特許 7183136 アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩＢ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-25

(45)【発行日】2022-12-05

(54)【発明の名称】アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩＢ抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20221128BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221128BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20221128BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P43/00 121

C12P21/08

C12N5/10

C12N15/13

【請求項の数】 35

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2019194319

(22)【出願日】2019-10-25

(62)【分割の表示】P 2016531878の分割

【原出願日】2014-07-31

(65)【公開番号】P2020040955

(43)【公開日】2020-03-19

【審査請求日】2019-11-25

(31)【優先権主張番号】61/861,198

(32)【優先日】2013-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/901,732

(32)【優先日】2013-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/933,632

(32)【優先日】2014-01-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515302853

【氏名又は名称】ファイヴ プライム セラピューティクス インク

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ハーディング， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ピアース， クリステン

(72)【発明者】

【氏名】パティル， ナムラタ

(72)【発明者】

【氏名】ブレナン， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ハンブルトン， ジュリー

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１０／０５４２６５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2006年，Vol.103, No.11，pp.4005-4010

【文献】“Potelligent CHOK1SV Technology”, [online], 2013.6.18, LONZA, [2018.7.27 検索], インターネット<URL: https://web.archive.org/web/20130618053 917/https://www.lonza.com/custom-manufacturing/development-technologies/ potelligent-chok1sv-technology.aspx>

【文献】mAb，2009年，Vol.1, Issue 3，pp.230-236

【文献】J. Immunol. Methods，2005年，Vol.306，pp.151-160

【文献】Clin. Cancer Res.，2007年，Vol.13, No.6，pp.1875-1882

【文献】J. Biol. Chem.，2002年，Vol.277, No.30，pp.26733-26740

【文献】Cancer Res.，2010年，Vol.70, Issue 11，pp.4481-4489

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む薬学的組成物であって、各抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が重鎖及び軽鎖を含み、
重鎖が
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、を含む重鎖可変領域を含み、かつ
軽鎖が
（ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３、を含む軽鎖可変領域を含み、
薬学的組成物中の抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の少なくとも９５％がアフコシル化されており、前記抗体がヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３の定常領域を含む、薬学的組成物。

【請求項2】

抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む薬学的組成物であって、各抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が重鎖及び軽鎖を含み、
重鎖が
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、を含む重鎖可変領域を含み、かつ
軽鎖が
（ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３、を含む軽鎖可変領域を含み、
前記抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体がアフコシル化抗体を含み、薬学的組成物中の抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の５％未満がフコシル化されている、薬学的組成物。

【請求項3】

重鎖可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

軽鎖可変領域が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

重鎖可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

重鎖が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

検出不可能なフコシル化を有する、請求項１～８の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～９の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

抗体が、キメラ抗体である、請求項１～１０の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

抗体が、ヒト化抗体である、請求項１～１１の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

抗体が、Ａｓｎ２９７でのフコースを欠いている、請求項１～１２の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

抗体が、ヒトκ軽鎖定常領域を含む、請求項１～１３の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

抗体が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１～１４の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

アフコシル化抗体が、同一のアミノ酸配列を有するフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体と比較して、インビトロでの増強されたＡＤＣＣ活性を有する、請求項１～１５の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体によるＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現標的細胞の特異的溶解よりも、少なくとも１０パーセント高いＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現標的細胞の特異的溶解を引き起こす、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

ＡＤＣＣ活性が、標的細胞としてＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現するＢａ／Ｆ３細胞、及びエフェクター細胞として単離されたヒトＰＢＭＣを使用して決定される、請求項１６又は１７に記載の薬学的組成物。

【請求項19】

アフコシル化抗体が、同一のアミノ酸配列を有するフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体と比較して、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する、請求項１～１８の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項20】

アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、又は少なくとも２０倍高い親和性でＦｃガンマＲＩＩＩＡに結合する、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【請求項21】

ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する親和性が、表面プラズモン共鳴により決定される、請求項１９又は２０に記載の薬学的組成物。

【請求項22】

ＦｃガンマＲＩＩＩＡが、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及びＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）から選択される、請求項１９～２１の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項23】

ＦｃガンマＲＩＩＩＡが、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）である、請求項２２に記載の薬学的組成物。

【請求項24】

アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合するが、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合しない、請求項１～２３の何れか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項25】

重鎖及び軽鎖を含むアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体であって、
重鎖が
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、を含む重鎖可変領域を含み、かつ
軽鎖が
（ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、
（ｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び
（ｖｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３、を含む軽鎖可変領域を含み、
前記抗体がヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３の定常領域を含む、抗体。

【請求項26】

重鎖可変領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は軽鎖可変領域が、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はこれらの両方を含む、請求項２５に記載の抗体。

【請求項27】

重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又はこれらの両方を含む、請求項２５又は２６に記載の抗体。

【請求項28】

請求項１～２７の何れか一項に記載の抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞であって、機能的アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子を欠いている、宿主細胞。

【請求項29】

ＣＨＯ細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。

【請求項30】

アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を作製するための方法であって、請求項２８又は２９に記載の宿主細胞を、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体をコードする核酸を発現するために適した条件下で培養することを含む、方法。

【請求項31】

アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を作製するための方法であって、請求項２８又は２９に記載の宿主細胞を、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を産生するために適した条件下で培養することを含む、方法。

【請求項32】

宿主細胞によって産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を回収することを更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。

【請求項33】

宿主細胞により産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の少なくとも９５％が、アフコシル化されている、請求項３０～３２の何れか一項に記載の方法。

【請求項34】

宿主細胞によって産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体において、フコースが検出されない、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

フコシル化が、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を含む方法によって検出される、請求項３３又は３４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が提供される。

【背景技術】

【0002】

線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーメンバーは、様々な程度で異なるＦＧＦＲに結合する異なるＦＧＦにより、４種のチロシンキナーゼ受容体である線維芽細胞増殖因子受容体１～４（ＦＧＦＲ１～４）、及びそれらのアイソフォームに結合する（Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 2006）。ヒトＦＧＦＲ２のタンパク質配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ローカス ＡＦ４８７５５３に提供されている。各ＥＧＦＲは、３種の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）を含む細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、一回膜貫通へリックス、及び細胞内触媒キナーゼドメインからなる（Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16:107, 2005）。Ｄ１及びＤ２の間のリンカーには、「アシッド・ボックス（ａｃｉｄ ｂｏｘ）」（ＡＢ）と呼ばれる隣接するアミノ酸の範囲がある。Ｄ１及びＡＢを含む領域は、リガンドへの結合により緩和される、受容体の自己制御に関与すると考えられている。ＦＧＦは、主に受容体のＤ２及びＤ３における領域を介して受容体に結合する。ＦＧＦＲは、様々なアイソフォームをもたらす、そのｍＲＮＡの複数の選択的スプライシングにより特徴づけられる（Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271:15292, 1996; ＦＧＦＲ２及びそのアイソフォームについてＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐ２１８０２及びアイソフォームＰ２１８０２－１からＰ２１８０２－２０も参照のこと）。とりわけ、３種全てのＩｇドメインを含むフォーム（αアイソフォーム）、又はＤ１を含まず、Ｄ２及びＤ３ドメインの２種のＩｇドメインのみを含むフォーム（βアイソフォーム）がある。ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ３において、全てのフォームが、ＩＩＩａと示されるＤ３の前半部分を含むが、２つの代替的エクソンがＤ３の後半部分に使用されることができ、これにより、ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃフォームが得られる。ＦＧＦＲ２について、これらは、それぞれＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（又は、単にＦＧＦＲ２ｂ及びＦＧＦＲ２ｃ）と示され；対応するベータフォームは、ＦＧＦＲ２（ｂｅｔａ）ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ２（ｂｅｔａ）ＩＩＩｃと示される。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（Ｋ－ｓａｍ－Ｉとも示される）は、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２の両方によく結合するもののＫＧＦファミリーメンバーには結合しないが、ＦＧＦＲ２（Ｋ－ｓａｍ－ＩＩとも示される）のＦＧＦＲ２ＩＩＩｂフォームは、ＦＧＦ１及びＫＧＦファミリーメンバー（ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ２２）の両方に対し高親和性受容体である(Miki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246, 1992)。実に、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが、ＫＧＦファミリーメンバーに対する唯一の受容体であり(Ornitz et al., 1996, op. cit.)、そのため、ＫＧＦＲと示されている。

【0003】

ＦＧＦＲ及びそのアイソフォームは、様々な組織において、異なる発現をする。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ（及び、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ３のＩＩＩｂフォーム）は、上皮組織に発現するが、ＦＧＦＲＩＩＩｃは、間葉組織に発現する(Duan et al., J. Biol. Chem. 267:16076, 1992; Ornitz et al., 1996, op. cit.)。これらの受容体の特定のＦＧＦリガンドは、反対の発現パターンを有する。従って、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ２２を含むＫＧＦサブファミリーメンバーはＦＧＦＲＩＩＩｂのみに結合し(Zhang et al., op. cit.)、かつ、間葉組織に発現し、よって、上皮細胞のパラクラインエフェクターであってもよい。一方、ＦＧＦ４サブファミリーメンバーＦＧＦ４～６は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合し、かつ、上皮及び間葉系の両方において発現し、よって、オートクライン又はパラクライン機能の何れかを有していてもよい。ＦＧＦＲ２のアイソフォーム及びそのリガンドの発現パターンのために、ＦＧＦＲ２は、上皮－間葉相互作用における役割を果たし(Finch et al., Dev. Dyn. 203:223, 1995)、そのため、マウスにおけるＦＧＦＲ２ＩＩＩｂのノックアウトが、胚性の欠陥及び死亡を引き起こす(De Moerlooze et al., Development 127:483, 2000)。

【0004】

ＫＧＦ（ＦＧＦ７）及びＫＧＦＲ（ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ）は、多くの膵臓がんにおいて、過剰発現しており(Ishiwata et al., Am. J. Pathol. 153: 213, 1998)、それらの共発現は、予後の悪さと相関している(Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007)。ＦＧＦＲ２遺伝子の体細胞変異は、子宮内膜（子宮）癌の大規模パネルの１２％に見いだされ、様々な試験ケースにおいて、腫瘍細胞生存のために必須あった。２種の腫瘍において、ＦＧＦＲ２変異は、アペール症候群に関連する、同じＳ２５２Ｗ置換であることが見出された。ＦＧＦＲ２の増幅と過剰発現は、予後が著しく悪い、未分化型びまん性胃がんと関連し、低分子化合物によるＦＧＦＲ２活性の阻害は、そのようながん細胞の増殖を強く阻害した (Kunii et al., Cancer Res. 68:2340, 2008; Nakamura et al., Gastroenterol. 131:1530, 2006)。

【発明の概要】

【0005】

いくつかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が提供され、重鎖可変領域は：（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み；かつ軽鎖可変領域は：（ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含み；抗体は、アフコシル化されている。いくつかの実施態様において、抗体はＡｓｎ２９７でのフコースを欠いている。いくつかの実施態様において、複数の抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む組成物が提供され、組成物中の各抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の重鎖可変領域は：（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み；かつ組成物中の各抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の軽鎖可変領域は：（ｉｖ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含み；組成物中の抗体の少なくとも９５％がアフコシル化されている。いくつかの実施態様において、組成物は、抗体産生細胞株の上清であってもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、緩衝化された組成物である。いくつかの実施態様において、重鎖可変領域ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、軽鎖可変領域ドメインが、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、重鎖可変領域ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変ドメインが、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、重鎖が、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、軽鎖が、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、重鎖が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖が、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、複数のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む組成物が提供され、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗体と、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合について競合する。

【0006】

いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載の任意の実施態様において、抗体は、κ軽鎖定常領域を含んでもよい。本明細書に記載の任意の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含んでもよい。

【0007】

いくつかの実施態様において、抗体は、同じアミノ酸配列を有するフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体に比較して、インビトロでの増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体による特異的溶解よりも、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、又は少なくとも７５パーセントポイント高い特異的溶解を引き起こす。いくつかの実施態様において、ＡＤＣＣ活性が、標的細胞としてＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現するＢａ／Ｆ３細胞、及びエフェクター細胞として単離されたヒトＰＢＭＣを使用して決定される。

【0008】

いくつかの実施態様において、抗体は、同じアミノ酸配列を有するフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体に比較して、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、又は少なくとも２０倍高い親和性でＦｃガンマＲＩＩＩＡに結合する。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡは、表面プラズモン共鳴を使用して決定される。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡは、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及びＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）から選択される。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡは、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）である。

【0009】

本明細書に記載の任意の実施態様において、抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合してもよいが、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合なくてもよい。

【0010】

本明細書に記載の任意の実施態様において、複数のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む組成物は、少なくとも９５％のアフコシル化抗体を含む。本明細書に記載の任意の実施態様において、複数のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む組成物は、フコシル化が非検出であってもよい。いくつかの実施態様において、フコースの存在は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動、又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を含む方法により決定されてもよい。

【0011】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞が提供され、宿主細胞は、機能的アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子を欠く。別の実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。

【0012】

いくつかの実施態様において、アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を作製するための方法が提供される。いくつかの実施態様において、方法は、宿主細胞を、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体をコードする核酸を発現するために適した条件下で培養することを含み、宿主細胞は、機能的アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子を欠く。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を作製するための方法は、宿主細胞を、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を産生するために適した条件下で培養することを含む。いくつかの実施態様において、方法は、宿主細胞によって産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を回収することを更に含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞によって産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の少なくとも５％がフコースを含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞によって産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の少なくとも９５％がフコースを欠く（例えば、アフコシル化されている）。いくつかの実施態様において、宿主細胞によって産生される抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体において、フコース検出されない。いくつかの実施態様において、フコースの存在は、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を含む方法により検出される。

