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7181855第ＩＸ因子の機能を調節するための組成物及び方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-22

(45)【発行日】2022-12-01

(54)【発明の名称】第ＩＸ因子の機能を調節するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/12 20060101AFI20221124BHJP

C07K 14/745 20060101ALI20221124BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20221124BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20221124BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20221124BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20221124BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20221124BHJP

C12P 21/02 20060101ALI20221124BHJP

A61P 7/04 20060101ALI20221124BHJP

A61K 38/36 20060101ALI20221124BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20221124BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20221124BHJP

A61K 35/761 20150101ALI20221124BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/745

C12N15/63 Z ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 Z

A61P7/04

A61K38/36

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019504782

(86)(22)【出願日】2017-07-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-12

(86)【国際出願番号】 US2017044104

(87)【国際公開番号】W WO2018022844

(87)【国際公開日】2018-02-01

【審査請求日】2020-07-22

(31)【優先権主張番号】62/367,321

(32)【優先日】2016-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】301040958

【氏名又は名称】ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＣＨＩＬＤＲＥＮ’ＳＨＯＳＰＩＴＡＬＯＦＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】アルーダヴァルディアアール

(72)【発明者】

【氏名】カミーレロドニーエム

(72)【発明者】

【氏名】サメルソンジョーンズベンジャミン

【審査官】福澤洋光

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２０１０４７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２４３８５５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５００７２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Johnathan, D. et.al.，The efficacy and the risk of immunogenicity of FIX Pauda (R338L) in hemophilia B dogs treated with by AAV muscle gene therapy，Blood，2012年，Vol.120, No.23，pp.4521-4523

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００

Ｃ１２Ｐ１／００－４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

置換を２つのみ含むヒトの第ＩＸ因子変異体であって、４１０位のＧｌｕがＬｙｓで置換されており、かつ３３８位のＡｒｇがＬｅｕで置換されている、第ＩＸ因子活性を有する変異体。

【請求項2】

請求項１に記載の少なくとも１つの第ＩＸ因子変異体及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物。

【請求項3】

請求項１に記載の第ＩＸ因子変異体の活性化第ＩＸ因子変異体。

【請求項4】

止血関連疾患の処置に使用するための、請求項１に記載の第ＩＸ因子変異体。

【請求項5】

前記止血関連疾患が、血友病Ｂ又は抑制性抗体と関連する血友病Ｂである、請求項４に記載の使用のための第ＩＸ因子変異体。

【請求項6】

請求項１に記載の第ＩＸ因子変異体をコードする単離された核酸分子。

【請求項7】

前記第ＩＸ因子変異体が、プロペプチド配列及び／又はシグナルペプチドを含む、請求項６に記載の核酸分子。

【請求項8】

前記核酸分子が細胞内切断部位をコードし、前記細胞内切断部位が、キモトリプシン付番方式における１５位と１６位との間にあるか、又は活性化ペプチドの全て若しくは一部を置き換える、請求項６に記載の核酸分子。

【請求項9】

調節配列に作動可能に連結されている、請求項６～８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、任意にベクターがアデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、レトロウイルスベクター、プラスミド、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、ベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞であって、任意に前記宿主細胞が、哺乳動物細胞又はＣＨＯ細胞である、宿主細胞。

【請求項11】

請求項１０に記載の宿主細胞をインキュベートすること、及びそれによって産生される活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）を精製することを含む、ＦＩＸａを生産する方法。

【請求項12】

止血関連疾患の処置に使用するための請求項９に記載の発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１６年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３６７，３２１号明細書の優先権を主張する。上記の出願は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、医学及び血液学の分野に関する。より詳細には、本発明は、新規の第ＩＸ因子変異体、及びこの第ＩＸ因子変異体を使用してそれを必要とする患者の凝固カスケードを調節する方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

本発明が属する最新技術を説明するために、本明細書を通していくつかの刊行物及び特許文書が引用される。これらの引用のそれぞれは、あたかも完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

切断などの血管損傷に応答して、凝固酵素が段階的に活性化され、最終的に障害部位に血餅の形成が生じる。トロンビンは、このカスケードの最終段階でその不活性前駆体プロトロンビンから生成され、続いて線維性血餅（ｆｉｂｒｏｕｓｃｌｏｔ）を生成する。活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）は、内因性Ｘａｓｅ複合体のセリンプロテアーゼであるため、この系の重要な構成要素であり、補因子活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）も含む。この酵素は、露出したアニオン性膜を有する細胞上で構築され、第Ｘ因子を活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に迅速に変換する。ＦＸａとその補因子である活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）は、トロンビンを活性化する酵素複合体であるプロトロンビナーゼを形成する。

【0005】

第ＩＸ因子の重要性は、第ＩＸ因子遺伝子に突然変異を有する個体における出血性疾患である血友病Ｂの発症によって反映される。血友病Ｂなどの出血性疾患では、第ＩＸ因子の異常又は欠損は、ＦＸａの生成が不十分となり、従ってトロンビン形成が不十分となる。喪失したタンパク質の補充は、血友病処置の中心である。有効ではあるが、現在のタンパク質補充療法にはいくつかの制限がある。例えば、現在の治療法は、投与されるタンパク質の半減期が短いために、高用量での複数回の静脈内注射を必要とする。従って、生物学的特性が改善された凝固因子が明らかに必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明に従って、それを必要とする患者の止血を調節するための組成物及び方法が提供される。より詳細には、止血を調節する（例えば、強める）第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子変異体が提供される。特定の実施形態では、この変異体は、４１０位のＧｌｕ；２２３位のＶａｌ；３４２位のＰｈｅ；３４３位のＴｈｒ；及び／又は４０６位のＡｓｎの少なくとも１つの置換を含む。特定の実施形態では、この変異体は、４１０位のＧｌｕ；２２３位のＶａｌ；及び／又は４０６位のＡｓｎの少なくとも１つの置換を含む。特定の実施形態では、第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子変異体は、３３８位のＡｒｇの置換、特に３３８位のＡｒｇのＬｅｕでの置換をさらに含む。本発明の変異体をコードする核酸はまた、その使用方法として開示される。このような核酸分子は、任意選択により、細胞内の切断部位（例えば、ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ）をコードし得る。本発明の別の態様は、本発明の変異体を発現する宿主細胞を含む。この変異体を単離及び精製する方法も開示される。

