(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-02
(45)【発行日】2022-12-12
(54)【発明の名称】バイオミメティック流体処理のためのシステム及び方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20221205BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20221205BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20221205BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N5/078
G01N37/00 101
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021038843
(22)【出願日】2021-03-11
(62)【分割の表示】P 2016559820の分割
【原出願日】2015-03-30
(65)【公開番号】P2021118686
(43)【公開日】2021-08-12
【審査請求日】2021-04-09
(31)【優先権主張番号】61/972,520
(32)【優先日】2014-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】505270980
【氏名又は名称】ブリガム・アンド・ウイミンズ・ホスピタル・インコーポレイテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】507044516
【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ
(73)【特許権者】
【識別番号】515183089
【氏名又は名称】ヴィリニュス ユニヴァーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100134832
【弁理士】
【氏名又は名称】瀧野 文雄
(74)【代理人】
【識別番号】100165308
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 俊明
(74)【代理人】
【識別番号】100115048
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 康弘
(72)【発明者】
【氏名】トーン ジョナサン エヌ．
(72)【発明者】
【氏名】イタリアーノ ジョーセフ イー．
(72)【発明者】
【氏名】マズティス リナス
(72)【発明者】
【氏名】ワイツ デイヴィド エイ．
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－０３１４２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５１０８０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特許第６４２９７９４（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】Nakagawa, Y. et al.，"Two differential flows in a bioreactor promoted platelet generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes"，Exp. Hematol.，2013年，Vol. 41，pp. 742-748
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
長手方向に沿って第１の入力から第１の出力に延在する第１の流路と、前記第１の流路に実質的に平行であり、前記長手方向に沿って第２の入力から第２の出力に延在する第２の流路と、
前記第１の流路と前記第２の流路との間の分離バリアと、を備える微少流体装置を含むバイオミメティック微少流体システムであって、
前記第１の流路は、少なくとも１つの第１の生体組成を第１の流路流量で受けるように構成され、
前記少なくとも１つの第１の生体組成は、ターゲットとなる生体物質を産生可能な生体供給材料を含み、
前記第２の流路は、少なくとも１つの第２の生体組成を第２の流路流量で選択的に受けるように構成され、
前記分離バリアは、前記第１の流路と前記第２の流路との間の流体連通経路を形成する複数の微小流路を有し、
前記複数の微小流路は、前記生体供給材料を選択的に捕捉するようなサイズであり、
前記第１の流路流量及び前記第２の流路流量は、前記複数の微小流路において前記生体供給材料を選択的に捕捉するように構成されているとともに、捕捉された前記生体供給材料によって前記ターゲットとなる生体物質の産生を引き起こすのに十分な範囲内にある前記第２の流路に沿った生理学的せん断速度を生成するように前記第１の流路と前記第２の流路との間の差異を生じさせるように構成されており、
前記第１の入力の上流に位置する第１の流動フィルタと、
前記第２の入力の上流に位置する第２の流動フィルタと、をさらに備え、
前記上流とは、前記少なくとも１つの第１の生体組成及び前記少なくとも１つの第２の生体組成の流れの方向に対して定義されるものである、バイオミメティック微少流体システム。
【請求項2】
前記分離バリアは、前記第１の流路と前記第２の流路の間に配置された、フィルム、一連のカラム、メンブランおよびメッシュのうちの少なくとも１つである、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項3】
前記複数の微小流路は、前記第１の流路と前記第２の流路の間に延在する孔、ギャップ又はスリットの少なくとも１つとして形成される、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項4】
前記生体供給材料は巨核球を含み、前記ターゲットとなる生体物質は血小板を含む、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項5】
前記生理学的せん断速度は、複数の血小板の産生を引き起こすために１００ｓ－１～１０，０００ｓ－１の範囲内になるように生成される、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項6】
前記生理学的せん断速度は、複数の血小板の産生を引き起こすために５００ｓ－１～２，５００ｓ－１の範囲内になるように生成される、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項7】
前記複数の微小流路は、０．１マイクロメートル～２０マイクロメートルの間のサイズである、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項8】
基材をさらに備え、前記第１の流路及び前記第２の流路が前記基材に形成される、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項9】
複数の微少流体装置を備える、請求項１に記載のバイオミメティック微少流体システム。
【請求項10】
生体物質を産生するための方法であって、ターゲットとなる生体物質を産生可能な生体供給材料を含む少なくとも１つの第１の生体組成を、第１の流路流量で請求項１～９のいずれか一項に記載の前記バイオミメティック微少流体システムの第１の流路に導入することと、
第２の生体組成を、第２の流路流量で前記バイオミメティック微少流体システムの第２の流路に導入することと、
前記第１の流路と前記第２の流路との間の分離バリアに流体連通経路を形成する複数の微小流路によって、前記生体供給材料を選択的に捕捉することと、
捕捉された前記生体供給材料によって前記ターゲットとなる生体物質の産生を引き起こすのに十分な前記第２の流路に沿った生理学的せん断速度を生成するように流路間の差異を生じさせることと、を有する、方法。
【請求項11】
前記分離バリアは、前記第１の流路と前記第２の流路の間に配置されたフィルム、一連のカラム、メンブランおよびメッシュのうちの少なくとも１つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記複数の微小流路は、０．１マイクロメートル～２０マイクロメートルの間のサイズである、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
５００ｓ－１～２，５００ｓ－１の範囲内の生理的せん断速度を生成するよう前記差異を生じさせることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記生体供給材料は巨核球を含み、前記ターゲットとなる生体物質は血小板を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
前記第２の生体組成を用いて、産生された前記ターゲットとなる生体物質を収集することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年３月３１日出願された、発明の名称を「バイオミメティック流体処理のためのシステム及び方法」とする米国仮出願第６１／９７２，５２０号に基づいており、同仮出願の利益を主張し、同仮出願を参照により組み込む。
連邦政府の支援を受けた研究に関する陳述
本願は、２０１４年３月３１日出願された、発明の名称を「バイオミメティック流体処理のためのシステム及び方法」とする米国仮出願第６１／９７２，５２０号に基づいており、同仮出願の利益を主張し、同仮出願を参照により組み込む。
連邦政府の支援を受けた研究に関する陳述
【0002】
本開示は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた１Ｋ９９ＨＬ１１４７１９－０１Ａ１及びＨＬ６８１３０に基づく政府支援によりなされた。政府は、本開示における特定の権利を有する。
【0003】
本開示は、一般的には、流体システム、例えば、微少流体装置、このような装置を含むシステム、並びにこのような装置及びシステムを使用する方法に関する。特に、本開示は、バイオミメティックプラットホームに基づく機能的な生体材料、物質、又は作用剤を製造する装置、システム、及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
血小板（ＰＬＴ）は、ホメオスタシス、血管新生、及び先天的な免疫に必須であり、その数が低レベルに下がることは、血小板減少症として公知であり、患者は、出血死の重篤なリスク下にある。低血小板数についての幾つかの原因としては、外科手術、ガン、ガン処置、再生不良性貧血、有害化学物質、アルコール、ウイルス、感染、妊娠、及び特発性免疫性血小板減少症が挙げられる。
【0005】
このような症状を処置するための置換ＰＬＴは、一般的には、その免疫原性及び敗血症に関連するリスクによる重大な臨床的懸念にも関わらず、完全にヒトドナーから得られる。しかしながら、ドナーの静的に近いプールと、細菌検査及び劣化による短い保管寿命とに結びついた、ＰＬＴ輸血に対する増大した需要により生じた不足は、医療専門家が患者に十分な治療を提供するのをより難しくしている。さらに、代替手段、例えば、人工血小板代替物は、現在のところ、生理学的な血小板製品を置き換えることができていない。
【0006】
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＰＬＴは、図８に例示されたプロセスにおいて、巨核球（ＭＫ）として公知の前駆体細胞により産生される。骨髄（ＢＭ）中で血管の外側に位置したＭＫは、類洞血管内において、長く、分岐した細胞構造に伸びる（プロＰＬＴ）。ここで、プロＰＬＴは、せん断速度を受け、ＰＬＴを循環中に放出する。機能的なヒトＰＬＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖するが、今日の細胞培養アプローチでは、約１０％のプロＰＬＴ産生しか得られず、ヒトＭＫ当たりに１０～１００個のＰＬＴしか得られない。対照的に、ヒトにおけるほとんど全ての成熟ＭＫはそれぞれ、循環する血小板数のために、約１，０００～１０，０００個のＰＬＴを産生する必要がある。このことは、血小板輸血単位のｅｘ ｖｉｖｏでの産生において、明らかなボトルネックとなる。
【0007】
加えて、第２世代の細胞培養アプローチは、ＰＬＴ放出の生理学的決定因子に更なる洞察を提供してきたが、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）組成、ＢＭ剛性、内皮細胞接触、又は血管せん断速度の限られた個々の制御を示すＢＭ微小環境全体を再現することはできず、同調性のプロＰＬＴ産生を上手くできず、６～８日の期間にわたる不均一なＰＬＴ放出をもたらした。さらに、高解像での生細胞顕微鏡観察によるプロＰＬＴ伸長を解明し、生理学的に関連する条件下で放出させることができないことは、薬剤開発を可能にするＰＬＴ産生の細胞骨格力学を特定し、血小板減少症のための新たな処置を確立するための努力を
、著しく妨害してきた。したがって、臨床的に有効な数の機能的なヒトＰＬＴを生成可能な、効率的で、ドナーに依存しないＰＬＴシステムが、ＰＬＴの調達及び保管に関連するリスクを回避し、増大する輸血の必要性に合致するのを手助けするのに必要である。
、著しく妨害してきた。したがって、臨床的に有効な数の機能的なヒトＰＬＴを生成可能な、効率的で、ドナーに依存しないＰＬＴシステムが、ＰＬＴの調達及び保管に関連するリスクを回避し、増大する輸血の必要性に合致するのを手助けするのに必要である。
【0008】
上記を考慮して、機能的なヒト血小板の効率的な産生に影響を及ぼすプロセス、メカニズム、及び条件を正確に反映させるために、血管の生理機能を再現することができるプラットホームを利用する、装置、システム、及び方法についての明確な要求が存在し続けている。このようなプラットホームは、輸血用のヒト血小板を効率的に生成し、薬剤有効性及び開発の前臨床段階での相互作用を確立する目的に非常に有用であることを証明するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本開示は、生理学的に正確なモデルを生成可能なシステム及び方法を提供することにより、前述の技術の欠点を克服するためのものである。同モデルは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて見出される条件、環境、構造、及び動的流動を再現する。説明されるであろうように、このような生理学的モデルは、機能的なヒト血小板及び他の生体材料を生成するのに利用することができる。同生体材料は、特定の健康状態、例えば、血小板減少症等の血小板欠損症状の輸血処置に適しているであろう。また、本開示に基づいて得られる生理学的モデルのついての他の用途は、薬剤開発と、薬剤及び処置の評価を含んでもよい。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示の一態様に基づいて、バイオミメティック微少流体システムが提供される。本システムは、基材と、前記基材に形成された第１の流路であって、前記第１の流路が、長手方向寸法に沿って、第１の入力から第１の出力に向かって伸び、かつ、第１の横断方向寸法に沿って伸びる第１の流路と、前記基材に形成された第２の流路であって、前記第２の流路が、前記長手方向寸法に沿って、第２の入力から第２の出力に向かって伸び、かつ、前記第１の横断方向寸法に沿って伸び、前記第１及び第２の流路が、前記長手方向寸法に沿って実質的に平行に伸び、第２の横断方向寸法に沿って伸びるカラムにより分離されている第２の流路とを含む。また、本システムは、前記第１の流路と第２の流路とを分離する前記カラムに形成された一連の開口であって、前記一連の開口がそれぞれ、前記第１の横断方向及び前記第２の横断方向におけるより更に前記長手方向寸法に沿って伸び、前記基材の第１の部分近くに配置され、前記第１の流路から前記第２の流路に向かって伸びて、前記第１の流路と前記第２の流路との間を通過する流体連通経路を形成している一連の開口を含む。さらに、本システムは、前記第１の入力に接続されている第１の供給源であって、前記第１の供給源が、前記第１の流路内に、少なくとも１つの第１の生体組成を、第１の流路流量で選択的に導入するように構成されている第１の供給源と、前記第２の入力に接続されている第２の供給源であって、前記第２の供給源が、前記第２の流路内に、少なくとも１つの第２の生体組成を、第２の流路流量で選択的に導入するように構成されており、前記第１の流路流量及び前記第２の流路流量が、前記流路中において、所定の範囲内で生理学的せん断速度を生じるように構成されている差異を生じさせる第２の供給源とを含む。
【0011】
