特許 7186215 凍結および解凍プロセスを含むボルデテラ・パータシス（ＢＯＲＤＥＴＥＬＬＡ ＰＥＲＴＵＳＳＩＳ）由来タンパク質を得る方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-30

(45)【発行日】2022-12-08

(54)【発明の名称】凍結および解凍プロセスを含むボルデテラ・パータシス（ＢＯＲＤＥＴＥＬＬＡ ＰＥＲＴＵＳＳＩＳ）由来タンパク質を得る方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/235 20060101AFI20221201BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20221201BHJP

【ＦＩ】

C07K14/235

C07K1/14

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2020505266

(86)(22)【出願日】2018-07-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-10-15

(86)【国際出願番号】 KR2018008283

(87)【国際公開番号】W WO2019027168

(87)【国際公開日】2019-02-07

【審査請求日】2021-05-11

(31)【優先権主張番号】10-2017-0097716

(32)【優先日】2017-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】506379781

【氏名又は名称】グリーン・クロス・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】アン・ドンホ

(72)【発明者】

【氏名】チェ・ギソプ

(72)【発明者】

【氏名】ムン・ジェフン

(72)【発明者】

【氏名】チョン・ヒョンジン

(72)【発明者】

【氏名】パク・ジョングワン

(72)【発明者】

【氏名】キム・ヘリョン

(72)【発明者】

【氏名】チェ・ボミ

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】特表平０５－５０６６４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３１３８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５００３９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０８－５０７７６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００９／０１６６５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Zenglan Li et al.，Vaccine，2016年06月11日，Vol. 34，p. 4032-4039

【文献】Mohammed Shehadul Islam et al.，Micromachines，2017年03月08日，Vol. 8, No. 83，p. 1-27，doi:10.3390/mi8030083

【文献】Yan Jie et al.，Journal of Zhejiang Medical University，1992年，Vol. 21, No. 3，p. 106-108

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）由来ＰＲＮタンパク質を得るための方法であって、
１）ボルデテラ・パータシスを含有する試料を凍結する工程；
２）凍結した試料を解凍する工程；
３）解凍した試料を破砕する工程；および
４）破砕された試料を精製する工程
を含む、方法であり、
ボルデテラ・パータシスを含有する試料が、ボルデテラ・パータシス培養物を遠心分離してスラリーを得、次いで、該スラリーをすぐに遠心分離するかまたは５℃で１～３日間保存した後に遠心分離することにより得られるペレットであり、
工程１）において、凍結が、－３０℃以下の温度で２０時間～１０日間行われ、
工程２）において、解凍が、１℃～２０℃の温度で１２時間～６０時間の冷蔵で行われる、
方法。

【請求項2】

工程１）において、凍結が、－３０℃～－８５℃の温度で行われる、請求項１記載の方法。

【請求項3】

工程１）において、凍結が、２０～３０時間行われる、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

解凍が、１℃～１０℃の温度で冷蔵することにより行われる、請求項１～３いずれか１項記載の方法。

【請求項5】

解凍が、３６～４８時間冷蔵することにより行われる、請求項１～４いずれか１項記載の方法。

【請求項6】

工程３）において、破砕が、尿素処理、熱処理、グアニジン処理およびヨウ素処理からなる群から選択されるいずれか１つの処理により行われる、請求項１～５いずれか１項記載の方法。

【請求項7】

尿素処理が、３Ｍ～７Ｍの尿素濃度で行われる、請求項６記載の方法。

【請求項8】

尿素処理が、１５０～２１０分間行われる、請求項６または７記載の方法。

【請求項9】

工程４）において、精製が、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）を行うことにより行われる、請求項１～８いずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、凍結および解凍プロセスを含む、ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）由来ＰＲＮタンパク質の精製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