【0007】

担体中に本発明の変異体を含む医薬組成物も提供される。本発明はまた、それを必要とする患者の止血関連疾患の処置方法も含み、この方法は、治療有効量の変異体又はこれをコードする核酸分子を対象に投与することを含む。このような方法は、限定されるものではないが、血友病、特に血友病Ｂを含む、（例えば、出血を低減する又は抑制するために）凝固促進剤が必要とされる障害の処置において有効性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】図１Ａは、ヒトプレプロ第ＩＸ因子のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。下線が引かれた太字の残基は、第ＩＸ因子付番に基づき、２２３位、３３８位、３４２位、３４３位、４０６位、及び４１０位である（図１Ｂを参照）。

【図1B】図１Ｂは、第ＩＸ因子の軽鎖アミノ酸配列（配列番号２）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号３）を示す。

【図1C】図１Ｃは、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の軽鎖アミノ酸配列（配列番号２）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図1D】図１Ｄは、ヒト第ＩＸ因子プレプロタンパク質をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。

【図2】図２は、ＦＩＸＲ３３８Ｌ＋Ｅ４１０Ｋ（ｎ＝７）又は野生型ＦＩＸ（ｎ＝２）をコードするＡＡＶ８ベクターの投与後の血友病マウスにおけるＦＩＸの比活性のグラフを示す。値は平均値±ＳＥＭとして示されている。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書では、新規な第ＩＸ因子変異体（チモーゲン）が提供される。特に、４１０位のＧｌｕ、２２３位のＶａｌ、３４２位のＰｈｅ、３４３位のＴｈｒ、及び／又は４０６位のＡｓｎの突然変異を含む第ＩＸ因子変異体が提供される。特定の実施形態では、第ＩＸ因子変異体は、４１０位のＧｌｕ；２２３位のＶａｌ；及び／又は４０６位のＡｓｎの少なくとも１つの置換を含む。第ＩＸ因子変異体は、３３８位のＡｒｇの突然変異（例えば、Ｒ３３８Ｌ）をさらに含み得る。本発明の第ＩＸ因子変異体は、野生型第ＩＸ因子と比較してより高い比活性を有する。

【0010】

血液凝固反応は、外傷後の重大な失血から生物を保護するために進化してきた防御機構である。上で簡単に説明したように、凝固は、一連のタンパク質分解反応を通して進行し、その各々は、血液中の不活性チモーゲン（不活性）をセリンプロテアーゼ（活性）産物に変換する。血液凝固カスケードの最終セリンプロテアーゼ産物であるトロンビンは、血小板を活性化し、そして構造タンパク質（フィブリノーゲン）を切断してフィブリンを生成し、それによって血液が血管から流出するのを物理的に妨げる網目構造を提供する。このプロセスからの逸脱は、出血の病理学的状態につながる。これは、第ＩＸ因子の異常又は欠損の場合に特に当てはまる。このような第ＩＸ因子活性の欠損は、遺伝性の出血性疾患である血友病Ｂをもたらす。静脈内送達された血漿由来又は組換え第ＩＸ因子によるタンパク質補充療法は、血友病Ｂ患者のための標準治療である。この治療法は有効であるが、この治療法は、大量の第ＩＸ因子の頻繁な（例えば、１週間に２～３回）静脈内投与を必要とする。本発明は、野生型ＦＩＸと比較して高い活性を有し、それにより（例えば、出血症状を処置するための投与のための）より迅速な応答、及び／又は投与に必要なタンパク質の量の低減（タンパク質補充療法に必要な用量の削減）を可能にする第ＩＸ因子変異体を提供する。

【0011】

第ＩＸ因子は、約９０ｎＭの濃度で不活性チモーゲン（５７ｋＤａ）として血漿中を循環する。第ＩＸ因子は、タンパク質の分泌時に除去される約４０のアミノ酸のプレプロリーダー配列を有する肝臓で最初に合成される。血管が損傷すると、３５残基の活性化ペプチドを放出する、第ＶＩＩａ因子／組織因子（ＴＦ）複合体又は第ＸＩａ因子のいずれかによる２つの結合の切断の後に、第ＩＸ因子がＦＩＸａに活性化される。第ＩＸ因子の活性化は、十分に説明されている機構に従う。高度に保存された部位（キモトリプシン付番方式ではＲ¹⁵－Ｖ^I6ＶＧＧ）での結合の切断は、重鎖の新たなＮ末端（Ｖ¹⁶Ｖ¹⁷ＧＧ）をアンマスクする。切断後、中間体は、新たに生成されたＮ末端が活性化ポケットに挿入されてＡｓｐ¹⁹⁴と塩橋を形成した後、迅速にプロテアーゼ状態に平衡化する「チモーゲン様状態」にある。この相互作用は、チモーゲンの活性酵素への変換の明確な特徴である。チモーゲン状態及びプロテアーゼ状態は、様々なリガンド又は補因子に応じてシフトすることができる平衡状態で存在する。遊離ＦＩＸａは、循環セルピン、最も顕著にはアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）との反応によって迅速に排除される。

【0012】

本発明は、ＦＩＸａ変異体、第ＩＸ因子変異体、第ＩＸ因子プレプロペプチド変異体、及び第ＩＸ因子プロペプチド変異体を含む変異体第ＩＸ因子分子を包含する。単純にするために、これらの変異体は、一般に、本出願を通してＦＩＸの文脈で説明される。しかしながら、本発明は、同じアミノ酸置換を有する第ＩＸａ因子、第ＩＸ因子プレプロペプチド、及び第ＩＸ因子プロペプチド分子を企図し、かつ包含する。

