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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-01
(45)【発行日】2022-12-09
(54)【発明の名称】血管新生促進材
(51)【国際特許分類】
A61L 27/52 20060101AFI20221202BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20221202BHJP
A61L 27/44 20060101ALI20221202BHJP
A61L 27/20 20060101ALI20221202BHJP
A61L 27/48 20060101ALI20221202BHJP
A61L 27/18 20060101ALI20221202BHJP
【ＦＩ】
A61L27/52
A61L27/54
A61L27/44
A61L27/20
A61L27/48
A61L27/18
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2018089002
(22)【出願日】2018-05-07
(65)【公開番号】P2019195347
(43)【公開日】2019-11-14
【審査請求日】2021-04-22
(73)【特許権者】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100075409
【弁理士】
【氏名又は名称】植木 久一
(74)【代理人】
【識別番号】100129757
【弁理士】
【氏名又は名称】植木 久彦
(74)【代理人】
【識別番号】100115082
【弁理士】
【氏名又は名称】菅河 忠志
(74)【代理人】
【識別番号】100125243
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 浩彰
(72)【発明者】
【氏名】大谷 亨
(72)【発明者】
【氏名】中島 忠章
(72)【発明者】
【氏名】上妻 雅
(72)【発明者】
【氏名】友岡 康弘
【審査官】参鍋 祐子
(56)【参考文献】
【文献】特開平０７－１０２００２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－０６７６８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】大谷亨 他，血管新生に及ぼすbFGF含有ヒアルロン酸架橋ヒドロゲルへのPEGグラフト化の影響，日本バイオマテリアル学会シンポジウム2016予稿集，2016年11月21日，98
【文献】生物物理，1984年，Vol.24(1)，pp.29-39
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ ２７／００
Ａ６１Ｌ ２４／００
Ａ６１Ｋ ４７／００
Ａ６１Ｋ ９／００
Ａ６１Ｋ ３８／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ハイドロゲルおよび細胞増殖因子を含み、上記ハイドロゲルが、ポリエチレングリコールで架橋されたヒアルロン酸、並びに、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール－ポリ（ε－カプロラクトン）ブロック共重合体の少なくとも一方を含むことを特徴とする血管新生促進材。
【請求項2】
上記ポリエチレングリコールおよび上記ポリエチレングリコール－ポリ（ε－カプロラクトン）ブロック共重合体の数平均分子量が、１０００以上、２００００以下である請求項１に記載の血管新生促進材。
【請求項3】
上記ポリエチレングリコールで架橋されたヒアルロン酸、上記ポリエチレングリコールおよび上記ポリエチレングリコール－ポリ（ε－カプロラクトン）ブロック共重合体の合計に対する、上記ポリエチレングリコールおよび上記ポリエチレングリコール－ポリ（ε－カプロラクトン）ブロック共重合体の割合が、１質量％以上、８０質量％以下である請求項１または２に記載の血管新生促進材。
【請求項4】
上記ハイドロゲルに対する細胞増殖因子の量が、１μｇ／ｇ以上、３０００μｇ／ｇ以下である請求項１～３のいずれかに記載の血管新生促進材。
【請求項5】
上記細胞増殖因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子である請求項１～４のいずれかに記載の血管新生促進材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、優れた血管誘導効果を示す血管新生促進材に関するものであり、幹細胞などを含む足場材料と共に生体内に埋植することにより、移植した幹細胞などの分化や増殖を促進するものである。
【背景技術】
【0002】
高齢化社会の進展に伴い、人々の興味は、より長く生きることから、高い生活の質（ＱＯＬ：Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）へと移りつつある。そのような状況下で注目を集めているのが再生医療である。再生医療とは、生まれつき、或いは疾病、不慮の事故、加齢などに伴い、欠損、損傷、機能低下した組織や臓器を、患者の体外で培養した細胞や組織を用いて修復再生し、機能を補完する医療である。従来の対症療法に対し、欠損または損傷した臓器を再生医療により再建させることで、疾病や損傷への根治療法が可能となる。それにより、患者や高齢者、障害者のＱＯＬが飛躍的に向上し、社会復帰と生活自立が可能となるため、医療分野にとどまらず、産業構造や社会構造の変化をもたらすことが期待されている。
【0003】
現在、再生医療の発展をもたらすと注目されているのが、京都大学の山中伸弥教授らにより開発されたｉＰＳ細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）である。ｉＰＳ細胞は、臓器や組織を構成する多くの細胞に分化できる能力である多能性を有した幹細胞と定義されている。人体を構成する多種多様な体細胞は、元を正すと１つの完全な分化能を持つ全能性幹細胞から分化したものである。そのため、全能性幹細胞も体細胞も核内に持つ遺伝子の塩基配列が全く同一であり、この分化能の違いが発現する遺伝子量によるものという仮定の下、作製されたのがｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は、皮膚細胞などの体細胞にｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２の４つの遺伝子を導入することで作製される。
【0004】
多能性を持つとされているｉＰＳ細胞の発見は、再生医療の分野において革新的なものであったが、実際に臨床に応用されている報告例は未だほとんど無い。例えば、必要な細胞数が少なく、三次元構造が必要でなく、血管が存在しない、加齢黄斑変性症患者のための色素上皮細胞シートの作製が報告されている程度である。その理由は、ｉＰＳ細胞が持つ危険性や倫理問題ももちろんだが、産業応用および臨床に向けての幹細胞への遺伝子導入法、培養法、精製法、移植法、細胞の標準化などの種々のステップが存在するためである。そのため、バイオマテリアルという側面から、この種々のステップを解決するための最適な材料や条件を提供することが求められている。
【0005】
再生医療への応用に向け、ｉＰＳ細胞を用いた成功例が報告されたのは、２００７年のＪ．Ｈａｎｎａらの報告が初である。しかし、前述した通りｉＰＳ細胞を用いた再生医療の臨床への応用は現実的なものではない。即ち、体外で培養した細胞を体内に移植した後に組織が再構築された報告例がほとんどなく、特に血管内皮細胞との共移植なしで体循環系に繋げた例が無い。体循環系に繋げるとは、組織の生存や細胞の増殖に不可欠な酸素や栄養物を取り入れることを目的として、既存の血管から新しい毛細血管の発生、すなわち血管新生を果たすことを意味する。体内に移植した細胞や組織に血管新生を誘導する技術をいかに確立できるかが、今後の再生医療において一つの課題となっている。
【0006】
