特許 7187486 ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４二重インヒビターペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-02

(45)【発行日】2022-12-12

(54)【発明の名称】ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４二重インヒビターペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20221205BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20221205BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20221205BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20221205BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20221205BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20221205BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20221205BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20221205BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20221205BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20221205BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221205BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221205BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20221205BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20221205BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221205BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20221205BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221205BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20221205BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

A61K35/17 A

A61K35/768

A61K38/08

A61K38/10

A61K38/16

A61P1/16

A61P17/00

A61P31/00

A61P33/06

A61P35/00

A61P37/04

C07K7/08 ZNA

C07K14/00

C12N5/10

C12N7/01

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2019564464

(86)(22)【出願日】2018-05-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-07-27

(86)【国際出願番号】 US2018034625

(87)【国際公開番号】W WO2018218137

(87)【国際公開日】2018-11-29

【審査請求日】2021-03-30

(31)【優先権主張番号】62/510,900

(32)【優先日】2017-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519091317

【氏名又は名称】レイドス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】グティエレス， ガブリエル エム．

(72)【発明者】

【氏名】コトライア， ヴィナヤカ

(72)【発明者】

【氏名】ファレス， ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】パヌッチ， ジェイムズ

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／２０９８０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００７１４０３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ａ６１Ｋ ３５／１７

Ａ６１Ｋ ３５／７６８

Ａ６１Ｋ ３８／０８

Ａ６１Ｋ ３８／１０

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ａ６１Ｐ ３３／０６

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０４

Ｃ０７Ｋ ７／０８

Ｃ０７Ｋ １４／００

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｎ １５／８６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＬＤ０１（配列番号１）、ＬＤ１１（配列番号５）、ＬＤ１０（配列番号１２）、ＬＤ１０ Ｒ９Ａ（配列番号１５）、ＬＤ１０ Ｐ１５Ａ（配列番号１７）、ＬＤ１７（配列番号２１）、ＬＤ１７ｍ（配列番号２２）、ＬＤ１０ｄａ（配列番号２４）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ａａ（配列番号２９）、ペプチドＬＤ０１（ｕ）（配列番号３６）、ペプチドＬＤ１７ｍ（ｕ）（配列番号３７）、およびペプチドＬＤ０１ ＴＱ１９（ｕ）（配列番号３８）からなる群より選択されるか；または
（ｂ）ＬＤ０１（配列番号１）、ＬＤ１１（配列番号５）、ＬＤ１０（配列番号１２）、ＬＤ１０ Ｒ９Ａ（配列番号１５）、ＬＤ１０ Ｐ１５Ａ（配列番号１７）、ＬＤ１７（配列番号２１）、ＬＤ１７ｍ（配列番号２２）、ＬＤ１０ｄａ（配列番号２４）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ａａ（配列番号２９）、およびＬＤ０４（配列番号７）、ＬＤ４０（配列番号８）、およびＬＤ０１ｒ（配列番号１１）、ペプチドａ（配列番号３６）、ペプチドＬＤ１７ｍ（ｕ）（配列番号３７）、およびペプチドＬＤ０１ ＴＱ１９（ｕ）（配列番号３８）からなる群より選択され、ここで該ペプチドは、Ｃ末端アミド化、Ｎ末端アセチル化、および１個のＬ－アミノ酸の、その相当するＤ－アミノ酸による置き換えからなる群より選択される１またはこれより多くの改変を含むか；あるいは
（ｃ）ＬＤ０１（配列番号ｌ）、ＬＤ１１（配列番号５）、ＬＤ１０（配列番号１２）、ＬＤ１０ Ｒ９Ａ（配列番号１５）、ＬＤ１０ Ｐ１５Ａ（配列番号１７）、ＬＤ１７（配列番号２１）、ＬＤ１７ｍ（配列番号２２）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ａａ（配列番号２９）、ＬＤ０４（配列番号７）、ＬＤ４０（配列番号８）、およびＬＤ０１ｒ（配列番号１１）、ペプチドＬＤ０１（ｕ）（配列番号３６）、ペプチドＬＤ１７ｍ（ｕ）（配列番号３７）、およびペプチドＬＤ０１ ＴＱ１９（ｕ）（配列番号３８）からなる群より選択され、ここでそのＮ末端アミノ酸は、Ｄアミノ酸である、
ペプチドであって、
ここで前記ペプチドが、（ｉ）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合、および、（ｉｉ）ＣＤ８６のＣＴＬＡ－４への結合を阻害する、ペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のペプチド、ＬＤ０４、ＬＤ４０、およびＬＤ０１ｒからなる群より選択されるペプチドをコードするヌクレオチドを含む、発現構築物。

【請求項3】

ＣＡＲ－Ｔ細胞または腫瘍溶解性ウイルスに存在する、請求項２に記載の発現構築物。

【請求項4】

（ａ）以下からなる群より選択される活性薬剤：
（ｉ）請求項１に記載のペプチド、ＬＤ０４、ＬＤ４０、およびＬＤ０１ｒからなる群より選択されるペプチド；
（ｉｉ）該ペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）該ペプチドを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞；および
（ｉｖ）該ペプチドを発現する腫瘍溶解性ウイルス；ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。

【請求項5】

前記活性薬剤は核酸であり、該核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、およびＲＮＡからなる群より選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記核酸はＲＮＡである、請求項５に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記ＲＮＡは、（ｉ）リボース糖の改変、（ｉｉ）リン酸結合の改変、および（ｉｉｉ）塩基の改変からなる群より選択される改変を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記改変は、リボ－ジフルオロトルイルヌクレオチド、４’－チオ改変ＲＮＡ、ボラノリン酸結合、ホスホロチオエート結合、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）糖置換、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）糖置換、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびＬ－ＲＮＡからなる群より選択される、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記活性薬剤は前記ペプチドであり、該ペプチドは、微粒子、ポリマーナノ粒子、リポソーム、固体脂質ナノ粒子、親水性粘膜付着性ポリマー、チオール化ポリマー、ポリマーマトリクス、ナノエマルジョン、およびヒドロゲルからなる群より選択されるペプチドキャリアシステムとともに提供される、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

過剰増殖性障害の進行を阻害する、感染性疾患を処置する、ワクチン接種への応答を増強する、敗血症を処置する、毛の再着色を促進する、または色素沈着した皮膚病変の美白を促進するための、請求項４～９のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記過剰増殖性障害の進行を阻害するために投与される、請求項１０に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記過剰増殖性障害はがんである、請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記がんは黒色腫である、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

