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特許7187436アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-02

(45)【発行日】2022-12-12

(54)【発明の名称】アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー

(51)【国際特許分類】

C07K 1/22 20060101AFI20221205BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20221205BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20221205BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22 ZNA

C07K16/00

C12N15/13

【請求項の数】 76

(21)【出願番号】P 2019503524

(86)(22)【出願日】2017-07-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-12

(86)【国際出願番号】 US2017043743

(87)【国際公開番号】W WO2018022628

(87)【国際公開日】2018-02-01

【審査請求日】2020-07-22

(31)【優先権主張番号】62/366,302

(32)【優先日】2016-07-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/366,309

(32)【優先日】2016-07-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/523,032

(32)【優先日】2017-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506423475

【氏名又は名称】セファロンインコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部達彦

(72)【発明者】

【氏名】リュ・ワン

(72)【発明者】

【氏名】ティエンイ・ジョウ

(72)【発明者】

【氏名】ジャオチン・ジャン

(72)【発明者】

【氏名】ミ・ジン

【審査官】松原寛子

(56)【参考文献】

【文献】特表平０３－５０４９７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２５５３０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００７／０５４８０９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００６８６１２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】PROTEIN A INTERMEDIATE WASH STRATEGIES [ONLINE]，BIOPROCESS INTERNATIONAL，2015年02月06日，検索日2021.8.11 <https://bioprocessintl.com/downstream-processing/chromatography/protein-intermediate-wash-strategies/

【文献】THERMO FISHER SCIENTIFIC INC.，INSTRUCTIONS PIERCE PROTEIN REFOLDING KIT[ONLINE]，2010年，検索日2021.8.11, <https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011490_Pierce_Protein_Refolding_UG.pdf>

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ１／２２

Ｃ０７Ｋ１６／００

Ｃ０７Ｋ１／３４

Ｃ１２Ｎ１５／１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水と、５０ｍＭ～１５０ｍＭのアルギニンと、５０ｍＭ～２００ｍＭのグアニジンとを含む、抗体と、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む１つ以上の夾雑タンパク質とを含む混合物から抗体を精製するのに使用するためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー洗浄溶液。

【請求項2】

アルギニンを７５ｍＭ～１２５ｍＭ含む、請求項１に記載の洗浄溶液。

【請求項3】

アルギニンを８５ｍＭ～１１５ｍＭ含む、請求項１または２に記載の洗浄溶液。

【請求項4】

アルギニンを９０ｍＭ～１１０ｍＭ含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項5】

アルギニンを９５ｍＭ～１０５ｍＭ含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項6】

アルギニンを１００ｍＭ含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項7】

グアニジンを１００ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項8】

グアニジンを１５０ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項9】

グアニジンを１００ｍＭ～１５０ｍＭ含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項10】

グアニジンを１５０ｍＭ含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項11】

アニオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項12】

前記アニオン性界面活性剤を１０ｍＭ～４０ｍＭ含む、請求項１１に記載の洗浄溶液。

【請求項13】

前記アニオン性界面活性剤を２０ｍＭ～３０ｍＭ含む、請求項１１または１２に記載の洗浄溶液。

【請求項14】

前記アニオン性界面活性剤を２２．５ｍＭ～２７．５ｍＭ含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項15】

前記アニオン性界面活性剤を２５ｍＭ含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項16】

前記アニオン性界面活性剤が、ナトリウムオクタノエートを含む、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項17】

ナトリウムクロライドをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項18】

ナトリウムクロライドを５０ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項１７に記載の洗浄溶液。

【請求項19】

ナトリウムクロライドを１００ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項１７または請求項１８に記載の洗浄溶液。

【請求項20】

ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項21】

ナトリウムクロライドを１００ｍＭ～１５０ｍＭ含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項22】

ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項23】

ｐＨが７．５である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項24】

精製した抗体の調製方法であって、抗体と、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む１つ以上の夾雑タンパク質とを含む混合物をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーリガンドの上に充填することと、５０ｍＭ～１５０ｍＭのアルギニンと５０ｍＭ～２００ｍＭのグアニジンとを含む水性洗浄溶液で、前記リガンドを洗浄して、前記１つ以上の夾雑タンパク質を前記リガンドから溶出してから、前記抗体を前記リガンドから溶出することによって、前記抗体の精製溶出液を形成することを含む前記方法。

【請求項25】

前記抗体が、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記抗体が、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記抗体が、ＣＤ３８に特異的に結合する、請求項２４に記載の方法。

【請求項31】

前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記溶液が、アルギニンを７５ｍＭ～１２５ｍＭ含む、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記溶液が、アルギニンを８５ｍＭ～１１５ｍＭ含む、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記溶液が、アルギニンを９０ｍＭ～１１０ｍＭ含む、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記溶液が、アルギニンを９５ｍＭ～１０５ｍＭ含む、請求項２４～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記溶液が、アルギニンを１００ｍＭ含む、請求項２４～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記溶液が、グアニジンを１００ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項２４～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記溶液が、グアニジンを１５０ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項２４～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記溶液が、グアニジンを１００ｍＭ～１５０ｍＭ含む、請求項２４～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記溶液が、グアニジンを１５０ｍＭ含む、請求項２４～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記溶液が、アニオン性界面活性剤をさらに含む、請求項２４～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記溶液が、前記アニオン性界面活性剤を１０ｍＭ～４０ｍＭ含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記溶液が、前記アニオン性界面活性剤を２０ｍＭ～３０ｍＭ含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記溶液が、前記アニオン性界面活性剤を２２．５ｍＭ～２７．５ｍＭ含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記溶液が、前記アニオン性界面活性剤を２５ｍＭ含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記アニオン性界面活性剤が、ナトリウムオクタノエートを含む、請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記溶液が、ナトリウムクロライドをさらに含む、請求項２４～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記溶液が、ナトリウムクロライドを５０ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記溶液が、ナトリウムクロライドを１００ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項４７または４８に記載の方法。

【請求項50】

前記溶液が、ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ～２００ｍＭ含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記溶液が、ナトリウムクロライドを１００ｍＭ～１５０ｍＭ含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記溶液が、ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ含む、請求項４７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記溶液のｐＨが７．５である、請求項２４～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

ウイルスを不活化するのに十分な期間、前記抗体の前記精製溶出液のｐＨを低下させることをさらに含む、請求項２４～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

ｐＨを２．５～５．０まで低下させることをさらに含む、請求項２４～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記抗体の前記精製溶出液をろ過して、ウイルスを除去することをさらに含む、請求項２４～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

透析ろ過、限外ろ過または透析ろ過と限外ろ過の両方で、前記抗体の前記精製溶出液を処理することをさらに含む、請求項２４～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記抗体の前記精製溶出液をメンブレンクロマトグラフィー担体の上に充填することと、さらに精製した溶出液を含むフロースルーを前記メンブレンクロマトグラフィー担体から回収することをさらに含む、請求項２４～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記メンブレンクロマトグラフィー担体が、陰イオン交換メンブレンクロマトグラフィー担体を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含まない、請求項２４～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含まない、請求項２４～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

容量が少なくとも２５０リットルであるバイオリアクターで、前記抗体と、１つ以上の夾雑タンパク質を発現させた、請求項２４～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記バイオリアクターの容量が、少なくとも５００リットル、少なくとも２０００リットルまたは少なくとも５０００リットルである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

製薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、前記抗体の前記精製溶出液を調合することをさらに含む、請求項２４～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

製薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、前記抗体の前記さらに精製した溶出液を調合することをさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。

【請求項66】

前記抗体をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させる、請求項２４～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記溶液が、アルギニンを２００ｍＭと、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）と、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む、請求項１または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項68】

前記溶液が、アルギニンを２５０ｍＭと、カプリル酸を２５ｍＭと、ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ含む、請求項１または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項69】

前記溶液が、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ含む、請求項１～１０または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項70】

前記溶液が、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを１５０ｍＭ含む、請求項１、１１～１５または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項71】

前記溶液が、アルギニンを２５０ｍＭと、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）含む、請求項１、１１～１５または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項72】

前記溶液が、アルギニンを２５０ｍＭと、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）含む、請求項１、１１～１５または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項73】

前記溶液が、アルギニンを５０ｍＭ～１００ｍＭと、グアニジンを１００ｍＭ～２５０ｍＭと、カプリル酸を２５ｍＭ含む、請求項１～１０または１７～２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項74】

前記溶液が、グアニジンを３５０ｍＭと、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）含む、請求項１または２３のいずれか１項に記載の洗浄溶液。

【請求項75】

ウイルス対数減少値（ＬＲＶ）によって測定した場合に、前記プロテインＡ洗浄溶液が、前記混合物からのウイルスクリアランスを向上させる、請求項２４～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記ＬＲＶが、４．０ｌｏｇ_１０～８．０ｌｏｇ_１０または３．０ｌｏｇ_１０～８．０ｌｏｇ_１０である、請求項７５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月２５日に提出された米国特許仮出願第６２／３６６，３０２号、２０１６年７月２５日に提出された米国特許仮出願第６２／３６６，３０９号及び２０１７年６月２１日に提出された米国特許仮出願第６２／５２３，０３２号（それぞれ、その内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的で本明細書に援用される）に関するものである。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出した配列表の参照
電子的に提出した配列表（名称：２８７３＿２７４ＰＣ０３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：８，３１１バイト、作成日：２０１７年７月２５）の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0003】

本発明は概して、タンパク質の生化学の分野に関するものである。さらに詳細には、本発明は、宿主細胞タンパク質から標的タンパク質を精製するためのアフィニティークロマトグラフィーで用いる中間洗浄バッファーに関するものである。アフィニティークロマトグラフィーカラムを塩基性アミノ酸、塩、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤または有機ホスフェートと、グアニジンで洗浄することによって、タンパク質調製物から、宿主細胞タンパク質の不純物が大幅に減少する。

【背景技術】

【0004】

組み換えタンパク質は、宿主細胞で発現させて、一連のクロマトグラフィーとろ過工程によって精製する（Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２：５４８０－４９９（２０１０））。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、その高い特異性のために、モノクローナル抗体を精製する際に、最も高い頻度で用いられているアプローチである（Ｓｈｕｋｌａｅｔａｌ．，ＪｏｆＣｈｒｏｍ．Ｂ８４８：１２８－３９（２００７））。標的タンパク質と共発現する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、問題となる主な不純物である。ＨＣＰは、標的タンパク質と共精製されることがあるからである。したがって、所望の純度の目的タンパク質を得るために、治療グレードのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は通常、プロテインＡクロマトグラフィーの後に、２回以上のポリッシングクロマトグラフィー工程によって精製する。残念なことに、追加の各クロマトグラフィー工程により、タンパク質収率が必然的に低下する。タンパク質がカラム上に残るからである。追加のカラムの使用により、プロセスの費用と操作の煩雑性が上昇する。

【0005】

典型的な精製スキーム（下流カスケードとしても知られている）では、アフィニティークロマトグラフィーの後に、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用い、その後に、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を用いる。陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換は通常、ポリッシング工程とみなす（例えば、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ．（２００６）．Ｐｒｏｃｅｓｓ－ｓｃａｌｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｐｏｌｉｓｈｉｎｇｕｓｉｎｇＣａｐｔｏ^ＴＭＱ、ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３１４７５０９１３７１２／ｌｉｔｄｏｃ２８９０３７１６＿２０１３０５０７２１２４４９．ＰＤＦを参照されたい）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ．（２００６）．Ｐｒｏｃｅｓｓ－ｓｃａｌｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｐｏｌｉｓｈｉｎｇｕｓｉｎｇＣａｐｔｏＴＭＱ、ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇｅｈｃｌｓ＿ｉｍａｇｅｓ／ＧＥＬＳ／Ｒｅｌａｔｅｄ％２０Ｃｏｎｔｅｎｔ／Ｆｉｌｅｓ／１３１４７５０９１３７１２／ｌｉｔｄｏｃ２８９０３７１６＿２０１３０５０７２１２４４９．ＰＤＦ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