例えば特許文献１には、ポリテトラメチレングリコールジアクリレートまたはトリエチレングリコールジメタクリレートを光重合開始剤で硬化させたリザーバー間にｂＦＧＦ／ヘパリン含有アガロースゲルを挟んだ、血管新生誘導因子を徐放するためのカプセルデバイスが開示されている。特許文献２には、特定のアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場が開示されている。特許文献３には、ポリヒドロキシケイ酸エチルエステル化合物を含む、血管新生率増加が治癒過程に必要な疾患の治療などに用いられる生分解性材料が開示されている。また、本発明者らは、ポリエチレングリコール鎖がグラフトしたヒアルロン酸を架橋したハイドロゲルにｂＦＧＦを内包させたものをマウス皮下へ埋植することにより、ｂＦＧＦが徐放され、血管新生が亢進されることを見出している（非特許文献１，２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１７－８６３１３号公報
【文献】特開２０１３－７４９３６号公報
【文献】特表２０１３－５２０４６３号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｔ．Ｏｏｙａら，６th Ａｓｉｓａｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ．，２０１７
【文献】大谷亨ら，日本バイオマテリアル学会シンポジウム２０１６，博多
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上述したように、本発明者らは、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）を含む特定のハイドロゲルにより生体内における血管新生を亢進できることを見出している。
しかし、ｉＰＳ細胞による実際の治療が未だ実際には成功しておらず、生体内で組織や臓器を再生する技術は非常に重要であり、欠損組織の細胞へ栄養成分などを送達するための血管を延ばすことは細胞増殖にとり必要不可欠であって、より優れた血管新生技術が切望されている。
そこで本発明は、優れた血管誘導効果を示す血管新生促進材を提供することを目的とする。
しかし、ｉＰＳ細胞による実際の治療が未だ実際には成功しておらず、生体内で組織や臓器を再生する技術は非常に重要であり、欠損組織の細胞へ栄養成分などを送達するための血管を延ばすことは細胞増殖にとり必要不可欠であって、より優れた血管新生技術が切望されている。
そこで本発明は、優れた血管誘導効果を示す血管新生促進材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、細胞増殖因子を含むハイドロゲルに遊離の特定高分子を含ませることにより、血管誘導効果が顕著に向上することを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0011】
［１］ ハイドロゲルおよび細胞増殖因子を含み、
上記ハイドロゲルが、架橋生分解性ポリマー、並びに、遊離水溶性高分子および遊離両親媒性高分子の少なくとも一方を含むことを特徴とする血管新生促進材。
［２］ 上記架橋生分解性ポリマーが架橋酸性多糖類である上記［１］に記載の血管新生促進材。
［３］ 上記架橋酸性多糖類が架橋ヒアルロン酸、架橋アルギン酸または架橋コンドロイチン硫酸である上記［２］に記載の血管新生促進材。
［４］ 上記遊離水溶性高分子が、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールである上記［１］～［３］のいずれかに記載の血管新生促進材。
［５］ 上記遊離両親媒性高分子が、ポリエチレングリコール－ポリ（ε－カプロラクトン）ブロック共重合体である上記［１］～［４］のいずれかに記載の血管新生促進材。
［６］ 上記細胞増殖因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子である上記［１］～［５］のいずれかに記載の血管新生促進材。
上記ハイドロゲルが、架橋生分解性ポリマー、並びに、遊離水溶性高分子および遊離両親媒性高分子の少なくとも一方を含むことを特徴とする血管新生促進材。
［２］ 上記架橋生分解性ポリマーが架橋酸性多糖類である上記［１］に記載の血管新生促進材。
［３］ 上記架橋酸性多糖類が架橋ヒアルロン酸、架橋アルギン酸または架橋コンドロイチン硫酸である上記［２］に記載の血管新生促進材。
［４］ 上記遊離水溶性高分子が、ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールである上記［１］～［３］のいずれかに記載の血管新生促進材。
［５］ 上記遊離両親媒性高分子が、ポリエチレングリコール－ポリ（ε－カプロラクトン）ブロック共重合体である上記［１］～［４］のいずれかに記載の血管新生促進材。
［６］ 上記細胞増殖因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子である上記［１］～［５］のいずれかに記載の血管新生促進材。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係る血管新生促進材を、足場材料および増殖させるべき細胞と共に生体内に移植することにより、血管を効率的に誘導することが可能となる。その結果、血液から細胞へ栄養成分などが送達され、細胞の分化や増殖が促進され、組織や臓器が再生する可能性がある。よって本発明は、再生医療を現実のものとする可能性があるものとして、産業上非常に重要である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図2】図２は、本発明に係る血管新生促進材と、マウスの膣間質株細胞であるＰ３ＶＳ細胞およびミュラー管上皮のクローン性株細胞であるＥ１細胞を含むコラーゲンゲルとを埋植した部分の試料を、ＣＤ３１抗体を使って染色した拡大写真である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明に係る血管新生促進材は、ハイドロゲルおよび細胞増殖因子を含み、当該上記ハイドロゲルは、架橋生分解性ポリマー、並びに、遊離水溶性高分子および遊離両親媒性高分子の少なくとも一方を含む。ハイドロゲルとは、三次元網目構造を有する親水性高分子で構成されており、水に不溶ではあるが、水を含んで膨潤している材料である。
【0015】
架橋生分解性ポリマーは、生分解性のポリマーが架橋されることにより不溶化したものである。本発明の血管新生促進材は生体内に埋植するので、生分解性であることが好ましい。生分解性とは、生体内に存在する酵素や微生物などにより分解され得る性質をいう。
【0016】
生分解性ポリマーとしては、特に制限されないが、例えば、カルボキシ基、スルホン酸基、アミノ基、水酸基など、架橋のための反応性官能基を有する親水性高分子を挙げることができる。例えば、カルボキシ基および／またはスルホン酸基を有する酸性多糖類であるヒアルロン酸、アルギン酸、コンドロイチン硫酸など；側鎖カルボキシ基を有する酸性ペプチドであるポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸など；アミノ基を有する塩基性多糖類であるキトサンなど；水酸基を有する中性多糖類であるキチンなどを挙げることができる。後述するハイドロゲルの製造方法に基づいて、遊離の水溶性高分子および両親媒性高分子の量を過剰に低減しないため、カルボキシ基および／またはスルホン酸基を有する多糖類またはペプチドが好ましく、カルボキシ基および／またはスルホン酸基を有する多糖類がより好ましい。
【0017】
架橋生分解性ポリマーの主鎖である生分解性ポリマーの大きさは特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば、多糖類の単糖単位の重合度としては、１００以上、６０００以下とすることができる。
【0018】
架橋生分解性ポリマーを架橋する分子としては、親水性であり且つ両末端に架橋のための反応性官能基を有するポリマーを用いることができる。架橋のための反応性官能基としては、アミノ基、水酸基、カルボキシ基を挙げることができる。当該分子の主鎖としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコールなどを挙げることができる。
【0019】
生分解性ポリマーの架橋程度は、特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、０．０１ｍｏｌ／ｍ3以上、０．１５ｍｏｌ／ｍ3以下の架橋密度とすることが好ましい。
【0020】
本発明に係るハイドロゲルは、ハイドロゲルに加えて、遊離水溶性高分子および遊離両親媒性高分子の少なくとも一方（以下、遊離水溶性高分子および遊離両親媒性高分子の少なくとも一方を「遊離水溶性高分子／両親媒性高分子」と略記する場合がある）を含む。
【0021】
