特許 7182816 ＨＡＰＬＮ１を含む脱毛の予防用または治療用の組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-25

(45)【発行日】2022-12-05

(54)【発明の名称】ＨＡＰＬＮ１を含む脱毛の予防用または治療用の組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20221128BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20221128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221128BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20221128BHJP

   A61Q 7/00 20060101ALI20221128BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

A61P17/14

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61K8/64

A61Q7/00

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021563100

(86)(22)【出願日】2020-04-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-27

(86)【国際出願番号】 KR2020005703

(87)【国際公開番号】W WO2020222538

(87)【国際公開日】2020-11-05

【審査請求日】2021-10-22

(31)【優先権主張番号】10-2019-0050698

(32)【優先日】2019-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0051429

(32)【優先日】2020-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】519321708

【氏名又は名称】ハプルサイエンス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】テ・キョン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ヘ・チャン・ハ

(72)【発明者】

【氏名】ジ・ミン・ジャン

(72)【発明者】

【氏名】イン・チュル・シン

(72)【発明者】

【氏名】ムン・ジュン・バク

(72)【発明者】

【氏名】ダン・ジョウ

【審査官】松本 淳

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１２８６３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１１２０１９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒアルロン酸及びプロテオグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein １）を有効成分として含む、脱毛の予防用または治療用の薬学組成物。

【請求項2】

前記ＨＡＰＬＮ１は、不正規（non－canonical）信号伝逹経路を活性化させ、前記不正規信号伝逹経路は、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＲａｓ－ＥＲＫ１／２信号伝逹経路であることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項3】

前記ＨＡＰＬＮ１は、毛母細胞（hair germinal matrix cell）の増殖を促進させ、毛髪を成長させることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項4】

前記脱毛は、男性型脱毛、女性型脱毛、円形脱毛または休止期性脱毛であることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。

【請求項5】

ヒアルロン酸及びプロテオグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein １）を有効成分として含む、脱毛の予防用または改善用の化粧料組成物。

【請求項6】

前記ＨＡＰＬＮ１は、不正規（non－canonical）信号伝逹経路を活性化させ、前記不正規信号伝逹経路は、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＲａｓ－ＥＲＫ１／２信号伝逹経路であることを特徴とする請求項５に記載の化粧料組成物。

【請求項7】

前記ＨＡＰＬＮ１は、毛母細胞（hair germinal matrix cell）の増殖を促進させ、毛髪を成長させることを特徴とする請求項５に記載の化粧料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒアルロン酸及びプロテオグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein）を有効成分として含む、脱毛の予防用または治療用の薬学組成物に係り、該ＨＡＰＬＮ１蛋白質は、投与時、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＥＲＫ１／２信号伝逹経路（すなわち、不正規（non-canonical）信号伝逹経路）を介し、毛母細胞の増殖を促進させることにより、毛髪を成長させる。

【背景技術】

【0002】

全世界的に、約３，５００万人の男性と、２，５００万名の女性とが脱毛で苦痛を受けており、毎年、脱毛患者の数は、増加している。毛髪は、外貌、断熱、頭皮保護、摩擦緩衝のようなさまざまな機能を有する。そのうちでも、毛髪は、特に、自尊感、社会性と直接関連するので、審美的な理由により、多くの人々は、毛髪管理に多大な関心を抱いている。

【0003】

人間の頭髪は、約１００，０００本の個別毛髪の集合体であり、それぞれの毛髪は、毛嚢（hair follicle）によって生成される。毛嚢は、毛嚢自体、上皮及び皮脂腺を再構成するのに必要な全ての細胞株を生成することができる幹細胞の保存所の役割を行う。毛嚢は、毛乳頭細胞（dermal papilla cell）、毛母細胞（hair germinal matrix cell）、毛嚢細胞の外壁・内壁（outer layer, inner layer）、突出部（bulge）などによって構成されている（図１）。

【0004】

毛髪は、成長期（anagen）、退化期（catagen）、休止期（telogen）の成長周期を反復する（図２）。該成長期は、通常、３年間ないし５年間持続され、毛乳頭細胞と毛母細胞とが発達しながら、毛母細胞のケラチノサイト（keratinocyte）が増殖、角質化され、毛髪が成長する段階である。該退化期は、１０日間ないし１４日間持続され、全般的な毛嚢細胞の細胞死滅（apoptosis）が起こりながら、毛嚢が縮小される段階である。該休止期は、３ヵ月から４ヶ月間の間ほど維持され、毛髪生成が中断された時期であり、毛嚢全体に、新たな細胞を供給し、次の成長期を準備する段階である。

【0005】

毛髪成長周期に関与する信号伝逹経路としては、Ｗｎｔ、Ｓｈｈ、ＪＡＫ、ＴＧＦβ／ＢＭＰ、テストステロン（testosterone）などが関与する信号伝逹経路がある。そのうち、Ｗｎｔ，Ｓｈｈ，ＪＡＫ信号伝逹経路は、休止期末期に活性化され、成長期への進入を促進させる。

【0006】

そのように、人間の毛髪は、一定毛周期（hair growth cycle）を有しているために、常時一定毛髪数を維持することになる。しかしながら、脱毛が進行されれば、毛根に存在する乳頭が小さくなり、毛乳頭が小さくなれば、頭髪の太さも細くなり、同時に、毛周期も短くなり、新たに育ってきた毛は、さらに細くなってしまう。従って、脱毛が進行されれば、頭髪は、綿毛に変わり、毛周期は、さらに短くなり、若干育った後、抜けてしまう。
脱毛は、大きく見て、男性型脱毛（male-pattern hair loss）、女性型脱毛（female-pattern hair loss）、円形脱毛（alopecia areata）、休止期性脱毛（telogen effluvium）の４種タイプに分けられる。男性型脱毛の原因は、遺伝的な原因が大きく位置しており、５α－還元酵素（５α－reductase）と係わっている。５α－還元酵素は、男性ホルモンのテストステロン（testosterone）を５α－ＤＨＴ（dihydrotestosterone）に変換させ、ＤＨＴは、毛嚢を縮小させて脱毛が誘発される。女性型脱毛の主な原因としては、出産または閉経によるホルモンの均衡の取れていない分泌を挙げることができる。それ以外に、社会生活の精神的ストレス、大気汚染露出、加工食品の摂取、高熱による重病、栄養の不均衡、抗癌剤及び抗甲状腺剤の服用、経口避姙薬の投与、シャンプー、強い紫外線下や運動中に流す汗、食習慣、心理的圧迫感のような多様な習慣及び環境も、脱毛の主犯と知られている。

