
(72)【発明者】
【氏名】阿孫 健一
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－２１０８９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０６５７３２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】応用糖質科学，2013年，Vol.3，p.253-255
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／１６
Ｃ０８Ｂ ３７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
酵母菌体を１０００～１０００００ｐｐｍの濃度で次亜塩素酸ナトリウム処理する工程、及び前記工程の後に、前工程の次亜塩素酸ナトリウム処理濃度よりも、高濃度で次亜塩素酸ナトリウム処理する工程を含む、β―１，３―１，６―グルカンの製造方法。
【請求項2】
酵母菌体が、酵母エキス抽出後の酵母菌体残渣である請求項１のβ―１，３―１，６―グルカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トルラ酵母菌体を特定の方法で処理することで得られるグルカンに関する。
【背景技術】
【0002】
グルカンは、植物、細菌、真菌類などの細胞壁を構成する主要な成分である。例えば、酵母の細胞壁は、多糖類で構成されているが、その成分は、グルカン類、マンナン類、キチン等である。酵母のグルカンにおいては、β―１，３連結グルコシル残基から構成され、β―１，３およびβ―１，６連結のグルコシル残基のグルカンで構成されている。
【0003】
また、近年、ナノサイズの材料開発が行われている。単繊維の平均直径がナノスケールのナノファイバーもその一つであり、ナノファイバーを構成する原料物質として、多糖が知られている。多糖は、酵母細胞壁中など天然に存在しており、酵母は、食品等で産業利用されており、酵母細胞壁は、大量に産出されているため、安定供給の観点からも有利な原料となる。多糖系のナノファイバーとして、β１，４－グルカン、β１，３－グルカンを原料物質とするナノファイバーが知られている（特許文献１、２）。
【0004】
黒酵母（Aureobasidium属）の細胞壁は、β―１，３―１，６グルカンで構成されていることが知られているが、酵母の種類により、同様の構成なのかは不明な点も多い。また、酵母細胞壁から抽出したβグルカンは、水に不溶なため、より簡便でかつ多様な構造をとりうるβ―グルカンを製造する方法が求められている（特許文献３、４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開2011-184816号公報
【文献】特開2006-160770号公報
【文献】特開2008-308650号公報
【文献】特開2005-237289号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
このような背景のもと、可溶性のβグルカンの簡便な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、酵母細胞壁に高濃度の次亜塩素酸ナトリウム処理をすることで、アモルファス膜を形成することができるβグルカンを分離することを見出し、本発明を完成させた。
【0008】
より具体的には、
（１）酵母菌体を１０００～１０００００ｐｐｍの濃度で次亜塩素酸ナトリウム処理する工程、及び前記工程の後に、前工程の次亜塩素酸ナトリウム処理濃度よりも、高濃度で次亜塩素酸ナトリウム処理する工程を含む、β―１，３―１，６―グルカンの製造方法、
（２）酵母菌体が、酵母エキス抽出後の酵母菌体残渣である前記（１）のβ―１，３―１，６―グルカンの製造方法、
である。
（１）酵母菌体を１０００～１０００００ｐｐｍの濃度で次亜塩素酸ナトリウム処理する工程、及び前記工程の後に、前工程の次亜塩素酸ナトリウム処理濃度よりも、高濃度で次亜塩素酸ナトリウム処理する工程を含む、β―１，３―１，６―グルカンの製造方法、
（２）酵母菌体が、酵母エキス抽出後の酵母菌体残渣である前記（１）のβ―１，３―１，６―グルカンの製造方法、
である。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、溶解性の高いβ―１，３―１，６―グルカンを製造することができる。さらに、本発明の方法で製造したβ―１，３―１，６―グルカンは、三重らせん形性能を有するヒドロゲル化剤として使用できる。本発明の方法で製造したβ―１，３―１，６―グルカンは、機能性物質をらせん構造内に包含させることができるため、従来にない機能性ヒドロゲルを開発できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】β―１，３―１，６―グルカンの基本構造