プロテインＡカラムの性能を向上させることによって、ポリッシングクロマトグラフィー工程を減少または排除すると、開発努力と製造コストを大幅に削減したり、標的物の回収率を向上したり、製造作業を簡潔化したりできる。
本発明は、捕捉カラムの性能を改善することで、必要なポリッシング工程数を減らす目的で、アフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する包括的な中間洗浄策を提供する。これらのデータにより、本発明の洗浄溶液によって、ｍＡｂの精製プロセスを大幅に簡潔化できる可能性のあることが示されている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１の態様では、本発明は、水と、塩基性アミノ酸と、塩と、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤または有機ホスフェートとを含むアフィニティークロマトグラフィー洗浄溶液を特徴とする。いくつかの好ましい実施形態では、この塩基性アミノ酸はアルギニンであり、塩はナトリウムクロライドであり、アニオン性界面活性剤はナトリウムオクタノエートである。いくつかの好ましい実施形態では、塩基性アミノ酸はアルギニンであり、塩はナトリウムクロライドであり、アニオン性界面活性剤はナトリウムオクタノエートであり、洗浄溶液はグアニジンも含む。いくつかの好ましい実施形態では、塩基性アミノ酸はアルギニンであり、塩はナトリウムクロライドであり、非イオン性界面活性剤は、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）である。いくつかの好ましい実施形態では、塩基性アミノ酸はアルギニンであり、塩はナトリウムクロライドであり、有機ホスフェートはトリブチルホスフェートである。本発明の洗浄溶液は好ましくは、ｐＨが７～９の範囲である。好ましい実施形態では、洗浄溶液は、ｐＨが約７．０であるか、ｐＨが約７．５であるか、ｐＨが約８．０であるか、ｐＨが約８．５であるか、またはｐＨが約９．０である。

【0009】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを０ｍＭ超、約５００ｍＭ未満と、ナトリウムクロライドを０ｍＭ超、約３００ｍＭ未満と、アニオン性界面活性剤を５ｍＭ超、約４５ｍＭ未満含む。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、アルギニンを約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ、アルギニンを約８５ｍＭ～約１１５ｍＭ、アルギニンを約９０ｍＭ～約１１０ｍＭ、アルギニンを約９５ｍＭ～約１０５ｍＭ、アルギニンを約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、アルギニンを約１５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、アルギニンを約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、アルギニンを約３００ｍＭ～約３５０ｍＭ、またはアルギニンを約２５０ｍＭ～約３００ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約５０ｍＭ、アルギニンを約７５ｍＭ、アルギニンを約９０ｍＭ、アルギニンを約１００ｍＭ、アルギニンを約１０５ｍＭ、アルギニンを約１１０ｍＭ、アルギニンを約１２５ｍＭ、アルギニンを約１５０ｍＭ、アルギニンを約２００ｍＭ、アルギニンを約２５０ｍＭ、アルギニンを約３００ｍＭ、アルギニンを３５０ｍＭ、アルギニンを約４００ｍＭ、アルギニンを約４５０ｍＭ、またはアルギニンを約５００ｍＭ含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約５ｍＭ～約４５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、またはアニオン性界面活性剤を２２．５ｍＭ～約２７．５ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約２２．５ｍＭ～約２７．５ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２０ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２２．５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約３０ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約４０ｍＭ、またはアニオン性界面活性剤を約４５ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、アニオン性界面活性剤は、ナトリウムオクタノエートを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭ、アルギニンを約２５０ｍＭ、またはアルギニンを約２００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１００ｍＭと、アニオン性界面活性剤を約２５ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭと、ナトリウムオクタノエートなどのアニオン性界面活性剤を約２５ｍＭ含み、ｐＨが約７．５である。

【0013】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約５０ｍＭ超、約１５０ｍＭ未満と、グアニジンを約５０ｍＭ超、約２５０ｍＭ未満と、ナトリウムクロライドを０ｍＭ超、約３００ｍＭ未満と、アニオン性界面活性剤を約５ｍＭ超、約４５ｍＭ未満含む。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、アルギニンを約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ、アルギニンを約８５ｍＭ～約１１５ｍＭ、アルギニンを約９０ｍＭ～約１１０ｍＭ、アルギニンを約９５ｍＭ～約１０５ｍＭ、またはアルギニンを約９８ｍＭ～約１０２ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ含む。本発明の洗浄溶液は、グアニジンを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、グアニジンを約５０ｍＭ～約２５０ｍＭ、グアニジンを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、グアニジンを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、グアニジンを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、グアニジンを約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、グアニジンを約１３５ｍＭ～約１６５ｍＭ、またはグアニジンを約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンを約１５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭと、グアニジンを約１５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンを約５０ｍＭ、グアニジンを約１２５ｍＭ、グアニジンを約１３５ｍＭ、グアニジンを約１４５ｍＭ、グアニジンを約１５０ｍＭ、グアニジンを約１５５ｍＭ、グアニジンを約１６０ｍＭ、グアニジンを約１６５ｍＭ、グアニジンを約１７０ｍＭ、グアニジンを約１７５ｍＭ、グアニジンを約１８０ｍＭ、グアニジンを約１８５ｍＭ、グアニジンを約１９０ｍＭ、グアニジンを約１９５ｍＭ、グアニジンを約２００ｍＭ含む。このような洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤をさらに含んでもよいか、ナトリウムクロライドをさらに含んでもよいか、またはアニオン性界面活性剤とナトリウムクロライドをさらに含んでもよい。

【0014】

いくつかの実施形態では、アルギニンとグアニジンとを含む洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約５ｍＭ～約４５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２２．５ｍＭ～約２７．５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２２ｍＭ～約２８ｍＭ、またはアニオン性界面活性剤を約２３ｍＭ～約２９ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約２５ｍＭ含む。アニオン性界面活性剤は好ましくは、ナトリウムオクタノエートである。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭと、グアニジンを約１５０ｍＭと、アニオン性界面活性剤（好ましくは、ナトリウムオクタノエートである）を約２５ｍＭ含み、ｐＨが約７．５である。

【0015】

いくつかの実施形態では、アルギニンとグアニジンとを含むか、またはアルギニンと、グアニジンと、アニオン性界面活性剤とを含む洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１３５ｍＭ～約１６５ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭと、グアニジンを約１５０ｍＭと、アニオン性界面活性剤（好ましくは、ナトリウムオクタノエートである）を約２５ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含み、ｐＨが約７．５である。

【0016】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを０ｍＭ超、約５００ｍＭ未満と、ナトリウムクロライドを０ｍＭ超、約２５０ｍＭ未満と、非イオン性界面活性剤を０体積％超、約０．２５体積％未満含む。その洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、アルギニンを約１５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、アルギニンを約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、アルギニンを約３００ｍＭ～約３５０ｍＭ、またはアルギニンを約２５０ｍＭ～約３００ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、アルギニンを約２５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ含む。その洗浄液は、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ含む。その洗浄溶液は、非イオン性界面活性剤を約０．０１％（ｗ／ｖ）～約０．２％（ｗ／ｖ）、非イオン性界面活性剤を約０．０５％（ｗ／ｖ）～約０．１５％（ｗ／ｖ）、非イオン性界面活性剤を約０．１％（ｗ／ｖ）～約０．１５％（ｗ／ｖ）、または非イオン性界面活性剤を約０．０５％（ｗ／ｖ）～約０．１％（ｗ／ｖ）含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、非イオン性界面活性剤を約０．０１％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．１５％（ｗ／ｖ）または約０．２％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含む。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭ、アルギニンを約２５０ｍＭ、またはアルギニンを約２００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１００ｍＭと、有機溶媒を約０．０％含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤を約０．１％（ｗ／ｖ）含み、ｐＨが約７．５である。

【0018】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを０ｍＭ超、約５００ｍＭ未満と、ナトリウムクロライドを０ｍＭ超、約２５０ｍＭ未満と、有機ホスフェートを０体積％超、約０．１体積％未満含む。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、アルギニンを約１５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、アルギニンを約２００ｍＭ～約３００ｍＭ、アルギニンを約３００ｍＭ～約３５０ｍＭ、またはアルギニンを約２５０ｍＭ～約３００ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ含む。その洗浄液は、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ含んでよい。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ含む。その洗浄溶液は、有機ホスフェートを約０．０３％（ｗ／ｖ）～約０．０７％（ｗ／ｖ）含んでよい。いくつかの実施形態では、有機ホスフェートは、トリブチルホスフェートを含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ウイルスクリアランスを向上させるか、または目的タンパク質を含む混合物のウイルスを不活化する。ウイルスクリアランスは、ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）で測定できる。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ウイルスクリアランスを向上させ、そのＬＲＶは、約１．０～約１０．０ｌｏｇ_１０である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ウイルスクリアランスを向上させ、そのＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０～約５．０ｌｏｇ_１０であるか、そのＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０～約３．０ｌｏｇ_１０であるか、そのＬＲＶは、約２．０ｌｏｇ_１０～約４．０ｌｏｇ_１０であるか、そのＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ_１０～約５．０ｌｏｇ_１０であるか、そのＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ_１０～約８．０ｌｏｇ_１０であるか、そのＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ_１０～約８．０ｌｏｇ_１０であるか、またはそのＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ_１０～６．０ｌｏｇ_１０である。いくつかの実施形態では、ＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約２．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約６．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約７．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約８．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約９．０ｌｏｇ_１０であるか、またはＬＲＶは、約１０．０ｌｏｇ_１０である。

【0020】

プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーカラムを用いて、目的タンパク質を精製するのに、このようないずれかの洗浄溶液を用いてよい。好ましい実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡクロマトグラフィーカラムである。好ましい実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。精製した目的タンパク質を含む組成物を提供し、そのタンパク質は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載または例示されている方法に従って精製する。したがって、別の態様では、本開示は、組成物を特徴とする。このような組成物は、目的タンパク質と、最小限の量の宿主細胞タンパク質とを含み、宿主細胞タンパク質は、目的タンパク質と共発現するが、大部分は、記載されている洗浄溶液を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、目的タンパク質から分離させる。目的タンパク質は好ましくは、抗体を含む。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）に特異的に結合する抗体である。ＴＬ１ａに特異的に結合する抗体は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含んでよい。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に特異的に結合する抗体である。ＣＧＲＰに特異的に結合する抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含んでよい。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体である。ＣＤ３８に特異的に結合する抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含んでよい。ＣＤ３８に特異的に結合する抗体は、インターフェロン分子（インターフェロンα分子を含むとともに、減弱化インターフェロンα分子を含む）への融合部をさらに含んでよい。

【0021】

いくつかの実施形態では、組成物は、水性担体と、ＴＬ１ａに特異的に結合する組み換え発現抗体またはハイブリドーマ発現抗体と、その組成物の約５００ｐｐｍ未満であるレベルの宿主細胞タンパク質とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約４５０ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約３００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約２００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約１５０ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約１００ｐｐｍ未満である。ＥＬＩＳＡを用いて、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベル（ｐｐｍ）を割り出してよい。この抗体は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬとを含んでよい。

【0022】

いくつかの実施形態では、組成物は、水性担体と、ＣＧＲＰに特異的に結合する組み換え発現抗体またはハイブリドーマ発現抗体と、その組成物の約８００ｐｐｍ未満であるレベルの宿主細胞タンパク質とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約７００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約５００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約２００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい態様では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約１５０ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約１００ｐｐｍ未満である。ＥＬＩＳＡを用いて、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベル（ｐｐｍ）を割り出してよい。この抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含んでよい。