本開示の別の態様では、骨髄及び血管構造の内の少なくとも一方の生理学的モデルを製造するための方法が開示される。方法は、基材と、前記基材に形成された第１の流路であって、前記第１の流路が、長手方向寸法及び第１の横断方向寸法に沿って、第１の入力から第１の出力に向かって伸びる第１の流路とを含むバイオミメティック微少流体システムを提供することを含む。第２の流路は、前記基材に形成される。前記第２の流路は、前記長手方向寸法及び前記第１の横断方向寸法に沿って、第２の入力から第２の出力に向かって伸びる。第３の流路は、前記基材に形成される。前記第３の流路は、前記長手方向寸法及び前記第１の横断方向寸法に沿って、前記第２の入力から第３の出力に向かって伸びる。ここで、前記第１、第２、及び第３の流路は、前記長手方向寸法に沿って実質的に平行に伸び、かつ、第２の横断方向寸法に沿って伸びる。一連の微小流路は、前記第１の流路を前記第２の流路に接続しており、かつ、前記第３の流路を前記第１の流路に接続している。ここで、前記一連の微小流路は、前記第１の横断方向及び前記第２の横断方向におけるより更に前記長手方向寸法に伸び、前記基材の第１の部分近くに配置されて、前記第１の流路と前記第２の流路との間、及び、前記第１の流路と前記基材の第１の部分近くの前記第３の流路との間を通過する流体連通経路を形成している。また、本方法は、第１の供給源を使用して、第１の生体組成を前記第１の流路内に、第１の流路流量で導入することと、第２の供給源を使用して、第２の生体組成を前記第２の流路及び第３の流路内に、第２の流路流量及び第３の流路流量それぞれで導入して、前記流路中において、所定の範囲内で生理学的せん断速度を生じるように、前記第１、第２、及び第３の流路流量間の差異を生じさせることとを含む。さらに、本方法は、前記生理学的せん断速度により、前記微小流路近くに生じたターゲットとなる生体物質を収集することを含む。
【0012】
本開示の更に別の態様では、別のバイオミメティック微少流体システムが提供される。本システムは、少なくとも１つの基材と、前記少なくとも１つの基材に形成された第１のチャンバであって、前記第１のチャンバが、長手方向寸法に実質的に沿って、第１の入力から第１の出力に向かって伸びる第１のチャンバとを含む。また、本システムは、前記少なくとも１つの基材に形成された第２のチャンバであって、前記第２のチャンバが、前記長手方向寸法に沿って、第２の入力から第２の出力に向かって伸び、前記第１及び第２のチャンバが、前記長手方向寸法に沿って、実質的に平行に伸びる第２のチャンバと、横断方向寸法に沿って、前記第１及び第２のチャンバを分離するメンブランであって、前記メンブランが、前記第１のチャンバと第２のチャンバとの間を通過する流体連通経路を形成しているメンブランとを含む。さらに、本システムは、各入力を使用して、前記第１のチャンバ及び前記第２のチャンバ内に、少なくとも１つの生体組成を、前記チャンバ間に、複数の血小板の産生を促進する生理学的せん断速度を生じさせることができる流量で、選択的に導入するように構成されている少なくとも１つの供給源を含む。
【0013】
本開示の前述及び他の態様及び利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。この説明において、添付の図面を参照する。同図面は、前記説明の一部を構成する。同図面において、本開示の好ましい実施形態を、例示として示される。このような実施形態は、本開示の完全な範囲を必ずしも表していないため、本開示の範囲を解釈するために、特許請求の範囲及び本明細書を参照するものとする。
【0014】
以下、本開示を、添付の図面を参照して説明するものとする。ここで、同じ参照番号は、同じ要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本開示の態様に基づく、例示となるバイオミメティック微少流体システムの模式図を示す。
【図2A】細胞外マトリクス（ＥＣＭ）組成を再現するために、骨髄及び血管のタンパク質でコートされた微少流体流路を示す、顕微鏡観察画像を示す。
【図2B】三次元ＥＣＭ組織化及び生理学的骨髄（ＢＭ）剛性をモデル化した、アルギン酸塩ゲル中に選択的に包埋された微小流路に捕捉された巨核球（ＭＫ）を示す、顕微鏡観察画像を示す。
【図2C】機能的な血管を生成するために、フィブリノゲンコートした第２の流路中で選択的に培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の、顕微鏡観察画像を示す。
【図2D】機能的な血小板（ＰＬＴ）を生成するための完全なシステムの画像を示す。
【図2E】本開示の態様に基づくバイオミメティック微少流体システム内での、せん断速度のシミュレーション分布のグラフィック表示を示す。
【図2F】複数の注入速度についての、第１の流路からの横断距離の関数としてのせん断速度を示すグラフを示す。
【図2G】ブロック微小流路数の関数としてのせん断速度を示すグラフを示す。
【図3A】０及び１８時間で培養されたＭＫの直径分布示すグラフを示す。
【図3B】精製後６時間でのプロＰＬＴの産生を例示する静的培養中でのＭＫの、顕微鏡観察画像を示す。
【図3C】ＭＫ捕捉直後での生理学的せん断下におけるプロＰＬＴ産生を示す、顕微鏡観察画像を示す。
【図3D】生理学的せん断下において得られたプロＰＬＴ産生ＭＫの増大と、静的培養からの増大とを示すグラフを示す。
【図3E】生理学的せん断下におけるプロＰＬＴ伸長速度を示すグラフを示す。
【図4A】幅３μｍの微小流路を通って圧迫されるＭＫを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図4B】幅３μｍの微小流路を通って、大きな断片に伸びているＭＫを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図4C】プロＰＬＴ伸長を例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図4D】プロＰＬＴシャフトに沿った種々の位置における、プロＰＬＴ伸長及び脱離イベントを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図4E】ＰＬＴ産生サイクルを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図4F】生理学的範囲内で増大したせん断速度が、プロＰＬＴ伸長速度を向上させないことを示すグラフを示す。
【図4G】ＧＦＰ－β１チューブリンを発現するようにレトロウイルス性にトランスフェクションされ、プロＰＬＴ伸長を示し、ＰＬＴサイズ端においてコイルを形成する末梢微小管を含んだＭＫを示す、顕微鏡観察画像を示す。
【図4H】５μＭ ジャスプラキノリド（Ｊａｓｐｌａｎｋｉｎｏｌｉｄｅ）（Ｊａｓ、アクチン安定化剤）及び１ｍＭ エリスロ－９－（３－［２－ヒドロキシノニル］（ＥＨＮＡ、細胞質ダイニン阻害剤）が、せん断誘引プロＰＬＴ産生を阻害することを例示するグラフを示す。
【図4I】生理学的せん断下におけるプロＰＬＴ産生の薬剤誘引阻害を例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図5A】本開示に基づいて産生されたＰＬＴが、血中ＰＬＴの構造的及び機能的特性を証明することを例示するグラフを示す。
【図5B】本開示に基づくシステム内に注入され、続けて、４日目に培養から単離されたＧＰＩＸ＋ＭＫと、注入後２時間で溶出液から収集されたＧＰＩＸ＋ＭＫとの、バイオマーカー発現、前方／側方散乱、及び相対濃度を例示するグラフを示す。
【図5C】せん断の適用が、ＧＰＩＸ＋産生を、静的培養上清に対して、よりＰＬＴサイズの細胞にシフトさせることを例示するグラフを示す。
【図5D】ＭＫが、２時間にわたって、ＰＬＴに変換されることを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図5E】せん断の適用が、静的培養上清に対して、よりＰＬＴサイズのβ１チューブリン＋ Ｈｏｅｓｃｈｔ－細胞産生にシフトさせることを示すグラフ表示である。ここで、挿入図は、溶出液中の遊離核の量を示す。
【図5F】本開示に基づいて産生されたＰＬＴが、血中ＰＬＴに超微細構造的に類似し、皮質ＭＴコイル、開放管系、暗調小管系、ミトコンドリア、及び特徴的な分泌顆粒を含有することを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図5G】本開示に基づいて産生されたＰＬＴ及びＰＬＴ中間体が、血中ＰＬＴに形態学的に類似し、匹敵するＭＴ及びアクチン発現を表すことを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図6A】本開示に基づいて得られたｈｉＰＳＣ－ＰＬＴが、血中ＰＬＴの構造的及び機能的特性を証明することを例示するグラフを示す。
【図6B】本開示に基づくｈｉＰＳＣ－ＭＫが、初代ヒトＭＫに超微細構造的に類似し、分葉核、陥入膜系、グリコーゲン貯蔵、オルガネラ、及び特徴的な分泌顆粒を含有することを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図6C】静的培養におけるｈｉＰＳＣ－ＭＫが、精製後６時間でプロＰＬＴを産生し始め、１８時間で最大プロＰＬＴ産生に達することを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図6D】生理学的せん断（約５００ｓ-1）下でのｈｉＰＳＣ－ＭＫが、捕捉直後にプロＰＬＴを産生し始め、プロＰＬＴを培養の最初の２時間以内に伸長／放出することを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図6E】生理学的せん断下でのプロＰＬＴ産生ｈｉＰＳＣ－ＭＫパーセント（％）が、静的培養を上回って顕著に増大することを例示するグラフである。
【図6F】生理学的せん断下でのプロＰＬＴ伸長速度が、約１９μｍ／分であることを例示するグラフである。
【図6G】本開示に基づいて得られたｈＰＬＴが、ヒト血中ＰＬＴに超微細構造的に類似し、皮質ＭＴコイル、開放管系、暗調小管系、ミトコンドリア、及び特徴的な分泌顆粒を含有することを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図6H】本開示に基づいて得られたｈＰＬＴが、ヒト血中ＰＬＴに形態学的に類似し、匹敵するＭＴ及びアクチン発現を表す、顕微鏡観察画像を示す。
【図6I】本開示に基づいて得られたｍＰＬＴが、ガラス表面での活性化及び展開において、フィロポディア（ｆｉｌｐｏｄｉａ）／ラメリポディアを形成することを例示する、顕微鏡観察画像を示す。
【図7】Ｔ－ＤＭ１が、ＭＫ分化を阻害し、異常なチューブリン組織化を誘導することによるプロＰＬＴ形成を妨害することを例示する、生細胞顕微鏡観察画像を示す。
【図8】ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＬＴ産生を示す例示を示す。
【図9】本開示の態様に基づく別の例示となるバイオミメティック微少流体システムの模式図を示す。
【図12】本開示の態様に基づく更に別のバイオミメティック微少流体システムの例示を示す。
【図13】本開示の態様に基づく生理学的モデルを生成するためのプロセスの工程を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
血小板（ＰＬＴ）は、血餅形成及び血管損傷の修復を刺激するのに重要な役割を果たす。低ＰＬＴ数による出血の疾病率及び死亡率は、化学療法又は放射線処置、外傷、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、臓器移植手術、重篤な火傷、敗血症、及び遺伝性障害を含む、数多くの症状にわたって遭遇する主な臨床上の問題である。その免疫原性及び関連するリスクによる重大な臨床上の懸念にも関わらず、高い要求及び短い保存寿命による在庫不足を伴って、ＰＬＴ輸血は、米国において、１年当たりに合計１０００万単位超にもなる。
【0017】
このような幅広い要求及びリスクの認識のもとに、本開示には、生理機能において存在する条件、環境、構造、及び動的流動を再現可能な本明細書のシステム及び方法が記載されている。このようなシステム及び方法は、ヒトの生理機能モデルを生成するのに使用さ
れてもよい。例えば、このモデルは、機能的なヒトＰＬＴを産生するのに使用することができる。
れてもよい。例えば、このモデルは、機能的なヒトＰＬＴを産生するのに使用することができる。
【0018】
ＰＬＴ産生は、巨核球（ＭＫ）の分化が関与する。巨核球は、図８に示されたように、骨髄（ＢＭ）における類洞血管の外側に存在し、長く、分岐した細胞構造（プロＰＬＴと呼ばれる）を、循環内に伸ばす。具体的には、プロＰＬＴは、薄い細胞質間橋により連結されたタンデムアレイ状のＰＬＴサイズの膨張を含む。ｉｎ ｖｉｖｏでは、プロＰＬＴは、血管せん断を受け、ＰＬＴ産生のためのアッセンブリラインとして機能する。プロＰＬＴの詳細な特徴決定は不完全なままであるが、これらの構造は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方において特定されている。
【0019】
ＰＬＴは、プロＰＬＴの先端から連続的に放出される。このメカニズムは、細胞の分子支柱及び桁として機能するチューブリン及びアクチンフィラメントの複雑なネットワークに高度に依存している。微小管（ＭＴ）束は、プロＰＬＴシャフトに対して平行に走り、プロＰＬＴ伸長は、互いに摺動するＭＴにより駆動される。プロＰＬＴ成熟中に、オルガネラ及び分泌顆粒は、ＭＴレール上を遠位に移動して、プロＰＬＴの先端で捕捉される。アクチンは、プロＰＬＴ分岐及びＰＬＴ端の増幅を促進する。マウスＭＫの生細胞顕微鏡観察は、これを理解するのに重要であった。しかしながら、今日の大部分の研究は、静的ＭＫ培養において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われてきた。
【0020】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、ＭＫ分化の主な制御因子として特定されてきた。トロンボポエチンは、培養において、ＭＫの濃縮集団を生成するのに使用されてきた。一参考文献において、プロＰＬＴ産生ＭＫからｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたヒトＰＬＴは機能的であったことが証明された。その後、ＭＫは、胎仔肝細胞（ＦＬＣ）、臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、複数の供給源から分化されてきた。しかしながら、現在の２Ｄ及び液体ＭＫ培養では、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＭＫ当たりに生成される推定約２０００個のＰＬＴの桁を満たさない。ごく最近、モジュール式の３Ｄのニット状ポリエステル足場が、培養において、１００万個のＣＤ３４+ヒト臍帯血細胞から、１日当たりに最大６×１０6個のＰＬＴを産生するために、連続的な流体流動下で適用されてきた。臨床的に有用なＰＬＴ数が得られることが示唆されているが、それらの３Ｄ注入バイオリアクタは、ＢＭ微小環境の複雑な構造及び流体の特徴を正確に再現しておらず、その閉鎖系モジュール設計は、プロＰＬＴ産生の可視化を妨げてしまう。このため、ＰＬＴ放出メカニズムの洞察をほとんど提供しない。代替的に、ＥＣＭコートシルク系チューブに隣接する３Ｄポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）バイオチップが、ＢＭ類洞を再現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＫ分化及びＰＬＴ産生を研究するのに提案されている。このような装置は、成熟中のＭＫ遊走を反復するが、高解像での生細胞顕微鏡観察に適しておらず、ＭＫ分化を駆動するのに必須の内皮細胞接触を再現できていない。
【0021】
ＭＫ分化は、培養中で研究されてきたが、プロＰＬＴ産生を刺激する条件は、特にｉｎ
ｖｉｖｏにおいて、ほとんど理解されていないままである。ＭＫは、ＢＭニッチに見出され、幾つかの証拠から、細胞－細胞、細胞－マトリクス、及びＢＭストローマの可溶性因子相互作用が、プロＰＬＴ形成及びＰＬＴ放出に関与することが示唆されている。実際に、ケモカインであるＳＤＦ－１及び成長因子であるＦＧＦ－４は、ＭＫを類洞内皮細胞にリクルートする。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質は、ＢＭ血管ニッチの別の主な構成物である。証拠から、膜貫通型糖タンパク質（ＧＰ）受容体を介したシグナル伝達は、例えば、ベルナール－スリエ症候群、グランツマン血小板無力症に見出される欠損を伴って、プロＰＬＴ形成、ＰＬＴの数及びサイズを制御することが示唆される。ＩＶ型コラーゲン及びビトロネクチンは、プロＰＬＴ産生を促進する。この産生は、そのコンジュゲートインテグリン受容体であるＧＰＩｂαに対する抗体により阻害され得る。同様に、
フィブリノゲンは、ＧＰＩＩｂｌｌｌａを介したプロＰＬＴ形成及びＰＬＴ放出を制御する。これらの知見は、プロＰＬＴ産生の環境決定因子を明らかにするが、還元論アプローチにより限定される。したがって、ＢＭ複雑性を定義する寄与を包含する新たなモデルが、ＭＫのＰＬＴへの生理学的制御を解明するのに必須である。
ｖｉｖｏにおいて、ほとんど理解されていないままである。ＭＫは、ＢＭニッチに見出され、幾つかの証拠から、細胞－細胞、細胞－マトリクス、及びＢＭストローマの可溶性因子相互作用が、プロＰＬＴ形成及びＰＬＴ放出に関与することが示唆されている。実際に、ケモカインであるＳＤＦ－１及び成長因子であるＦＧＦ－４は、ＭＫを類洞内皮細胞にリクルートする。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質は、ＢＭ血管ニッチの別の主な構成物である。証拠から、膜貫通型糖タンパク質（ＧＰ）受容体を介したシグナル伝達は、例えば、ベルナール－スリエ症候群、グランツマン血小板無力症に見出される欠損を伴って、プロＰＬＴ形成、ＰＬＴの数及びサイズを制御することが示唆される。ＩＶ型コラーゲン及びビトロネクチンは、プロＰＬＴ産生を促進する。この産生は、そのコンジュゲートインテグリン受容体であるＧＰＩｂαに対する抗体により阻害され得る。同様に、