本発明に係るハイドロゲルにおいて水溶性高分子／両親媒性高分子が遊離して存在しているとは、水溶性高分子／両親媒性高分子が架橋生分解性ポリマーに共有結合しておらず、ハイドロゲル中に架橋生分解性ポリマーとは独立して存在していることを意味する。但し、ハイドロゲル内に遊離した水溶性高分子／両親媒性高分子が存在していれば、一部の水溶性高分子／両親媒性高分子が架橋生分解性ポリマーに共有結合していてもよいものとする。
【0022】
水溶性高分子としては、特に制限されないが、例えば、ポリエチレングリコ－ル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリグリセロールなどの合成水溶性高分子；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの半合成水溶性高分子；グアーガム、カラギーナン、アルギン酸塩など植物由来水溶性高分子；キサンタンガムなど微生物由来水溶性高分子；コンドロイチン硫酸塩やヒアルロン酸塩など動物由来水溶性高分子を挙げることができ、合成水溶性高分子が好ましく、ポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコールがより好ましい。
【0023】
両親媒性高分子は、親水性部分と疎水性部分の両方を有し、水と疎水性溶媒の両方に親和性を有する高分子であり、例えば、親水性部分と疎水性部分を有するＡＢ型ジブロック共重合体を挙げることができる。親水性部分としては、上記の水溶性高分子を挙げることができる。また、疎水性部分としては、例えば、ポリ（ε－カプロラクトン）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などを挙げることができる。かかる疎水性部分により、ペプチドである細胞増殖因子をハイドロゲル中により安定的に保持できる可能性がある。
【0024】
遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の分子量は、水溶性が維持されている範囲で適宜選択すればよいが、例えば、数平均分子量を１０００以上、２００００以下とすることができる。
【0025】
ハイドロゲルにおける遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の量は、適宜調整すればよいが、例えば、架橋生分解性ポリマーと遊離水溶性高分子／両親媒性高分子との合計に対する遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の割合としては、１質量％以上、８０質量％以下とすることができる。
【0026】
細胞増殖因子とは、一般的に、特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性のタンパク質をいい、本発明においては、生体内において所望の組織または臓器を構成する細胞への分化を促進したり、当該細胞の増殖を促進できるものを選択すればよい、本発明の血管新生促進材においては、細胞増殖因子は、ハイドロゲルに含まれる水に溶解している。その様な細胞増殖因子としては、例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）などの繊維芽細胞増殖因子；ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ－１）、ＰＬＧＦ－２などの血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリー；アンギオポエチン；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）などを挙げることができ、繊維芽細胞増殖因子が好ましく、ｂＧＦＧがより好ましい。
【0027】
細胞増殖因子の量は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば、ハイドロゲルに対して１μｇ／ｇ以上、３０００μｇ／ｇ以下とすることができる。
【0028】
本発明に係るハイドロゲルは、当業者公知の方法により製造することができる。例えば、生分解性ポリマー、遊離水溶性高分子／両親媒性高分子および架橋剤を含む水溶液に縮合剤を添加し、生分解性ポリマーを架橋剤で架橋すればよい。この際、遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の一部が生分解性ポリマーと反応し、生分解性ポリマーにグラフトしたり、生分解性ポリマーを架橋することにより、遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の量が減ってしまうおそれがあり得る。この様な場合には、生分解性ポリマーと架橋剤が優先的に反応するよう、生分解性ポリマー、遊離水溶性高分子／両親媒性高分子および架橋剤の反応性官能基を選択したり、これら試薬の量を調整したり、縮合剤の種類を選択したり、すればよい。
【0029】
例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム＝クロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）などのトリアジン系縮合剤は、溶媒である水やアルコール中でもカルボン酸とアミンとのアミド化反応を選択的に進行せしめることができる。よって、かかるトリアジン系縮合剤を用いて、生分解性ポリマーとしてカルボキシ基および／またはスルホン酸基を有する酸性多糖類を用い、両末端にアミノ基を有する架橋剤を用い、水酸基を有する遊離水溶性高分子／両親媒性高分子を用いれば、架橋剤による酸性多糖類の架橋反応を選択的に進めることができ、遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の低減を抑制することができる。或いは、遊離水溶性高分子／両親媒性高分子の水酸基を保護してもよい。
【0030】
架橋反応後は、水洗や透析などにより、架橋剤などを十分に除去することが好ましい。この際、架橋生分解性ポリマーの三次元網目構造内に取り込まれ、また、架橋生分解性ポリマーへの親和性も高い遊離水溶性高分子／両親媒性高分子は除去され難く、逆に架橋剤などの低分子は除去され易い。
【0031】
得られたハイドロゲル内へ細胞増殖因子を取り込む方法も特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、ハイドロゲルを凍結乾燥などで一旦乾燥させ、細胞増殖因子の水溶液を添加することで、ハイドロゲル内に細胞増殖因子を取り込ませることができる。細胞増殖因子の量は、細胞増殖因子水溶液の添加量や濃度などにより調整できる。
【0032】
本発明に係る血管新生促進材は、生体内において血管の新生を促進することができる。よって、本発明の血管新生促進材を、幹細胞や増殖能の高い細胞を含む足場材料と共に生体内へ埋植することにより、血管の新生を促進し、幹細胞の分化や細胞の増殖を進めることが可能になり得る。生体内で増殖させたい細胞は、その増殖や組織化を促す細胞と共に移植してもよい。
【0033】
但し、本発明者らの実験的知見によれば、本発明の血管新生促進材は、増殖能の高い細胞には毒性を示すことがある。この様な場合には、移植細胞を足場材料内に存在せしめたり、本発明の血管新生促進材と足場材料を互いに接触しない状態で埋植することが好ましい。即ち、細胞が足場材料内に存在し、本発明の血管新生促進材と細胞が直接接触しないのであれば、本発明の血管新生促進材と足場材料を互いに接触させた状態で生体内に移植してもよい。しかし、本発明の血管新生促進材と足場材料との距離としては、０．１ｍｍ以上、１ｃｍ以下が好ましい。当該距離が０．１ｍｍ以上であれば、増殖させたい細胞に対する血管新生促進材の悪影響を十分に抑制できる。一方、当該距離が１ｃｍ以下であれば、本発明の血管新生促進材により新生された血管を増殖させたい細胞までより確実に到達させることができる。上記距離としては、８ｍｍ以下がより好ましく、５ｍｍ以下がより更に好ましく、３ｍｍ以下または２ｍｍ以下がより更に好ましい。
【0034】
なお、本発明の血管新生促進材は、使用後、即ち所望の組織や臓器が生体内で再生された後、生体内酵素などで分解され、排出されると考えられる。或いは、本発明の血管新生促進材が生体内酵素などで分解されつつ、細胞増殖因子が経時的に放出され、細胞の分化や増殖が促進される可能性もある。
【実施例】
【0035】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0036】
実施例１： ハイドロゲルの調製