【0007】

現在、韓国内において最も頻繁に使用される脱毛治療剤としては、フィナステリド（finasteride；商品名プロペシア（Propecia（登録商標）））、デュタステリド（dutasteride；商品名アボダート（Avodart（登録商標）））、ミノキシジル（minoxidil；商品名マイノクシル（登録商標）またはロゲイン（Rogaine（登録商標）））などがある。フィナステリドとデュタステリドは、５α－還元酵素抑制剤（５α－reductase inhibitor）であり、男性ホルモン（testosterone）が、５α－ＤＨＴ（dihydrotestosterone）に転換されることを抑制する。しかしながら、該製品は、性欲減退、勃起不全、運転能及び遂行能の喪失などの副作用を示す。一方、ミノキシジルの場合、これまでのところ、そのメカニズムが完壁に明らかにされていないが、細胞膜を過分極（hyperpolarization）させるカリウムチャネル開放剤（potassium channel opener）であり、血管拡張及びカリウムチャネル開放を介し、毛嚢に、酸素、血液、栄養素などの供給を増大させ、毛嚢を健康にさせると見られる。しかしながら、該製品も、塗布部位のかゆみ、紅斑、皮膚刺激、目の刺激などの副作用が示され、頭以外に、身体部位においても、所望しない毛髪の成長が観察されたりする。そのような既存製品の副作用は、患者の不安感を増幅させ、はなはだしい場合、投与拒否にまでつながってしまうために、副作用が少ない薬物を開発しようとする努力が続けられている。

【0008】

ヒアルロン酸及びプロテオグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein １）は、基質（cartilagｅ）で発見される細胞外基質蛋白質である。該蛋白質は、ヒアルロン酸とプロテオグリカンとの凝集体を安定化させる役割を行い、細胞間結合に関与すると報告されている。

【0009】

最近報告された研究として、米国特許公開公報第２０１２／０１２８６３２号においては、毛嚢形成を誘導することができる毛乳頭細胞（dermal papilla cell）及び毛根鞘細胞（dermal sheath cell）のような発毛性皮膚細胞（trichogenic dermal cell）を同定する方法を提示しながら、発毛性皮膚細胞を検出して同定するのに使用されうるバイオマーカー（biomarker）のうち一つとして、ＨＡＰＬＮ１を提示している。また、米国特許登録公報第８，３３４，１３６号においては、毛乳頭細胞において、細胞接着（cell adhesion）に関与する２０個余りの遺伝子を並べ、前記遺伝子の発現を維持または増大させ、毛嚢形成を促進させることができる可能性を言及するが、前記２０個の遺伝子のうち一つとして、ＨＡＰＬＮ１を開示するだけであり、また、それら遺伝子の発現により、実際に毛嚢形成が促進されるか否かということを確認した結果を全く開示していない。

【0010】

従って、前述の文献は、ただ、毛乳頭細胞または毛根鞘細胞を同定するか、あるいは他の細胞と区別するためのバイオマーカーのうち一つとして、ＨＡＰＬＮ１を言及しているだけであり、ＨＡＰＬＮ１蛋白質を、直接有効成分として投与するとき、脱毛を予防または治療する効果を示すという点については、全く言及されていない。さらには、毛髪成長周期に関与する多くの経路のうち、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＥＲＫ１／２信号伝逹経路の活性化が脱毛治療に効果的であり、特に、ＨＡＰＬＮ１が、毛母細胞（germinal matrix cell）に作用し、前述の経路を活性化させることにより、発毛を促進させるという点については、現在まで全く研究されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】米国特許公開公報第２０１２／０１２８６３２号

【文献】米国特許登録公報第８，３３４，１３６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、深刻な副作用が伴う既存の脱毛治療剤と比較し、脱毛治療の効果にすぐれながらも、副作用が少ない脱毛の予防用または治療用の薬学組成物を提供することを目的とする。

【0013】

本発明は、既存の脱毛治療剤で使用される作用メカニズムとは異なる作用メカニズムを介し、脱毛の予防効果または治療効果を示す薬学組成物を提供することを目的とする。

【0014】

本発明は、毛母細胞の増殖を促進させ、毛髪を成長させる薬学組成物を提供することを目的とする。毛髪は、成長期、退化期、休止期を反復するが、そのうち成長期は、毛母細胞が活発に分化し、毛髪を生成する段階であり、該段階において、毛髪の太さと長さとが決定される。成長期は、脱毛治療において最も核心的段階であるために、毛嚢の成長期入り込みを促進させたり、成長期の毛母細胞増殖の一助としたりする治療剤を開発すること重要である。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は、ＨＡＰＬＮ１を有効成分として含む、脱毛の予防用または治療用の薬学組成物を提供する。

【0016】

本発明は、またＨＡＰＬＮ１を有効成分として含む、脱毛の予防用または改善用の化粧料組成物を提供する。

【0017】

一実施様態において、前記ＨＡＰＬＮ１は、不正規（non-canonical）信号伝逹経路を活性化させ、ここで、該不正規（non-canonical）信号伝逹経路は、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＥＲＫ１／２信号伝逹経路である。それにより、本発明のＨＡＰＬＮ１は、毛母細胞（hair germinal matrix cell）の増殖を促進させ、毛髪を成長させる。