【0013】

本発明のＦＩＸ変異体は、任意の哺乳動物種由来であり得る。特定の実施形態では、ＦＩＸ変異体はヒトのものである。遺伝子ＩＤ：２１５８及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１３３．３及びＮＰ＿０００１２４．１は、野生型ヒト第ＩＸ因子プレプロタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列の例を提供する。図１Ａは、ヒト第ＩＸ因子プレプロタンパク質のアミノ酸配列の一例である配列番号１を示す。第ＩＸ因子プレプロペプチドは、アミノ酸１～２８のシグナルペプチド及びアミノ酸２９～４６のプロペプチド配列を含む。プロペプチドの切断により、Ｔｙｒ－Ａｓｎ－Ｓｅｒの新たな末端配列を有するタンパク質が生じる。第ＩＸ因子はまた、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体又はＦＸＩａによってアルギニル－アラニンペプチド結合で成熟二本鎖形態（軽鎖及び重鎖）に切断されて第ＩＸ因子チモーゲンを生成する。２本の鎖は、ジスルフィド結合をよって連結されている。図１Ｂは、それぞれヒト第ＩＸ因子の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列の例である配列番号２及び３を示す。第ＩＸ因子は、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体又はＦＸＩａによる３５のアミノ酸の活性化ペプチドのアルギニル－バリンペプチド結合での切断によって活性化されて、野生型ＦＩＸａ重鎖（配列番号４）のＶＶＧＧの新たなアミノ末端配列（配列番号６）が生じる。図１Ｃは、配列番号２及び４を示し、これらの配列は、ヒトＦＩＸａの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列の例である。特に、上記のタンパク質分解的切断事象は、不正確であり得、それにより切断部位でのアミノ酸（例えば、１個、２個、又は３個以上のアミノ酸）の付加又は喪失をもたらす。図１Ｄは、ヒト第ＩＸ因子プレプロタンパク質をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。第ＩＸ因子及びＦＩＸａをコードする核酸分子は、示されたアミノ酸配列及びヌクレオチド配列から容易に決定することができる。

【0014】

特定の実施形態では、本発明の変異体は、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、本発明の変異体は、配列番号１のアミノ酸２９～４６１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、本発明の変異体は、配列番号１のアミノ酸４７～４６１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、この変異体は、軽鎖及び重鎖を含み、この軽鎖は、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有し、かつこの重鎖は、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性、特に、少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、この変異体は、軽鎖及び重鎖を含み、この軽鎖は、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有し、かつこの重鎖は、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性、特に少なくとも９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する。上記の同一性パーセントは、本発明の置換（例えば、２２３位、３３８位、３４２位、３４３位、４０６位、及び／又は４１０位の置換）を除外する。

【0015】

本発明の変異体はまた、訳後修飾（γ－カルボキシル化）してもよい。この変異体は、細胞内又はインビトロで翻訳後修飾することができる。本発明の変異体はまた、ペグ化又はグリコペグ化してもよい（例えば、ｎｏｎａｃｏｇｂｅｔａｐｅｇｏｌ；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ１２４：３８８０－３８８６を参照）。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、４０ｋＤａのＰＥＧ）を、（例えば、活性化ペプチド内で）変異体に付着させることができる。特定の実施形態では、本発明の変異体をアルブミンに融合することができる（例えば、Ｓａｎｔａｇｏｓｔｉｎｏｅｔａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ１２７：１７６１－１７６９；Ｍｅｔｚｎｅｒｅｔａｌ．（２００９）Ｔｈｒｏｍｂ，Ｈａｅｍｏｓｔ．，１０２：６３４－４４；Ｎｏｌｔｅｅｔａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１０：１５９１－９；Ｈｅｒｚｏｇｅｔａｌ．（２０１４）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１３３：９００－７；Ｓｃｈｕｌｔｅ（２００９）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１２４：Ｓ６－Ｓ８を参照）。例えば、この変異体は、切断可能なリンカー（例えば、活性化ペプチドに基づくリンカー）を介してアルブミンに連結することができる。特定の実施形態では、本発明の変異体は、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ₁のＦｃドメイン；二量体又は単量体）に連結される（例えば、ｅｆｔｒｅｎｏｎａｃｏｇａｌｆａ（Ａｌｐｒｏｌｉ（登録商標））；Ｐｏｗｅｌｌｅｔａｌ．（２０１３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６９：２３１３－２３２３；Ｐｅｔｅｒｓｅｔａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ１１５：２０５７－６４；Ｓｈａｐｉｒｏｅｔａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１１９：６６６－７２を参照）。例えば、この変異体は、（切断可能又は切断不可能な）リンカーを介してＦｃドメイン（例えば、ヒンジ並びにＣＨ₂及びＣＨ₃ドメイン（例えば、ＩｇＧ₁由来））に連結することができる。

【0016】

本発明のＦＩＸ変異体は、２２３位、３４２位、３４３位、４０６位、及び／又は４１０位に少なくとも１つの置換を含み得る。特定の実施形態では、本発明のＦＩＸ変異体は、２２３位、４０６位、及び／又は４１０位に少なくとも１つの置換を含み得る。

【0017】

特定の実施形態では、４１０位のグルタミン酸は、非酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ以外）で置換されている。特定の実施形態では、４１０位のグルタミン酸は、塩基性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓ）又は極性アミノ酸（例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒ）で置換されている。特定の実施形態では、４１０位のグルタミン酸は、リジン、チロシン、アルギニン、又はヒスチジンで置換されている。特定の実施形態では、４１０位のグルタミン酸は、リジン又はチロシンで置換されている。特定の実施形態では、４１０位のグルタミン酸はリジンで置換されている。

【0018】

特定の実施形態では、４０６位のアスパラギンは、塩基性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓ）で置換されている。特定の実施形態では、４０６位のアスパラギンはアルギニン、リジン、又はグルタミンで置換されている。特定の実施形態では、４０６位のアスパラギンは、アルギニン又はリジンで置換されている。特定の実施形態では、４０６位のアスパラギンはアルギニンで置換されている。