【図2】製造例１で得られたβ―グルカンの1H NMRスペクトル
【図3】実施例１で得られたβ―グルカンが形成する透明薄膜中で2,6-ANSが示す円二色性スペクトル
【図4】実施例１で得られたβ―グルカンが形成するヒドロゲル中で2,6-ANSが示す円二色性スペクトル
【図5】実施例１で得られたβ―グルカンの1H NMRスペクトル
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下に、本発明を具体的に説明する。本発明において原料として用いることのできる酵母菌体の種類は、特に制限がない。酵母の種類により、本発明の方法で得られるβグルカンの製性質が異なると考えられる。使用する酵母は、たとえば、サッカロミセス、エンドミコプシス、サッカロミコデス、ネマトズボラ、キャンディダ、トルロプシス、プレタノミセス、ロドトルラなどの属に属する菌、あるいはいわゆるビール酵母、パン酵母、清酒酵母などが挙げられる。このうち、特に産業利用されているキャンディダ・ユティリス又はサッカロマイセス・セレビシエが望ましい。
【0012】
本発明は、常法のより培養された酵母菌体をそのまま処理することも可能であるが、より好ましくは、酵母菌体残渣を原料とすることが好ましい。本発明の酵母菌体残渣とは、酵母に熱水、酸・アルカリ性溶液、自己消化、機械的破砕のいずれか一つ以上を用いて抽出処理することにより、酵母エキスまたは有用成分を抜いた後の残渣である。例えば、興人ライフサイエンス（株）製の「ＫＲ酵母」が挙げられる。
このような残渣は一般的に、グルカン、マンナン、蛋白質、脂質や核酸を主要な成分とするものであるが、構造的にはグルカン、マンナンや蛋白質と他の成分が複合体となって強固に結合していることが推察される。
このような残渣は一般的に、グルカン、マンナン、蛋白質、脂質や核酸を主要な成分とするものであるが、構造的にはグルカン、マンナンや蛋白質と他の成分が複合体となって強固に結合していることが推察される。
【0013】
本発明のβグルカンの製造方法は、上述の酵母菌体残渣に水を加えて、菌体濃度は、任意であるが、通常は、乾燥菌体重量で約０．５～２０重量％濃度の菌体懸濁液を調製する。必要であれば、菌体懸濁液を遠心分離して洗浄し、再度水を加えて約０．５～２０重量％濃度の菌体懸濁液を調製する。調製した菌体懸濁液を、アルカリ剤、例えば、ＮａＯＨ等で、０．０５～０．５Ｍ（モル濃度）、好ましくは、０．１Ｍの濃度となるよう調整する。
【0014】
調整後、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）を１０００ｐｐｍ～１５０００ｐｐｍ濃度となるようＮａＣｌＯを加える。反応温度は、特に制限なく２～３５℃でよい。反応時間は、使用する酵母菌体、ＮａＣｌＯ濃度により適宜調整することができるが、０．５～３０時間で行う。
【0015】
本発明では、前段の１回目の次亜塩素酸ナトリウム処理の後に、２回目の次亜塩素酸ナトリウム処理をする。２回目のＮａＣｌＯ処理は、１回目のＮａＣｌＯ濃度より、高い濃度で行う。１回目のＮａＣｌＯ処理濃度に対して、２回目のＮａＣｌＯ処理濃度は濃度の２～５倍、より好ましくは３～４倍の濃度で行う。処理温度は、１回目と同じ温度で良い。反応時間は、１回目のＮａＣｌＯ処理時間よりも長時間行う。１回目の処理時間に対して、５～３０倍の時間で行う。ＮａＣｌＯ処理中は、撹拌をすることが好ましい。
【0016】
本発明の次亜塩素酸ナトリウム処理の例としては、1回目に１０００ｐｐｍ～５０００ｐｐｍで、３０分から２時間処理する。その後、次亜塩素酸ナトリウムを添加して、濃度が５０００ｐｐｍから１５０００ｐｐｍになるよう調整し、１～３０時間処理する。次亜塩素酸ナトリウム濃度以外の反応条件は、適宜調整して良く、処理中の温度は、４～２５℃で反応をする。反応中は、撹拌しても良い。
【0017】
本発明で得られたβ―グルカンは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析において、１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、β―１，３―１，６―グルカンであり、本発明の、β―１，３―１，６グルカンとは、β－１，３－グルコシド結合を主鎖に有しβ－１，６－グルコシド結合を側鎖に有するβ―グルカンである。
さらに、本発明で得られた、β―１，３―１，６―グルカンは、三重らせん構造形成し、ヒドロゲル化剤として利用できるβ―グルカンである。また、本発明で得られるβ―１，３―１，６―グルカンは、アルカリ条件（ｐＨ１０以上）で水溶性となる。