百日咳は、主に乳児に発生し、２週間以上の咳により特徴づけられる急性呼吸器疾患である。グラム陰性で好気性の短い球桿菌であるボルデテラ・パータシスは、百日咳を引き起こすことが報告されている。ボルデテラ・パータシスは、その唯一の宿主としてヒトを用い、主に気道を介して感染する。さらに、ボルデテラ・パータシスは、気道粘膜上に生息し、人体に疾患を引き起こす。１９３０年代には、細胞百日咳ワクチンが開発され、このワクチンは百日咳に対して予防効果があることが証明された。さらに、１９４０年代には、百日咳ワクチンは、破傷風およびジフテリア不活化死菌ワクチンと併用された；しかしながら、全細胞百日咳ワクチンの有害作用（癲癇発作、浮腫、発熱など）が報告された。したがって、安全性のある百日咳ワクチンの開発が必要とされた。

【0003】

１９５０年代には、ボルデテラ・パータシスの病原性についての研究が行われ、光源として、百日咳毒素（ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ）および線毛（ＦＩＭ）などの成分が報告された。その後、これらのタンパク質の単離および精製を含む非細胞百日咳ワクチンの開発が進行中であった。１９８０年代以降、精製百日咳ワクチンが開発され、日本で初めてワクチン接種された。

【0004】

非細胞百日咳ワクチンを調製するためには、ＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮなどのタンパク質を精製しなければならなかった。従来、抗原は、硫酸アンモニウム沈殿および密度勾配遠心分離を繰り返すことにより同時に精製されていた。しかしながら、このような方法には、多くの不純物が生成され、精製プロセスを制御することが困難であるという欠点がある。物理的方法と化学的方法を併用してそれぞれの抗原を個別に精製することができる別の方法がある。韓国公開特許第２０１５－０１２４９７３号には、ＰＴ、ＦＨＡ、ならびにＦＩＭ２型および３型を含有する非細胞百日咳ワクチンが記載されている。

【0005】

その一方で、３つまたは４つの成分を混合することを含む百日咳ワクチン製造方法には、１つの成分でも生産性が低下すると全体の生成期間が長くなる可能性があるという問題がある。

【0006】

したがって、百日咳ワクチンを効率的に調製するために、ＰＲＮタンパク質を大量に効率的に製造する方法が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

これに関して、本発明者らは、ボルデテラ・パータシスのＰＲＮタンパク質の抽出量を増加させ得る条件を得るための努力をしながら、ボルデテラ・パータシスを含有する試料が特定の条件下で凍結工程（低温ショック）および解凍工程を受ける場合にボルデテラ・パータシスのＰＲＮタンパク質の抽出量が増加することを確認し、それにより本発明を完成した。

【0008】

したがって、本発明の目的は、ボルデテラ・パータシスのＰＲＮタンパク質の抽出量を増加させることができる、ＰＲＮタンパク質を得る方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の目的を達成するために、本発明は、ボルデテラ・パータシスを含有する試料を凍結する工程；２）凍結した試料を解凍する工程；３）解凍した試料を破砕する工程；および４）破砕された試料を精製する工程を含む、ボルデテラ・パータシス由来ＰＲＮタンパク質を得る方法を提供する。

【発明の効果】

【0010】

本発明によるボルデテラ・パータシスのＰＲＮタンパク質を得る方法は、ＰＲＮタンパク質の抽出量が最大になるように、ボルデテラ・パータシスを含有する試料を凍結し、冷蔵温度で試料を解凍することを含む。上記条件下で前処理を行った試料を精製することによりＰＲＮタンパク質を得る場合、ＰＲＮタンパク質の抽出量は、そのような前処理を伴わない抽出方法と比べて著しく増加した。さらに、該ＰＲＮタンパク質を得る方法はまた、百日咳ワクチンを生産する目的でＰＲＮタンパク質の大量生産にも効果的に使用できる