フィブリノゲンは、ＧＰＩＩｂｌｌｌａを介したプロＰＬＴ形成及びＰＬＴ放出を制御する。これらの知見は、プロＰＬＴ産生の環境決定因子を明らかにするが、還元論アプローチにより限定される。したがって、ＢＭ複雑性を定義する寄与を包含する新たなモデルが、ＭＫのＰＬＴへの生理学的制御を解明するのに必須である。
【0022】
ＢＭにおいて、プロＰＬＴは、１００～１０，０００ｓ-1、又は特に、５００～２５００ｓ-1の範囲の、壁せん断速度を受ける。ＰＬＴ血栓形成における連続的な血流の役割が研究されてきたが、驚くべきことに、せん断力がＰＬＴ放出を制御するメカニズムには、ほとんど注意が払われてこなかった。また、調査された際、実験は、真の生理学的条件の代表例ではなかった。幾つかの予備的研究において、ＥＣＭコートしたスライドガラス上に、ＭＫがかけられ、このスライドは、せん断によるＥＣＭ接触活性化を区別することなく、固定化／付着ＭＫを選択する。あるいは、放出されたプロＰＬＴは、インキュベータ振とう機中で、求心性に振とうされてきた。この振とうでは、循環型層状せん断流動が反復されず、血管せん断速度の正確な制御が提供されず、高解像での生細胞顕微鏡観察に適していない。これらの主な制限にも関わらず、ＭＫを高せん断速度に曝すことは、プロＰＬＴ産生を加速させると考えられる。一方、せん断の非存在下で培養されたプロＰＬＴは、流体せん断応力で維持されたプロＰＬＴより、少ないＰＬＴしか放出しなかった。
【0023】
本開示から、微少流体装置が、動的流体流動を生成し、正確に調整することにより、細胞に化学的合図を伝達するための血管条件を模倣するのに、優れたプラットホームを提供することができると認められる。細胞含有ヒドロゲル内に微少流体ネットワークを埋め込むことは、３Ｄ足場を介して、可溶性因子の効率的な対流輸送を支持することが示されている。アガロースに封入された肝細胞、初代軟骨細胞を播種されたアルギン酸カルシウムヒドロゲル、及び３Ｄチューブ状ポリ（エチレングリコール）ヒドロゲルに埋め込まれた内皮細胞からなる、生きた３Ｄ組織接触が製造されている。したがって、この技術は、肝臓、腎臓、腸、及び肺を含む、臓器－オンチップの開発に適用されてきた。加えて、微小血管－オンチップモデルの近年の開発は、心血管生物学及び病態生理学を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて研究するのに使用されてきた。これらの研究から、細胞及び生理学的進行を研究するために、身体的微小環境及び生きた臓器の本来の化学的合図を模倣することの重要性が強調されている。例えば、このことは、ＰＬＴ産生の薬剤媒介性阻害に特に重要である。プロＰＬＴを産生するＭＫは、ＢＭ中において血管外にのみ存在するため、ＢＭの半固体ＥＣＭ微小環境及び循環の流体微小環境の両方と相互作用させて、バイオミメティック微少流体バイオチップは、関連する生理学的メカニズム、例えば、薬剤誘引血小板減少症を担うメカニズムを解明するモデルシステムを達成することができる。
【0024】
ここから図１に切り替えて、本開示の種々の実施形態に基づく、バイオミメティックシステム１００の非限定的な例を例示する模式図を示す。システム１００は、基材１０１と、第１の流路１０２と、第２の流路１０４とを含む。ここで、各流路は、例えば、限定されず、粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成等を輸送する、又は、これらからなる、任意の流体媒体の流動を運ぶように構成されている。一実施形態において、システム１００及び／又は基材１０１は、細胞不活性ケイ素系有機ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して構成されていてもよい。
【0025】
第１の流路１０２は、第１の流路入力１０６及び第１の流路出力１０８を含む。同様に、第２の流路１０４は、第２の流路入力１１０及び第２の流路出力１１２を含む。第１の流路１０２及び第２の流路１０４は、説明されるであろうように、所望の流動プロファイル、速度、又は量、例えば、生理学的システムにおけるものを達成するために、実質的に長手方向に沿って伸び、長手方向及び横断方向に寸法を有する。一態様において、前記流路を説明する長手方向１３０及び横断方向１３２の寸法サイズは、例えば、骨髄及び血管の場合には、解剖学的又は生理学的構造、アッセンブリ、構成、又は配置と一致する範囲にあることができる。例として、長手方向１３０寸法は、１０００～３０，０００マイクロメートル、又は特に、１０００～３０００マイクロメートルの範囲にあることができる。横断方向１３２寸法は、１００～３，０００マイクロメートル、又は特に、１００～３００マイクロメートルの範囲にあることができる。ただし、他の値も可能である。一部の態様では、各流路は、例えば、粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成等を、横断している流体媒体から、受容、局在化、捕捉、又は蓄積するように、作製、調節、又は製造されてもよい。
【0026】
また、システム１００は、第１の流路１０２と第２の流路１０４とを分離する一連のカラム１１４も含む。カラム１１４の長軸は、前記流路の長手方向１３０寸法に対して実質的に平行に配置されることができる。一連のカラム１１４は、前記流路の長手方向１３０寸法と実質的に等しい距離を伸びる。カラム１１４は、一連のギャップ又は微小流路１１６により分離されてもよい。一連のギャップ又は微小流路１１６は、第１の流路１０２から第２の流路１０４に向かって伸びて、カラム１１４間を通過する部分的な流体連通経路を形成している。ただし、前記ギャップに言及する場合、「微小流路」という用語は、特定の幅を伴うものではない。例えば、前記ギャップは、マイクロメートル範囲より実質的に大きくてもよいし、又は、同範囲より小さくてもよい。一部の態様では、カラム１１４及び微小流路１１６は、カラム１１４及び微小流路１１６の概ね近傍の領域に、粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成等が、結合、付着することができ、又は、同領域に他の方法で閉じ込められることができるような寸法である。例として、カラム１１４の長手方向１３０及び横断方向１３２寸法は、１～２００マイクロメートルの範囲にあることができる。一方、カラム１１４間の分離距離又はギャップにより画定される微小流路１１６の長手方向１３０寸法は、０．１～２０マイクロメートルの範囲にあることができる。ただし、他の値も可能である。
【0027】
一部の態様では、第１の流路１０２中の第１の媒体の流動は、第１の注入口１１８に接続されている第１の供給源を使用して確立されてもよい。ここで、前記第１の媒体の流動は、第１の排出口１２０を介して抜き取り可能である。同様に、第２の流路１０４中の第２の媒体の流動は、第２の注入口１２２に接続されている第２の供給源を使用して確立されてもよい。ここで、前記第２の媒体の流動は、第２の排出口１２４を介して抜き取り可能である。ただし、第１の流路１０２又は第２の流路１０４からの流動は、それらの間の流体連通により、第１の排出口１２０又は第２の排出口１２４のいずれから抜き取られてもよい。一部の構成では、第１の排出口１２０若しくは第２の排出口１２４のいずれか、又は両方は、前記第１の供給源若しくは第２の供給源、又は両方を使用して確立された流動を、排出又は捕捉するための性能を含んでもよい。また、このような性能は、所望の材料又は物質、例えば、血小板又は栓球を、捕捉された流動から分離する能力を含んでもよい。
【0028】
前記第１及び第２の供給源（図１において図示せず）は、制御された流動又は流体圧を送達するために構成された任意のシステム、例えば、微少流体ポンプシステムを含んでもよく、任意の数の要素又はコンポーネント、例えば、流動制御装置、アクチュエータ等を含んでもよい。任意の所望又は必要とされる量の時間持続可能な流速又は流量は、供給源の特定の構成、要素、及びコンポーネントを使用して、並びに、第１の流路１０２及び第２の流路１０４に関連する幾何学的寸法により制御されてもよい。一部の態様では、第１の流路１０２及び第２の流路１０４中の流量は、例えば、骨髄及び血管において見出される生理学的条件を複製するように制御されてもよい。例えば、流量は、ＰＬＴを生成するのに十分な所望の血管せん断速度を達成するように制御されてもよい。
【0029】
また、システム１００は、任意の形状又は形態のろ過要素及び抵抗要素を含んでもよく、流動方向に応じて、前記第１及び第２の流体媒体それぞれの経路に沿って配置されてもよい。具体的には、前記ろ過要素は、通過中の流体媒体から、任意の種類のデブリ、ダスト、及び他の汚染物質、又は、望ましくない材料、要素、若しくは微粒子を捕捉又は除去するように設計されていてもよい。加えて、前記抵抗要素は、流動力又は流量の減衰変動を制御するのが望ましい場合がある。一部の構成では、図１に示されたように、ろ過要素１２６は、望ましくない汚染物質を直ちに捕捉するために、第１の注入口１１８及び第２の注入口１２２近くに配置されることができる。次に、流動抵抗要素１２８は、図１に示されたように、ろ過要素１２６から下流に配置されてもよい。
【0030】
一部の実施例において、ｅｘ ｖｉｖｏでヒト骨髄（ＢＭ）血管ニッチを再構成することは、第１の流路１０２を、血小板産生を制御する骨粉、ペプチド、又はタンパク質の任意の組み合わせにより、選択的に満たすことにより達成されてもよい。同組み合わせとしては、制限されず、Ｃｌ、ＣＩＶ、ＦＧ、ＦＮ、ＶＮ、ＬＮ、ＶＷＦ、ポリ－Ｌ－リジン、フィブリノゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｓ１ＰＲ１、ＳＤＦ－１、及びＦＧＦ－４、ゲル、例えば、アガロース、アルギン酸塩、及びマトリゲル、又は、溶液、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳ、ＤＭＥＭ、ＥＧＭ、若しくは他の培地が挙げられる。あるいは、ＥＣＭタンパク質は、表面スライドへのバイオチップ付着前にタンパク質マイクロ／ナノスタンプを使用して、又は、微少流体装置アッセンブリ後に平行微少流体流を使用して、ガラス表面又は多孔質メンブラン上に直接パターン化されてもよい。局所的な成分濃度は、整列及び３Ｄ配置に注目して、注入中に前記微少流体流の流量を制御することにより調節されてもよい。
【0031】
他の実施例では、ヒトＢＭ血管を反復することは、内皮細胞を摂氏３７度及び５％ ＣＯ2で培養することにより、第２の流路１０４を選択的にコートすることにより達成され
てもよい。内皮細胞は、４％ ホルムアルデヒドで固定されてもよく、細胞の局在及びアーキテクチャを解明するために細胞のバイオマーカーについてプローブされてもよい。内皮化されたＢＭバイオチップの第２の流路１０４は、蛍光又は発色媒体、例えば、ＦＩＴＣ－デキストラン、又は、ビーズで満たされてもよく、サンプル／細胞／分子拡散を評価し、血管透過性を決定するために、生細胞顕微鏡観察により可視化されてもよい。
てもよい。内皮細胞は、４％ ホルムアルデヒドで固定されてもよく、細胞の局在及びアーキテクチャを解明するために細胞のバイオマーカーについてプローブされてもよい。内皮化されたＢＭバイオチップの第２の流路１０４は、蛍光又は発色媒体、例えば、ＦＩＴＣ－デキストラン、又は、ビーズで満たされてもよく、サンプル／細胞／分子拡散を評価し、血管透過性を決定するために、生細胞顕微鏡観察により可視化されてもよい。
【0032】
ここから図９に切り替えて、本開示の種々の実施形態に基づく、バイオミメティックシステム９００の別の非限定的な例を示す。システム９００は、基材９０２を含む。基材９０２には、第１又は中央の流路９０４が、中央の流路９０４に対して側方又は隣接する第２及び第３の流路又は側方の流路９０６と共に形成されている。システム９００の各流路は、例えば、限定されず、粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成、作用剤等を輸送する、又は、これらからなる、任意の流体媒体の流動を運ぶように構成されていてもよい。一部の態様では、システム９００及び／又は基材９０２は、細胞不活性ケイ素系有機ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＣ、ＰＳ、ＰＭＭＡ、ガラス、及び／若しくは任意の他の適切な材料、又はそれらの組み合わせを使用して構成されていてもよい。特定の構成では、基材９０２は、分離可能で、再密閉でき、又は接着可能なコンポーネント、例えば、前記基材の第１の部分９０３及び第２の部分９０５を含んでもよいし、又は、同部分から組み立てられてもよく、適切な技術及び方法を使用して作製及び／又は組み合わせられてもよい。
【0033】
中央の流路９０４及び側方の流路９０６は、長手方向９０８に沿って実質的に平行に伸びる。一部の好ましい態様では、長手方向９０８並びに横断方向９１０及び９１２に沿って前記流路を画定する寸法は、生理学的構造と一致する範囲にあることができる。またさらに、特定の寸法は、細胞、物質、組成、若しくは他の材料の前記流路への堆積を促進し、又は、所望の流体流動プロファイル、速度、圧力、若しくは量、例えば、生理学的システムに関連するものを、持続、制御、若しくは再現するのが望ましい場合がある。一部の設計では、横断方向９１０及び９１２に沿った中央の流路９０４及び側方の流路９０６の寸法は、図９に例示されたように、等しくある必要はない。例として、全流路の長手方向９１４は、１０００～３０，０００マイクロメートルの範囲にあることができる。一方、各流路についての横断方向寸法は、１０～３，０００マイクロメートルの範囲、又は特に、１０～１５０マイクロメートルの範囲にあることができる。長手方向及び横断方向の寸法について、他の値も可能である。
【0034】
前記流路は、長手方向９０８に対して概ね平行に配置され、前記流路の長手方向寸法９１４に実質的に等しい距離を伸びるカラム９１６により分離される。カラム９１６は、任意の数の開口９１８を含んでもよい。開口９１８は、前記流路間に部分的な流体連通経路を形成している。開口９１８は、必要に応じた形状、寸法、及び配置をとる。開口９１８は、例えば、開口部、スリット、孔、ギャップ、微小流路等であることができる。これらは、中央の流路９０４と第１及び／又は第２の側方の流路９０６の各々との間に伸びる。例として、開口９１８の長手方向及び横断方向寸法は、０．１～２０マイクロメートルの範囲にあることができる。ただし、他の値も可能である。図９に例示されたように、開口９１８は、横断方向寸法より長い長手方向寸法を有してもよい。一部の好ましい設計では、開口９１８は、図９に例示されたように、前記基材の第１の部分９０３近くに概ね位置する。最後に、開口９１８は、前記基材の第１の部分９０３に向かって伸びてもよい。これにより、捕捉されたＭＫ及び／又はプロＰＬＴが、例えば、流体媒体を通過することにより生じる流体圧又は圧力差により、前記基材の第１の部分９０３の表面に圧迫されることができる。前記基材の第１の部分９０３が透明である場合、改善された解像度を、プロＰＬＴ及びＰＬＴ産生プロセスを画像化することに関して達成することができる。この方法において、開口９１８は、所望の生体物質、例えば、ＰＬＴを最適に産生し、又は、同生体物質の収量を最大化するように、配置され、形成され、寸法決定されてもよい。
【0035】
図９に示されたように、中央の流路９０４は、第１の流路入力又は中央の流路入力９２０と、第１の流路出力又は中央の流路出力９２２とを含む。側方の流路９０６は、第２の流路入力又は側方の流路入力９２４を共有してもよく、別々の第２及び第３の流路出力又は側方の流路出力９２６を含んでもよい。側面の流路入力９２４の近くで、システム９００の各側方の流路９０６は、拡張部分又はポート９２８を含む。特定の動作モードでは、拡張部分又はポート９２８は、各側方の流路９０６それぞれについての更なる流体入力又は出力として機能することができる。この機能は、説明されるであろうように、システム９００に柔軟性の増大を提供する。
【0036】
また、システム９００は、ろ過性能を含んでもよい。同ろ過性能は、任意の形状又は形態をとることができ、通過中の流体から、任意の種類のデブリ、ダスト、及び任意の他の汚染物質を捕捉又は吸着するように構成されていることができる。一方で、同ろ過性能は、流体に含有される細胞、作用剤、又は他の所望の材料、例えば、ＭＫの流動を可能にする。図９に示された非限定的な構成において、ろ過要素９３０は、側方の流路入力９２４の近くに配置されてもよい。また加えて、システム９００は、流動制御性能を含んでもよい。同流動制御性能は、各種の形状又は形態をとることができ、流動力又は流量の減衰変動を制御するように設計されることができる。図９に示された非限定的な構成では、流動抵抗要素９３２が、流路入力９２０及び９２４の近くに配置されてもよい。
【0037】