【0019】

特定の実施形態では、２２３位のバリンは、塩基性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓ）、酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、又は極性アミノ酸（例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、又はＧｌｎ）で置換されている。特定の実施形態では、２２３位のバリンは極性アミノ酸で置換されている。特定の実施形態では、２２３位のバリンはチロシンで置換されている。

【0020】

特定の実施形態では、３４２位のフェニルアラニンは、塩基性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓ）、酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、又は極性アミノ酸（例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、又はＧｌｎ）で置換されている。特定の実施形態では、３４２位のフェニルアラニンは塩基性アミノ酸で置換されている。特定の実施形態では、３４２位のフェニルアラニンはヒスチジンで置換されている。

【0021】

特定の実施形態では、３４３位のトレオニンは、塩基性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓ）、酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、疎水性アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、又はＧｌｙ）、又は極性アミノ酸（例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、又はＧｌｎ）で置換されている。特定の実施形態では、３４３位のトレオニンは塩基性アミノ酸で置換されている。特定の実施形態では、３４３位のトレオニンは、メチオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、又はグリシンで置換されている。特定の実施形態では、３４３位のトレオニンは、メチオニン、リジン、アルギニン、又はグルタミンで置換されている。特定の実施形態では、３４３位のトレオニンは、メチオニン、リジン、又はアルギニンで置換されている。特定の実施形態では、３４３位のトレオニンは、メチオニン又はリジンで置換されている。特定の実施形態では、３４３位のトレオニンはメチオニンで置換されている。

【0022】

本発明の変異体は、２２３位、３４２位、３４３位、４０６位、及び／又は４１０位に少なくとも１つの上記の置換を含み得る。本発明の変異体は、少なくとも１つの他の置換をさらに含み得る。特定の実施形態では、この変異体は、３３８位のアルギニンの置換をさらに含む。特定の実施形態では、３３８位のアルギニンは、非塩基性アミノ酸（例えば、ＨｉｓやＬｙｓ以外）で置換されている。特定の実施形態では、３３８位のアルギニンは、非極性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、又はＭｅｔ）で置換されている。特定の実施形態では、３３８位のアルギニンはロイシンで置換されている。

【0023】

上記の変異体をコードする核酸分子も本発明に包含される。変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。この核酸分子は、任意の都合のよいベクター、特に発現ベクター中に維持することができる。

【0024】

少なくとも１つの変異体ポリペプチド及び少なくとも１つの担体を含む組成物もまた本発明に包含される。少なくとも１つの変異体核酸分子及び少なくとも１つの担体を含む組成物もまた本発明に包含される。任意の従来の担体が、投与されるべき変異体と適合性でない場合を除いて、医薬組成物における担体の使用が企図される。特定の実施形態では、担体は、静脈内投与用の薬学的に許容可能な担体である。

【0025】

定義
本発明の生物学的分子に関する様々な用語が上記に使用され、さらに本明細書及び特許請求の範囲を通しても使用される。

【0026】

語句「止血関連疾患」は、出血障害、例えば、限定されるものではないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、抑制抗体を有する血友病Ａ及びＢの患者、少なくとも１つの凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子、及び／又はフォン・ヴィレブランド因子；特に第ＩＸ因子）の欠損、ＦＶ／ＦＶＩＩＩ複合欠損症、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣＩ欠損症、γ－カルボキシラーゼ欠損症；外傷、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害（凝固不良）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に関連する出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰な抗凝固；並びにバーナード・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｔｈｒｏｍｂｌａｓｔｅｍｉａ）、及び貯蔵プール欠乏症などの血小板障害を指す。特定の実施形態では、止血関連疾患は血友病Ｂである。

【0027】

本発明の核酸に関して、用語「単離された核酸」が時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、ＤＮＡ分子を指し、このＤＮＡ分子は、このＤＮＡ分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてこのＤＮＡ分子が（５’及び３’方向において）直接隣接している配列から分離されている。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターに挿入された、又は原核生物若しくは真核生物のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ分子を含み得る。本発明のＲＮＡ分子に関して、用語「単離された核酸」は主に、上記定義されたような単離されたＤＮＡ分子によってコードされているＲＮＡ分子を指す。あるいは、この用語は、ＲＮＡ分子を指すことがあり、このＲＮＡ分子は、このＲＮＡ分子が「実質的に純粋な」形態で存在するように、このＲＮＡ分子がその天然の状態で（すなわち、細胞又は組織中で）結合するはずであるＲＮＡ分子から十分に分離されている。

【0028】

タンパク質に関しては、用語「単離されたタンパク質」が本明細書で時々使用される。この用語は、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指すことがある。あるいは、この用語は、タンパク質を指すことがあり、このタンパク質は、このタンパク質が本来結合するはずである他のタンパク質から（例えば、「実質的に純粋な」形態で存在するように）十分に分離されている。

【0029】

用語「ベクター」は、例えば、核酸配列を発現及び／又は複製することができる宿主細胞への導入のために、核酸配列を挿入することができる担体核酸分子（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現に必要とされる必須の調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含む特殊なベクターである。

【0030】

用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に影響を与えるように、コード配列の発現に必要な調節配列がコード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子内に配置されることを意味する。この同じ定義は、時には、発現ベクター中のコード配列及び転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結エレメント）の配置に当てはまる。この定義はまた、ハイブリッド核酸分子が生成される第１及び第２の核酸分子の核酸配列の配置にも当てはまる場合もある。

【0031】

用語「単離されたタンパク質」又は「単離及び精製されたタンパク質」は、本明細書で時折使用される。この用語は主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが本来結合するはずである他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を指し得る。「単離された」は、他の化合物又は材料との人工又は合成の混合物も、また、例えば不完全な精製又は安定剤の添加によって存在し得る、基本的活性を妨害しない不純物の存在も排除するものではない。