【0013】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物が提供される。

【0014】

いくつかの実施態様において、がんを処置する方法が提供される。いくつかの実施態様において、方法は、本明細書に記載のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物の有効量を投与することを含む。いくつかの実施態様において、がんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、及び食道がんから選択される。いくつかの実施態様において、がんは胃がんである。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅は、ＦＧＦＲ２：ＣＥＮ１０（染色体１０セントロメア）比が＞３である。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含むがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含むがんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現又は過剰発現は、ＩＨＣによって決定される。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の１＋、２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣ染色は、実施例６に記載されるように、スコア付けされる。

【0015】

いくつかの実施態様において、がんを処置する方法は、白金剤、パクリタキセル、アブラキサン（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）（登録商標）、ドセタキセル、ゲムシタビン、カペシタビン、イリノテカン、エピルビシン、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ロイコボリン、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、及びドキソルビシン塩酸塩から選択される少なくとも１の追加の治療剤を投与することを更に含む。いくつかの実施態様において、白金剤は、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンから選択される。いくつかの実施態様において、がんの処置は、パクリタキセルを投与することを更に含む。いくつかの実施態様において、がんの処置は、シスプラチン、及び／又は５－ＦＵを投与することを更に含む。

【0016】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物の使用が提供される。いくつかの実施態様において、そのような使用は、がんを有する個体におけるがんを処置するための使用である。いくつかの実施態様において、がんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、及び食道がんから選択される。いくつかの実施態様において、がんは胃がんである。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅は、ＦＧＦＲ２：ＣＥＮ１０（染色体１０セントロメア）比が＞３である。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を有するがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を有するがんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現又は過剰発現は、ＩＨＣによって決定される。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の１＋、２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣ染色は、実施例６に記載されるように、スコア付けされる。

【0017】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む、がんを処置するための薬学的組成物が提供される。いくつかの実施態様において、がんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、及び食道がんから選択される。いくつかの実施態様において、がんは胃がんである。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅は、ＦＧＦＲ２：ＣＥＮ１０（染色体１０セントロメア）比が＞３である。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を有するがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を有するがんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現又は過剰発現は、ＩＨＣによって決定される。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の１＋、２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣ染色は、実施例６に記載されるように、スコア付けされる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１Ａから１Ｃは、実施例３に記載された、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現Ｂａ／Ｆ３細胞に対する、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ及びフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦのＡＤＣＣ活性を示す。凡例において、「αＦＧＦＲ２ｂＦ／ＦＧＦＲ２ｂ」は、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦ抗体がＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現Ｂａ／Ｆ３標的細胞に対して試験されたことを示す。

【図2】図２Ａから２Ｄは、実施例４に記載されるように、１０ｍｇ／ｋｇ（Ａ及びＢ）、及び３ｍｇ／ｋｇ（Ｃ及びＤ）での、ＯＣＵＭ－２Ｍ胃がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ及びフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦの有効性を示す。

【図3】図３Ａ及び３Ｂは、実施例４に記載されるように、ＯＣＵＭ－２Ｍ胃がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡの用量依存的有効性を示す。

【図4】図４Ａ及び４Ｂは、実施例４に記載されるように、ＯＣＵＭ－２Ｍ胃がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ及びパクリタキセルの組合せ療法の有効性を示す。

【図5】図５Ａ及び５Ｂは、実施例４に記載されるように、ＯＣＵＭ－２Ｍ胃がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ及び５－ＦＵ／シスプラチンの組合せ療法の有効性を示す。

【図6】図６Ａ及び６Ｂは、実施例４に記載されるように、ＭＦＭ－２２３乳がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡの有効性を示す。

【図7】図７は、実施例１に記載されるように、（Ａ）ポテリジェント（Potelligent）（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞及び（Ｂ）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において産生されるαＦＧＦＲ２ｂ抗体のグリカンプロフィールを示す。

【図8】図８は、抗体に典型的に見出されるＮ－結合グリカンのスキーム図を示す。

【図9】図９は、αＦＧＦＲ２ｂＡ又はαＦＧＦＲ２ｂＦの濃度増加に伴うＢａ／Ｆ３ ＦＧＦ２ｂ細胞のＡＤＣＣを示す。アッセイは、実施例５に記載されるように、Ｅ：Ｔ比２５：１で正常ヒトＰＢＭＣを用いて実施された。データは、ＬＤＨ放出としてプロットされる。

【図10】図１０は、αＦＧＦＲ２ｂＡ又はαＦＧＦＲ２ｂＦの濃度増加に伴うＯＣＵＭ－２Ｍ細胞のＡＤＣＣを示す。アッセイは、Ｅ：Ｔ比２５：１で正常ヒトＰＢＭＣを用いて実施された。実施例５に記載されている。データは特異的溶解パーセントでプロットされる。

【図11】図１１Ａから１１Ｆは、実施例６に記載されるように、免疫組織化学を使用した腫瘍組織試料におけるＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合するアフコシル化抗体が提供される。いくつかの実施態様において、また、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する抗体を形成することができるアフコシル化抗体の重鎖及び軽鎖が提供される。いくつかの実施態様において、１以上の特定の超可変領域（ＨＶＲ）を含む、アフコシル化抗体、重鎖、及び軽鎖が提供される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体に比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体に比較して、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体に比較して、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体に比較して、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合しない。

【0020】

ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。抗体重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドも、また、提供される。アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を発現する宿主細胞が提供される。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対するアフコシル化抗体を使用した処置の方法が提供される。そのような方法は、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、及び食道がん等のがんを処置する方法を含むが、これらに限定されない。

【0021】

本明細書において使用される章（section headings）は、体系化の目的のみのためであり、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。

【0022】

本明細書において引用される、特許出願、特許公開公報、及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む全ての引用文献は、各引用文献のその全体が、具体的に及び個々に本明細書に援用されることが示されるように、引用により本明細書に援用される。

【0023】

本明細書に記載、又は引用される技術及び手順は、通常よく理解され、一般的に当業者によって、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al.eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 及び Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); 及びこれらの改訂版に記載される、広く利用される従来法を使用して用いられる。

【0024】

Ｉ．定義
本明細書に別途定義されていない限り、本願発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解される意味を持つものとする。更に、文脈的に必須でない又は明記されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、そして、複数形の用語は、単数形を含むものとする。

【0025】

本明細書に記載の本願発明の態様及び実施態様は、「からなる」及び／又は「基本的にからなる」態様及び実施態様を含む。本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に指示がない限り、複数への参照が含まれる。

【0026】

別途定義されていない限り、又は当業者にそのように理解されない限り、本出願において、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。複数従属請求項に関連し、「又は」の使用は、１以上の前出の独立又は従属請求項の引用を意味する。

【0027】

当業者により理解されるように、本明細書中の「およそ（約、ａｂｏｕｔ）」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体に対する実施態様を含む(記載する)。例えば、「約Ｘ」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。

【0028】

用語「核酸分子」、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、区別なく用いられてもよく、かつ、核酸のポリマーを意味してもよい。そのような核酸のポリマーは、天然及び／又は非天然核酸を含んでもよく、かつ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含んでもよいが、これらに限定されない。「核酸配列」は核酸分子又はポリヌクレオチドを含む核酸の直鎖状配列を指す。

【0029】

用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに区別なく用いられ、最短の長さに限定されない。そのような、アミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然アミノ酸残基を含んでもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、トリマー（ｔｒｉｍｅｒ）、及び多量体を含んでもよいが、これらに限定されない。完全長タンパク質及びその断片の両方が、定義により含まれる。その用語は、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、リン酸化、等のポリペプチドの発現後修飾も含む。更に、本願発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する範囲で、天然型の配列に対する欠失、付加、置換（天然では通常保存的）等の修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異形成による意図的なものであってもよく、又は、タンパク質を産生する宿主の突然変異又はＰＣＲ増幅時のエラーによる偶発的なものであってもよい。

【0030】

「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ」又は「ＦＧＦＲ２ｂ」は、区別なく用いられ、線維芽細胞増殖因子受容体２ＩＩＩｂスプライシングフォームを指す。例示的なヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂは、２０１３年７月７日付ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７５２５９．４に示される。非限定的な例示的成熟ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂアミノ酸配列は、配列番号１で示される。

【0031】

「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ」又は「ＦＧＦＲ２ｃ」は、区別なく用いられ、線維芽細胞増殖因子受容体２ＩＩＩｃスプライシングフォームを指す。例示的なヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃは、２０１３年７月７日付ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１３２．３に示される。非限定的な例示的成熟ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃアミノ酸配列は、配列番号１２で示される。

【0032】

用語「エピトープ」は、抗原結合分子（例えば、抗体の結合領域を含む、抗体、抗体断片、又はスキャフォールドタンパク質）が結合する、標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質等の抗原）における部位を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸、ポリペプチド、又は糖側鎖等の化学的に活性な表層の分子グループからなり、特定の三次元構造的特徴、並びに特定の電荷的特徴を有する。エピトープは、標的分子の、近接する残基又は並置された非近接の残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成され得る。三次構造的折りたたみにより形成されるエピトープは、典型的には、還元溶媒による処置で喪失するが、近接する残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープは、典型的に、還元溶媒に対する曝露により得られる。エピトープは、少なくとも３、少なくとも５、又は８～１０残基（例えば、アミノ酸、又はヌクレオチド）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例において、エピトープは、２０残基長未満（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）、１５残基長未満、又は１２残基長未満である。２つの抗体が抗原に対する競合的結合を示す場合、それらは、ある抗原内の同一のエピトープに結合してもよい。

【0033】

「非直鎖状エピトープ」又は「立体構造エピトープ」は、そのエピトープに特異的な抗体が結合する、抗原性タンパク質内の、非近接のポリペプチド、アミノ酸、及び／又は糖を含む。

【0034】

「直鎖状エピトープ」は、そのエピトープに特異的な抗体が結合する、抗原性タンパク質内の、近接のポリペプチド、アミノ酸、及び／又は糖を含む。

【0035】

本明細書における用語「抗体」は最も広義に用いられ、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含むが、これらに限定されない。

【0036】

抗体との用語は、抗原に結合することが可能な断片である、例えばＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及び（Ｆａｂ’）_２等を含むが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。パパイン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）_２断片を産生する。抗体との用語は、また、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び、マウス、ヒト、カニクイザル等の様々な種の抗体を含むが、これらに限定されない。

【0037】

用語「重鎖可変領域」は、重鎖ＨＶＲ１、フレームワーク（ＦＲ）２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、及びＨＶＲ３を含む領域を指す。いくつかの実施態様において、重鎖可変領域は、また、少なくとも、ＦＲ１及び／又は少なくともＦＲ４の一部を含む。

【0038】

用語「重鎖定常領域」は、少なくとも３つのＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３の重鎖定常ドメインを含む領域を指す。非限定的例示的重鎖定常領域は、γ、δ、及びαを含む。非限定的例示的重鎖定常領域は、ε及びμを含む。各重鎖定常領域は、抗体アイソタイプに対応する。例えば、γ定常領域を含む抗体がＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体がＩｇＤ抗体であり、そして、α定常領域を含む抗体がＩｇＡ抗体である。更に、μ定常領域を含む抗体が、ＩｇＭ抗体であり、そして、ε定常領域を含む抗体が、ＩｇＥ抗体である。特定のアイソタイプは、サブクラスに更に分類され得る。例えば、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１（γ_１定常領域を含む）、ＩｇＧ２（γ_２定常領域を含む）、ＩｇＧ３（γ_３定常領域を含む）、及びＩｇＧ４（γ_４定常領域を含む）抗体を含むがこれらに限定されず；ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１（α_１定常領域を含む）及びＩｇＡ２（α_２定常領域を含む）抗体を含むがこれらに限定されず；かつ、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれに限定されない。

【0039】

用語「重鎖」は、リーダー配列を有する又は有さない、少なくとも重鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、重鎖は、少なくとも重鎖定常領域の一部を含む。用語「完全長重鎖」は、リーダー配列を有する又は有さない、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。

【0040】

用語「軽鎖可変領域」は、軽鎖ＨＶＲ１、フレームワーク（ＦＲ）２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、及びＨＶＲ３を含む領域を指す。いくつかの実施態様において、軽鎖可変領域は、また、少なくとも、ＦＲ１及び／又はＦＲ４を含む。

【0041】

用語「軽鎖定常領域」は、軽鎖定常ドメインＣ_Ｌを含む領域を指す。非限定的例示的軽鎖定常領域は、λ及びκを含む。

【0042】

用語「軽鎖」は、リーダー配列を有する又は有さない、少なくとも軽鎖可変領域を含む、ポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、軽鎖は、少なくとも軽鎖定常領域の一部を含む。用語「完全長軽鎖」は、リーダー配列を有する又は有さない、軽鎖可変領域、及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。

【0043】

用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、Ｖ_Ｈに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶ_Ｌに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最高であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～６５、及びＨ３の９５～１０２に生じる(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。超可変領域（ＨＶＲ）、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）との用語は、本明細書において区別なく用いられ、抗原結合領域を形成する可変領域の部分を指すのに使用される。

【0044】

本明細書に記載の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、Ｖ_Ｌアクセプターヒトフレームワークは、Ｖ_Ｌヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。

【0045】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。いくつかの実施態様において、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。

【0046】

「親和性成熟」抗体は、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良をもたらす、その１以上の超可変領域（ＨＶＲ）において１以上の改変を持つ抗体、及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。

【0047】

「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、残りの重鎖及び／又は軽鎖は異なる起源又は種から由来する抗体を指す。いくつかの実施態様において、キメラ抗体は、第１の種（例えば、マウス、ラット、カニクイザル等）に由来する少なくとも１の可変領域、及び第２の種（例えば、ヒト、カニクイザル等）に由来する少なくとも１の定常領域を含む抗体を指す。いくつかの実施態様において、キメラ抗体は、少なくとも１のマウス可変領域、及び少なくとも１のヒト定常領域を含む。いくつかの実施態様において、キメラ抗体は、少なくとも１のカニクイザル可変領域、及び少なくとも１のヒト定常領域を含む。いくつかの実施態様において、キメラ抗体の全ての可変領域は、第１の種に由来し、かつキメラ抗体の全ての定常領域は第２の種に由来する。

