知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 学校法人 聖マリアンナ医科大学の特許一覧 ▶ 協和メデックス株式会社の特許一覧
特許7182146ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-24
(45)【発行日】2022-12-02
(54)【発明の名称】ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20221125BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221125BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221125BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
C12N15/11 Z ZNA
G01N33/50 P
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2017171605
(22)【出願日】2017-09-06
(65)【公開番号】P2019041733
(43)【公開日】2019-03-22
【審査請求日】2020-07-30
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２９年３月７日国際レトロウイルス学会が発行した第１８回国際ヒトレトロウイルスＨＴＬＶ会議 Ｐｒｏｇｒａｍ ＆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｂｏｏｋ第１１１頁で公開。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２９年３月７日ホテルグランドアーク半蔵門において開催された第１８回国際ヒトレトロウイルスＨＴＬＶ会議で発表。
(73)【特許権者】
【識別番号】596165589
【氏名又は名称】学校法人 聖マリアンナ医科大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000162478
【氏名又は名称】ミナリスメディカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(74)【代理人】
【識別番号】100106574
【弁理士】
【氏名又は名称】岩橋 和幸
(72)【発明者】
【氏名】山野 嘉久
(72)【発明者】
【氏名】東久世 裕太
(72)【発明者】
【氏名】永井 豪
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１４－１６３７６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Mohammad Mehdi Akbarin et al.，Evaluation of the role of TAX, HBZ, and HTLV-1 proviral load on the survival of ATLL patients.，Blood Res.，2017年06月22日，Vol.52, No.2，p.106-11，doi: 10.5045/br.2017.52.2.106
【文献】Tetsuya Usui et al.，Characteristic expression of HTLV-1 basic zipper factor (HBZ) transcripts in HTLV-1 provirus-positive cells.，Retrovirology，2008年04月22日，5:34，doi: 10.1186/1742-4690-5-34
【文献】Human T-lymphotropic virus 1 bZIP factor(HBZ) mRNA, complete cds，GenBank: DQ273132.1，2006年01月19日，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/DQ273132.1?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=30&RID=GWKA490D01R&from=580&to=1331
【文献】Sayed-Hamidreza Mozhgani et al.，Evaluation of HTLV-1 HBZ and proviral load, together with host IFN λ3, in pathogenesis of HAM/TSP.，J. Med. Virol.，2016年11月10日，Vol.89, No.6，p.1102-1107，doi: 10.1002/jmv.24721
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被検者より採取した検体中のヒトＴ細胞白血病ウイルス１型［Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ（以下、ＨＴＬＶ－１と記す）］プロウイルスＤＮＡの測定方法であって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子と、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子とを、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて測定することを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法。
【請求項2】
前記ＰＣＲ法を用いる、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対を用いて行われる、請求項１に記載の測定方法。
【請求項3】
前記プライマー対が、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対である、請求項２に記載の測定方法。
【請求項4】
被検者より採取した検体中のヒトＴ細胞白血病ウイルス１型［Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ（以下、ＨＴＬＶ－１と記す）］プロウイルスＤＮＡの測定方法であって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて測定することを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法であって、
前記ＰＣＲ法を用いる、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、以下の（１）～（６）のいずれかのプライマー対を用いて行われる、測定方法。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
【請求項5】
前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、さらに、第１のＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて行われる、請求項２～４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項6】
前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、請求項５に記載の測定方法。
【請求項7】
前記プライマー対とプローブとの組み合わせが、以下の（１）～（７）のいずれかである、請求項５又は６に記載の測定方法。（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ
【請求項8】
さらに、前記検体中の内部標準遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する、請求項１～７のいずれかに記載の測定方法。
【請求項9】
前記内部標準遺伝子が、ＲＮａｓｅＰ遺伝子である、請求項８に記載の測定方法。
【請求項10】
前記被検者が、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者である、請求項１～９のいずれかに記載の測定方法。
【請求項11】
ＨＴＬＶ－１関連疾患が、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）である、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項12】
被検者より採取した検体中のヒトＴ細胞白血病ウイルス１型［Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ（以下、ＨＴＬＶ－１と記す）］プロウイルスＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて測定するためのキットであって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬、及び、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬、を含むことを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キット。
【請求項13】
前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対を含む試薬である、請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
前記プライマー対が、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対である、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
被検者より採取した検体中のヒトＴ細胞白血病ウイルス１型［Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ（以下、ＨＴＬＶ－１と記す）］プロウイルスＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて測定するためのキットであって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬を含むことを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットであって、
前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、以下の（１）～（６）のいずれかのプライマー対を含む、キット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
【請求項16】
前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、さらに、第１のＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブを含む、請求項１３～１５のいずれかに記載のキット。
【請求項17】
前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
前記プライマー対とプローブとの組み合わせが、以下の（１）～（７）のいずれかである、請求項１６又は１７に記載のキット。（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ
【請求項19】
さらに、前記検体中の内部標準遺伝子測定試薬を含む、請求項１２～１８のいずれかに記載のキット。
【請求項20】
前記内部標準遺伝子が、ＲＮａｓｅＰ遺伝子である、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
前記被検者が、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者である、請求項１２～２０のいずれかに記載のキット。
【請求項22】
前記ＨＴＬＶ－１関連疾患が、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）である、請求項２１に記載のキット。
【請求項23】
被検者より採取した検体中のヒトＴ細胞白血病ウイルス１型［Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ（以下、ＨＴＬＶ－１と記す）］プロウイルスＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて測定するために用いるプライマー対であって、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーと、からなるプライマー対であって、
前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかであるプライマー対。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
【請求項24】
請求項２３に記載のプライマー対を用いて増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブ。
【請求項25】
前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、請求項２４に記載のプローブ。
【請求項26】
以下の（１）～（７）からなる群より選ばれる、プライマー対とプローブとのセット。（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとのセット；（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとのセット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型［Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ（以下、ＨＴＬＶ－１と記す）］プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キット、並びに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを標的として結合するプローブ及びプライマーに関する。
【背景技術】
【0002】
ＨＴＬＶ－１はＲＮＡレトロウイルスの一種で、日沼らによって成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（Ａｄｕｌｔ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＴＬ）の原因ウイルスとして同定された（非特許文献１～３）。ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡには、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐＸ領域が存在し、ｐＸ領域にはｔａｘ遺伝子、ＨＢＺ遺伝子が存在する。ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡとは、ＨＴＬＶ－１のＲＮＡが逆転写酵素により変換されて、ヒトゲノム中に組み込まれたＤＮＡであり、ＨＴＬＶ－１感染の診断に用いられている。
【0003】
ＨＴＬＶ－１が引き起こす疾患としては、例えば血流内やリンパ器官内で発症する成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、脊髄内で発症するＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＴＬＶ－１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ：ＨＡＭ）、眼球内で発症したＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（ＨＴＬＶ－１ ｕｖｅｉｔｉｓ：ＨＵ）等が知られている（非特許文献４～７）。
【0004】
ヒトにおけるＨＴＬＶ－１感染は、主に母から子への垂直感染ならびに夫から妻への水平感染であるが、輸血による医原性感染も知られている。輸血による医原性感染は、１９８６年から開始された抗ＨＴＬＶ－１抗体を検査することにより防止されてきた。輸血による医原性感染の疫学的研究から、ＨＴＬＶ－１感染は血球細胞成分が介在していることが知られている。ＨＴＬＶ－１に感染すると、生体中に抗ＨＴＬＶ－１抗体が生成してくるため、抗ＨＴＬＶ－１抗体を測定することにより、ＨＴＬＶ－１の感染を知ることができる。
【0005】
抗ＨＴＬＶ－１抗体を測定する方法としては、免疫学的手法を用いた測定方法が知られており、ゼラチン粒子凝集法（ＰＡ法）、蛍光抗体法（ＦＡ法）、間接蛍光抗体法（ＩＦ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ウェスタンブロット法（ＷＢ法）などが知られている。ＨＴＬＶ－１キャリア 指導の手引き（厚生労働省研究班「本邦におけるＨＴＬＶ－１感染及び関連疾患の実態調査と総合対策」、２０１１年）によると、一般医療機関ではスクリーニング検査としてＰＡ法やＣＬＥＩＡ法が用いられる。スクリーニング検査で陽性と判断された場合であっても、ＷＢ法による確認検査が実施される。さらに、ＷＢ法による確認検査で判定保留となった場合、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いてＨＴＬＶ－１プロウイルスを検出する検査が実施される。
【0006】
ＰＣＲ法を用いてＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを検出する方法として、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡのｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子という比較的配列が安定した領域を標的とする方法（特許文献１）が知られているが、ＨＴＬＶ－１キャリア又はＨＴＬＶ－１関連疾患患者において、ｔａｘ遺伝子領域に遺伝子変異や欠損が見られることが報告されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１５－０５８００４号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.78(10), pp.6476-6480. 1981
【文献】Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.79, 2031-2035. 1982
【文献】Sciences, Vol.219, pp.856-859. 1983
【文献】Uchiyama et al,Blood,1977;50:481-492.
【文献】Gessain et al,Lancet,1985;2:407-410.
【文献】Osame et al,Lancet,1986;1;1031-1032.
【文献】Kaplan et al,J.Aquir.Immune Defi.Syndro.,1990;3:1096-1101.