【0032】

用語「実質的に純粋な」は、少なくとも５０～６０重量％の目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）、特に少なくとも７５重量％、又は少なくとも９０～９９重量％以上の目的の化合物を含む調製物を指す。純度は、目的の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動法、及びＨＰＬＣ分析など）によって測定することができる。

【0033】

「薬学的に許容可能な」は、動物、特にヒトでの使用が連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方若しくはその他の一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。

【0034】

「担体」は、例えば、希釈剤、アジュバント、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、ＴｒｉｓＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤、又は本発明の活性剤と一緒に投与されるビヒクルを指す。薬学的に許容可能な担体は、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの滅菌液であり得る。水又は水性生理食塩溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液が、好ましくは、特に注射用溶液のための担体として利用される。適切な医薬担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ” ｂｙＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｃｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；及びＫｉｂｂｅ，ｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載されている。

【0035】

変異体をコードする核酸分子及びポリペプチドの調製
本発明の変異体をコードする核酸分子は、組換えＤＮＡ技術方法を使用することによって調製することができる。ヌクレオチド配列情報の利用可能性は、様々な手段による本発明の単離された核酸分子の調製を可能にする。例えば、変異体をコードする核酸配列は、当技術分野において周知の標準的なプロトコルを用いて適切な生物学的供給源から単離することができる。

【0036】

本発明の核酸は、任意の便利なクローニングベクター中にＲＮＡ又はＤＮＡとして維持することができる。特定の実施形態では、クローンは、プラスミドクローニング／発現ベクター中に維持され、このベクターは、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で増殖される。あるいは、この核酸は、哺乳動物細胞（例えば、Ｔ細胞、造血細胞など）での発現に適したベクター中に維持してもよい。翻訳後修飾が変異体の機能に影響を与える場合、分子を哺乳動物細胞で発現させることが好ましい。

【0037】

一実施形態では、本発明の変異体をコードする核酸は、細胞内タンパク質分解性切断部位の挿入によってさらに修飾することができる（本発明はまた、切断の前及び後の両方で得られるポリペプチドも包含する）。哺乳動物細胞でＦＩＸａ変異体を発現させるために、細胞内タンパク質分解切断部位（例えば、ＰＡＣＥ／フリン切断部位）を、変異体第ＩＸ因子のＡｒｇ¹⁵位とＶａｌ¹⁶位との間に挿入することができる。このような切断部位には、限定されるものではないが：Ａｒｇ－Ｘａａ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇ（配列番号７）、Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ、又はＡｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ（配列番号８）が含まれる。これらの切断部位は、細胞内のプロテアーゼ（ＰＡＣＥ／フリン様酵素）によって効率的に認識され、除去される。これにより、分子における重鎖が１６位で始まる処理された変異体ＦＩＸａが得られる。この切断部位のこの位置への導入により、第ＩＸ因子のＦＩＸａへの細胞内変換が可能となる。別の実施形態では、３５のアミノ酸の活性化ペプチドの一部又は全てを除去することができ、かつ細胞内プロテアーゼ切断部位をその位置に導入することができ、これにより発現時にＦＩＸａ変異体が得られる。

【0038】

最終的にこれらの種類の修飾は、修飾変異体第ＩＸ因子を発現する細胞からの「活性」処理形態の変異体第ＩＸ因子の分泌を可能にする。切断された因子の分泌は、血液凝固中又はタンパク質の単離後にタンパク質分解性切断の必要性をなくす。

【0039】

本発明の変異体コード核酸分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及び一本鎖又は二本鎖であり得るこれらの断片が含まれる。従って、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、変異体発現を検出するためのプローブとして有用である。

【0040】

本発明の変異体は、既知の方法に従って様々な方式で調製することができる。タンパク質は、例えば免疫親和性精製によって、適切な供給源（例えば、形質転換された細菌又は変異体を発現する動物培養細胞若しくは組織）から精製することができる。変異体をコードする核酸分子の利用可能性により、当技術分野で公知のインビトロ発現方法を用いた変異体の産生が可能となる。例えば、ｃＤＮＡ又は遺伝子は、インビトロ転写のためのｐＳＰ６４又はｐＳＰ６５などの適切なインビトロ転写ベクターにクローニングし、続いて小麦胚芽又はウサギ網状赤血球溶血液などの適切な無細胞翻訳系で無細胞翻訳することができる。インビトロ転写及び翻訳系は市販されている。

【0041】

あるいは、より大量の変異体を、適切な原核生物又は真核生物発現系での発現によって産生することができる。例えば、変異体をコードするＤＮＡ分子の一部又は全てを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、又はＣＨＯ若しくはＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞での発現に適したプラスミドベクターに挿入することができる。あるいは、変異体を含む標識融合タンパク質を作製することができる。このような変異体標識融合タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、又は、限定されるものではないが酵母及び哺乳動物細胞（例えば、Ｔ細胞、造血細胞など）などの真核細胞での発現に適合されたプラスミドベクターに導入される所望のポリペプチド標識の一部又は全てをコードするヌクレオチド配列に正しいコドン読み枠で連結されたＤＮＡ分子の一部又は全てによってコードされる。上記のようなベクターは、宿主細胞内でのＤＮＡの発現を可能にするように配置された、宿主細胞内でのＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを含む。発現に必要なこのような調節エレメントには、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、及びエンハンサー配列が含まれる。

【0042】

組換え原核生物系又は真核生物系での遺伝子発現によって産生される変異体タンパク質は、当技術分野で公知の方法に従って精製することができる。特定の実施形態では、市販の発現／分泌系を使用することができ、それによって組換えタンパク質が発現され、その後宿主細胞から分泌され、周囲の培地から容易に精製されることになる。発現／分泌ベクターが使用されない場合、代替のアプローチでは、親和性分離、例えば組換えタンパク質に特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用、又はそれらのＮ末端又はＣ末端において６～８ヒスチジン残基で標識された組換えタンパク質の単離のためのニッケルカラムによって組換えタンパク質を精製する。代替の標識は、ＦＬＡＧエピトープ、ＧＳＴ、又は赤血球凝集素エピトープを含み得る。このような方法は、熟練した診療医によって一般的に使用されている。