【0018】

一実施様態において、本発明の薬学組成物は、男性型脱毛、女性型脱毛、円形脱毛または休止期性脱毛の予防用または治療用でもある。また、前記脱毛は、毛母細胞（hair germinal matrix cell）において、ＨＡＰＬＮ１蛋白質の発現が低減されたものでもある。

【0019】

一実施様態において、本発明の薬学組成物は、単独、または他の治療剤と共に組み合わせて使用される。

【発明の効果】

【0020】

本発明の薬学組成物は、有効成分として、細胞外基質を構成する体内蛋白質であるＨＡＰＬＮ１を有効成分として含むので、既存の脱毛治療剤より副作用が少ない。

【0021】

また、本発明の薬学組成物に有効成分として含まれたＨＡＰＬＮ１は、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＥＲＫ１／２信号伝逹経路、すなわち、不正規（non-canonical）信号伝逹経路を活性化させ、毛母細胞の増殖を介し、毛髪を成長させる。そのような作用メカニズムは、既存の脱毛治療剤で使用される作用メカニズムとは全く異なる方式であり、現在まで知られていない。それにより、ＨＡＰＬＮ１は、新たな概念の脱毛治療剤として使用され、今後の脱毛研究に画期的な戦略、及び新たな方向を提示することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】毛嚢の構造を示す模式図である。

【図2】毛髪成長周期を示す模式図である。

【図3】ＨＡＰＬＮ１の毛母細胞増殖及び毛髪成長促進のメカニズムを示す模式図である。

【図4】成長期（anagen）、退化期（catagen）、休止期（telogen）のそれぞれの毛髪成長周期において、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＨＡＰＬＮ１ ｍＲＮＡの発現程度を示す。

【図5】成長期（anagen）、退化期（catagen）、休止期（telogen）のそれぞれの毛髪成長周期において、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＨＡＰＬＮ１ ｍＲＮＡの発現程度を示す。

【図6】ヒト毛母細胞において、ＨＡＰＬＮ１によるＴβＲII蛋白質増加を確認した結果を示す。

【図7】ヒト毛母細胞において、ＨＡＰＬＮ１及び／またはヒアルロン酸（ＨＡ）によるＴβＲII蛋白質増加を確認した結果を示す。

【図8】ヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度に対する内因性ＨＡＰＬＮ１欠乏効果確認した結果を示す。

【図9】内因性ＨＡＰＬＮ１が欠乏したヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度に対する外因性ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した結果を示す。

【図10】内因性ＨＡが欠乏したヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度及びＨＡＳ２蛋白質濃度に対する外因性ＨＡＰＬＮ１の効果を確認した結果を示す。

【図11】ヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度に対するＣＤ４４欠乏の効果を確認した結果を示す。

【図12】ＣＤ４４が欠乏したヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度に対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した結果を示す。

【図13】細胞膜ＴβＲII蛋白質濃度に対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した結果を示す。

【図14】ヒト毛母細胞において、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－Ｓｍａｄ２、ｐ－ＭＥＫ１／２、ｐ－ｃ－Ｒａｆに対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した結果を示す。

【図15】ヒト毛母細胞において、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－Ｓｍａｄ２、ｐ－ＭＥＫ１／２、ｐ－ｃ－Ｒａｆに対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した結果を示す。

【図16】ヒト毛母細胞において、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－Ｓｍａｄ２、ｐ－ＭＥＫ１／２、ｐ－ｃ－Ｒａｆに対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した結果を示す。

【図17】ＴＧＦ－β２存在時、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡで処理した群において、細胞増殖が促進されたところを確認した結果を示す。

【図18】各毛髪成長周期において、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＴβＲII蛋白質の発現を確認した結果を示す。

【図19】マウスの毛髪成長に対するＨＡＰＬＮ１の腹腔全身投与の効果を確認するための実験スケジュール及びその結果を示す。

【図20】マウスの毛髪成長に対するＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡの腹腔全身投与の効果を確認するための実験スケジュール及びその結果を示す。

【図21】ヒト毛乳頭細胞に、ＨＡＰＬＮ１蛋白質、ＣＸ３ＣＬ１蛋白質、ＣＤＯＮ蛋白質またはミノキシジルで処理した場合、細胞増殖を確認した結果を示す。

【図22】ヒト毛母細胞に、ＨＡＰＬＮ１蛋白質、ＣＸ３ＣＬ１蛋白質またはＣＤＯＮ蛋白質で処理した場合細胞増殖を確認した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、添付図面を参照し、本発明が属する技術分野において当業者であるならば、容易に実施することができるように、本願の実施様態及び実施例について詳細に説明する。しかし、本願は、さまざまな形態にも具現され、ここで説明する実施様態及び実施例に限定されるものではない。

【0024】

本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、それは、特別に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいということを意味する。

【0025】

本発明は、ＨＡＰＬＮ１（hyaluronan and proteoglycan link protein）を有効成分として含む、脱毛の予防用または治療用の薬学組成物に関する。一実施様態において、本発明は、有効量のＨＡＰＬＮ１蛋白質を、脱毛の予防または治療を必要とする対象体に投与することを含む、前記対象体において、脱毛を予防または治療する方法を提供する。他の実施様態において、本発明は、脱毛の予防または治療のためのＨＡＰＬＮ１蛋白質の用途を提供する。

【0026】

ＨＡＰＬＮ１は、体内存在の蛋白質であり、従来、脱毛治療関連研究においては、特定細胞を同定したり、それを他の細胞と区別したりするためのバイオマーカーとして使用された。本発明のＨＡＰＬＮ１蛋白質は、直接有効成分として使用される場合、深刻な副作用を伴う既存の脱毛治療剤と比較し、相対的に副作用が少なく、すぐれた脱毛の予防効果または治療効果を示す。