【文献】JOURNAL OF VIROLOGY, July 2010, p. 7278-7287.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
ｐＸ領域のうちｔａｘ遺伝子領域を標的とした従来のＰＣＲ法では、ｔａｘ遺伝子領域に遺伝子変異がある場合、正確なＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定ができない。本発明の目的は、ｐＸ領域のｔａｘ遺伝子に遺伝子変異がある場合であっても、正確なＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定を可能とする方法およびキット、並びに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを標的として結合するプライマー及びプローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡのｐＸ領域におけるＨＢＺ遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定することにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを正確に測定できるという知見を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の［１］～［３０］に関する。
［１］被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法であって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定することを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法。
［２］さらに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する、［１］記載の測定方法。
［３］前記ＰＣＲ法を用いる、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対を用いて行われる、［１］又は［２］に記載の測定方法。
［４］プライマー対が、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対である、［３］に記載の測定方法。
［５］前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかである、［４］に記載の測定方法。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
［６］前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、さらに、第１のＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて行われる、［３］～［５］のいずれかに記載の測定方法。
［７］前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、［６］記載の測定方法。
［８］前記プライマー対とプローブとの組み合わせが、以下の（１）～（７）のいずれかである、［６］又は［７］に記載の測定方法。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ
［９］さらに、前記検体中の内部標準遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する、［１］～［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１０］前記内部標準遺伝子が、ＲＮａｓｅＰ遺伝子である、［９］に記載の測定方法。
［１１］前記被検者が、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者である、［１］～［１０］のいずれかに記載の測定方法。
［１２］前記ＨＴＬＶ－１関連疾患が、ＨＡＭである、［１１］に記載の測定方法。
［１３］被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて測定するためのキットであって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬を含むことを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キット。
［１４］さらに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬を含む、［１３］記載のキット。
［１５］前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対を含む試薬である、［１３］又は［１４］に記載のキット。
［１６］前記プライマー対が、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対である、［１５］に記載のキット。
［１７］前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかである、［１６］に記載のキット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
［１８］前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、さらに、第１のＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブを含む、［１５］～［１７］のいずれかに記載のキット。
［１９］前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、［１８］に記載のキット。
［２０］前記プライマー対とプローブとの組み合わせが、以下の（１）～（７）のいずれかである、［１８］又は［１９］に記載のキット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ
［２１］さらに、前記検体中の内部標準遺伝子測定試薬を含む、［１３］～［２０］のいずれかに記載のキット。
［２２］前記内部標準遺伝子が、ＲＮａｓｅＰ遺伝子である、［１９］に記載のキット。
［２３］被検者が、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者である、［１３］～［２２］のいずれかに記載のキット。
［２４］前記ＨＴＬＶ－１関連疾患が、ＨＡＭである、［２３］に記載のキット。
［２５］被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて測定するために用いるプライマー対であって、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーと、からなるプライマー対。
［２６］前記プライマー対が、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーと、からなるプライマー対である、［２５］記載のプライマー対。
［２７］前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかである、［２６］に記載のプライマー対。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
［２８］［２５］～［２７］のいずれかに記載のプライマー対を用いて増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブ。
［２９］前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、［２８］記載のプローブ。
［３０］以下の（１）～（７）からなる群より選ばれる、プライマー対とプローブとのセット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとのセット
［１］被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法であって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定することを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法。
［２］さらに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する、［１］記載の測定方法。
［３］前記ＰＣＲ法を用いる、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対を用いて行われる、［１］又は［２］に記載の測定方法。
［４］プライマー対が、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対である、［３］に記載の測定方法。
［５］前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかである、［４］に記載の測定方法。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
［６］前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子の測定が、さらに、第１のＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて行われる、［３］～［５］のいずれかに記載の測定方法。
［７］前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、［６］記載の測定方法。
［８］前記プライマー対とプローブとの組み合わせが、以下の（１）～（７）のいずれかである、［６］又は［７］に記載の測定方法。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ
［９］さらに、前記検体中の内部標準遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する、［１］～［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１０］前記内部標準遺伝子が、ＲＮａｓｅＰ遺伝子である、［９］に記載の測定方法。
［１１］前記被検者が、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者である、［１］～［１０］のいずれかに記載の測定方法。
［１２］前記ＨＴＬＶ－１関連疾患が、ＨＡＭである、［１１］に記載の測定方法。
［１３］被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて測定するためのキットであって、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬を含むことを特徴とするＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キット。
［１４］さらに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬を含む、［１３］記載のキット。
［１５］前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーとのプライマー対を含む試薬である、［１３］又は［１４］に記載のキット。
［１６］前記プライマー対が、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対である、［１５］に記載のキット。
［１７］前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかである、［１６］に記載のキット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
［１８］前記ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬が、さらに、第１のＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブを含む、［１５］～［１７］のいずれかに記載のキット。
［１９］前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、［１８］に記載のキット。
［２０］前記プライマー対とプローブとの組み合わせが、以下の（１）～（７）のいずれかである、［１８］又は［１９］に記載のキット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとの組み合わせ
［２１］さらに、前記検体中の内部標準遺伝子測定試薬を含む、［１３］～［２０］のいずれかに記載のキット。
［２２］前記内部標準遺伝子が、ＲＮａｓｅＰ遺伝子である、［１９］に記載のキット。
［２３］被検者が、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者である、［１３］～［２２］のいずれかに記載のキット。
［２４］前記ＨＴＬＶ－１関連疾患が、ＨＡＭである、［２３］に記載のキット。
［２５］被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて測定するために用いるプライマー対であって、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの増幅を可能とし、かつ、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第１のＰＣＲプライマーと、１５塩基以上５０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第２のＰＣＲプライマーと、からなるプライマー対。
［２６］前記プライマー対が、配列番号３～配列番号７からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８～配列番号１３からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーと、からなるプライマー対である、［２５］記載のプライマー対。
［２７］前記プライマー対が、以下の（１）～（６）のいずれかである、［２６］に記載のプライマー対。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（２）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対：
（３）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（４）配列番号６で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（５）配列番号７で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対；
（６）配列番号５で示される配列番号からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される配列番号からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対
［２８］［２５］～［２７］のいずれかに記載のプライマー対を用いて増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブ。
［２９］前記プローブが、配列番号１４～配列番号２０からなる群より選ばれる１つの配列番号で示される塩基配列からなるプローブである、［２８］記載のプローブ。
［３０］以下の（１）～（７）からなる群より選ばれる、プライマー対とプローブとのセット。
（１）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１４で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（２）配列番号３で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１５で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（３）配列番号４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号９で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（４）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（５）配列番号６で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１１で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（６）配列番号７で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブとのセット；
（７）配列番号５で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーと、配列番号１３で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーとからなるプライマー対と、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブとのセット
【発明の効果】
【0011】