【0048】

「ヒト抗体」は、非ヒト可変領域のフレームワーク領域における少なくとも１のアミノ酸が、ヒト可変領域に由来する対応するアミノ酸と置換された、抗体を指す。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１のヒト定常領域、又はその断片を含む。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）_２等である。

【0049】

「ＨＶＲグラフト化抗体（ＨＶＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、第１の種（非ヒト）の１以上の超可変領域（ＨＶＲ）が、第２の種（ヒト）のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされたヒト化抗体を指す。

【0050】

「機能的Ｆｃ領域」は、天然型配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有している。例示的な「エフェクター機能」は、Ｆｃ受容体結合；Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御等を含む。そのようなエフェクター機能は、通常、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合するためのＦｃ領域を必要とし、様々なアッセイを用いて評価され得る。

【0051】

「天然型配列のＦｃ領域」は、自然界に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然型配列のヒトＦｃ領域は、天然型配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然型配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然型配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然型配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、並びにその自然発生的な変異体を含む。

【0052】

「変異Ｆｃ領域」は、少なくとも１のアミノ酸変異による、天然型配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。

【0053】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を示す。いくつかの実施態様において、ＦｃγＲは、天然型ヒトＦｃＲである。更に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び代替的にスプライシングされたフォームも含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制型受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をその細胞質ドメインに含み、抑制型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 及び de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に概説されている。将来的に同定されることになるものを含め、他のＦｃＲは、本明細書においては用語「ＦｃＲ」に包含される。

【0054】

用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、また、母親のＩｇＧの胎児への輸送に関与する新生児受容体であるＦｃＲｎを含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及び Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) and regulation of homeostasis of immunoglobulins）。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は、知られている（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); 国際公開第２００４／９２２１９号(Hinton et al.)を参照）。

【0055】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例は以下のものを含む：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化。

【0056】

「ヒトエフェクター細胞」とは、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。特定の実施態様において、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、マクロファージ、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球を含む。エフェクター細胞は、例えば血液などの天然のソースから単離されてもよい。

【0057】

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）に結合した、分泌されたＩｇが、細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、続いてサイトトキシンによる標的細胞の殺傷することを可能にする、細胞障害の形態を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号又は米国特許第６７３７０５６（Presta）に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。そのようなアッセイのための、有効なエフェクター細胞は、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価され得る。Ｆｃ領域アミノ酸が改変された追加的抗体、及び増強された又は低下したＡＤＣＣ活性は、例えば、米国特許第７９２３５３８及び米国特許第７９９４２９０に記載されている。

【0058】

アッセイで使用されるそのような抗体及び親抗体の量が同一の場合、「増強されたＡＤＣＣ活性」を有する抗体は、親抗体と比較して、インビトロ又はインビボでＡＤＣＣの媒介に関してより有効な抗体を指し、ここで、抗体及び親抗体は、少なくとも１の構造的態様において異なる。いくつかの実施態様において、抗体及び親抗体は、同一のアミノ酸配列を有するが、親抗体がフコシル化されているのに対し、抗体はアフコシル化されている。いくつかの実施態様において、ＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載のインビトロのＡＤＣＣアッセイを使用して決定されるが、例えば、動物モデル等の、他のアッセイ又はＡＤＣＣ活性を決定するための方法が企図される。いくつかの実施態様において、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する、増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対する、増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する、増強された親和性を有する。

【0059】

「改変された」ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性を有する抗体は、親抗体に比較して、増強された又は低減されたＦｃＲ結合活性及び／又はＡＤＣＣ活性を有し、ここで、抗体及び親抗体は、少なくとも１の構造的態様において異なる。ＦｃＲに対し「増加した結合を示す」抗体は、少なくとも１のＦｃＲに、親抗体よりも高い親和性で結合する。ＦｃＲに対し「低下した結合を示す」抗体は、少なくとも１のＦｃＲに、親抗体よりも低い親和性で結合する。ＦｃＲに対し低下した結合を示す抗体は、ＦｃＲに対し、ほとんど検出できない、又は検出できない結合、例えば、天然型配列のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して０～２０％の結合を有してもよい。

【0060】

「ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性」は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する、親抗体より高い親和性を有する抗体を指し（いくつかの例で、また、Ｃｄ１６ａを指す）、ここで、抗体及び親抗体は、少なくとも１の構造的態様において異なる。いくつかの実施態様において、抗体及び親抗体は、同一のアミノ酸配列を有するが、親抗体がフコシル化されているのに対し、抗体はアフコシル化されている。ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する親和性を決定するための、任意の好適な方法が、使用されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する親和性は、本明細書に記載の方法により決定される。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する抗体は、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対する、増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する、増強された親和性を有する。

【0061】

アフコシル化された抗体又は「フコースを欠く」抗体は、定常領域のグリコシル化においてフコースを欠いている、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ抗体を指す。最大２Ｇａｌ残基により終了される主要なフコシル化二分岐複合オリゴ糖グリコシル化のように、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化はＡｓｎ２９７で生じる。いくつかの実施態様において、抗体はＡｓｎ２９７におけるフコースを欠いている。これらの構造は、末端Gal残基の量によって、Ｇ０、Ｇ１（α１，６又はα１，３）又はＧ２グリカン残基と規定される。例えば、Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003)を参照のこと。抗体ＦｃのＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997)に記載されている。いくつかの実施態様において、非糖改変ＣＨＯ宿主細胞において、組換えに技術により発現された抗体バッチの少なくとも８５％がＡｓｎ２９７においてフコシル化される。複数の抗体を含む組成物を参照する場合、Ａｓｎ２９７におけるフコースを含む、組成物中の抗体の＜５％がアフコシル化されている場合に、抗体はアフコシル化されていると考えられる。フコースを測定する方法は、本明細書に記載の方法を含む、当該分野で周知の任意の方法を含む。いくつかの実施態様において、フコースは、実施例１に記載の方法により検出される。いくつかの実施態様において、フコースは、複数のアフコシル化抗体を含む組成物において不検出である。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗体は、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する増強された親和性を有する。

【0062】

「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。標準的な補体の活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の、同起源の抗原に結合する抗体（適切なサブクラス）への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるＣＤＣアッセイが実施されてもよい。改変Ｆｃ領域アミノ酸配列、及び増強又は低下したＣ１ｑ結合能を有する抗体は、米国特許第６１９４５５１号、米国特許第７９２３５３８号、米国特許第７９９４２９０号及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記載される。また、例えば、Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。

【0063】

本明細書で使用される用語「実質的に類似」又は「実質的に同じ」は、当業者が、２以上の数値の間の差異が、前記値によって測定される生物学的特性という脈絡の中で、ほとんど又は全く生物学的及び／又は統計学的有意性がないと考えるであろうほどの、２以上の数値の間の十分に高い類似性を意味する。いくつかの実施態様において、２以上の実質的に類似する値は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％の何れか未満で異なる。

【0064】

本明細書で使用される用語「実質的に低下した」又は「実質的に異なる」は、当業者が、２つの数値の間の差異が、前記値によって測定される生物学的特性という脈絡の中で、統計学的有意性を認めるほどの、２つの数値の間の十分に高い相違を意味する。いくつかの実施態様において、２つの実質的に異なる値は、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の何れかより高く異なる。

【0065】

用語「リーダー配列」及び「シグナル配列」は、区別なく用いられ、哺乳動物細胞由来のポリペプチドの分泌を促進するポリペプチドのＮ末端に位置するアミノ酸残基の配列を指す。リーダー配列は、成熟タンパク質を形成するとき、哺乳動物細胞由来のポリペプチドの移行に際し切断されてもよい。リーダー配列は、天然又は合成であってもよく、付着する相手のタンパク質に対し、異種性であっても同種性であってもよい。

【0066】

「天然型の配列」のポリペプチドは、自然界に見出されるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然型の配列のポリペプチドは、任意の動物に由来する、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。そのような天然型の配列のポリペプチドは、自然界から単離され得、又は、組換え技術又は合成手段によって製造され得る。用語「天然型の配列」のポリペプチドは、特に、天然に存在する、短鎖化型又は分泌型のポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異体フォーム（例えば、代替的にスプライシングされたフォーム）、及び天然に存在するポリペプチドの対立遺伝子変異体を包含する。

【0067】

ポリペプチドの「変異体」は、必要に応じ、配列をアライメントし、ギャップを挿入して、最大パーセントの配列同一性を達成した後、かつ、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない状態で、天然型の配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体は、例えば、ポリペプチドのＮ又はＣ末端で１以上のアミノ酸残基が付加され又は欠失しているポリペプチドを含む。いくつかの実施態様において、変異体は、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施態様において、変異体は、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施態様において、変異体は、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0068】

本明細書において、ペプチド、ポリペプチド、又は抗体配列に関し、「アミノ酸配列同一性のパーセンテージ（％）」及び「相同性」は、必要に応じ、配列をアライメントし、ギャップを挿入して、最大パーセントの配列同一性を達成した後、かつ、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない状態で、特定のペプチド又はポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（DNASTAR）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0069】

アミノ酸置換は、ポリペプチドにおける１アミノ酸の、他のアミノ酸との置換を含んでもよいが、これに限定されない。保存的置換は、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。

【0070】

アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（２）中性の親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（３）酸性：Asp、Glu;
（４）塩基性：His、Lys、Arg;
（５）鎖配向に影響する残基：Gly、Pro;
（６）芳香族:Trp、Tyr、Phe.

【0071】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。

【0072】

用語「ベクター」は、宿主細胞中で増幅され得るクローン化ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド（複数）を含むように操作されてもよいポリヌクレオチドを説明するために用いられる。ベクターは、以下の１以上の要素を含んでもよい：複製起点、目的のポリペプチドの発現を調節する、１以上の調節配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）、及び／又は１以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、及び例えばβガラクトシダーゼのような、比色アッセイにおいて使用されてもよい遺伝子）。用語「発現ベクター」は、宿主細胞において、目的のポリペプチドを発現させるために使用されるベクターを指す。

【0073】

「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントになってもよい、又はレシピエントになった、細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。例示的な真核細胞は、霊長類又は非霊長類細胞等の哺乳動物細胞；酵母等の菌類細胞；植物細胞；及び昆虫細胞等を含む。非限定的例示的哺乳動物細胞は、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Crucell）、及び２９３及びＣＨＯ細胞、及び、それらの改変細胞である、例えば、それぞれ２９３－６Ｅ及びＤＧ４４等の細胞を含むが、これらに限定されない。

【0074】

用語「単離された」は、典型的に共に自然界で見出される又は産生される少なくとも一部の成分から、分離された分子を指す。例えば、細胞が産生された細胞の、少なくとも一部の成分から分離された場合、ポリペプチドは「単離された」といえる。発現後に細胞により分泌されたポリペプチドの場合、ポリペプチドを産生する細胞からポリペプチドを含む上清を物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」ことと考えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、自然界に典型的に見出される、より大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ）の一部でない場合、又は、例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドを産生する細胞の少なくとも一部の成分から分離された場合、「単離された」という。従って、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」といってもよい。

【0075】

用語「個体」又は「対象」は、本明細書において区別なく用いられ、例えば、哺乳動物等の動物を指す。いくつかの実施態様において、哺乳動物の処置の方法を提供し、哺乳動物は、ヒト、げっ歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、実験哺乳動物、家畜哺乳動物、競技用哺乳動物、及び愛玩哺乳動物を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施例において、「個体」又は「対象」は、疾患又は障害の処置を必要とする個体又は対象を指す。

【0076】

「疾患」又は「障害」は、処置が必要とされる健康状態を指す。

【0077】

用語「がん」は、制御不能な細胞増殖、抑制不能な細胞成長、及びアポトーシスによる減少した細胞死に関連する悪性増殖性疾患を指す。いくつかの非限定的例示的がんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、及び食道がんから選択される。いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅は、ＦＧＦＲ２：ＣＥＮ１０（染色体１０セントロメア）比が＞３である。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含むがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を有するがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含むがんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍より高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、胃がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む胃がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含む胃がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含む胃がんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍より高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、胃がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、過剰発現は、ｍＲＮＡ過剰発現である。いくつかの実施態様において、過剰発現は、タンパク質過剰発現である。

【0078】

用語「腫瘍」は、本明細書において、異常に高いレベルの増殖及び成長を示す細胞群を指すために用いられる。腫瘍は、良性、前悪性、又は悪性であってもよく；悪性腫瘍細胞は、がん性である。腫瘍細胞は、固形腫瘍又はリンパ性腫瘍（ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｔｕｍｏｒ）細胞であってもよい。用語「腫瘍成長」は、本明細書において、それに伴う腫瘍サイズの増加をもたらす腫瘍を含む１以上細胞による増殖又は成長を指すために使用される。

【0079】

本明細書において、「処置」は、有益な又は所望の臨床的結果を得るための手法である。本明細書において、「処置」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための治療法の、任意の投与又は適用を包含する。本願発明の目的のために、有益な又は所望の臨床的結果は：１以上の症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の拡張の阻止又は遅延（例えば、肺又はリンパ節への転移等の、転移）、疾患の再発の阻止又は遅延、疾患の進行の遅延又は減速、病状の改善、疾患又は疾患の進行の阻止、疾患又はその進行の阻止又は減速、疾患進行の停止、及び寛解（部分寛解又は完全寛解に関わらず）、の任意の１以上を含むが、これらに限定されない。「処置」には、増殖関連疾患の病理学的帰結の低減も包含される。本願発明の方法は、処置の１以上の任意の態様を企図する。