【0023】

いくつかの実施形態では、組成物は、水性担体と、ＣＤ３８に特異的に結合する組み換え発現抗体もしくはハイブリドーマ発現抗体、またはそのコンストラクトであって、その抗体に融合したインターフェロン分子を含む抗体またはそのコンストラクトと、その組成物の約５００ｐｐｍ未満であるレベルの宿主細胞タンパク質とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約４００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい態様では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約３００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約２００ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約１５０ｐｐｍ未満である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベルは、その組成物の約１００ｐｐｍ未満である。ＥＬＩＳＡを用いて、組成物中の宿主細胞タンパク質のレベル（ｐｐｍ）を割り出してよい。この抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含んでよい。

【0024】

本発明の洗浄溶液は、タンパク質の精製法で用いてよい。別の態様では、本開示は、組み換え発現によるか、またはハイブリドーマ発現によるかを含め、細胞から発現させる目的タンパク質の精製方法を特徴とする。概して、この方法は、目的タンパク質と、１つ以上の夾雑宿主細胞タンパク質との混合物をアフィニティークロマトグラフィーリガンドの上に充填することと、塩基性アミノ酸と、塩と、非イオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤とを含む水性洗浄溶液で、そのリガンドを洗浄して、その１つ以上の夾雑タンパク質をそのリガンドから溶出して、続いて、目的タンパク質をそのリガンドから溶出することによって、目的タンパク質の精製溶出液を形成することを含む。その水性洗浄溶液は、上の段落で説明した洗浄溶液を含め、本明細書に記載または例示されているようないずれかの溶液であってよい。そのリガンドは、当業者に知られているいずれかの好適なアフィニティーリガンド、例えば、プロテインＡであってよく、その場合、目的タンパク質は、抗体を含む。この方法は、目的タンパク質と、１つ以上の夾雑タンパク質をバイオリアクターで発現させることをさらに含んでよい。

【0025】

この方法は、目的タンパク質の精製溶出液を酸性化して（例えば、目的タンパク質の精製溶出液のｐＨを低下させて）、その溶出液中のウイルスを不活化することをさらに含んでよい。ｐＨを低下させる作業は、溶出液中のウイルスを不活化するのに十分な期間行い、その後、ｐＨは、より中性なｐＨまで上昇させる。この方法は、目的タンパク質の精製溶出液をろ過して、不活化ウイルスも含め、ウイルスを除去することをさらに含んでよい。この方法は、透析ろ過、限外ろ過、または透析ろ過と限外ろ過の両方によって、目的タンパク質の精製溶出液を処理することをさらに含んでよい。この方法は、製薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、目的タンパク質の精製溶出液を調合することをさらに含んでよい。この方法は、目的タンパク質の精製溶出液をメンブレンクロマトグラフィー担体、例えば、陰イオン交換メンブレンクロマトグラフィー担体の上に充填することと、さらに精製した溶出液を含むフロースルーを、メンブレンクロマトグラフィー担体から回収することをさらに含んでよい。この方法は、製薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物として、目的タンパク質の、さらに精製した溶出液を調合することをさらに含んでよい。

【0026】

いくつかの態様では、この方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含まない。いくつかの態様では、この方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含まない。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】樹脂プレートにおける単一成分の洗浄バッファーによるＨＣＰの除去量を示している。

【図2】樹脂プレートにおける、アミノ酸と界面活性剤を組み合わせたもの、またはグアニジンと界面活性剤を組み合わせたものを含む洗浄バッファーによるＨＣＰの除去量を示している。

【図3】樹脂プレートにおける、アルギニンとグアニジンを界面活性剤とともに組み合わせたものを含む洗浄バッファーによるＨＣＰの除去量を示している。

【図4】Ａｔｏｌｌカラムにおける、ＮａＣｌと、トリブチルホスフェートと、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００と、アルギニンと、ナトリウムオクタノエートと、グアニジンを組み合わせたものによるＨＣＰの除去量を示している。

【図5】非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００／ＮａＣｌ／アルギニンの洗浄バッファーを用いた場合の宿主細胞タンパク質クリアランスに対するｐＨの影響を示している。

【図6】アルギニンと、グアニジンと、界面活性剤と、ナトリウムオクタノエートを様々に組み合わせたものを含む洗浄液を用いた場合の、様々な抗体（抗ＴＬ１ａ、抗ＣＤ－３８及び抗ＣＧＲＰ）からのＨＣＰの除去量を示している。

【図7】本発明のプロテインＡ洗浄バッファーを用いる新規な精製スキーム（右側の列）と比較した従来の抗体精製スキーム（左側の列）のフローチャートを示し、プロテインＡクロマトグラフィーの後にメンブレンクロマトグラフィーを行う。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明で提供するのは、アフィニティークロマトグラフィー洗浄組成物と、そのような組成物を用いるポリペプチド精製スキームと、純度の高いポリペプチド調製物、例えば、上記のような組成物または精製スキームを用いて精製したようなポリペプチド調製物である。

【0029】

本発明の態様に関連する様々な用語は、本明細書と請求項を通じて用いられている。別段に示されていない限り、このような用語には、当該技術分野における通常の意味が与えられるものとする。具体的に定義されている他の用語は、本明細書に示されている定義に沿った形で解釈するものとする。

【0030】

本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、明示的な別段の定めのない限り、複数の言及物が含まれる。

【0031】

「水を含む溶液」という用語は、「水溶液」という用語と同義的に用いられている。

【0032】

「宿主細胞タンパク質」、「ＨＣＰ」、「宿主細胞タンパク質夾雑物」及び「宿主細胞タンパク質の不純物」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。

【0033】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「目的ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指す目的で、同義的に用いられている。このポリマーは、直鎖状であることも、分岐状であることもでき、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断されていることができる。これらの用語には、天然において修飾されているアミノ酸ポリマー、または介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化またはいずれかの他の操作もしくは修飾（標識成分とのコンジュゲートなど）によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含まれる。この定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含むポリペプチドと、当該技術分野において知られているその他の修飾体も含まれる。本開示のポリペプチドは抗体ベースであるので、特定の実施形態では、本開示のポリペプチドは、一本鎖としても、会合鎖としても存在できることが分かる。好ましくは、目的タンパク質は、ポリペプチド、抗体、その抗原結合断片または抗体コンストラクトである。

【0034】

「抗ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）」という用語は、ＴＬ１ａに結合できるいずれかのタンパク質を指す。抗ＴＬ１ａタンパク質としては、例えば、抗ＴＬ１ａ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。

【0035】

「抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）」という用語は、ＣＧＲＰに結合できるいずれかのタンパク質を指す。抗ＧＣＲＰタンパク質としては、例えば、抗ＣＧＲＰ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。

【0036】

「抗ＣＤ３８」という用語は、ＣＤ３８に結合できるいずれかのタンパク質を指す。抗ＣＤ３８タンパク質としては、例えば、抗ＣＤ３８抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。

【0037】

本明細書で使用する場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、専門用語であり、本明細書では同義的に用いることができ、抗原と特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を指す。

【0038】

「抗体」という用語は、その免疫グロブリン分子の可変領域内における少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、標的（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖鎖、ポリヌクレオチド、脂質またはこれらを組み合わせたものなど）を認識して、その標的に特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語には、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及びいずれかのその他の改変免疫グロブリン分子が含まれる（ただし、その抗体が、所望の生物学的活性を示す場合に限る）。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ及びμという重鎖定常ドメインの特徴に基づき、５つのいずれかの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の免疫グロブリンであることができる。免疫グロブリンのクラスによって、サブユニット構造と三次元構造が異なり、そのサブユニット構造と三次元構造は周知である。抗体は、ネイキッドであることも、他の分子（毒素、放射線同位体など）にコンジュゲートしていることもできる。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語には、二重特異性抗体と多特異性抗体が含まれる。

【0039】

「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の一部を指す。「抗原結合断片」とは、インタクト抗体の部分のうち、抗原に結合する部分を指す。抗原結合断片は、インタクト抗体の抗原決定可変領域を含むことができる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、直鎖状抗体及び一本鎖抗体が挙げられるが、これらに限らない。「抗原結合断片」は、二重特異性抗原結合断片であることも、多特異性抗原結合断片であることもできる。

【0040】

「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片とは、単一の抗原決定基、すなわちエピトープを高い特異性で認識して、それに結合するのに関与する均一な抗体集団または抗原結合断片集団を指す。この抗体は、様々な抗原決定基に対する様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル」抗体という用語またはその抗原結合断片には、インタクトな完全長モノクローナル抗体、ならびに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含むいずれかの他の改変免疫グロブリン分子の両方が含まれる。さらに、「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片とは、いずれかの数の方式（ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現及びトランスジェニック動物によるものが挙げられるが、これらに限らない）で作製したモノクローナル抗体と、その抗原結合断片を指す。

【0041】

「ヒト化」抗体という用語またはその抗原結合断片は、特異的免疫グロブリン鎖であるヒト以外の（例えばマウス）抗体または抗原結合断片、キメラ免疫グロブリン、またはヒト以外の（例えばマウス）最小配列を含むその断片の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒト以外の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基のうち、所望の特異性、親和性及び能力を有する残基によって、ＣＤＲの残基が置き換えられている（「ＣＤＲ移植」）ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４－１５３６（１９８８））。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するヒト以外の種の抗体または断片の対応する残基で置き換えられている。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｖフレームワーク領域及び／またはヒト以外の置き換えた残基のいずれかにおいて、追加の残基を置換することによってさらに改変して、抗体またはその抗原結合断片の特異性、親和性及び／または能力を改良及び至適化することができる。概して、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒト以外の免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域をすべてまたは実質的にすべてを含む可変ドメインの少なくとも１つ、典型的には２つもしくは３つの実質的にすべてを含むことになる一方で、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことができる。ヒト化抗体を作製するのに用いる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｒｏｇｕｓｋａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９－９７３（１９９４）及びＲｏｇｕｓｋａｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９（１０）：８９５－９０４（１９９６）に記載されている。いくつかの実施形態では、「ヒト化抗体」は、表面再処理抗体である。

【0042】

抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域（単独であるか、または組み合わせたもの）を指す。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域としても知られている）によって連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって密接して一体に保たれており、もう一方の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定する技法には、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈｅｄ．，１９９１，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭｄ．））と、（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８））という少なくとも２つのものがある。加えて、当該技術分野では、これらの２つのアプローチを組み合わせたものを用いて、ＣＤＲを決定することもある。

【0043】

「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生される抗体、またはヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体であって、当該技術分野において知られているいずれかの技法を用いて作製した抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな抗体、すなわち完全長抗体、その断片、ならびに／または少なくとも１つのヒト重鎖及び／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体（例えば、マウス軽鎖ポリペプチドとヒト重鎖ポリペプチドとを含む抗体など）が含まれる。

【0044】

「ハイブリドーマ発現させた」という用語は、免疫学的起源の不死化細胞株と抗体産生細胞の融合によって作製するハイブリッド細胞株で発現する目的タンパク質を指す。「ハイブリドーマ」という用語には、ヒト細胞とマウスミエローマ細胞株との融合後に、形質細胞と融合させることによって得られる、ヘテロハイブリッドミエローマ融合体の子孫（一般的にはトリオーマ細胞株として知られている）が含まれる。さらに、「ハイブリドーマ」という用語には、例えばクアドローマのように、抗体を産生するいずれかの不死化ハイブリッド細胞株を含めるように意図されている（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３を参照されたい）。ハイブリッド細胞株は、ヒトとマウスを含むいずれかの種のものであることができる。