本発明により、ｐＸ領域のうちｔａｘ遺伝子領域に遺伝子変異がある場合であっても、正確なＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定を可能とする方法及びキット、並びに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを標的として結合するプライマー及びプローブが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＨＴＬＶ－１陽性細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）のゲノムＤＮＡを、第６表に示すＨＢＺ遺伝子を標的として結合するプライマー対（ＨＢＺ１プライマー対～ＨＢＺ７プライマー対）、又は、ｔａｘ遺伝子を標的として結合するプライマー対を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った際の反応曲線を示す。実線は、ｔａｘ遺伝子を標的として結合するプライマー対を用いた際の反応曲線を示し、破線及び一点鎖線は、ＨＢＺ１プライマー対～ＨＢＺ７プライマー対を用いた際の反応曲線を示す。横軸はＰＣＴのサイクル数を、縦軸は正規化された発光強度を表す。また、陰性コントロールとして精製水を、第６表に示すＨＢＺ遺伝子を標的として結合するプライマー対（ＨＢＺ１プライマー対～ＨＢＺ７プライマー対）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った際の反応曲線の結果を二点鎖線で示す。さらに、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｌｉｎｅを点線で示す。
【図2】ＨＡＭ患者ゲノムＤＮＡ２８検体中を用いて、ＨＢＺ５プライマー対を用いたＰＣＲにより算出されたＨＴＬＶ－１プロウイルス量（ｙ軸）と、ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにより算出されＨＴＬＶ－１プロウイルス量（ｘ軸）との相関関係を示す図である。
【図3】ｔａｘ遺伝子内に一塩基変異が存在するＨＡＭ患者由来のゲノムＤＮＡ中の、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにより算出されたＨＴＬＶ－１プロウイルス量、及び、ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにより算出されたＨＴＬＶ－１プロウイルス量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１．ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法
本発明の、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法は、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定することを特徴とする方法である。
本発明の、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法は、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定することを特徴とする方法である。
【0014】
本発明におけるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡとは、ＨＴＬＶ－１のＲＮＡが逆転写酵素により変換されて、ヒトゲノム中に組み込まれたＤＮＡである。
本発明における被検者としては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法を可能とする被検者であれば特に制限はなく、例えばＨＴＬＶ－１感染者、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者等が挙げられ、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者が好ましい。ＨＴＬＶ－１関連疾患としては、例えばＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）等が挙げられる。
本発明における被検者としては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法を可能とする被検者であれば特に制限はなく、例えばＨＴＬＶ－１感染者、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者等が挙げられ、ＨＴＬＶ－１関連疾患患者が好ましい。ＨＴＬＶ－１関連疾患としては、例えばＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）等が挙げられる。
【0015】
本発明における検体としては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡが測定され得る検体であれば特に制限はなく、例えば血液、尿、唾液、乳汁、鼻汁、脳脊髄液、骨髄液、リンパ組織等が挙げられ、血液が好ましい。前記血液としては、例えば全血、血球、血清、血漿等が挙げられ、血球が好ましい。血球としては、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）等が挙げられる。リンパ組織としては、例えば脾臓、胸腺、リンパ節等が挙げられる。
【0016】
本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法は、以下の工程を含む
方法により行うことができる。
（１）被検者から検体を採取し、当該採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した試料に対して、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（３）工程（２）で得られる増幅断片の量を測定する工程。
＜工程（１）＞
工程（１）は、被検者から採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程であり、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）等を用いて調製することができる。被検者より採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。なお、工程（１）において、被検者から採取された検体から調製されるＤＮＡを含有する試料としては、被検者から採取された検体そのものであっても、被検者から採取された検体から抽出されたＤＮＡでもよい。
方法により行うことができる。
（１）被検者から検体を採取し、当該採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した試料に対して、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（３）工程（２）で得られる増幅断片の量を測定する工程。
＜工程（１）＞
工程（１）は、被検者から採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程であり、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）等を用いて調製することができる。被検者より採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。なお、工程（１）において、被検者から採取された検体から調製されるＤＮＡを含有する試料としては、被検者から採取された検体そのものであっても、被検者から採取された検体から抽出されたＤＮＡでもよい。
【0017】
＜工程（２）＞
工程（２）は、工程（１）で調製したＤＮＡを含む試料に対して、本発明に係る前記第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程である。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡが含まれている場合には、ｐＸ領域におけるＨＢＺ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。より具体的には、被検者のゲノムＤＮＡに組み込まれた、プロウイルス化したＨＴＬＶ－１のｐＸ領域におけるＨＢＺ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。
工程（２）は、工程（１）で調製したＤＮＡを含む試料に対して、本発明に係る前記第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程である。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡが含まれている場合には、ｐＸ領域におけるＨＢＺ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。より具体的には、被検者のゲノムＤＮＡに組み込まれた、プロウイルス化したＨＴＬＶ－１のｐＸ領域におけるＨＢＺ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。
【0018】
本発明における第１のＰＣＲプライマーＨＢＺは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第１のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第１のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、例えば配列番号３～７のいずれかで示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
本発明における第２のＰＣＲプライマーＨＢＺは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、例えば配列番号８～１３のいずれかで示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
本発明における、ＰＣＲによるＨＢＺ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対としては、例えば以下の第１表に記載した配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対等が挙げられる。
本発明における第２のＰＣＲプライマーＨＢＺは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号２で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、例えば配列番号８～１３のいずれかで示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
本発明における、ＰＣＲによるＨＢＺ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対としては、例えば以下の第１表に記載した配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対等が挙げられる。
【0019】
【表1】
【0020】
本発明における第１のＰＣＲプライマーＨＢＺ及び第２のＰＣＲプライマーＨＢＺは常法の核酸合成法に従って合成することができる。
【0021】
工程（２）におけるＰＣＲの反応条件は、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定が可能であれば特に制限は無いが、好ましいＰＣＲの条件を以下に例示する。
１）ＰＣＲの反応液に含まれる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺの終濃度は、0.01～10 μmol/Lが好ましく、0.03～3 μmol/Lがより好ましく、0.1～1 μmol/Lが特に好ましい。ＰＣＲの反応液に含まれる第２のＰＣＲプライマーＨＢＺの終濃度は、0.01～10μmol/Lが好ましく、0.03～3μmol/Lがより好ましく、0.1～1μmol/Lが特に好ましい。
２）ＰＣＲの反応液に含まれるゲノムＤＮＡの終濃度は、0.1 ng/μL～1000 ng/μLの範囲内が好ましく、0.4～400 ng/μLの範囲内がより好ましい。
３）ＰＣＲのサイクル数は、20～60回が好ましく、30～60回がより好ましく、40～60回がさらに好ましい。
４）ＰＣＲの変性温度は、90℃～100℃が好ましく、94℃～98℃がより好ましく、95℃程度が特に好ましい。
５）ＰＣＲのアニーリング温度は、55～70℃が好ましく、55～65℃がより好ましく、60℃程度がさらに好ましい。
６）ＰＣＲの伸長反応温度は、70℃～78℃が好ましく、72℃～75℃がより好ましい。ＰＣＲの伸長反応の時間は、20～40秒が好ましく、25～35秒がより好ましい。なお、アニーリングの後に伸長反応を行っても、アニーリングと伸長反応を同時に行ってもよい。
７）ＰＣＲの反応液に含まれるポリメラーゼの終濃度は、0.005 U/μL～0.2U/μLが好ましく、0.015 U/μL～0.15 U/μLがより好ましく、0.025 U/μL～0.1 U/μLが特に好ましい。
８）ＰＣＲの反応液に含まれるdNTPの終濃度は、0.01 mmol/L～1.2 mmol/Lが好ましく、0.05 mmol/L～0.8 mmol/Lがより好ましく、0.1 mmol/L～0.6 mmol/Lが特に好ましい。
９）ＰＣＲの反応液に含まれる塩化マグネシウムの終濃度は、1.0 mmol/L～8.0 mmol/Lが好ましく、1.5 mmol/L～6.0 mmol/Lがより好ましく、2.25 mmol/L～4.5 mmol/Lが特に好ましい。
１）ＰＣＲの反応液に含まれる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺの終濃度は、0.01～10 μmol/Lが好ましく、0.03～3 μmol/Lがより好ましく、0.1～1 μmol/Lが特に好ましい。ＰＣＲの反応液に含まれる第２のＰＣＲプライマーＨＢＺの終濃度は、0.01～10μmol/Lが好ましく、0.03～3μmol/Lがより好ましく、0.1～1μmol/Lが特に好ましい。
２）ＰＣＲの反応液に含まれるゲノムＤＮＡの終濃度は、0.1 ng/μL～1000 ng/μLの範囲内が好ましく、0.4～400 ng/μLの範囲内がより好ましい。
３）ＰＣＲのサイクル数は、20～60回が好ましく、30～60回がより好ましく、40～60回がさらに好ましい。
４）ＰＣＲの変性温度は、90℃～100℃が好ましく、94℃～98℃がより好ましく、95℃程度が特に好ましい。
５）ＰＣＲのアニーリング温度は、55～70℃が好ましく、55～65℃がより好ましく、60℃程度がさらに好ましい。
６）ＰＣＲの伸長反応温度は、70℃～78℃が好ましく、72℃～75℃がより好ましい。ＰＣＲの伸長反応の時間は、20～40秒が好ましく、25～35秒がより好ましい。なお、アニーリングの後に伸長反応を行っても、アニーリングと伸長反応を同時に行ってもよい。
７）ＰＣＲの反応液に含まれるポリメラーゼの終濃度は、0.005 U/μL～0.2U/μLが好ましく、0.015 U/μL～0.15 U/μLがより好ましく、0.025 U/μL～0.1 U/μLが特に好ましい。
８）ＰＣＲの反応液に含まれるdNTPの終濃度は、0.01 mmol/L～1.2 mmol/Lが好ましく、0.05 mmol/L～0.8 mmol/Lがより好ましく、0.1 mmol/L～0.6 mmol/Lが特に好ましい。
９）ＰＣＲの反応液に含まれる塩化マグネシウムの終濃度は、1.0 mmol/L～8.0 mmol/Lが好ましく、1.5 mmol/L～6.0 mmol/Lがより好ましく、2.25 mmol/L～4.5 mmol/Lが特に好ましい。
【0022】
＜工程（３）＞
工程（３）は、工程（２）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定する工程である。ＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、プローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法等が挙げられる。
本発明においては、工程（２）と工程（３）とは同時に行っても、工程（２）の後に工程（３）を行ってもよいが、工程（２）と工程（３）とを同時に行う方が好ましい。工程（２）と工程（３）とを同時に行う場合、リアルタイムＰＣＲを用いることができる。
工程（２）と工程（３）とを同時に行う場合、以下の工程（１ａ）～（３ａ）を行うことにより、工程（２）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ａ）被検者から採取された検体から、ＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（２ａ）工程（１ａ）で調製した試料に対して、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対と、プローブとを用いてＰＣＲを行い、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させる工程；
（３ａ）工程（２ａ）で得られる当該複合体の量を測定する工程。
工程（３）は、工程（２）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定する工程である。ＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、プローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法等が挙げられる。
本発明においては、工程（２）と工程（３）とは同時に行っても、工程（２）の後に工程（３）を行ってもよいが、工程（２）と工程（３）とを同時に行う方が好ましい。工程（２）と工程（３）とを同時に行う場合、リアルタイムＰＣＲを用いることができる。
工程（２）と工程（３）とを同時に行う場合、以下の工程（１ａ）～（３ａ）を行うことにより、工程（２）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ａ）被検者から採取された検体から、ＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（２ａ）工程（１ａ）で調製した試料に対して、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対と、プローブとを用いてＰＣＲを行い、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させる工程；
