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▶ デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-22
(45)【発行日】2022-12-01
(54)【発明の名称】賦形剤を含む乾燥微生物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/66 20150101AFI20221124BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20221124BHJP
A61K 35/745 20150101ALI20221124BHJP
A61K 36/06 20060101ALI20221124BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20221124BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20221124BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20221124BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20221124BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20221124BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20221124BHJP
【ＦＩ】
A61K35/66
A61K35/747
A61K35/745
A61K36/06 A
A61K47/04
A61K9/48
A61K9/20
A61K9/14
A61P3/02
A61K9/19
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2019538674
(86)(22)【出願日】2018-01-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-20
(86)【国際出願番号】 EP2018050761
(87)【国際公開番号】W WO2018134135
(87)【国際公開日】2018-07-26
【審査請求日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】62/448,066
(32)【優先日】2017-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17159494.8
(32)【優先日】2017-03-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】397060588
【氏名又は名称】デュポン ニュートリション バイオサイエンシーズ エーピーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】クリストフ・ホラード
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー・バビン
【審査官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／０１８５０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００２－３０６１２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／０１８５４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５０２５０５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）乾燥微生物と（ｂ）粉末形態のリン酸塩とのブレンド物を含有する組成物であって、前記リン酸塩が、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＭｇＨＰＯ4、Ｍｇ［Ｈ2ＰＯ4］2、及びこれらの混合物から選択され、
前記リン酸塩が微生物及びリン酸塩の総重量を基準として少なくとも５０重量％の量で存在する、上記組成物。
【請求項2】
前記リン酸塩が、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、及びこれらの混合物から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記リン酸塩が、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、及びこれらの混合物から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記リン酸塩が、Ｋ 2 ＨＰＯ 4 、Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 、及びＭｇＨＰＯ 4 から選択される１つ又はそれ以上の塩と、
ＫＨ 2 ＰＯ 4 、ＮａＨ 2 ＰＯ 4 、及びＭｇ［Ｈ 2 ＰＯ 4 ］ 2 から選択される１つ又はそれ以上の塩との混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記リン酸塩がｐＨ６～９にｐＨ調整される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記リン酸塩が６．８～７．２にｐＨ調整される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記リン酸塩が微生物及びリン酸塩の総重量を基準として少なくとも６０重量％の量で存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記リン酸塩が微生物及びリン酸塩の総重量を基準として少なくとも８０重量％の量で存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記微生物が凍結乾燥されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記微生物がプロバイオティクスである、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
前記微生物が、乳酸杆菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、ビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サッカロミケス（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びこれらの混合物から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記微生物が、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）亜種インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ロイテリ・プロテクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｐｒｏｔｅｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・ロイテリ・プロデンティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｐｒｏｄｅｎｔｉｓ）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、及びこれらの混合物から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