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、ＰＲＮ精製プロセスのフローチャートを示す。

【図2】図２は、ペレット調製および解凍のためのプロセスと、尿素処理のためのプロセスの詳細なフローチャートを示す。

【図3】図３は、様々な調製および保存条件下で得られた各ペレットを尿素で処理することにより得られた結果を示す。

【図4a】図４ａは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を用いて、比較例１～５および実施例１～３の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す

【図4b】図４ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を用いて、比較例６～１０ならびに実施例４および５の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す。

【図4c】図４ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を用いて、比較例１１～１６および実施例６の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す

【図5a】図５ａは、ウエスタンブロット技術を用いて、比較例１～５および実施例１～３の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す。

【図5b】図５ｂは、ウエスタンブロット技術を用いて、比較例６～１０ならびに実施例４および５の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す。

【図5c】図５ｃは、ウエスタンブロット技術を用いて、比較例１１～１６および実施例６の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す。

【図6】図６は、様々なスラリーおよびペレット保存条件下で比較例１～７および実施例１～３の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量を示す。

【図7】図７は、様々なペレット保存条件下で比較例１５～１７および実施例７の各方法によりＰＲＮタンパク質を得た場合のＰＲＮタンパク質の抽出量を示す。

【図8】図８は、様々なペレット解凍条件を用いた場合のＰＲＮタンパク質の抽出量の差を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の態様では、１）ボルデテラ・パータシスを含有する試料を凍結する工程；２）凍結した試料を解凍する工程；３）解凍した試料を破砕する工程；および４）破砕された試料を精製する工程を含む、ボルデテラ・パータシス由来ＰＲＮタンパク質を得る方法が提供される。

【0013】

第１に、ボルデテラ・パータシスを含有する試料を凍結する工程を行う。

【0014】

本発明において、「ボルデテラ・パータシス」は、ボルデテラ・パラパータシス（Bordetella parapertussis）とも称され、鞭毛および胞子を含まないわずか約０.３～１μｍ程度のグラム陰性球桿菌である。ボルデテラ・パータシスの主要タンパク質の１つであるＰＲＮは、パータクチンの略語であり、百日咳を引き起こすボルデテラ・パータシスの病原性因子である。さらに、気管上皮細胞に付着する外膜タンパク質であるＰＲＮは、ボルデテラ・パータシスから得られ、百日咳ワクチンの重要な成分の１つである。

【0015】

本発明において、「ボルデテラ・パータシスを含有する試料」は、ボルデテラ・パータシスを培養することにより得られる培養物、連続遠心分離により培養物から分離されたスラリー、または高速遠心分離によりスラリーから得られたペレットであり得、ペレットが好ましい。ここで、得られたスラリーをすぐに遠心分離してペレットを得てもよい。しかしながら、得られたスラリーを１～５日後に遠心分離してペレットを得てもよい。ここで、スラリーを０℃～２５℃で保存してもよい。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。

【0016】

本発明の実施態様では、ボルデテラ・パータシス株を改変スタイナーショルト（modified stainer scholte）（ＭＳＳ）培地中にて３５℃の温度で培養し、細胞培養物を室温で２時間連続遠心分離し、それから得たスラリーを２℃～８℃にて７,０００ｒｐｍの速度で５０分間高速遠心分離することによりペレットを製造した。

【0017】

第２に、凍結した試料を解凍する工程を行う。

【0018】

ボルデテラ・パータシス株を含有する試料を凍結する工程において、凍結は、－１℃、－２℃、－５℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃もしくは－９０℃の温度で、または－１℃～－９０℃、－５℃～－８５℃、－１５℃～－７５℃もしくは－３０℃～－６０℃の温度で行われ得る。凍結は、０.５時間、１時間、２時間、５時間、１０時間、２０時間、３０時間もしくは４０時間、または０.５時間～４０時間、１時間～３０時間、２時間～２０時間もしくは５時間～１０時間行われ得る。