（３ａ）工程（２ａ）で得られる当該複合体の量を測定する工程。
【0023】
工程（２）の後に工程（３）を行う場合、以下の工程（１ｂ）～（３ｂ）を行うことにより、工程（２）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ｂ）被検者から採取された検体から、ＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（２ｂ）工程（１ｂ）で調製した試料に対して、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（３ｂ）工程（２ｂ）で得られる反応液にプローブを添加し、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させ、当該複合体の量を測定する工程。
ＰＣＲの反応液に含まれる当該プローブの終濃度は、0.005～5 μmol/Lが好ましく、0.01～1 μmol/Lがより好ましく、0.05～0.4 μmol/Lが特に好ましい。
（１ｂ）被検者から採取された検体から、ＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（２ｂ）工程（１ｂ）で調製した試料に対して、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（３ｂ）工程（２ｂ）で得られる反応液にプローブを添加し、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させ、当該複合体の量を測定する工程。
ＰＣＲの反応液に含まれる当該プローブの終濃度は、0.005～5 μmol/Lが好ましく、0.01～1 μmol/Lがより好ましく、0.05～0.4 μmol/Lが特に好ましい。
【0024】
前記プローブとしては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを測定し得るプローブであれば特に制限は無く、例えば、前記第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと前記第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。前記第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと前記第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１４～２０のいずれかで示される塩基配列からなるオリグヌクレオチド等が挙げられる。
前記プローブは、標識物質で修飾されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質、蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせ等が挙げられる。
標識物質で修飾された前記プローブとしては、例えば、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドであるTaqManプローブ（アプライドバイオシステムズ社製）やDual Labeled Probe（シグマアルドリッチ社製）、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅ Ｈとの組み合わせによるサイクリングプローブ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。TaqManプローブやDual Labeled Probeにおける蛍光物質とクエンチャー物質との組み合わせとしては、例えば第２表に記載の組み合わせ等が挙げられる。
前記プローブは、標識物質で修飾されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質、蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせ等が挙げられる。
標識物質で修飾された前記プローブとしては、例えば、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドであるTaqManプローブ（アプライドバイオシステムズ社製）やDual Labeled Probe（シグマアルドリッチ社製）、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅ Ｈとの組み合わせによるサイクリングプローブ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。TaqManプローブやDual Labeled Probeにおける蛍光物質とクエンチャー物質との組み合わせとしては、例えば第２表に記載の組み合わせ等が挙げられる。
【0025】
【表2】
【0026】
ＰＣＲ増幅断片の量を測定する場合は、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を試料として用いて、上記（１）～（３）を行うことにより、予め作成した、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの量とＰＣＲ増幅断片の量との関係を表す検量線と、工程（３）で測定されたＰＣＲ増幅断片の量とから、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの量を決定することができる。
なお、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品として、既知コピー数のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を用いることもできる。既知コピー数のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を用いることにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量、すなわち、一定の細胞数あたりのＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡコピー数を測定することができる。なお、当該一定の細胞数は任意に設定することができ、例えば１～１００００の範囲の細胞数が挙げられる。
リアルタイムＰＣＲを行う場合、「ＰＣＲ増幅断片の量」の代わりに、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ値）を用いることもできる。このＣｔ値は、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表し、この値が小さいほど、試料中のＤＮＡ量が多い。
本発明における、ＰＣＲによるＨＢＺ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対、及び、プローブのセットとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法を可能とするセットであれば特に制限はなく、例えば以下の第３表に記載の配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとプローブとのセット等が挙げられる。
なお、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品として、既知コピー数のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を用いることもできる。既知コピー数のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を用いることにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量、すなわち、一定の細胞数あたりのＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡコピー数を測定することができる。なお、当該一定の細胞数は任意に設定することができ、例えば１～１００００の範囲の細胞数が挙げられる。
リアルタイムＰＣＲを行う場合、「ＰＣＲ増幅断片の量」の代わりに、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ値）を用いることもできる。このＣｔ値は、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表し、この値が小さいほど、試料中のＤＮＡ量が多い。
本発明における、ＰＣＲによるＨＢＺ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対、及び、プローブのセットとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法を可能とするセットであれば特に制限はなく、例えば以下の第３表に記載の配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとプローブとのセット等が挙げられる。
【0027】
【表3】
【0028】
本発明の検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法は、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定すると共に、さらに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する方法を含んでもよい。ＨＢＺ遺伝子と共に、ｔａｘ遺伝子を測定することにより、ｔａｘ遺伝子、ＨＢＺ遺伝子のいずれか一方の遺伝子に変異がある場合でも、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを正確に測定することができる。
ＨＢＺ遺伝子と共に、ｔａｘ遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する方法は、前記工程（１）～（３）と共に、以下の工程（４）及び（５）を含む方法により行うことができる。なお、工程（２）及び工程（３）と工程（４）及び工程（５）は、いずれの順に行ってもよく、工程（２）及び工程（３）の後に工程（４）及び工程（５）を行っても、工程（４）及び工程（５）の後に工程（２）及び工程（３）を行ってもよい。
（４）工程（１）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（５）工程（４）で得られる増幅断片の量を測定する工程。
ＨＢＺ遺伝子と共に、ｔａｘ遺伝子をＰＣＲ法を用いて測定する方法は、前記工程（１）～（３）と共に、以下の工程（４）及び（５）を含む方法により行うことができる。なお、工程（２）及び工程（３）と工程（４）及び工程（５）は、いずれの順に行ってもよく、工程（２）及び工程（３）の後に工程（４）及び工程（５）を行っても、工程（４）及び工程（５）の後に工程（２）及び工程（３）を行ってもよい。
（４）工程（１）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（５）工程（４）で得られる増幅断片の量を測定する工程。
【0029】
＜工程（４）＞
工程（４）は、工程（１）で調製したＤＮＡを含む試料に対して、前記期第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程である。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡが含まれている場合には、ｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。より具体的には、被検者のゲノムＤＮＡに組み込まれた、プロウイルス化したＨＴＬＶ－１のｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。
本発明における第１のＰＣＲプライマーｔａｘは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第２のＰＣＲプライマーｔａｘと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第１のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３０で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第１のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、例えば配列番号２４又は２５示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
本発明における第２のＰＣＲプライマーｔａｘは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第１のＰＣＲプライマーｔａｘと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第２のＰＣＲプライマーｔａｘとしは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第２のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、例えば配列番号２６又は２７で示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
前記第１のＰＣＲプライマーｔａｘ及び第２のＰＣＲプライマーｔａｘは常法の核酸合成法に従って合成することができる。
本発明における、ＰＣＲによるｔａｘ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるＰＣＲプライマー対としては、例えば以下の第４表に記載の配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対等が挙げられる。
工程（４）は、工程（１）で調製したＤＮＡを含む試料に対して、前記期第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程である。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡが含まれている場合には、ｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。より具体的には、被検者のゲノムＤＮＡに組み込まれた、プロウイルス化したＨＴＬＶ－１のｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。
本発明における第１のＰＣＲプライマーｔａｘは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第２のＰＣＲプライマーｔａｘと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第１のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３０で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第１のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、例えば配列番号２４又は２５示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
本発明における第２のＰＣＲプライマーｔａｘは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであって、第１のＰＣＲプライマーｔａｘと共にプライマー対として、ＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定に用いられるプライマーである。本発明における第２のＰＣＲプライマーｔａｘとしは、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーであれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなり、配列番号３１で示される塩基配列における連続する１５以上の塩基を含むプライマーが好ましい。第２のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、例えば配列番号２６又は２７で示される塩基配列からなるプライマー等が挙げられる。
前記第１のＰＣＲプライマーｔａｘ及び第２のＰＣＲプライマーｔａｘは常法の核酸合成法に従って合成することができる。
本発明における、ＰＣＲによるｔａｘ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるＰＣＲプライマー対としては、例えば以下の第４表に記載の配列番号で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対等が挙げられる。
【0030】
【表4】
【0031】
工程（４）におけるＰＣＲの反応条件は、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定を可能とする条件であれば特に制限は無く、例えば前述の条件等が挙げられる。ＰＣＲの反応液に含まれる第１のＰＣＲプライマーｔａｘの終濃度は、0.01～10 μmol/Lが好ましく、0.03～3 μmol/Lがより好ましく、0.1～1 μmol/Lが特に好ましい。また、ＰＣＲの反応液に含まれる第２のＰＣＲプライマーｔａｘの終濃度は、0.01～10 μmol/Lが好ましく、0.03～3 μmol/Lがより好ましく、0.1～1 μmol/Lが特に好ましい。
工程（２）と工程（４）とは別々に行っても、同時に行ってもよいが、同時に行うことが好ましい。
また、工程（２）と工程（４）とは同一容器内で行ってもよいし、別々の容器で行ってもよい。
＜工程（５）＞
工程（５）は、工程（４）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定する工程である。ＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、並びにプローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法等が挙げられる。