（１）ＰＥＧグラフトヒアルロン酸の合成
各試薬の使用量を表１に示す。１００ｍＬナスフラスコ中、ヒアルロン酸（ＨＡ，ＪＮＣ社製，Ｍn：２３０ｋＤａ）を純水に溶解させた。次いで、片末端がアミノ化されたＰＥＧであるα－メチル－ω－アミノプロピルポリオキシメチレン（ＰＥＧ－ＮＨ2，日油社製，Ｍn：５２０５）を加えた後、更に縮合剤（「ＤＭＴ－ＭＭ」Ｗａｋｏ社製）を加え、室温で２４時間攪拌した。反応終了後、分画分子量１２０００～１４０００の透析膜を用いて３日間透析を行い、不純物を十分に除去した。その後、凍結乾燥した。ＰＥＧグラフトヒアルロン酸は白色の綿上の物質であった。
得られたＰＥＧグラフトヒアルロン酸に関して、リファレンスとしてα－アルミナ（５．４８ｍｇ）を用いて、昇温範囲－３０～１６０℃、昇温速度２℃／ｍｉｎで示差走査熱量測定を行った。６０℃付近のＰＥＧの融解エンタルピーの大きさを面積から算出し、既報を参考に、ＰＥＧの融解エンタルピーΔＨ（ｍＪ／ｍｇ）：ｙとＰＥＧのグラフト率（ｗｔ％）：ｘ間のｙ＝１．６１１３ｘとの関係からグラフト率を算出した。また、先行研究より、使用した原料ＰＥＧとＨＡの質量に対する原料ＰＥＧの質量の割合：ｐと、ＰＥＧグラフトヒアルロン酸の質量に対するグラフトしたＰＥＧの質量の割合：ｑの間にはｑ＝０．６７８ｐの関係があることから、合成されたＰＥＧグラフトヒアルロン酸におけるグラフトしたＰＥＧの割合は、約５質量％および６３質量％と算出された。なお、ＰＥＧグラフトヒアルロン酸の収率は、それぞれ９５％および９１％と高収率であった。
（１）ＰＥＧグラフトヒアルロン酸の合成
各試薬の使用量を表１に示す。１００ｍＬナスフラスコ中、ヒアルロン酸（ＨＡ，ＪＮＣ社製，Ｍn：２３０ｋＤａ）を純水に溶解させた。次いで、片末端がアミノ化されたＰＥＧであるα－メチル－ω－アミノプロピルポリオキシメチレン（ＰＥＧ－ＮＨ2，日油社製，Ｍn：５２０５）を加えた後、更に縮合剤（「ＤＭＴ－ＭＭ」Ｗａｋｏ社製）を加え、室温で２４時間攪拌した。反応終了後、分画分子量１２０００～１４０００の透析膜を用いて３日間透析を行い、不純物を十分に除去した。その後、凍結乾燥した。ＰＥＧグラフトヒアルロン酸は白色の綿上の物質であった。
得られたＰＥＧグラフトヒアルロン酸に関して、リファレンスとしてα－アルミナ（５．４８ｍｇ）を用いて、昇温範囲－３０～１６０℃、昇温速度２℃／ｍｉｎで示差走査熱量測定を行った。６０℃付近のＰＥＧの融解エンタルピーの大きさを面積から算出し、既報を参考に、ＰＥＧの融解エンタルピーΔＨ（ｍＪ／ｍｇ）：ｙとＰＥＧのグラフト率（ｗｔ％）：ｘ間のｙ＝１．６１１３ｘとの関係からグラフト率を算出した。また、先行研究より、使用した原料ＰＥＧとＨＡの質量に対する原料ＰＥＧの質量の割合：ｐと、ＰＥＧグラフトヒアルロン酸の質量に対するグラフトしたＰＥＧの質量の割合：ｑの間にはｑ＝０．６７８ｐの関係があることから、合成されたＰＥＧグラフトヒアルロン酸におけるグラフトしたＰＥＧの割合は、約５質量％および６３質量％と算出された。なお、ＰＥＧグラフトヒアルロン酸の収率は、それぞれ９５％および９１％と高収率であった。
【0037】
【表1】
【0038】
（２）ハイドロゲルの調製
３５ｍｍ ｄｉｓｈ上で、ＨＡを純水（２．０ｍＬ）に加え、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ，ナカライテスク社製，Ｍn：７４００～１０２００）またはエチレングリコール－ε－カプロラクトンブロック共重合体（ＰＥＧ－ＰＣＬ，関西大学より入手，Ｍn：１０３００）を加え、均一な溶液になるまでスパチュラで攪拌した。その後、両末端がアミノ化されたＰＥＧであるα－アミノプロピル－ω－アミノプロピルポリオキシメチレン（ＰＥＧ－ＢＡ，日油社製，Ｍn：２１２１）を加え、完全に溶解するまで攪拌後、縮合剤（「ＤＭＴ－ＭＭ」Ｗａｋｏ社製）を加えた。全試薬が完全に溶解したことを確認した後、室温で２４時間静置した。２４時間経過後、エッペンチューブの先端を使い、それぞれのハイドロゲルを直径１ｃｍ、厚さ２ｍｍに型抜きをした。その後、未反応物を取り除くため純水に２日間浸漬した。この間、純水を３回交換した。洗浄水は、架橋剤導入率の算出のため保管した。洗浄終了後、凍結乾燥して乾燥ハイドロゲルを回収した。得られた乾燥ハイドロゲルは白色の固体であった。また、上記（１）で得られたＰＥＧグラフトヒアルロンを同様に架橋し、乾燥ハイドロゲルを得た。
各乾燥ハイドロゲルの調製に用いた試薬の量を表２に示す。なお、約５質量％および６３質量％のＰＥＧがグラフトしたＰＥＧグラフトヒアルロン酸から得られたハイドロゲルを、それぞれ「ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ」および「ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡ」という。また、ＨＡに水溶性高分子または両親媒性高分子をグラフトさせず単に混合したまま架橋したハイドロゲルである「ＰＥＧ／ＨＡ」および「ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ」の前に付した数字は、ＰＥＧ誘導体とＨＡの合計に対するＰＥＧ誘導体の質量パーセンテージである。
３５ｍｍ ｄｉｓｈ上で、ＨＡを純水（２．０ｍＬ）に加え、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ，ナカライテスク社製，Ｍn：７４００～１０２００）またはエチレングリコール－ε－カプロラクトンブロック共重合体（ＰＥＧ－ＰＣＬ，関西大学より入手，Ｍn：１０３００）を加え、均一な溶液になるまでスパチュラで攪拌した。その後、両末端がアミノ化されたＰＥＧであるα－アミノプロピル－ω－アミノプロピルポリオキシメチレン（ＰＥＧ－ＢＡ，日油社製，Ｍn：２１２１）を加え、完全に溶解するまで攪拌後、縮合剤（「ＤＭＴ－ＭＭ」Ｗａｋｏ社製）を加えた。全試薬が完全に溶解したことを確認した後、室温で２４時間静置した。２４時間経過後、エッペンチューブの先端を使い、それぞれのハイドロゲルを直径１ｃｍ、厚さ２ｍｍに型抜きをした。その後、未反応物を取り除くため純水に２日間浸漬した。この間、純水を３回交換した。洗浄水は、架橋剤導入率の算出のため保管した。洗浄終了後、凍結乾燥して乾燥ハイドロゲルを回収した。得られた乾燥ハイドロゲルは白色の固体であった。また、上記（１）で得られたＰＥＧグラフトヒアルロンを同様に架橋し、乾燥ハイドロゲルを得た。
各乾燥ハイドロゲルの調製に用いた試薬の量を表２に示す。なお、約５質量％および６３質量％のＰＥＧがグラフトしたＰＥＧグラフトヒアルロン酸から得られたハイドロゲルを、それぞれ「ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ」および「ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡ」という。また、ＨＡに水溶性高分子または両親媒性高分子をグラフトさせず単に混合したまま架橋したハイドロゲルである「ＰＥＧ／ＨＡ」および「ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ」の前に付した数字は、ＰＥＧ誘導体とＨＡの合計に対するＰＥＧ誘導体の質量パーセンテージである。
【0039】
【表2】
【0040】
なお、「ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ」および「ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡ」においては、ＰＥＧは全てＨＡにアミド結合しており、遊離のＰＥＧは透析により除去されてハイドロゲル中には実質的に存在していないと考えられる。また、「ＰＥＧ／ＨＡ」および「ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ」においては、縮合剤であるＤＭＴ－ＭＭはアミンに対する反応性が高く、アルコールとアミンが共存している場合でも、生成するエステルはアミドの１％以下であることから（Ｍ．Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５７，１５５１（２００１））、ほぼ全てのＰＥＧおよびＰＥＧ－ＰＣＬはＨＡに共有結合しておらず、ハイドロゲル中に遊離して存在していると考えられる。
【0041】
（３）含水率測定
作製した各乾燥ハイドロゲル（１０ｍｇ）を水中に９日間浸漬させた後、膨潤したハイドロゲルの質量を測定した。膨潤ハイドロゲルの質量（Ｗwet）と乾燥ハイドロゲルの質量（Ｗdry）から、下記式に基づいて含水率を算出した。結果を表３に示す。