【0019】

さらに、凍結した試料を冷蔵保存することによりゆっくりと解凍する。ここで、解凍は、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、７℃、１０℃、１５℃、２０℃もしくは２５℃の温度で、または１℃～２５℃、２℃～１８℃、５℃～１５℃もしくは７℃～１０℃の温度で冷蔵することにより行われ得る。解凍は、０.１時間、１時間、５時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間もしくは６０時間、または０.１時間～６０時間、１時間～５５時間、５時間～５０時間もしくは１２～４８時間冷蔵することにより行われ得る。

【0020】

本発明の実施態様では、ペレットを－３０℃以下で２時間凍結保存し、凍結したペレットを室温または１℃～７℃の冷蔵温度で解凍した。

【0021】

ここで、凍結工程および解凍工程は、１回以上繰り返して行うことができる。

【0022】

第３に、解凍した試料を破砕する工程を行う。

【0023】

解凍した試料を破砕工程にかける。ここで、破砕は、例えば尿素処理、熱処理、グアニジン処理およびヨウ素処理を介して行われ得る。しかしながら、破砕方法は、これらに限定されず、当該技術分野において知られている様々な破砕方法を適用することができる。

【0024】

尿素処理により試料が破砕される場合、該処理は、０.１Ｍ、０.５Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍもしくは１０Ｍの尿素濃度で、または０.１Ｍ～１０Ｍ、１Ｍ～８Ｍ、３Ｍ～７Ｍもしくは４Ｍ～５Ｍの尿素濃度で行われ得る。尿素処理は、５分間、１０分間、２０分間、５０分間、８０分間、１２０分間、１８０分間、２４０分間もしくは３６０分間、または５分間～３６０分間、２０分間～２４０分間もしくは５０分間～１８０分間行われ得る。

【0025】

本発明の実施態様では、解凍したペレットにペレット重量の４倍の量の５.０Ｍ尿素バッファーを負荷し、３時間撹拌することにより、ペレット中のボルデテラ・パータシスの外膜を破砕した。

【0026】

第４に、破砕された試料を精製する工程を行う。

【0027】

細胞可溶化物または細胞溶媒物を遠心分離した後、様々なカラムクロマトグラフィー法などを用いて、不要な細胞デブリを除去することができる。カラムクロマトグラフィー法としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和性クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【0028】

本発明の実施態様では、破砕されたペレットを精製する工程において、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）を行うことによりＰＲＮタンパク質を得た。

【0029】

本明細書で用いる場合、「イオン交換クロマトグラフィー」は、アニオンまたはカチオンが交換樹脂である固定相と共有結合しているイオン交換樹脂を使用することができる。移動相中の反対に荷電された溶質イオンは静電引力により固定相に引き付けられる。イオン交換クロマトグラフィーは、静電力によってイオンまたは荷電化合物がイオン交換体に吸着することにより達成される平衡に基づいている。

【0030】

本発明の実施態様では、イオン交換クロマトグラフィーカラムにアニオン交換樹脂を使用し、平衡バッファーとしてＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、洗浄バッファーとしてＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、溶離バッファーとしてＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を使用して、ＰＲＮタンパク質を溶出した。

【0031】

本明細書で用いる場合、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー」とは、疎水性官能基を有するマトリックスと分子との間の疎水性相互作用を用いる分取方法をいう。親水性で不活性なアガロースを変性させることによりマトリックスに疎水性機能を持たせることができる。アルキルアミンをＢｒＣＮ活性化アガロースと反応させることにより得られる変性アガロースが広く使用される。疎水性相互作用クロマトグラフィーはタンパク質の純粋な分離に広く使用されている。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーでは、タンパク質溶離のために、イオン強度を低下させることができるか、またはｐＨを上昇させることができ、極性を下げる脂肪族アミン、アルコール、または非イオン界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を使用することができる。

【0032】

本発明の実施態様では、平衡バッファーとしてＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、洗浄バッファーとしてＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、および溶離液としてＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を使用して、ＰＲＮタンパク質を溶出した。