【0027】

特に、本発明のＨＡＰＬＮ１蛋白質は、直接有効成分として使用される場合、既存の脱毛治療剤とは全く異なる方式で毛髪成長を促進させる。具体的には、本発明のＨＡＰＬＮ１蛋白質は、不正規（non－canonical）信号伝逹経路を活性化させ、このとき、不正規（non－canonical）信号伝逹経路は、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＥＲＫ１／２信号伝逹経路である。それを介し、ＨＡＰＬＮ１は、毛母細胞（hair germinal matrix cell）の増殖を促進させて毛髪を成長させ、脱毛の予防効果または治療効果を示す。

【0028】

本発明で最初に明らかにされたＨＡＰＬＮ１蛋白質の不正規（non－canonical）信号伝逹経路活性化につき、具体的に説明すれば、次の通りである。

【0029】

ＴＧＦ－β信号伝逹メカニズムと係わり、毛母細胞が、ＴＧＦ－βによって刺激を受ければ、該ＴＧＦ－βは、毛母細胞のＴβＲII（ＴＧＦ－β receptor ２）と結合する。その後、該ＴβＲIIは、ＴβＲI（ＴＧＦ－β receptor １）と結合し、ＴβＲ複合体（ＴβＲ complex）を形成する。該ＴβＲ複合体は、エンドサイトーシス作用により、細胞内に入ることになるが、クラスリン（clathrin）によるエンドサイトーシス作用時、Ｓｍａｄ２／３信号伝逹を介し、細胞周期が遮断される（cell cycle arrest）。該経路は、正規的信号伝逹経路（canonical pathway）である。一方、カベオリン（caveolin）－１によるエンドサイトーシス作用時、Ｓｍａｄ７信号伝逹を介し、ＴβＲIとＴβＲIIは、最終的に分解される。そのような過程においても、ＴＧＦ－β信号伝逹経路が作動するが、正規のＳｍａｄメカニズム（canonical Ｓｍａｄ pathway）とは別個に、不正規経路（non－canonical pathway）のＲａｓ－ＥＲＫ１／２メカニズムが存在するが、そのようなＲａｓ－ＥＲＫ１／２信号伝逹が活性化される場合に示される結果は、細胞増殖である。

【0030】

本発明においては、ＨＡＰＬＮ１が、ＴＧＦ－β信号伝逹メカニズムにおいて、Ｒａｓ－ＥＲＫ１／２経路、すなわち、不正規経路（non－canonical pathway）を活性化させるという事実を最初に明らかにした（図３）。具体的なメカニズムについて述べれば、ヒアルロン酸（ＨＡ：hyaluronic acid）は、細胞のヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２：hyaluronan synthase ２）によって生成される。ＨＡは、細胞膜のＣＤ４４（ＨＡの受容体）と結合し、該ＣＤ４４は、ＴβＲと結合する。すなわち、ＨＡは、ＴβＲと間接的に結合されている。ＨＡのエンドサイトーシス作用が起こるためには、ヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬ２：hyaluronidase）のＨＡ分解が必須である。ＨＡＰＬＮ１は、ＨＡとプロテオグリカンとを連結させ、ＨＡの安定化を誘導する。ＨＡＰＬＮ１は、ＨＡをプロテオグリカンで隙間なく覆い包み、ＨＹＡＬ２がＨＡを分解させることを抑制するか、あるいは活性酸素（ＲＯＳ：reactive oxygen species）によるＨＡ分解を抑制する。その結果、ＨＡＰＬＮ１は、ＴβＲのエンドサイトーシス作用を抑制し、Ｓｍａｄ２／３メカニズム活性、及びＴβＲの分解を防ぎ、細胞膜のＴβＲIIを増加させる。それにより、ＨＡＰＬＮ１により、不正規（non－canonical）信号伝逹経路、すなわち、Ｒａｓ－ＥＲＫ１／２メカニズムが活性化され、細胞増殖が促進され、結局、毛髪成長につながる。

【0031】

従って、本発明のＨＡＰＬＮ１蛋白質は、ＴＧＦ－β蛋白質で活性化されるＲａｓ－ＥＲＫ１／２信号伝逹を介し、細胞増殖を促進させ、脱毛の予防または治療のために使用されうる。特に、本発明のＨＡＰＬＮ１蛋白質は、毛母細胞（hair germinal matrix cell）の増殖を促進させ、毛髪を成長させる。

【0032】

本発明の「脱毛」とは、その原因と係わりなく、正常に毛髪が存在しなければならない部位に毛髪がない状態を称し、例えば、男性型脱毛、女性型脱毛、円形脱毛または休止期性脱毛でもある。

【0033】

さらに他の実施様態において、本発明は、ＨＡＰＬＮ１を有効成分として含む、脱毛の予防用または改善用の化粧料組成物を提供する。前記化粧料組成物としては、例えば、毛髪用化粧料でもあり、その剤形は、特別に制限されるものではなく、目的とするところにより、適切に選択されうる。

【0034】

例えば、前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどにも剤形化されるが、それらに限定されるものではない。さらに詳細には、シャンプー・リンス・ボディークレンザのような洗浄料、ヘアトニック・ゲルまたはムースのような整髪剤、養毛剤または染毛剤のような毛髪用化粧料の組成物でもある。

【0035】

本発明の一実施様態において、前記化粧料組成物は、必要により、適切な各種の基剤と添加剤とを含んでもよく、それら成分の種類と量は、発明者によって容易に選定されうる。必要により、許容可能な添加剤を含んでもよく、例えば、当業界に一般的な防腐剤、色素、添加剤などの成分をさらに含んでもよい。

【0036】

以下、実施例を介し、本発明についてさらに詳細に説明するが、下記の実施例は、ただ、説明の目的のためのものであり、本願発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0037】

［実施例１］
各毛髪成長周期における、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＨＡＰＬＮ１ ｍＲＮＡの発現確認
本実施例においては、マウス皮膚を利用し、各毛髪成長周期において、ＨＡＰＬＮ１蛋白質の発現を確認した。