【0080】

がんに関連し、用語「処置する」は、腫瘍細胞又はがん細胞の成長を阻害すること、腫瘍細胞またはがん細胞の複製を阻害すること、腫瘍の全体量を減少させること、及び、疾患に関連する１以上の症状を改善させること、の任意の１又は全てを含む。

【0081】

用語「阻害」又は「阻害する」は、任意の表現型特性の低下又は停止、又はその特性の発生率、程度、又は見込みの低下又は停止を指す。「低下する」又は「阻害する」ことは、活性、機能、及び／又は量を、参照と比較して、減少、低下、又は停止させることを指す。特定の実施態様において、「低下する」又は「阻害する」により、20%以上の全体的な低下をもたらす能力を意味する。別の実施態様において、「低下する」又は「阻害する」により、５０％以上の全体的な低下をもたらす能力を意味する。更に別の実施態様において、「低下する」又は「阻害する」により、７５％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の全体的な低下をもたらす能力を意味する。

【0082】

本明細書において、「参照」は、比較のために使用される、任意の試料、標準、又はレベルを指す。参照は、健常及び／又は非疾患性試料から取得されてもよい。いくつかの実施例において、参照は、非処置試料から取得されてもよい。いくつかの実施例において、参照は、対象個体の非処置又は非疾患性試料から取得されてもよい。いくつかの実施例において、参照は、対象又は患者でない、１以上の健常個体から取得される。

【0083】

本明細書において、「疾患進行の遅延」は、その疾患（がん等の）の進行を妨げること、減速させること、遅らせること、抑制すること、及び／又は延期することを意味する。遅延は、疾患歴及び／又は処置される個体によって、異なる長さの時間であり得る。当業者に明白なように、十分な又は顕著な遅延は、事実上、個体が疾患を進行させない、阻止を含む。例えば、進行がん又は転移がん等の後期がんが、遅延されてもよい。

【0084】

本明細書において、「阻止すること」は、疾患に罹患しやすいが、その疾患と診断されたことのない、対象における疾患の発生又は再発に関し、予防を提供することを含む。

【0085】

本明細書において、機能又は活性を「抑制する」ことは、目的の条件又はパラメーター以外が同じ条件の場合と比較した場合、又は、別の条件と比較した場合、機能又は活性を低下させることである。例えば、腫瘍成長を低下させる抗体は、抗体が存在しない条件下の腫瘍の成長速度と比較して、腫瘍の成長速度を低下させる。

【0086】

薬剤の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。

【0087】

本願発明の物質／分子、アゴニスト、又はアンタゴニストの「治療的有効量」は、個体の病状、年齢、性別及び体重、また、個体における所望の反応を引き出すための本発明の物質／分子、アゴニスト、又はアンタゴニストの能力等の要因によって変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子、アゴニスト、又はアンタゴニストの毒性又は有害作用よりも治療的に有益な作用が上回る量である。治療的有効量は、１以上の投与により送達されてもよい。

【0088】

「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。必ずではないが、通常、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に対象に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。

【0089】

用語「薬学的製剤」及び「薬学的組成物」は、有効な活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する対象にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌されていてもよい。

【0090】

「薬学的に許容可能な担体」は、対象への投与のために、薬学的組成物を共に含む治療剤と共に使用するために、当該技術分野で従来から使用される、非毒固体、半固体、又は液体の賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、処方助剤、又は担体を指す。薬学的に許容可能な担体は、レシピエントに対し、その使用される用量及び濃度において非毒性であり、かつ、製剤の他の成分と適合性を有する。薬学的に許容可能な担体は、使用される製剤のために好適である。

【0091】

「滅菌された」製剤は、無菌であり、又は基本的に生きた微生物及びその胞子を含まない。

【0092】

１以上の更なる治療剤「との組合せ」投与は、任意の順序での、同時の（並行した）、及び連続した、又は順次的な投与を含む。

【0093】

用語「同時の」は、本明細書において、２以上の治療剤を投与することを指すために使用され、ここで、少なくとも投与の一部は時間的に重複し、又は１の治療剤の投与は他の治療剤の投与に比較して短い時間で行われる。例えば、２以上の治療剤は、例えば、約３０、１５、１０、５、又は１分の何れか未満である、約６０分未満の分離時間で投与される。

【0094】

用語「順次的な」は、本明細書において、２以上の治療剤の投与を指すために使用され、１以上の薬剤の投与は、１以上の他の薬剤の投与の中断後に継続する。例えば、２以上の治療剤は、約２０、３０、４０、５０、又は６０分、１日、２日、３日、１週間、２週間、又は１ヶ月、又はそれ以上の何れか等の、約１５分より長い分離時間で投与される。

【0095】

本明細書において、「併用して」は、他の処置手段に加え、ある処置手段を投与することを指す。そのように、「併用して」は、対象に対し、他の処置手段の投与前、投与中、投与後に、ある処置手段を投与することを指す。

【0096】

用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、このような治療製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、組合せ療法、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。

【0097】

「製品」は、任意の製品（例えば、包装品又は容器）、又は、疾患又は障害（例えば、がん）を処置するための医薬等の少なくとも１の薬品、又は本明細書に記載のバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含むキットである。特定の実施態様において、製品又はキットは、本明細書に記載の方法を実施するための単位で、販売促進され、流通され、又は販売される。

【0098】

ＩＩ．抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体
いくつかの実施態様において、本願発明は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対するように指向されたアフコシル化抗体を提供する。アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、本明細書に記載の、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、及び重鎖及び／又は軽鎖ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）を含む抗体を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、本発明は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する単離されたアフコシル化抗体を提供する。特定の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ活性を調節する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する増強された親和性を有する。

【0099】

抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、本明細書の実施例に記載の「αＦＧＦＲ２ｂ」を指し、かつ、配列リストは、２０１２年１月２４日発行の米国特許第８１０１７２３号のＨｕＧＡＬ－ＦＲ２１抗体と同一のアミノ酸配列を有する。米国特許第８１０１７２３号は、特に、任意の目的のために引用により本明細書に援用され、かつ、ＨｕＧＡＬ－ＦＲ２１の可変領域及び完全長の成熟抗体鎖のアミノ酸配列を示す、米国特許第８１０１７２３号の図１３及び１４は、特に、任意の目的のために引用により本明細書に援用される。加えて、米国特許第８１０１７２３号の図１３において下線で示されるＨｕＧＡＬ－ＦＲ２１抗体のＨＶＲ配列は、特に、任意の目的のために、本明細書に援用される。

【0100】

ある実施態様において、本願発明は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６つのＨＶＲ（例えばＣＤＲ）を含むアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを提供する。

【0101】

いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、重鎖可変領域を含む少なくとも１の重鎖及び重鎖定常領域の少なくとも一部、及び軽鎖可変領域を含む少なくとも１の軽鎖及び軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、各重鎖が重鎖可変領域及び重鎖定常領域の少なくとも一部を含む、２つの重鎖、及び、各軽鎖が軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む、２つの軽鎖を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0102】

ある実施態様において、本願発明は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、６つのＨＶＲを含むアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を提供する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、上記６つのＨＶＲを含み、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、上記６つのＨＶＲを含み、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、かつ、増強されたＡＤＣＣ活性、及びＦｃガンマＲＩＩＩＡ（例えばＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及び／又はＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８））に対する増強された親和性から選択される少なくとも１の活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合しない。

【0103】

ある実施態様において、本願発明は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、６つのＨＶＲを含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体と競合する、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を提供する。

【0104】

ある実施態様において、本願発明は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１、少なくとも２、又は３つ全てのＶ_Ｈ ＨＶＲ配列を含むアフコシル化抗体を提供する。

【0105】

別の実施態様において、本願発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１、少なくとも２、又は３つ全てのＶ_Ｌ ＨＶＲ配列を含むアフコシル化抗体を提供する。

【0106】

別の実施態様において、本願発明のアフコシル化抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１、少なくとも２、又は３つ全てのＶ_Ｈ ＨＶＲ配列を含むＶ_Ｈ ドメイン；及び（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は３つ全てのＶ_ＬＨＶＲ配列を含むＶ_Ｌドメイン、を含む。

【0107】

別の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶ_Ｈ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂへ結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、配列番号４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号５のＶ_Ｈ配列を含む。特定の実施態様において、Ｖ_Ｈは、以下から選択される１、２、又は３つのＨＶＲを含む：（Ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３。

【0108】

別の実施態様において、配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が提供される。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶ_Ｌ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、配列番号５において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号４のＶ_Ｌ配列を含む。特定の実施態様において、Ｖ_Ｌは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１、２、又は３つのＨＶＲ配列を含む。

【0109】

別の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）配列、及び配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するＶ_Ｈ配列は、参照配列に対し、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含み、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するＶ_Ｌ配列は、参照配列に対し、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、配列番号４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、配列番号５において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、一方又は両方の配列の翻訳後修飾を含む、配列番号４のＶ_Ｈ配列及び配列番号５Ｖ_Ｌ配列を含む。特定の実施態様において、Ｖ_Ｈは、以下から選択される１、２、又は３つのＨＶＲを含む：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；及びＶ_Ｌは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される１、２、又は３つのＨＶＲ配列を含む。

【0110】

別の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶ_Ｈ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶ_Ｌを含む。別の実施態様において、抗体は、それらの配列の翻訳後修飾を含む、それぞれ配列番号４及び配列番号５であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む。

【0111】

別の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含むアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、配列番号２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体重鎖は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号２におけるＶ_Ｈ配列を含む。特定の実施態様において、重鎖は、以下から選択される１、２、又は３つのＨＶＲを含む：（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３。

【0112】

別の実施態様において、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、配列番号３において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の軽鎖は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号３のＶ_Ｌ配列を含む。特定の実施態様において、軽鎖は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１、２、又は３つのＨＶＲ配列を含む。

【0113】

別の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖配列、及び配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する軽鎖配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、そのような抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合せずに、選択的にＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する能力を保持する。特定の実施態様において、配列番号２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、配列番号３において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。特定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体重鎖は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号２におけるＶ_Ｈ配列を含み、かつアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体軽鎖は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号３におけるＶ_Ｌ配列を含む。特定の実施態様において、重鎖は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される１、２、又は３つのＨＶＲを含み；かつ軽鎖は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される１、２、又は３つのＨＶＲ配列を含む。

【0114】

例示的キメラ抗体
特定の実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗体等の抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第 4,816,567号；及び Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0115】

非限定的例示的アフコシル化キメラ抗体は、本明細書に記載の重鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３及び／又は軽鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３配列を含むキメラ抗体を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、上記可変領域を含み、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する。いくつかの実施態様において、アフコシル化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、上記可変領域を含み、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、かつ、増強されたＡＤＣＣ活性、及びＦｃガンマＲＩＩＩＡ（例えばＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及び／又はＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８））に対する増強された親和性から選択される少なくとも１の活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合しない。

【0116】

いくつかの実施態様において、アフコシル化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、配列番号４に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施態様において、アフコシ化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、配列番号５に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、配列番号４に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む重鎖、及び配列番号５に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む軽鎖を含む。

【0117】

例示的アフコシル化キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、また、本明細書に記載の抗体又はその断片とＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合について競合するキメラ抗体を含む。従って、いくつかの実施態様において、キメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合について競合するように提供される。いくつかの実施態様において、抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂへの結合について競合するが、ＦＧＦＲ２ＩＩＩには結合しない。

【0118】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のキメラ抗体は、１以上のヒト定常領域を含む。いくつかの実施態様において、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＤから選択されるアイソタイプのものである。いくつかの実施態様において、ヒト軽鎖定常領域は、κ及びλから選択されるアイソタイプのものである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域及びヒトκ軽鎖を含む。

【0119】

上記のように、エフェクター機能が所望であるか否かに関わらず、特定の抗体を対象にした特定の処置方法に依存してもよい。従って、いくつかの実施態様において、エフェクター機能が所望である場合、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、又はヒトＩｇＧ３重鎖定常領域を含むキメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が選択される。従って、いくつかの実施態様において、エフェクター機能が所望でない場合、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ２重鎖定常領域を含むキメラ抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が選択される。

【0120】

例示的ヒト化抗体
いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合するアフコシル化ヒト化抗体が提供される。ヒト化抗体は、治療用抗体に対する免疫応答をもたらし、かつ治療の効果を低下させる、非ヒト抗体に対するヒト免疫応答（例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答）を、低下させ又は除去するので、ヒト化抗体は、治療用分子として有効である。

【0121】

特定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低下させるために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は、例えばＣＤＲ等のＨＶＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、かつ、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、１以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）における、対応する残基により置換されている。

【0122】

ヒト化抗体、及びヒト化抗体を作製する方法は、例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633に概説され、また、例えば、Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033;米国特許第５８２１３３７号、７５２７７９１号、６９８２３２１号、及び７０８７４０９号； Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 （ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングを記載）; Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498 (「表面再構成」を記載); Dall’Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60（「ＦＲ シャフリング」を記載）;及びOsbourn et al., (2005) Methods 36:61-68 and Klimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260 （ＦＲシャフリングに対する「ガイデッド・セレクション（guided selection）」法を記載）に更に記載されている。

【0123】

ヒト化に使用されてもよいヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット（best-fit）」法（例えば、Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296 (2296)参照)を使用して選択されるフレームワーク領域； 軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；及びPresta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623参照)；ヒト成熟 (体細胞変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633 参照）；及びFRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684及びRosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618参照）を含むが、これらに限定されない。