【0033】

本明細書で用いる場合、「ゲル濾過クロマトグラフィー」は、固定相でモレキュラーシーブを使用し、該モレキュラーシーブは、親水性であるために水を吸収して膨潤することができる、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ポリアクリルアミド、またはアガロースゲルである。試料分子のサイズが膨潤したゲルの最大孔よりも大きい場合には、該分子は、ゲル粒子を通過しないため、固定相粒子の空間を通ってカラムから出てくる。より小さな分子は、ゲル粒子の開いた孔に入り、それらのサイズおよび形状に応じて様々な速度で通過する。したがって、分子は、サイズが小さくなる順に溶出される。ゲルクロマトグラフィーでは、試料サイズ、粘度、イオン強度、流速などが考慮される。

【0034】

本発明の実施態様では、平衡バッファーとしてＮａＣｌ溶液含有硫酸ナトリウムを使用してＰＲＮタンパク質を溶出した。

【0035】

発明のモード
以下に、下記の実施例により、本発明をより詳しく記載する。しかしながら、下記の実施例は本発明を例示するためだけのものであり、本発明の範囲をこれらに限定するものではない。

【実施例】

【0036】

実施例１．ＰＲＮを得るプロセス
ＰＲＮを得るプロセスは、以下のプロセス工程で行った：ペレットの調製および解凍、尿素処理、カラムクロマトグラフィー（ＩＥＸ、ＨＩＣおよびＳＥＣ）、濃縮およびバッファー交換（ＵＦ／ＤＦ）、ならびに不純物不含ＰＲＮタンパク質の精製。ＰＲＮを得るプロセスのフローチャートを図１に示す。

【0037】

実施例１.１．ボルデテラ・パータシスの培養
ボルデテラ・パータシス（Korea National Institute of Health）をＭＳＳ培地で３５℃の温度で４日間培養した。培養期間については、具体的には、種培養のために１日、一次濃縮培養に１日、二次濃縮培養に１日、主培養に１日かかった。

【0038】

実施例１.２．ペレット調製
細胞培養物を、室温で２時間、流速１００Ｌ／時および９,５００ｒｐｍの条件下での連続遠心分離により、細胞上清とスラリーとに分離した。分取したスラリーを、５℃±３℃で５０分間、７,０００ｒｐｍにて高速遠心分離して、ペレットを得た。移管お実施例において、スラリーを３日間保存する場合には、スラリーを５℃の冷蔵温度で３日間保存し、次いで、高速遠心分離してペレットを調製した。

【0039】

実施例１.３．凍結および解凍
調製したペレットを－３０℃以下で２時間保存し、次いで、室温（ＲＴ）で１日間保存して解凍した。その後、下記の実施例１.４～１.７の手順を行ってＰＲＮタンパク質を得た。さらに、下記の表１に示す実施例１～６および比較例１～１６におけるようにスラリーの保存条件ならびに凍結および解凍条件を変えて実験を行い、次いで、下記の実施例１.４～１.７の手順を行ってＰＲＮタンパク質を得た。

【0040】

【表1】

【0041】

実施例１.４．尿素処理
解凍したペレットに該ペレットの重量の４倍量の５.０Ｍ尿素バッファーを添加し；磁気棒を使用して２８０ｒｐｍの速度で３時間、撹拌を行った。３時間撹拌しておいた尿素処理した溶液を、５℃±３℃の条件下、７,０００ｒｐｍ（１２２３０ＲＣＦ）の速度で１.５時間高速遠心分離した。この遠心分離後に、細胞デブリを除去し、上清を回収した。回収した上清を０.２２μｍフィルターで濾過した。ペレット調製、実施例１.２および１.３の解凍、ならびに尿素処理の詳しいプロセスフローチャートを図２に例示する。