本発明においては、工程（４）と工程（５）とは同時に行っても、工程（４）の後に工程（５）を行ってもよいが、工程（４）と工程（５）とを同時に行う方が好ましい。工程（４）と工程（５）とを同時に行う場合、リアルタイムＰＣＲを用いることができる。
工程（４）と工程（５）とを同時に行う場合、以下の工程（１ｃ）、（４ｃ）及び（５ｃ）を行うことにより、工程（４）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ｃ）被検者から検体を採取し、当該採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（４ｃ）工程（１ｃ）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対と、プローブとを用いてＰＣＲを行い、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させる工程；
（５ｃ）工程（４ｃ）で得られる当該複合体の量を測定する工程。
工程（４）の後に工程（５）を行う場合、以下の工程（１ｄ）、（４ｄ）及び（５ｄ）を行うことにより、工程（４）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ｄ）被検者から検体を採取し、当該採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（４ｄ）工程（１ｄ）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（５ｄ）工程（４ｄ）で得られる反応液にプローブを添加し、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させ、当該複合体の量を測定する工程。
ＰＣＲの反応液に含まれる当該プローブの終濃度は、0.005～5 μmol/Lが好ましく、0.01～1 μmol/Lがより好ましく、0.05～0.4 μmol/Lが特に好ましい。
本発明におけるｔａｘ遺伝子測定用プローブとしては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを測定し得るプローブであれば特に制限は無く、例えば、前記第１のＰＣＲプライマーｔａｘと前記第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。前記第１のＰＣＲプライマーｔａｘと前記第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、例えば配列番号２８又は２９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
本発明における、ＰＣＲによるｔａｘ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるＰＣＲプライマー対、及び、プローブのセットとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法を可能とするセットであれば特に制限はなく、例えば以下の第５表に記載の配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとプローブとのセット等が挙げられる。
工程（２）と工程（４）とは別々に行っても、同時に行ってもよいが、同時に行うことが好ましい。
また、工程（２）と工程（４）とは同一容器内で行ってもよいし、別々の容器で行ってもよい。
＜工程（５）＞
工程（５）は、工程（４）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定する工程である。ＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、並びにプローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法等が挙げられる。
本発明においては、工程（４）と工程（５）とは同時に行っても、工程（４）の後に工程（５）を行ってもよいが、工程（４）と工程（５）とを同時に行う方が好ましい。工程（４）と工程（５）とを同時に行う場合、リアルタイムＰＣＲを用いることができる。
工程（４）と工程（５）とを同時に行う場合、以下の工程（１ｃ）、（４ｃ）及び（５ｃ）を行うことにより、工程（４）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ｃ）被検者から検体を採取し、当該採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（４ｃ）工程（１ｃ）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対と、プローブとを用いてＰＣＲを行い、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させる工程；
（５ｃ）工程（４ｃ）で得られる当該複合体の量を測定する工程。
工程（４）の後に工程（５）を行う場合、以下の工程（１ｄ）、（４ｄ）及び（５ｄ）を行うことにより、工程（４）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定することができる。
（１ｄ）被検者から検体を採取し、当該採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程；
（４ｄ）工程（１ｄ）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程；
（５ｄ）工程（４ｄ）で得られる反応液にプローブを添加し、当該増幅断片と当該プローブとからなる複合体を形成させ、当該複合体の量を測定する工程。
ＰＣＲの反応液に含まれる当該プローブの終濃度は、0.005～5 μmol/Lが好ましく、0.01～1 μmol/Lがより好ましく、0.05～0.4 μmol/Lが特に好ましい。
本発明におけるｔａｘ遺伝子測定用プローブとしては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを測定し得るプローブであれば特に制限は無く、例えば、前記第１のＰＣＲプライマーｔａｘと前記第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。前記第１のＰＣＲプライマーｔａｘと前記第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、例えば配列番号２８又は２９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
本発明における、ＰＣＲによるｔａｘ遺伝子の測定に用いられる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるＰＣＲプライマー対、及び、プローブのセットとしては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法を可能とするセットであれば特に制限はなく、例えば以下の第５表に記載の配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとプローブとのセット等が挙げられる。
【0032】
【表5】
【0033】
本発明のプローブは、標識物質で修飾されていてもよい。標識物質としては、例えば前述の標識物質等が挙げられる。
ＰＣＲ増幅断片の量を測定する場合は、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を試料として用いて、上記工程（１）、工程（４）及び工程（５）を行うことにより、予め作成した、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの量とＰＣＲ増幅断片の量との関係を表す検量線と、工程（４）で検出されたＰＣＲ増幅断片の量とから、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの量を決定することができる。
なお、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品として、既知コピー数のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を用いることもできる。リアルタイムＰＣＲを行う場合、「ＰＣＲ増幅断片の量」の代わりに、Ｃｔ値を用いることもできる。このＣｔ値は、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表し、この値が小さいほど、試料中のＤＮＡ量が多い。
ＰＣＲ増幅断片の量を測定する場合は、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を試料として用いて、上記工程（１）、工程（４）及び工程（５）を行うことにより、予め作成した、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの量とＰＣＲ増幅断片の量との関係を表す検量線と、工程（４）で検出されたＰＣＲ増幅断片の量とから、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの量を決定することができる。
なお、既知濃度のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品として、既知コピー数のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを含む標準品を用いることもできる。リアルタイムＰＣＲを行う場合、「ＰＣＲ増幅断片の量」の代わりに、Ｃｔ値を用いることもできる。このＣｔ値は、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表し、この値が小さいほど、試料中のＤＮＡ量が多い。
【0034】
本発明の測定方法において、検体中に含まれる細胞数を定量化して、検体中のゲノムＤＮＡ量を正規化（ノーマライズ）するために、ＨＢＺ遺伝子の代わりに、内部標準遺伝子を用いて工程（１）～工程（３）を行い、内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含んでいてもよい。
上記内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含む本発明の測定方法により、検体中の、一定の細胞数当たりのＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡコピー数、すなわち、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定することができる。本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法には、当該内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含む、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定方法も包含される。なお、当該一定の細胞数は任意に設定することができ、例えば、１～１００００の範囲の細胞数が挙げられる。
内部標準遺伝子の断片を増幅する方法は、工程（１）で調製した試料について、内部標準遺伝子を標的として結合する第１のプライマー内部標準と、内部標準遺伝子を標的として結合する第２のプライマー内部標準とからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより行うことができる。
本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法において、内部標準遺伝子の断片を増幅するＰＣＲは、ｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子のＰＣＲと同一の反応液中で行っても、異なった反応液中で行ってもよいが、同一の反応液中で行うことが好ましい。
また、ＨＢＺ遺伝子と共にｔａｘ遺伝子を用いるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定を行う場合は、上記と同様に、検体中に含まれる細胞数を定量化して、検体中のゲノムＤＮＡ量を正規化（ノーマライズ）するために、ｔａｘ遺伝子の代わりに、内部標準遺伝子を用いて工程（１）、工程（４）及び工程（５）を行い、内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含んでいてもよい。内部標準遺伝子の断片を増幅するＰＣＲは、ｔａｘ遺伝子のＰＣＲと同一の反応液中で行っても、異なった反応液中で行ってもよいが、同一の反応液中で行った方が好ましい。
内部標準遺伝子の断片を増幅するＰＣＲの反応は、前述の、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを増幅するＰＣＲと同一の条件で行うことが好ましい。
内部標準遺伝子としては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定が可能であれば特に制限は無いが、シングルコピーの宿主遺伝子等が挙げられる。シングルコピーの宿主遺伝子としては例えば、ＲＮａｓｅＰ遺伝子等が挙げられる。
ＲＮａｓｅＰ遺伝子を標的として結合する第１のプライマーＲＮａｓｅＰと第２のプライマーＲＮａｓｅＰとからなるプライマー対としては、ＲＮａｓｅＰ遺伝子を標的として結合するプライマー対であれば特に制限はなく、例えば、配列番号２１で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーＲＮａｓｅＰと、配列番号２２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーＲＮａｓｅＰと、からなるプライマー対等が挙げられる。
工程（２）又は工程（４）の増幅工程の方法に従って得られる、内部標準遺伝子のＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、並びにプローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する等が挙げられる。プローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
当該プローブとしては、配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
上記内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含む本発明の測定方法により、検体中の、一定の細胞数当たりのＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡコピー数、すなわち、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定することができる。本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法には、当該内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含む、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定方法も包含される。なお、当該一定の細胞数は任意に設定することができ、例えば、１～１００００の範囲の細胞数が挙げられる。
内部標準遺伝子の断片を増幅する方法は、工程（１）で調製した試料について、内部標準遺伝子を標的として結合する第１のプライマー内部標準と、内部標準遺伝子を標的として結合する第２のプライマー内部標準とからなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより行うことができる。
本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法において、内部標準遺伝子の断片を増幅するＰＣＲは、ｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子のＰＣＲと同一の反応液中で行っても、異なった反応液中で行ってもよいが、同一の反応液中で行うことが好ましい。
また、ＨＢＺ遺伝子と共にｔａｘ遺伝子を用いるＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定を行う場合は、上記と同様に、検体中に含まれる細胞数を定量化して、検体中のゲノムＤＮＡ量を正規化（ノーマライズ）するために、ｔａｘ遺伝子の代わりに、内部標準遺伝子を用いて工程（１）、工程（４）及び工程（５）を行い、内部標準遺伝子の断片を増幅する方法を含んでいてもよい。内部標準遺伝子の断片を増幅するＰＣＲは、ｔａｘ遺伝子のＰＣＲと同一の反応液中で行っても、異なった反応液中で行ってもよいが、同一の反応液中で行った方が好ましい。
内部標準遺伝子の断片を増幅するＰＣＲの反応は、前述の、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを増幅するＰＣＲと同一の条件で行うことが好ましい。
内部標準遺伝子としては、本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定が可能であれば特に制限は無いが、シングルコピーの宿主遺伝子等が挙げられる。シングルコピーの宿主遺伝子としては例えば、ＲＮａｓｅＰ遺伝子等が挙げられる。
ＲＮａｓｅＰ遺伝子を標的として結合する第１のプライマーＲＮａｓｅＰと第２のプライマーＲＮａｓｅＰとからなるプライマー対としては、ＲＮａｓｅＰ遺伝子を標的として結合するプライマー対であれば特に制限はなく、例えば、配列番号２１で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーＲＮａｓｅＰと、配列番号２２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーＲＮａｓｅＰと、からなるプライマー対等が挙げられる。