含水率（％）＝［（Ｗwet－Ｗdry）／Ｗwet］×１００
作製した各乾燥ハイドロゲル（１０ｍｇ）を水中に９日間浸漬させた後、膨潤したハイドロゲルの質量を測定した。膨潤ハイドロゲルの質量（Ｗwet）と乾燥ハイドロゲルの質量（Ｗdry）から、下記式に基づいて含水率を算出した。結果を表３に示す。
含水率（％）＝［（Ｗwet－Ｗdry）／Ｗwet］×１００
【0042】
【表3】
【0043】
各ハイドロゲルの含水率は９０～９４％となり、各ハイドロゲル間で最大４％の差がみられた。この差は、膨潤ハイドロゲルの質量を測定する際に水気を切る操作に基づく測定誤差によるものと考えられ、今回調製したハイドロゲルの含水率は、ほぼ同程度であると判断された。
なお、ＰＥＧ－ＰＣＬを含むハイドロゲル以外のハイドロゲルは、水を含むことにより無色透明となったが、ＰＧＥ－ＰＣＬを含む膨潤ハイドロゲルは白色であった。よって、ＰＥＧ－ＰＣＬは、ゲル中で凝集体を形成していることが示唆された。
なお、ＰＥＧ－ＰＣＬを含むハイドロゲル以外のハイドロゲルは、水を含むことにより無色透明となったが、ＰＧＥ－ＰＣＬを含む膨潤ハイドロゲルは白色であった。よって、ＰＥＧ－ＰＣＬは、ゲル中で凝集体を形成していることが示唆された。
【0044】
（４）架橋剤の導入率測定
各ハイドロゲルの調製時に用いた洗浄水に含まれる架橋剤（ＰＥＧ－ＢＡ）を２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応させ、分光光度計を用いて３４５ｎｍの吸光度を測定することで、洗浄水に含まれる架橋剤の量を求めた。当該量と、使用した原料架橋剤の量から、各ハイドロゲルの架橋剤反応率を算出した。結果を表４に示す。
各ハイドロゲルの調製時に用いた洗浄水に含まれる架橋剤（ＰＥＧ－ＢＡ）を２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応させ、分光光度計を用いて３４５ｎｍの吸光度を測定することで、洗浄水に含まれる架橋剤の量を求めた。当該量と、使用した原料架橋剤の量から、各ハイドロゲルの架橋剤反応率を算出した。結果を表４に示す。
【0045】
【表4】
【0046】
架橋剤導入率は、８９～９６％とハイドロゲル間で最大７％の差が認められた。グラフト体ではＨＡのカルボン酸がグラフト化に使われており、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡにおいては、架橋剤と反応できるカルボン酸は他のゲルに比べ約５０％しか存在しない。しかし、グラフト率は９１％であったことから、グラフト化による架橋剤導入率への影響は無いと判断された。
【0047】
（５）架橋密度測定
調製したハイドロゲルの架橋密度をオートグラフによる圧縮試験により算出した。具体的には、調製したハイドロゲルを円柱状に裁断し、膨潤前の厚みｔ0と体積Ｖ0を測定した。更にハイドロゲルを純水により膨潤平衡に達するまで膨潤させた後、厚みｔsと体積Ｖsを測定した。表面の水分を軽くふき取り固定式厚板間にハイドロゲルを挿入後、圧縮速度１．０ｍｍ／ｍｉｎでオートグラフ試験を行い、ハイドロゲルの応力を測定した。架橋密度を、以下のゴム弾性の理論式を用いて算出した。
τ＝ＲＴ×（νe／Ｖ0）×ν2 1/3×（α－１／α2）
［式中、τは応力（Ｎ／ｍ2）を示し、Ｒは気体定数（Ｊ／Ｋｍｏｌ）を示し、Ｔは絶対温度（Ｋ）を示し、νe／Ｖ0は架橋密度（ｍｏｌ／ｍ3）を示し、ν2はハイドロゲルの膨潤前後体積比（単位無し）を示し、αは伸長率（Δｌ／ｌ0）を示し、ｌはハイドロゲルの厚みを表す。］
各ハイドロゲル間の結果を、データ分析・グラフ作成ソフト（「ＯＲＩＧＩＮ ８．０３」ライトストーン社）を使ってｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｆｉｓｈｅｒ検定に付した。結果を図１に示す。図１中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
ＨＡの架橋密度に対し、６３ＰＥＧ／ＨＡは約５１％、６３ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡは約３１％、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡは約１０％の架橋密度であり、有意に低いことが分かった。更に、６３ＰＥＧ／ＨＡとＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡ間にも有意差が確認できた。これは、ハイドロゲル中に存在するＰＥＧ誘導体が、立体的な阻害効果を示し架橋剤の導入率を低下させているとため考えられるが、架橋剤導入率は全てのハイドロゲルで同程度であることが上記の実験で証明されている。そのため、この結果は、２官能性である架橋剤の片方の官能基のみ反応し、ＨＡにグラフトしたような構造をとる架橋剤が存在することを示唆する。これにより、架橋剤の導入率は他のハイドロゲルと変わらず、架橋密度の低いハイドロゲルが調製されたと考えられた。また、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡが最も低い架橋密度を示したのは、グラフト化により架橋剤と反応できるカルボン酸量が他のハイドロゲルの半分ほどしかないことに起因し、架橋密度が低下したと考えられる。
調製したハイドロゲルの架橋密度をオートグラフによる圧縮試験により算出した。具体的には、調製したハイドロゲルを円柱状に裁断し、膨潤前の厚みｔ0と体積Ｖ0を測定した。更にハイドロゲルを純水により膨潤平衡に達するまで膨潤させた後、厚みｔsと体積Ｖsを測定した。表面の水分を軽くふき取り固定式厚板間にハイドロゲルを挿入後、圧縮速度１．０ｍｍ／ｍｉｎでオートグラフ試験を行い、ハイドロゲルの応力を測定した。架橋密度を、以下のゴム弾性の理論式を用いて算出した。
τ＝ＲＴ×（νe／Ｖ0）×ν2 1/3×（α－１／α2）
［式中、τは応力（Ｎ／ｍ2）を示し、Ｒは気体定数（Ｊ／Ｋｍｏｌ）を示し、Ｔは絶対温度（Ｋ）を示し、νe／Ｖ0は架橋密度（ｍｏｌ／ｍ3）を示し、ν2はハイドロゲルの膨潤前後体積比（単位無し）を示し、αは伸長率（Δｌ／ｌ0）を示し、ｌはハイドロゲルの厚みを表す。］
各ハイドロゲル間の結果を、データ分析・グラフ作成ソフト（「ＯＲＩＧＩＮ ８．０３」ライトストーン社）を使ってｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｆｉｓｈｅｒ検定に付した。結果を図１に示す。図１中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
ＨＡの架橋密度に対し、６３ＰＥＧ／ＨＡは約５１％、６３ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡは約３１％、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡは約１０％の架橋密度であり、有意に低いことが分かった。更に、６３ＰＥＧ／ＨＡとＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡ間にも有意差が確認できた。これは、ハイドロゲル中に存在するＰＥＧ誘導体が、立体的な阻害効果を示し架橋剤の導入率を低下させているとため考えられるが、架橋剤導入率は全てのハイドロゲルで同程度であることが上記の実験で証明されている。そのため、この結果は、２官能性である架橋剤の片方の官能基のみ反応し、ＨＡにグラフトしたような構造をとる架橋剤が存在することを示唆する。これにより、架橋剤の導入率は他のハイドロゲルと変わらず、架橋密度の低いハイドロゲルが調製されたと考えられた。また、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡが最も低い架橋密度を示したのは、グラフト化により架橋剤と反応できるカルボン酸量が他のハイドロゲルの半分ほどしかないことに起因し、架橋密度が低下したと考えられる。
【0048】
（６）表面性状観察
凍結乾燥後の各ハイドロゲルを約３ｍｍ角に切り取り、アルミ板の上にカーボンテープを用いて接着した。更に白金蒸着を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察した。