前記微生物がラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
単位微生物用量の請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物を含有する組成物。
【請求項15】
請求項１４に記載の組成物を含有するカプセル。
【請求項16】
請求項１４に記載の組成物を含有する小袋。
【請求項17】
請求項１４に記載の組成物を含有する錠剤。
【請求項18】
請求項１４に記載の組成物を含有する粉末栄養製剤。
【請求項19】
（ｉ）（ａ）乾燥微生物、及び（ｂ）粉末形態のリン酸塩を準備する工程；並びに（ｉｉ）前記乾燥微生物と前記粉末形態のリン酸塩とを混合して組成物を得る工程；
を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乾燥微生物の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥によって、貯蔵のために微生物を乾燥することは一般的である。そのような乾燥微生物は、工業用途及び食品用途、例えばチーズ及びヨーグルトの製造において、並びにプロバイオティクスとしても使用されている。貯蔵中に乾燥生物の生存能力はある程度低下するため、時間とともに生細胞数は減少する。これは特に高湿環境では問題になる。
【0003】
プロバイオティクスは、適切な投与量で投与された場合にヒト又は動物の健康に有益な生きた微生物である。プロバイオティクスを投与する１つの方法は、賦形剤と混合され、カプセル又は小袋の中に包装された乾燥プロバイオティクスの摂取によるものである。残念なことに、乾燥したプロバイオティクスの細胞は貯蔵中にあまり安定ではないため、生細胞数は時間とともに減少し、治療効果が低下する。これは、プロバイオティクスが高い湿度含有率を有する賦形剤とブレンドされている場合、容器の壁が外部の大気中の水分に対して透過性である場合、及びプロバイオティクスが高い相対湿度環境で貯蔵される場合に特に当てはまる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
第１の態様では、本発明は、（ａ）乾燥微生物と（ｂ）粉末形態のリン酸塩とのブレンド物を含有する組成物を提供する。
【0005】
第２の態様では、本発明は、（ａ）乾燥微生物と（ｂ）粉末形態のリン酸塩との混合物を含有する組成物を含有する単位微生物用量を提供する。
【0006】
第３の態様では、本発明は、
（ｉ）（ａ）乾燥微生物、及び（ｂ）粉末形態のリン酸塩を準備する工程；
（ｉｉ）乾燥微生物と粉末形態のリン酸塩とを混合して組成物を得る工程；
を含む、組成物の調製方法を提供する。
（ｉ）（ａ）乾燥微生物、及び（ｂ）粉末形態のリン酸塩を準備する工程；
（ｉｉ）乾燥微生物と粉末形態のリン酸塩とを混合して組成物を得る工程；
を含む、組成物の調製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】従来の賦形剤（「ＭＣＣ」）又は賦形剤なし（「凍結乾燥プロバイオティクス」）と比較した、本発明による賦形剤（「Ｋ２ＨＰＯ４」）と混合した様々な菌株の３０℃での湿潤条件（ａｗ＝０．４）での３か月貯蔵後の％生存率を示す。
【図2】従来の賦形剤（「ＭＣＣ」）と比較した、本発明による賦形剤（「Ｋ２ＨＰＯ４」）と混合した凍結乾燥ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）のａｗ（ａｗ＝０．１、ａｗ＝０．２、及びａｗ＝０．３）の関数としての３０℃で３か月後の％生存率を示す。
【図3】３０℃で６か月後の、湿潤条件（ａｗ０．４）下のブレンド物中のＫ２ＨＰＯ４賦形剤の割合の関数としてのラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の％生存率を示す。
【図4】３０℃で６か月後の、湿潤条件（ａｗ０．４）下のＭＣＣとのブレンド物中のＫ２ＨＰＯ４賦形剤の割合の関数としてのラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の％生存率を示す。
【図5】１か月後及び３か月後の３０℃での乾燥条件下（ａｗ０．１）での凍結乾燥ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末の％生存率に対する賦形剤のｐＨの影響を示す。「ＫＰ」は表示ｐＨまでｐＨが調整されたＫ２ＨＰＯ４を示し、「Ｋ２ＨＰＯ４」はｐＨ調整なしのＫ２ＨＰＯ４を示し、「ＭＣＣ」は微結晶セルロースを示す。
【図6】３か月後の３０℃での湿潤条件下（ａｗ０．４）での凍結乾燥ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末の％生存率に対する賦形剤のｐＨの影響を示す。「Ｋ２ＨＰＯ４」は表示ｐＨまでｐＨが調整されたＫ２ＨＰＯ４を示し、「ＭＣＣ」は微結晶セルロースを示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本明細書で言及される全ての文献は参照により組み込まれる。
【0009】
本発明者らは、驚くべきことに、乾燥微生物の生存率が賦形剤としてのリン酸塩を使用することによって改善されることを見出した。その効果は、高い水分活性（ａｗ）環境で特に顕著である。高い水分活性は、ａｗ＞０．１５であるとみなされる。
【0010】
典型的には、微生物乾燥粉末、特にプロバイオティクスは、微生物濃度を標準化するために賦形剤とブレンドされる。特に微生物がカプセル及び小袋に入れられている場合に最も使用される賦形剤のうちの１つは、微結晶セルロース（ＭＣＣ）である。本発明者らは、参照賦形剤としてＭＣＣを使用した。本発明者らは、ＭＣＣ賦形剤においてほぼ０％の生存率であるのと比較して、リン酸塩を使用すると、３か月以上６０％を超える乾燥微生物の生存率が得られることを見出した。この効果は、高い水分活性の環境（ａｗ＞０．１５、特にａｗ＞０．２、更にはａｗ＞０．３）において特に顕著である。
【0011】
水分活性は、好ましくは露点湿度計によって測定される。
【0012】
微生物の生存率は２つの異なる方法で表される。
Ａ）生存率
％生存率＝（貯蔵後のＣＦＵ／ＣＦＵｔ０）×１００％
Ｂ）Ｌｏｇ損失
Ｌｏｇ損失＝Ｌｏｇ（ＣＦＵｔ０）－Ｌｏｇ（貯蔵後のＣＦＵ）
Ａ）生存率
％生存率＝（貯蔵後のＣＦＵ／ＣＦＵｔ０）×１００％
Ｂ）Ｌｏｇ損失
Ｌｏｇ損失＝Ｌｏｇ（ＣＦＵｔ０）－Ｌｏｇ（貯蔵後のＣＦＵ）
【0013】
乾燥微生物
本発明の組成物は、乾燥微生物を含有する。微生物、特にプロバイオティクスは、任意の手段で乾燥させることができるものの、凍結乾燥及び噴霧乾燥が好ましく、凍結乾燥が特に好ましい。