【0043】

前述の方法によって調製された変異体タンパク質は、標準的な手順に従って分析することができる。例えば、このようなタンパク質は、既知の方法に従ってアミノ酸配列分析を行うことができる。

【0044】

上記のように、本発明に従ってポリペプチドを産生する便利な方法では、発現系での核酸の使用によってこのポリペプチドをコードする核酸を発現させる。本発明の方法に有用な様々な発現系は当業者に周知である。

【0045】

従って、本発明はまた、（開示されるような）ポリペプチドを産生する方法も包含し、この方法は、ポリペプチドをコードする核酸（一般に核酸）からの発現を含む。これは、このようなベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチドの産生をもたらす又は可能にする適切な条件下で培養することによって好都合に達成することができる。ポリペプチドはまた、網状赤血球溶血液などのインビトロ系でも産生させることができる。

【0046】

変異体タンパク質及び変異体コード核酸の使用
変更されたプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異体核酸は、例えば、血液凝固カスケードを調節する治療薬及び／又は予防薬（タンパク質又は核酸）として本発明に従って使用することができる。本発明の特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、生物学的に適合する担体中への注入によって、例えば血管内又は静脈内注射によって患者に投与することができる。本発明の変異体は、分子の安定性を増大させるために、任意選択によりリポソーム内に封入してもよいし、又は他のリン脂質若しくはミセルと混合してもよい。変異体は、単独で、又は止血を調節することが知られている他の剤（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、又はこれらの誘導体）と組み合わせて投与することができる。変異体ポリペプチドを送達するための適切な組成物は、限定されるものではないが、患者の状態及び血行動態を含む様々な生理学的変数を考慮して医師が決定することができる。様々な用途及び投与経路によく適した様々な組成物が当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。

【0047】

精製された変異体を含む調製物は、生理学的に許容可能なマトリックスを含み、好ましくは医薬調製物として製剤される。この調製物は、当分野で公知の方法を用いて製剤することができる。特定の実施形態では、変異体は、ＮａＣｌ若しくはＣａＣｌ₂などの塩を含有する緩衝液、並びに／又はグリシン及び／若しくはリジンなどのアミノ酸と混合してｐＨ６～８の範囲にすることができる。必要になるまで、変異体を含む精製された調製物は、最終溶液の形態、又は凍結乾燥若しくは急速冷凍形態で保存することができる。特定の実施形態では、調製物は、凍結乾燥形態で保存され、適切な再構成溶液を用いて視覚的に透明な溶液に溶解される。あるいは、本発明による調製物はまた、液体調製物として又は急速冷凍される液体として利用可能にすることができる。

【0048】

第ＩＸ因子変異体を含む本発明による調製物はさらに、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体、又は第ＩＸ因子変異体をＦＩＸａに活性化することができるＦＸＩａ若しくはその誘導体と組み合わせてもよい。特定の実施形態では、ＦＩＸａ変異体は、組み合わせ調製物の形態で利用可能にすることができ、この組み合わせ調製物の形態は、潜在的にはプロテアーゼが補充された小型カラム又はシリンジの形態である、マトリックス上に固定化された第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体又はＦＸＩａを保持する容器、及び第ＩＸ因子変異体を含む医薬調製物を含む容器を備える。第ＩＸ因子変異体を活性化するために、第ＩＸ因子変異体含有溶液を、例えば、固定化プロテアーゼに押し付けることができる。調製物の保存中は、第ＩＸ因子変異体含有溶液は、好ましくはプロテアーゼから空間的に分離されている。本発明による調製物は、プロテアーゼと同じ容器に保存することができるが、成分は、調製物の投与前に容易に除去することができる不透過性の仕切りによって空間的に分離されている。この溶液はまた、別々の容器に保存し、投与直前になって初めて互いに接触させることができる。

【0049】

第ＩＸ因子変異体を対象に投与することができる。あるいは、第ＩＸ因子変異体は、直接の使用の直前、すなわち対象への投与の直前にＦＩＸａに活性化することができる。この活性化は、第ＩＸ因子変異体を固定化プロテアーゼと接触させることによって、又は一方のプロテアーゼ及び他方の第ＩＸ因子変異体を含有する溶液を混合することによって行うことができる。従って、溶液中の２つの成分を別々に維持し、これらが装置を通過するときにこれらの成分が互いに接触し、それによってＦＩＸａ又はＦＩＸａ変異体の活性化をもたらす適切な注入装置によってこれらを混合することが可能である。従って、患者には、ＦＩＸａの混合物に加えて、活性化に関与するセリンプロテアーゼが投与される。これに関連して、セリンプロテアーゼの追加投与も、内因性第ＩＸ因子を活性化し、この活性化が凝固時間を短縮し得るため、投与量に細心の注意を払うことが重要である。

【0050】

本発明による調製物は、１成分調製物の形態でＦＩＸ活性を有する医薬調製物として、又は多成分調製物の形態で他の因子と組み合わせて利用可能にすることができる。

【0051】

精製されたタンパク質を医薬調製物に加工する前に、精製されたタンパク質を従来の品質管理を行って、治療用提示形態に形成することができる。特に、組換え製造中に、精製された調製物を、細胞核酸及び発現ベクターに由来する核酸の非存在について試験することができる。

【0052】

本発明の別の特徴は、高い安定性及び構造的完全性を有するＦＩＸａ変異体を含み、かつ、特に不活性な第ＩＸ／ＩＸａ因子中間体及び自己タンパク質分解産物を含まない調製物を利用可能にすることに関し、この調製物は、上記のタイプの第ＩＸ因子変異体を活性化すること、及び適切な調製物に製剤化することによって生産することができる。