第２の治療剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１０～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記第２の治療剤は、以下：
（ｉ）がんワクチン；
（ｉｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞；
（ｉｉｉ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、キラー免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ）、インドールアミン（２，３）－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ａ２Ａアデノシンレセプター（Ａ２ＡＲ）からなる群より選択される分子の活性を低減または遮断する治療剤；
（ｉｖ）サイトカイン；
（ｖ）ＣＤ４０、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、および誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される分子のアゴニスト；
（ｖｉ）腫瘍溶解性ウイルス；ならびに
（ｖｉｉ）４－１ＢＢアゴニスト、４－１ＢＢアンタゴニスト、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のインヒビター、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のインヒビター、およびＶＥＧＦＲのインヒビターからなる群より選択される治療剤、
からなる群より選択される、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記薬学的組成物は、感染性疾患を処置するために、または該感染性疾患に対するワクチンへのワクチンアジュバントとして投与される、請求項１０に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

前記感染性疾患は、マラリアまたはＢ型肝炎である、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

前記薬学的組成物は、敗血症を処置するために投与される、請求項１０に記載の薬学的組成物。

【請求項19】

前記薬学的組成物は、毛の再着色を促進するかまたは色素沈着した皮膚病変の美白を促進するために投与される、請求項１０に記載の薬学的組成物。

【請求項20】

過剰増殖性障害の進行を阻害する、感染性疾患を処置する、ワクチン接種への応答を増強する、敗血症を処置する、毛の再着色を促進する、または色素沈着した皮膚病変の美白を促進するための医薬の製造における、請求項４～９のいずれかに記載の組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、米国仮特許出願第６２／５１０，９００号（２０１７年５月２５日出願）の優先権を主張し、これを参考として援用する。

【0002】

本出願は、２０１８年５月２５日に作成し、「０００４７９００２５８ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の、本出願の配列表である、提出された９．９７ｋｂのテキストの内容を参考として援用する。

【0003】

本開示で引用される各科学文献、特許、および公開特許出願は、その全体において本明細書に参考として援用される。

【0004】

技術分野
本開示は一般に、免疫調節性ペプチドに関する。

【背景技術】

【0005】

背景
Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１（ＰＤ－１）およびそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）は、広く発現され、Ｔ細胞活性化において多くの免疫調節の役割（腫瘍細胞および感染性因子に対する免疫を弱めることを含む）を発揮する。ＰＤ－１は、従って、種々の治療適用にとって魅力的な標的である。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）は、Ｔ細胞に対して負のシグナルを提供し、同様に魅力的な治療標的である。免疫チェックポイント経路の有用な調節因子が継続して必要である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ＬＤ０１（配列番号１）、ＬＤ１１（配列番号５）、ＬＤ１０（配列番号１２）、ＬＤ１０ Ｒ９Ａ（配列番号１５）、ＬＤ１０ Ｐ１５Ａ（配列番号１７）、ＬＤ１７（配列番号２１）、ＬＤ１７ｍ（配列番号２２）、ＬＤ１０ｄａ（配列番号２４）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ａａ（配列番号２９）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ｄａ（配列番号３０）、ペプチドＬＤ０１（ｕ）（配列番号３６）、ペプチドＬＤ１７ｍ（ｕ）（配列番号３７）、およびペプチドＬＤ０１ ＴＱ１９（ｕ）（配列番号３８）からなる群より選択されるか；または
（ｂ）ＬＤ０１（配列番号１）、ＬＤ１１（配列番号５）、ＬＤ１０（配列番号１２）、ＬＤ１０ Ｒ９Ａ（配列番号１５）、ＬＤ１０ Ｐ１５Ａ（配列番号１７）、ＬＤ１７（配列番号２１）、ＬＤ１７ｍ（配列番号２２）、ＬＤ１０ｄａ（配列番号２４）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ａａ（配列番号２９）、およびＬＤ０１ ＴＱ１９ ｄａ（配列番号３０）、ＬＤ０４（配列番号７）、ＬＤ４０（配列番号８）、およびＬＤ０１ｒ（配列番号１１）、ペプチドａ（配列番号３６）、ペプチドＬＤ１７ｍ（ｕ）（配列番号３７）、およびペプチドＬＤ０１ ＴＱ１９（ｕ）（配列番号３８）からなる群より選択され、ここで該ペプチドは、Ｃ末端アミド化、Ｎ末端アセチル化、および少なくとも１個のＬ－アミノ酸の、その相当するＤ－アミノ酸による置き換えからなる群より選択される１またはこれより多くの改変を含むか；あるいは
（ｃ）ＬＤ０１（配列番号ｌ）、ＬＤ１１（配列番号５）、ＬＤ１０（配列番号１２）、ＬＤ１０ Ｒ９Ａ（配列番号１５）、ＬＤ１０ Ｐ１５Ａ（配列番号１７）、ＬＤ１７（配列番号２１）、ＬＤ１７ｍ（配列番号２２）、ＬＤ０１ ＴＱ１９ ａａ（配列番号２９）、ＬＤ０４（配列番号７）、ＬＤ４０（配列番号８）、およびＬＤ０１ｒ（配列番号１１）、ペプチドＬＤ０１（ｕ）（配列番号３６）、ペプチドＬＤ１７ｍ（ｕ）（配列番号３７）、およびペプチドＬＤ０１ ＴＱ１９（ｕ）（配列番号３８）からなる群より選択され、ここでそのＮ末端アミノ酸は、Ｄアミノ酸である、
ペプチド。
（項目２）
項目１に記載のペプチド、ＬＤ０４、ＬＤ４０、およびＬＤ０１ｒからなる群より選択されるペプチドをコードする、発現構築物。
（項目３）
ＣＡＲ－Ｔ細胞または腫瘍溶解性ウイルスに存在する、項目２に記載の発現構築物。
（項目４）
（ａ）以下からなる群より選択される活性薬剤：
（ｉ）項目１に記載のペプチド、ＬＤ０４、ＬＤ４０、およびＬＤ０１ｒからなる群より選択されるペプチド；
（ｉｉ）該ペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）該ペプチドを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞；および
（ｉｖ）該ペプチドを発現する腫瘍溶解性ウイルス；ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。
（項目５）
前記活性薬剤は核酸であり、該核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、およびＲＮＡからなる群より選択される、項目４に記載の薬学的組成物。
（項目６）
前記核酸はＲＮＡである、項目５に記載の薬学的組成物。
（項目７）
前記ＲＮＡは、（ｉ）リボース糖の改変、（ｉｉ）リン酸結合の改変、および（ｉｉｉ）塩基の改変からなる群より選択される改変を含む、項目６に記載の薬学的組成物。
（項目８）
前記改変は、リボ－ジフルオロトルイルヌクレオチド、４’－チオ改変ＲＮＡ、ボラノリン酸結合、ホスホロチオエート結合、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）糖置換、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）糖置換、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびＬ－ＲＮＡからなる群より選択される、項目７に記載の薬学的組成物。
（項目９）
前記活性薬剤は前記ペプチドであり、該ペプチドは、微粒子、ポリマーナノ粒子、リポソーム、固体脂質ナノ粒子、親水性粘膜付着性ポリマー、チオール化ポリマー、ポリマーマトリクス、ナノエマルジョン、およびヒドロゲルからなる群より選択されるペプチドキャリアシステムとともに提供される、項目４に記載の薬学的組成物。
（項目１０）
過剰増殖性障害の進行を阻害する、感染性疾患を処置する、ワクチン接種への応答を増強する、敗血症を処置する、毛の再着色を促進する、または色素沈着した皮膚病変の美白を促進するための方法であって、該方法は、それを必要とする個体に、有効量の、項目４～９のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを包含する方法。
（項目１１）
前記薬学的組成物は、前記過剰増殖性障害の進行を阻害するために投与される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記過剰増殖性障害はがんである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記がんは黒色腫である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記患者に第２の治療を投与することをさらに包含する、項目１０～１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記第２の治療は、以下：
（ｉ）がんワクチン；
（ｉｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ） Ｔ細胞療法；
（ｉｉｉ）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、キラー免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ）、インドールアミン（２，３）－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ａ２Ａアデノシンレセプター（Ａ２ＡＲ）からなる群より選択される分子の活性を低減または遮断することを含む治療；
（ｉｖ）サイトカイン；
（ｖ）ＣＤ４０、ＯＸ４０、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、および誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）からなる群より選択される分子のアゴニスト；
（ｖｉ）腫瘍溶解性ウイルス；ならびに
（ｖｉｉ）４－１ＢＢアゴニスト、４－１ＢＢアンタゴニスト、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のインヒビター、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のインヒビター、およびＶＥＧＦＲのインヒビターからなる群より選択される治療剤、
からなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記薬学的組成物は、感染性疾患を処置するために、または該感染性疾患に対するワクチンへのワクチンアジュバントとして投与される、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記感染性疾患は、マラリアまたはＢ型肝炎である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記少なくとも１つのペプチドは、敗血症を処置するために投与される、項目１０に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも１つのペプチドは、毛の再着色を促進するかまたは色素沈着した皮膚病変の美白を促進するために投与される、項目１０に記載の方法。
（項目２０）
過剰増殖性障害の進行を阻害する、感染性疾患を処置する、ワクチン接種への応答を増強する、敗血症を処置する、毛の再着色を促進する、または色素沈着した皮膚病変の美白を促進することにおける使用のための、項目４～９のいずれかに記載の組成物。
（項目２１）
過剰増殖性障害の進行を阻害する、感染性疾患を処置する、ワクチン接種への応答を増強する、敗血症を処置する、毛の再着色を促進する、または色素沈着した皮膚病変の美白を促進するための医薬の製造における、項目４～９のいずれかに記載の組成物の使用。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１は、ヒトＰＤ－１に結合するペプチドＬＤ０１の単一濃度ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）データを提供するグラフである。