本発明の組成物は、乾燥微生物を含有する。微生物、特にプロバイオティクスは、任意の手段で乾燥させることができるものの、凍結乾燥及び噴霧乾燥が好ましく、凍結乾燥が特に好ましい。
【0014】
微生物という表現は、任意の細菌もしくは酵母、又はこれらの混合物、特にプロバイオティクスを包含することが意図されている。
【0015】
プロバイオティクスという用語には、宿主に健康上の利益を与えることを目的として宿主に投与される全ての生存微生物が含まれる。特に、これは酵母もしくは細菌、又はこれらの任意の混合物であってもよい。
【0016】
乾燥微生物、特にプロバイオティクスは、送達に適した任意の形態で提供することができる。例えば、乾燥微生物、特にプロバイオティクスは、顆粒又は粉末の形態で提供されてもよい。１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは粉末形態である。
【0017】
本発明の組成物は、１種の微生物（特にプロバイオティクス）、１種の微生物株（特にプロバイオティクス）、微生物種の混合物（特にプロバイオティクス）、又は微生物株の混合物（特にプロバイオティクス）を含有していてもよい。１つの態様においては、本発明の組成物は、１種の微生物（特にプロバイオティクス）と、任意選択的な１種の微生物株（特にプロバイオティクス）とを含有する。１つの態様においては、本発明の組成物は、微生物の株の混合物（特にプロバイオティクス）を含有する。１つの態様においては、本発明の組成物は微生物種の混合物（特にプロバイオティクス）を含有する。
【0018】
好ましい実施形態では、微生物、特にプロバイオティクスは、乳酸杆菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、ビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サッカロミケス（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びこれらの混合物から選択される。
【0019】
更に好ましい実施形態では、微生物、特にプロバイオティクスは、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）亜種インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ロイテリ・プロテクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｐｒｏｔｅｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・ロイテリ・プロデンティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｐｒｏｄｅｎｔｉｓ）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、及びこれらの混合物から選択される種から選択される。
【0020】
更に好ましい実施形態では、微生物、特にプロバイオティクスは、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、及びこれらの混合物から選択される種から選択される。
【0021】
１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＧＢＩ－３０、６０８６、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）亜種インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）３５６２４、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕ）ＮＣＦＭ、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）Ｓｔ１１（又はＮＣＣ２４６１）、ラクトバシラス・ジョンソニィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｌａ１（＝ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＬＣ１、ラクトバシラス・ジョンソニィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ５３３）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２９９ｖ、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ５５７３０（ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＳＤ２１１２）、ラクトバシラス・ロイテリ・プロテクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｐｒｏｔｅｃｔｉｓ）（ＤＳＭ１７９３８、ＡＴＣＣ５５７３０の娘株）、ラクトバシラス・ロイテリ・プロデンティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｐｒｏｄｅｎｔｉｓ）（ＤＳＭ１７９３８／ＡＴＣＣ５５７３０とＡＴＣＣ ＰＴＡ５２８９との組み合わせ）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＲ－１、ラクトバシラス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＲＣ－１４、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＬ１２８５、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ＬＢＣ８０Ｒ、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ ９、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）８７００：２、及びこれらの混合物の微生物から選択される。
【0022】
１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＣＦＭ株）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓｅｉ）（ＬＰＣ３７株）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｉｓ）（ＨＮ００１９）、及びこれらの混合物の株のプロバイオティクスから選択される。
【0023】
微生物、特にプロバイオティクスは、必要量の微生物、特にプロバイオティクスを送達するために任意の適切な量で存在していてもよい。微生物の「濃度」、特に組成物１グラム当たりの微生物のコロニー形成単位（ＣＦＵ）でのプロバイオティクスも、当業者が選択することができる。１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは、組成物１グラム当たり少なくとも１×１０８ＣＦＵの量で存在する。１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは、組成物１グラム当たり少なくとも１×１０９ＣＦＵの量で存在する。１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは、組成物１グラム当たり少なくとも１×１０１０ＣＦＵの量で存在する。１つの態様においては、微生物、特にプロバイオティクスは、組成物１グラム当たり１×１０９～５×１０９ＣＦＵの量で存在する。