工程（２）又は工程（４）の増幅工程の方法に従って得られる、内部標準遺伝子のＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、並びにプローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する等が挙げられる。プローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
当該プローブとしては、配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
【0035】
２．検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キット
本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットは、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬を含むことを特徴とするキットであり、本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法に用いることができる。検体としては、例えば前述の検体等が挙げられる。検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬は、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を測定する試薬であって、前述の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定する方法に用いられる試薬である。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬には、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対が含まれている。第１のＰＣＲプライマーＨＢＺ、及び、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、例えば前述の第１のＰＣＲプライマーＨＢＺ、及び、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺ等がそれぞれ挙げられる。第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対としては、例えば前記の第１表に記載した配列番号で示される塩基配列からなるプライマー対等が挙げられる。
ｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬には、さらに、第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが含まれていてもよい。プローブとしては、例えば前述のプローブ等が挙げられる。
第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対と、プローブのセットとしては、例えば前記の第３表に記載した配列番号で示される塩基配列からなるＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとプローブとのセット等が挙げられる。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬に含まれる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬に含まれる第２のＰＣＲプライマーＨＢＺの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬に含まれる前記プローブの濃度は、0.05～50 μmol/Lが好ましく、0.1～10 μmol/Lがより好ましく、0.5～4 μmol/Lが特に好ましい。
本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットは、当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬を含むことを特徴とするキットであり、本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法に用いることができる。検体としては、例えば前述の検体等が挙げられる。検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬は、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を測定する試薬であって、前述の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定する方法に用いられる試薬である。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬には、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、ＨＢＺ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対が含まれている。第１のＰＣＲプライマーＨＢＺ、及び、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとしては、例えば前述の第１のＰＣＲプライマーＨＢＺ、及び、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺ等がそれぞれ挙げられる。第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対としては、例えば前記の第１表に記載した配列番号で示される塩基配列からなるプライマー対等が挙げられる。
ｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬には、さらに、第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと、第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが含まれていてもよい。プローブとしては、例えば前述のプローブ等が挙げられる。
第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対と、プローブのセットとしては、例えば前記の第３表に記載した配列番号で示される塩基配列からなるＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとプローブとのセット等が挙げられる。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬に含まれる第１のＰＣＲプライマーＨＢＺの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬に含まれる第２のＰＣＲプライマーＨＢＺの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬に含まれる前記プローブの濃度は、0.05～50 μmol/Lが好ましく、0.1～10 μmol/Lがより好ましく、0.5～4 μmol/Lが特に好ましい。
【0036】
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットには、ｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬と共に、さらに、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬が含まれていてもよい。当該ｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬は、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を測定する試薬であって、前述の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて測定する方法に用いられる試薬である。ｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬には、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマーｔａｘと、ｔａｘ遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対が含まれている。第１のＰＣＲプライマーｔａｘ、及び、第２のＰＣＲプライマーｔａｘとしては、例えば前述の第１のＰＣＲプライマーｔａｘ、及び、第２のＰＣＲプライマーｔａｘ等がそれぞれ挙げられる。第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対としては、例えば前記の第４表に記載した配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対等が挙げられる。
ｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬には、さらに、第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが含まれていてもよい。プローブとしては、例えば前述のプローブ等が挙げられる。
第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるＰＣＲプライマー対とプローブのセットとしては、例えば前記の第５表に記載された配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとプローブとのセット等が挙げられる。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬に含まれる第１のＰＣＲプライマーｔａｘの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬に含まれる第２のＰＣＲプライマーｔａｘの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬に含まれる前記プローブの濃度は、0.05～50 μmol/Lが好ましく、0.1～10 μmol/Lがより好ましく、0.5～4 μmol/Lが特に好ましい。
ｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬には、さらに、第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが含まれていてもよい。プローブとしては、例えば前述のプローブ等が挙げられる。
第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるＰＣＲプライマー対とプローブのセットとしては、例えば前記の第５表に記載された配列番号で示される第１のＰＣＲプライマーｔａｘと第２のＰＣＲプライマーｔａｘとプローブとのセット等が挙げられる。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬に含まれる第１のＰＣＲプライマーｔａｘの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬に含まれる第２のＰＣＲプライマーｔａｘの濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子測定試薬に含まれる前記プローブの濃度は、0.05～50 μmol/Lが好ましく、0.1～10 μmol/Lがより好ましく、0.5～4 μmol/Lが特に好ましい。
【0037】
本発明における、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットには、さらに、内部標準遺伝子測定試薬が含まれていてよい。内部標準遺伝子としては、例えば前述の内部標準遺伝子等が挙げられる。内部標準遺伝子測定試薬には、内部標準遺伝子を標的として結合する第１のＰＣＲプライマー内部標準と、内部標準遺伝子を標的として結合する第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対が含まれている。第１のＰＣＲプライマー内部標準、及び、第２のＰＣＲプライマー内部標準としては、例えば前述の第１のＰＣＲプライマー内部標準、及び、第２のＰＣＲプライマー内部標準等がそれぞれ挙げられる。第１のＰＣＲプライマー内部標準と第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対としては、例えば前述のプライマー対等が挙げられる。
内部標準遺伝子測定試薬には、さらに、第１のＰＣＲプライマー内部標準、及び、第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが含まれていてもよい。プローブとしては、例えば前述のプローブ等が挙げられる。
第１のＰＣＲプライマー内部標準と第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対とプローブのセットとしては、例えば配列番号２１で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマー内部標準と配列番号２２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対と、配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブとのセット等が挙げられる。
本発明における内部標準遺伝子測定試薬に含まれる第１のＰＣＲプライマー内部標準の濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。本発明における内部標準遺伝子測定試薬に含まれる第２のＰＣＲプライマー内部標準の濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。
本発明における内部標準遺伝子測定試薬に含まれる前記プローブの濃度は、0.05～50 μmol/Lが好ましく、0.1～10 μmol/Lがより好ましく、0.5～4 μmol/Lが特に好ましい。
内部標準遺伝子測定試薬には、さらに、第１のＰＣＲプライマー内部標準、及び、第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対により増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが含まれていてもよい。プローブとしては、例えば前述のプローブ等が挙げられる。
第１のＰＣＲプライマー内部標準と第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対とプローブのセットとしては、例えば配列番号２１で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマー内部標準と配列番号２２で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマー内部標準とからなるプライマー対と、配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブとのセット等が挙げられる。
本発明における内部標準遺伝子測定試薬に含まれる第１のＰＣＲプライマー内部標準の濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。本発明における内部標準遺伝子測定試薬に含まれる第２のＰＣＲプライマー内部標準の濃度は、0.1～100 μmol/Lが好ましく、0. 3～30 μmol/Lがより好ましく、1～10 μmol/Lが特に好ましい。
本発明における内部標準遺伝子測定試薬に含まれる前記プローブの濃度は、0.05～50 μmol/Lが好ましく、0.1～10 μmol/Lがより好ましく、0.5～4 μmol/Lが特に好ましい。
【0038】
本発明の検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットは、前述のＨＢＺ遺伝子測定試薬を含んでいれば、その構成に特に制限はなく、例えば、ＨＢＺ遺伝子測定試薬を含む１試薬系のキット、ＨＢＺ遺伝子測定試薬のうち、第１のＰＣＲプライマーＨＢＺと第２のＰＣＲプライマーＨＢＺとからなるプライマー対を第１試薬に含み、プローブを第２試薬に含む２試薬系のキット等が挙げられる。本発明の検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットが、ｐＸ領域内のＨＢＺ遺伝子測定試薬と、前述のｔａｘ遺伝子測定試薬が含まれている場合も、その構成に特に制限はなく、例えば、第１試薬にＨＢＺ遺伝子測定試薬とｔａｘ遺伝子測定試薬とを含む１試薬系のキット、第１試薬にＨＢＺ遺伝子測定試薬を含み、第２試薬にｔａｘ遺伝子測定試薬を含む２試薬系のキット等が挙げられるが、第１試薬にＨＢＺ遺伝子測定試薬を含み、第２試薬にｔａｘ遺伝子測定試薬を含む２試薬系のキットが好ましい。また、ＨＢＺ遺伝子測定試薬のうちプライマー対を第１試薬、ＨＢＺ遺伝子測定試薬うちプローブを第２試薬に含み、ｔａｘ遺伝子測定試薬を第３試薬に含む３試薬系のセットであっても、ｔａｘ遺伝子測定試薬のうちプライマー対を第１試薬、ｔａｘ遺伝子測定試薬うちプローブを第２試薬に含み、ＨＢＺ遺伝子測定試薬を第３試薬に含む３試薬系のセットや、ＨＢＺ遺伝子測定試薬のうちプライマー対を含む第１試薬、ＨＢＺ遺伝子測定試薬うちプローブを含む第２試薬、ｔａｘ遺伝子測定試薬のうちプライマー対を含む第３試薬、ｔａｘ測定試薬のうちプローブを含む第４試薬からなる４試薬系であってもよい。
また、本発明の検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットが、前述の内部標準遺伝子測定試薬を含んでいる場合も、その構成に特に制限はなく、例えば、ＨＢＺ遺伝子測定試薬を第１試薬含み、内部標準遺伝子を第２試薬に含む２試薬系、ＨＢＺ遺伝子試薬を第１試薬に含み、ｔａｘ遺伝子を第２試薬に含み、内部標準遺伝子を第３試薬に含む３試薬系等が挙げられる。