【0045】

「組み換え発現させた」という用語は、組み換えプラスミドまたはベクターのように、外因性ポリヌクレオチドの導入によって遺伝子改変したか、または遺伝子改変できる「組み換え宿主細胞」で、目的タンパク質を発現させることを指す。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も指すように意図されていることを理解すべきである。継代世代では、変異または環境の影響のいずれかにより、特定の改変が生じることがあるので、このような子孫は実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも、本明細書で使用する場合の「組み換え宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。

【0046】

「アミノ酸」という用語は、いずれかの天然及び／または非天然アミノ酸残基を指す。「天然アミノ酸」という用語は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌを指す。「塩基性アミノ酸」という用語は、アルギニン、リシン、グリシン及びヒスチジンを指す。アミノ酸には、Ｄ体の天然アミノ酸と非天然アミノ酸も含まれる。「Ｄ－」とは、天然（「Ｌ－」）アミノ酸の構造とは対照的に、「Ｄ－」（右旋性）構造を持つアミノ酸を示す。天然アミノ酸と非天然アミノ酸は、企業（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍｔｅｃｈ）から購入することも、当該技術分野において知られている方法を用いて合成することもできる。

【0047】

「アフィニティークロマトグラフィー」または「アフィニティー精製」という用語は、固体支持体に固定化または結合したリガンドと、その結合パートナーとの特異的結合の相互作用に基づく分離方法を指す。複合混合物をカラムに通すと、リガンドに対する特異的結合親和性を持つそれらの分子が結合する。他の試料成分を洗い流した後、結合した分子を支持体から剥離し、その結果、元の混合物から、その分子が精製される。それぞれの特異的なアフィニティーシステムには、当業者に知られている独自の条件群が必要となる。

【0048】

「アフィニティーリガンド」という用語は、金属（例えば、Ｃｄ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｇａ^＋３、Ｆｅ^＋３、Ｎｉ^＋２及びＺｎ^＋２）、色素（例えば、チバクロンブルー及びその変種）、グルタチオン、サブチリシン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、ボロネート、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、抗ｃ－Ｍｙｃ、抗ＨＡ、ヌクレオチド、コエンザイム、抗体、ヘパリン、抗原（特に、既知の特異性を持つ抗体に対する抗原）、ならびにその他の既知のアフィニティーリガンドを指す。

【0049】

「ウイルスクリアランス」という用語は、「ウイルス不活化」、「ウイルスの不活化」、「ウイルス除去」及び「ウイルスの除去」という用語と同義的に用いられている。「ウイルス不活化」という用語には、混合物に含まれるウイルスを無機能にしたり、または精製する混合物からウイルスを除去したりすることが含まれる。そのウイルスは、抗体産生源、下流の処理工程または製造条件に起因し得る。ウイルスを無機能にしたり、またはウイルスを除去したりする方法としては、熱活性化、ｐＨ不活化、化学的不活化剤などが挙げられる。「ｐＨウイルス不活化」という用語には、ウイルスを無機能にするのに十分なｐＨ環境、例えば、ｐＨ約２．５～５．０の環境にウイルスを暴露することが含まれる。

【0050】

「ｌｏｇ_１０減少係数（ＬＲＦ）」、「ｌｏｇ_１０減少値（ＬＲＶ）」及び「対数クリアランス」という用語は、同義的であり、出発物質のウイルス力価と、関連する生成物画分のウイルス力価との比の算出値を指す。減少係数は、ウイルスを除去または不活化するためのプロセス工程の潜在能または能力を示すのに好適なパラメーターである。いずれのプロセス工程のＬＲＶも、生成物を汚染し得るウイルスに似ているいずれかの既知のモデルウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）を用いて測定できる。

【0051】

ウイルスクリアランスを調べる目的は、ウイルスを不活化／除去するのに有効とみなすことができるプロセス工程（複数可）を評価することと、プロセス工程（複数可）によって得られる全体的なウイルス減少レベルを定量的に推定することである。ウイルス減少レベルは、各種プロセス工程の後に得た、目的タンパク質を含む混合物に、相当量のウイルスを加えて（「スパイキング」）から、次の工程の際に、ウイルスの除去または不活化を示すことによって得てよい。ウイルス感染性の低下は、ウイルス粒子の除去またはウイルス感染性の不活化によって実現してよい。ウイルスクリアランスの調査は、混合物に存在することが分かっているウイルスのクリアランスを示す目的で行う。減少係数は通常、対数スケール（ｌｏｇ１０）で表す。クリアランス評価調査のためのモデルウイルスは、目的タンパク質を含む混合物を汚染し得るウイルスに似るように選択する。細胞株由来の目的タンパク質のウイルスクリアランスのバリデーションでは、モデルウイルス（異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕｌＶ）及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）など）を用いることが多い。

【0052】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、目的タンパク質を含む混合物のウイルスクリアランスを向上させたり、またはウイルスを不活化したりする。ウイルスクリアランスは、ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ）で測定できる。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ウイルスクリアランスを向上させ、そのＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０～約１０．０ｌｏｇ_１０である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ウイルスクリアランスを向上させ、そのＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０～約５．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０～約３．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約２．０ｌｏｇ_１０～約４．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ_１０～約５．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ_１０～約８．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ_１０～約８．０ｌｏｇ_１０であるか、またはＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ_１０～６．０ｌｏｇ_１０である。いくつかの実施形態では、ＬＲＶは、約１．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約２．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約３．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約４．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約５．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約６．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約７．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約８．０ｌｏｇ_１０であるか、ＬＲＶは、約９．０ｌｏｇ_１０であるか、またはＬＲＶは、約１０．０ｌｏｇ_１０である。

【0053】

本発明は、目的タンパク質を含む精製溶出液と組成物であって、本発明の方法のいずれかを用いたウイルスクリアランス調査によって測定した場合に、ウイルス粒子を「実質的に含まない」精製溶出液と組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「ウイルス粒子を実質的に含まない」という用語は、目的タンパク質を含む精製溶出液または組成物であって、目的タンパク質をウイルス粒子から分離した精製溶出液または組成物を指す。「実質的に含まない」という用語は、目的タンパク質を含む溶液または組成物であって、ウイルス粒子が約０．０００５％～約０．００１％未満である溶液または組成物を指す。好ましくは、本発明の組成物は、ウイルス粒子が約０．０００５％未満であるであるときに、「実質的に含まない」。

【0054】

本発明は、目的タンパク質を含む精製溶出液と組成物であって、本発明の方法のいずれかを用いたウイルスクリアランス調査によって測定した場合に、ウイルス粒子を「含まない」精製溶出液と組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「ウイルス粒子を含まない」という用語は、約０．０００１％未満を有する組成物を指す。本発明の組成物は、最大感度条件のウイルスクリアランス調査によってウイルス粒子を検出できないときに、ウイルス粒子を含まない。

【0055】

本開示によれば、ナトリウムクロライド（ＮａＣｌ）と、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または有機ホスフェートの両方をアルギニンとともに洗浄溶液に含めると、アフィニティークロマトグラフィー精製の際に、組み換えタンパク質調製物からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の除去量が実質的に向上することが観察されている。このようなＨＣＰ除去量の向上は、それぞれの成分自体または他の成分のうちの１つのみと組み合わせた場合よりも大きかった。３つの成分（１．アルギニン、ＮａＣｌ及びＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、２．アルギニン、ＮａＣｌ及びナトリウムオクタノエートまたは３．アルギニン、ＮａＣｌ及びトリブチルホスフェート）による三成分の組み合わせにより、相加的（例えば、相乗的）であるよりも大きなＨＣＰ除去量の向上をもたらした。さらに、グアニジンを加えると、比較的低濃度のアルギニンの使用が可能になることが観察されたので、操作コストが低下する可能性がある。さらに、洗浄バッファー中の各成分が低濃度（当該技術分野において通常用いられる濃度との比較）であっても、ＨＣＰが有効に除去された。これは有益である。環境によくない廃棄物が削減される可能性があるからである。ＨＣＰ（ｐｐｍ）は、ＣＨＯＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎｓ３ｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎというキット（ＩｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃＡｓｓａｙｆｏｒｔｈｅＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＣＨＯＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎｓ、カタログ番号Ｆ５５０、ＣｙｇｎｕｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）をメーカーのプロトコールに従って用いて割り出すことができる。

【0056】

塩と非イオン性界面活性剤を組み合わせると、高度に宿主細胞タンパク質が除去されることは予想外であった。これらの賦形剤には、反対の作用がある場合があるからであり、すなわち、塩は、疎水性相互作用を向上させ、非イオン性界面活性剤は、疎水性相互作用を低下させるからである。

【0057】

アルギニンとアニオン性界面活性剤を組み合わせると、高度に宿主細胞タンパク質が除去されることも予想外であった。アルギニンを界面活性剤、例えばナトリウムオクタノエート（ナトリウムカプリレートまたはＣＡともいう）と組み合わせた洗浄バッファーの別の用途では、洗浄バッファーでアルギニンのみを用いた場合と比べて、残存ＨＣＰのレベルが高くなるからである。例えば、Ｎａｂｉｌａｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，３０：１１１４－２４を参照されたい。

【0058】

アルギニンとグアニジンを組み合わせると、各成分の使用量を大幅に減少させることができる。米国特許第８，３５０，０１３号には、高濃度のアルギニン、特に＞５００ｍＭのアルギニンまたは＞１Ｍのグアニジンによって、不純物の有効な除去が概ね観察されたことが開示されている。本発明では、１００ｍＭのグアニジンと１００ｍＭのアルギニンを組み合わせたところ、同等の有効性で不純物が除去された。アルギニンは高価であり、高濃度のグアニジン（１Ｍ前後のグアニジン）には腐食性がある。したがって、本発明により、大幅にコストを削減できるとともに、腐食をなくすことができる一方で、ＨＣＰを有効に除去できる。

【0059】

ＨＣＰの除去レベルは、陰イオン交換（ＡＥＸ）または陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーによる、その後の精製工程をタンパク質精製スキームから除外できるほど十分であることが観察された。精製スキームにおけるＡＥＸとＣＥＸの二段階工程を、メンブレンクロマトグラフィーの精製スキームにおける一段階工程に置き換えて、高精製タンパク質調製物をもたらすことができる。単離の観点では、メンブレンクロマトグラフィーの工程は、ＡＥＸとＣＥＸを組み合わせたもの（ＡＥＸ＋ＣＥＸ）ほどは有効な精製工程ではない。しかしながら、本発明のアフィニティークロマトグラフィー方法によって、精製プロセスが改善される。本明細書に記載または例示されているようなアフィニティークロマトグラフィーとメンブレンアフィニティークロマトグラフィーによって得られる精製レベルは、先行技術で例示されているようなＡＥＸ＋ＣＥＸの組み合わせによるアフィニティークロマトグラフィーによって得られる精製レベルに匹敵する。

【0060】

ＡＥＸ＋ＣＥＸをメンブレンクロマトグラフィーに置き換えると、特に初期臨床物質の生成において有益である。メンブレンクロマトグラフィーは、充填能と対流物質移動が高く、その結果、ＡＥＸまたはＣＥＸの樹脂ベースの精製プロセススキームに比べて、生産スループットが向上し、バッファー消費量が減少し、コストが削減されるからである。さらに、メンブレンクロマトグラフィーは、使い捨てシステムであり、カラムクロマトグラフィーと比べて、精製スキームにおける柔軟性を高める。