【0024】
単位プロバイオティクス用量として処方される場合、その用量は任意の望まれる量のプロバイオティクスを含む。典型的な単位用量は、１用量当たり１０８～１０１４ＣＦＵ、より好ましくは１用量当たり１０９～１０１２ＣＦＵ、特に好ましくは１０９～１０１１ＣＦＵを含むであろう。
【0025】
微生物、特にプロバイオティクスは、乾燥形態であり、好ましくは噴霧乾燥又は凍結乾燥形態、特に凍結乾燥形態である。好ましくは、乾燥微生物、特にプロバイオティクスは、０．４以下、より好ましくは０．３以下、特に好ましくは０．２以下の水分活性を有する。より特に好ましくは、乾燥微生物、特にプロバイオティクスは、０．１以下の水分活性を有する。
【0026】
リン酸塩
本発明の組成物はリン酸塩を含有する。リン酸塩は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）の任意の塩であり、リン酸二水素塩（Ｈ２ＰＯ４ －）、リン酸水素塩（ＨＰＯ４ ２－）、及びリン酸塩（ＰＯ４ ３－）に基づいた塩を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、リン酸水素塩（ＨＰＯ４ ２－）、又はリン酸水素塩（ＨＰＯ４ ２－）とリン酸二水素塩（Ｈ２ＰＯ４ －）との混合物を含有する。
本発明の組成物はリン酸塩を含有する。リン酸塩は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）の任意の塩であり、リン酸二水素塩（Ｈ２ＰＯ４ －）、リン酸水素塩（ＨＰＯ４ ２－）、及びリン酸塩（ＰＯ４ ３－）に基づいた塩を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、リン酸水素塩（ＨＰＯ４ ２－）、又はリン酸水素塩（ＨＰＯ４ ２－）とリン酸二水素塩（Ｈ２ＰＯ４ －）との混合物を含有する。
【0027】
水和と無水の両方のリン酸塩を使用することができる。
【0028】
リン酸塩のカチオンは特に限定されない。好ましい実施形態では、リン酸塩のカチオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムから選択される。好適なリン酸塩の例としては、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｍ
ｇＨＰＯ４、Ｍｇ［Ｈ２ＰＯ４］２、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ［Ｈ２ＰＯ４］２が挙げられる。特に好ましい実施形態では、リン酸塩はリン酸カリウム塩である。
ｇＨＰＯ４、Ｍｇ［Ｈ２ＰＯ４］２、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ［Ｈ２ＰＯ４］２が挙げられる。特に好ましい実施形態では、リン酸塩はリン酸カリウム塩である。
【0029】
好ましくは、リン酸塩は、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、又はリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）とリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）との混合物である。
【0030】
好ましい実施形態では、リン酸塩はｐＨ６～ｐＨ９、好ましくはｐＨ６．５～８、より特に好ましくはｐＨ６．８～７．２にｐＨ調整される。「塩のｐＨ」という表現は、塩が水に溶解している際の溶液のｐＨを意味する。ｐＨは、リン酸二水素塩、リン酸水素塩、及びリン酸塩のブレンド物を使用することによって調整することができる。好ましい実施形態では、ＨＰＯ４
２－とＨ２ＰＯ４
－の塩のブレンド物が使用される。望まれるｐＨを得るためのこれらの塩の相対的な量は周知である。例えば、６１．５／３８．５のＨＰＯ４
２－／Ｈ２ＰＯ４
－モル比は７のｐＨを与える。あるいは、ｐＨ調整された塩は、ＰＯ４
３－及び／又はＨＰＯ４
２－の塩の溶液を、酸又は塩で望みのｐＨまで滴定し、その後得られた溶液を例えば噴霧乾燥などにより乾燥させることによって調製することができる。
【0031】
リン酸塩は、乾燥微生物、特にプロバイオティクスの望まれる安定化を与えるために、任意の適切な量で本発明の組成物中に存在していてもよい。本発明との関係においては、重量％は、微生物（特にプロバイオティクス）及びリン酸塩の総重量に対して与えられる。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも１０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも２０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも３０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも４０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも５０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも６０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも７０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の少なくとも８０重量％の量で存在する。
【0032】
１つの態様においては、リン酸塩は組成物の１０～９０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の２０～９０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の３０～９０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の４０～９０重量％、より好ましくは５０～８０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の５０～９０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の６０～９０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の７０～９０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は組成物の８０～９０重量％の量で存在する。本発明との関係においては、重量％は、微生物（特にプロバイオティクス）及びリン酸塩の総重量に対して与えられる。
【0033】