また、本発明の検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ測定キットが、前述の内部標準遺伝子測定試薬を含んでいる場合も、その構成に特に制限はなく、例えば、ＨＢＺ遺伝子測定試薬を第１試薬含み、内部標準遺伝子を第２試薬に含む２試薬系、ＨＢＺ遺伝子試薬を第１試薬に含み、ｔａｘ遺伝子を第２試薬に含み、内部標準遺伝子を第３試薬に含む３試薬系等が挙げられる。
【0039】
３．本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キットの用途
本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キットは、ＨＴＬＶ－１関連疾患の検査に用いることができる。ＨＴＬＶ－１関連疾患としては、例えばＡＴＬ、ＨＡＭ、ＨＵ等が挙げられる。ＨＴＬＶ－１関連疾患の検査としては、例えば被検者が現在、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性のモニタリング、被検者が将来、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性のモニタリング、被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性のモニタリング等が挙げられる。具体的には、例えば被検者が現在、ＡＴＬを発症している可能性のモニタリング、被検者が将来、ＡＴＬを発症する可能性のモニタリング、被検者が発症しているＡＴＬが治癒する可能性のモニタリング、被検者が現在、ＨＡＭを発症している可能性のモニタリング、被検者が将来、ＨＡＭを発症する可能性のモニタリング、被検者が発症しているＨＡＭが治癒する可能性のモニタリング等が挙げられる。なお、ここでの「治癒」とは、ＨＴＬＶ－１感染細胞が消失することの他、ＡＴＬにおいて症状や検査結果でがんの存在を確認できなくなった状態を示す「寛解」、ＨＡＭにおいて、ＨＡＭの臨床症状（例えば、歩行障害、排尿障害、両下肢の感覚障害等）、検査所見若しくは画像所見が改善することを意味する。
（１）被検者が現在、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性のモニタリング
被検者が現在、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性をモニタリングする方法としては、例えば以下の工程（Ａ１）及び（Ｂ１）を含む方法等が挙げられる。
（Ａ１）被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、経時的に当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する工程。
（Ｂ１）工程（Ａ１）で測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症していないＨＴＬＶ－１の感染者（以下、ＨＴＬＶ－１キャリアと記す）より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量よりも高い量で維持されている場合には該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性は低いと判定する工程。
＜工程（Ａ１）＞
工程（Ａ１）において、被検者より経時的に採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。
工程（Ａ１）において、被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
＜工程（Ｂ１）＞
工程（Ｂ１）は、工程（Ａ１）で得られた、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量よりも高い量で維持されている場合には、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が低いと判定する。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、現在、当該被検者がＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性を判定するための基準値であり、複数のＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、得られた測定値の統計解析により設定することができる。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の検体であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する方法としては、例えば公知の解析方法（Ｓｔｅｅｌ法、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定等)を用いることができる。当該解析により、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量よりも高い量で維持されている場合は、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が高いと判定され、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合は、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性は低いと判定される。
本発明のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キットは、ＨＴＬＶ－１関連疾患の検査に用いることができる。ＨＴＬＶ－１関連疾患としては、例えばＡＴＬ、ＨＡＭ、ＨＵ等が挙げられる。ＨＴＬＶ－１関連疾患の検査としては、例えば被検者が現在、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性のモニタリング、被検者が将来、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性のモニタリング、被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性のモニタリング等が挙げられる。具体的には、例えば被検者が現在、ＡＴＬを発症している可能性のモニタリング、被検者が将来、ＡＴＬを発症する可能性のモニタリング、被検者が発症しているＡＴＬが治癒する可能性のモニタリング、被検者が現在、ＨＡＭを発症している可能性のモニタリング、被検者が将来、ＨＡＭを発症する可能性のモニタリング、被検者が発症しているＨＡＭが治癒する可能性のモニタリング等が挙げられる。なお、ここでの「治癒」とは、ＨＴＬＶ－１感染細胞が消失することの他、ＡＴＬにおいて症状や検査結果でがんの存在を確認できなくなった状態を示す「寛解」、ＨＡＭにおいて、ＨＡＭの臨床症状（例えば、歩行障害、排尿障害、両下肢の感覚障害等）、検査所見若しくは画像所見が改善することを意味する。
（１）被検者が現在、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性のモニタリング
被検者が現在、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性をモニタリングする方法としては、例えば以下の工程（Ａ１）及び（Ｂ１）を含む方法等が挙げられる。
（Ａ１）被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、経時的に当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する工程。
（Ｂ１）工程（Ａ１）で測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症していないＨＴＬＶ－１の感染者（以下、ＨＴＬＶ－１キャリアと記す）より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量よりも高い量で維持されている場合には該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性は低いと判定する工程。
＜工程（Ａ１）＞
工程（Ａ１）において、被検者より経時的に採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。
工程（Ａ１）において、被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
＜工程（Ｂ１）＞
工程（Ｂ１）は、工程（Ａ１）で得られた、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量よりも高い量で維持されている場合には、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が低いと判定する。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、現在、当該被検者がＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性を判定するための基準値であり、複数のＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、得られた測定値の統計解析により設定することができる。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の検体であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する方法としては、例えば公知の解析方法（Ｓｔｅｅｌ法、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定等)を用いることができる。当該解析により、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量よりも高い量で維持されている場合は、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性が高いと判定され、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合は、現在、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症している可能性は低いと判定される。
【0040】
（２）被検者が将来、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性のモニタリング
被検者が将来、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性をモニタリングする方法としては、例えば以下の工程（Ａ２）及び（Ｂ２）を含む方法等が挙げられる。
（Ａ２）被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、経時的に当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する工程。
（Ｂ２）工程（Ａ２）で測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量へ推移している場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が低いと判定する工程。
＜工程（Ａ２）＞
工程（Ａ２）において、被検者より経時的に採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。
工程（Ａ２）において、被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
＜工程（Ｂ２）＞
工程（Ｂ２）は、工程（Ａ２）で得られた、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量へ推移している場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が低いと判定する。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、将来、当該被検者がＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性を判定するための基準値であり、前述の方法により設定することができる。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の検体であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中ＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する方法としては、例えば前述の解析方法を用いることができる。当該解析により、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量へ推移している場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が高いと判定され、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が低いと判定される。
被検者が将来、ＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性をモニタリングする方法としては、例えば以下の工程（Ａ２）及び（Ｂ２）を含む方法等が挙げられる。
（Ａ２）被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、経時的に当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する工程。
（Ｂ２）工程（Ａ２）で測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量へ推移している場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が低いと判定する工程。
＜工程（Ａ２）＞
工程（Ａ２）において、被検者より経時的に採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。
工程（Ａ２）において、被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
＜工程（Ｂ２）＞
工程（Ｂ２）は、工程（Ａ２）で得られた、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量へ推移している場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が高いと判定し、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が低いと判定する。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、将来、当該被検者がＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性を判定するための基準値であり、前述の方法により設定することができる。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の検体であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中ＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する方法としては、例えば前述の解析方法を用いることができる。当該解析により、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量へ推移している場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が高いと判定され、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量で維持されている場合には、将来、当該被検者はＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する可能性が低いと判定される。
【0041】
（３）被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性のモニタリング
被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性をモニタリングする方法としては、例えば以下の工程（Ａ３）及び（Ｂ３）を含む方法等が挙げられる。
（Ａ３）被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、経時的に当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する工程。
（Ｂ３）工程（Ａ３）で測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量から、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量へ推移している場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性が高いと判定し、高い量で維持されている場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性は低いと判定する工程。
＜工程（Ａ３）＞
工程（Ａ３）において、被検者より経時的に採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。
工程（Ａ３）において、被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
＜工程（Ｂ３）＞