【0061】

本開示は、アフィニティークロマトグラフィー洗浄組成物と、そのような組成物を用いるポリペプチド精製スキームと、例えばこのような組成物または精製スキームを用いて精製した高純度のポリペプチド調製物を特徴とする。この組成物と精製スキームは、特にハイブリドーマ発現または組み換え発現モノクローナル抗体に非常に適しているが、アフィニティークロマトグラフィーによって精製を行ういずれかの組み換え発現ポリペプチドの調製にも用いてよい。

【0062】

目的ポリペプチドの発現は、いずれかの好適な宿主細胞で行ってよく、その細胞は、そのポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフォーメーションされていてよい。宿主細胞は、真核細胞であっても、原核細胞であってもよく、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限らない。哺乳動物細胞が好ましい。好適な哺乳動物細胞の非限定的な例としては、抗体発現ハイブリドーマ細胞、発現宿主（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞及びマウスハイブリドーマＮＳ０細胞など）が挙げられる。ポリペプチドの発現は、細胞から細胞培養培地に分泌させても、細胞内で行わせてもよい。細胞培養は、バイオリアクターで行ってよい（例えば発酵）。典型的なバイオリアクター細胞培養は、基礎培地で開始し、培養の開始後、培養の終了まで、定期的に栄養分を注入して行う。この注入は概して、流加培地によるものであり、タンパク質の発現期に細胞培養を維持するものである。大半は、流加培地の注入は、ボーラス注入で行い、濃縮流加培地を細胞培養物に所定の時点で、通常は１日に１回、速やかに加える。ボーラス送りの代わりに、バイオリアクター細胞培養物は、長時間送りまたは連続送りを用いて注入してよい。市販の流加培地は、バイオリアクターへの栄養分の注入に適している。

【0063】

バイオリアクターの容量は、少なくとも約２５０リットルであってよい。いくつかの態様では、バイオリアクターの容量は、少なくとも約５００リットルである。いくつかの態様では、バイオリアクターの容量は、少なくとも約２０００リットルである。いくつかの態様では、バイオリアクターの容量は、少なくとも約５０００リットル、１０，０００リットルまたは１５，０００リットルである。

【0064】

発現後、ポリペプチドを含む培地（例えば細胞培養培地）を清澄化して、例えば、宿主細胞と粒子状破片を除去してよい。清澄化は、ろ過、遠心分離またはこれらを組み合わせたものを含んでよい。例えば、珪藻土及びセルロース繊維による深層ろ過を用いてよい。市販のメンブレンフィルターを用いた（例えば０．２μｍのフィルターによる）メンブレンろ過を用いて、いずれかの微生物夾雑物を除去してもよい。

【0065】

発現と、清澄化（用いる場合）の後、目的ポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、夾雑宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去してよい。アフィニティークロマトグラフィーは、目的ポリペプチドの精製に適するいずれかのアフィニティーリガンドを含んでよい。アフィニティークロマトグラフィーリガンドの非限定的な例としては、金属（例えば、Ｃｄ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｇａ^＋３、Ｆｅ^＋３、Ｎｉ^＋２及びＺｎ^＋２）、色素（例えば、チバクロンブルー及びその変種）、グルタチオン、サブチリシン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、ボロネート、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、抗ｃ－Ｍｙｃ、抗ＨＡ、ヌクレオチド、コエンザイム、抗体、ヘパリン、抗原（特に、既知の特異性を持つ抗体に対する抗原）、ならびに他の既知のアフィニティーリガンドが挙げられる。アフィニティーリガンドは概して、固体支持体に固定化されおり、アフィニティーリガンド用には、既知かつ一般的な担体が数多くある。担体は好ましくは、クロマトグラフィーカラムに詰めることができる粒子、例えばビーズを含む。

【0066】

プロテインＡ及び／またはプロテインＧをアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして用いて、抗体または抗体コンストラクトを精製するときには、その抗体または抗体コンストラクトは、プロテインＡまたはプロテインＧリガンドに結合するＦｃドメインまたはＦｃドメインの少なくとも一部を含む。Ｆｃドメインまたはその一部は好ましくは、プロテインＡまたはプロテインＧに結合できるＩｇＧアイソタイプ（そのいずれかのサブタイプを含む）のものである。プロテインＬをアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして用いて、抗体または抗体コンストラクトを精製するときには、その抗体または抗体コンストラクトは、プロテインＬリガンドに結合する軽（Ｌ）鎖または軽鎖の少なくとも一部を含む。

【0067】

本発明のポリペプチド調製物は、リガンド－担体の上に充填し、それによって、目的タンパク質は、そのリガンド－担体に結合するのに十分な親和性で、リガンドと非共有結合で相互作用する。このリガンドは好ましくは、タンパク質結合能が高い。例えば、プロテインＡリガンドの抗体結合能は好ましくは、約１０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌであり、いくつかの態様では、その抗体結合能は、約１０ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌであり、いくつかの態様では、その抗体結合能は、約２０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌである。その担体は好ましくは、ポリペプチド調製物の充填前に平衡化する。平衡化は好ましくは、バッファー溶液で行う。

【0068】

ポリペプチド調製物のアフィニティークロマトグラフィー担体への充填は、目的ポリペプチドをリガンドに吸着させるのに適する温度、体積及び期間で行う。リガンドに吸着しない無用なＨＣＰは、クロマトグラフィーの際に担体を通流する。

【0069】

いくつかの好ましい態様では、目的ポリペプチドは、プロテインＡと相互作用できる定常領域を含む抗体または抗体コンストラクトを含む。したがって、発現した抗体調製物は、プロテインＡを含む担体に充填してよく、それによって、その抗体が、プロテインＡリガンドと相互作用する。プロテインＡの抗体結合能は、約１０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌであってよい。プロテインＡ担体は、プロテインＡアフィニティー培地（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴＳＵＲＥ（登録商標），ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、プロテインＡアフィニティー培地（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（登録商標），ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、プロテインＡアフィニティー培地（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴＳＵＲＥ（登録商標）ＬＸ，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、プロテインＡ樹脂（ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳＵＰｒＡ（商標），ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、プロテインＡ樹脂（ＥＳＨＭＵＮＯ（登録商標）Ａ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、プロテインＡ樹脂（ＰＯＲＯＳ（商標）ＭＡＢＣＡＰＴＵＲＥ（登録商標）Ａ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、プロテインＡ樹脂（ＡＭＳＰＨＥＲＥ（商標）Ａ３担体，ＪＳＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、プロテインＡ樹脂（ＫＡＮＥＫＡＫａｎＣａｐ（商標）Ａ，（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、プロテインＡ樹脂（ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）ＵｌｔｒａＰｌｕｓ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）及びシリカ系プロテインＡ培地（ＡＢＳＯＬＵＴＥ（登録商標）ＨｉｇｈＣａｐ，Ｎｏｖａｓｅｐ，Ｂｏｏｔｈｗｙｎ，ＰＡ）を含め、市販されている。当該技術分野において入手可能ないずれかの好適なプロテインＡ担体を用いてよい。抗体調製物のプロテインＡ担体への充填は、モノクローナル抗体をプロテインＡリガンドに吸着させるのに適する温度、体積及び期間で行う。プロテインＡリガンドに吸着しない無用なＨＣＰは、クロマトグラフィーの際に担体を通流する。

【0070】

アフィニティーリガンドに付着するか、または目的ポリペプチドに付着するＨＣＰをさらに除去するために、ポリペプチド吸着担体を洗浄する。この洗浄液は、塩基性アミノ酸と、塩と、非イオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤とを含む水溶液を含む。好ましい実施形態では、このアミノ酸はアルギニンであるが、アルギニンの代わりに、ヒスチジン、リシンまたはグリシンを用いてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、アミノ酸の代わりに、またはアミノ酸と組み合わせて（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リシンもしくはグリシンの代わりに、またはアルギニン、ヒスチジン、リシンもしくはグリシンと組み合わせて）、尿素またはグアニジンを用いてよい。好ましい実施形態では、塩はナトリウムクロライドであるが、ナトリウムクロライドの代わりに、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムを用いてよい。好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、またはポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）ブランドの非イオン性界面活性剤、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＮＪ）であるが、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００の代わりに、ＮＰ－４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー、トリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）、テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）またはコール酸ナトリウムを用いてよい。好ましい実施形態では、アニオン性界面活性剤を非イオン性界面活性剤の代わりに用いる場合、アニオン性界面活性剤は、ナトリウムオクタノエート（ナトリウムカプリレートとしても知られている）である。好ましい洗浄液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含む。別の好ましい洗浄液は、アルギニンと、グアニジンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含む。別の好ましい洗浄液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、アニオン性界面活性剤のナトリウムオクタノエートを含む。ナトリウムオクタノエートの代わりに、ヘプタン酸ナトリウム、ノナン酸ナトリウム、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムまたはＮ－ラウロイルサルコシンを用いてよい。本明細書の全体を通じて記載または例示されているようなこのような洗浄溶液は、本開示に従って特徴付けられている。

【0071】

いくつかの態様では、洗浄溶液は好ましくは、水と、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、アニオン性界面活性剤としてのナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは好ましくは、０ｍＭ超、約５００ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムクロライドは好ましくは、０ｍＭ超、約２５０ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約５０ｍＭ未満の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約４００ｍＭの濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約２００ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約３５ｍＭ未満の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３５０ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約２００ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約３０ｍＭ未満の濃度である。

【0072】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３００ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１７５ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約３０ｍＭ以下の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３００ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１７５ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約２５ｍＭ以下の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３００ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１５０ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約２５ｍＭ以下の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、ナトリウムオクタノエートを含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約２５０ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１５０ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムオクタノエートは好ましくは、０ｍＭ超、約２５ｍＭ以下の濃度である。

【0073】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約５００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２５０ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約１０ｍＭ～約５０ｍＭ含む。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約４００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約１０ｍＭ～約４０ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約１５０ｍＭ～約３５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約１５ｍＭ～約３５ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約１５ｍＭ～約３５ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２０ｍＭ～約３０ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２５ｍＭ～約３０ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ～約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２０ｍＭ～約２５ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ～約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２５ｍＭ～約３０ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２２５ｍＭ～約２７５ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２０ｍＭ～約３０ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２４０ｍＭ～約２６０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１４０ｍＭ～約１６０ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２２ｍＭ～約２８ｍＭ含んでもよい。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約２４５ｍＭ～約２５５ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２４ｍＭ～約２６ｍＭ含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭと、ナトリウムオクタノエートを約２５ｍＭ含む。

【0074】

別の態様では、洗浄溶液は、水と、アルギニンと、グアニジンを含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドをさらに含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤とナトリウムクロライドをさらに含む。そのアニオン性界面活性剤は、ナトリウムオクタノエートであってよい。ナトリウムオクタノエートの代わりに、ヘプタン酸ナトリウム、ノナン酸ナトリウム、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウムまたはＮ－ラウロイルサルコシンを用いてよい。

【0075】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを０ｍＭ超、約２００ｍＭ未満と、グアニジンを０ｍＭ超、約３００ｍＭ未満と、ナトリウムクロライドを０ｍＭ超、約２５０ｍＭ未満と、アニオン性界面活性剤を０ｍＭ超、約５０ｍＭ未満含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、アルギニンを約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ、アルギニンを約８５ｍＭ～約１１５ｍＭ、アルギニンを約９０ｍＭ～約１１０ｍＭ、アルギニンを約９５ｍＭ～約１０５ｍＭ、またはアルギニンを約９８ｍＭ～約１０２ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、グアニジンを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、グアニジンを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、グアニジンを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、グアニジンを約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、グアニジンを約１３５ｍＭ～約１６５ｍＭ、またはグアニジンを約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンを約１５０ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭと、グアニジンを約１５０ｍＭ含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２２．５ｍＭ～約２７．５ｍＭ、アニオン性界面活性剤を約２２ｍＭ～約２８ｍＭ、またはアニオン性界面活性剤を約２３ｍＭ～約２９ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アニオン性界面活性剤を約２５ｍＭ含む。アニオン性界面活性剤は好ましくは、ナトリウムオクタノエートである。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭと、グアニジンを約１５０ｍＭと、アニオン性界面活性剤（好ましくはナトリウムオクタノエートである）を約２５ｍＭ含み、ｐＨが約７．５である。