【0038】

マウス皮膚は、生後２３日齢（初期成長期）、生後３２日齢（成長期）、生後４０日齢（退化期）、生後４４日齢（休止期）から採取し、新鮮凍結（fresh frozen）した。皮膚組織切片は、８μｍ厚に作製され、ＨＡＰＬＮ１（Abcam、米国）抗体を利用し、ＨＡＰＬＮ１蛋白質の存在有無を検出した。免疫蛍光法（immunofluorescence）は、普遍的な実験方法よって進めた。

【0039】

その結果は、図４に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１は、成長期の毛母細胞において、相当に発現されていることを確認し、退化期、休止期においては、発現が減っていることを確認した。

【0040】

次に、ＨＡＰＬＮ１がどの細胞で生成されるかということを知るために、マウス皮膚において、ＨＡＰＬＮ１ ｍＲＮＡを確認した。

【0041】

該マウス皮膚は、生後３２日齢（成長期）、生後４０日齢（退化期）、生後４４日齢（休止期）から採取し、皮膚組織切片は、８μｍ厚にパラフィン薄切りした。ＨＡＰＬＮ１ ｍＲＮＡ probe（ＡＣＤｂｉｏ、米国）を利用して検出し、ＩＳＨ（in-situ hybridization）実験は、製造社の実験方法（ＡＣＤｂｉｏ；ＲＮＡ scope（登録商標） ２．５ ＨＤ Assay-BROWN、ＣＡ、米国）によって行われた。

【0042】

その結果は、図５に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１ ｍＲＮＡは、成長期の毛母細胞で発現されることを確認し、退化期、休止期においては、発現が確認されなかった。

【0043】

［実施例２］
ヒト毛母細胞における、ＨＡＰＬＮ１によるＴβＲII蛋白質増加の確認
本実施例においては、ＨＡＰＬＮ１が、ＴβＲIIの分解を防ぎ、その量を増大させるか否かということを確認した。

【0044】

ＨＡＰＬＮ１を、ヒト毛母細胞に濃度別に処理した。具体的には、ヒト毛母細胞（ＨＨＧＭＣ：human hair germinal matrix cell）をポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０×１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清の新たな培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１を、０，５，１０，２０ｎｇ／ｍＬで処理し、２４時間培養した。細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＴβＲIIを測定した。濃度計（densitometer）を利用し、ＧＡＰＤＨ対比の各ＴβＲIIの光学的濃度を比較した（すなわち、ＴβＲII光学的濃度÷ＧＡＰＤＨ光学的濃度）。このとき、該ＧＡＰＤＨは、ローディング対照群（loading control）として使用された。

【0045】

その結果は、図６に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１ ２０ｎｇ／ｍＬで、ＴβＲIIが増加することが確認された。

【0046】

それにより、ヒト毛母細胞をＨＡＰＬＮ１で処理すれば、ＴβＲIIが増加するということを確認した。

【0047】

［実施例３］
ヒト毛母細胞における、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡによるＴβＲII蛋白質増加の確認
ＨＡＰＬＮ１は、ＴＧＦ－β信号伝逹経路において、ＴβＲIIに直接作用するのではなく、ＨＡを安定化させることにより、ＴβＲIIに影響を及ぼすと仮定したが、それを確認するために、ＨＡＰＬＮ１とＨＡとで共に処理する実験を行った。

【0048】

ヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清の新たな培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ２５ｎｇ／ｍＬ、ＨＡ ２５μｇ／ｍＬで処理し、１時間後、ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で処理した。２３時間後、細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＴβＲI及びＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比の各ＴβＲIIの光学的濃度を比較した

【0049】

その結果は、図７に図示されているように、ヒト毛母細胞に、ＨＡＰＬＮ１またはＨＡで処理したとき、ＴβＲII増加を確認した。

【0050】

それにより、ＨＡＰＬＮ１単独処理時、ＴβＲIIが著しく増加したことを再確認し、特に、ＨＡＰＬＮ１が、ＨＡによるＴβＲII増加をさらに強化させるということを確認した。それに反し、ＴβＲIの濃度には変化がなかったので、ＨＡＰＬＮ１によるＴβＲIIの増加は選択的であると言える。

【0051】

［実施例４］
ヒト毛母細胞における、ＴβＲII蛋白質濃度に対する内因性ＨＡＰＬＮ１欠乏効果の確認
ヒト毛母細胞のＴβＲII蛋白質濃度に対する内因性ＨＡＰＬＮ１の影響を確認すべく、ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡを使用し、内因性ＨＡＰＬＮ１を欠乏させた。

【0052】

ヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、low serum培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル（scrambled）ｓｉＲＮＡを、ウェル当たり２５ｐｍｏｌずつ入れ、２４時間培養した。細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＨＡＰＬＮ１及びＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比のそれぞれＨＡＰＬＮ１及びＴβＲIIの光学的濃度を比較した。

【0053】

その結果は、図８に図示されているように、ヒト毛母細胞にＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡで処理し、内因性ＨＡＰＬＮ１を欠乏させることにより、ＴβＲIIも減ったということを確認した。

【0054】

［実施例５］
内因性ＨＡＰＬＮ１が欠乏したヒト毛母細胞における、ＴβＲII蛋白質濃度に対する外因性ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果確認
ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡを利用し、ＨＡＰＬＮ１を欠乏させたヒト毛母細胞に、外因性ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡによるＴβＲII蛋白質増加いかんを確認した。

【0055】

ヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、low serum培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを、ウェル当たり２５ｐｍｏｌずつ入れ、２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ及び培地をいずれも除去した後、ＨＡＰＬＮ１（２５ｎｇ／ｍＬ）またはＨＡ（２５μｇ／ｍＬ）が添加された無血清培地に替え、１時間培養した。ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で処理し、２３時間培養した。細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比のＴβＲIIの光学的濃度を比較した。