図１を参照して説明されたように、前記流路、カラム９１６、及び開口９１８は、概ね前記流路内、又は、カラム９１６及び開口９１８近傍の任意の領域に、粒子、細胞、物質、微粒子、材料、組成等が、結合、付着することができ、又は、同領域に他の方法で閉じ込められることができるように作製されてもよい。これにより、開口９１８近くの領域から、任意の所望又はターゲットとなる生体物質の収集が可能となる。前記流路及び／又はカラム９１６及び／又は開口９１８を予めコートするための組成、材料、又は作用剤の非限定的な例としては、制限されず、ウシ血清アルブミン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、ポリ－Ｌ－リジン、ビトロネクチン、ＣＣＬ５、Ｓ１ＰＲ１、ＳＤＦ－１、ＦＧＦ－４、及び他の細胞外マトリクスタンパク質、又は血小板産生を制御するタンパク質を挙げることができる。一部の態様では、このようなコーティングは、システム９００の作製工程中に、又は、前記流路を通した流体媒体流動によるその後の注入までに行われることができる。加えて、前記流路には、細胞又は他の生体組成及び材料が播種されてもよく、制限されず、ヒト又は非ヒトの内皮細胞、間葉系細胞、骨芽細胞、及び繊維芽細胞が挙げられる。特に、三次元細胞外マトリクス組織化及び生理学的骨髄剛性を複製又は模倣するために、細胞が、ヒドロゲル溶液中に注入されてもよい。このヒドロゲル溶液は、その後に重合されてもよい。前記ヒドロゲル溶液としては、制限されず、アルギン酸塩、マトリゲル、及びアガロースを挙げることができ、例えば、必要に応じて、任意の流路内に選択的に充填されてもよい。
【0038】
図１０に切り替えて、システム９００の例示となる動作方式を示す。同動作方式は、所望の又はターゲットとなる生体物質、例えば、血中ＰＬＴを生成する、例示となるプロセス１０００を示す。具体的には、工程１００２において、第１の生体材料又は組成を、中央の流路入力９２０を介して提供する。このような生体材料としては、ＰＬＴを生成するために含有される細胞、例えば、ＭＫを挙げることができる。次いで、工程１００４において、前記生体材料の少なくとも幾らかの部分が、説明されたように、カラム９１６及び開口９１８の概ね周囲の領域に付着することができる。例えば、ＭＫが、開口９１８近くに捕捉されてもよい。工程１００６において、ターゲットとなる生体物質を、前記流路における流量、速度、せん断速度、又は圧力差により生成することができる。例えば、ＭＫの通過として伸長したプロＰＬＴは、開口９１８周囲で捕捉されるか、又は、開口９１８を通してろ過され、その後、ＰＬＴに変換する。工程１００８において、ターゲットとなる産生された生体物質は、前記流体媒体により運ばれ、その後の使用のために、溶出液から収集及び分離することができる。工程１０１０において、収集後処理を行ってもよい。例えば、工程１０１０は、前記バイオリアクタから得られた血小板を、ＦＤＡ認可保存媒体、例えば、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ、Ｔｒｉｍａ Ａｃｃｅｌ等により製造された血小板添加溶液に透析するプロセスを含んでもよい。例えば、動的透析システム、例えば、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ等により製造された、低せん断で、０．７５ｍｍ、０．６５μ ｍＰＥＳルーメンを通過させる連続的な流動を使用する透析システムを、使用することができる。さらに、工程１０１０における収集後処理は、ＦＤＡにより要求された場合、ヒトへの注入前に血小板生成物を照射するプロセスを含んでもよい。このため、培養培地を、ヒトの患者に注入することができる媒体で置き換えてもよい。
【0039】
システム９００の固有の設計特徴は、双方向的な方法において、更なる流体入力又は出力として機能する、説明された入力、出力、及び拡張部分又はポート９２８により、媒体が選択的に注入されることができることである。すなわち、媒体、細胞、又は任意の材料、組成、若しくは物質を、任意又は全ての前記流路内に、前進又は後退両方の流体流動により、別々に又は同時に導入することができる。したがって、例えば、２つの側方の流路９０６によるＰＬＴの収集効率向上に加えて、システム９００により、各流路を独立して制御し、異なる動作条件、例えば、媒体、細胞、コーティング剤、材料、せん断速度、流体流動方向等の直接比較を容易にすることもできる。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＰＬＴを産生するための例示となる流体流動実施例を例示する。これにより、ＭＫを、中央の流路９０４（図１１Ａ）、又は、側方の流路９０６（図１１Ｂ）のいずれか若しくは両方のいずれかに導入することができる。
【0040】
ここから図１２に切り替えて、本開示の種々の実施形態に基づく、バイオミメティックシステム１２００の別の非限定的な例を示す。システム１２００は、基材１２０２を含む。例として、基材１２０２は、細胞不活性ケイ素系有機ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＣ、ＰＳ、ＰＭＭＡ、ガラス、及び／若しくは任意の他の適切な材料、又はそれらの組み合わせを使用して構成されていてもよい。図１２に示されたように、基材１２０２は、基材１２０２に形成された、第１のチャンバ１２０４と、第２のチャンバ１２０６とを含む。これらのチャンバは、多孔質メンブラン１２０８により分離されている。
【0041】
一部の用途では、システム１２００は、例えば、第１のチャンバ１２０４、第２のチャンバ１２０６、又は多孔質メンブラン１２０８を個々に作製するために、組み立て又は分解を必要とする場合がある。システム１２００自体は、第２の基材（図１２において図示せず）を含んでもよい。この場合、第１のチャンバ１２０４は、第１の基材１２０２に形成され、第２のチャンバ１２０６は、前記第２の基材に形成される。システム１２００自体は、第１のチャンバ１２０４及び第２のチャンバ１２０６が着脱可能に連結されるのを可能にする更なる機構を含んでもよい。例えば、システム１２００は、第１のチャンバ１２０４、第２のチャンバ１２０６、及び多孔質メンブラン１２０８間の流体密封を壊す又は修復するのを容易にするコンポーネント又は要素を含んでもよい。
【0042】
第１のチャンバ１２０４及び第２のチャンバ１２０６は、所望の用途に応じて選択された長手方向及び横断方向寸法を有して、任意の所望の方法で、形成され、寸法決定されることができる。例えば、ターゲットとなる生体物質、例えば、ＰＬＴを所望の収量で産生するために、前記チャンバの寸法は、流量、速度プロファイル、せん断速度、せん断応力、又は前記チャンバ間の圧力差を制御するのに最適化されてもよい。図１２の例に示されたように、第１のチャンバ１２０４及び第２のチャンバ１２０６は、長手方向に沿って実質的に平行に伸びてもよい。例として、前記チャンバは、１０００～３０，０００マイクロメートルの範囲の長手方向寸法と、１０～３００マイクロメートルの範囲の横断方向寸法とを含んでもよい。ただし、他の値も可能である。
【0043】
一部の構成では、システム１２００内外へのガス輸送を可能にする開口部も、第１のチャンバ１２０４の上面に包含されてもよい。疎水性ガス透過性メンブラン自体が、材料が前記開口部から出てしまうのを防止するために、第１のチャンバ１２０４近くに積層されてもよい。このような実施例において、システム１２００は、例えば、場合により、例えば、再密閉式チップホルダを使用して互いにクランプされた、疎水性ガス透過性メンブラン、第１のチャンバ１２０４、多孔質メンブラン１２０８、及び第２のチャンバ１２０６を含む。ここで、各チャンバは、説明されたように、別々の基材に形成されている。
【0044】
多孔質メンブラン１２０８は、第１のチャンバ１２０４と第２のチャンバ１２０６との間に部分的な流体連通経路を形成することができる、任意の要素であることができる。例えば、多孔質メンブラン１２０８は、メッシュ又は、多孔質メンブラン１２０８に構成された孔、開口、若しくは微小流路を有する薄膜でもよい。多孔質メンブラン１２０８は、特定の用途に基づいて、形作られ、形成され、寸法決定される。例として、多孔質メンブラン１２０８は、ポリカーボネート材料、ＰＤＭＳ、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＣ、ＰＳ、又はＰＭＭＡ等の材料を使用して構成されることができる。加えて、多孔質メンブラン１２０８は、１～１００ミリメートルの範囲にある横方向及び横断方向寸法を含んでもよく、０．１～３０マイクロメートル、及び特に、８～１２マイクロメートルの範囲にある厚みを有してもよい。ただし、他の寸法も可能な場合がある。一部の設計では、多孔質メンブラン１２０８は、システム１２００の個々のチャンバの寸法を超えて伸びることができる。具体的には、多孔質メンブラン１２０８は、以下に説明されたように、複数の同時プロＰＬＴ産生プロセスを支持する性能と共に、所望の生体材料、細胞等を捕捉するための大きな表面積を有して構成されてもよく、したがって、ＰＬＴ収量の増大に寄与する。
【0045】
多孔質メンブラン１２０８に適した孔径の選択は、細胞、例えば、ＭＫの最大捕捉を達
成することができるようにあることができる。例えば、多孔質メンブラン１２０８は、直径が０．１～２０マイクロメートル、及びより具体的には、５～８マイクロメートルの範囲にある孔を有することができる。一部の態様では、多孔質メンブラン１２０８は、特定の材料、化学物質、又は作用剤を含むように作製されてもよい。例えば、多孔質メンブラン１２０８は、血小板産生を制御するペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ－Ｌ－リジン、フィブリノゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｓ１ＰＲ１、ＳＤＦ－１、ＦＧＦ－４等を含んでもよい。
成することができるようにあることができる。例えば、多孔質メンブラン１２０８は、直径が０．１～２０マイクロメートル、及びより具体的には、５～８マイクロメートルの範囲にある孔を有することができる。一部の態様では、多孔質メンブラン１２０８は、特定の材料、化学物質、又は作用剤を含むように作製されてもよい。例えば、多孔質メンブラン１２０８は、血小板産生を制御するペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ－Ｌ－リジン、フィブリノゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｓ１ＰＲ１、ＳＤＦ－１、ＦＧＦ－４等を含んでもよい。
【0046】
図１２に示されたように、第１のチャンバ１２０４は、注入口１２１０及び排出口１２１２を含む。同様に、第２のチャンバ１２０６は、注入口１２１４及び排出口１２１６を含む。一部の態様では、前記チャンバは、種々の化学物質、作用剤、又は材料を使用して、１つ以上の供給源を使用する各チャンバ注入口を通した注入により、又は、関連する基材における個々の層をインキュベートすることにより、個々に作製されることができる。他の態様では、第１のチャンバ１２０４及び第２のチャンバ１２０６の注入による作製は、並行して行われてもよい。すなわち、化学物質、作用剤、又は材料を含有する流体は、層状の流動流が混ざらないように、両方の注入口から導入されてもよく、両方の排出口から収集されてもよい。
【0047】
システム１２００と共に使用するための化学物質、作用剤、又は材料の非限定的な例としては、ウシ血清アルブミン（例えば、１～１０％）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、及び他の細胞外マトリクスタンパク質、又は血小板産生を制御するタンパク質を挙げることができる。加えて、一方又は両方のチャンバには、細胞が播種されて、骨髄及び血管組成を、関連する細胞培養中の個々の層を通して注入ことにより、又は、同層をインキュベートすることにより反復することができる。これらとしては、限定されず、ヒト又はマウスの内皮細胞、間葉系細胞、骨芽細胞、及び繊維芽細胞等が挙げられる。さらに、三次元細胞外マトリクス組織化及び生理学的骨髄剛性をモデル化するために、細胞が、ヒドロゲル溶液中に注入されることができる。前記ヒドロゲル溶液としては、制限されず、アルギン酸塩及びアガロースが挙げられ、システム１２００内で重合されてもよい。
【0048】
また、システム１２００は、ろ過性能を含んでもよい。同ろ過性能は、任意の形状又は形態をとることができ、通過中の流体から、任意の種類のデブリ、ダスト、及び任意の他の汚染物質を捕捉又は吸着するように構成されていることができる。一部の態様では、フィルタはそれを通して、細胞、作用剤、又は他の所望の材料、例えば、ＭＫの流動を可能にする。また加えて、システム１２００は、流動制御性能を含んでもよい。同流動制御性能は、各種の形状又は形態をとることができ、流動力又は流量の減衰変動を制御するように設計されることができる。またさらに、システム１２００は、システム１２００を通って流動する任意の媒体の流動を確立、持続、又は排出するように構成されている、任意のシステム、装置、供給源、又は機器を含んでもよい。説明されたように、これは、システム１２００のチャンバ内に生体組成を、前記チャンバ間に生理学的せん断を所定の範囲内で生成可能な流量で導入することにより、生理学的条件を複製可能な１つ以上の供給源を含んでもよい。ここで、前記所定の範囲は、１００ｓ-1～１０，０００ｓ-1であることができる。
【0049】
図１２に示されたように、一部の設計では、システム１２００の複数のコピーが、バイオミメティック装置又はシステムを構成するように、アレイ状にアッセンブリされてもよい。システム１２００の各コピーは、他のコピーとは独立して、又は、他のコピーと関連して動作する。このようなアプローチは、ＰＬＴ産生プロセスを並列化させるのに都合がよく、効率的な方法を提供することができる。例えば、１つのシステム１２００の注入口及び／又は排出口は、第２のシステム１２００の注入口及び／又は排出口に接続されてい
てもよい等である。一部の設計では、注入口は、生体材料、例えば、ＭＫが、各システム１２００内に１つ以上の供給源を使用して、ランダムに又は同時に導入及び分布されてもよいような方式で設計されてもよい。加えて、各システム１２００からの排出口は、アレイ状の全システム１２００からの、ターゲットとなる生体物質、例えば、プロＰＬＴ及びＰＬＴを含有する流出液の１つの容器内に収集可能な１つの主な流路に接続されていてもよい。
てもよい等である。一部の設計では、注入口は、生体材料、例えば、ＭＫが、各システム１２００内に１つ以上の供給源を使用して、ランダムに又は同時に導入及び分布されてもよいような方式で設計されてもよい。加えて、各システム１２００からの排出口は、アレイ状の全システム１２００からの、ターゲットとなる生体物質、例えば、プロＰＬＴ及びＰＬＴを含有する流出液の１つの容器内に収集可能な１つの主な流路に接続されていてもよい。
【0050】
例として、寸法５０ミリメートル×７５ミリメートルの多孔質メンブラン１２０８について、１６０個超のシステム１２００が、１つのバイオミメティック装置上に組み合わせられてもよい。各システム１２００についての孔数が約１．２×１０8個であると考える
と、これは、各装置が、約２×１０10個の細胞を捕捉可能である場合があることを意味しており、これは、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物及びヒト）での検査及び注入に十分な数のＰＬＴを産生するのに十分高い値を表す。
と、これは、各装置が、約２×１０10個の細胞を捕捉可能である場合があることを意味しており、これは、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物及びヒト）での検査及び注入に十分な数のＰＬＴを産生するのに十分高い値を表す。
【0051】
システム１２００は、複数の利点を含む。同利点には、多孔質メンブラン１２０８上に位置する孔の第１の表面を、規定されたＥＣＭタンパク質で特異的にコートし、孔の第２の表面をこれらのタンパク質によらず又は他のＥＣＭタンパク質によりコートするための能力が挙げられる。これは、ＭＫが、前記第１の表面で、対象となるそのタンパク質と接触して留まることができるのを確保する。一方、プロＰＬＴは伸び、ＰＬＴを、互いに接触から放出する。加えて、説明されたように、システム１２００の設計は、特定の用途で必要とされたような、種々の材料で構成され、種々の孔径を有する種々の多孔質メンブラン１２０８の洗浄又は交換を容易にする。
【0052】
本開示の態様に基づくシステム１００、９００、及び１２００は、寸法、環境、及び条件をその中で複製することにより、ヒトの生理機能において見出された生理学的条件を複製又は再現するプラットホームを提供する。例えば、図１を参照して説明されたように、密接に間隔が空いたカラムにより分離されている微少流体流路は、制御された環境及び流動条件を受け、ヒトＢＭを複製する現実的な生理学的モデルを提供する。システム１００、９００、及び１２００を使用して、ＭＫ捕捉、ＢＭ剛性、ＥＣＭ比較、微小流路サイズ、血行動態血管せん断、及び内皮細胞接触を制御することにより、機能的なＰＬＴを生成することができる。
【0053】
図１３に切り替えて、生理学的モデルを製造するためのプロセス１３００の工程を示す。この場合、前記モデルは、骨髄及び血管構造の内の少なくとも一方を含むことができる。プロセスブロック１３０２において、任意の数の生体組成を、例えば、図１、９、及び１２を参照して説明されたように、提供されたバイオミメティック微少流体システム内に導入することができる。一部の実施例では、プロセスブロック１３０２は、提供されたシステムの第１の流路又はチャンバ内に、第１の流量で第１の供給源を使用して、第１の生体組成を導入することと、提供されたシステムの第２の流路又はチャンバ内に、第２の流量で第２の供給源を使用して、第２の生体組成を導入することとを含んでもよい。他の実施例では、前記システムの第３の流路又はチャンバ内に、第３の流量で前記第２又は第３の供給源を使用して、前記第２又は第３の生体組成を導入してもよい。説明されたように、各流路又はチャンバは、供給源及び流動の任意の組み合わせを使用して、生体組成により作製、処理、及び／又は注入されてもよい。この場合、各生体組成としては、半固体、固体、液体、細胞等、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。