【0042】

実施例１.５．ＩＥＸカラムによる精製
ＩＥＸ樹脂を充填したカラムに３ＣＶの蒸留水（ＤＷ）を１００ｃｍ／時で流して保存溶液を除去した。次いで、該カラムに１Ｎ ＮａＯＨ溶液を４０ｃｍ／時で１時間流して洗浄を行った。該カラムに、３ＣＶの、平衡バッファーであるＴｒｉｓ－ＨＣｌを流して平衡化を行った。平衡化完了後、該ＩＥＸカラムに濃縮およびバッファー交換１のためのプロセス溶液を流して吸着させた。該カラムに３ＣＶの該平衡バッファーを流して、カラム内に残っていた溶液を除去した。その後、該カラムに、５ＣＶの、洗浄バッファーであるＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を流して洗浄を行った。洗浄完了後、該カラムに、５ＣＶの、溶離バッファーであるＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を流してＰＲＮタンパク質を溶出させた。

【0043】

実施例１.６．ＨＩＣカラムによる精製
ＨＩＣ樹脂を充填したカラムに３ＣＶの蒸留水を１００ｃｍ／時で流して保存溶液を除去した。次いで、該カラムに１Ｎ ＮａＯＨ溶液を４０ｃｍ／時で１時間流して洗浄を行った。該カラムに、３ＣＶの、平衡バッファーであるＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を流して平衡化を行った。平衡化完了後、ＩＥＸカラムによる精製プロセスを介して得られた溶離液と３.６Ｍ ＮａＣｌとを１:１の割合で混合することにより得られた溶液を該ＨＩＣカラムに流して吸着させた。該カラムに３ＣＶの該平衡バッファーを流して、カラム内に残っていた溶液を除去した。その後、該カラムに、５ＣＶの、洗浄バッファーであるＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を流して洗浄を行った。洗浄完了後、５ＣＶの、溶離バッファーであるＮａＣｌ溶液含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を流してＰＲＮタンパク質を溶出させた。

【0044】

実施例１.７．ＧＦＣカラムによる精製
ＧＦＣ樹脂を充填したカラムに３ＣＶの蒸留水を１５ｃｍ／時で流して保存溶液を除去した。次いで、該カラムに１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１５ｃｍ／時で１時間流して洗浄を行った。３ＣＶの、平衡バッファーであるＮａＣｌ溶液含有リン酸ナトリウムを流して平衡化を行った。平衡化完了後、濃縮およびバッファー交換２のためのプロセス溶液をＧＦＣカラムに流してＰＲＮタンパク質を溶出させた。

【0045】

実験例１．ペレット調製および保存条件によるＰＲＮ抽出量の差異の同定
ＰＲＮタンパク質の抽出量が効果的に増加する条件を同定するために、実施例１のＰＲＮ入手プロセスにおけるペレット調製および保存条件を変えて実験を行った。ペレット調製および保存条件は実施例１.３の表１に示したとおりであり、実験手順および各条件による結果を以下の実験例１.１～１.５に示す。

【0046】

実験例１.１．スラリーおよびペレット保存条件による尿素処理に起因する上清の色の変化
実施例１.３の表１に示すように調製および保存条件を変えて使用することにより得られた各ペレットを尿素バッファー処理し、撹拌を行った。次いで、得られたものを遠心分離した。遠心分離により得られた上清をフィルターで濾過し、各保存条件による上清の色の違いを同定した。上記のプロセスを実施例１.４に詳述し、実験結果を図３に示す。

【0047】

図３に示されるように、上清は、ペレットを凍結保存し、次いで、冷蔵保存した条件（実施例２と実施例３、および実施例５と実施例６）で暗黄色（dark yellow color）を示した。これは、冷凍保存および冷蔵保存の後に尿素処理した場合に多くのペレットが破砕されることを意味する。