【0124】

非限定的例示的ヒト化抗体は、本明細書に記載のαＦＧＦＲ２ｂを含む。非限定的例示的アフコシル化ヒト化抗体は、フコースを含むαＦＧＦＲ２ｂと同一のアミノ酸配列を有する、本明細書に記載のαＦＧＦＲ２ｂＡを含む。非限定的例示的アフコシル化ヒト化抗体は、また、αＦＧＦＲ２ｂの重鎖可変領域、及び／又はαＦＧＦＲ２ｂの軽鎖可変領域を含む抗体を含む。非限定的例示的アフコシル化ヒト化抗体は、配列番号４の重鎖可変領域及び／又は配列番号５の軽鎖可変領域を含む抗体を含む。例示的なヒト化抗体は、また、αＦＧＦＲ２ｂの重鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３、及び／又は軽鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３を含むヒト化抗体を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、上記ＨＶＲを含み（すなわち、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３）、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合する。いくつかの実施態様において、ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、上記ＨＶＲを含み、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、かつ、増強されたＡＤＣＣ活性、及びＦｃガンマＲＩＩＩＡ（例えばＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及び／又はＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８））に対する増強された親和性から選択される少なくとも１の活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合しない。

【0125】

いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗体は、また、αＦＧＦＲ２ｂの重鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３、及び／又は軽鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３を含む。非限定的例示的アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号６、７、及び８に記載の重鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３のセットを含む抗体を含む。非限定的例示的アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、配列番号９、１０、及び１１に記載の軽鎖ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、及びＨＶＲ３のセットを含む抗体を含む。

【0126】

いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、配列番号４に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、配列番号５に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも ９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに結合し、配列番号４に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む重鎖、及び配列番号５に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である可変領域配列を含む軽鎖を含む。

【0127】

いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、本明細書に記載の、少なくとも１つのＨＶＲを含む。つまり、いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、本明細書に記載の重鎖ＨＶＲ１、本明細書に記載の重鎖ＨＶＲ２、本明細書に記載の重鎖ＨＶＲ３、本明細書に記載の軽鎖ＨＶＲ１、本明細書に記載のＨＶＲ２、本明細書に記載のＨＶＲ３を含む。更に、いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、本明細書に記載のＨＶＲに基づく少なくとも１つの変異ＨＶＲを含み、変異ＨＶＲは本明細書に記載のＨＶＲに対し１、２、３、又は４アミノ酸置換を有する。いくつかの実施態様において、１以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。当業者は、特定のＨＶＲ配列に対し１以上の好適な保存的アミノ酸を選択することができ、ここで、好適な保存的アミノ酸置換は、変異ＨＶＲを含む抗体の結合特性を特異的に変化させることは予測されない。

【0128】

例示的アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、また、本明細書に記載の抗体又はその断片とＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合について競合する抗体を含む。従って、いくつかの実施態様において、ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合についてαＦＧＦＲ２ｂと競合するように提供される。いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合についてαＦＧＦＲ２ｂと競合するように提供され、かつ、増強されたＡＤＣＣ活性、及びＦｃガンマＲＩＩＩＡ（例えばＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）及び／又はＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８））に対する増強された親和性から選択される少なくとも１の活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに結合しない。

【0129】

いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、本明細書に記載の、少なくとも１のヒト定常領域を含む。いくつかの実施態様において、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＤから選択されるアイソタイプのものである。いくつかの実施態様において、ヒト軽鎖定常領域は、κ及びλから選択されるアイソタイプのものである。

【0130】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化ヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域を含む。従って、いくつかの実施態様において、エフェクター機能が所望である場合、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はヒトＩｇＧ３重鎖定常領域を含むアフコシル化ヒト化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が選択される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化ヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化ヒト化抗体は、Ｎ２９７がフコシル化されていない、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化ヒト抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域及びヒトκ軽鎖を含む。

【0131】

いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化ヒト化抗体は、配列番号２のアミノ酸配列及び任意の翻訳後修飾からなる重鎖、及び配列番号３のアミノ酸配列及び任意の翻訳後修飾からなる軽鎖を含むアフコシル化抗体を含む。

【0132】

例示的抗体定常領域
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗体は、１以上のヒト定常領域を含む。いくつかの実施態様において、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＤから選択されるアイソタイプのものである。いくつかの実施態様において、ヒト軽鎖定常領域は、κ及びλから選択されるアイソタイプのものである。

【0133】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域を含む。いくつかの実施態様において、エフェクター機能が所望である場合、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はヒトＩｇＧ３重鎖定常領域を含むアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体が選択される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗体は、Ｎ２９７がフコシル化されていない、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域及びヒトκ軽鎖を含む。

【0134】

本明細書及び特許請求の範囲において、明示され又は当業者に周知ない限り、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、明示的に引用により本明細書に援用される、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. に示されるＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。

【0135】

特定の実施態様において、本願発明の抗体は、野生型ＩｇＧ又は野生型抗体に対し少なくとも１のアミノ酸置換を有する変異Ｆｃ領域を含む。特定の実施態様において、変異Ｆｃ領域は、野生型抗体のＦｃ領域において、２以上のアミノ酸置換を有する。特定の実施態様において、変異Ｆｃ領域は、野生型抗体のＦｃ領域において、３以上のアミノ酸置換を有する。特定の実施態様において、変異Ｆｃ領域は、本明細書に記載の、少なくとも１、２、又は３のＦｃ領域アミノ酸置換を有する。特定の実施態様において、本明細書における変異Ｆｃ領域は、天然型の配列のＦｃ領域と、及び／又は親抗体のＦｃ領域と、少なくとも約８０％の相同性を有するであろう。特定の実施態様において、本明細書における変異Ｆｃ領域は、天然型の配列のＦｃ領域と、及び／又は親抗体のＦｃ領域と、少なくとも約９０％の相同性を有するであろう。特定の実施態様において、本明細書における変異Ｆｃ領域は、天然型の配列のＦｃ領域と、及び／又は親抗体のＦｃ領域と、少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。

【0136】

特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加または低下させるように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の追加又は除去は、１以上のグリコシル化部位が作成又は除去されたアミノ酸配列を変更することにより、簡便に行われてもよい。

【0137】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する炭水化物が変更されてもよい。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ－結合により一般的に付着した、分岐した、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al.TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われてもよい。

【0138】

ある実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着したフコースを欠いた炭水化物構造（すなわち、アフコシル化抗体）を有するよう提供される。例えば、複数のそのような抗体を含む組成物におけるフコースの量は、０％から約５％であってもよい。いくつかの実施態様において、複数のそのような抗体は、少なくとも９５％のアフコシル化抗体を含む。フコースの量は、Ａｓｎ２９７に付着する全糖構造体の総量に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）を計算することにより決定される。抗体におけるフコースを検出する非限定的例示的方法は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号参照）、蛍光標識された遊離オリゴ糖のＨＰＬＣ法（例えば、Schneider et al., “N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection,” Agilent Technologies, Inc. (2012); Lines, J. Pharm. Biomed. Analysis, 14: 601-608 (1996); Takahasi, J. Chrom., 720: 217-225 (1996)参照）、蛍光標識された遊離オリゴ糖のキャピラリー電気泳動法 （例えば、Ma et al., Anal. Chem., 71: 5185-5192 (1999)参照）、及び単糖組成物測定のための、パルスドアンペロメトリ検出を伴うＨＰＬＣ（例えば、Hardy, et al., Analytical Biochem., 170: 54-62 (1988)参照）を含む。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７位に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、２９７位の±３残基上流又は下流のアミノ酸に位置してもよく、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、２９４位と３００位の間に位置してもよい。本明細書に記載の抗体αＦＧＦＲ２ｂにおいて、Ａｓｎ２９７は、配列ＱＹＮＳＴに見出され、かつ、下記配列の表で、配列番号２に太字及び下線で示される。フコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させていてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）を参照のこと。「アフコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。アフコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号、Adams et al., 特に実施例１１）、及びノックアウトＣＨＯ細胞等の、機能的アルファ－１、６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８を欠くノックアウト細胞株(例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006);及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)が含まれる。

【0139】

抗体は、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された、二分岐オリゴ糖とともに更に提供される。このような抗体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善していてもよい。そのような抗体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号 (Jean-Mairet et al.);米国特許第６６０６８４号(Umana et al.);及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）に記載されている。Fc領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体も提供される。このような抗体はＣＤＣ機能が改善されていてもよい。このような抗体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）;国際公開第１９９８／５８９６４号 (Raju, S.); 及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。

【0140】

抗体は、また、アミノ末端リーダー伸長と共に提供される。例えば、アミノ末端リーダー配列の１以上のアミノ酸残基は、抗体の重鎖又は軽鎖の１以上の任意の末端に存在する。例示的なアミノ末端リーダー伸長は、抗体の１又は両方の軽鎖に存在する、３つのアミノ酸残基、ＶＨＳ、を含む、又はからなる。

【0141】

ヒトＦｃＲｎ抗親和性結合ポリペプチドのインビボ又は血清半減期は、例えば、変異Ｆｃ領域を伴うポリペプチドが投与される、遺伝子組換えマウスにおいて、ヒトにおいて、又は非ヒト霊長類において、分析される。例えば、Petkova et al. International Immunology 18(12):1759-1769 (2006)を参照のこと。

【0142】

いくつかの実施態様において、アフコシル化抗体は、フコースを含む親抗体よりも効果的に、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣを媒介し、通常ＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載のように、インビトロのＡＤＣＣ活性を使用して決定されてもよいが、例えば、動物モデル等のＡＤＣＣ活性を決定するための他のアッセイ又は方法が企図される。

【0143】

特定の実施態様において、抗体の「Ｋ_Ｄ」、「Ｋ_ｄ」、「Ｋｄ」、又は「Ｋｄ値」は、約１０反応単位(ＲＵ)で固定した抗原ＣＭ５チップを用い、２５℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)-２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIACORE Inc.)を、供給業者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μＬ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。反応速度論的な測定のために、完全長抗体などのポリペプチドの段階希釈液が、２５℃、およそ２５μＬ／分の流速で、０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０(商標）界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入される。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル(BIACORE（登録商標）Evaluation Software version 3.2)を用いて、会合速度(ｋ_ｏｎ)と解離速度(ｋ_ｏｆｆ)を算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０^６Ｍ^－１ｓ^－１を上回る場合、会合速度は、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗－抗原抗体の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；吸収＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定することができる。

【0144】

上記「会合速度（「on-rate」、「rate of association」、「association rate」、又は「k_on」）」は、また、上記ＢＩＡＣＯＲＥ （登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００システム（BlAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して決定され得る。

【0145】

特定の実施態様において、前記２つの値の間の差異（例えば、Ｋｄ値）は、実質的に同一であり、例えば、参照／比較値の関数は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。

【0146】

特定の実施態様において、前記２つの値の間の差異（例えば、Ｋｄ値）は、実質的に相違し、例えば、参照／比較分子の関数は、約１０％より高い、約２０％より高い、約３０％より高い、約４０％より高い、及び／又は約５０％より高い。

【0147】

例示的リーダー配列
一部の分泌タンパク質が大量に発現し、かつ分泌されるために、異種タンパク質由来のリーダー配列が望ましい。いくつかの実施態様において、リーダー配列が分泌プロセスでＥＲ内で除去されるときに、得られる成熟ポリペプチドが改変されないままであり得るという点で、異種リーダー配列は、有利であるかもしれない。追加の異種リーダー配列は、いくつかのタンパク質を発現し、かつ分泌するために必要とされるかもしれない。

【0148】

特定の例示的リーダー配列の配列は、例えば、Department of Biochemistry, National University of Singaporeにより維持されるオンラインのリーダー配列データベースに示されている。Choo et al., BMC Bioinformatics, 6: 249 (2005);及び国際公開第２００６／０８１４３０号を参照のこと。

【0149】

ＩＩＩ．アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の特性
いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、インビトロ及び／又はインビボでの増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、インビトロでの増強されたＡＤＣＣ活性を有する。いくつかの実施態様において、インビトロでのＡＤＣＣ活性は、本明細書の、例えば実施例３に記載の方法により決定される。簡潔に言うと、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現細胞は、エフェクター（ＰＢＭＣ）対標的細胞が２５：１の比で、フコシル化抗体又はアフコシル化抗体の存在下で、単離されたばかりのヒトＰＢＭＣと接触せしめられる。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現Ｂａ／Ｆ３細胞が、標的細胞として使用される。いくつかの実施態様において、細胞傷害性は、ＣｙｔｏＴｏｘ非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を使用して、ＬＤＨ放出を定量することで決定される。いくつかの実施態様において、最大溶解は、５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を用いて決定され、自然放出は、抗体の非存在下で決定された。いくつかの実施態様において、特異的溶解のパーセンテージは、以下の式により決定されてもよい：（実験値-自然放出）／（最大値－自然放出）×１００＝特異的溶解（％）。いくつかの実施態様において、増強されたＡＤＣＣを有するアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、試験された少なくとも１の濃度において、同量のフコシル化抗体による特異的溶解よりも、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、又は少なくとも７５パーセントポイント高い特異的溶解をもたらす。いくつかの実施態様において、増強されたＡＤＣＣを有するアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、試験された少なくとも１の濃度において、同量のフコシル化抗体による特異的溶解よりも、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、又は少なくとも７５パーセントポイント高い特異的溶解をもたらし、ここで、各抗体の濃度は０．０１から１μｇ／ｍｌであり、かつ標的細胞は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現Ｂａ／Ｆ３細胞である。いくつかの実施態様において、抗体の濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、又は１μｇ／ｍｌである。

【0150】

いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する増強された親和性を有する。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する抗体親和性は、例えば、本明細書の実施例２、及び／又は以下に記載される表面プラズモン共鳴アッセイを使用して決定される。以下の記載はＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）についてあるが、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）に対する親和性の決定のためにも好適である。簡潔に言うと、いくつかの実施態様において、フコシル化又はアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、プロテインＡコーティングされたデキストランチップに捕捉される。ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）（例えばR&D Systemsから入手可能）は、様々な濃度で注入される。フコシル化及びアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）の結合定数、解離定数、及び親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴システム（例えば、Biacore T200 Evaluation Software 1:1 binding model)を提供するソフトウェアを用い、決定されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（例えばＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）又はＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８））に対する増強された親和性を有するアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、又は少なくとも２０倍高い親和性でＦｃガンマＲＩＩＩＡに結合する。例えば、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、９．２ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に結合し、かつ、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、２０７ｎＭの親和性（Ｋ_Ｄ）でＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に結合し、そして、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体よりも２０７／９．２＝２２．５倍高い親和性でＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に結合する。