ＨＡハイドロゲルには数１０～１００μｍの空孔が多数有する多孔質な構造が確認できた。遊離ＰＥＧを含むハイドロゲルについて、５ＰＥＧ／ＨＡには数１０μｍから大きいもので約２００μｍに相当する空孔が見て取れる多孔質な構造が確認できたが、６３ＰＥＧ／ＨＡには１００μｍ程度の空孔が少数しか確認できなかった。遊離ＰＥＧ－ＰＣＬを含むハイドロゲルは、他のハイドロゲルと比較し、表面のラフネスが観察された。これはＰＥＧ－ＰＣＬの結晶構造が関係していると考えられる。空孔に関しては、５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ、６３ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡともに数１０μｍの空孔が小数しか確認できず、ＰＥＧ－ＰＣＬの重量比が空孔の数や大きさに与える影響は少ないと判断できる。ＰＥＧ－ｇ－ＨＡハイドロゲルについて、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡには１００μｍ程度の空孔が少数確認できたが、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡはひび割れたような構造の中に１０００μｍ程度の空孔が極少数確認できた。ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡは、最も架橋密度が低い値を示す脆いハイドロゲルであり、ハイドロゲル中の巨大な空孔は定性的に架橋密度の低さを支持していると考えられた。
凍結乾燥後の各ハイドロゲルを約３ｍｍ角に切り取り、アルミ板の上にカーボンテープを用いて接着した。更に白金蒸着を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察した。
ＨＡハイドロゲルには数１０～１００μｍの空孔が多数有する多孔質な構造が確認できた。遊離ＰＥＧを含むハイドロゲルについて、５ＰＥＧ／ＨＡには数１０μｍから大きいもので約２００μｍに相当する空孔が見て取れる多孔質な構造が確認できたが、６３ＰＥＧ／ＨＡには１００μｍ程度の空孔が少数しか確認できなかった。遊離ＰＥＧ－ＰＣＬを含むハイドロゲルは、他のハイドロゲルと比較し、表面のラフネスが観察された。これはＰＥＧ－ＰＣＬの結晶構造が関係していると考えられる。空孔に関しては、５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ、６３ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡともに数１０μｍの空孔が小数しか確認できず、ＰＥＧ－ＰＣＬの重量比が空孔の数や大きさに与える影響は少ないと判断できる。ＰＥＧ－ｇ－ＨＡハイドロゲルについて、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡには１００μｍ程度の空孔が少数確認できたが、ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡはひび割れたような構造の中に１０００μｍ程度の空孔が極少数確認できた。ＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡは、最も架橋密度が低い値を示す脆いハイドロゲルであり、ハイドロゲル中の巨大な空孔は定性的に架橋密度の低さを支持していると考えられた。
【0049】
実施例２： 血管誘導率測定
マウス尾を０．１％酢酸による抽出に付し、３ｍｇ／ｍＬ Ｔｙｐｅ Ｉ コラーゲン溶液を得た。当該コラーゲン溶液と、ｐ５３ノックアウトマウス由来の膣間質株細胞であるＰ３ＶＳ細胞（２．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を含む１０×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」Ｓｉｇｍａ社製）と、２６２ｍＭ ＮａＨＣＯ3および０．０５Ｎ ＮａＯＨ含有の２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを８：１：１の割合で且つ総量が５００μＬとなるよう混合し、ＰＥＴ製カルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ社製，孔径：０．４μ）上に流し込み、３７℃で２０分処置して固めることによって、コラーゲンゲルを得た。当該コラーゲンゲル上に、ミュラー管上皮のクローン性株細胞であるＥ１細胞（１．８×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、２４ウェルプレートに設置した。各ウェル中に１０％ Ｅｑｕａ ＦＥＴＡＬ（Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、１０μｇ／ｍＬインシュリン（Ｗａｋｏ社）、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン（ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）、および５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｗａｋｏ社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を５００μＬ入れ、３７℃で１日培養した。上皮細胞の接着を確認した後、カルチャーインサート中から培地を吸引し、１週間毎日培地交換しながら共培養し、Ｅ１細胞とＰ３ＶＳ細胞を含むコラーゲンゲルを得た。
別途、ＨＡ、５ＰＥＧ／ＨＡ、５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ、およびＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡの乾燥ハイドロゲルを２．５ｍｍ3に切断した。２５μｇ／ｍＬの濃度で塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を０．１％ウシ血清由来アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、得られた溶液を各乾燥ハイドロゲルに０．１ｍＬずつ滴下し、２４時間静置することで、一定量のｂＦＧＦを含むハイドロゲルを調製した。
上記コラーゲンゲルを、各ハイドロゲルと共にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（三協ラボサービス）の皮下に移植し、飼料と水を自由摂取させつつ２週間飼育した。
次いで、移植した試料を取り出し、４％パラホルムアルデヒド水溶液中、４℃で一晩固定化し、組織脱水溶液（富士フィルム和光純薬工業社）を使って脱水した。試料をパラフィンに包埋し、６μｍ切片に切断した。切片をキシレンで脱パラフィン化し、再水和し、ＰＢＳですすぎ、０．５％シトラコン酸ナトリウム水溶液中、９５℃で４５分間処理して抗原を露出させた。非特異的結合を、５％ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ製）、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有するＰＢＳ中、室温で３０～６０分間ブロックした。一次抗体として、内皮細胞マーカーであるウサギ抗マウスＣＤ３１抗体（１／２００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いた。切片を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで数回洗浄した後、切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ抗体（１／３００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）と室温で２時間インキュベートし、血管内皮細胞を染色した。５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルを用いた場合の試料の写真を図２に示す。