微生物（特にプロバイオティクス）及びリン酸塩以外の成分が組成物中に存在する場合、リン酸塩は、全組成物の少なくとも１０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも２０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも３０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも４０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも５０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも５９重量％又は６０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも７０重量％の量で存在する。１つの態様においては、リン酸塩は、全組成物の少なくとも８０重量％の量で存在する。
【0034】
好適な混合物は、８０重量％のリン酸塩と、２０重量％の微生物、特にプロバイオティクスである。
【0035】
リン酸塩は、好ましくは粉末形態である。好ましくは、粒径分布は、５～１２０（より好ましくは５～９０）のミクロン単位のＤ１０値、７０～１８０（より好ましくは８０～１４０）のミクロン単位のＤ５０値、及び１６０～４００（より好ましくは１８０～３５０）のミクロン単位のＤ９０値を有する。
【0036】
微生物、特にプロバイオティクスの生存率は、高い水分活性（ａｗ＞０．１５、好ましくはａｗ＞０．２、より好ましくはａｗ＞０．３）条件下で特に増加する。
【0037】
本発明の組成物は、好ましくは、微生物単独と比較して、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは６０％超、微生物（特にプロバイオティクス）の生存率を増加させる。
【0038】
本発明の組成物は、好ましくは、湿潤条件下（ａｗ＞０．１５、好ましくは＞０．２、より好ましくは＞０．３）、微生物単独と比較して、少なくとも１％～３０％、より好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは３０％超、微生物（特にプロバイオティクス）の生存率を増加させる。
【0039】
本発明の組成物は、好ましくは、賦形剤としてＭＣＣを用いたプロバイオティクスと比較して、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは６０％超、プロバイオティクスの生存率を増加させる。
【0040】
本発明の組成物は、好ましくは、湿潤条件下（ａｗ＞０．１５、好ましくは＞０．２、より好ましくは＞０．３）、賦形剤としてＭＣＣを用いたプロバイオティクスと比較して、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは６０％超のプロバイオティクスの生存率を増加させる。
【0041】
追加の成分
本発明の組成物は、プロバイオティクス及びリン酸塩のみを含有してもよく、あるいはこれは１種以上の追加の成分を含有してもよい。
本発明の組成物は、プロバイオティクス及びリン酸塩のみを含有してもよく、あるいはこれは１種以上の追加の成分を含有してもよい。
【0042】
一実施形態では、組成物は、追加の賦形剤（マルトデキストリン、微結晶セルロース（ＭＣＣ）等）、プロバイオティクス（イヌリン、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ポリデキストロース等）、流動助剤（シリカ、ステアリン酸マグネシウム等）を更に含有する。
【0043】
追加の成分が存在する場合、好ましくはそれらは全組成物の２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満を占める。
【0044】
使用
本発明の組成物は、プロバイオティクスとしてヒト又は動物に投与するために使用することができ、あるいは工業用途又は食品用途のために使用することができる。典型的な食品用途としては、チーズ、ヨーグルト、発酵大豆製品（味噌、納豆など）、ザワークラウト、食用アルコール製品などの製造が挙げられる。典型的な工業用途としては、工業用アルコールの製造などの発酵による原料又は完成材料の製造が挙げられる。
本発明の組成物は、プロバイオティクスとしてヒト又は動物に投与するために使用することができ、あるいは工業用途又は食品用途のために使用することができる。典型的な食品用途としては、チーズ、ヨーグルト、発酵大豆製品（味噌、納豆など）、ザワークラウト、食用アルコール製品などの製造が挙げられる。典型的な工業用途としては、工業用アルコールの製造などの発酵による原料又は完成材料の製造が挙げられる。
【0045】
形態
本発明の組成物は、例えば食品もしくは工業用途の前、又はヒトもしくは動物への投与前、及び／又は適切な剤形への分割前の、貯蔵又は輸送のためのバルク粉末ミックスの形態であってもよい。
本発明の組成物は、例えば食品もしくは工業用途の前、又はヒトもしくは動物への投与前、及び／又は適切な剤形への分割前の、貯蔵又は輸送のためのバルク粉末ミックスの形態であってもよい。
【0046】
更なる態様においては、本発明は、ヒト又は動物に投与するための単位微生物用量を提供する。単位微生物用量は、適切な量の本発明の組成物を含み、これは、例えば小袋、カプセル、又は錠剤の中に包装されていてもよい。典型的な単位用量は、１用量当たり１０８～１０１４ＣＦＵ、より好ましくは１用量当たり１０１０～１０１２ＣＦＵを含むであろう。
【0047】
方法
更なる態様においては、本発明は、（ｉ）（ａ）乾燥微生物及び（ｂ）粉末形態のリン酸塩を準備すること；（ｉｉ）乾燥微生物と粉末形態のリン酸塩とを混合して組成物を得ること；を含む、本発明の組成物の調製方法を提供する。本方法の好ましい実施形態においては、微生物は凍結乾燥されている。
更なる態様においては、本発明は、（ｉ）（ａ）乾燥微生物及び（ｂ）粉末形態のリン酸塩を準備すること；（ｉｉ）乾燥微生物と粉末形態のリン酸塩とを混合して組成物を得ること；を含む、本発明の組成物の調製方法を提供する。本方法の好ましい実施形態においては、微生物は凍結乾燥されている。
【0048】
混合は、微生物にダメージを与えない任意の方法によって行うことができる。例えば、適切な容器内での回転又は振とう、及び／又はパドルなどの混合器具による混合である。
【実施例】
【0049】
材料
以下の凍結乾燥プロバイオティクスを用いて実験を行った：ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＣＦＭ株）株、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（ＬＰＣ３７株）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）（ＨＮ００１９）。
以下の凍結乾燥プロバイオティクスを用いて実験を行った：ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＣＦＭ株）株、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（ＬＰＣ３７株）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）（ＨＮ００１９）。
【0050】
微結晶セルロースはＭｉｎｇｔａｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から供給され、リン酸二カリウムはＢＫＧ ｌｕｌｈｉ Ｇｍｂｈ社から得た。
【0051】
使用したカプセルは、Ｃａｐｓｕｇｅｌ ｃｉｅからのＶｃａｐｓ、サイズ０、ＣＳ、ヒプロメロースであった。