【0007】

【図2】図２は、マウスＰＤ－１に結合するペプチドＬＤ０１の単一濃度ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）データを提供するグラフである。

【0008】

【図3】図３は、マウスＰＤ－１に結合するペプチドＬＤ０１の反応速度論を示すグラフである。

【0009】

【図4AB】図４Ａ～Ｃは、細胞表面に発現されたヒトＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合に対するペプチドの効果を示すグラフである。図４Ａ， 低濃度範囲のペプチドＬＤ０１。図４Ｂ， 高濃度範囲のペプチドＬＤ０１。図４Ｃ， ペプチドＬＤ０１。

【図4C】同上。

【0010】

【図5】図５は、無細胞アッセイにおいてＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合に対するペプチドＬＤ０１の効果を示すグラフである。

【0011】

【図6】図６は、抗ＣＤ３抗体濃度の関数として脾細胞増殖を示すグラフである。

【0012】

【図7】図７は、ペプチドＬＤ０１が、外因的に添加したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質の存在下および非存在下で抗ＣＤ３刺激脾細胞増殖の増殖を増強することを示すグラフである。

【0013】

【図8】図８は、マウス黒色腫モデルにおいて肺腫瘍結節の数に対するペプチドＬＤ０１の効果を示すグラフである。^＊ｐ＜０．０５。

【0014】

【図9】図９は、マウス黒色腫モデルにおいてペプチドＬＤ０１による肺腫瘍結節の％減少を示すグラフである。

【0015】

【図10】図１０は、実施例５に記載されるとおりのマウス黒色腫モデルにおいて肺腫瘍結節に対するペプチドＬＤ０１の効果を比較する。左（コホート４）、２００μｇ ペプチドＬＤ０１で処置。右（コホート１）、処置なし。

【0016】

【図11】図１１は、マウス黒色腫モデルにおいて肺腫瘍結節の数に対するペプチドＬＤ１２、ＬＤ０１、ＬＤ１０ｄａ、およびＬＤ１６ｄａの効果を示すグラフである。^＊ｐ＜０．０５。

【0017】

【図12】図１２は、マラリアワクチンの免疫原性に対するペプチドＬＤ０１の効果を示すグラフである（実施例６）。

【0018】

【図13】図１３は、マラリアワクチンの免疫原性に対するペプチドＬＤ１２、ＬＤ０１、ＬＤ１０ｄａ、およびＬＤ１６ｄａの効果を示すグラフである（実施例６）。

【0019】

【図14】図１４は、マウス敗血症モデルにおいて２×１０^５ 脾細胞あたりのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数に対するペプチドＬＤ０１の効果を示すグラフである。

【0020】

【図15】図１５は、ペプチドＬＤ０１が、ぶどう球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）単独と比較してヒトＰＢＭＣによってＩＦＮγ分泌を４倍増加させることを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

詳細な説明
本開示は、チェックポイントレセプター「ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １」（ＰＤ－１）とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断し、ＣＴＬＡ－４へのＣＤ８６の結合をも遮断するペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、開示されるペプチドは、その安定性または他の薬物動態特性を増強するために、化学的方法または組換え方法を使用して改変される。例えば、ＵＳ ２０１７／００２０９５６を参照のこと。改変としては、１またはこれより多くのＬ－アミノ酸をその相当するＤ型で置き換えること、Ｃ末端および／またはＮ末端残基に対するアセチル化、Ｃ末端および／またはＮ末端残基に対するアミド化、環化、エステル化、グリコシル化、アシル化、ミリスチン酸もしくはパルミチン酸の結合、Ｎ末端グリシンの付加、親油性部分（例えば、長い脂肪酸鎖）の付加、およびＰＥＧ化が挙げられるが、これらに限定されない。