【0048】

実験例１.２．ペレット保存条件によるタンパク質抽出量の差異の同定
ペレット保存条件によるＰＲＮタンパク質の抽出量の違いを同定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット技術を用いた。ここで、ウエスタンブロット技術において、抗体として、モルモット抗ＰＲＮ（Young In Frontier）およびビオチン標識モルモット抗ＰＲＮ（Young In Frontier）を使用した。これらの結果は図４および５に示されている。

【0049】

図４および５に示されるように、ペレットを凍結保存し、次いで、冷蔵保存する条件で、大量のＰＲＮタンパク質が得られた。

【0050】

実験例１.３．スラリーおよびペレット保存条件によるＰＲＮタンパク質の抽出量の同定
スラリーおよびペレット保存条件によるＰＲＮタンパク質の抽出量の違いを同定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を使用した。これらの結果は図６に示されている。ここで、図６のグラフの下部にある１～１１の番号のそれぞれのペレット保存条件は以下のとおりであり、より詳しい条件は下記の表２に示されている：
１： ペレット調製直後に尿素処理；
２： 凍結保存、および室温で１日間解凍；
３： 凍結保存せずに室温で１日間解凍；
４： 凍結保存、および１日間冷蔵で解凍；
５： 凍結保存、および３日間冷蔵で解凍；
６： 凍結保存せずに１日間冷蔵で解凍；
７： 凍結保存せずに３日間冷蔵で解凍；
８： １日間凍結保存（－３０℃）；
９： ３日間凍結保存（－３０℃）；
１０： １日間凍結保存（－７０℃）；および
１１： ３日間凍結保存（－７０℃）。

【0051】

【表2】

【0052】

図６に示されるように、スラリー状態で０日間保存した後に調製されたペレットは、ペレットが凍結保存されている間じゅうＰＲＮタンパク質の抽出量の経時的増加を示し（実施例２と実施例３との比較による）；スラリー状態で３日間保存された後に調製されたペレットは、ペレットが凍結保存されている間じゅうＰＲＮタンパク質の抽出量の経時的減少を示した（実施例５と実施例６との比較による）。さらに、凍結保存されたペレットは、凍結保存されなかったペレットと比較して、ＰＲＮタンパク質の抽出量の増加を示した（実施例１と比較例２との比較、実施例２と比較例３との比較、および実施例３と比較例４との比較による）。これは、ＰＲＮタンパク質の抽出量を増加させるためには、スラリーをそのまま保存するよりも、ペレット化しスラリーを直ちにペレット化して該ペレットを保存する方が効果的であり、また、凍結工程によりＰＲＮタンパク質の抽出量が大幅に増加することを意味している。

【0053】

実験例１.４．ペレット解凍によるＰＲＮタンパク質の抽出量の差異の同定
図６において、凍結保存した実験グループ（実施例１と実施例４、実施例２と実施例５、実施例３と実施例６、比較例５と比較例１３、比較例６と比較例１４、比較例７と比較例１５、および、比較例８と比較例１６）にうち、凍結保存し、次いで、解凍した実験グループ（実施例１と実施例４、実施例２と実施例５、および、実施例３と実施例６）は、ＰＲＮタンパク質の抽出量の顕著な増加を示した。したがって、ＰＲＮタンパク質の抽出量が解凍に応じて変わるかどうかを同定するために、さらなる実験を行った。ここで、ペレットの解凍は５℃の冷蔵温度で４８時間行った。実験結果は表３および図７に示される。

【0054】

【表3】

【0055】

表３および図７に示されるように、ペレットが尿素処理前に解凍された場合、ペレットが凍結された場合と比較して、ＰＲＮタンパク質の抽出量の約３倍増加が観察された。凍結したペレットを尿素処理した３つの実験グループ全てにおいて、ＰＲＮタンパク質が低レベルで抽出された。これは、尿素処理前のペレットの解凍がＰＲＮタンパク質抽出に大きな効果を奏することを意味している。これらの結果から、ＰＲＮタンパク質の抽出量を効果的に増加させるためには、ペレットを尿素処理前に解凍しなければならないことが判明した。