工程（Ｂ３）は、工程（Ａ３）で得られた、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量から、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量へ推移している場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性が高いと判定し、高い量で維持されている場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性は低いと判定する。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性を判定するための基準値であり、前述の方法により設定することができる。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の検体であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中ＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する方法としては、例えば前述の解析方法を用いることができる。当該解析により、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量から、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量へ推移している場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性が高いと判定し、高い量で維持されている場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性は低いと判定される。 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性をモニタリングする方法としては、例えば以下の工程（Ａ３）及び（Ｂ３）を含む方法等が挙げられる。
（Ａ３）被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定し、経時的に当該検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する工程。
（Ｂ３）工程（Ａ３）で測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量から、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量へ推移している場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性が高いと判定し、高い量で維持されている場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性は低いと判定する工程。
＜工程（Ａ３）＞
工程（Ａ３）において、被検者より経時的に採取された検体としては、前述の検体が挙げられる。
工程（Ａ３）において、被検者より経時的に採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
＜工程（Ｂ３）＞
工程（Ｂ３）は、工程（Ａ３）で得られた、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量から、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量へ推移している場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性が高いと判定し、高い量で維持されている場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性は低いと判定する。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性を判定するための基準値であり、前述の方法により設定することができる。
ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の検体であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中ＨＴＬＶ－１プロウイルス量とを対比する方法としては、例えば前述の解析方法を用いることができる。当該解析により、被検者より採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と比較して、高い量から、ＨＴＬＶ－１キャリアより採取した検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量と同じか又は低い量へ推移している場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性が高いと判定し、高い量で維持されている場合には、当該被検者が発症しているＨＴＬＶ－１関連疾患が治癒する可能性は低いと判定される。 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【0042】
［実施例１］
〔ＨＴＬＶ－１含有ゲノムＤＮＡでの増幅の確認〕
ＨＴＬＶ－１陽性細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）（ＡＴＣＣ社製）より調製したゲノムＤＮＡを、ＨＴＬＶ－１陰性細胞（ＳＲ細胞）（ＡＴＣＣ社製）より調製したゲノムＤＮＡで希釈したサンプルを準備し、精製水を陰性コントロールとして準備した。それぞれのサンプルを鋳型として、第６表に記載した配列番号で示される、ＨＢＺ遺伝子を増幅するプライマー対（ＨＢＺ１プライマー対～ＨＢＺ７プライマー対）と、各プライマー対に対応するよう設計された、第６表に記載した配列番号で示されるプローブより調製された各Dual Labeled Probe（シグマアルドリッチ社製）とのセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。また、ｔａｘ遺伝子を増幅する、配列番号２４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと配列番号２６で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対（以下、ｔａｘプライマー対という）と、配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブを用いて設計したDual Labeled Probeとのセットを用いて上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行い、ＨＢＺプライマー対の反応性とｔａｘプライマー対の反応性とを比較した。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ量１．０μｇ／ｔｅｓｔ、ＰＣＲ反応液２５μＬで、ＰＣＲ装置Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ＭＤｘ ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（キアゲン社製）を用いて、９５℃ ３０秒の後、９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒のＰＣＲサーマルサイクルを５０サイクル行った。それぞれのプライマー対を用いるＰＣＲについて、２回ずつＰＣＲを行った。その結果を、図１に示す。ＴＬ－Ｏｍ１由来のＤＮＡを鋳型として標的配列を増幅した結果、すべてのＨＢＺプライマー対において、Ｃｔ値を得て、陽性となったが、一方、陰性コントロールでは、全ての反応で陰性であった。その中でも、ＨＢＺ５プライマー対がｔａｘプライマーとＣｔ値の差が最も小さく、反応性が近かったため、以下の実施例では、ＨＢＺ５のプライマー対と対応のDual Labeled Probeプローブとのセットを使用した。
〔ＨＴＬＶ－１含有ゲノムＤＮＡでの増幅の確認〕
ＨＴＬＶ－１陽性細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）（ＡＴＣＣ社製）より調製したゲノムＤＮＡを、ＨＴＬＶ－１陰性細胞（ＳＲ細胞）（ＡＴＣＣ社製）より調製したゲノムＤＮＡで希釈したサンプルを準備し、精製水を陰性コントロールとして準備した。それぞれのサンプルを鋳型として、第６表に記載した配列番号で示される、ＨＢＺ遺伝子を増幅するプライマー対（ＨＢＺ１プライマー対～ＨＢＺ７プライマー対）と、各プライマー対に対応するよう設計された、第６表に記載した配列番号で示されるプローブより調製された各Dual Labeled Probe（シグマアルドリッチ社製）とのセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。また、ｔａｘ遺伝子を増幅する、配列番号２４で示される塩基配列からなる第１のＰＣＲプライマーｔａｘと配列番号２６で示される塩基配列からなる第２のＰＣＲプライマーｔａｘとからなるプライマー対（以下、ｔａｘプライマー対という）と、配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブを用いて設計したDual Labeled Probeとのセットを用いて上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行い、ＨＢＺプライマー対の反応性とｔａｘプライマー対の反応性とを比較した。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ量１．０μｇ／ｔｅｓｔ、ＰＣＲ反応液２５μＬで、ＰＣＲ装置Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ＭＤｘ ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（キアゲン社製）を用いて、９５℃ ３０秒の後、９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒のＰＣＲサーマルサイクルを５０サイクル行った。それぞれのプライマー対を用いるＰＣＲについて、２回ずつＰＣＲを行った。その結果を、図１に示す。ＴＬ－Ｏｍ１由来のＤＮＡを鋳型として標的配列を増幅した結果、すべてのＨＢＺプライマー対において、Ｃｔ値を得て、陽性となったが、一方、陰性コントロールでは、全ての反応で陰性であった。その中でも、ＨＢＺ５プライマー対がｔａｘプライマーとＣｔ値の差が最も小さく、反応性が近かったため、以下の実施例では、ＨＢＺ５のプライマー対と対応のDual Labeled Probeプローブとのセットを使用した。
【0043】
【表6】
【0044】
［実施例２］
〔ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量との相関〕
ＨＢＺプライマー対の妥当性を評価するために、前記ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、前記ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量と相関しているか否かを検討した。
被検体細胞数定量用として、ＲＮａｓｅＰのプライマー対及び、そのプライマー対に対応するよう設計された各Dual Labeled Probe（シグマアルドリッチ社製）を使用し、ＨＡＭ患者ゲノムＤＮＡ２８検体（５０ ｎｇ／ｔｅｓｔ）（以下、ＨＡＭ検体という）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１に記載した条件と同じ条件の下で行った。各ＨＡＭ検体について、ＨＢＺプライマー対及びｔａｘプライマー対のそれぞれのプライマー対を用いるＰＣＲにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡコピー数を測定し、また、ＲＮａｓｅＰプライマーを用いるＰＣＲにより被検体細胞数を測定し、各ＨＡＭ検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を、ＨＢＺプライマー対及びｔａｘプライマー対それぞれのプライマー対に対して算出し、相関性を評価した。その結果を図２に示す。図２に示したように、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定と、ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定との相関における相関係数の平方（Ｒ２）は、０．９５６５であり、両プライマー対を用いるＰＣＲによる測定間で良好な相関が認められた。この結果から、ＨＢＺ遺伝子を、ＨＢＺプライマー対を用いるＰＣＲ法により測定することにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量を正確に測定できることが判明した。なお、本法におけるＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、以下の式によって算出した。
〔ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量と、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量との相関〕
ＨＢＺプライマー対の妥当性を評価するために、前記ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量が、前記ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにより測定したＨＴＬＶ－１プロウイルス量と相関しているか否かを検討した。
被検体細胞数定量用として、ＲＮａｓｅＰのプライマー対及び、そのプライマー対に対応するよう設計された各Dual Labeled Probe（シグマアルドリッチ社製）を使用し、ＨＡＭ患者ゲノムＤＮＡ２８検体（５０ ｎｇ／ｔｅｓｔ）（以下、ＨＡＭ検体という）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１に記載した条件と同じ条件の下で行った。各ＨＡＭ検体について、ＨＢＺプライマー対及びｔａｘプライマー対のそれぞれのプライマー対を用いるＰＣＲにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡコピー数を測定し、また、ＲＮａｓｅＰプライマーを用いるＰＣＲにより被検体細胞数を測定し、各ＨＡＭ検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルス量を、ＨＢＺプライマー対及びｔａｘプライマー対それぞれのプライマー対に対して算出し、相関性を評価した。その結果を図２に示す。図２に示したように、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定と、ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲによるＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定との相関における相関係数の平方（Ｒ２）は、０．９５６５であり、両プライマー対を用いるＰＣＲによる測定間で良好な相関が認められた。この結果から、ＨＢＺ遺伝子を、ＨＢＺプライマー対を用いるＰＣＲ法により測定することにより、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量を正確に測定できることが判明した。なお、本法におけるＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、以下の式によって算出した。
【0045】
【数1】
【0046】
［実施例３］
〔変異検体の検出〕
ｔａｘ遺伝子内に一塩基変異が確認された、ＨＡＭ患者より採取された検体を対象とし、ＨＢＺ５プライマー対又は前記ｔａｘプライマー対のそれぞれのプライマー対を用いて、実施例１に記載した条件と同様の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。その結果を図３に示す。図３に示したように、当該ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにおいては、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量が極めて低く、ＰＣＲでの増幅反応が進行しなかったのに対して、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにおいては、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量は高く、ＰＣＲでの増幅反応が正常に進行した。この結果から、本発明のＨＢＺプライマー対を用いるＰＣＲにより、ｔａｘ遺伝子に変異のある検体に対しても正確にＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定できることが判明した。
〔変異検体の検出〕
ｔａｘ遺伝子内に一塩基変異が確認された、ＨＡＭ患者より採取された検体を対象とし、ＨＢＺ５プライマー対又は前記ｔａｘプライマー対のそれぞれのプライマー対を用いて、実施例１に記載した条件と同様の条件でリアルタイムＰＣＲを行った。その結果を図３に示す。図３に示したように、当該ｔａｘプライマー対を用いたＰＣＲにおいては、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量が極めて低く、ＰＣＲでの増幅反応が進行しなかったのに対して、ＨＢＺプライマー対を用いたＰＣＲにおいては、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量は高く、ＰＣＲでの増幅反応が正常に進行した。この結果から、本発明のＨＢＺプライマー対を用いるＰＣＲにより、ｔａｘ遺伝子に変異のある検体に対しても正確にＨＴＬＶ－１プロウイルス量を測定できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【0047】
本発明の、検体中のＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡの測定方法及び測定キット、並びに、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡを標的として結合するプローブ及びプライマーは、臨床診断において有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】