さらに、本発明で得られた、β―１，３―１，６―グルカンは、三重らせん構造形成し、ヒドロゲル化剤として利用できるβ―グルカンである。また、本発明で得られるβ―１，３―１，６―グルカンは、アルカリ条件（ｐＨ１０以上）で水溶性となる。
【実施例】
【0018】
以下に本願発明を具体的に記載するが、本願発明は、これに限定されない。
【0019】
（β―グルカンの製造例１）
「ＫＲ酵母」（興人ライフサイエンス社製）８ｇを固形分 １％（１ｇ／１００ ｍＬ）とし、０．１Ｍ ＮａＯＨとなるよう調整した。調整後４℃にて、次亜塩素酸ナトリウムを６０００ｐｐｍの濃度となるよう調整した。調整後、撹拌しながら、１時間、５時間、２４時間反応し、反応後、それぞれを延伸分離し、沈殿物を回収した。回収後、凍結乾燥により乾燥し、塩基性条件で１Ｈ―ＮＭＲ測定した。１Ｈ―ＮＭＲ測定の条件は、以下の通りである。
「ＫＲ酵母」（興人ライフサイエンス社製）８ｇを固形分 １％（１ｇ／１００ ｍＬ）とし、０．１Ｍ ＮａＯＨとなるよう調整した。調整後４℃にて、次亜塩素酸ナトリウムを６０００ｐｐｍの濃度となるよう調整した。調整後、撹拌しながら、１時間、５時間、２４時間反応し、反応後、それぞれを延伸分離し、沈殿物を回収した。回収後、凍結乾燥により乾燥し、塩基性条件で１Ｈ―ＮＭＲ測定した。１Ｈ―ＮＭＲ測定の条件は、以下の通りである。
【0020】
（１Ｈ―ＮＭＲ測定）溶媒には標準物質として、それぞれトリメチルシランまたは3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4acid, sodium saltを含む重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d6）または重水を用いた。塩基性条件で測定する場合は、少量のNaOHを添加してpHを調整した。5 mg/mL程度になる様に、試料と溶媒を混合し、この時点で不溶成分が見られる場合は、加熱および超音波照射により完全に溶解させた。得られた溶液を、1H NMR（400 MHz）装置にて２０℃または６０℃の条件で測定を行った。積算回数は３２回である。
【0021】
測定結果は、図２に示す。実施例１で得られたβ―グルカンは、β―１，３―１，６―グルカンであることが確認できた。
【0022】
（三重らせん形性能の確認）
一般に天然物から得られる、β―１，３―グルカンは、三分子が会合し、三重らせん構造を形成することが知られている。そこで、実施例１得られた、β―１，３―１，６グルカンに三重らせん構造形成能があるか確認した。実施例１で得られたβ―グルカンを水（アルカリ条件の場合はpH 10以上）に再度溶解し、２，６－ＡＮＳ（2,6-ANS;2-ANILINONAPHTHALENE-6-SULFONIC ACID）をマーカーとして、三重らせん構造形成能の確認を行った。
（膜系とゲル系の試料調製・測定）
膜系：β―グルカンをDMSOに懸濁した後、ヒートガンを用いて加熱することで、飽和条件に近い濃厚粘性DMSO溶液を調製した（おおよその濃度：100 mg/mL）。ここに、２，６－ＡＮＳのDMSO溶液を［２，６－ＡＮＳ］ = 1 mMになる様に添加した。この溶液を基板上に塗り広げ、薄い液膜を調製した。この液膜を水で穏やかに濯ぐことでDMSOを除去した結果、透明な膨潤膜が得られた。この膨潤膜を常温・常圧下で一晩静置することで乾燥し、トルラ酵母残渣由来β―グルカンからなる透明薄膜を調製した。この薄膜中で２，６－ＡＮＳが示す円偏光二色性を円二色性分散計で測定した。結果は図３に示す。
ゲル系：β―グルカンをバイアルに入れ、終濃度が1wt%, 2wt%になるように水を加え、さらに2,6-ANS水溶液を[2,6-ANS] = 1 mMになるように添加した。この懸濁液をヒートガンを用いて加熱し、β―グルカンを完全に溶解させた後、得られた溶液を速やかに石英セルに移し、室温で静置してゲルを形成させた。このゲル中で２，６－ＡＮＳが示す円偏光二色性を円二色性分散計で測定した。結果は図４に示す。
一般に天然物から得られる、β―１，３―グルカンは、三分子が会合し、三重らせん構造を形成することが知られている。そこで、実施例１得られた、β―１，３―１，６グルカンに三重らせん構造形成能があるか確認した。実施例１で得られたβ―グルカンを水（アルカリ条件の場合はpH 10以上）に再度溶解し、２，６－ＡＮＳ（2,6-ANS;2-ANILINONAPHTHALENE-6-SULFONIC ACID）をマーカーとして、三重らせん構造形成能の確認を行った。
（膜系とゲル系の試料調製・測定）