【0056】

実験例１.５．ペレット解凍条件によるＰＲＮタンパク質の抽出量の差異の同定
ペレット解凍方法によるＰＲＮタンパク質の抽出量の違いを同定するために、ペレットを凍結保存し、次いで、それぞれ、冷蔵（２日間）、室温（１時間）、および３７℃（１５分間）で保存した場合のＰＲＮタンパク質の抽出量をチェックした。これらの結果は図８に示されている。

【0057】

図８に示されるように、解凍を行った場合、冷蔵で徐々に解凍した場合には、高温で急速に解凍した場合と比較して、ＰＲＮタンパク質の抽出量の増加が観察された。さらに、冷蔵で２日間解凍した場合には、３７℃で１５分間解凍した場合と比較して、ＰＲＮタンパク質の抽出量の約２倍増加が観察された。これらの結果から、ＰＲＮタンパク質の抽出量を効果的に増加させるためには、ペレットを凍結後に冷蔵でゆっくりと解凍しなければならないことが判明した。

【0058】

実験例２．スケールアップの可能性の同定
実験例１.１～１.５で同定したＰＲＮタンパク質の抽出量が効果的に増加する条件を５０Ｌスケールでさえ適用することができるかどうかを同定するために、スラリーを保存せずに直ちにペレットし、得られたペレットを１日間凍結保存（－３０℃）し、次いで、冷蔵（５℃）で２日間解凍した。その後、ペレット５３３ｇを回収し、５.０Ｍ尿素バッファー１,８００ｍＬで処理し、磁気棒を使用して３時間撹拌した。撹拌した尿素処理溶液を６,３００ｒｐｍの速度で１.５時間遠心分離した。遠心分離後、細胞デブリを除去し；上清１,６５０ｍＬを回収し、フィルターで濾過した。その後、実施例１.５～１.７の手順を行った。結果は表４に示されている。

【0059】

【表4】

【0060】

表４に示されるように、実験例１.１～１.５で同定したＰＲＮタンパク質の抽出量が効果的に増加する条件を５０Ｌスケールでさえ適用することができ、２００ＬスケールでＰＲＮタンパク質約３００ｍｇ～４００ｍｇを得ることができることが判明した。
本願は下記の態様も包含する。
［態様１］
ボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）由来ＰＲＮタンパク質を得るための方法であって、
１）ボルデテラ・パータシスを含有する試料を凍結する工程；
２）凍結した試料を解凍する工程；
３）解凍した試料を破砕する工程；および
４）破砕された試料を精製する工程
を含む、方法。
［態様２］
ボルデテラ・パータシスを含有する試料が、ボルデテラ・パータシス培養物を遠心分離することにより得られるペレットである、態様１記載の方法。
［態様３］
工程１）において、凍結が、－５℃～－８５℃の温度で行われる、態様１記載の方法。
［態様４］
工程１）において、凍結が、２０～３０時間行われる、態様１記載の方法。
［態様５］
工程２）において、解凍が、冷蔵で行われる、態様１記載の方法。
［態様６］
解凍が、１℃～１０℃の温度で冷蔵することにより行われる、態様５記載の方法。
［態様７］
解凍が、３６～４８時間冷蔵することにより行われる、態様５記載の方法。
［態様８］
工程３）において、破砕が、尿素処理、熱処理、グアニジン処理およびヨウ素処理からなる群から選択されるいずれか１つの処理により行われる、態様１記載の方法。
［態様９］
尿素処理が、３Ｍ～７Ｍの尿素濃度で行われる、態様８記載の方法。
［態様１０］
尿素処理が、１５０～２１０分間行われる、態様８記載の方法。
［態様１１］
工程４）において、精製が、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）を行うことにより行われる、態様１記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6】

【図7】

【図8】