【0077】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、ナトリウムクロライドを約１３５ｍＭ～約１６５ｍＭ、またはナトリウムクロライドを約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭと、グアニジンを約１５０ｍＭと、アニオン性界面活性剤（好ましくはナトリウムオクタノエートである）を約２５ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭ含み、ｐＨが約７．５である。

【0078】

別の態様では、洗浄溶液は、水と、任意にグアニジンと組み合わせた塩基性アミノ酸と、塩と、非イオン性界面活性剤を含む。より好ましくは、本発明の洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは好ましくは、０ｍＭ超、約５００ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムクロライドは好ましくは、０ｍＭ超、約２５０ｍＭ未満の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は好ましくは、０体積％超、約０．２５体積％未満の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約４００ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約２００ｍＭ未満の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、０体積％超、約０．２５体積％未満の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３５０ｍＭ未満の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１５０ｍＭ未満の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、約０．２体積％未満の濃度である。

【0079】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３００ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１００ｍＭ以下の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、約０．１５体積％以下の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３００ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約２００ｍＭ以下の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、約０．１１体積％以下の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約３００ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１５０ｍＭ以下の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、約０．１体積％以下の濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を含み、そのアルギニンは、０ｍＭ超、約２５０ｍＭ以下の濃度であり、ナトリウムクロライドは、０ｍＭ超、約１５０ｍＭ以下の濃度であり、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、約０．１体積％以下の濃度である。

【0080】

いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約５００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０１％～約０．２５％（ｗ／ｖ）含む。本発明の洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約４００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約１５０ｍＭ～約３５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約５０ｍＭ～約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０１％～約０．２％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約１００ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０５％～約０．１５％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０５％～約０．１５％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭ～約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０５％～約０．１５％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭ～約３５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭ～約１５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１％～約０．２％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約７５ｍＭ～約１２５ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１％～約０．２％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２７５ｍＭ～約３２５ｍＭと、ナトリウムクロライドを約９０ｍＭ～約１１０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１％～約０．２％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２９０ｍＭ～約３１０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約９５ｍＭ～約１０５ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１３％～約０．１７％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２９５ｍＭ～約３０５ｍＭと、ナトリウムクロライドを約９７ｍＭ～約１０３ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１４％～約０．１６％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２９８ｍＭ～約３０２ｍＭと、ナトリウムクロライドを約９８ｍＭ～約１０２ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１４％～約０．１６％（ｗ／ｖ）含んでもよい。その洗浄溶液は、アルギニンを約２９９ｍＭ～約３０１ｍＭと、ナトリウムクロライドを約９９ｍＭ～約１０１ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１４％～約０．１６％（ｗ／ｖ）含んでもよい。

【0081】

いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１５％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１５％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約３００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約１００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２５０ｍＭと、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．１５％（ｗ／ｖ）含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを約２００ｍＭと、ナトリウムクロライドを約２００ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を約０．０５％（ｗ／ｖ）含む。

【0082】

本発明の洗浄液の導電率目標値は、約１５ｍＳ／ｃｍ～約４５ｍＳ／ｃｍの範囲であってよい。本発明の洗浄液の導電率目標値は、約１６ｍＳ／ｃｍ～約４２ｍＳ／ｃｍ、約１７ｍＳ／ｃｍ～約４０ｍＳ／ｃｍまたは約１８ｍＳ／ｃｍ～約３８ｍＳ／ｃｍの範囲であってよい。導電率目標値は、導電率計を含むいずれかの好適な技法に従って測定できる。

【0083】

一実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンと、アルギニンと、ＮＰ４０を含む。

【0084】

一実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンと、アルギニンと、ＰＳ２０を含む。

【0085】

一実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンと、アルギニンと、カプリル酸（ＣＡ）を含む。

【0086】

一実施形態では、洗浄溶液は、トリブチルホスフェートとアルギニンを含む。

【0087】

一実施形態では、洗浄溶液は、トリブチルホスフェートと、アルギニンと、塩（ＮａＣｌなど）を含む。

【0088】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００とアルギニンを含む。任意に、この洗浄溶液は、塩（ＮａＣｌなど）も含む。

【0089】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを２００ｍＭと、トリブチルＰｉを０．０５％と、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0090】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを２５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0091】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0092】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0093】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを２５０ｍＭと、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）（またはトリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ））含む。

【0094】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを５０～１００ｍＭと、グアニジンを１００～２５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭ含み、好ましくは、アルギニンは＞５０ｍＭであり、グアニジンは＞１００ｍＭである。

【0095】

一実施形態では、洗浄溶液は、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを３００ｍＭと、ＮａＣｌを１００ｍＭ含む。

【0096】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．０５％～０．１５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２００～３００ｍＭと、ＮａＣｌを１００～２００ｍＭ含む。

【0097】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0098】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを２００ｍＭと、トリブチルを０．０５％（ｗ／ｖ）と、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0099】

一実施形態では、洗浄溶液は、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭと、ＴＲＩＴＯＮを０．１％（ｗ／ｖ）含む。

【0100】

一実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンを３５０ｍＭと、トリブチルを０．０５％（ｗ／ｖ）含む。

【0101】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0102】

一実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸を２５ｍＭと、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0103】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＣＡを２５ｍＭと、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0104】

一実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸を２５ｍＭと、グアニジンを３５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0105】

一実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸を２５ｍＭと、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１００ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0106】

一実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸を２５ｍＭと、アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0107】

一実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸を２５ｍＭと、アルギニンを５０ｍＭと、グアニジンを１００ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0108】

一実施形態では、洗浄溶液は、カプリル酸を２５ｍＭと、アルギニンを５０ｍＭと、グアニジンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0109】

一実施形態では、洗浄溶液は、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0110】

一実施形態では、洗浄溶液は、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを３５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0111】

一実施形態では、洗浄溶液は、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２００ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0112】

一実施形態では、洗浄溶液は、グアニジンを３５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0113】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．０５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２００ｍＭと、ＮａＣｌを２００ｍＭ含む。

【0114】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを２００ｍＭ含む。

【0115】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２００ｍＭと、ＮａＣｌを１００ｍＭ含む。

【0116】

【0117】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを３００ｍＭと、ＮａＣｌを２００ｍＭ含む。

【0118】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．０５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを３００ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0119】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．０５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１００ｍＭ含む。

【0120】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを３００ｍＭと、ＮａＣｌを１００ｍＭ含む。

【0121】

一実施形態では、洗浄溶液は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２００ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む。

【0122】

夾雑物（ＨＣＰを含む）の除去のために、本明細書に記載及び例示されている洗浄溶液を用いて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄する。洗浄後、目的ポリペプチドをアフィニティーリガンドから溶出する。溶出用バッファーは概して、アフィニティーリガンドの種類に合わせて作製するので、様々であり得る。溶出は、目的タンパク質の溶出収率を最大にするのに適する温度、体積、期間で行ってよい。ポリペプチドの溶出によって、そのポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液が得られる。定常領域を含む抗体または抗体コンストラクトをポリペプチドが含むとともに、アフィニティーリガンドがプロテインＡである態様では、溶出用バッファーは好ましくは酸性である。抗体または抗体コンストラクトの溶出により、その抗体または抗体コンストラクトを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液が得られる。

【0123】

一実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）目的ペプチド（例えば抗体）と不純物（例えばＨＣＰ）とを含む混合物をプロテインＡクロマトグラフィーカラムに充填することと、（ｉｉ）（精製抗体を作るなどのために、）本発明の洗浄溶液でカラムを洗浄して、混合物中のＨＣＰのレベルを低下させるとともに、抗体の純度を向上させることと、（ｉｉｉ）溶出用バッファーをカラムに入れて、クロマトグラフィー溶出液を放出することを含む。アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、精製抗体と、工程（ｉ）でプロテインＡクロマトグラフィーカラムに充填した混合物と比べてレベルの低下したＨＣＰとの混合物を含む。

【0124】

抗体または抗体コンストラクトを含む溶出液を含め、ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液は、大幅にレベルの低下した宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み、このタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーの際に、ポリペプチドの調製物から、本発明の洗浄溶液によって除去された。抗体または抗体コンストラクトを含む溶出液を含め、ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液は好ましくは、宿主細胞タンパク質を約１０００ｐｐｍ未満含む。パーツパーミリオン（ｐｐｍ）でのＨＣＰ値は、生成物１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇ数で表してもよい。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約９００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約８００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約７００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約６００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約５００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約４００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約３５０ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約３００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約２５０ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約２００ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約１５０ｐｐｍ未満含む。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶出液は、宿主細胞タンパク質を約１００ｐｐｍ未満含む。宿主細胞タンパク質の量（例えばｐｐｍ）は、ＥＬＩＳＡ（宿主細胞タンパク質定量ＥＬＩＳＡなど）を含むいずれかの好適なアッセイに従って割り出すことができる。例えば、ＨＣＰのｐｐｍは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定したようなものである。液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を用いて、ＨＣＰを測定したり、特徴付けたりしてもよい。ＨＣＰＥＬＩＳＡキットは市販されており（例えば、ＣＨＯＨＣＰＥＬＩＳＡキット（ＣｙｇｎｕｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ２８４６１，ＵＳＡ、カタログ番号Ｆ５５０）など）、このようないずれかのキットは、ＨＣＰ含有量の測定に適している。

【0125】

ＨＣＰ含有量を減少させるのに加えて、本発明のアフィニティークロマトグラフィー洗浄溶液を用いて、目的タンパク質を含む組成物において、ウイルスのレベルを低下させたり、またはウイルスを不活化させたりしてもよい。典型的な先行技術の精製プロセスでは、タンパク質（例えば抗体）の精製方法の際に、陰イオン交換を用いた後に、さらなる酸性化処理を行って、ウイルスのレベルを低下させたり、またはウイルスを不活化したりする。驚くべきことに、本発明のアフィニティークロマトグラフィー洗浄溶液を用いると、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を省けるほど十分に、ウイルスのレベルが低下することを本発明者は発見した。

【0126】

アフィニティークロマトグラフィー溶出液（例えば、ポリペプチドを含むか、または抗体もしくは抗体コンストラクトを含む）は、陽イオン交換方法及び／または溶出液に存在するいずれかの残存ウイルスを不活化するための処理法によって、さらに処理してよい。ウイルスの不活化は、溶出液に存在するいずれかのウイルスを不活化するのに十分な温度と期間で、溶出液を酸性化することを含んでもよい。酸性化は、例えば、所望のｐＨになるまで、酢酸、クエン酸、塩酸、ギ酸またはこれらを組み合わせたものを溶出液に加えることを含んでよい。低ｐＨによるウイルス不活化の後、溶出液をｐＨ５．０～７．５（プロセスでの必要性に左右される）まで中性化してよい。中性化工程の際には、不純物（または生成物）の沈殿により、生成物プールに混濁が現れることがある。深層ろ過を用いて、ｐＨ調整済みの調製物をろ過して、混濁と不純物を除去してよい。