【0053】

本発明の医薬調製物は、一例として、約１～１０００μｇ／ｋｇ、約１０～５００μｇ／ｋｇ、約１０～２５０μｇ／ｋｇ、又は約１０～１００μｇ／ｋｇの用量を含み得る。この量は、少なくとも１日１回静脈内投与することができる。患者は、出血で診療所に現れたとき直ちに、又は出血を引き起こす切断／創傷が起こる前に処置することができる。あるいは、患者は、１～３時間ごとにボーラス注入を受けてもよいし、又は十分な改善が見られる場合は、本明細書に記載の変異体の１日１回の注入を受けてもよい。

【0054】

変異体をコードする核酸は、本発明に従って様々な目的に使用することができる。本発明の特定の実施形態では、血液凝固を調節するための核酸送達ビヒクル（すなわち、発現ベクター）が提供され、この発現ベクターは、本明細書に記載の変異体ポリペプチド又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む。変異体コード発現ベクターの患者への投与は、凝固カスケードを変更するのに役立つ変異体ポリペプチドの発現をもたらす。本発明によると、変異体をコードする核酸配列は、その発現が止血を増加させる本明細書に記載の変異体第ＩＸ因子ポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、核酸配列は、ヒト第ＩＸ因子又は第ＩＸａ因子ポリペプチド変異体をコードする。本発明の変異体をコードする核酸分子又は本発明の変異体をコードする核酸分子を含む細胞は、止血を調節するために対象に投与することができる。この核酸分子は、例えば、血小板、Ｔ細胞、及び／又は他の造血細胞で発現させてもよいし、又はこれらに送達してもよい。

【0055】

変異体核酸配列を含む発現ベクターは、単独で、又は止血を調節するのに有用な他の分子と組み合わせて投与することができる。本発明によると、発現ベクター又は治療薬の組み合わせは、単独で、又は薬学的に許容可能な若しくは生物学的に適合性の組成物中で患者に投与することができる。

【0056】

本発明の特定の実施形態では、変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターはウイルスベクターである。本発明で使用することができる、組織特異的プロモーター／エンハンサーを含む又は含まないウイルスベクターとしては、限定されるものではないが：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、又は他の誘導体及び／若しくは代替の血清型）、及びハイブリッドＡＡＶベクター（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ以上の血清型の組み合わせハイブリッド）、レンチウイルスベクター及び偽型レンチウイルスベクター（例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられる。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ血清型１～１２及びその他のいずれか１つ以上）及び異なるＡＡＶからのゲノム（例えば、ＡＡＶ血清型２）を有するハイブリッドＡＡＶベクターであり得る。

【0057】

本発明の特定の実施形態では、変異体又はその機能的断片をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを投与するための方法が提供される。本明細書に記載されるように、このようなアデノウイルスベクターの投与後の変異体ポリペプチドの発現は、止血の調節、特に凝血促進活性の増強に役立つ。

【0058】

また、止血を調節するための方法も本発明に含まれ、この方法は、変異体ポリペプチドをコードする核酸送達ビヒクルを個体の細胞（例えば、血小板、Ｔ細胞、造血細胞など）に供給すること、及び変異体ポリペプチドが発現される条件下でこの細胞を増殖させることを含む。この細胞を対象に投与することができる。

【0059】

前述の議論から、変異体ポリペプチド、及び変異体ポリペプチドを発現する核酸ベクターを、異常な血液凝固に関連する障害の処置に使用できることが分かる。

【0060】

本発明の発現ベクターは、生物学的に活性なタンパク質（例えば、変異体ポリペプチド又はその機能的断片若しくは誘導体）の産生を可能にするために、対象に送達することができる医薬組成物に組み込むことができる。本発明の特定の実施形態では、レシピエントが治療有効量の変異体ポリペプチドを産生することを可能にするのに十分な遺伝物質を含む医薬組成物は、対象の止血に影響を及ぼし得る。あるいは、上で議論したように、有効量の変異体ポリペプチドを、それを必要とする患者に直接注入することができる。この組成物は、単独で投与してもよいし、又は限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、及び水を含む任意の滅菌生体適合性医薬担体中で投与することができる少なくとも１つの他の剤、例えば、安定化化合物と組み合わせて投与してもよい。この組成物は、患者に単独で投与してもよいし、又は止血に影響を及ぼす他の剤（例えば、補因子）と組み合わせて投与してもよい。

【0061】

特定の実施形態では、医薬組成物はまた、本明細書に記載のように薬学的に許容可能な賦形剤／担体も含む。このような担体は、それ自体がこの組成物を摂取する個体に有害な免疫応答を誘発せず、かつ過度の毒性なしに投与することができる任意の医薬品を含む。薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、水、食塩水、グリセロール、糖、及びエタノールなどの液体が挙げられる。薬学的に許容可能な塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩などの鉱酸塩；並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩などの有機酸塩も含まれ得る。さらに、湿潤剤又は乳化剤、及びｐＨ緩衝物質など補助物質は、このようなビヒクル中に存在してもよい。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ（２２ｎｄＥｄ．（２０１２）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ）で入手可能である。

【0062】

非経口又は血管内投与に適した医薬製剤は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化することができる。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性懸濁注射液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。任意選択により、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を高めて高濃度溶液の調製を可能にする剤を含有してもよい。

【0063】

医薬組成物は、塩として提供することができ、かつ限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多くの酸と共に形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性又は他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。他の場合には、調製物は、以下のいずれか又は全てを含み得る凍結乾燥粉末であり得る：使用前に緩衝液と組み合わせられる１～５０ｍＭのヒスチジン、０．１％～２％のスクロース、及び２～７％のマンニトール、ｐＨ４．５～５．５の範囲。

【0064】

医薬組成物を調製した後に、これを適切な容器に入れ、そして処置についてのラベルを貼ってもよい。変異体含有ベクター又はポリペプチドの投与のために、このようなラベルは、投与の量、頻度、及び投与方法を含むであろう。