【0052】
シリカは、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧから入手したＳｉｐｅｒｎａｔ５０ｓであった。
【0053】
ステアリン酸マグネシウムはＡｃｅｔｏ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。
【0054】
マルトデキストリン（ＩＴ６）はＲｏｑｕｅｔｔｅから入手した。
【0055】
分析方法
水分活性測定（ａｗ）
水分活性測定のために、Ａｑｕａｌａｂ ３ＴＥ，Ｄｅｃａｇｏｎを使用した。鏡、光学センサー、内部ファン、及び赤外線温度センサーを含む密閉チャンバーのヘッドスペース内で、試料（約１ｇ）を平衡化する。
水分活性測定（ａｗ）
水分活性測定のために、Ａｑｕａｌａｂ ３ＴＥ，Ｄｅｃａｇｏｎを使用した。鏡、光学センサー、内部ファン、及び赤外線温度センサーを含む密閉チャンバーのヘッドスペース内で、試料（約１ｇ）を平衡化する。
【0056】
細胞計数方法
使用される細胞計数方法は、株に応じた品質管理研究所からの方法である。結果は、製品１ｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）で示した。
使用される細胞計数方法は、株に応じた品質管理研究所からの方法である。結果は、製品１ｇ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）で示した。
【0057】
方法は、以下のことから構成された：
（ｉ）１ｇの試料を瓶の中に秤り入れた。滅菌ペプトン水を１００ｇまで入れ、混合物をベンチトップシェーカーを用いて４００ｒｐｍで５分間混合した。混合物を室温で２０分間放置し、その後５分間再び混合して均質な溶液を得た。元の試料から１０－２希釈液を得た。
（ｉｉ）その後の希釈を１：１０の段階で行い、１ｍｌの溶液を９ｍｌのペプトン水に添加することによって行った。溶液を最大速度でＶｏｒｔｅｘシステムを使用して２０秒間各工程で均質化した。
（ｉｉｉ）ＭＲＳ寒天及び１％のシステインを用いて細胞を平板培養した。
（ｉｖ）各決定のために、４つのプレートを数えた：２つの異なる体積の細胞懸濁液を平板培養し、各体積を二度繰り返した。次いで、プレート上で得られたコロニーの数を加え、これらのプレートのために使用した細胞懸濁液の体積の総和で割った。
（ｖｉ）プレートを、３７℃で７２時間インキュベートした。
（ｉ）１ｇの試料を瓶の中に秤り入れた。滅菌ペプトン水を１００ｇまで入れ、混合物をベンチトップシェーカーを用いて４００ｒｐｍで５分間混合した。混合物を室温で２０分間放置し、その後５分間再び混合して均質な溶液を得た。元の試料から１０－２希釈液を得た。
（ｉｉ）その後の希釈を１：１０の段階で行い、１ｍｌの溶液を９ｍｌのペプトン水に添加することによって行った。溶液を最大速度でＶｏｒｔｅｘシステムを使用して２０秒間各工程で均質化した。
（ｉｉｉ）ＭＲＳ寒天及び１％のシステインを用いて細胞を平板培養した。
（ｉｖ）各決定のために、４つのプレートを数えた：２つの異なる体積の細胞懸濁液を平板培養し、各体積を二度繰り返した。次いで、プレート上で得られたコロニーの数を加え、これらのプレートのために使用した細胞懸濁液の体積の総和で割った。
（ｖｉ）プレートを、３７℃で７２時間インキュベートした。
【0058】
実施例１
試料の調製
様々なプロバイオティクス種をＭＣＣと混合して、１．５×１０１０～３×１０１０ＣＦＵ／ｇのＣＦＵを得た。ブレンド物をプラスチック瓶中で２０分間回転（約６０ｔｒ／分）させることにより混合した。その後、カプセルにブレンド物を詰めた。試料の調製は、４０％ＲＨ、２５℃のクリーンルームで行った。
試料の調製
様々なプロバイオティクス種をＭＣＣと混合して、１．５×１０１０～３×１０１０ＣＦＵ／ｇのＣＦＵを得た。ブレンド物をプラスチック瓶中で２０分間回転（約６０ｔｒ／分）させることにより混合した。その後、カプセルにブレンド物を詰めた。試料の調製は、４０％ＲＨ、２５℃のクリーンルームで行った。
【0059】
高湿度暴露試験
マルトデキストリンを、平衡に到達するまで４０％ＲＨの雰囲気に暴露した。その結果、マルトデキストリンのａｗはほぼ０．４であった。同じ方法を使用して、０．３及び０．１のａｗで平衡化されたマルトデキストリンを得た。
マルトデキストリンを、平衡に到達するまで４０％ＲＨの雰囲気に暴露した。その結果、マルトデキストリンのａｗはほぼ０．４であった。同じ方法を使用して、０．３及び０．１のａｗで平衡化されたマルトデキストリンを得た。
【0060】
カプセルを作製し、次のものを充填した：
１．プロバイオティクス粉末のみ、
２．プロバイオティクス（２０重量％）－ＭＣＣ（８０重量％）ブレンド物、及び
３．プロバイオティクス（２０重量％）－Ｋ２ＨＰＯ４（８０重量％）のブレンド物。
１．プロバイオティクス粉末のみ、
２．プロバイオティクス（２０重量％）－ＭＣＣ（８０重量％）ブレンド物、及び
３．プロバイオティクス（２０重量％）－Ｋ２ＨＰＯ４（８０重量％）のブレンド物。
【0061】
これらのカプセルをガラス瓶の中に入れた。その後、約０．４のａｗでマルトデキストリンを上に添加し、瓶を必要とされる時間振とうした。
【0062】
カプセルを３０℃の環境室の中で６か月間貯蔵した。安定性の性能に対する賦形剤の種類の影響を評価するために、０か月、１か月、及び３か月の時点でＣＦＵ及びａｗを測定した。
【0063】
生存率の計算
プロバイオティクスの生存率は２つの異なる方法で表した。
Ａ）生存率
％生存率＝（貯蔵後のＣＦＵ／ＣＦＵｔ０）×１００％
Ｂ）Ｌｏｇ損失
Ｌｏｇ損失＝Ｌｏｇ（ＣＦＵｔ０）－Ｌｏｇ（貯蔵後のＣＦＵ）
プロバイオティクスの生存率は２つの異なる方法で表した。
Ａ）生存率
％生存率＝（貯蔵後のＣＦＵ／ＣＦＵｔ０）×１００％
Ｂ）Ｌｏｇ損失
Ｌｏｇ損失＝Ｌｏｇ（ＣＦＵｔ０）－Ｌｏｇ（貯蔵後のＣＦＵ）
【0064】
結果
使用した賦形剤による３か月後の湿潤条件下（ａｗ０．４）での様々な菌株の生存率を表１に示す。ＭＣＣはプロバイオティクスをＭＣＣと混合した場合を表し、Ｋ２ＨＰＯ４はプロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４と混合した場合を表し、「凍結乾燥プロバイオティクス」は、プロバイオティクス粉末のみを用いた場合を表す。
使用した賦形剤による３か月後の湿潤条件下（ａｗ０．４）での様々な菌株の生存率を表１に示す。ＭＣＣはプロバイオティクスをＭＣＣと混合した場合を表し、Ｋ２ＨＰＯ４はプロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４と混合した場合を表し、「凍結乾燥プロバイオティクス」は、プロバイオティクス粉末のみを用いた場合を表す。
【0065】
【表1】
【0066】
図１は、同じ結果をグラフ形式で示している。ＭＣＣはプロバイオティクスをＭＣＣと混合した場合を表し、Ｋ２ＨＰＯ４はプロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４と混合した場合を表し、「凍結乾燥プロバイオティクス」は、プロバイオティクス粉末のみを用いた場合を表す。
【0067】
表１及び図１は、安定性に対するＫ２ＨＰＯ４の影響が菌株に応じて変化することを示している。生存率は、ＭＣＣ又はプロバイオティクスのみを用いるよりも賦形剤としてのＫ２ＨＰＯ４を用いる方が常に高い。賦形剤としてのＫ２ＨＰＯ４の使用が、特に湿潤条件下で、菌株の安定性（生存率）を改善することは明らかである。