【0151】

ＩＶ．抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体発現及び産生
抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体をコードする核酸分子
抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の１以上の鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。いくつかの実施態様において、核酸分子は、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、核酸分子は、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の、重鎖をコードするポリヌクレオチド及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。いくつかの実施態様において、第１核酸分子は重鎖をコードする第１ポリヌクレオチドを含み、かつ第２核酸分子は軽鎖をコードする第２ポリヌクレオチドを含む。

【0152】

いくつかのそのような実施態様において、重鎖及び軽鎖は、２つの別々のポリペプチドとして、１つの核酸分子から、又は、２つの別々の核酸分子から、発現される。いくつかの実施態様において、抗体がｓｃＦｖであるような場合、単一のポリヌクレオチドが互いに結合する重鎖及び軽鎖を含む単一のポリペプチドをコードする。

【0153】

いくつかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、翻訳されるとき重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置する、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。上記のように、リーダー配列は、天然型の重鎖又は軽鎖リーダー配列であってもよく、又は、別の異種リーダー配列であってもよい。

【0154】

核酸分子は、当該技術分野での従来法である組換えＤＮＡ技術を使用して構築されてもよい。いくつかの実施態様において、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現のために好適な発現ベクターである。

【0155】

ベクター
抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ重鎖及び／又は抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。また、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ重鎖及び／又は抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。そのようなベクターは、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、ベクターは、重鎖をコードする第１ポリヌクレオチド配列、及び軽鎖をコードする第２ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、重鎖及び軽鎖は、２つの別々のポリペプチドとして、ベクターから発現する。いくつかの実施態様において、重鎖及び軽鎖は、例えば、抗体がｓｃＦｖである場合等に、単一のポリペプチドの一部として発現される。

【0156】

いくつかの実施態様において、第１ベクターは重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ第２ベクターは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、第１ベクター及び第２ベクターは、同量（近いモル量又は近い質量）で、宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施態様において、５：１から１：５のモル又は質量比の第１ベクター及び第２ベクターが宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施態様において、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターについて、１：１から１：５の質量比が使用される。いくつかの実施態様において、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターについて、１：２の質量比が使用される。

【0157】

いくつかの実施態様において、ベクターは、ＣＨＯ、又はＣＨＯ由来細胞、又はＮＳＯ細胞において、ポリペプチドの発現のために最適化されるように、選択される。例示的な、そのようなベクターは、例えば、Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)に記載されている。

【0158】

宿主細胞
様々な実施態様において、抗FGFR2IIIb重鎖及び／又は抗FGFR2IIIb軽鎖は、細菌細胞等の原核細胞、菌細胞等の真核細胞（例えば、酵母）、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞において発現されてもよい。そのような発現は、例えば、当該技術分野で周知の手順に従って実施される。ポリペプチドを発現するために使用されてもよい例示的な真核細胞は、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４．Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、及びＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞(Crucell)；及びＮＳＯ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ重鎖及び／又は抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ軽鎖は、酵母において発現されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４ Ａ１号を参照のこと。いくつかの実施態様において、特定の真核宿主細胞は、所望の翻訳後修飾を、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ重鎖及び／又は抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ軽鎖に付加できる能力に基づき、選択される。例えば、いくつかの実施態様において、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞において産生された同一ポリペプチドよりも、高レベルのシアル酸付加を有するポリペプチドを産生する。

【0159】

１以上の核酸の所望の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介トランスフェクション法、陰イオン脂質仲介トランスフェクション法、エレクトロポーテーション法、トランスダクション法、インフェクション等を含むが、これらに限定されない、任意の方法により実施されてもよい。非限定的例示的方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。核酸は、任意の好適な方法に従い、一過的に又は安定的に所望の宿主細胞にトランスフェクトされてもよい。

【0160】

いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、例えば、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Presta, L;及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号、Adams et al., 特に実施例１１）、及びノックアウトＣＨＯ細胞等の、機能的アルファ－１,６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８を欠くノックアウト細胞株（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006);及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)等のアフコシル化抗体を産生することが可能な細胞において、産生される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、機能的ＦＵＴ８遺伝子を欠くＣＨＯ細胞において産生される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（BioWa/Lonza, Allendale, NJ）において産生される。

【0161】

抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の精製
抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、任意の好適な方法により精製されてもよい。そのような方法は、親和性マトリクス又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用を含むが、これらに限定されない。好適な親和性リガンドは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂＥＣＤ、及び抗体定常領域に結合するリガンドを含む。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又は抗体アフィニティカラムが定常領域を結合するために、かつ、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を精製するために用いられてもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチル又はフェニルカラムも、また、いくつかのポリペプチドを精製するために好適である。ポリペプチドを精製する数多くの方法が、当該技術分野で周知である。

【0162】

抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の無細胞産生
いくつかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、無細胞系で産生される。非限定的例示的無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載されている。

【0163】

Ｖ．治療用組成物及び方法
抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を使用した疾患治療方法
本願発明の抗体、及び本願発明の抗体を含む組成物は、ヒト又は動物のための処置方法における使用のために提供される。アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を投与することを含む、疾患を処置する方法が、また、提供される。アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を用いて処置され得る非限定的例示的疾患は、がんを含むが、これに限定されない。いくつかの実施態様において、アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。いくつかの実施態様において、がんは、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、及び食道がんから選択される。いくつかの実施態様において、アフコシル化された抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を投与することを含む、胃がんを処置する方法が提供される。

【0164】

いくつかの実施態様において、がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含むがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含むがんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含むがんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍より高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、胃がんはＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含む胃がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含む胃がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃよりもＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを多く過剰発現する。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅を含む胃がんは、標準化されたＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現レベルよりも、２倍、３倍、５倍、又は１０倍より高い標準化されたレベルでＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを発現する。いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＧＵＳＢに対し標準化されている。いくつかの実施態様において、胃がんは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを過剰発現するが、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅を含まない。いくつかの実施態様において、過剰発現は、ｍＲＮＡ過剰発現である。いくつかの実施態様において、過剰発現は、タンパク質過剰発現である。

【0165】

ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ遺伝子増幅は、インサイツ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を含むがこれに限定されない、当該技術分野での任意の好適な方法により決定されてもよい。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ２増幅は、ＦＧＦＲ２：ＣＥＮ１０（染色体１０セントロメア）比が＞３である。

【0166】

ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ ｍＲＮＡ過剰発現は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む方法を含むがこれに限定されない、当該技術分野での任意の好適な方法により決定されてもよい。用語「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ ｍＲＮＡ過剰発現」は、増加したＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ ｍＲＮＡレベルの原因にかかわらず（すなわち、転写の増加により及び／又はｍＲＮＡの分解の低下により、他の機構により、又は機構の組合せにより、レベルの増加がもたらされるか否かにかかわらず）増加したレベルが、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ ｍＲＮＡの増加したレベルを意味する。

【0167】

ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂタンパク質過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）等の抗体ベースの方法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野での任意の好適な方法により決定されてもよい。いくつかの実施態様において、ＩＨＣ染色は、当該技術分野での方法に従って、スコア付けされる。用語「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂタンパク質過剰発現」は、増加したＦＧＦＲ２ＩＩＩｂタンパク質レベルの原因にかかわらず（すなわち、翻訳の増加により及び／又はタンパク質の分解の低下により、他の機構により、又は機構の組合せにより、レベルの増加がもたらされるか否かにかかわらず）増加したレベルが、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂタンパク質の増加したレベルを意味する。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の１＋、２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣによる、腫瘍細胞の２＋又は３＋の染色は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの過剰発現を示す。いくつかの実施態様において、ＩＨＣ染色は、実施例６に記載されるように、スコア付けされる。

【0168】

薬学的組成物
様々な実施態様において、アフコシル化抗体を含む組成物は、幅広い種類の薬学的に許容可能な担体と共に製剤中に提供される（例えば、Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)参照）。ビヒクル、アジュバント、及び希釈剤を含む、様々な薬学的に許容可能な担体が入手可能である。更に、例えば、pH調節及び緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤、等の様々な薬学的に許容可能な補助的物質が入手可能である。非限定的例示的担体は、生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せを含む。

【0169】

様々な実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む組成物は、例えば、植物油又はその他の油分、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸、又はプロピレングリコール等の水性又は非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁、乳化することにより；かつ、所望の場合、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、及び保存料等の従来使用される添加物と共に、皮下投与を含む注射のために製剤化されてもよい。様々な実施態様において、例えば、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容可能な推進剤を使用して、吸入のために製剤化されてもよい。組成物は、様々な実施態様において、生分解性又は非生分解性ポリマー等と共に、徐放マイクロカプセルに製剤化されてもよい。非限定的例示的生分解性製剤は、ポリ乳酸－グリコール酸ポリマーを含む。非限定的例示的非生分解性製剤は、ポリグリセリン脂肪酸エステルを含む。そのような製剤を製造するための特定の方法は、例えば、欧州特許出願公開公報１１２５５８４ Ａ１号に記載されている。

【0170】

投与ルート
様々な実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、経口、動脈内、非経口、鼻腔内、筋肉内、心内、脳室内、気管内、口腔、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び髄腔内、又は移植又は吸入による、様々なルートにより、インビボで投与されてもよい。対象の組成物は、固体、半固体、液体、又は気体の形態に製剤化されてもよく；形態は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、かん腸、注射、吸入、エアロゾルを含むが、これらに限定されない。好適な製剤及び投与ルートは、目的の適用に従って、選択されてもよい。

【0171】

薬学的組成物は、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、又は食道がん等のがんの処置又は予防のための有効量が投与される。治療的有効量は、典型的には、処置される対象の体重、彼又は彼女の身体状態又は健康状態、処置される健康状態の深刻性、又は処置される対象の年齢によるものである。通常、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、用量あたり、約１０μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与されてもよい。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、用量あたり、約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与されてもよい。いくつかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、用量あたり、約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与されてもよい。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、用量あたり、約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与されてもよい。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、用量あたり、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与されてもよい。

【0172】

アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の組成物は、対象の必要に応じて、投与されてもよい。投与頻度は、処置される健康状態、処置される対象の年齢、処置される健康状態の深刻さ、処置される対象の一般的健康状態等を考慮して、主治医等の当業者により決定されてもよい。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の有効用量が、１又は複数回、対象に投与される。様々な実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の有効用量が、１か月に１回、１か月に２回以上、例えば２か月に１回又は３か月に１回、対象に投与される。別の実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の有効用量が、例えば、１か月に１回未満、例えば２週間に１回又は毎週、対象に投与される。アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の有効用量が、少なくとも１回、対象に投与される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の有効用量は、少なくとも１か月、少なくとも６か月、又は少なくとも１年の期間に、複数回投与されてもよい。

【0173】

組合せ療法
アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、単独で、又は他の処置方法を伴って、投与されてもよい。それは、例えば、手術、化学療法、又は放射線療法等の他の処置方法の前に、実質的に同時に、又は後に提供されてもよい。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、他の抗がん剤と併用して投与される。アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体と共に投与されてもよい非限定的限定的抗がん剤は、白金剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）、ＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ（登録商標））、ＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵと組合わされたオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５－ＦＵ、及びイリノテカンの組合せ）、ロイコボリン、フルオロウラシル（５－ＦＵ、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標））、マイトマイシンＣ（ＭＩＴＯＺＹＴＲＥＸ（商標）、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、及びドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシンＰＦＳ、アドリアマイシンＲＤＦ、ＲＵＢＥＸ（登録商標））を含む。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、パクリタキセルと併用して投与される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、シスプラチン及び／又は５－ＦＵと併用して投与される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、シスプラチン及び５－ＦＵと併用して投与される。いくつかの実施態様において、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体は、ＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン、５－ＦＵ、及びロイコボリン）と併用して投与される。

【0174】

キット／製品
本願発明は、キット、医薬、組成物、及び、本明細書に記載の任意の方法のための単位用量形態を含む。

【0175】

本発明のキットは、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体（又は単位用量形態、及び／又は製品）を含む１以上の容器を含む。いくつかの実施態様において、１以上の追加の薬剤を伴い、又は伴わずに、アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を含む、既定量の組成物を含む、単位用量が提供される。いくつかの実施態様において、そのような単位用量は、注射のための、使い捨ての充填済みシリンジで提供される。様々な実施態様において、単位用量に含まれる組成物は、生理食塩水、ショ糖等；リン酸等のバッファーを含んでもよく；かつ／又は安定かつ有効なｐＨ範囲内に製剤化されてもよい。一方、いくつかの実施態様において、組成物は、例えば滅菌水等の好適な液体の添加によって再構成され得る、凍結乾燥粉末として提供されてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、ショ糖及びアルギニンを含むがこれに限定されない、タンパク質凝集を阻害する１以上の物質を含む。いくつかの実施態様において、本願発明の組成物は、ヘパリン及び／又はプロテオグリカンを含む。

【0176】

いくつかの実施態様において、本願発明のキットは、本明細書に記載の任意の方法に従って、例えば、がん（例えば、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、又は食道がん）の処置における使用説明書を更に含む。キットは、好適な個体又は処置を選択する説明を更に含む。本願発明のキットに添付される説明書は、典型的には、ラベル又はパッケージ挿入物に記載された説明（例えば、キットに含まれる紙）であるが、機械可読説明（例えば、磁気又は光学ディスクに保存された説明）もまた許容される。いくつかの実施態様において、キットは、他の治療剤を更に含む。