【0054】
プロセスブロック１３０４において、流量を、流路又はチャンバ間に所望の差異を生じさせるために制御することができる。一部の態様では、このような流量を制御することは、血小板産生を容易にするであろう所定の範囲内の生理学的せん断速度を生成することができる。例えば、このような所定の範囲は、１００ｓ-1～１０，０００ｓ-1、及びより具体的には、５００ｓ-1～２５００ｓ-1でもよい。一部の態様では、流量の各方向を、図１１を参照して説明されたように、反転させてもよい。次に、プロセスブロック１３０６において、例えば、提供されたバイオミメティック微少流体システム中に構成された前記微小流路近くで産生されたターゲットとなる生体物質を、前記溶出液から収集してもよい。説明されたように、このようなターゲットとなる生体物質は、血小板を含むことができる。一部の態様では、前記溶出液は、ターゲットとなる生体物質を前記溶出液から抽出するために、プロセスブロック１３０６における数多くの処置工程を受けてもよい。
【0055】
これらのアプローチに利用される材料及び方法の更なる例が、以下に詳細に説明される。これらの例は、例示の目的のみで提供され、本開示の範囲を限定することを全く意図していないことが認められるであろう。実際に、本明細書に示され、説明されたものに加えて、種々の改変、例えば、血液脳関門に対する適用性又は別々の媒体にわたる分子拡散が可能である場合がある。例えば、寸法、構成、材料、細胞種、微粒子、流動性媒体、及び流量、作製法及びレシピ、並びに、画像化、処置、及び分析法等を含む特定の実施例が説明される。ただし、この実施例は、添付の特許請求の範囲の範囲内で使用され、同範囲内にあることができることが、認められるであろう。
【実施例】
【0056】
微少流体装置の設計及び作製
ソフトリソグラフィを使用して、微少流体装置を作製した。図１の例に示されたように、前記装置は、気泡及びダストを捕捉するための受動フィルタ、続けて、流体抵抗を含む２つの流路を含んだ。前記流体抵抗は、動作中に上昇する流量の変動を減衰させるのに使用した。前記流路を、長さ１３００マイクロメートル、幅１３０マイクロメートル、及び深さ３０マイクロメートルの長方形領域に組み合わせ、３マイクロメートルの間隔を空けた一連のカラム（幅１０マイクロメートル及び長さ９０マイクロメートル）により分離した。効率的なガス交換を確保し、細胞培養中における高解像での生細胞顕微鏡観察を支持するために、前記微少流体装置を、スライドガラスと結合させた細胞不活性ケイ素系有機ポリマーで構築した。
ソフトリソグラフィを使用して、微少流体装置を作製した。図１の例に示されたように、前記装置は、気泡及びダストを捕捉するための受動フィルタ、続けて、流体抵抗を含む２つの流路を含んだ。前記流体抵抗は、動作中に上昇する流量の変動を減衰させるのに使用した。前記流路を、長さ１３００マイクロメートル、幅１３０マイクロメートル、及び深さ３０マイクロメートルの長方形領域に組み合わせ、３マイクロメートルの間隔を空けた一連のカラム（幅１０マイクロメートル及び長さ９０マイクロメートル）により分離した。効率的なガス交換を確保し、細胞培養中における高解像での生細胞顕微鏡観察を支持するために、前記微少流体装置を、スライドガラスと結合させた細胞不活性ケイ素系有機ポリマーで構築した。
【0057】
ＡｕｔｏＣＡＤにおけるＡｕｔｏＤｅｓｋソフトウェアを使用して、所望の２Ｄパターンを設計し、フォトリソグラフィクロムマスクに印刷した。シリコンウエハ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗａｆｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、ＳＵ－８ ３０２５フォトレジスト（Ｍｉｃｈｒｏｃｈｅｍ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）で、膜厚３０マイクロメートルにスピンコートし（Ｌａｕｒｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｗａｌｅｓ，ＰＡ）、６５℃で１分間及び９５℃で５分間ベーキングし、前記クロムマスクを通して、ＵＶ光（約１０ｍＪ ｃｍ-2）に３０秒間露光させた。プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート中に前記基材を７分間沈めることにより、結合しなかったＳＵ－８フォトレジストを除去した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を、前記シリコンウエハのパターン化された側上に注ぎ、脱気し、６５℃で約１２時間架橋させた。硬化後、ＰＤＭＳ層を、型から剥がし、注入口及び排出口の孔を、直径０．７５ｍｍの生検用パンチで開けた。ＰＤＭＳスラブをガラスのカバースライド（＃１．５、０．１７×２２×５０ｍｍ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｓｅｎｅｆｆｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に結合させ、続けて、酸素プラズマ（ＰｌａｓｍａＰｒｅｐ ２、ＧａＬａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ ＧｍｂＨ，Ｂａｄ Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理することにより、前記流路を密封した。ＰＥ／２チューブ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ，Ｌａｋｅ Ｈａｖａｓｕ Ｃｉｔｙ，ＡＺ）を介し、２７ゲージ針を備えた１ｍＬのシリンジ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、サンプルを、前記微少流体装置内に注入した。液体の流量を、シリンジポンプ（ＰＨＤ ２０００、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）により制御した。
【0058】
微少流体装置の動作
細胞がガラスと直接接触するのを防止するために、装置を、０．２２μｍろ過した１０％ ＢＳＡ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で、３０分間コートした。図１を参照して、第１の注入口１１８及び第２の注入口１２２それぞれに、１２．５μＬ／時間の量で、２つのシリンジ微少流体ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、初代ＭＫ及び媒体を注入した。第１の排出口１２０を閉じた時点で、両入力溶液を、初代ＭＫを捕捉させる第２の排出口１２４に方向を変えさせた。
細胞がガラスと直接接触するのを防止するために、装置を、０．２２μｍろ過した１０％ ＢＳＡ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で、３０分間コートした。図１を参照して、第１の注入口１１８及び第２の注入口１２２それぞれに、１２．５μＬ／時間の量で、２つのシリンジ微少流体ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、初代ＭＫ及び媒体を注入した。第１の排出口１２０を閉じた時点で、両入力溶液を、初代ＭＫを捕捉させる第２の排出口１２４に方向を変えさせた。
【0059】
細胞外マトリクス組成モデリング（２Ｄ）
前記流路をローダミン－コンジュゲートフィブリノゲン（１ｍｇ／ｍＬ）又はフィブロネクチン（５０μｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｏｎ Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）で３０分間満たすことにより、微少流体装置を、細胞外マトリクスタンパク質で選択的にコートした。層状の流動流が混ざらないように、サンプルを、両注入口を通して平行に注入し、両排出口から収集した。装置を、１×ＰＢＳで洗浄し、任意の残りの曝されたガラスをコートするために、０．２２μｍろ過した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）１０％ ＢＳＡ溶液（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で、３０分間コートした。
前記流路をローダミン－コンジュゲートフィブリノゲン（１ｍｇ／ｍＬ）又はフィブロネクチン（５０μｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｏｎ Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）で３０分間満たすことにより、微少流体装置を、細胞外マトリクスタンパク質で選択的にコートした。層状の流動流が混ざらないように、サンプルを、両注入口を通して平行に注入し、両排出口から収集した。装置を、１×ＰＢＳで洗浄し、任意の残りの曝されたガラスをコートするために、０．２２μｍろ過した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）１０％ ＢＳＡ溶液（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で、３０分間コートした。
【0060】
ＢＭ剛性モデリング（３Ｄ）
初代ＭＫを、培養培地中に、平均分子量１５０～２５０ｋＤ（Ｐｒｏｎｏｖａ ＳＬＧ１００、ＦＭＣ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｙ）を有する、１％ 無菌アルギン酸塩中に再懸濁させ、ＭＫが捕捉されるまで、前記微少流体装置（図１における、第１の注入口１１８、第２の排出口１２４）にわたって満たした。次いで、前記第２の流路を、１×ＰＢＳで選択的に満たして、この流路からアルギン酸塩を除去した。均一なアルギン酸塩ゲルを作製するために、３０ｍＭ ナノ粒子炭酸カルシウム（ｍｋＮＡＮＯ，Ｃａｎａｄａ）を、カルシウム源として使用し、ゆっくり加水分解する、６０ｍＭ Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解させ、これにより、前記溶液中にカルシウムを放出する（Ｋｈａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ ＮＪＰ ２０１３をレビューすること）。前記炭酸カルシウム懸濁液を、前記第１の流路に保持された前記アルギン酸塩溶液が重合するまで（約２０分間）、前記第２の流路に沿って注入した。次いで、前記第２の流路を、１×ＰＢＳで選択的に洗浄し、培養培地で置き換えた。アルギン酸塩ゲルの機械的特性を決定するために、０．２５％、０．５％、１．０％、及び２．０％ アルギン酸塩ゲルを調製し、その周波数依存性せん断係数を、３７℃におけるレオロジーにより測定した（Ａｒｅｓ Ｇ２ ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）。
初代ＭＫを、培養培地中に、平均分子量１５０～２５０ｋＤ（Ｐｒｏｎｏｖａ ＳＬＧ１００、ＦＭＣ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｙ）を有する、１％ 無菌アルギン酸塩中に再懸濁させ、ＭＫが捕捉されるまで、前記微少流体装置（図１における、第１の注入口１１８、第２の排出口１２４）にわたって満たした。次いで、前記第２の流路を、１×ＰＢＳで選択的に満たして、この流路からアルギン酸塩を除去した。均一なアルギン酸塩ゲルを作製するために、３０ｍＭ ナノ粒子炭酸カルシウム（ｍｋＮＡＮＯ，Ｃａｎａｄａ）を、カルシウム源として使用し、ゆっくり加水分解する、６０ｍＭ Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶解させ、これにより、前記溶液中にカルシウムを放出する（Ｋｈａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ ＮＪＰ ２０１３をレビューすること）。前記炭酸カルシウム懸濁液を、前記第１の流路に保持された前記アルギン酸塩溶液が重合するまで（約２０分間）、前記第２の流路に沿って注入した。次いで、前記第２の流路を、１×ＰＢＳで選択的に洗浄し、培養培地で置き換えた。アルギン酸塩ゲルの機械的特性を決定するために、０．２５％、０．５％、１．０％、及び２．０％ アルギン酸塩ゲルを調製し、その周波数依存性せん断係数を、３７℃におけるレオロジーにより測定した（Ａｒｅｓ Ｇ２ ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）。
【0061】
類洞血管接触モデリング（３Ｄ）
微少流体装置を、上記されたように、５０μｇ／ｍＬ フィブロネクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｏｎ Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ ＣＯ）及び１０％ ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で選択的にコートし、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベータに移した。ＥＢＭ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の１０００万個／ｍＬ ＨＵＶＥＣを、前記フィブロネクチンコート流路上に、１２．５μＬ／時間で播種し、この表面に３時間にわたって付着させた。前記注入口のサンプルを、細胞を含まないＥＢＭ培地に置き換え、ＨＵＶＥＣがコンフルエントに達するまで（２～８日）、前記流路を通して満たした。細胞を、５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ及び１μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、４５分間染色し、新鮮な培地で洗浄し、又は、４％ ホルムアルデヒド中で固定させ、共焦点蛍光顕微鏡観察により可視化した。
微少流体装置を、上記されたように、５０μｇ／ｍＬ フィブロネクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｏｎ Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ ＣＯ）及び１０％ ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で選択的にコートし、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベータに移した。ＥＢＭ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中の１０００万個／ｍＬ ＨＵＶＥＣを、前記フィブロネクチンコート流路上に、１２．５μＬ／時間で播種し、この表面に３時間にわたって付着させた。前記注入口のサンプルを、細胞を含まないＥＢＭ培地に置き換え、ＨＵＶＥＣがコンフルエントに達するまで（２～８日）、前記流路を通して満たした。細胞を、５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ及び１μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、４５分間染色し、新鮮な培地で洗浄し、又は、４％ ホルムアルデヒド中で固定させ、共焦点蛍光顕微鏡観察により可視化した。
【0062】
血管せん断速度モデリング（３Ｄ）
ＭＫに加えられるせん断応力を、前記微少流体装置内における流体力学のコンピュータモデルで推定した。市販の有限要素法ソフトウェア（ＣＯＭＳＯＬ）を使用して、ナビエ－ストークス方程式を解いた。圧縮できない流動についての定常状態ナビエストークス流動方程式は、下記のとおりである。
ＭＫに加えられるせん断応力を、前記微少流体装置内における流体力学のコンピュータモデルで推定した。市販の有限要素法ソフトウェア（ＣＯＭＳＯＬ）を使用して、ナビエ－ストークス方程式を解いた。圧縮できない流動についての定常状態ナビエストークス流動方程式は、下記のとおりである。
【0063】
【数1】
【0064】
式中、ρは、流体密度であり、ｐは、圧力であり、μは、流体粘度であり、ｆは、流体における物体力作用である。前記微少流体装置の正確な寸法を複製する３次元コンピュータドメインにおいて、上記方程式（１）を解いた。前記装置内の流体は、水の粘度及び密度（それぞれ、０．００１Ｐａｓ及び１０００ｋｇ／ｍ3）を有すると推定された。すべ
り境界条件は、前記流路壁において推定されなかった。注入流量は、１２．５～２００μＬ／時間の範囲であった。スリットでより細かく作製した三角形メッシュを使用して、前記ドメインを離散化した。前記モデルは、３１５，３１７度の自由度を含んだ。メッシュの独立性を、せん断速度間における１０％未満の差異を得ることにより確認し、２５１，１０１～４１５，３０９度の自由度が見出された。ＵＭＦＰＡＣＫ線形系ソルバーを使用して、定常状態の溶液を得た。