【0056】

その結果は、図９に図示されているように、内因性ＨＡＰＬＮ１が欠乏したヒト毛母細胞に、外因性ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡで処理するや否や、減っていたＴβＲIIが回復するということを確認することができた。

【0057】

［実施例６］
内因性ＨＡが欠乏したヒト毛母細胞における、ＴβＲII蛋白質濃度及びＨＡＳ２蛋白質濃度に対する外因性ＨＡＰＬＮ１の効果確認
４－ＭＵ（４－methylumbelliferone）は、ＨＡを生成するＨＡＳ２（hyaluronan synthase ２）の抑制剤である。細胞で生成されるＨＡの影響を確認すべく、４－ＭＵを使用し、細胞のＨＡ生成を抑制させた。

【0058】

４－ＭＵで処理し、内因性ＨＡが抑制されたヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清の新たな培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ２５ｎｇ／ｍＬで処理し、１時間後、ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で処理した。２３時間後、細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＨＡＳ２及びＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比のＨＡＳ２及びＴβＲIIの光学的濃度を比較した。

【0059】

その結果は、図１０に図示されているように、４－ＭＵ処理時には、ＨＡＳ２及びＴβＲIIの量が減り、それにより、ＨＡＰＬＮ１で処理すれば、ＨＡＳ２及びＴβＲIIが回復するということを確認した。

【0060】

［実施例７］
実施例３において、ＨＡＰＬＮ１は、ＨＡを介し、ＴβＲIIを調節することが確認されていた。しかし、ＨＡも、ＴβＲIIと直接結合しているのではなく、ＨＡの受容体であるＣＤ４４がＴβＲIIと結合している。

【0061】

本実施例においては、ＣＤ４４は、ＴβＲII調節過程における重要な要素のうち一つであるか否かということ、さらに実際に、ＨＡＰＬＮ１がＴβＲIIを増加させる過程において、ＣＤ４４が必須であるか否かということを確認した。

【0062】

１．ヒト毛母細胞における、ＴβＲII蛋白質濃度に対するＣＤ４４欠乏の効果確認
まず、ヒト毛母細胞にＣＤ４４が欠乏する場合、ＴβＲII蛋白質濃度がどのように変化するかということを確認した。

【0063】

ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡで処理し、細胞内ＣＤ４４を欠乏させたヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、low serum培地に変えた。ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを、ウェル当たり２５ｐｍｏｌずつ入れ、２４時間培養した。細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＣＤ４４及びＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比のＣＤ４４及びＴβＲIIの光学的濃度を比較した。

【0064】

その結果は、図１１に図示されているように、ＣＤ４４の欠乏時、ヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度が相当に減ったということを確認した。

【0065】

２．ＣＤ４４が欠乏したヒト毛母細胞における、ＴβＲII蛋白質濃度に対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果確認
次に、ＣＤ４４が欠乏したヒト毛母細胞において、ＴβＲII蛋白質濃度に対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果を確認した。

【0066】

ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡを利用し、ＣＤ４４を欠乏させたヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、low serum培地に変えた。ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを、ウェル当たり２５ｐｍｏｌずつ入れ、２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ及び培地をいずれも除去した後、ＨＡＰＬＮ１（２５ｎｇ／ｍＬ）またはＨＡ（２５μｇ／ｍＬ）が添加された無血清培地に替え、１時間培養した。ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で処理し、２３時間培養した。細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比のＴβＲIIの光学的濃度を比較した。

【0067】

その結果は、図１２に図示されているように、ヒト毛母細胞にＣＤ４４が欠乏した場合、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡで処理するにしても、ＴβＲIIが回復するということを確認することができなかった。

【0068】

前述の実験から、ＨＡＰＬＮ１及びＨＡが、ＴβＲIIを増加させる過程において、ＣＤ４４が必須な要素であるということを確認した。

【0069】

［実施例８］
細胞膜ＴβＲII蛋白質濃度に対するＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡの効果確認
ＨＡＰＬＮ１が、ＴβＲIIのエンドサイトーシス作用を抑制し、細胞膜ＴβＲII増加をもたらすと仮定したが、それを証明するための実験を行った。

【0070】

細胞膜に存在する全ての蛋白質をビオチンで標識し、ビオチン抗体で免疫沈降（immunoprecipitation）を行い、細胞膜蛋白質のみを分離した。細胞膜蛋白質において、ＴβＲIIの比率変化を確認するために、ウェスタンブロッティングを行った。具体的な実験方法は、下記の通りである。

【0071】

ヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン１００ｍｍディッシュに、２．７Ｘ１０^６個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清の新たな培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ２５ｎｇ／ｍＬ、ＨＡ ２５μｇ／ｍＬで処理し、１時間後、ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で処理した。２３時間後、ビオチンを標識するために、ＥＺ－Link（商標） Sulfo－ＮＨＳ－ＬＣ－Biotin（Thermo Fisher Scientific、ＭＡ、米国）２５０μｇ／ｍＬ濃度で処理し、４℃で１時間培養した。５０ｍＭ Tris－ＨＣｌで処理し、ビオチン標識反応を終結させた。細胞を集めた後、lysis buffer（５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。抗ビオチン抗体を利用し、免疫沈降実験を行い、細胞膜蛋白質を分離した。ウェスタンブロッティングを利用し、分離した細胞膜蛋白質試料において、ＴβＲIIを測定した。濃度計を利用し、ＧＡＰＤＨ対比の各ＴβＲIIの光学的濃度を比較した。

【0072】

その結果は、図１３に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡ処理時、細胞膜ＴβＲII蛋白質濃度が上昇するということを確認した。

【0073】

［実施例９］
ＨＡＰＬＮ１の細胞増殖効果及び作用メカニズムの究明
本実施例においては、ＨＡＰＬＮ１が、いかなるメカニズムにより、細胞増殖を誘導するかということを知るために、Ｓｍａｄ２ pathway及びＥＲＫ１／２ pathwayに対するＨＡＰＬＮ１の効果を確認した。