【0177】

本発明のキットは、適切に包装されている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラー又はビニール袋）等があるが、これらに限定されない。キットは、例えばバッファー及び解説等の追加の成分を、任意選択的に提供する。本願は、従って、バイアル（例えば密封バイアル）、ボトル、ジャー、フレキシブル包装等を含む製品も提供する。

【実施例】

【0178】

以下に記載の実施例は、単に本発明の例示であると意図されており、決して本発明を限定するものと考えられるべきではない。実施例は、以下の実施例が、全ての実施例、又は実行された実施例のみであることを説明することを意図するものではない。使用された数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確認するために、注意が払われてきているが、一部の実験的誤差及び偏差は、説明されるべきである。別途指示がない限り、部（parts）は重量部（parts by weight）、分子量は重量平均の分子量、温度は摂氏温度での温度、及び圧力は大気圧での又は大気圧付近での圧力である。

【0179】

実施例1：アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体の産生
発現ベクターの構築モノクローナル抗体αＦＧＦＲ２ｂの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードするヌクレオチド配列は、製造業者の説明書に従って、ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Lonza, Basel, Switzerland）にクローニングされた。システムにより、軽鎖及び重鎖の両方のための発現カセットを含むダブル遺伝子ベクター（ＤＧＶ）が作製された。

【0180】

宿主細胞株の選択アフコシル化モノクローナル抗体αＦＧＦＲ２ｂＡ（αＦＧＦＲ２ｂの後の「Ａ」は、「アフコシル化」を示す）を生成するために、宿主細胞として、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（BioWa/Lonza, Allendale, NJ）が選択された。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞は、ＦＵＴ８遺伝子（α１，６－フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、そして、そのために、フコース非含有抗体（アフコシル化抗体）を産生する。

【0181】

アフコシル化αＦＧＲ２ｂＡ抗体の産生のための安定細胞株の構築：上記αＦＧＦＲ２ｂ抗体重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、製造業者の説明書に従って、エレクトロポーテーション法によりＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞にトランスフェクトされた。エレクトロポーテーションされた細胞は、約１００００細胞／５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに、Ｌ－グルタミン非含有ＣＤ ＣＨＯ培地に播種された。次の日に、６７、μＭＬ－メチオニン スルホキシミン（MSX, SIGMA cat#M5379, St. Louis, MO）含有ＣＨ ＣＨＯ選択培地が、１５０、μｌ／ウェルで添加された。細胞成長及びクローンの形成は、ＩＮ細胞アナライザー２０００ (IN Cell Analyzer 2000) (GE Healthcare, Piscataway, NJ)でモニターされた。

【0182】

４～６週間後、生存しているコロニーは、ＸＬ６６５コンジュゲートプロテインＡ及びクリプテートコンジュゲートポリクローナルウサギＩｇＧ（Cisbio, Bedford, MA）を用いて精製されたαＦＧＦＲ２ｂ抗体について生成された標準カーブに対し、ホモジニアス時間分解蛍光（Homogenous Time Resolved Fluorescence,HTRF）ベースのアッセイにより、αＦＧＦＲ２ｂＡ抗体の発現についてスクリーニングした。２４ウェルプレート、遠心管、フラスコ振盪、ベンチスケールのバイオリアクター、及びプラットフォームプロダクション工程（platform production process）を含む一連の増加スケールの産生工程を通し、最も発現の高いクローンを増殖させた。各工程で、最も発現の高いクローンを含むサブセットのみに、次の工程を実施した。最終的な産生クローンは、タンパク質産生タイター、細胞成長特性、産物の質、安定性、及びバイオリアクターにおける拡張性、の評価に基づいて選択された。最終的な産生株は、αＦＧＦＲ２ｂＡについて約３．５ｇ／Ｌの発現レベルを有していた。最終的産生細胞株におけるαＦＧＦＲ２ｂＡにおけるフコシル化の欠如は、順相ＨＬＰＣ（Ｎ－ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーを使用して確認された。

【0183】

αＦＧＦＲ２ｂＡ抗体は、カラムクロマトグラフィーにより精製され、限外濾過により精製物質が濃縮され、そして、透析濾過により精製バッファー（２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭＬ－アルギニン、０．０１％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０）と交換された。抗体は、－７０oＣより低い温度で保管された。

【0184】

αＦＧＦＲ２ｂＡのグリカン分析は、タンパク質からのグリカンの放出、アントラニル酸（２－ＡＡ）によるグリカンの標識、及び標識されたグリカンの精製により実施される。蛍光検出を伴う順相ＨＰＬＣは、グリカンを分離し、抗体における各グリカンの相対量を測定するために、使用される。図７は、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株に由来するαＦＧＦＲ２ｂ、及びＣＨＯＫ１ＳＶから産生されるαＦＧＦＲ２ｂが、２つの異なるグリカン分布を有することを示す。（Ａ）Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株に由来するαＦＧＦＲ２ｂのグリカン分布は、抗体がフコースを欠く（「Ｇ０」）ことを示す。（Ｂ）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株に由来するαＦＧＦＲ２ｂのグリカン分布は、抗体がフコースを含む（「Ｇ０Ｆ」）ことを示す。

【0185】

順相ＨＰＬＣ分離で得られるグリカンのピークは、２つの直交法を使用して検出した。第１に、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶにより産生されたαＦＧＦＲ２ｂは、標識され、かつ、順相ＨＰＬＣ法により分離された。蛍光検出の後、グリカンを、ＱＴｒａｐ質量分析計を通過させた。各ピークの質量が検出され、その質量は各グリカンを確実に検出するために使用され、表２に示された。

【0186】

グリカンの各フコシル化形態（G0F、 G1F、及び G2F）の質量は、また、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶにより産生されたαＦＧＦＲ２ｂにおいて探索され、観察されなかった。図８は、抗体において典型的に観察される、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、及びマンノース－５（又はＭａｎ－５）グリカン構造のスキーム図を示す。

【0187】

ＨＰＬＣアッセイにより示されたピークは、また、Ｐｒｏｚｙｍｅより購入したグリカン標準を使用し、標準と、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株及びＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株の両方から取得したαＦＧＦＲ２のプロフィールとの間の保持時間をマッチングさせて、確認した。これらの標準は、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｍａｎ５、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆを検出することができた。

【0188】

ＨＰＬＣアッセイにより得られた結果、並びに特性データにより、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株に由来するαＦＧＦＲ２における、フコシル化の欠如が確認された。

【0189】

実施例２：アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体の結合親和性
ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）に対するαＦＧＦＲ２ｂＡ及びαＦＧＦＲ２ｂＦの結合親和性（αＦＧＦＲ２ｂの後の「Ｆ」は、「フコシル化」を示す）は、表面プラズモン共鳴アッセイにより決定された。簡潔に言うと、プロテインＡを、アミンカップリングキット（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ）及びブロッキング剤として１００ｍＭエチレンジアミン（Sigma）含有１００ｍＭホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）（Sigma, St. Louis, MO）を使用して、デキストランチップに共有結合させた。約６００－８００ＲＵのαＦＧＦＲ２ｂＡ及びαＦＧＦＲ２ｂＦは、分離フローセル、及び対照コントロールとして機能する、プロテインＡ（Pierce）で誘導体化されたフローセルに捕捉された。ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）（R&D Systems, Minneapolis, MN）は、ＨＢＳ－Ｐ＋ランニングバッファー（Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ）で希釈され、５つの濃度（０ｎＭ、１２．３ｎＭ、３７ｎＭ、１１１ｎＭ、３３３ｎＭ、及び１０００ｎＭ）で、２重試験（デュープリケート）で注入された。αＦＧＦＲ２ｂＡに対する結合定数、解離定数、及び親和性は、Biacore T200 Evaluation Software 1:1結合モデルを使用して、算出された。αＦＧＦＲ２ｂＦ結合に対する親和性定数は、Biacore T200 Evaluation Software steady state親和性モデルを使用して決定された。結果を表３に示す。

【0190】

表３に示されるように、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）は、αＦＧＦＲ２ｂＦに対する結合よりも、２０倍より高い親和性で、αＦＧＦＲ２ｂＡに結合した。

【0191】

実施例３：アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体のＡＤＣＣ活性
αＦＧＦＲ２ｂＡ抗体対αＦＧＦＲ２ｂＦ抗体のＡＤＣＣ活性を決定するために、インビトロアッセイが実施された。Ｂａ／Ｆ３ ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現標的細胞は以下のように産生された。Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHから取得したＢａ／Ｆ３細胞（DSMZ, cat# ACC300, Braunschweig, Germany）は、１０％ウシ胎仔血清（Mediatech, cat# 35-010-CV）、１ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ－３（Peprotech, cat# 213-13, Rocky Hill, NJ)、１×ＢＭＥ(Invitrogen, cat# 1047574, Grand Island, NY)、及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Mediatech cat# 30-002-Cl）添加ＲＰＭＩ（Mediatech, cat# 10-041-CV, Manassas, VA）で維持された。Ｂａ／Ｆ３細胞は、Cell Line Nucleofector（登録商標） Kit V（Lonza, cat# VCA-1003）を用い、製造業者のプロトコルに従って、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ｐＢＮｅｗ－ｈＦＧＦＲ２ｂを発現する発現ベクターによりトランスフェクトされた。ｐＢＮｅｗベクターは、ニワトリβアクチンのイントロン、及び、アンピシリン及びピューロマイシン成長選択遺伝子を伴い、ＣＡＧプロモーターを含む。トランスフェクトされた細胞は、３日間完全増殖培地（full growth media）でインキュベートされ、そして、２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（InVivoGen, cat # ant-pr-1, San Diego, CA）で処置された。ピューロマイシン選択は、培養中にわたり維持された。個々の安定なクローンを生成するために、細胞は、３ウェルあたり１細胞の密度で播種された。抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が、最も高いＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現レベルのクローンを選択するために使用された。

【0192】

ＭＦＭ－２２３細胞はＨｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（英国）から取得され；ＯＣＵＭ－２Ｍ細胞は大阪市立大学（大阪、日本）から取得され、ＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞は、ＡＴＣＣ（Rockville, MD）から得られた。全ての細胞は、一般的な方法を使用して培養された。健常ドナーから単離されたばかりのＰＭＢＣは、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Emeryville, CA）から取得された。

【0193】

ＡＤＣＣアッセイは、３人の独立したドナーから３日別々の日に取得したエフェクター細胞を使用して実施された。ＡＤＣＣアッセイ試験は、単離されたばかりのヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、エフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）細胞比２５：１で、実施された。標的細胞は、エフェクター存在下かつ抗体濃度が増加していく条件下で、１６時間インキュベートされた。ＡＤＣＣアッセイは、ＳＫＯＶ－３標的細胞に対しＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、及びＲａｊｉ標的細胞に対するＲＩＴＵＸＩＮ（登録商標）という、２のポジティブコントロール抗体を使用して評価された。完全ヒトＩｇＧ１ネガティブコントロール抗体（Eureka Therapeutics, Catalog ET901, Emeryville, CA）が、非特異的細胞障害性のために使用された。細胞傷害性は、製造業者の説明書（CytoTox Non Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, Madison, WI）に従って、ＬＤＨ放出の定量により、決定された。

【0194】

最大溶解は、５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の存在下で決定され、自然放出は、抗体の非存在下で決定された。特異的溶解のパーセンテージは、自然放出を差し引いた最大溶解のパーセンテージとして、以下のように算出された：
（実験値－自然放出）／（最大値－自然放出）×１００＝特異的溶解（％）

【0195】

Ｂａ／Ｆ３細胞についての結果を図１に示す。アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現Ｂａ／Ｆ３細胞において、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦ抗体より高い特異的溶解を誘導した。ＯＣＵＭ－２Ｍ、ＭＦＭ２２３、及びＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞において、抗体の最大特異的溶解は、ＯＣＵＭ－２Ｍ及びＭＦＭ ２２３細胞において同等であった（データは示さない）が、αＦＧＦＲ２ｂＡは、αＦＧＦＲ２ｂＦよりも低い濃度でより高いＡＤＣＣ活性を示した。更に、αＦＧＦＲ２ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現Ｂａ／Ｆ３細胞において、ＡＤＣＣ活性をほとんど示さない、又はＡＤＣＣ活性を示さなかった。図１Ａを参照のこと。

【0196】

実施例４：胃がん及び乳がん異種移植モデルにおけるアフコシル化抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体活性
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Wilmington, MA）から、６週齢のメスＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスを購入し、マウスを、研究開始前1週間順化させた。ヒト胃癌細胞株ＯＣＵＭ－２Ｍ又は乳癌細胞株が、腫瘍モデルとして使用された。ＯＣＵＭ－２Ｍは、公立大学法人大阪市立大学（OCU、大阪、日本）から購入し、ＭＦＭ－２２３はＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（Public Health England）（98050130, HPA Culture Collections, Salisbury, UK）から購入した。細胞は、最長３回まで完全増殖培地で継代され、移植のために増殖させた。ＯＣＵＭ－２Ｍ及びＭＦＭ－２２３細胞は、それぞれ、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）及び最小必須培地（ＭＥＭ）で培養された。全ての培地には、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ－グルタミン、及びペニシリン－ストレプトマイシン溶液が添加されていた。細胞は、５％ＣＯ_２の湿潤環境下で、３７℃で培養された。