り境界条件は、前記流路壁において推定されなかった。注入流量は、１２．５～２００μＬ／時間の範囲であった。スリットでより細かく作製した三角形メッシュを使用して、前記ドメインを離散化した。前記モデルは、３１５，３１７度の自由度を含んだ。メッシュの独立性を、せん断速度間における１０％未満の差異を得ることにより確認し、２５１，１０１～４１５，３０９度の自由度が見出された。ＵＭＦＰＡＣＫ線形系ソルバーを使用して、定常状態の溶液を得た。
【0065】
初代マウス巨核球培養
マウスＦＬＣを、ＷＴ ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から収集し、ＭＫを培養した。
マウスＦＬＣを、ＷＴ ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から収集し、ＭＫを培養した。
【0066】
電子顕微鏡観察
巨核球入力物及びバイオリアクタ溶出物を、０．１Ｍ カコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中の１．２５％ パラホルムアルデヒド、０．０３％ ピクリン酸、２．５％ グルタルアルデヒドで、１時間固定し、１％ 四酸化オスミウムで後固定し、一連のアルコールにより脱水し、プロピレンオキシドを浸潤させ、エポキシ樹脂中に包埋した。超薄切片を染色し、Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴｗｉｎ電子顕微鏡（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）により、加速電圧８０ｋＶで調べた。ＡＭＴデジタル取得及び解析ソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を使用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＡＭＴ）２Ｋ電荷結合素子カメラにより、画像を記録した。
巨核球入力物及びバイオリアクタ溶出物を、０．１Ｍ カコジル酸塩バッファー（ｐＨ７．４）中の１．２５％ パラホルムアルデヒド、０．０３％ ピクリン酸、２．５％ グルタルアルデヒドで、１時間固定し、１％ 四酸化オスミウムで後固定し、一連のアルコールにより脱水し、プロピレンオキシドを浸潤させ、エポキシ樹脂中に包埋した。超薄切片を染色し、Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴｗｉｎ電子顕微鏡（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）により、加速電圧８０ｋＶで調べた。ＡＭＴデジタル取得及び解析ソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を使用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＡＭＴ）２Ｋ電荷結合素子カメラにより、画像を記録した。
【0067】
免疫蛍光顕微鏡観察
巨核球、放出されたプロＰＬＴ、又はバイオリアクタ溶出物を精製し、プローブした。サンプルを、５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、４５分間インキュベートし、新鮮な媒体で洗浄し、生細胞蛍光顕微鏡観察により可視化し、又は、４％ ホルムアルデヒド中で固定し、ポリ－Ｌ－リジン（１μｇ／ｍＬ）でコートしたカバーガラス上で遠心分離した。細胞骨格成分の分析のために、サンプルを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で透過処理し、免疫蛍光ブロッキングバッファー（５０ｍｌ １×ＰＢＳ中の０．５ｇ ＢＳＡ、０．２５ｍｌ １０％ アジ化ナトリウム、５ｍｌ ＦＣＳ）中で、抗体標識前に一晩ブロッキングした（５５）。微小管細胞骨格を描写するために、サンプルを、マウス又はヒトβ１－チューブリン用のウサギポリクローナル一次抗体とインキュベートした。アクチン細胞骨格を描写するために、サンプルを、Ａｌｅｘａ ５６８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とインキュベートした。細胞核を、１μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識した。バックグラウンド蛍光及び非特異的抗体標識を補正するために、スライドを、二次抗体単独とインキュベートした。したがって、全ての画像を調節した。サンプルを、１０×（開口数、０．３０）Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ ａｉｒ及び６３×（開口数、１．４）Ｐｌａｎ－ＡｐｏＣｈｒｏｍａｔオイル液浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で調べた。ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、画像を得た。画像解析ソフトウェアであるＭｅｔａｍｏｒｐｈバージョン７．７．２．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）及びＩｍａｇｅＪバージョン１．４７ｐソフトウェア（ＮＩＨ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｅｚｐ－ｐｒｏｄ１．ｈｕｌ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｉｊ／）を使用して、画像を解析した。
巨核球、放出されたプロＰＬＴ、又はバイオリアクタ溶出物を精製し、プローブした。サンプルを、５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、４５分間インキュベートし、新鮮な媒体で洗浄し、生細胞蛍光顕微鏡観察により可視化し、又は、４％ ホルムアルデヒド中で固定し、ポリ－Ｌ－リジン（１μｇ／ｍＬ）でコートしたカバーガラス上で遠心分離した。細胞骨格成分の分析のために、サンプルを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で透過処理し、免疫蛍光ブロッキングバッファー（５０ｍｌ １×ＰＢＳ中の０．５ｇ ＢＳＡ、０．２５ｍｌ １０％ アジ化ナトリウム、５ｍｌ ＦＣＳ）中で、抗体標識前に一晩ブロッキングした（５５）。微小管細胞骨格を描写するために、サンプルを、マウス又はヒトβ１－チューブリン用のウサギポリクローナル一次抗体とインキュベートした。アクチン細胞骨格を描写するために、サンプルを、Ａｌｅｘａ ５６８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とインキュベートした。細胞核を、１μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識した。バックグラウンド蛍光及び非特異的抗体標識を補正するために、スライドを、二次抗体単独とインキュベートした。したがって、全ての画像を調節した。サンプルを、１０×（開口数、０．３０）Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ ａｉｒ及び６３×（開口数、１．４）Ｐｌａｎ－ＡｐｏＣｈｒｏｍａｔオイル液浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で調べた。ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、画像を得た。画像解析ソフトウェアであるＭｅｔａｍｏｒｐｈバージョン７．７．２．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）及びＩｍａｇｅＪバージョン１．４７ｐソフトウェア（ＮＩＨ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｅｚｐ－ｐｒｏｄ１．ｈｕｌ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｉｊ／）を使用して、画像を解析した。
【0068】
細胞サイズ及び形態決定
細胞について、個々に閾値を決め、高含量細胞質領域及び周辺測定を、ＩｍａｇｅＪにおいて、以下に概説された研究者コードソフトウェアを使用して行った。解析を、全サンプルの手検測により確認した。不適切に閾値決定された細胞を、この解析から除外した。ＭＫの直径を、非円形細胞を説明するために、面積測定から算出した。２０００個超の細胞を、各条件についてカウントした。ＭＫ面積及び溶出液組成の解析を、少なくとも３つの独立したサンプルについて行った。対応するサンプルについての両側のスチューデントｔ検定を使用して、統計学的有意差を確立した。エラーバーは、平均周囲のある標準偏差を表す。
細胞について、個々に閾値を決め、高含量細胞質領域及び周辺測定を、ＩｍａｇｅＪにおいて、以下に概説された研究者コードソフトウェアを使用して行った。解析を、全サンプルの手検測により確認した。不適切に閾値決定された細胞を、この解析から除外した。ＭＫの直径を、非円形細胞を説明するために、面積測定から算出した。２０００個超の細胞を、各条件についてカウントした。ＭＫ面積及び溶出液組成の解析を、少なくとも３つの独立したサンプルについて行った。対応するサンプルについての両側のスチューデントｔ検定を使用して、統計学的有意差を確立した。エラーバーは、平均周囲のある標準偏差を表す。
【0069】
生細胞顕微鏡観察
せん断培養のために、ＭＫを、「ネイキッド」な微少流体装置（ＢＳＡコートのみ）にロードした。注入量を、１２．５μＬ／時間から２００μＬ／時間に、２時間にわたって漸次倍加させた。静的培養のために、単離されたＭＫを、３％ ＢＳＡでコートしたガラスのカバースライドを、１ｃｍの孔を有する１０ｍｍペトリ皿上に載せることにより形成されたチャンバ中にピペッティングし、２４時間培養した。静的及びせん断培養を両方とも、３７℃及び５％ ＣＯ2で維持し、１０×（開口数、０．３０）Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆ
ｌｕａｒ ａｉｒ対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｃａｒｌ
Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で調べた。ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、２秒（せん断培養）又は２０分（静的培養）のいずれかの間隔で、微分干渉（ＤＩＣ）画像を得た。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈバージョン７．７．２．０画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）及びＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．４７ｐを使用して、画像を解析した。プロＰＬＴ伸長速度を、少なくとも３つの独立したサンプルからの２００個のＭＫにわたって手作業で決定した。ＰＬＴ展開実験のために、溶出液を、微少流体装置から２時間後に収集し、上記されたように、コートしていない静的培養チャンバ中にピペッティングした。ＰＬＴを、重力沈降によりガラスと接触させた。展開を、５秒間隔で５分間にわたって捕捉した。
せん断培養のために、ＭＫを、「ネイキッド」な微少流体装置（ＢＳＡコートのみ）にロードした。注入量を、１２．５μＬ／時間から２００μＬ／時間に、２時間にわたって漸次倍加させた。静的培養のために、単離されたＭＫを、３％ ＢＳＡでコートしたガラスのカバースライドを、１ｃｍの孔を有する１０ｍｍペトリ皿上に載せることにより形成されたチャンバ中にピペッティングし、２４時間培養した。静的及びせん断培養を両方とも、３７℃及び５％ ＣＯ2で維持し、１０×（開口数、０．３０）Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆ
ｌｕａｒ ａｉｒ対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｃａｒｌ
Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で調べた。ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、２秒（せん断培養）又は２０分（静的培養）のいずれかの間隔で、微分干渉（ＤＩＣ）画像を得た。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈバージョン７．７．２．０画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）及びＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．４７ｐを使用して、画像を解析した。プロＰＬＴ伸長速度を、少なくとも３つの独立したサンプルからの２００個のＭＫにわたって手作業で決定した。ＰＬＴ展開実験のために、溶出液を、微少流体装置から２時間後に収集し、上記されたように、コートしていない静的培養チャンバ中にピペッティングした。ＰＬＴを、重力沈降によりガラスと接触させた。展開を、５秒間隔で５分間にわたって捕捉した。
【0070】
ＧＦＰ－β１チューブリンレトロウイルストランスフェクション
Ｄｅｎｄｒａ２融合β１チューブリンを、ｐＭＳＣＶプラスミド中にクローニングした。パッケージング細胞であるＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥＭ中で、３０～５０％コンフルエントに培養した。ｇａｇ／ｐｏｌ、ｖｓｖＧ、及び、ｐＭＳＣＶベクター中でＤｅｎｄｒａ２と融合したβ１チューブリンをコードする、２μｇ ＤＮＡプラスミドを使用して、ＨＥＫ ２９３細胞のトランスフェクションを行った。翌日、培地を交換した後、細胞を、ウイルス産生のために、７２時間インキュベートした。０．２２μｍ フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を通して、上清をろ過した。アリコートを、－８０℃で保存した。培養の２日目に、上記された胎仔肝臓培養物から単離されたＭＫを、１０％ ＦＢＳ、８μｇ／ｍＬ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）、及び前記レトロウイルス上清を含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させた。サンプルを、６ウェルプレートに移し、８００×ｇにおいて、２５℃で９０分間遠心分離し、次いで、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート後、ＭＫを、遠心分離により洗浄し、１０％ ＦＢＳ及びＴＰＯを含有する新鮮なＤＭＥＭ中に再懸濁させた。ＭＫを、培養の４日目までに成熟させ、次いで、先に説明されたように、ＢＳＡ勾配により単離した。
Ｄｅｎｄｒａ２融合β１チューブリンを、ｐＭＳＣＶプラスミド中にクローニングした。パッケージング細胞であるＨＥＫ ２９３細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥＭ中で、３０～５０％コンフルエントに培養した。ｇａｇ／ｐｏｌ、ｖｓｖＧ、及び、ｐＭＳＣＶベクター中でＤｅｎｄｒａ２と融合したβ１チューブリンをコードする、２μｇ ＤＮＡプラスミドを使用して、ＨＥＫ ２９３細胞のトランスフェクションを行った。翌日、培地を交換した後、細胞を、ウイルス産生のために、７２時間インキュベートした。０．２２μｍ フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を通して、上清をろ過した。アリコートを、－８０℃で保存した。培養の２日目に、上記された胎仔肝臓培養物から単離されたＭＫを、１０％ ＦＢＳ、８μｇ／ｍＬ ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）、及び前記レトロウイルス上清を含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させた。サンプルを、６ウェルプレートに移し、８００×ｇにおいて、２５℃で９０分間遠心分離し、次いで、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート後、ＭＫを、遠心分離により洗浄し、１０％ ＦＢＳ及びＴＰＯを含有する新鮮なＤＭＥＭ中に再懸濁させた。ＭＫを、培養の４日目までに成熟させ、次いで、先に説明されたように、ＢＳＡ勾配により単離した。
【0071】
フローサイトメトリー
血小板を、静的ＭＫ培養又はバイオリアクタ溶出液の放出されたプロＰＬＴ画分から収集し、休止状態下で調べた。サンプルを、ＣＤ４２ａ又はＣＤ４１／６１（Ｅｍｆｒｅｔ
Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｅｉｂｅｌｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対するＦＩＴＣ－コンジュゲート抗体でプローブし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にランした。ＰＬＴを、ＰＬＴが検出器を通過する際の、その特徴的な前方及び側方散乱によりゲーティングした。ＦＩＴＣ－コンジュゲートＩｇＧ抗体特異性コントロール（Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を差し引いた後に、その合計蛍光強度を算出した。ＰＬＴ収量の定量化を、正味のＧＰ ＩＸ＋ＰＬＴ産生を、溶出液回収期間にわたる正味のＧＰ ＩＸ＋ＭＫ枯渇で割ることにより決定し、少なくとも３つの独立したサンプルについて行った。結果は、ＧＰ ＩＩｂＩＩＩａ＋細胞と同一であった。
血小板を、静的ＭＫ培養又はバイオリアクタ溶出液の放出されたプロＰＬＴ画分から収集し、休止状態下で調べた。サンプルを、ＣＤ４２ａ又はＣＤ４１／６１（Ｅｍｆｒｅｔ
Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｅｉｂｅｌｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対するＦＩＴＣ－コンジュゲート抗体でプローブし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にランした。ＰＬＴを、ＰＬＴが検出器を通過する際の、その特徴的な前方及び側方散乱によりゲーティングした。ＦＩＴＣ－コンジュゲートＩｇＧ抗体特異性コントロール（Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を差し引いた後に、その合計蛍光強度を算出した。ＰＬＴ収量の定量化を、正味のＧＰ ＩＸ＋ＰＬＴ産生を、溶出液回収期間にわたる正味のＧＰ ＩＸ＋ＭＫ枯渇で割ることにより決定し、少なくとも３つの独立したサンプルについて行った。結果は、ＧＰ ＩＩｂＩＩＩａ＋細胞と同一であった。
【0072】
画像解析
ＩｍａｇｅＪ及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈにおいて取得したデジタル画像を解析した。境界線は、明確に、種々の画像を分離し、又は、同じ画像の領域を分離する。画像内の特異的な特徴について、強調、ぼかし、移動、除去、又は導入は行っておらず、輝度、コントラスト及びカラーバランスに対してなされた調節は、画像全体に線形適用した。
ＩｍａｇｅＪ及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈにおいて取得したデジタル画像を解析した。境界線は、明確に、種々の画像を分離し、又は、同じ画像の領域を分離する。画像内の特異的な特徴について、強調、ぼかし、移動、除去、又は導入は行っておらず、輝度、コントラスト及びカラーバランスに対してなされた調節は、画像全体に線形適用した。
【0073】
微少流体装置モデルのヒトＢＭについての生理学的特徴
生理学的条件を反復するために、前記流路をそれぞれ、フィブリノゲン及びフィブロネクチンそれぞれで選択的にコートして、ＢＭのＥＣＭ組成及び血管微小環境を再現した（図２Ａに示す）。前記微少流体装置にわたって流動をランすることにより、第１の流路に沿って注入された初代ＭＫは、前記カラム間に連続的に捕捉されることになり、前記第２の流路内にプロＰＬＴを伸長し（図２Ｂに示す）、生理学的なプロＰＬＴの伸長を反復するであろう。３Ｄ ＥＣＭ組織化及び生理学的ＢＭ剛性（２５０Ｐａ）をモデル化するために、ＭＫを、前記微少流体内で重合された、１％ アルギン酸塩溶液に注入した。前記微少流体装置は、ＭＫを前記第１の流路内のアルギン酸塩ゲル中に選択的に包埋する一方で、前記第２の流路において、血流を維持した。アルギン酸塩は、プロＰＬＴ産生を阻害せず、前記第２の流路からのＭＫの距離を制御することができた。
生理学的条件を反復するために、前記流路をそれぞれ、フィブリノゲン及びフィブロネクチンそれぞれで選択的にコートして、ＢＭのＥＣＭ組成及び血管微小環境を再現した（図２Ａに示す）。前記微少流体装置にわたって流動をランすることにより、第１の流路に沿って注入された初代ＭＫは、前記カラム間に連続的に捕捉されることになり、前記第２の流路内にプロＰＬＴを伸長し（図２Ｂに示す）、生理学的なプロＰＬＴの伸長を反復するであろう。３Ｄ ＥＣＭ組織化及び生理学的ＢＭ剛性（２５０Ｐａ）をモデル化するために、ＭＫを、前記微少流体内で重合された、１％ アルギン酸塩溶液に注入した。前記微少流体装置は、ＭＫを前記第１の流路内のアルギン酸塩ゲル中に選択的に包埋する一方で、前記第２の流路において、血流を維持した。アルギン酸塩は、プロＰＬＴ産生を阻害せず、前記第２の流路からのＭＫの距離を制御することができた。
【0074】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、前記第２の流路に沿って選択的に播種し、コンフルエントに増殖させて、機能的な血管を産生した（図２Ｃに示す）。加えて、ＭＫの挙動を、１０×～１５０×倍の高解像での生細胞顕微鏡観察によりモニターした。放出されたＰＬＴを、前記溶出液から収集した。図２Ｄは、動作を例示する完全なシステムを示す。層流せん断速度を特徴決定し（図２Ｅに示す）、２つの微少流体ポンプ（前記第１の流路用ポンプ及び前記第２の流路用ポンプ）を使用して、密接に制御した。前記装置内の
せん断速度は、注入量に対して直線的に比例し、生理学的範囲（５００～２５００ｓ-1）に広がるように調節した。空の微小流路ジャンクションにおけるせん断速度は、前記第１の流路からの距離に対して増大する（図２Ｆに示す）が、ＭＫ捕捉に基づいて、流動を、次の利用可能なギャップに向きを変えさせた。これにより、ＭＫは、これらの部位において、生理学的（７６０～７８０ｓ-1）せん断速度を受け続けた（図２Ｇに示す）。
せん断速度は、注入量に対して直線的に比例し、生理学的範囲（５００～２５００ｓ-1）に広がるように調節した。空の微小流路ジャンクションにおけるせん断速度は、前記第１の流路からの距離に対して増大する（図２Ｆに示す）が、ＭＫ捕捉に基づいて、流動を、次の利用可能なギャップに向きを変えさせた。これにより、ＭＫは、これらの部位において、生理学的（７６０～７８０ｓ-1）せん断速度を受け続けた（図２Ｇに示す）。
【0075】
血管せん断はプロＰＬＴ産生、生理学的伸長、及び放出をトリガとする
ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＭにおいて、ＭＫは、プロＰＬＴを、血流方向に伸長し、ＰＬＴ、プロＰＬＴ、大きな細胞質フラグメント（プレＰＬＴ）、及びＭＫ全体さえも、類洞血管内に放出し、これを、肺の微小血管床において捕捉することができ、又は、循環中で他の方法で成熟させることができる。ＰＬＴ産生における生理学的せん断の効果を決定するために、マウス胎仔肝臓培養物由来（ｍＦＬＣ）ＭＫを、培養４日目に単離し、前記微少流体装置内に注入する前に、サイズ及び倍数性により特徴決定した（図３Ａに示す）。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＭにおいて、ＭＫは、プロＰＬＴを、血流方向に伸長し、ＰＬＴ、プロＰＬＴ、大きな細胞質フラグメント（プレＰＬＴ）、及びＭＫ全体さえも、類洞血管内に放出し、これを、肺の微小血管床において捕捉することができ、又は、循環中で他の方法で成熟させることができる。ＰＬＴ産生における生理学的せん断の効果を決定するために、マウス胎仔肝臓培養物由来（ｍＦＬＣ）ＭＫを、培養４日目に単離し、前記微少流体装置内に注入する前に、サイズ及び倍数性により特徴決定した（図３Ａに示す）。
【0076】
輸血可能なＰＬＴをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するのにおける主な課題の１つは、プロＰＬＴ産生をトリガする因子を特定することであった。静的条件下では、ＭＫは、単離後約６時間で、プロＰＬＴを産生し始め、１８時間で最大プロＰＬＴ産生に達する（図３Ｂに示す）。それに比べて、生理学的せん断（図３Ｃに示す、約５００ｓ-1）下でのＭＫは、捕捉後数秒以内に、プロＰＬＴを産生し始め、培養の最初の２時間以内に最大プロＰＬＴ産生及びバイオチップの飽和に達した。生理学的せん断下で培養されたＭＫは、静的培養に対してほとんど高度に分岐していない、より少なく、より長いプロＰＬＴを産生した。せん断培養中のプロＰＬＴを、前記低次の流路内に均一に伸長させ、血管流路壁に対する流動方向に整列させた。このことは、生理学的なプロＰＬＴ産生を反復している。生理学的せん断下でのプロＰＬＴ産生ＭＫの割合は、静的培養を上回って約９０％に倍加した（図３Ｄに示す）。
【0077】
注入用の臨床数のＰＬＴを生成するのにおける別の主な課題は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養では、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて観察された速度より明らかに遅い速度でプロＰＬＴを伸長することである。本発明者らの微少流体装置における生理学的せん断の適用は、プロＰＬＴの伸長速度を、静的培養コントロールを上回る桁まで約３０μｍ／分に向上させた（図３Ｅに示す）。この伸長速度は、生きているマウスにおける生体内顕微鏡観察からのプロＰＬＴ伸長速度の生理学的推定値と一致しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＬＴ産生の増大を支持する。
【0078】
ヒト及びマウスの両方における初期の組織学研究から、ＭＫ全体及びＭＫフラグメントは、肺循環床に捕捉する血管内皮裏打ちＢＭ血管におけるギャップ又は開窓により圧迫される場合があると予測されてきた。プレＰＬＴと呼ばれる大きなＰＬＴ中間体は、血中で近年発見された。ｍＢＭ及びＦＬＣ由来ＭＫ及びプレＰＬＴのマウスへの静脈注入は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＬＴを産生した。本研究では、直径１００μｍ＋のＭＫが、３μｍ（図４Ａに示す）及び１．５μｍのギャップにより圧迫し、又は、大きなＭＫフラグメントを伸長し（図４Ｂ示す）、血管ＰＬＴ産生のモデルを支持するのをルーチンに観察された。加えて、脱離イベントが、高解像での生細胞顕微鏡観察により、ルーチンにキャプチャされ、プロＰＬＴシャフトに沿って可変位置において生じ、プレＰＬＴサイズの中間体（直径３～１０μｍ）及びＰＬＴ（直径１．５～３μｍ）の両方を放出した（図４Ｃ及び図４Ｄに示す）。各脱離後、得られたプロＰＬＴ端は、新たなＰＬＴサイズの膨張を先端に形成した。この膨張は、その後伸長し、放出し、このサイクルを繰り返した（図４Ｅに示す）。
【0079】
せん断速度を一定に維持したが、プロＰＬＴ伸長速度は、前記シャフトに沿った種々の位置で変動しており、これにより、プロＰＬＴ伸長の制御された細胞骨格駆動メカニズム
が予測される（図４Ｃに示す）。前記生理学的範囲内で微少流体せん断速度を増大させることは、培養における、中央プロＰＬＴ伸長速度又はプロＰＬＴ伸長速度の分布に影響を及ぼさなかった（図４Ｆに示す）。ＧＦＰ－β１を発現するようにレトロウイルス性にトランスフェクションしたＭＫにおけるプロＰＬＴ投影には、外周微小管（ＭＴ）が含まれた。外周微小管は、ＰＬＴサイズ端においてコイルを形成した（図４Ｇに示す）。プロＰＬＴは、５ｍｍ超の長さに達し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、最大１０００ｓ-1のせん断速度に耐えた。このことは、生体内顕微鏡観察からのプロＰＬＴ産生の生理学的例示を反復し、脱離イベントがせん断により生じなかったことを証明している。せん断誘導プロＰＬＴ伸長が細胞骨格由来であったことを確認するために、ＭＫを、微少流体装置への注入前に、５μＭ ジャスプラキノリド（Ｊａｓｐｌａｎｋｉｎｏｌｉｄｅ）（Ｊａｓ、アクチン安定化剤）又は１ｍＭ エリスロ－９－（３－［２－ヒドロキシノニル］（ＥＨＮＡ、細胞質ダイニン阻害剤）と共にインキュベートした。Ｊａｓ及びＥＨＮＡは両方とも、静的及び生理学的せん断条件下の両方において、せん断誘導プロＰＬＴ産生（図４Ｈ及び図４Ｉに示す）及びＰＬＴ放出を阻害した。
が予測される（図４Ｃに示す）。前記生理学的範囲内で微少流体せん断速度を増大させることは、培養における、中央プロＰＬＴ伸長速度又はプロＰＬＴ伸長速度の分布に影響を及ぼさなかった（図４Ｆに示す）。ＧＦＰ－β１を発現するようにレトロウイルス性にトランスフェクションしたＭＫにおけるプロＰＬＴ投影には、外周微小管（ＭＴ）が含まれた。外周微小管は、ＰＬＴサイズ端においてコイルを形成した（図４Ｇに示す）。プロＰＬＴは、５ｍｍ超の長さに達し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、最大１０００ｓ-1のせん断速度に耐えた。このことは、生体内顕微鏡観察からのプロＰＬＴ産生の生理学的例示を反復し、脱離イベントがせん断により生じなかったことを証明している。せん断誘導プロＰＬＴ伸長が細胞骨格由来であったことを確認するために、ＭＫを、微少流体装置への注入前に、５μＭ ジャスプラキノリド（Ｊａｓｐｌａｎｋｉｎｏｌｉｄｅ）（Ｊａｓ、アクチン安定化剤）又は１ｍＭ エリスロ－９－（３－［２－ヒドロキシノニル］（ＥＨＮＡ、細胞質ダイニン阻害剤）と共にインキュベートした。Ｊａｓ及びＥＨＮＡは両方とも、静的及び生理学的せん断条件下の両方において、せん断誘導プロＰＬＴ産生（図４Ｈ及び図４Ｉに示す）及びＰＬＴ放出を阻害した。
【0080】
得られたＰＬＴは血中ＰＬＴの構造的及び機能的特性を証明する
ＰＬＴは、その表面にバイオマーカーであるＧＰ ＩＸ及びＩＩｂＩＩＩａを発現する直径約１～３μｍの無核の円板状細胞であり、アクチン系細胞骨格ネットワークを取り囲む６～８個のＭＴの皮質ＭＴコイルにより特徴付けられる。ＰＬＴ収量を確立するために、バイオマーカー発現並びに前方／側方散乱及び糖タンパク質（ＧＰ）ＩＸ＋ｍＦＬＣ－ＭＫの相対濃度を、培養４日目において、本発明者らの微少流体装置への注入直前に、フローサイトメトリーにより測定した（図５Ａに示す）。溶出液を、注入後２時間で収集し、ｍＦＬＣ－ＭＫ入力と比較した（図５Ｂに示す）。入力ＭＫ及び溶出液ＰＬＴは両方とも、その表面にＧＰ ＩＸ及びＩＩｂＩＩＩａを発現し、特徴的な前方／側方散乱を示した。せん断の適用により、前記溶出液の細胞組成は、培養５日目に単離した静的培養上清に対して、よりＰＬＴサイズのＧＰＩＸ＋細胞に向かってシフトした（図５Ｃに示す）。８５±１％ ＭＫが、２時間にわたってＰＬＴに変換された。この変換は、％ プロＰＬＴ産生の本発明者らの定量（図３Ｄ）と一致し、静的培養を上回る有意義な改善を構成する（図５Ｄ）。本発明者らの微少流体装置への２時間にわたる約５００ｓ-1 せん断の連続的な注入は、ＭＫ当たりに約２１個のＰＬＴを産生し、もっと長い期間（６～８日）にわたって匹敵する数のＰＬＴを生成する既存の培養アプローチを上回るＰＬＴ産生速度の主な利点を構成する。
ＰＬＴは、その表面にバイオマーカーであるＧＰ ＩＸ及びＩＩｂＩＩＩａを発現する直径約１～３μｍの無核の円板状細胞であり、アクチン系細胞骨格ネットワークを取り囲む６～８個のＭＴの皮質ＭＴコイルにより特徴付けられる。ＰＬＴ収量を確立するために、バイオマーカー発現並びに前方／側方散乱及び糖タンパク質（ＧＰ）ＩＸ＋ｍＦＬＣ－ＭＫの相対濃度を、培養４日目において、本発明者らの微少流体装置への注入直前に、フローサイトメトリーにより測定した（図５Ａに示す）。溶出液を、注入後２時間で収集し、ｍＦＬＣ－ＭＫ入力と比較した（図５Ｂに示す）。入力ＭＫ及び溶出液ＰＬＴは両方とも、その表面にＧＰ ＩＸ及びＩＩｂＩＩＩａを発現し、特徴的な前方／側方散乱を示した。せん断の適用により、前記溶出液の細胞組成は、培養５日目に単離した静的培養上清に対して、よりＰＬＴサイズのＧＰＩＸ＋細胞に向かってシフトした（図５Ｃに示す）。８５±１％ ＭＫが、２時間にわたってＰＬＴに変換された。この変換は、％ プロＰＬＴ産生の本発明者らの定量（図３Ｄ）と一致し、静的培養を上回る有意義な改善を構成する（図５Ｄ）。本発明者らの微少流体装置への２時間にわたる約５００ｓ-1 せん断の連続的な注入は、ＭＫ当たりに約２１個のＰＬＴを産生し、もっと長い期間（６～８日）にわたって匹敵する数のＰＬＴを生成する既存の培養アプローチを上回るＰＬＴ産生速度の主な利点を構成する。
【0081】
本発明者らの生成物の形態学的比較を定量化するために、本発明者らの微少流体装置からの溶出液を、β１チューブリン（ＰＬＴ特異的チューブリンアイソフォーム）及びＨｏｅｓｃｈｔ（核染料）についてプローブし、免疫蛍光顕微鏡観察により分析した。細胞を、その形態及びサイズに基づいて分類し、静的ＭＫ培養上清と比較した。せん断の適用により、前記溶出液の細胞組成が、よりＰＬＴサイズのβ１チューブリン＋Ｈｏｅｓｃｈｔ－細胞にシフトした（図５Ｅに示す）。このシフトは、フローサイトメトリーデータ（図５Ｃ）と一致し、組成において、全血中のＰＬＴ中間体分布により類似する生成物をもたらした。溶出液中の遊離核の定量から、静的培養に対して増大した微少流体装置媒介性ＰＬＴ産生が確認され、ＭＫ当たりに約２０±１２個のＰＬＴのＰＬＴ収量が確立された。この収量は、フローサイトメトリーデータと一致する。
【0082】
休止中のＰＬＴは、開放管系を形成する表面膜の特徴的な陥入、暗調管系を形成する残った小胞体の閉鎖流路ネットワーク、オルガネラ、特徴的な分泌顆粒を含有し、ガラスとの接触活性化時に平坦化／展開するであろう。微少流体装置生成ＰＬＴは、薄切片透過型電子顕微鏡により、マウス血中ＰＬＴと超微細構造的に区別がつかず、皮質ＭＴコイル、開放管系、暗調小管系、ミトコンドリア、アルファ及び密顆粒を含有した（図５Ｆに示す）。微少流体装置生成ＰＬＴ及びＰＬＴ中間体は、免疫蛍光顕微鏡観察により、マウス血中ＰＬＴに匹敵するＭＴ及びアクチンの組織化を表し（図５Ｇに示す）、ガラスとの接触活性化時に正常に展開し、フィロポディア（ｆｉｌｐｏｄｉａ）及びラメリポディアの両方を形成した。