【0022】

ペプチドおよびその改変されたバージョンの非限定的な例は、以下の表に含まれる。その中で、「ＮＨ_２」は、Ｃ末端アミド化を示し、「ＣＨ_３ＣＯ」は、Ｎ末端アセチル化を示し、小文字は、そのアミノ酸のＤ型を示す。

【化1】

【0023】

ペプチドは、当該分野で公知の任意の方法（合成法、組換え法、または両方を含む）によって作製され得る。合成法としては、固相法または液相法が挙げられ、保護基の使用を含み得る。例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９７６）、ＭｃＯｍｉｅ（１９７３）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９７６）、Ｓｔｕａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ（１９８４）を参照のこと。

【0024】

ペプチドの組換え生成は、任意の適切な発現系においてそのペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列（複数可）を使用して行われ得る。その開示されるペプチドのうちの１またはこれより多くをコードする核酸分子は、そのコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む発現カセットへと組み込まれ得る。制御エレメントとしては、イニシエーター、プロモーター（誘導性、抑制性、および構成性のプロモーターを含む）、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。シグナル配列は含まれ得る。その発現カセットは、そのペプチド（複数可）の生成に適切な宿主細胞へと導入され得るベクターの中に提供され得る。発現カセットおよび発現ベクターを構築するための方法は、周知である。発現ベクターは、１またはこれより多くのペプチド（配列番号５、７、８、１１、１２、１５、１７、３６、３７、３８、または３９を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる）をコードする１またはこれより多くの発現カセットを含み得る。

【0025】

いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのペプチドは、融合タンパク質の成分として発現される。その融合タンパク質の他の成分は、例えば、サイトカインまたは操作されたＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり得る。融合タンパク質は、その成分の間に１またはこれより多くのリンカーを含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチドとその融合タンパク質の別の成分との間のリンカーは、その融合タンパク質の発現後にそのペプチドを放出するためのタンパク質分解切断部位を含み得る。例えば、ＵＳ ２０１６／０１３８０６６；ＵＳ ２０１８／０１３５０６０；ＵＳ ２０１４／０３４３２５１；ＵＳ ２０１２／０１４２８９１；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４を参照のこと。

【0026】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質の成分は、そのペプチドの血漿半減期を増強し得る部分（例えば、アルブミンまたはトランスサイレチン）である。他の実施形態において、ペプチドまたはペプチドの改変されたバージョンは、その部分に結合体化される。このような結合体（conjugate）を調製するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｐｅｎｃｈａｌａ ｅｔ ａｌ， ２０１５； Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， ２０１６； Ｚｏｒｚｉ ｅｔ ａｌ， ２０１７）。

【0027】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質の成分は、パートナー分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質（ペプチドもしくは改変されたペプチドの半減期をインビボで増加させる、および／または標的組織もしくは細胞への特異的送達を提供することが意図された抗体））である。あるいは、ペプチドまたはその改変されたバージョンは、そのパートナー分子へと結合体化され得る。結合体化は、直接であり得るか、またはリンカーを介するものであり得る。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ペプチドまたはその改変されたバージョンは、１またはこれより多くのアミノ酸を、パートナー分子に結合させるために使用されるアミノ酸（例えば、リジン）で置換するために、またはそのペプチドを、例えば、１個、２個、３個、もしくは４個のグリシンスペーサー分子でＮ末端伸長することによって、変化させ得る。

【0028】

本開示はまた、その開示されるペプチドのうちの１またはこれより多くを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための方法は、例えば、米国特許第９，３２８，１５６号；米国特許第９，８４５，３６２号；および米国特許第９，１０１，５８４号に開示される。

【0029】

本開示はまた、その開示されるペプチドのうちの１またはこれより多くをコードする核酸分子を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ＵＳ ２０１７／０１５７１８８； Ｌａｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１７； ＵＳ ２０１５／０２５０８３７を参照のこと。腫瘍溶解性ウイルスとしては、レオウイルス、セネカバレーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、モルビリウイルス属のウイルス（ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0030】

腫瘍溶解性レオウイルスの例としては、ＲＥＯＬＹＳＩＮ（登録商標）（ｐｅｌａｒｅｏｒｅｐ）およびＵＳ ２０１７／００４９８２９で開示されるレオウイルスが挙げられる。

【0031】

腫瘍溶解性セネカバレーウイルスの例としては、ＮＴＸ－１０１（Ｒｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）が挙げられる。

【0032】

腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルスの例は、Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００；およびＳｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３で開示される。

【0033】

腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルスの例としては、７３－Ｔ ＰＶ７０１株およびＨＤＶ－ＨＵＪ株（Ｐｈｕａｎｇｓａｂ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７； およびＦｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６もまた参照のこと）が挙げられる。

【0034】

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスの例としては、ＮＶ１０２０（Ｇｅｅｖａｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）およびＴ－ＶＥＣ（Ａｎｄｔｂａｃｋａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）が挙げられる。

【0035】

腫瘍溶解性モルビリウイルス属のウイルスの例としては、腫瘍溶解性麻疹ウイルス（例えば、ＭＶ－Ｅｄｍ（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．， ２００６）およびＨＭＷＭＡＡ（Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）が挙げられる。

【0036】

腫瘍溶解性レトロウイルスの例は、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１２で開示される。

【0037】

腫瘍溶解性インフルエンザウイルスの例は、例えば、ＵＳ ２０１８／００５７５９４で開示される。

【0038】

腫瘍溶解性シンドビスウイルスの例は、例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ， ２０１７で開示される。

【0039】

腫瘍溶解性ポックスウイルスの例は、例えば、Ｃｈａｎ ＆ ＭｃＦａｄｄｅｎ， ２０１４で開示される。

【0040】

腫瘍溶解性アデノウイルスの例としては、ＯＮＹＸ－０１５（Ｋｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００）およびＨ１０１またはＯｎｃｏｒｉｎｅ（Ｌｉａｎｇ， ２０１８）が挙げられる。

【0041】

治療的使用
本明細書で開示されるペプチドおよびその改変されたバージョンは、多くの治療的適用（過剰増殖性障害（がんを含む）を処置する、感染性疾患を処置する、ワクチン接種への応答を増強する、敗血症を処置する、毛の再着色を促進する、および色素沈着した皮膚病変の美白を促進することが挙げられる）を有する。「処置する」とは、本明細書で使用される場合、ペプチドまたはその改変されたバージョンが投与される状態の１またはこれより多くの症状の進行を低減するかまたは阻害することを含む。