【0197】

培養細胞が８５～９０％コンフルエントに達したとき、細胞は、回収され、５０％マトリゲル（BD BioSciences, San Jose, CA）を含む冷却Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋非含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁された。ＯＣＵＭ－２Ｍ細胞は、５ｘ１０^５細胞／１００μｌ／マウスで、マウスの右脇から皮下に移植された。ＭＦＭ－２２３細胞は、５ｘ１０^５細胞／１００μｌ／マウスで、マウスの右脇から皮下に移植され、かつ、０．７２ｍｇ９０日放出１７－βエストラジオールペレット（Innovative Research of America, Sarasota, FL）は、右脇へ皮下に接種された。マウスは、細胞移植後に週２回、腫瘍成長をモニターされた。腫瘍サイズは、式：腫瘍サイズ（ｍｍ^３）＝（幅（ｍｍ）×長さ（ｍｍ）^２）／２により測定された。ＭＦＭ－２２３腫瘍が８０ｍｍ^３に達したとき、マウスはグループ分けされ、ランダム化（ｎ＝１０）され、処置が開始された。ＯＣＵＭ－２Ｍ腫瘍について、腫瘍が平均サイズ１００ｍｍ^３に達した場合に抗ＦＧＦＲ２ｂを使用した単一療法が開始され、腫瘍が平均サイズ２５０ｍｍ^３に達した場合に組合せ療法が開始された。

【0198】

抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂヒト化抗体（アフコシル化、αＦＧＦＲ２ｂＡ；フコシル化、αＦＧＦＲ２ｂＦ）又はネガティブコントロールとしてのアルブミンが、図の説明に示すように、週２回、１から１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与された。化学療法剤は、パクリタキセルについて１２ｍｇ／ｋｇで、フルオロウラシル（５－ＦＵ）について２．３ｍｇ／ｋｇで、及びシスプラチンについて３３ｍｇ／ｋｇで、週２回腹腔内投与された。治療の開始後、腫瘍サイズは、各マウスにおいて週２回測定された。各腫瘍の長さ及び幅は、ノギスを使用して測定され、腫瘍サイズは、上記式に従って算出された。皮下の腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたとき、又は腫瘍が過度に壊死性になったとき、マウスを安楽死させた。

【0199】

結果としての腫瘍体積の比較は、Ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意であると決定した。Ｐ値は、腫瘍が測定された最終日における算出された腫瘍体積の独立した、両側ｔ検定を使用して算出した。

【0200】

図２は、ＦＧＦＲ２増幅を有するＯＣＵＭ－２Ｍヒト胃がん異種移植モデルにおける、１０ｍｇ／ｋｇ（Ａ及びＢ）及び３ｍｇ／ｋｇでの（Ｃ及びＤ）、αＦＧＦＲ２ｂＡ及びαＦＧＦＲ２ｂＦの有効性を示す。（Ａ）１０ｍｇ／ｋｇでは、フコシル化及びアフコシル化抗体の両方が、直接的な腫瘍退行を誘導した。しかしながら、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦよりも、更に継続的な応答を誘導した。（Ｂ）アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦに比較して、最終的なＯＣＵＭ－２Ｍ腫瘍サイズを有意に低下させた。統計的有意性は、両側独立ｔ検定により決定した。（Ｃ）３ｍｇ／ｋｇの用量の場合、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦに比較して腫瘍成長を低下させた。実際に、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦと比較して、より高い腫瘍退行及び継続的応答を誘導した（注：１匹の動物は、約４２日時点でαＦＧＦＲ２ｂＦグループから除去され、これによりカーブのシフトが生じた）。（Ｄ）フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦと比較された、３ｍｇ／ｋｇでのアフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、最終的ＯＣＵＭ－２Ｍ腫瘍サイズを顕著に低下させた。統計的有意性は、両側独立ｔ検定により決定した。

【0201】

図３は、αＦＧＦＲ２ｂＡによる、用量依存的腫瘍阻害を示す。（Ａ）平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達したとき、皮下ＯＣＵＭ－２Ｍ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスは、１、１．５、２、３、又は５ｍｇ／ｋｇのアフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡで処置された。アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡの全ての用量が腫瘍成長を阻害したが、最も高い抑制及び継続的応答は、３及び５ｍｇ／ｋｇで観察され、２、１．５、及び１ｍｇ／ｋｇαＦＧＦＲ２ｂＡでは成長抑制が低下した。（Ｂ）アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、最終的ＯＣＵＭ－２Ｍ腫瘍サイズを減少させ、より高い用量は、より強力な成長抑制を示した。腫瘍成長抑制は、全ての用量について、統計的に有意であった（５ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０００１；３ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０００１；２ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０００１；１．５ｍｇ／ｋｇ、ｐ＝０．０００３；１ｍｇ／ｋｇ、ｐ＝０．００１３）。統計的有意性は、両側独立ｔ検定により決定した。

【0202】

図４は、ＯＣＵＭ－２Ｍ胃がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡの投与による、パクリタキセルの抗腫瘍活性の増強を示す。（Ａ）平均腫瘍サイズが約２８５ｍｍ^３に達したとき、皮下ＯＣＵＭ－２Ｍ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスは、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、パクリタキセル（１２ｍｇ／ｋｇ）、又はこれら２つの組合せで処置された。パクリタキセルとアフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡとを組合せることにより、αＦＧＦＲ２ｂＡ又はパクリタキセル単独の何れかと比較して、腫瘍サイズが低下した。（Ｂ）αＦＧＦＲ２ｂＡ／パクリタキセルの組合せ療法は、パクリタキセル（ｐ＝０．０００５）又はαＦＧＦＲ２ｂＡ（ｐ＝０．０００９）単独の何れかと比較して、最終的なＯＣＵＭ－２Ｍ腫瘍サイズを有意に低下させた。統計的有意性は、両側独立ｔ検定により決定した。

【0203】

図５は、ＯＣＵＭ－２Ｍ胃がん異種移植モデルにおける、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡの投与による、シスプラチン／５－ＦＵの抗腫瘍活性の増強を示す。（Ａ）平均腫瘍サイズが約２６０ｍｍ^３に達したとき、皮下ＯＣＵＭ－２Ｍ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスは、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、フルオロウラシル（５－ＦＵ）並びにシスプラチン（それぞれ、２．３及び３３ｍｇ／ｋｇ）、又はこれら３つの組合せで処置された。５－ＦＵ／シスプラチンとアフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡとを組合せることにより、αＦＧＦＲ２ｂＡ又は５－ＦＵ／シスプラチン単独の何れかと比較して、腫瘍サイズが低下した。（Ｂ）αＦＧＦＲ２ｂＡ／５－ＦＵ／シスプラチン組合せ療法は、５－ＦＵ／シスプラチンと比較して、最終的なＯＣＵＭ－２Ｍ 腫瘍サイズを有意に低下させた（ｐ＝０．０００３）。αＦＧＦＲ２ｂＡ／５－ＦＵ／シスプラチン組合せ療法による、αＦＧＦＲ２ｂＡ単独に比較した、腫瘍サイズの更なる低下は、顕著であったが、統計的に有意ではなかった。統計的有意性は、両側独立ｔ検定により決定した。

【0204】

図６は、ＭＦＭ－２２３ヒト乳がん異種移植モデルにおける、αＦＧＦＲ２ｂＡの有効性を示す。（Ａ）ＦＧＦＲ２増幅を有するＭＦＭ－２２３ヒト乳癌細胞株は、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植され、平均腫瘍サイズが約８０ｍｍ^３に達したとき、アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ療法が開始された。アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ（５ｍｇ／ｋｇ）は、アルブミンコントロール（５ｍｇ／ｋｇ）と比較して、ＭＦＭ－２２３腫瘍の成長を著しくに低下させた。（Ｂ）アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡは、アルブミンコントロールと比較して、最終的なＭＦＭ－２２３腫瘍サイズを有意に低下させた（ｐ＝０．０００８）。統計的有意性は、両側独立ｔ検定により決定した。

【0205】

実施例５：アフコシル化抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、フコシル化抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体より高いＡＤＣＣを媒介する。
αＦＧＦＲ２ｂＡ抗体対αＦＧＦＲ２ｂＦ抗体のＡＤＣＣ活性を決定するために、インビトロアッセイが実施された。Ｂａ／Ｆ３ ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現標的細胞は上記のように生成された。ＯＣＵＭ－２Ｍ細胞は、大阪市立大学（大阪、日本）より取得した。全ての細胞は、一般的な方法を使用して培養された。健常ドナーから単離されたばかりのＰＭＢＣは、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Emeryville, CA）から取得された。

【0206】

ＡＤＣＣアッセイは、単離されたばかりのヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、エフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）細胞比２５：１で、実施された。標的細胞は、エフェクター存在下かつ抗体濃度が増加していく条件下で、１６時間インキュベートされた。全ての条件は、三重試験（トリプリケート）で実施された。細胞傷害性は、製造業者の推奨（Promega’s CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）に従って、ＬＤＨ放出の定量により、決定された。ＯＣＵＭ－２Ｍ細胞について、最大溶解は、５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の存在下で決定され、自然放出は、抗体の非存在下で決定された。特異的溶解のパーセンテージは、自然放出を差し引いた最大溶解のパーセンテージとして、以下のように算出された：（実験値－自然放出）／（最大値－自然放出）×１００＝特異的溶解（％）GraphPad software curve-fitting analysisを使用し、ＥＣ５０値を取得した。

【0207】

Ｂａ／Ｆ３細胞についての結果を図９に示す。アフコシル化αＦＧＦＲ２ｂＡ抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ発現Ｂａ／Ｆ３細胞において、フコシル化αＦＧＦＲ２ｂＦ抗体より高い力価（低い濃度での、より高いＡＤＣＣ活性）を示した。ＯＣＵＭ－２Ｍ細胞についての同様の結果は、図１０に示される。表４は、図９及び１０に示される、異なる２つの細胞株における、フコシル化ＦＧＦＲ２ｂ抗体と比較した、アフコシル化抗ＦＧＦＲｂ抗体の力価の増加倍数を示す。

【0208】

実施例６：腫瘍組織における、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂタンパク質の免疫組織化学的検出
ＧＡＬ－ＦＲ２１のマウス可変領域（米国特許第８１０１７２３号を参照）及びマウスＩｇＧ２ａ定常領域を含む、マウスαＦＧＦＲ２ｂ抗体が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）胃ガン組織においてＦＧＦＲ２ＩＩＩｂタンパク質を検出するために用いられた。ＦＦＰＥ腫瘍組織は、一連のキシレン洗浄、及び、濃度を段階的に下げた一連のエタノール洗浄によりパラフィンを除去し、水で５分間再水和した。スライドにマウントされた組織切片は、０．１ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）に浸漬され、１５分間、９５o～９９oＣに加熱された。組織切片は、冷却され、室温で５分間３％Ｈ_２Ｏ_２と接触せしめられ、そして、ＴＢＳＴ（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄され、室温で３０分間ブロッキングバッファー（２．５％正常ウマ血清含有ＴＢＳＴ）でブロックされた。組織切片は、そして、ブロッキングバッファー中の５μｇ／ｍｌ αＦＧＦＲ２ｂ抗体と、室温で３０分間インキュベートされた。３０分から２時間のインキュベーション時間により同様の染色強度が得られた。ＴＢＳＴバッファーでの３回の洗浄に続き、組織切片は、ブロッキングバッファー(Vector Laboratories, Burlingame, CA; Cat. No. PK-7200)に希釈した調製済み（ＲＴＵ）ビオチン価ウマ二次抗体（１０μｇ／ｍｌ）と、室温で３０分インキュベートされた。組織切片は、ＴＢＳＴバッファーで２回洗浄され、そして、ストレプロアビジン－西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP; Vector Laboratories, Cat. No. PK-7200）と室温で３０分インキュベートされた。検出は、３’，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質（Vector Laboratories, Cat. No. PK-4105）を使用して、製造業者の説明書に従って、室温で１０分間、実施された。組織切片は、その後、ヘマトキシリンを使用し、製造業者の説明書に従って、対比染色された。組織切片は、段階的に濃度を段階的に上げたエタノール及びキシレンの洗浄により脱水され、そして、カバーグラスでカバーされた。

【0209】

０．１から５ｍｇ／ｍｌのαＦＧＦＲ２ｂ抗体の染色濃度が、タンパク質検出のために特に効果的であった。

【0210】

染色は、以下のようにスコア付けされた：
０ αＦＧＦＲ２ｂ抗体による染色は観察されない。
１＋ 試料において、αＦＧＦＲ２ｂ抗体による弱い染色が観察される。ネガティブコントロール抗体で染色された対応切片においては、染色は観察されない。
２＋ αＦＧＦＲ２ｂ抗体に特異的な膜－細胞質染色が、切片においてより広範囲に観察される。
３＋ 染色された腫瘍細胞の少なくとも１のサブセットにおいて、明白な膜分布を伴う、αＦＧＦＲ２ｂ抗体での強く特異的な染色が観察される。

【0211】

図１１は、腫瘍組織の例示的な０（Ａ）、１＋（Ｂ、Ｃ）、２＋（Ｄ）、及び３＋（Ｅ、Ｆ）の染色を示す。図１１Ａにおいて、管細胞及び散在腫瘍細胞は、αＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用した染色がないことを示す。間質性胃腫瘍試料を示す図１１Ｂにおいて、腫瘍細胞（矢印）は、αＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用したいくつかの染色を示すが、周辺の管細胞は染色を示さない。びまん性胃腫瘍試料を示す図１１Ｃにおいて、腫瘍細胞（矢印）は、αＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用したいくらかの染色を示すが、周辺の間質細胞（矢じり）は染色を示さない。図１１Ｄにおいて、腫瘍細胞（矢印）は、αＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用した中程度の染色を示すが、周辺の間質細胞（矢じり）は染色を示さない。図１１Ｅにおいて、腫瘍細胞（矢印）は、αＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用した高い膜分布染色を示すが、周辺の間質細胞（矢じり）は染色を示さない。図１１Ｆにおいて、腫瘍細胞（矢印）は、αＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用した高い膜／細胞質染色を示すが、周辺の間質細胞（矢じり）は染色を示さない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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