【0083】
ヒトＰＬＴ産生への本微少流体装置の適用
ヒトＰＬＴを生成するために、本発明者らの微少流体装置中のｍＦＬＣ－ＭＫを、ｈｉＰＳＣ由来ＭＫで置き換えた。ｈｉＰＳＣ由来ＭＫは、注入用ＭＫの実質的に無限の供給源を提供する。ｈｉＰＳＣ－ＭＫを、培養１５日目に単離し、その時点で、ｈｉＰＳＣ－ＭＫは、最大直径２０～６０μｍに達しており（図６Ａに示す）、初代ヒトＭＫと超微細構造的に類似した（図６Ｂに示す）。静的培養において、ｈｉＰＳＣ－ＭＫは、単離後６時間でプロＰＬＴを産生し始め、１８時間で最大プロＰＬＴ産生に達した（図６Ｃに示す）。それに比べて、生理学的せん断（約５００ｓ-1）下でのｈｉＰＳＣ－ＭＫは、捕捉直後にプロＰＬＴを産生し始め、培養の最初の２時間以内にプロＰＬＴを伸長／放出した（図６Ｄに示す）。せん断下での プロＰＬＴ産生ｈｉＰＳＣ－ＭＫパーセント（％）は、静的培養（約１０％）を上回って、約９０％に顕著に増大した（図６Ｅに示す）。
ヒトＰＬＴを生成するために、本発明者らの微少流体装置中のｍＦＬＣ－ＭＫを、ｈｉＰＳＣ由来ＭＫで置き換えた。ｈｉＰＳＣ由来ＭＫは、注入用ＭＫの実質的に無限の供給源を提供する。ｈｉＰＳＣ－ＭＫを、培養１５日目に単離し、その時点で、ｈｉＰＳＣ－ＭＫは、最大直径２０～６０μｍに達しており（図６Ａに示す）、初代ヒトＭＫと超微細構造的に類似した（図６Ｂに示す）。静的培養において、ｈｉＰＳＣ－ＭＫは、単離後６時間でプロＰＬＴを産生し始め、１８時間で最大プロＰＬＴ産生に達した（図６Ｃに示す）。それに比べて、生理学的せん断（約５００ｓ-1）下でのｈｉＰＳＣ－ＭＫは、捕捉直後にプロＰＬＴを産生し始め、培養の最初の２時間以内にプロＰＬＴを伸長／放出した（図６Ｄに示す）。せん断下での プロＰＬＴ産生ｈｉＰＳＣ－ＭＫパーセント（％）は、静的培養（約１０％）を上回って、約９０％に顕著に増大した（図６Ｅに示す）。
【0084】
プロＰＬＴ伸長速度は、ｍＦＬＣ－ＭＫコントロールよりわずかに低く（３０μｍ／分に対して、約１９μｍ／分）（図６Ｆに示す）、生理学的コントロールにより密接に近似した。微少流体装置生成ＰＬＴは、前方及び側方散乱を表した。ヒト血中ＰＬＴに特徴的な表面バイオマーカー発現は、薄切片透過型電子顕微鏡により、ヒト血中ＰＬＴと超微細構造的に区別がつかず（図６Ｇに示す）、免疫蛍光顕微鏡観察により、ヒト血中ＰＬＴに匹敵するＭＴ及びアクチン発現を表し（図６Ｈに示す）、ガラスとの接触活性化時に正常に展開し、フィロポディア（ｆｉｌｐｏｄｉａ）及びラメリポディアの両方を形成した（図６Ｉに示す）。まとめると、これらのデータから、ｈｉＰＳＣ－ＭＫは、潜在的に無限数の機能的なヒトＰＬＴを生成するために、本発明者らのバイオミメティック微少流体装置に適用することができることが証明されている。
【0085】
薬剤開発への本微少流体装置の適用
血小板減少症は、突然現れ、多くの場合、意図せず、大量出血し、死亡する恐れがある。抗体及び細胞媒介性自己免疫応答が、血小板減少症を引き起こすことが示されてきた。また加えて、血小板減少症は、癌治療剤、例えば、ダサチニブを含む広い範囲の薬品によってもトリガされる場合がある。動物モデルは、一般的には、ヒトにおける薬品の安全性及び有効性の予測因子としては不十分であり、臨床研究には、時間と費用がかかり、有害である恐れもある。ヒトＢＭを模倣して設計された微少流体装置は、主な臨床的に重要な領域におけるイノベーションを提供し、ＢＭ及びＭＫの生物学に基づく各種の薬品の影響を研究するのに効率的で現実的なプラットホームを提供する。
血小板減少症は、突然現れ、多くの場合、意図せず、大量出血し、死亡する恐れがある。抗体及び細胞媒介性自己免疫応答が、血小板減少症を引き起こすことが示されてきた。また加えて、血小板減少症は、癌治療剤、例えば、ダサチニブを含む広い範囲の薬品によってもトリガされる場合がある。動物モデルは、一般的には、ヒトにおける薬品の安全性及び有効性の予測因子としては不十分であり、臨床研究には、時間と費用がかかり、有害である恐れもある。ヒトＢＭを模倣して設計された微少流体装置は、主な臨床的に重要な領域におけるイノベーションを提供し、ＢＭ及びＭＫの生物学に基づく各種の薬品の影響を研究するのに効率的で現実的なプラットホームを提供する。
【0086】
ＰＬＴ生存及びクリアランス速度は、通常、フローサイトメトリーを使用する注入研究により測定される。しかしながら、プロＰＬＴ産生の速度及び程度の定量は、このアプローチに適しておらず、血小板新生段階に影響を及ぼすものを確立するための直接的な可視化を必要とする。対照的に、本開示に基づく微少流体システムの適用は、ＰＬＴ産生における薬剤の影響を研究するのに優れたプラットホームを提供し、ＰＬＴ産生の新たな制御因子の特定を容易にすることができ、臨床的に有意義な薬剤誘引血小板減少症のメカニズムを解明することができるプラットホームを提供する。
【0087】
概念の証明として、ＧＦＰ・ＰＩチューブリン発現（生細胞顕微鏡観察）メカニズムを特定するのに、ハイコンテント生細胞顕微鏡観察を利用した。このメカニズムは、現在乳ガン用に臨床開発中の抗体薬剤コンジュゲートであるトラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１）がＰＬＴ産生に影響を及ぼすメカニズムである。これらの研究から、Ｔ－ＤＭ１は、ＭＫ分化を阻害し、異常なチューブリン組織化を誘引することにより、プロＰＬＴ形
成を妨害することが証明された（図７に示す）。治療剤、例えば、Ｔ－ＤＭ１がＭＫ成熟及びプロＰＬＴ産生に影響を及ぼす経路を定義することは、薬剤誘引血小板減少症を管理し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＬＴ産生を制御する戦略を生む可能性がある。
成を妨害することが証明された（図７に示す）。治療剤、例えば、Ｔ－ＤＭ１がＭＫ成熟及びプロＰＬＴ産生に影響を及ぼす経路を定義することは、薬剤誘引血小板減少症を管理し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＬＴ産生を制御する戦略を生む可能性がある。
【0088】
本開示のアプローチは、ヒトＢＭ及び血管生理学をｅｘ ｖｉｖｏにおいて反復し、注入用の機能的なヒトＰＬＴの代替的な供給源を生成する、非常に新規な微少流体設計を利用する。増大する輸血需要に合致し、血小板の調達及び保管に現在関連するリスクを除去するのに臨床的に望ましいが、ここまでは、２つの主な定量的障害が、治療用途のドナーに依存しないＰＬＴの開発において存続してきた。これは、（１）１ＰＬＴ輸血単位（約３×１０11個 ＰＬＴ）の産生を支持する十分な数（約３×１０8個）のヒトＭＫを生成
することと、（２）ＭＫ当たりに生理学的数の機能的なヒトＰＬＴ（約１０3～１０4個）を生成することとである。ヒト胚性幹細胞培養（ｈＥＳＣ）の開発、及びごく最近、ヒト誘導多能性幹細胞培養（ｈｉＰＳＣ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒトＭＫに分化して、第１の定量的障害に取り組むことができる前駆体細胞の潜在的に無限の供給源を提供する。実際には、ＰＬＴは無核であるため、ＰＬＴ微少流体装置由来ユニットは、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣから得られた細胞生成物が発癌性又は催奇形性である恐れがあるという懸念に取り組むため、注入前に照射される場合がある。
することと、（２）ＭＫ当たりに生理学的数の機能的なヒトＰＬＴ（約１０3～１０4個）を生成することとである。ヒト胚性幹細胞培養（ｈＥＳＣ）の開発、及びごく最近、ヒト誘導多能性幹細胞培養（ｈｉＰＳＣ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒトＭＫに分化して、第１の定量的障害に取り組むことができる前駆体細胞の潜在的に無限の供給源を提供する。実際には、ＰＬＴは無核であるため、ＰＬＴ微少流体装置由来ユニットは、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣから得られた細胞生成物が発癌性又は催奇形性である恐れがあるという懸念に取り組むため、注入前に照射される場合がある。
【0089】
ＰＬＴ産生の環境決定因子を研究する試みは、還元論アプローチにより限定されてきた。２Ｄ液体培養の主な限界は、３Ｄ ＢＭ組成及び剛性、プロＰＬＴ伸長の方向性、並びに静脈内皮への接近を説明することできないことである。同様に、類洞血管に入ったプロＰＬＴ産生ＭＫは、５００～２５００ｓ-1の壁せん断速度を受けるが、ＥＣＭコートガラススライド上にＭＫを満たすことによる血管の流れをモデル化する試みは、固定化／付着ＭＫを選択し、せん断によるＥＣＭ接触活性化を区別することができなくしてきた。あるいは、放出されたプロＰＬＴは、インキュベータ振とう機中で、求心性に振とうされてきた。この振とうでは、ＢＭ血管における層状せん断流動が反復されず、血管せん断速度の正確な制御が提供されず、高解像での生細胞顕微鏡観察に適していない。これらの制限にも関わらず、ＭＫを高せん断速度（１８００ｓ-1）に曝すことは、プロＰＬＴ産生を加速させ、せん断の非存在下で培養されたプロＰＬＴは、２時間の約０．５Ｐａの流体せん断応力で維持されたプロＰＬＴより、明らかに少ないＰＬＴしか放出しなかった。さらに、多重光子生体内顕微鏡観察における近年の進歩は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるプロＰＬＴ産生の解像向上を提供し、プロＰＬＴ伸長及びＰＬＴ放出における血管流の重要性を確認してきた。これらの研究により、ｉｎ ｖｉｖｏでのプロＰＬＴ産生の生理学的に正確な事例が提供されてきたが、微小環境の不十分な解像及び限られた制御のために、ＢＭ微小環境がＰＬＴ放出にどのように関与しているのかという詳細な研究が妨げられてきた。
【0090】
細胞－細胞接触、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）組成及び剛性、血管せん断速度、ｐＯ２／ｐＨ、可溶性因子の相互作用、並びに温度が、プロＰＬＴ形成及びＰＬＴ放出に関与するという証拠を準備することは、３Ｄ微少流体培養システム内でのＢＭ及び血管微小環境を反復することが、臨床的に有意義な数の機能的なヒトＰＬＴを達成するのに必須であることを示唆している。実際には、モジュール式の３Ｄのニット状ポリエステル足場が、培養物中の１×１０6個のＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞から、１日当たりに最大６×１０6個のＰＬＴを産生するために、連続的な流体流動下で適用されてきた。臨床的に有用な数の培養由来ヒトＰＬＴが得られることが示唆されているが、３Ｄ注入バイオリアクタは、ＢＭ微小環境の複雑な構造及び流体の特徴を正確に再現しておらず、その閉鎖系モジュール設計は、プロＰＬＴ産生の直接的な可視化を妨げてしまう。このため、ＰＬＴ放出メカニズムの洞察をほとんど提供しない。代替的に、ＥＣＭコートシルク系チューブに隣接する３Ｄ ＰＤＭＳバイオチップが、ＢＭ類洞を再現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＫ分化及びＰＬＴ産生を研究するのに提案されている。成熟中のＭＫ遊走を反復することができるが、この設計は、高解像での生細胞顕微鏡観察に適しておらず、ＭＫ分化を駆動するのに必須
の内皮細胞接触を再現していない。
の内皮細胞接触を再現していない。
【0091】
それに比べて、本開示の微少流体装置設計は、ＰＬＴ放出に対する時間的に有意義な改善及び増大した合計ＰＬＴ収量を可能にする、完全なパッケージを提供する。また、前記微少流体装置内での血管せん断速度の適用は、プロＰＬＴ産生を誘引し、生理学的なプロＰＬＴ伸長及び放出を再現する。さらに、ＭＫは、循環に入る小さなギャップにより圧迫することができ、生理学的な流動条件下において、プレＰＬＴ中間体を放出することができる。本開示の微少流体装置内でのＭＫの連続的な注入により生じた生成物は、生理学的なＰＬＴ濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｎ）に近づき、血中ＰＬＴの構造的及び機能的特性の両方を証明した。最後に、ＰＬＴ微少流体装置は、ヒトＭＫ培養に適用して、機能的なヒトＰＬＴを産生することができた。ＭＫ当たりのＰＬＴ収量は、理論的な推定値には達しなかったが、ＭＫ培養物が、大きなＭＫフラグメント（プレＰＬＴ、プロＰＬＴ）をルーチンに放出し、ＭＫ自体を溶出液流路内に放出したことの観察から、実際のＰＬＴ数は、支えとなる微小環境、例えば、肺又は循環の血液における、ＰＬＴ中間体のＰＬＴへの更なる分化に依存する可能性があることが示唆される。実際には、ｍＦＬＣ由来プロＰＬＴがマウスに注入された場合、これらは、１２～２４時間にわたって、ＰＬＴに急速に変換された。興味深いことに、本研究におけるＣＭＦＤＡ標識ＰＬＴは、血中において容易に検出されたが、より大きなプレＰＬＴ中間体は検出されなかった。このことは、それらが、肺の微小循環で捕捉されている可能性があることを示唆している。同様に、ｍＦＬＣ及びＢＭ由来ＭＫをマウスに注入した場合、それらはほとんどが、排他的に、肺に局在し、最初の２時間以内にＰＬＴを放出した。両方の場合において、血管せん断速度、血中での可溶性因子の相互作用、及び内皮細胞接触が、このプロセスを制御しており、これらの組織における局所的な微小環境が末端ＰＬＴ産生にどのように関与しているかを試験することは、更なる調査を保証することは、ほぼ確実である。
【0092】
１つの微少流体システム内における３Ｄ ＥＣＭ組成及び剛性、細胞－細胞接触、血管せん断速度、ｐＯ２／ｐＨ、可溶性因子の相互作用、並びに温度を含むＢＭ生理機能の主な要素を組み合わせることにより、本開示のアプローチは、薬剤開発のための、ｅｘ ｖｉｖｏでの微小環境の前例のない制御及びバイオミメティックプラットホームを提供する。さらに、高解像での生細胞顕微鏡観察の支援により、培養中における細胞の直接的な可視化が可能となり、ほとんど特徴決定されていない生理学的プロセスに機会を提供する。最後に、前記微少流体装置設計は、中央の流路のいずれかの側の排出流路を反映させ、より多くの数のカラムを支持する前記装置に拡張し、より大きな微少流体装置マトリクス内に複数のユニットを並列に配置することにより、容易に大型化することができる。より長い装置におけるｈｉＰＳＣ－ＭＫの連続的な収集は、例えば、ＰＬＴ機能の伝統的な凝集検査、及び、ＰＬＴカウントの増大を測定するための免疫抑制マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ異物性輸血研究を行うのに臨床的に有意義な数のＰＬＴをもたらすことができる。この研究には、研究当たりに、約１０8個のＰＬＴを必要とする。
【0093】
まとめると、本開示は、ヒト血小板を高解像画像化に適したアプローチにおいて生成するために、ヒトＢＭ及び類洞血管微小環境を再現するシステム及び方法を証明してきた。本開示に基づくバイオミメティック微少流体システムは、ＰＤＭＳ、ガラス、及び任意の他の適切な材料を使用して作製することができ、現実的な生理学的条件、例えば、流速、せん断速度、圧力差等をシミュレーションするために設計された、複数の微少流体流路及びチャンバ構成を含むことができる。したがって、本明細書に記載された微少流体システムの流路又はチャンバは、ＥＣＭ及びヒト内皮細胞並びに、生理学的システムに適合する他の生物由来物質又は材料で、選択的にコートされてもよい。説明された動作の一部の状態では、本明細書で詳述された微少流体システムの種々の流路に沿って注入された、丸い又はプロＰＬＴ産生ＭＫは、連続的に捕捉され、隣接する流路内で血小板産生プロＰＬＴを伸ばすことができ、これにより、収集用のＰＬＴを連続的に放出する。このようなプロ
セスは、制御可能な生理学的せん断速度及び制御された微小環境により刺激又は最適化されることができる。流体流に入った放出されたＰＬＴは、例えば、高解像での顕微鏡観察を使用して可視化を可能にするプロセスにより、溶出液から収集することができる。
セスは、制御可能な生理学的せん断速度及び制御された微小環境により刺激又は最適化されることができる。流体流に入った放出されたＰＬＴは、例えば、高解像での顕微鏡観察を使用して可視化を可能にするプロセスにより、溶出液から収集することができる。
【0094】
上記で表された種々の構成は、単に例示であり、本開示の範囲を何等限定することを意味しない。本明細書で記載された構成の変形例は、当業者に明らかであろうし、このような変形例は、本願の意図した範囲内である。特に、１つ以上の上記された構成からの特徴は、上記で明確に記載されていない場合がある特徴の部分的組み合わせを含む代替的な構成を作製するように選択することができる。加えて、１つ以上の上記構成からの特徴が選択及び組み合わせられて、上記で明確に記載されていない場合がある特徴の組み合わせを含む代替的な構成を作製することができる。このような組み合わせ及び部分的な組み合わせに適した特徴は、本願をレビューした際に、全体として当業者に容易に明らかとなるであろう。本明細書に記載され、特許請求の範囲に列記された主題は、技術上の全ての適切な変更をカバーし、包含することを意図している。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