【0127】

ウイルスの不活化後、ウイルスの不活化を含まない場合には、アフィニティークロマトグラフィーからの溶出後、またはウイルスの不活化を含む場合、陽イオン交換工程後、目的ポリペプチドをメンブレンクロマトグラフィーでさらに精製してよい。精製した目的ポリペプチド（抗体または抗体コンストラクトを含んでよい）を含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液は典型的には、そのｐＨを調製して、メンブレンクロマトグラフィー担体に充填して、そのメンブレンに通すと、残存の宿主細胞タンパク質夾雑物がメンブレンに結合し、目的タンパク質がフロースルーに残る。メンブレンクロマトグラフィーフロースルー（精製した目的ポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液のままである）は、目的ポリペプチドと、クロマトグラフィーメンブレンに充填する前のアフィニティークロマトグラフィー溶出液よりも少ない宿主細胞タンパク質とを含む。メンブレンクロマトグラフィー担体は、陰イオン交換メンブレン（ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ（登録商標）Ｑ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標）Ｑ（ＰａｌｌＣｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）、ＮＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＤＱ（Ｎａｔｒｉｘ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）など）、または耐塩性マルチモジュール陰イオン交換メンブレン（ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ（登録商標）ＳＴＩＣメンブレン（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはＣＨＲＯＭＡＳＯＲＢメンブレン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）など）を含んでもよい。したがって、メンブレンクロマトグラフィーは、陰イオン交換メンブレンクロマトグラフィーを含んでよい。メンブレンクロマトグラフィー工程は典型的には、残存不純物の約５０％～約９９％以上を除去できる。

【0128】

本発明のアフィニティークロマトグラフィー溶出液は、精製した目的ポリペプチド（抗体または抗体コンストラクトを含んでよい）を含む。上で示したように、本発明のアフィニティークロマトグラフィー溶出液は、いずれかの残存ウイルスを不活化するために、さらに処理してもよく、及び／または第２のクロマトグラフィー工程（メンブレンクロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーなど）によってさらに精製してもよい。ウイルスの不活化のためにアフィニティークロマトグラフィー溶出液を処理したり、またはさらに精製したりするいずれのケースでも、抗体または抗体コンストラクトを含む目的ポリペプチドの、得られた組成物をさらに処理して、例えばヒト以外の動物またはヒトへの治療投与に適する形態にしてもよい。このようなさらなる処理としては、目的ポリペプチドの精製調製物の限外ろ過、ナノろ過、濃縮及び透析ろ過をいずれかに組み合わせたものを挙げてよい（図７）。

【0129】

限外ろ過は、目的ポリペプチドの調製物を濃縮するためのプロセスである。メンブレンのポアサイズまたは分画分子量に基づき、溶液中の他の分子からタンパク質をろ過する。透析ろ過を用いて、目的ポリペプチドを所望のバッファーに（例えば、溶出用バッファーから安定な処方バッファーに）交換する。限外ろ過と透析ろ過では典型的には、タンジェンシャルフローろ過を用いる。

【0130】

精製スキーム（本発明のアフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファーの使用を含むとともに、任意に、第２のクロマトグラフィー精製工程（例えば、メンブレンクロマトグラフィー及び／または陽イオン交換（順不同））の１つ以上をさらに含み、任意に、ウイルス不活化、ナノろ過、限外ろ過及び／または透析ろ過をさらに含む）の後には、目的ポリペプチドは好ましくは、組成物に存在している。この組成物は好ましくは、担体と目的ポリペプチドを含む。この担体は好ましくは水性であり、製薬学的に許容可能な担体であってよい。この担体は、バッファーを含んでもよく、１つ以上の製薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。この組成物は、医薬組成物と称してよい。「組成物」及び「精製組成物」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。

【0131】

目的ポリペプチド（抗体または抗体コンストラクトを含む）を含む組成物は好ましくは、宿主細胞タンパク質を約１０００ｐｐｍ未満含む。この組成物は好ましくは、宿主細胞タンパク質を約９００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約８００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約７００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約６００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約５００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約４５０ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約４００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約３５０ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約３００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約２００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約２５０ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約１５０ｐｐｍ未満または宿主細胞タンパク質を約１００ｐｐｍ未満含む。宿主細胞タンパク質の量（例えばｐｐｍ）は、ＥＬＩＳＡ（宿主細胞タンパク質定量ＥＬＩＳＡなど）を含むいずれかの好適なアッセイに従って割り出すことができる。例えば、ＨＣＰのｐｐｍは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定したようなものである。

【0132】

いくつかの態様では、組成物中の目的ポリペプチドは、抗体または抗体コンストラクトである。この抗体または抗体コンストラクトは、トランスフォーメーションした宿主細胞（例えば、その抗体もしくは抗体コンストラクトをコードする遺伝子を含む宿主細胞）によって組み換え発現したものであってよく、またはハイブリドーマ細胞によって発現させたものであってもよい。この抗体または抗体コンストラクトは、ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１ａ）上のエピトープに特異的に結合してよい。この抗体または抗体コンストラクトは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）上のエピトープに特異的に結合してよい。この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＤ３８上のエピトープに特異的に結合してよい。

【0133】

いくつかの態様では、組成物は、ＣＧＲＰに特異的に結合するとともに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む精製抗体または抗体コンストラクトを含む。その重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでよい。その軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでよい。本発明の組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、ＶＬとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＧＲＰに特異的に結合する。本発明の組成物は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、ＶＨとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＧＲＰに特異的に結合する。本発明の組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＧＲＰに特異的に結合する。この抗体は、米国特許出願公開第２００９／０２２０４８９号またはＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０５４８０９号に記載されているいずれかの抗体であってよい。

【0134】

いくつかの態様では、本発明の組成物は、ＴＬ１ａに特異的に結合するとともに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む精製抗体または抗体コンストラクトを含む。この抗体は、米国特許出願公開第２０１４／０２５５３０２号（参照により、本明細書に援用される）に記載されているいずれかの抗体であってよい。この抗体は、米国特許仮出願第６２／２２０，４４２号に記載されているいずれかの抗体であってよい。

【0135】

いくつかの態様では、本発明の組成物は、ＣＤ３８に特異的に結合するとともに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む精製抗体または抗体コンストラクトを含む。この抗ＣＤ３８抗体はさらに、第２のポリペプチド分子に融合していてもよく、例えば、ポリペプチド毒素に融合しているか、またはインターフェロンポリペプチド（インターフェロンαなど）に融合していてよい。その重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含んでよい。その軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでよい。本発明の組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、ＶＬとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＤ３８に特異的に結合する。本発明の組成物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、ＶＨとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＤ３８に特異的に結合する。本発明の組成物は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＣＤ３８に特異的に結合する。この抗体は、米国特許出願公開第２０１６／００６８６１２号または米国特許出願公開第２０１５／０３１３９６５号（それぞれ、参照により、本明細書に援用される）に記載されているいずれかの抗体であってよい（これらの刊行物に記載されているように、減弱化インターフェロン分子にさらに融合されている抗体を含む）。

【0136】

いくつかの態様では、本発明の組成物は、ＴＬ１ａに特異的に結合するとともに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む精製抗体または抗体コンストラクトを含む。そのＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列を含んでもよい。そのＶＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。そのＶＬは、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよい。したがって、そのＶＨは、配列番号５を含んでもよく、ＶＬは、配列番号７を含んでもよいか、またはＶＨは、配列番号６を含んでもよく、ＶＬは、配列番号７を含んでもよい。本発明の組成物は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨと、ＶＬとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＴＬ１ａに特異的に結合する。本発明の組成物は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬと、ＶＨとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＴＬ１ａに特異的に結合する。本発明の組成物は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗体または抗体コンストラクトを含んでよく、この抗体または抗体コンストラクトは、ＴＬ１ａに特異的に結合する。この抗体は、米国特許出願第１５／２６７，２１３号または米国特許出願公開第２０１４／０２５５３０２号（それぞれ、参照により、本明細書に援用される）に記載されているいずれかの抗体であってよい。

【0137】

いくつかの好ましい態様では、抗体（例えば、抗ＴＬ１ａ、抗ＣＧＲＰ及び抗ＣＤ３８）は、ヒトＩｇＧ定常領域を含む。このヒトＩｇＧ定常領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４定常領域であってよい。抗体（例えば、抗ＴＬ１ａ、抗ＣＧＲＰ及び抗ＣＤ３８）は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であってよい。

【0138】

本明細書に説明されているように、アルギニンと、ナトリウムクロライドと、非イオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤とを含む洗浄バッファーで洗浄することを含むアフィニティークロマトグラフィーを少なくとも含む精製スキームであって、任意に、第２のクロマトグラフィー精製工程（例えば、ＡＥＸ、ＡＥＸ／ＨＩＣ、ＣＥＸまたはメンブレンクロマトグラフィー）、ウイルス不活化、ナノろ過、濃縮及び透析ろ過のうちの１つ以上をさらに含むスキームに従って作製した目的タンパク質（抗体または抗体コンストラクトを含む）の宿主細胞タンパク質低減調製物も提供する。このような宿主細胞タンパク質低減調製物は、宿主細胞タンパク質を約９００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約８００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約７００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約６００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約５００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約４５０ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約４００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約３５０ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約３００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約２００ｐｐｍ未満、宿主細胞タンパク質を約２５０ｐｐｍ、宿主細胞タンパク質を約１５０ｐｐｍ未満または宿主細胞タンパク質を約１００ｐｐｍ未満含む。宿主細胞タンパク質の量（例えばｐｐｍ）は、ＥＬＩＳＡ（宿主細胞タンパク質定量ＥＬＩＳＡなど）を含むいずれかの好適なアッセイに従って割り出すことができる。例えば、ＨＣＰのｐｐｍは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定したようなものである。

【0139】

本開示の実施形態は、本開示の洗浄溶液の調製物と、目的タンパク質の精製のために、本開示の洗浄溶液を使用する方法とを詳細に説明する下記の非限定的な実施例を参照することによって、さらに定義できる。本開示の範囲から逸脱することなく、材料と方法の両方に多くの修正を行えることは当業者には明らかであろう。

【実施例】

【0140】

本明細書に記載されている実施例と実施形態は、例示するためのものに過ぎないことと、これらを踏まえた様々な修正または変化が当業者に示されるとともに、それらの修正または変化が、本願の趣旨及び範囲に含まれることになることが分かる。

【0141】

実施例１
材料と方法
材料と器具：これらの実施例で用いるモノクローナル抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて、研究室内で発現させた。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴＳＵＲＥ（登録商標）プロテインＡ樹脂は、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。バッファー溶液はすべて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの水精製システムから得た超純水を用いて調製した。バッファーと溶液調製物で用いた化学物質は、ＪＴＢａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手した。ハイスループットのクロマトグラフィー実験は、ＴｅｃａｎＦｒｅｅｄｏｍＥＶＯ（登録商標）２００という液体処理システム（ＴｅｃａｎＧｒｏｕｐＡＧ，ＭａｎｎｅｄｏｒｆＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。この機器には、組み込まれた樹脂プレートとＡｔｏｌｌのカラムステーションが搭載されており、最大で９６個のクロマトグラフィー条件を並行して調査可能である。ＦＲＥＥＤＯＭＥＶＯＷＡＲＥ（登録商標）というソフトウェア（ＴｅｃａｎＧｒｏｕｐＡＧ，ＭａｎｎｅｄｏｒｆＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をシステムの制御と試料の回収に使用した。ＡｋｔａＡｖａｎｔの液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ハイスループット調査から得られた所定の洗浄溶液をさらに検証した。この機器には、カラムの排出口をモニタリングして、１ランあたり１回、洗浄条件を調査可能にするために、ＵＶ検出器と導電率検出器が組み込まれている。