【0068】
異なる湿度条件下でのラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生存率
３０℃で３か月後のラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の、ａｗ及び賦形剤の関数としての生存率を表２に示す。ＭＣＣはプロバイオティクスをＭＣＣと混合した場合を表し、Ｋ２ＨＰＯ４はプロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４と混合した場合を表す。
３０℃で３か月後のラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の、ａｗ及び賦形剤の関数としての生存率を表２に示す。ＭＣＣはプロバイオティクスをＭＣＣと混合した場合を表し、Ｋ２ＨＰＯ４はプロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４と混合した場合を表す。
【0069】
【表2】
【0070】
図２は、同じ結果をグラフ形式で示している。ＭＣＣはプロバイオティクスをＭＣＣと混合した場合を表し、Ｋ２ＨＰＯ４はプロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４と混合した場合を表す。
【0071】
表２及び図２は、高湿度条件（ａｗ＞０．１）では、Ｋ２ＨＰＯ４を用いた生存率がＭＣＣを用いた生存率よりも常に高いことを示している。低湿度条件（ａｗ＝０．１）では、Ｋ２ＨＰＯ４を用いた安定性とＭＣＣを用いた安定性とは同様である。
【0072】
これらの結果から、Ｋ２ＨＰＯ４を添加すると湿潤条件下での菌株の安定性が改善されることが分かる。
【0073】
実施例２
この実施例では、湿潤環境におけるＫ２ＨＰＯ４濃度の関数としてのプロバイオティクスの安定性を調べる。Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ及びステアリン酸マグネシウムを流動助剤として添加して、市販のブレンド組成物と同様の試料組成物を得た。この実施例のために、凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末を使用した。実施例は２段階で調製した。パート１では、プロバイオティクスはＫ２ＨＰＯ４のみと混合した。パート２では、プロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４及びＭＣＣと混合した。
この実施例では、湿潤環境におけるＫ２ＨＰＯ４濃度の関数としてのプロバイオティクスの安定性を調べる。Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ及びステアリン酸マグネシウムを流動助剤として添加して、市販のブレンド組成物と同様の試料組成物を得た。この実施例のために、凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末を使用した。実施例は２段階で調製した。パート１では、プロバイオティクスはＫ２ＨＰＯ４のみと混合した。パート２では、プロバイオティクスをＫ２ＨＰＯ４及びＭＣＣと混合した。
【0074】
試料の調製
パート１：Ｋ２ＨＰＯ４と混合されたプロバイオティクス
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ、及びステアリン酸マグネシウムからなるブレンド物を調製した。Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ及びステアリン酸マグネシウムの濃度を一定に保ちながら、凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の濃度を徐々に増加させ、Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を徐々に減少させた１０個の試料を作製した。下の表は、パート１の様々な試料の説明を示している。
パート１：Ｋ２ＨＰＯ４と混合されたプロバイオティクス
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ、及びステアリン酸マグネシウムからなるブレンド物を調製した。Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ及びステアリン酸マグネシウムの濃度を一定に保ちながら、凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の濃度を徐々に増加させ、Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を徐々に減少させた１０個の試料を作製した。下の表は、パート１の様々な試料の説明を示している。
【0075】
【表3】
【0076】
パート２：Ｋ２ＨＰＯ４及びＭＣＣと混合されたプロバイオティクス
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭＣＣ、Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ、及びステアリン酸マグネシウムからなるブレンド物を調製した。ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末、Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ、及びステアリン酸マグネシウムの濃度を一定に保ちながら、Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を徐々に増加させ、ＭＣＣの濃度を徐々に減少させた９個の試料を作製した。下の表は、パート２の様々な試料の説明を示している。
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭＣＣ、Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ、及びステアリン酸マグネシウムからなるブレンド物を調製した。ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末、Ｓｉｐｅｒｎａｔ５０ｓ、及びステアリン酸マグネシウムの濃度を一定に保ちながら、Ｋ２ＨＰＯ４の濃度を徐々に増加させ、ＭＣＣの濃度を徐々に減少させた９個の試料を作製した。下の表は、パート２の様々な試料の説明を示している。
【0077】
【表4】
【0078】
結果
パート１の結果
湿潤条件下（ａｗ０．４）でのＫ２ＨＰＯ４賦形剤の重量パーセントの関数としての、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の３０℃で６か月後の生存率を表５に示す。
パート１の結果
湿潤条件下（ａｗ０．４）でのＫ２ＨＰＯ４賦形剤の重量パーセントの関数としての、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の３０℃で６か月後の生存率を表５に示す。
【0079】
【表5】
【0080】
図３は、同じ結果をグラフ形式で示している。
【0081】