【0042】

「投与する」とは、本明細書で使用される場合、開示されるペプチドまたはその改変されたバージョンの直接的投与、および間接的投与を含む。

【0043】

いくつかの実施形態において、その開示されるペプチドおよび／またはその改変されたバージョンのうちの１またはこれより多くは、直接投与される。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、ペプチドキャリアシステムが使用される。多くのペプチドキャリアシステムが当該分野で公知である（微粒子、ポリマーナノ粒子、リポソーム、固体脂質ナノ粒子、親水性粘膜付着性ポリマー、チオール化ポリマー、ポリマーマトリクス、ナノエマルジョン、およびヒドロゲルが挙げられる）。Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｂｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ｆｅｒｉｄｏｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）を参照のこと。任意の適切なシステムが使用され得る。

【0044】

いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの開示されるペプチドを発現および分泌する操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞レセプターと抗原との結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）の部位においてＰＤ－１阻害を果たすために使用され得る。そのＴ細胞ベースの治療は、例えば、その開示されるペプチドのうちの１またはこれより多くを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞であり得る。誘導性または構成性のいずれかの発現が使用され得る。

【0045】

いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、上記開示されるペプチドのうちの１またはこれより多くを送達するために使用され得る。誘導性または構成性のいずれかの発現が使用され得る。

【0046】

他の実施形態において、上記開示されるペプチドのうちの１またはこれより多くは、そのペプチド（複数可）をコードする１またはこれより多くの核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせ）を使用して送達される；例えば、ＵＳ ２０１７／０１６５３３５を参照のこと。１またはこれより多くのペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の種々の送達システムを使用して送達され得る。核酸送達システムとしては、遺伝子銃；カチオン性脂質およびカチオン性ポリマー；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中の被包；エレクトロポレーション；ウイルスベースのおよび細菌ベースの送達システムが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベースのシステムとしては、改変されたウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または１もしくはこれより多くのウイルスのエレメントを含むハイブリッドウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ＵＳ ２００２／０１１１３２３は、ペプチドを投与するために、「裸のＤＮＡ」、すなわち、「トランスフェクション促進タンパク質、ウイルス粒子、リポソーム製剤、荷電した脂質およびリン酸カルシウム沈殿剤」を含まない「非感染性、非免疫原性、非組み込みＤＮＡ配列」の使用を記載する。細菌ベースの送達システムは、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）で開示される。

【0047】

いくつかの実施形態において、ペプチドは、そのペプチドをコードするＲＮＡ分子を介して投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＮＡ分子は、ナノ粒子中に被包される。いくつかの実施形態において、そのナノ粒子は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、ポリエチレンイミン、キトサン、ポリ（β－アミノエステル）を含む。いくつかの実施形態において、そのナノ粒子は、カチオン性脂質またはイオン化可能な脂質を含む。いくつかの実施形態において、そのＲＮＡ分子は、生体活性リガンド（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、コレステロール、ビタミンＥ、抗体、細胞透過性ペプチド）に結合体化される。例えば、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００９）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｂｅｈｒ（１９９７）、Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｄｅｓｉｇａｕｘ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｄｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、Ｆｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｋａｃｚｍａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ｋａｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、Ｋｏｚｉｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ｌｅｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ｌｙｎｎ ＆ Ｌａｎｇｅｒ（２０００）、Ｍｏｓｃｈｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｎｉｓｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｒｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００９）、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６）を参照のこと。

【0048】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、免疫系によるその分解の機会または認識を低減するために改変され得る。リボース糖、リン酸結合、および／または個々の塩基は、改変され得る。例えば、Ｂｅｈｌｋｅ（２００８）、Ｂｒａｍｓｅｎ（２００９）、Ｃｈｉｕ（２００３）、Ｊｕｄｇｅ ＆ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ（２００８）、Ｋａｕｆｆｍａｎ（２０１６）、Ｌｉ（２０１６）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ（２００５）、Ｐｒａｋａｓｈ（２００５）、Ｐｒａｔｔ ＆ ＭａｃＲａｅ（２００９）、Ｓａｈｉｎ（２０１４）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ（２００４）、Ｗｉｔｔｒｕｐ ＆ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（２０１５）を参照のこと。いくつかの実施形態において、その改変は、リボ－ジフルオロトルイルヌクレオチド、４’－チオ改変ＲＮＡ、ボラノリン酸結合、ホスホロチオエート結合、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）糖置換、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）糖置換、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびＬ－ＲＮＡのうちの１またはこれより多くである。

【0049】

いくつかの実施形態において、投与は、１またはこれより多くの他の治療とともに行われる。「とともに（ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」は、その１またはこれより多くの他の治療の投与と一緒の、その投与の前の、またはその投与の後の、投与を含む。

【0050】

薬学的組成物、投与経路、およびデバイス
１またはこれより多くのペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルス（上記で考察されるとおり）は、代表的には、薬学的に受容可能なビヒクルを含む薬学的組成物において投与される。「薬学的に受容可能なビヒクル」は、そのペプチドまたはその改変されたバージョンの生物学的活性に影響を及ぼさず、患者に投与される場合、有害反応を引き起こさない１またはこれより多くの物質を含み得る。薬学的組成物は、液体であってもよいし、凍結乾燥されていてもよい。凍結乾燥された組成物は、適切な液体（代表的には、その組成物を再構成するにあたって使用するための注射用水（ＷＦＩ））とともにキットの中に提供され得る。薬学的組成物の他の適切な形態としては、懸濁剤、エマルジョン、および錠剤が挙げられる。

【0051】

薬学的組成物は、任意の適切な経路によって投与され得る（静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、硬膜外、腫瘍内、経皮（例えば、ＵＳ ２０１７／０２８１６７２）、粘膜（例えば、鼻内または口腔）、肺、および局所（例えば、ＵＳ ２０１７／０２７４０１０）の経路が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、ＵＳ ２０１７／０１０１４７４を参照のこと。

【0052】

投与は、全身性または局所であり得る。局所の注入および注射に加えて、埋込物（ｉｍｐｌａｎｔ）が局所投与を達成するために使用され得る。適切な材料の例としては、シラスティック膜（ｓｉａｌａｓｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ポリマー、線維性マトリクス、およびコラーゲンマトリクスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0053】

局所投与は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、経皮パッチ（例えば、マイクロニードルパッチ）、または当該分野で周知の他の適切な形態によるものであり得る。

【0054】

投与はまた、制御放出によるもの、例えば、マイクロニードルパッチ、ポンプおよび／または適切なポリマー材料を使用するものであり得る。適切な材料の例としては、ポリ（メタクリル酸２－ヒドロキシエチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちのいずれかを含むデバイスとしては、シリンジ、ポンプ、経皮パッチ、スプレーデバイス、膣リング、およびペッサリーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

過剰増殖性障害（がんを含む）の処置
いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、過剰増殖性障害（がんを含む）の進行を阻害するために患者に投与される。このような阻害としては、例えば、新生物または前新生物細胞の増殖を低減すること；新生物または前新生物細胞を破壊すること；および腫瘍の転移を阻害することまたは腫瘍のサイズを減少させることが挙げられ得る。