【0074】

ヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり５．０Ｘ１０^４個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清の新たな培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ２５ｎｇ／ｍＬ、ＨＡ ２５μｇ／ｍＬで処理し、２３時間培養した後、ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で１時間刺激を与えた。細胞を集めた後、lysis buffer（２５ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Triton－Ｘ１００、phosphatase inhibitor及びprotease inhibitor）を入れ、超音波処理（sonication）を介し、細胞を全部崩した。ウェスタンブロッティングを利用し、当該試料において、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－Ｓｍａｄ２、ｐ－ＭＥＫ１／２、ｐ－ｃ－Ｒａｆを測定した。濃度計を利用し、ＥＲＫ１／２，Ｓｍａｄ２／３，ＭＥＫ１、ｃ－Ｒａｆ対比のｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－Ｓｍａｄ２、ｐ－ＭＥＫ１／２、ｐ－ｃ－Ｒａｆの光学的濃度を比較した。このとき、ＥＲＫ１／２、Ｓｍａｄ２／３、ＭＥＫ１、ｃ－Ｒａｆは、ローディング対照群（loading control）として使用された。

【0075】

その結果は、図１４ないし図１６に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡで処理した細胞においては、ＴＧＦ－β２によるＥＲＫ１／２信号伝逹が活性化された。また、ＨＡＰＬＮ１は、ＨＡのＥＲＫ１／２信号伝逹活性化を強化させるということを確認した。一方、Ｓｍａｄ２のリン酸化には変化がなかった。また、ＥＲＫ１／２の上位（upstream）メカニズムであるＭＥＫ１／２及びｃ－Ｒａｆも、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡ処理により、活性が増大したことを確認した。

【0076】

それにより、ＨＡＰＬＮ１により、ＥＲＫ signalが活性化されることを確認し、それは、non－canonical pathwayを介し、信号伝逹がなされることを示す。しかしながら、ＨＡＰＬＮ１は、Ｓｍａｄ２／３のcanonical pathwayを活性化させないということを確認した。

【0077】

［実施例１０］
ＨＡＰＬＮ１の細胞増殖効果及び作用メカニズムの究明
ヒト毛母細胞を、ポリ－Ｄ－リシン９６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり２．０Ｘ１０^３個ずつ分注し、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、無血清の新たな培地に変えた。ＨＡＰＬＮ１ ２５ｎｇ／ｍＬ、ＨＡ ２５μｇ／ｍＬで処理し、１時間培養した後、ＴＧＦ－β２（２ｎｇ／ｍＬ）で２３時間刺激を与えた。ＣＣＫ－８（Enzo Biochem、ＮＹ、米国）で処理し、３７℃で１時間培養した。４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図１７に示した。

【0078】

ＴＧＦ－β２存在時、ＨＡＰＬＮ１及び／またはＨＡで処理した群において、対照群より細胞増殖が促進されたことを確認した。それは、ＨＡＰＬＮ１が、non－canonical ＴＧＦ－β信号伝逹経路を介し、ヒト毛母細胞の増殖を促進させることを意味する。

【0079】

［実施例１１］
各毛髪成長周期における、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＴβＲII蛋白質の発現確認
本実施例においては、マウス皮膚の各毛髪周期において、ＨＡＰＬＮ１とＴβＲIIとを蛍光染色し、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＴβＲII蛋白質の発現を確認した。

【0080】

マウス皮膚は、生後３２日齢（成長期）、生後４０日齢（退化期）、生後４４日齢（休止期）から採取し、新鮮凍結（fresh frozen）した。皮膚組織切片は、８μｍ厚に作製され、ＨＡＰＬＮ１（Abcam、米国）抗体とＴβＲII抗体とを利用し、ＨＡＰＬＮ１蛋白質及びＴβＲII蛋白質の存在有無を検出した。免疫蛍光法（immunofluorescence）は、普遍的な実験方法によって進めた。

【0081】

その結果は、図１８に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１は、成長期の毛母細胞において発現されていることを確認し、退化期、休止期では発現が減ったということを確認した。また、成長期（anagen）の毛母細胞（hair germical matrix）において、ＨＡＰＬＮ１及びＴβＲIIが同じ位置（co-localization）に発現していることを確認した。それは、ＨＡＰＬＮ１及びＴβＲIIがヒト毛母細胞の増殖に寄与するということを意味する。

【0082】

［実施例１２］
動物モデルでＨＡＰＬＮ１による毛髪成長周期の変化観察
１．マウスの毛髪成長に対するＨＡＰＬＮ１の腹腔全身投与の効果確認
体内ＨＡＰＬＮ１は、加齢するほど減る。体内ＨＡＰＬＮ１が減った２０ヵ月齢Ｃ５７マウスにＨＡＰＬＮ１を投与した。

【0083】

Ｃ５７マウスは、毛髪成長周期がそれぞれ異なるが、２回の毛髪成長周期を経て、全てのマウスの周期を一定に合わせた（図１９スケジュール参照）。その後、３日に１回ずつ、ＨＡＰＬＮ１を、０．１ｍｇ／ｋｇで腹腔注射した。

【0084】

その結果は、図１９に図示されているように、対照群と比較したとき、ＨＡＰＬＮ１で処理した群において、短期間に毛髪成長期に入った。

【0085】

２．マウスの毛髪成長に対するＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡの腹腔全身投与の効果確認
ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡを７週齢Ｃ５７マウスに投与し、ＨＡＰＬＮ１欠乏により、毛髪成長周期がどのように変化するかということを観察した。そのために、ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡ（Dharmacon；Accell ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ、ＣＯ、米国）を１週間に２回４ｎｍｏｌずつ４週間腹腔注射した（図２０スケジュール参照）。
その結果は、図２０に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１ ｓｉＲＮＡを投与した群が、対照群に比べ、毛髪成長期への進入が遅くなったことを確認した。