膜系：β―グルカンをDMSOに懸濁した後、ヒートガンを用いて加熱することで、飽和条件に近い濃厚粘性DMSO溶液を調製した（おおよその濃度：100 mg/mL）。ここに、２，６－ＡＮＳのDMSO溶液を［２，６－ＡＮＳ］ = 1 mMになる様に添加した。この溶液を基板上に塗り広げ、薄い液膜を調製した。この液膜を水で穏やかに濯ぐことでDMSOを除去した結果、透明な膨潤膜が得られた。この膨潤膜を常温・常圧下で一晩静置することで乾燥し、トルラ酵母残渣由来β―グルカンからなる透明薄膜を調製した。この薄膜中で２，６－ＡＮＳが示す円偏光二色性を円二色性分散計で測定した。結果は図３に示す。
ゲル系：β―グルカンをバイアルに入れ、終濃度が1wt%, 2wt%になるように水を加え、さらに2,6-ANS水溶液を[2,6-ANS] = 1 mMになるように添加した。この懸濁液をヒートガンを用いて加熱し、β―グルカンを完全に溶解させた後、得られた溶液を速やかに石英セルに移し、室温で静置してゲルを形成させた。このゲル中で２，６－ＡＮＳが示す円偏光二色性を円二色性分散計で測定した。結果は図４に示す。
【実施例1】
【0023】
（本願発明によるβ―グルカンの製造）
次亜塩素酸ナトリウムの処理を２段に行った以外は、製造例と同様に、ＫＲ酵母を用いて、β―グルカンの製造を行った。次亜塩素酸ナトリウム処理は、３０００ｐｐｍで１時間処理を行った後に、１０８００ｐｐｍとし、２４時間処理を行った。
実施例１で得られたβ―グルカンを製造例と同様に、１Ｈ―ＮＭＲ測定と三重らせん形性能の確認を行った。１Ｈ―ＮＭＲ測定の結果は、図５に示す。確認の結果、製造例と同様に、実施例１の方法で得られたβ―グルカンは、β―１，３―１，６グルカンであり、三重らせん構造形成能を有していることを確認できた。
次亜塩素酸ナトリウムの処理を２段に行った以外は、製造例と同様に、ＫＲ酵母を用いて、β―グルカンの製造を行った。次亜塩素酸ナトリウム処理は、３０００ｐｐｍで１時間処理を行った後に、１０８００ｐｐｍとし、２４時間処理を行った。
実施例１で得られたβ―グルカンを製造例と同様に、１Ｈ―ＮＭＲ測定と三重らせん形性能の確認を行った。１Ｈ―ＮＭＲ測定の結果は、図５に示す。確認の結果、製造例と同様に、実施例１の方法で得られたβ―グルカンは、β―１，３―１，６グルカンであり、三重らせん構造形成能を有していることを確認できた。
【0024】
（比較例１）
（低濃度ＮａＣｌＯ処理によるβ―グルカンの製造）
次亜塩素酸ナトリウムの濃度を２４０ｐｐｍとした以外は、実施例１と同様にβ―グルカンの製造を行った。
（低濃度ＮａＣｌＯ処理によるβ―グルカンの製造）
次亜塩素酸ナトリウムの濃度を２４０ｐｐｍとした以外は、実施例１と同様にβ―グルカンの製造を行った。
【0025】
実施例１で得られたβ―グルカンと比較例１で得られたβ―グルカンを比較した。比較例１で得られたβ―グルカンは、中性の水には、加熱しても溶けなかったが、ｐＨ１２以上の強アルカリ性の水には、一部溶解した。一方、実施例１で得られたβ―グルカンは、ｐＨ１０のアルカリ性の水には、容易に溶解した。また、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）には、比較例１のβ―グルカンも溶解したが、実施例１のβ―グルカンは、比較例１と比べて、容易に溶解した。実施例１のβ―グルカンは、中性の水に懸濁して加熱すると、容易に溶解し、これを室温まで冷却するとヒドロゲルを形成した。これは、ヒドロゲル形成の過程で、加熱により一旦らせん構造が解かれ、その後冷却に伴ってらせん構造が再形成することによるものである。一方、比較例１のβ―グルカンは、ヒドロゲルを形成しなかった。このように、実施例１のβ―グルカンと比較例１のβ―グルカンは、溶解能及びらせん形性能に相違があることが分かった。
【0026】
（製造例との比較）
２段次亜塩素酸処理により得られたβ―グルカンのヒドロゲル形成能を各β―グルカン濃度で比較した。本願発明の方法のより得られた、β－グルカンは、０．４重量％でヒドロゲル形成が見られた。また、実施例１により得られたβ―グルカンと製造例１で得られたβ―グルカンを比較すると、実施例１により得られたβ―グルカンは、水への溶解性が向上しているが、ヒドロゲル形成能を維持しており、本発明の次亜塩素酸処理により、水への溶解性を向上させたβ―グルカンを容易に製造できることが見出された。
２段次亜塩素酸処理により得られたβ―グルカンのヒドロゲル形成能を各β―グルカン濃度で比較した。本願発明の方法のより得られた、β－グルカンは、０．４重量％でヒドロゲル形成が見られた。また、実施例１により得られたβ―グルカンと製造例１で得られたβ―グルカンを比較すると、実施例１により得られたβ―グルカンは、水への溶解性が向上しているが、ヒドロゲル形成能を維持しており、本発明の次亜塩素酸処理により、水への溶解性を向上させたβ―グルカンを容易に製造できることが見出された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