【0065】

本発明での使用に適した医薬組成物は、活性成分が意図した治療目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。治療有効量の決定は、本発明で提供される技術及び手引きを使用する熟練した医師の十分に能力の範囲内である。治療用量は、とりわけ、対象の年齢及び全身状態、異常な血液凝固表現型の重症度、及び変異体ポリペプチドの発現レベルを調節する制御配列の強度に依存する。従って、ヒトでの治療有効量は、比較的広範囲となり、ベクターをベースとした変異体処置に対する個々の患者の反応に基づき、医師が決定することができる。

【0066】

変異体ポリペプチドは、単独で又は他の剤と組み合わせて、上記のような適切な生物学的担体中で患者に直接注入することができる。変異体又はその機能的断片をコードする核酸配列を含む本発明の発現ベクターは、予防及び／又は治療に有効なレベルの変異体ポリペプチドを達成及び維持するために様々な手段（以下を参照）によって患者に投与することができる。当業者は、特定の患者の治療的処置のために、本発明の変異体をコードする発現ベクターを使用するための特定のプロトコルを容易に決定することができる。

【0067】

本発明の変異体をコードするアデノウイルスベクターは、公知の任意の手段によって患者に投与することができる。インビボでの医薬組成物の直接送達は、一般に従来の注射器を用いた注射によって達成することができるが、対流促進送達などの他の送達方法も考えられる。これに関して、この組成物は、皮下、表皮、皮内、クモ膜下腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、血管内、静脈内、動脈内、経口、肝内、骨内、又は筋肉内に送達することができる。他の投与方式としては、経口及び肺投与、坐剤、並びに経皮投与が挙げられる。血液凝固障害の患者の処置を専門とする臨床医は、限定されるものではないが：患者の状態及び処置の目的（例えば、血液凝固の増強又は低減）を含むいくつかの基準に基づいて、変異体核酸配列を含むアデノウイルスベクターの投与の最適経路を決定することができる。

【0068】

本発明はまた、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターも包含する。また、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むレンチウイルス又は偽型レンチウイルスベクターも包含される。また、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む裸プラスミド又は発現ベクターも包含される。

【0069】

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、例示であり、本発明を限定することを決して意図するものではない。

【実施例】

【0070】

実施例１
２２３位、４０６位、又は４１０位のアミノ酸が修飾されている一連の組換え第ＩＸ因子誘導体を活性について試験した。具体的には、Ｇｌｕ⁴¹⁰は、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、又はＨｉｓで置換され；Ｖａｌ²²³はＴｙｒで置換され；かつＡｓｎ⁴⁰⁶は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＧｌｎで置換されていた。さらに、Ｇｌｕ⁴¹⁰がＬｙｓで置換され、かつＡｒｇ³³⁸がＬｅｕで置換された第ＩＸ因子変異体が作製された。簡単に述べると、１００ｍｍプレート内のＨＥＫ２９３細胞に、第ＩＸ因子変異体を発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞の培地を４８時間で収集し、そして第ＩＸ因子活性を、１段階の第ＩＸ因子特異的凝固アッセイで評価した。抗原レベルを、第ＩＸ因子特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した。実験的変動を制御するために、第ＩＸ因子変異体の比活性を抗原レベルに対して正規化した。表１に示されるように、上で確認した置換は、野生型第ＩＸ因子よりも高い比活性をもたらした。特に、二重変異体は、第ＩＸ因子の比活性を１５倍を超えて増強した。

【0071】

【表1】

【0072】

血友病Ｂマウスに、肝臓特異的プロモーターの制御下で、４×１０¹¹のベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの、ＦＩＸＲ３３８Ｌ＋Ｅ４１０Ｋ（ｎ＝７）又はＷＴＦＩＸ（ｎ＝２）をコードするＡＡＶ８ベクターを血管内投与した。図２は、血友病ＢマウスにおけるＦＩＸ変異体（Ｒ３３８Ｌ＋Ｅ４１０Ｋ）及びＦＩＸ－ＷＴのインビボ比活性を示す。血漿試料を、ベクター注入の４週間後に回収し、活性をａＰＴＴベースのアッセイによって測定し、抗原をＦＩＸＥＬＩＳＡによって測定した。重要なことに、ＦＩＸ変異体は、野生型ＦＩＸよりもインビボで劇的に高い活性を示す。

【0073】

実施例２
新規のＦＩＸ変異体を同定するために、（１）血友病Ｂと関連すると報告されなかったアミノ酸位置；（２）種間で高度に保存されていたアミノ酸位置；及び（３）タンパク質機能に関連する領域内に位置していたアミノ酸位置を選択した。例えば、活性化ＦＩＸが活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）に結合する能力、又は内因性経路の活性化に関与する他の酵素と相互作用する能力に影響を及ぼす領域。３４２位又は３４３位のアミノ酸が修飾されている一連の組換え第ＩＸ因子誘導体を活性について試験した。具体的には、Ｔｈｒ³⁴³をＭｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、又はＧｌｙで置換し、Ｐｈｅ³⁴²をＨｉｓで置換した。

【0074】

簡潔に述べると、６ウェルプレート内のコンフルエントなＨＥＫ２９３細胞を、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ＦＩＸ変異体の１０μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトする。トランスフェクションの４～６時間後に、細胞を、コンフルエントな状態が継続されているかについてチェックし、１０μｇ／ｍｌのビタミンＫを含むＦＩＸ発現培地に替えた。２４時間後に、馴化培地を回収した。ＦＩＸ抗原レベルを、市販のＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡ（ＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ａｎｃａｓｔｅｒ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）によって決定し、そして活性を、ａＰＴＴベースの凝固アッセイによって決定した。両方のアッセイは、標準として市販の組換えＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））を使用する。全ての実験を三連で行い、そして同時にトランスフェクトされたＦＩＸ－ＷＴと比較した（Ａｒｒｕｄａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００１）９７：１３０）。

【0075】

表２に示されるように、上で確認した置換は、野生型第ＩＸ因子よりも高い比活性をもたらした。

【0076】

【表2】