皮下移植したコラーゲンはホスト組織と癒着していた。図２中、点線はコラーゲンゲルと癒着ホスト組織との境界であり、左側がホスト組織、右側がコラーゲンゲルである。また、緑色蛍光は血管内皮細胞の細胞膜を、青色蛍光は細胞核を表している。移植したコラーゲンゲル中には血管内皮細胞を入れていないことから、ホスト組織側からコラーゲンゲル側に血管が新生していることが認められる。この様に、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルには明確な血管誘導能が認められ、５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルにも同様の結果が確認された。同様の実験を３回繰り返したところ、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを用いた場合のみ３回ともコラーゲンゲルが維持されていたことから、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを用いた実験を６回繰り返した。
一方、ＨＡ、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ、およびＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡのハイドロゲルを用いた場合には、コラーゲンゲルは退縮してしまっており、コラーゲンゲルは１回しか維持されなかったことから、誤差を算出できるほど実験を繰り返すことができなかった。その理由としては、コラーゲンゲルまで血管が新生されず、移植細胞が死滅してしまったことにより、炎症反応などが惹起されてコラーゲンゲルの分解が促進されてしまった可能性が考えられる。一方、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを用いた場合には、コラーゲンゲルまで血管が新生され、移植細胞が維持されたことから、コラーゲンゲルも維持されたと考えられる。
得られた画像を解析し、各画像中に占めるＣＤ３１抗体染色部分、即ち血管部分の割合を算出した。結果を表５に示す。
マウス尾を０．１％酢酸による抽出に付し、３ｍｇ／ｍＬ Ｔｙｐｅ Ｉ コラーゲン溶液を得た。当該コラーゲン溶液と、ｐ５３ノックアウトマウス由来の膣間質株細胞であるＰ３ＶＳ細胞（２．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を含む１０×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」Ｓｉｇｍａ社製）と、２６２ｍＭ ＮａＨＣＯ3および０．０５Ｎ ＮａＯＨ含有の２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒを８：１：１の割合で且つ総量が５００μＬとなるよう混合し、ＰＥＴ製カルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ社製，孔径：０．４μ）上に流し込み、３７℃で２０分処置して固めることによって、コラーゲンゲルを得た。当該コラーゲンゲル上に、ミュラー管上皮のクローン性株細胞であるＥ１細胞（１．８×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、２４ウェルプレートに設置した。各ウェル中に１０％ Ｅｑｕａ ＦＥＴＡＬ（Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、１０μｇ／ｍＬインシュリン（Ｗａｋｏ社）、１０μｇ／ｍＬトランスフェリン（ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）、および５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｗａｋｏ社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を５００μＬ入れ、３７℃で１日培養した。上皮細胞の接着を確認した後、カルチャーインサート中から培地を吸引し、１週間毎日培地交換しながら共培養し、Ｅ１細胞とＰ３ＶＳ細胞を含むコラーゲンゲルを得た。
別途、ＨＡ、５ＰＥＧ／ＨＡ、５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡ、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ、およびＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡの乾燥ハイドロゲルを２．５ｍｍ3に切断した。２５μｇ／ｍＬの濃度で塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を０．１％ウシ血清由来アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水に溶解させ、得られた溶液を各乾燥ハイドロゲルに０．１ｍＬずつ滴下し、２４時間静置することで、一定量のｂＦＧＦを含むハイドロゲルを調製した。
上記コラーゲンゲルを、各ハイドロゲルと共にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（三協ラボサービス）の皮下に移植し、飼料と水を自由摂取させつつ２週間飼育した。
次いで、移植した試料を取り出し、４％パラホルムアルデヒド水溶液中、４℃で一晩固定化し、組織脱水溶液（富士フィルム和光純薬工業社）を使って脱水した。試料をパラフィンに包埋し、６μｍ切片に切断した。切片をキシレンで脱パラフィン化し、再水和し、ＰＢＳですすぎ、０．５％シトラコン酸ナトリウム水溶液中、９５℃で４５分間処理して抗原を露出させた。非特異的結合を、５％ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ製）、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有するＰＢＳ中、室温で３０～６０分間ブロックした。一次抗体として、内皮細胞マーカーであるウサギ抗マウスＣＤ３１抗体（１／２００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いた。切片を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで数回洗浄した後、切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ抗体（１／３００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）と室温で２時間インキュベートし、血管内皮細胞を染色した。５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルを用いた場合の試料の写真を図２に示す。
皮下移植したコラーゲンはホスト組織と癒着していた。図２中、点線はコラーゲンゲルと癒着ホスト組織との境界であり、左側がホスト組織、右側がコラーゲンゲルである。また、緑色蛍光は血管内皮細胞の細胞膜を、青色蛍光は細胞核を表している。移植したコラーゲンゲル中には血管内皮細胞を入れていないことから、ホスト組織側からコラーゲンゲル側に血管が新生していることが認められる。この様に、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルには明確な血管誘導能が認められ、５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルにも同様の結果が確認された。同様の実験を３回繰り返したところ、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを用いた場合のみ３回ともコラーゲンゲルが維持されていたことから、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを用いた実験を６回繰り返した。
一方、ＨＡ、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡ、およびＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡのハイドロゲルを用いた場合には、コラーゲンゲルは退縮してしまっており、コラーゲンゲルは１回しか維持されなかったことから、誤差を算出できるほど実験を繰り返すことができなかった。その理由としては、コラーゲンゲルまで血管が新生されず、移植細胞が死滅してしまったことにより、炎症反応などが惹起されてコラーゲンゲルの分解が促進されてしまった可能性が考えられる。一方、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを用いた場合には、コラーゲンゲルまで血管が新生され、移植細胞が維持されたことから、コラーゲンゲルも維持されたと考えられる。