【0057】

がんの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：黒色腫（皮膚または眼内の悪性黒色腫を含む）、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部のがん、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、慢性もしくは急性の白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、リンパ球性リンパ腫が挙げられる）、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸の腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、およびＴ細胞リンパ腫。

【0058】

がん併用療法
いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、１またはこれより多くの他のがん治療または免疫療法（例えば、以下で記載されるもの）とともに投与される。

【0059】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、ＰＤ－１の活性を低減または遮断するか（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ）またはＣＴＬＡ－４の活性を低減または遮断する（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）第２の薬剤を含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、ＰＤ－Ｌ１の活性を低減または遮断する薬剤（例えば、アテゾリズマブ）を含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、他の阻害性チェックポイント分子および／または免疫系を抑制する分子の活性を低減または遮断する薬剤を含む。これらの分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
１．リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｔｒｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０を参照のこと）；
２．Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＶＩＳＴＡ（ｃ１０ｏｒｆ５４、ＰＤ－１Ｈ、ＤＤ１α、Ｇｉ２４、Ｄｉｅｓ１、およびＳＩＳＰ１としても公知）；ＵＳ ２０１７／０３３４９９０、ＵＳ ２０１７／０１１２９２９、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ， ２０１５を参照のこと）；
３．Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ３）（ＴＩＭ－３；ＵＳ ２０１７／０１９８０４１、ＵＳ ２０１７／００２９４８５、ＵＳ ２０１４／０３４８８４２、Ｓａｋｕｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ２０１０を参照のこと）；
４．キラー免疫グロブリン様レセプター（ＫＩＲ；ＵＳ ２０１５／０２９０３１６を参照のこと）；
５．インドールアミン（２，３）－ジオキシゲナーゼを阻害する薬剤（ＩＤＯ；Ｍｅｌｌｅｍｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ， ２０１７を参照のこと）；
６．ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（Ｂ ａｎｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）（ＢＴＬＡ；ＵＳ ２０１６／０９２２２１１４を参照のこと）；ならびに
７．Ａ２Ａアデノシンレセプター（Ａ２ＡＲ；Ｂｅａｖｉｓ ｅｔ ａｌ， ２０１５；ＵＳ ２０１３／０２６７５１５；ＵＳ ２０１７／０１６６８７８；Ｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ， ２０１５；Ｍｅｄｉａｖｉｌｌａ－Ｖａｒｅｌａ ｅｔ ａｌ， ２０１７；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ， ２０１６を参照のこと）。

【0062】

ＬＡＧ－３の活性を低減または遮断する薬剤としては、ＢＭＳ－９８６０１６、ＩＭＰ３２１、およびＧＳＫ２８３１７８１（Ｈｅ ｅｔ ａｌ， ２０１６）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

ＶＩＳＴＡの活性を低減または遮断する薬剤としては、低分子（例えば、ＣＡ－１７０）および抗体（例えば、Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ， ２０１４）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0064】

ＴＩΜ－３の活性を低減または遮断する薬剤としては、抗体（例えば、ＭＢＧ４５３およびＴＳＲ－０２２；Ｄｅｍｐｋｅ ｅｔ ａｌ， ２０１７を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

ＫＩＲの活性を低減または遮断する薬剤としては、モノクローナル抗体（例えば、ＩＰＨ２１０１およびリリルマブ（ＢＭＳ－９８６０１５、以前のＩＰＨ２１０２）；Ｂｅｎｓｏｎ ＆ Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ， ２０１４を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

ＩＤＯの活性を低減または遮断する薬剤としては、エパカドスタットおよびＵＳ ２０１７／００３７１２５に開示される薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

ＢＴＬＡの活性を低減または遮断する薬剤としては、ペプチド（例えば、Ｓｐｏｄｚｉｅｊａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

Ａ２ＡＲの活性を低減または遮断する薬剤としては、低分子（例えば、ＣＰＩ－４４４およびビパデナント）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、サイトカイン（例えば、インターロイキン７）を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、刺激性チェックポイント分子のアゴニストを含む。これらの分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
１．ＣＤ４０；
２．ＯＸ４０；
３．グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＧＩＴＲ）；および
４．誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）。

【0071】

ＣＤ４０のアゴニストとしては、ＣＤ４０アゴニストモノクローナル抗体（例えば、ｃｐ－８７０，８９３、ＣｈｉＬｏｂ７／４、ダセツズマブ、およびルカツムマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｋｈｕｂｃｈａｎｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０；Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ， ２０１３；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５を参照のこと。

【0072】

ＯＸ４０のアゴニストとしては、ＯＸ４０アゴニスト抗体（例えば、ＭＯＸＲ０９１６、ＭＥＤ１６４６９、ＭＥＤ１０５６２、ＰＦ－０４５６１８６００、ＧＳＫ３１７４９９８、およびＩＮＣＣＡＧＮ０１９４９）、およびＯＸ４０Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＭＥＤＩ６３８３）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｈｕｓｅｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４；Ｌｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１５；Ｍｅｓｓｅｎｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１７を参照のこと。Ｓｈｒｉｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１７もまた参照のこと。

【0073】

ＧＩＴＲのアゴニストとしては、ＭＥＤＩ１８７３が挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｔｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７を参照のこと。

【0074】

ＩＣＯＳのアゴニストとしては、ＩＣＯＳアゴニスト抗体ＪＴＸ－２０１１およびＧＳＫ３３５９６０９が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ， ２０１５；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６を参照のこと。

【0075】

他の実施形態において、その第２の治療は、４－１ＢＢアゴニスト（Ｓｈｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）（例えば、ウレルマブ）；４－１ＢＢアンタゴニスト（ＵＳ ２０１７／０１７４７７３を参照のこと）；未分化リンパ腫キナーゼのインヒビター（ＡＬＫ； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； ＵＳ ２０１７／０２７４０７４）（例えば、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ＰＦ－０６４６３９２２、ＮＶＰ－ＴＡＥ６８４、ＡＰ２６１１３、ＴＳＲ－０１１、Ｘ－３９６、ＣＥＰ－３７４４０、ＲＸＤＸ－１０１）；ヒストンデアセチラーゼのインヒビター（ＨＤＡＣ；ＵＳ ２０１７／０３２７５８２を参照のこと）；ＶＥＧＦＲインヒビター（例えば、アキシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、チボザニブ、ベバシズマブ）；および／または抗ＣＤ２７抗体（例えば、バルリルマブ）を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、がんワクチン（例えば、Ｄｕｒａｉｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）を含む。「がんワクチン」は、そのがんワクチンが投与される個体において、特定の抗原に対して免疫応答を引き出すことが意図された免疫原性組成物である。がんワクチンは代表的には、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導または刺激し得る腫瘍抗原を含む。「腫瘍抗原」とは、標的腫瘍の表面上に存在する抗原である。腫瘍抗原は、非腫瘍細胞によって発現されていない分子であってもよいし、例えば、非腫瘍細胞によって発現される分子の変化したバージョン（ａｌｔｅｒｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）（例えば、誤って折りたたまれたか、短縮化されたか、または他の方法で変異したタンパク質）であってもよい。