【0142】

プロテインＡクロマトグラフィー：５Ｃ．Ｖ（カラム体積）において１×ＰＢＳで、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴＳＵＲＥ（登録商標）というクロマトグラフィーカラムを平衡化した。平衡化後、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）をカラムに、樹脂１リットルあたりｍＡｂ４０グラムという充填量で充填した。充填を行った後、カラムの１回目の洗浄を３カラム体積（ＣＶ）の１×ＰＢＳバッファーで行ってから、２回目の洗浄を５ＣＶの洗浄バッファー候補で行った。続いて、５ＣＶの５ｍＭコハク酸（ｐＨ５．８）バッファーを用いて、カラムの３回目の洗浄を行った。５ＣＶの２５ｍＭグリシン、１０ｍＭコハク酸（ｐＨ３．７）バッファーを用いて、ｍＡｂをカラムから溶出した。生成後、定置洗浄を行った。

【0143】

宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の定量ＥＬＩＳＡ：ＣＨＯＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎｓ３ｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎキット（ＩｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃＡｓｓａｙｆｏｒｔｈｅＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＣＨＯＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎｓ、カタログ番号Ｆ５５０、ＣｙｇｎｕｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）をメーカーのプロトコールに従って用いることによって、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を割り出した。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｐｌｕｓというマイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＳｕｎｎｙｖａｌｅＣＡ）で４５０／６５０ｎｍにおける吸光データを取得して、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏ６．４．２というソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で解析した。ＣＨＯＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎｓ３ｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎキットに含まれる標準物質から作成した標準曲線の４つのロジスティック当てはめパラメーターから、ＨＣＰ値を算出した。

【0144】

実施例２
プレートベースの調査の実験結果
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅの樹脂プレートで、ＴＬ１ａ抗体を用いて、合わせて２８個の単一成分条件のＨＣＰクリアランスを調べた。結果は図１に示されており、下記のようにまとめることができる。
・アミノ酸とテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）は、ナトリウムオクタノエート（ＣＡ）と界面活性剤よりも、ＨＣＰの除去に有効である。
・アミノ酸またはＴＭＡＣの濃度が高いほど、ＨＣＰクリアランスが向上する傾向があり、試験した濃度範囲では、ＣＡに関しても同様である。
・試験したすべての化学物質のうち、アルギニンとグアニジンが最も有効である。

【0145】

二成分におけるＨＣＰクリアランスの結果は、図２に示されている。二成分実験においては、洗剤と荷電賦形剤（アルギニン、グアニジン、ヒスチジン、ＴＭＡＣまたはグリシンを含む）を組み合わせて、ＨＣＰの除去における有効性を評価する。結果は、下記のようにまとめることができる。
・２５ｍＭのＣＡを低濃度の荷電賦形剤（５０ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのグアニジンまたは１００ｍＭのヒスチジンのいずれか）に加えると、０．０５％（ｗ／ｖ）のＮＰ４０または０．０５％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を加える場合と比べて、ＨＣＰクリアランスを大幅に向上できる。
・アルギニンまたはグアニジンの濃度が１７５ｍＭを超えると、具体的には、アルギニンを１７５ｍＭ～３００ｍＭの範囲で、グアニジンを１７５ｍＭ～１Ｍの範囲で試験すると、試験した二成分のいずれの組み合わせにおいても、５００ｐｐｍ未満のＨＣＰクリアランスが実現する。

【0146】

三成分のスクリーニングでは、アルギニンと、グアニジンと、洗剤の複合作用を試験し、ＨＣＰクリアランスの結果は、図３に示されている。この結果は、下記のようにまとめることができる。
・低濃度のグアニジンとアルギニン（それぞれ＜１００ｍＭ）を洗剤と組み合わせると、＜５００ｐｐｍのＨＣＰクリアランスを実現可能である。
・２５ｍＭのＣＡを低濃度のアルギニンとグアニジンの組み合わせ（アルギニンとグアニジンはそれぞれ、＜１００ｍＭである）を加えると、０．０５％（ｗ／ｖ）のＮＰ４０または０．０５％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を加える場合よりも、ＨＣＰクリアランスが向上する。
・グアニジンとアルギニンを組み合わせたものの濃度が＞１７５ｍＭであると、ＨＣＰクリアランスは一貫して＜５００ｐｐｍとなる。

【0147】

実施例３
Ａｔｏｌｌカラムから得られた実験結果
１４個の洗浄溶液で、ＨＣＰクリアランスについて、抗Ｔｌ１ａ（ｍＡｂ）において、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴＳＵＲＥ（登録商標）クロマトグラフィー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で調べた。溶出プール中のＨＣＰレベルは、図４に示されている。その結果は、下記のようにまとめることができる。
・アルギニンまたはグアニジンを含まない７つの洗浄溶液のＨＣＰレベルは、１０，０００ｐｐｍ超であった。
・２５０ｍＭのアルギニンを単独で用いると、ＨＣＰクリアランスは約４００～５００ｐｐｍであり、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）と、ＮａＣｌを１５０ｍＭ組み入れると、アルギニン濃度を２００ｍＭまで低下させることができ、ＨＣＰクリアランスも３００～４００ｐｐｍに改善した。アルギニンは高価であるので、この方策にはコストメリットがある。
・０．１％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を２５０ｍＭのアルギニンと、１５０ｍＭのＮａＣｌと組み合わせると、ＨＣＰは、２００～３００ｐｐｍまで低減される。
・グアニジンを１５０ｍＭのＮａＣｌとともに加えると、ＨＣＰクリアランスを５００～６００ｐｐｍまで低減できる。
・２５０ｍＭのアルギニンを２５ｍＭのＣＡと１５０ｍＭのＮａＣｌと組み合わせると、ＨＣＰは、３００ｐｐｍ前後まで低減される。１５０ｍＭのアルギニンを１５０ｍＭのグアニジンと置き換えても、ＨＣＰクリアランスは、３００ｐｐｍ前後のままである。アルギニンはグアニジンよりも高価であるので、この方策にはコストメリットがある。

【0148】

要約すると、下記の組み合わせの４つの溶液では、ＨＣＰクリアランスが単一成分また二成分溶液よりも優れていた。
・アルギニンを２００ｍＭと、トリブチルＰｉを０．０５％（ｗ／ｖ）と、ＮａＣｌを１５０ｍＭ
・アルギニンを２５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ
・アルギニンを１００ｍＭと、グアニジンを１５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ
・ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを２５０ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭ

【0149】

アルギニンを２５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭと、ＮａＣｌを１５０ｍＭという条件に関しては、１５０ｍＭのアルギニンをグアニジンと置き換えても、ＨＣＰクリアランスの効果は同様に有効であるうえに、より安価である。

【0150】

抗Ｔｌ１ａ抗体をモデルとして用いて、アルギニンを２５０ｍＭと、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）と、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む洗浄溶液のＨＣＰクリアランスを複数のｐＨ値でさらに調べた。結果は図５に示されている。ｐＨ６．５～ｐＨ１０．５の範囲では、溶出プール中のＨＣＰのレベルは、１００ｐｐｍ～２００ｐｐｍの範囲で、ｐＨによる有意な影響は観察されなかった。１５０ｍＭのＮａＣｌは、タンパク質のすべての荷電基を遮蔽するのに十分であると考えられる。したがって、ｐＨにいずれかの有意な作用があるようには観察されなかった。すべての組み合わせの溶液は、ＮａＣｌを１５０ｍＭ含み、ｐＨの作用について、さらなる試験は行われていない。

【0151】

抗ＴＬ１ａ抗体、抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）抗体、及びモノクローナル抗ＣＤ３８抗体のＣ末端をインターフェロン分子に融合した融合タンパク質によって、アルギニンと、０．１％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００との組み合わせ、アルギニンと、グアニジンと、ナトリウムオクタノエートとの組み合わせ、及びトリブチルホスフェートの組み合わせを調査した。ＨＣＰクリアランスの結果は、図６に示されている。３つのすべての分子において有効である組み合わせは、下記のとおりである。
・アルギニンを２５０ｍＭと、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）（またはトリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ））
・アルギニンを５０～１００ｍＭと、グアニジンを１００～２５０ｍＭと、ＣＡを２５ｍＭ（好ましくは、アルギニンは＞５０ｍＭ、グアニジンは＞１００ｍＭ）
・グアニジンを３５０ｍＭと、トリブチルホスフェートを０．０５％（ｗ／ｖ）

【0152】

このデータにより、これらの洗浄溶液をプラットフォームプロセスで使用できることが示唆されており、すなわち、これらの洗浄溶液は、いずれの抗体の精製においても有効であることが見込まれる。

【0153】

実施例４
濃縮作用
非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００と、アルギニンと、ＮａＣｌの濃度がＨＣＰクリアランスに及ぼす作用も、抗ＴＬ１ａ、抗ＣＧＲＰ及び抗ＣＤ３８－ＩＦＮ融合分子で調べた。８個の洗浄溶液を調べ、ＨＣＰの結果は、表１にまとめられている。これらのデータでは、３つのすべての分子において、ＨＣＰクリアランスに関して、同様の傾向が見られる。データによって、非イオン性界面活性剤のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００を０．１５％（ｗ／ｖ）と、アルギニンを３００ｍＭと、ＮａＣｌを１００ｍＭの洗浄液によって、ＨＣＰの除去に関して、有意な改善が得られたことが示された。有効なＨＣＰクリアランス作用範囲は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００については０．０５％～０．１５％ｗ／ｖ、アルギニンでは２００～３００ｍＭ、ＮａＣｌでは１００～２００ｍＭである。データにより、これらの洗浄溶液が、いずれの目的ペプチド（例えば抗体）の精製においても有効であり得ることが示唆されている。

【表1】

【表2】

【0154】

実施例５
所定の条件のプロセス検証
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅとＳａｒｔｏｂｉｎｄＱのプロセスを用いた５ｃｍのクロマトグラフィーカラムで、４つのプロセス条件を３つの分子（ＴＬ１ａ、ＣＧＲＰ及びＣＤ－３８）においてさらに調べた。ＨＣＰクリアランスの結果を表３にまとめた。３つのすべての組み合わせの洗浄液条件において、ＨＣＰの除去が、コントロール条件の１ＭＮａＣｌよりもかなり改善した。プロテインＡ及びＳａｒｔｏｂｉｎｄＱの工程後の残存ＨＣＰは少なく、臨床用途の要件を満たしている（ＨＣＰ＜１００ｐｐｍ）。

【表3】

【0155】

実施例６
ウイルスクリアランスの結果
７つの所定の洗浄溶液のウイルスクリアランスをインビトロでのウイルス様粒子クリアランスで調べ、その結果は、表４Ａにまとめられている。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００は、インビトロでのＶＬＰクリアランスの有効性が高いことが観察された。

【表4A】

【0156】

追加の洗浄溶液（表４Ｂにまとめられている）を用いた調査により、Ｔｒｉｔｏｎが、レトロウイルス様粒子のクリアランスを大幅に改善できることが示された。

【表4B】

【0157】

さらに、異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕｌＶ）とマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）という２つのモデルウイルスを用いて、スパイクインによる調査によって、所定の洗浄溶液によるウイルスクリアランスを評価した。その組成物と結果は、表５及び６に示されている。結果により、ｐＨ５．８の５ｍＭコハク酸のコントロール洗浄溶液と比べて、Ｘ－ＭｕｌＶクリアランスが１．７ｌｏｇ（アルギニン）または０．８ｌｏｇ（アルギニン＋グアニジン）上昇し、ＭＶＭクリアランスは１．０ｌｏｇ（アルギニン＋トリブチルホスフェート）、１．３ｌｏｇ（アルギニン）または（アルギニン＋グアニジン）上昇したことが示されている。

【表5】