得られた画像を解析し、各画像中に占めるＣＤ３１抗体染色部分、即ち血管部分の割合を算出した。結果を表５に示す。
【0050】
【表5】
【0051】
表５に示す結果の通り、本発明に係る５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルには、他のハイドロゲルに比べ、明らかに優れた血管新生作用が認められた。
【0052】
実施例３： 上皮誘導評価
上記実施例２と同様にして、ミュラー管上皮のクローン性株細胞であるＥ１細胞と上皮の組織化を誘導するＰ３ＶＳ由来のクローン性間質細胞であるＭ２細胞を含むコラーゲンゲルを作製し、コラーゲンゲルのみ、或いは上記実施例２で効果の認められた５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルと共にマウス皮下に移植し、２週間飼育した後に試料を得た。得られた試料中に上皮組織が存在しているか、また、生存した間質細胞（Ｍ２細胞）を含むコラーゲンゲルが残存しているかを観察した。試料を、上皮組織が存在しておらず且つ生存した間質細胞を含むコラーゲンゲルも存在していなかったものと、少なくともどちらかが存在していたものに分類した。結果を表６に示す。
上記実施例２と同様にして、ミュラー管上皮のクローン性株細胞であるＥ１細胞と上皮の組織化を誘導するＰ３ＶＳ由来のクローン性間質細胞であるＭ２細胞を含むコラーゲンゲルを作製し、コラーゲンゲルのみ、或いは上記実施例２で効果の認められた５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルと共にマウス皮下に移植し、２週間飼育した後に試料を得た。得られた試料中に上皮組織が存在しているか、また、生存した間質細胞（Ｍ２細胞）を含むコラーゲンゲルが残存しているかを観察した。試料を、上皮組織が存在しておらず且つ生存した間質細胞を含むコラーゲンゲルも存在していなかったものと、少なくともどちらかが存在していたものに分類した。結果を表６に示す。
【0053】
【表6】
【0054】
表６に示す結果の通り、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルを共移植した場合には、マウスを２週間飼育した後、得られた試料には、上皮細胞より構成された組織と、生存間質細胞を含むコラーゲンゲルの少なくとも一方が含まれていた。かかる結果をχ2検定に付したところ、ｐ＜０．０５で有意差が認められた。
また、子宮上皮に特異的に発現する転写因子であるＨＭＧＡ２に対する抗体を用いて、子宮上皮の核を緑色蛍光に免疫組織化学染色した５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲル－コラーゲンゲル共移植試料の写真を図３に示す。図３の通り、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルとコラーゲンゲルとを共移植した場合には、コラーゲンゲルとホスト組織の境界付近に単層上皮層が形成され、子宮上皮マーカーであるＨＭＧＡ２の発現も認められたことから、子宮様上皮組織が誘導されたことが示唆された。
これら結果は、本発明のハイドロゲルにより血管が新生され、コラーゲン中の上皮細胞などに酸素や栄養成分が供給されたことによると考えられる。
また、子宮上皮に特異的に発現する転写因子であるＨＭＧＡ２に対する抗体を用いて、子宮上皮の核を緑色蛍光に免疫組織化学染色した５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲル－コラーゲンゲル共移植試料の写真を図３に示す。図３の通り、５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルとコラーゲンゲルとを共移植した場合には、コラーゲンゲルとホスト組織の境界付近に単層上皮層が形成され、子宮上皮マーカーであるＨＭＧＡ２の発現も認められたことから、子宮様上皮組織が誘導されたことが示唆された。
これら結果は、本発明のハイドロゲルにより血管が新生され、コラーゲン中の上皮細胞などに酸素や栄養成分が供給されたことによると考えられる。
【0055】
実施例４： ｂＦＧＦ放出挙動評価
蛍光分子（ＦＩＴＣ）で標識した塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を合成し、濃度１０００μｇ／ｍＬの１２ｍＭ ＰＢＳ溶液を調製した。乾燥した各ハイドロゲルに当該溶液を０．１ｍＬずつ滴下し、４２時間静置することで、１ゲル当たり１００μｇのＦＩＴＣ－ｂＦＧＦを含むハイドロゲルを調製した。
上記ハイドロゲルをティーパックに包み、０．１質量％ＮａＮ3を含む１２ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に入れ、３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，１２０，１８０，３６０，５４０，７２０，１４４０分後、およびそれ以降は２４時間毎に溶液サンプルを取得し、蛍光測定することによりＰＢＳ中に放出されたＦＩＴＣ－ｂＦＧＦの濃度を求めた。測定は各ハイドロゲルにつき６回行い、最大値と最小値を除いた４つのデータから平均値を求めた。結果を図４に示す。
得られた各２群間の結果をｔ－テストにより有意差検定したところ、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡハイドロゲルとＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡハイドロゲルとの間で、インキュベート開始から５，１０，４４０分後を除いてｐ＜０．０５で有意差が認められた他は、一切有意差は認められなかった。
５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルには血管誘導効果や組織形成促進効果が認められた一方で、ＨＡハイドロゲル、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡハイドロゲルおよびＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡハイドロゲルには効果が認められなかったという上記実施例２，３の結果を考慮すれば、ハイドロゲルの血管誘導効果や組織形成促進効果は、細胞増殖因子の徐放作用などとは関係が無いことが分かった。
蛍光分子（ＦＩＴＣ）で標識した塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を合成し、濃度１０００μｇ／ｍＬの１２ｍＭ ＰＢＳ溶液を調製した。乾燥した各ハイドロゲルに当該溶液を０．１ｍＬずつ滴下し、４２時間静置することで、１ゲル当たり１００μｇのＦＩＴＣ－ｂＦＧＦを含むハイドロゲルを調製した。
上記ハイドロゲルをティーパックに包み、０．１質量％ＮａＮ3を含む１２ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に入れ、３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，１２０，１８０，３６０，５４０，７２０，１４４０分後、およびそれ以降は２４時間毎に溶液サンプルを取得し、蛍光測定することによりＰＢＳ中に放出されたＦＩＴＣ－ｂＦＧＦの濃度を求めた。測定は各ハイドロゲルにつき６回行い、最大値と最小値を除いた４つのデータから平均値を求めた。結果を図４に示す。
得られた各２群間の結果をｔ－テストにより有意差検定したところ、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡハイドロゲルとＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡハイドロゲルとの間で、インキュベート開始から５，１０，４４０分後を除いてｐ＜０．０５で有意差が認められた他は、一切有意差は認められなかった。
５ＰＥＧ／ＨＡハイドロゲルと５ＰＥＧ－ＰＣＬ／ＨＡハイドロゲルには血管誘導効果や組織形成促進効果が認められた一方で、ＨＡハイドロゲル、ＰＥＧ５－ｇ－ＨＡハイドロゲルおよびＰＥＧ６３－ｇ－ＨＡハイドロゲルには効果が認められなかったという上記実施例２，３の結果を考慮すれば、ハイドロゲルの血管誘導効果や組織形成促進効果は、細胞増殖因子の徐放作用などとは関係が無いことが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】