【0077】

いくつかの実施形態において、その第２の治療は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を含む。例えば、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ， ２０１３；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ， ２０１６を参照のこと。

【0078】

いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、ＣＡＲ－Ｔ細胞がん治療の有効性を増加させるために、そのＣＡＲ－Ｔ細胞がん治療とともに投与される。

【0079】

いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、例えば、ＵＳ ２０１７／０１４３７８０で開示されるとおりの腫瘍溶解性ウイルスとともに投与される。腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例は、上に記載される。

【0080】

さらなる治療的使用
いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、感染性疾患（例えば、ウイルス、真菌、細菌、および原生動物、ならびに蠕虫によって引き起こされる慢性感染症を含む）を処置するために患者に投与される。

【0081】

ウイルス因子の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を含む）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスが挙げられる。

【0082】

真菌因子の例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍが挙げられる。

【0083】

細菌因子の例としては、連鎖球菌（例えば、ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられる。

【0084】

原生動物の例としては、Ｓａｒｃｏｄｉｎａ（例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｇｉａｒｄｉａ）、Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、およびＳｐｏｒｏｚｏａ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）が挙げられる。

【0085】

蠕虫の例としては、Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｓ（例えば、吸虫、条虫）、Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌｉｎｓ、およびＮｅｍａｔｏｄｅｓが挙げられる。

【0086】

いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、ワクチン接種への応答を（例えば、エフェクターＴ細胞を増やすおよび／またはＴ細胞疲弊を低減することによって）増強するために、ワクチンアジュバントとして投与される。そのワクチンは、例えば、ＲＮＡワクチン（例えば、ＵＳ ２０１６／０１３０３４５、ＵＳ ２０１７／０１８２１５０）、ＤＮＡワクチン、組換えベクター、タンパク質ワクチン、またはペプチドワクチンであり得る。このようなワクチンは、当該分野で周知であるように、例えば、ウイルス様粒子を使用して送達され得る。

【0087】

いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、敗血症を処置するために投与される。

【0088】

いくつかの実施形態において、上に記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、毛色の再着色を促進するために投与される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるペプチド、改変されたペプチド、核酸分子、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または腫瘍溶解性ウイルスのうちの１またはこれより多くは、色素沈着した皮膚病変の美白を促進するために投与される。

【実施例】

【0089】

実施例１． ペプチドＬＤ０１は、ヒトおよびマウスのＰＤ－１に結合する
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標） Ｔ－２００を使用して２５℃で行った。そのアッセイおよび再生緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ Ｐ２０を含んだ。固定化緩衝液は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）であった。リガンドを固定するために使用した流速は、５μｌ／分であった。反応速度論分析のための流速は、３０μｌ／分であった。

【0090】

スカウティング。 ペプチドＬＤ０１の４４００ ＲＵを、アミンカップリング法（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によって、ＣＭ５チップのフローセル２上に直接固定した。占有されなかった部位を、１Ｍ エタノールアミンでブロッキングした。スカウティングを単一分析物濃度２９０ｎＭで行って、結合のあり／なしを確認した。フローセル１をブランクのまま維持し、参照差し引きのために使用した。リガンドへの分析物の結合を、リアルタイムでモニターした。

【0091】

完全な反応速度論． そのスカウティングの結果に基づいて、完全な反応速度論（ｆｕｌｌ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を、分析物濃度１００ｎＭにおいて、続いて、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２ｎＭおよび０ｎＭの濃度への段階希釈において、または示されるとおりに行った。Ｋ_Ｄを、その観察されたｋ_ｏｎ（オンレート）およびｋ_ｏｆｆ（オフレート）から、または迅速なオフレートとの相互作用に関する定常状態平衡反応速度論によって決定した。

【0092】

カイ２乗（χ^２）分析を、実際のセンサーグラムとＢＩＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアから生成されたセンサーグラムとの間で行って、その分析の精度を決定した。１～２以内のχ^２値は、有意（正確）と見做し、１未満を高度に有意（高度に正確）と見做す。

【0093】

単一濃度結合データを、ヒトおよびマウスのＰＤ１に関して、それぞれ、図１および図２に示す。マウスＰＤ－１への結合に関する反応速度論データを、図３に示す。これらのデータは、ペプチドＬＤ０１がヒトおよびマウス両方のＰＤ－１に結合し、以下の実施例におけるマウスモデルの使用を支持することを示す。

【0094】

実施例２． ペプチドＬＤ０１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上で発現されたヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合を増強する
表面上でヒトＰＤ－１を安定して発現するヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）を、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。この細胞株を、無菌技術を使用して培養し、対数増殖期において維持した。ＰＤ－１タンパク質発現レベルを、品質評価のためにアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識した抗ヒトＰＤ－１を使用して測定した。

【0095】

実験のために、２００μＬの２．５×１０^５ 細胞を、染色緩衝液中でマイクロタイタープレートへとプレーティングした。これらの細胞を、染色緩衝液中の種々の濃度のペプチドＬＤ０１とともに１時間インキュベートし、洗浄し、次いで、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質とともに１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程の後に、その細胞を、ＡＦ６４７で標識した抗ヒトＦｃとともに３０分間インキュベートした。数回洗浄した後、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ結合に起因する平均蛍光強度を、フローサイトメトリーによって測定した。

【0096】

その結果を、図４Ａ～Ｃに示す。これらの結果は、ペプチドＬＤ０１が、ヒトＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ細胞へのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合を増強し、用量応答傾向が増加することを示す。

【0097】

実施例３． ペプチドＬＤ０１は、無細胞アッセイにおいてＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１ Ｆｃの結合を増強する
マイクロタイタープレートを、ペプチドＬＤ０１で４℃において一晩コーティングした。そのプレートを洗浄し、１％ ＢＳＡで１時間、室温においてブロッキングした。次いで、そのプレートを、１００μＬの１μｇ／ｍＬ ＰＤ－１とともに室温において１時間インキュベートした。そのプレートを再び洗浄し、ＰＤ－Ｌ１とともに室温において１時間インキュベートした。もう一度洗浄した後に、そのプレートを、抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰとともにインキュベートした。１時間インキュベートし、洗浄した後、そのＨＲＰを、ＴＭＢ基質とともにインキュベートすることによって検出し、そのＯＤをマイクロプレートリーダーで読み取った。