表５及び図３は、生存率がＫ２ＨＰＯ４の量の関数として変化することを示している。結果は、Ｋ２ＨＰＯ４が５０重量％を超えると生存率が有意に増加することを示している。Ｋ２ＨＰＯ４が８０重量％を超えても、８０重量％よりは劣るもののＫ２ＨＰＯ４なしよりも依然として有意に優れている。
【0082】
パート２の結果
湿潤条件下（ａｗ０．４）でのＭＣＣとのブレンド物におけるＫ２ＨＰＯ４賦形剤の割合の関数としての、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の３０℃で６か月後の生存率を表６に示す。
湿潤条件下（ａｗ０．４）でのＭＣＣとのブレンド物におけるＫ２ＨＰＯ４賦形剤の割合の関数としての、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の３０℃で６か月後の生存率を表６に示す。
【0083】
【表6】
【0084】
図４は、同じ結果をグラフ形式で示している。
【0085】
表６及び図４は、生存率がＫ２ＨＰＯ４の割合の関数として変化し、Ｋ２ＨＰＯ４が４０重量％を超えると、Ｋ２ＨＰＯ４なしよりも有意に優れていることを示している。
【0086】
実施例３
ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）に対するＫ２ＨＰＯ４賦形剤のｐＨの影響を評価した。
ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）に対するＫ２ＨＰＯ４賦形剤のｐＨの影響を評価した。
【0087】
様々なｐＨ値のＫ２ＨＰＯ４を含む様々な賦形剤（ｐＨ６．５；ｐＨ６．９；ｐＨ７．１；ｐＨ７．６；ｐＨ８．１；ｐＨ９）を製造した。様々なｐＨの賦形剤は、下の２つの方法のいずれかによって調製した：
１．Ｋ２ＨＰＯ４溶液を調製し、リン酸を添加して溶液のｐＨを望みの値にし、次いで溶液を噴霧乾燥して粉末を得た；又は
２．Ｋ２ＨＰＯ４を、望みのｐＨを得るために計算された様々な量のＫＨ２ＰＯ４と乾燥形態でブレンドした。
１．Ｋ２ＨＰＯ４溶液を調製し、リン酸を添加して溶液のｐＨを望みの値にし、次いで溶液を噴霧乾燥して粉末を得た；又は
２．Ｋ２ＨＰＯ４を、望みのｐＨを得るために計算された様々な量のＫＨ２ＰＯ４と乾燥形態でブレンドした。
【0088】
試料の調製
パート１：乾燥条件下での生存に対する賦形剤のｐＨの影響：
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末を様々なｐＨで様々な賦形剤とブレンドした。各ブレンド物の組成は、８０％の賦形剤Ｋ２ＨＰＯ４粉末及び２０％の凍結乾燥プロバイオティクス粉末であった。ブレンド物をプラスチック瓶中で２０分間回転（約６０ｔｒ／分）させることにより混合した。小袋にブレンド物を詰めた。試料の調製は、４０％ＲＨ、２５℃のクリーンルーム内で行った。試験中、小袋を乾燥湿度（ａｗ≦０．１）で３０℃で３か月間貯蔵した。
パート１：乾燥条件下での生存に対する賦形剤のｐＨの影響：
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末を様々なｐＨで様々な賦形剤とブレンドした。各ブレンド物の組成は、８０％の賦形剤Ｋ２ＨＰＯ４粉末及び２０％の凍結乾燥プロバイオティクス粉末であった。ブレンド物をプラスチック瓶中で２０分間回転（約６０ｔｒ／分）させることにより混合した。小袋にブレンド物を詰めた。試料の調製は、４０％ＲＨ、２５℃のクリーンルーム内で行った。試験中、小袋を乾燥湿度（ａｗ≦０．１）で３０℃で３か月間貯蔵した。
【0089】
パート２：湿潤条件下での生存率に対する賦形剤のｐＨの影響：
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末を、様々なｐＨ及びＭＣＣで様々なＫ２ＨＰＯ４粉末とブレンドした。各ブレンド物の組成は、８０％の賦形剤及び２０％の凍結乾燥プロバイオティクス粉末であった。ブレンド物をプラスチック瓶中で２０分間回転（約６０ｔｒ／分）させることにより混合した。試料の調製は、４０％ＲＨ、２５℃のクリーンルームで行った。カプセルにブレンド物を詰め、カプセルをガラス瓶の中に入れた。その後、約０．４のａｗでマルトデキストリンを上に添加し、瓶を振とうした。瓶を３０℃で３か月間貯蔵した。
凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）粉末を、様々なｐＨ及びＭＣＣで様々なＫ２ＨＰＯ４粉末とブレンドした。各ブレンド物の組成は、８０％の賦形剤及び２０％の凍結乾燥プロバイオティクス粉末であった。ブレンド物をプラスチック瓶中で２０分間回転（約６０ｔｒ／分）させることにより混合した。試料の調製は、４０％ＲＨ、２５℃のクリーンルームで行った。カプセルにブレンド物を詰め、カプセルをガラス瓶の中に入れた。その後、約０．４のａｗでマルトデキストリンを上に添加し、瓶を振とうした。瓶を３０℃で３か月間貯蔵した。
【0090】
８０％の乾燥ＭＣＣ及び２０％の凍結乾燥プロバイオティクス粉末を含む対照を調製し、同じ方法で試験した。
【0091】
結果
パート１の結果
乾燥条件（ａｗ≦０．１）下、３０℃で１か月間及び３か月間貯蔵した後の、Ｋ２ＨＰＯ４賦形剤のｐＨの関数としての、凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生存率を表７に示す。
パート１の結果
乾燥条件（ａｗ≦０．１）下、３０℃で１か月間及び３か月間貯蔵した後の、Ｋ２ＨＰＯ４賦形剤のｐＨの関数としての、凍結乾燥したラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生存率を表７に示す。
【0092】
【表7】
【0093】
図５は、同じ結果をグラフ形式で示している。
【0094】
表７及び図５は、乾燥条件下での生存率／安定性はｐＨの関数として変化するが、全ての場合において、唯一の賦形剤としてのＭＣＣを用いた生存率よりも優れていることを示している。安定性は賦形剤のｐＨの影響を受けた。乾燥条件下での安定性のためには、Ｋ２ＨＰＯ４の最適ｐＨは６．９～７．１である。評価された他の種には、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）及びラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）が含まれていた。
【0095】
パート２の結果
湿潤条件下（ａｗ＝０．４）で３０℃で３か月間貯蔵した後の、Ｋ２ＨＰＯ４賦形剤のｐＨの関数としての、凍結乾燥ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生存率を表８に示す。
湿潤条件下（ａｗ＝０．４）で３０℃で３か月間貯蔵した後の、Ｋ２ＨＰＯ４賦形剤のｐＨの関数としての、凍結乾燥ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生存率を表８に示す。
【0096】
【表8】
【0097】
図６は、同じ結果をグラフ形式で示している。
【0098】
表８及び図６は、安定性がｐＨ値の関数として変化することを示している。ｐＨ調整された全ての賦形剤は、湿潤条件下でＭＣＣ粉末よりも優れた安定性を有する。湿潤条件下で最も優れた安定性を得るためには、最適なｐＨは６．９である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】