【0086】

［実施例１３］
ＨＡＰＬＮ１、ＣＸ３ＣＬ１及びＣＤＯＮの毛乳頭細胞または毛母細胞増殖の効果検証
米国特許登録公報第８，３３４，１３６号は、毛乳頭細胞に存在するＨＡＰＬＮ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＤＯＮのような細胞接着遺伝子の発現を維持または増加させれば、毛嚢形成または毛髪再生が促進される可能性を提示している。本実施例においては、前記細胞接着遺伝子が発現するＨＡＰＬＮ１蛋白質、ＣＸ３ＣＬ１蛋白質またはＣＤＯＮ蛋白質を、毛乳頭細胞または毛母細胞に直接処理したとき、実際に増殖効果が発現されるか否かということを検証した。

【0087】

１．毛乳頭細胞増殖の効果確認
ヒト毛乳頭細胞を、毛乳頭細胞増殖培地（Promocell）を利用し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベータで培養した。細胞が９０％ほど充填されれば、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で細胞を脱着させた後、１，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離させて細胞だけ回収した。それを、９６ウェルプレートに、それぞれウェル当たり２．０Ｘ１０^３個ずつ分注し、２４時間培養し、無血清培地にＨＡＰＬＮ１、ＣＸ３ＣＬ１及びＣＤＯＮそれぞれの最終濃度が２５ｎｇ／ｍｌになるように希釈させた。既存培養培地を除去した後、希釈させたＨＡＰＬＮ１、ＣＸ３ＣＬ１及びＣＤＯＮを、それぞれウェルに２００μｌずつ分注し、１時間培養した。実験偏差を減らすために、グループ当たり３個のウェルずつ処理した（triplication）。また、毛乳頭細胞を増殖させると知られたミノキシジル（minoxidil）で１０μＭ処理し、陽性対照群として設定した。

【0088】

前記希釈方法と同一に、ＨＡＰＬＮ１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＣＸ３ＣＬ１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＣＤＯＮ（２５ｎｇ／ｍｌ）、またはミノキシジル（１０μＭ）、及びヒト組み換えＴＧＦ－β２を、最終濃度が２ｎｇ／ｍｌになるように希釈させた後、ＴＧＦ－β２が含まれるグループの培地で２００μｌずつ交換した。実験偏差を減らすために、グループ当たり３個のウェルずつ処理した（triplicate）。

【0089】

２３時間の培養後、培養器からプレートを取り出し、培地と試薬とが含まれたまま、ＣＣＫ－８（ＷＳＴ－８）溶液を、２００μｌ培地当たり２０μｌ添加し、１時間３７℃で、培養基で反応させた後、マイクロプレートリーダ（microplate reader）を利用し、４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図２１に示した。

【0090】

図２１に図示されているように、ＴＧＦ－β２が存在したにしても存在していないにしても、ミノキシジルで処理した陽性対照群においては、有意の毛乳頭細胞増殖活性が確認されたが（＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ＨＡＰＬＮ１、ＣＸ３ＣＬ１及びＣＤＯＮは、いずれも毛乳頭細胞を増殖させることができないか、かえってその増殖を抑制した。すなわち、毛乳頭細胞内の細胞接着遺伝子が発現する蛋白質を毛乳頭細胞に投与しても、毛乳頭細胞の増殖効果が示されていないことが分かる。

【0091】

２．毛母細胞増殖の効果確認
ヒト毛母細胞を、ＭＳＣＭ（Mesenchymal Stem Cell Medium）を利用し、ポリ－Ｄ－リシンがコーティングされたフラスコに放ち、３７℃で、５％ ＣＯ_２インキュベータで培養した。細胞が９０％ほど充填されるようになれば、０．０５％ トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で細胞を脱着させた後、１，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、細胞だけ回収した。それを、９６ウェルのポリ－Ｄ－リシンコーティングプレート（coated plate）（ＢＤ bioscience）に、それぞれウェル当たり２．０Ｘ１０^３個ずつ分注し、２４時間培養し、無血清培地に、ＨＡＰＬＮ１、ＣＸ３ＣＬ１及びＣＤＯＮそれぞれの最終濃度が、２５ｎｇ／ｍｌになるように希釈させた。その後の過程は、前記毛乳頭細胞に係わる実験と同一に進め、吸光度を測定し、その結果を図２２に示した。

【0092】

図２２に図示されているように、ＨＡＰＬＮ１は、ＴＧＦ－β２が存在しない環境において、有意の毛母細胞増殖活性を示し（＊Ｐ＜０．０５）、ＴＧＦ－β２が存在する環境においては、特にすぐれた毛母細胞増殖活性を示し（＊＊＊Ｐ＜０．００１）、ＴＧＦ－β信号伝逹経路を介し、ヒト毛母細胞の増殖効果を有することが確認された。一方、ＣＸ３ＣＬ１及びＣＤＯＮは、母乳頭細胞の場合と同様に、毛母細胞においても、かえって細胞増殖を抑制する結果を示した。

【0093】

結局、米国特許登録公報第８，３３４，１３６号は、毛乳頭細胞に存在する細胞接着遺伝子の発現を維持または増加させれば、毛嚢形成または毛髪再生が促進される可能性を言及するものの、実際、細胞接着遺伝子が発現する蛋白質が、いずれも毛乳頭細胞または毛母細胞を増殖させるものではないということを確認することができる。

【0094】

従って、ＨＡＰＬＮ１蛋白質だけが、毛母細胞の増殖を促進させ、毛髪を成長させ、脱毛の予防効果または治療効果を有するということが分かる。

【0095】

以上、本発明の内容の特定部分について詳細に記述したが、当業界の当業者であるならば、そのような具体的記述は、単に望ましい実施様態であるのみ、それにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は、明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲と、それらの等価物とによって定義されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】