【0098】

その結果を図５に示す。これらの結果は、ペプチドＬＤ０１が、無細胞アッセイにおいてヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合を増強することを確認する。

【0099】

実施例４． マウス脾細胞増殖に対するペプチドＬＤ０１の効果
ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質は、抗ＣＤ３誘導性脾細胞増殖を低減すると仮定する。ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ媒介性増殖に対するペプチドＬＤ０１の効果を決定するために、実験を行った。

【0100】

カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識マウス脾細胞（４００，０００ 細胞、５μＭ ＣＦＳＥ）を、１μｇ／ｍＬ 抗ＣＤ３抗体および種々のレベルのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃまたは無関係のコントロールＦｃを使用して刺激した。ＰＤ－１に対するペプチドＬＤ０１の効果をモニターするために、種々の濃度のペプチドＬＤ０１（１μＭ、５μＭ、および２５μＭ）を、その脾細胞の増殖に対するそれらの効果に関して試験した。ＣＦＳＥ希釈プロフィールを、３日間の処理の後にフローサイトメトリーによって分析した。

【0101】

細胞数および抗ＣＤ３抗体濃度の滴定結果を図６に示し、ペプチドＬＤ０１データを図７に示す。これらの結果は、ペプチドＬＤ０１が、抗ＣＤ３刺激したマウス脾細胞の増殖を、外因的に添加したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの存在下および非存在下で増強することを示す。

【0102】

実施例５． マウス黒色腫モデルにおけるペプチドＬＤ０１の効果
ペプチドＬＤ０１のインビボでの機能性を評価するために、抗転移活性を、免疫適格Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてＢ１６－Ｆ－１０マウス黒色腫の同系モデルにおいて評価した。簡潔には、ＡＴＣＣから得たマウスＢ１６－Ｆ１０－ＬａｃＺ細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。一旦コンフルエントになった後、細胞を集め、２００μｌのＰＢＳ中の２×１０^５ 細胞を、尾静脈を介して各マウスに静脈内注射した。細胞を送達した後、動物を、研究コホートへと無作為に割り当てた（各群において５匹のマウス）。試験サンプル、処置経路および処置日数を、表１Ａに詳述する。ペプチドのインビボ半減期は、抗体（数週間）と比較して比較的短い（数時間）であることから、ペプチドを静脈内送達し、より頻繁に与えた。

【表1A】

【0103】

この研究において使用した陰性コントロールペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ、配列番号３３）であった。２００μｇのペプチドまたは抗体を、処置日ごとに投与した。細胞注射後１４日目に、そのマウスを安楽死させ、肺を除去し、Ｆｅｋｅｔｅの溶液中で固定した。その腫瘍結節を計数した。

【0104】

個々のマウスの腫瘍結節の数を図８に示す一方で、処置なし（コホート１）と比較した各コホートにおける腫瘍結節のパーセンテージ低減を図９に示す。処置なし（コホート１）とペプチドＬＤ０１（コホート３）または抗ＰＤ－１抗体（コホート６）との間の有意差を、対応のないｔ検定を使用して検出し、図８において^＊ｐ＜０．０５によって示した。処置なし（コホート１）およびペプチドＬＤ０１（コホート４）の顕微鏡による肺画像の例を図１０に示す。これらの結果は、ペプチドＬＤ０１（コホート３および４）が、インビボで機能的に活性であり、処置なし（コホート１）と比較して肺転移を約５０％低減することを示す。さらに、ペプチドＬＤ０１（コホート３および４）の有効性は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体での処置（コホート５および６）に類似であるかまたはわずかに上回った。

【0105】

ペプチドＬＤ０１、ＬＤ１０ｄａ、およびＬＤ１６ｄａを、上記のように試験し、このとき、ペプチドＬＤ１２（コホート２）を陰性コントロールとして使用した。試験サンプル、処置経路、および処置日数を、表１Ｂに詳述する。

【表1B】

【0106】

個々のマウスの腫瘍結節の数を図１１に示す。処置なし食塩水（コホート１）とＬＤ０１（コホート３）、ＬＤ１６ｄａ（コホート５）またはα－ＰＤ－１ ｍＡｂ（コホート６）との間の有意差を、図１１において一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して検出した（^＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＬＤ０１（コホート３）およびＬＤ１６ｄａ（コホート５）が、インビボで機能的に活性であり、処置なし食塩水（コホート１）と比較して約３０％肺転移を低減することを示す。

【0107】

実施例６． マラリアワクチンの免疫原性に対するペプチドＬＤ０１の効果
マラリアワクチンの免疫原性に対するペプチドＬＤ０１の効果を、免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｌｉスポロゾイト周囲タンパク質（ＡｄＰｙＣＳＰ）を発現する組換え複製欠損アデノウイルスの１０^１０ ウイルス粒子で筋肉内に免疫した。試験サンプル、マウス数、処置経路、および処置日数を表２Ａに示す。

【表2A】

【0108】

この研究において使用した陰性コントロールペプチドは、オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号３４）であった。免疫後１２日目に、マウスを安楽死させ、個々の脾臓を除去し、脾ＣＳＰ特異的、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、脾細胞を、ペプチドＳＹＶＰＳＡＥＱＩ（配列番号３５）、ＰｙＣＳＰのＨ－２Ｋｄ拘束ＣＤ８^＋ Ｔ細胞エピトープで刺激した。

【0109】

各コホートに関して０．５×１０^６ 脾細胞あたりのＣＳＰ特異的、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８ Ｔ細胞の平均数±標準偏差を、図１２に示す。ＡｄＰｙＣＳＰ単独（コホート１）とペプチドＬＤ０１（コホート３）、抗ＰＤ－１抗体（コホート４）または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（コホート５）との間の有意差を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して検出した（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、および^＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ペプチドＬＤ０１（コホート３）が、インビボで機能的に活性であり、ＣＳＰ特異的、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８ Ｔ細胞の数をＡｄＰｙＣＳＰ単独（コホート１）と比較して約２倍増加させることをさらに示す。さらに、ペプチドＬＤ０１（コホート３）の免疫原性は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（コホート４および５）での処置をわずかに上回った。

【0110】

ペプチドＬＤ０１、ＬＤ１０ｄａ、およびＬＤ１６ｄａを、上に記載されるように試験し、このとき、陰性コントロールとしてペプチドＬＤ１２（コホート２）を使用した。試験サンプル、処置経路および処置日数を、表２Ｂに詳述する。

【表2B】

【0111】

免疫後１２日目に、マウスを安楽死させ、個々の脾臓を除去し、脾臓ＣＳＰ特異的、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。そのＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、脾細胞を、ペプチドＳＹＶＰＳＡＥＱＩ（配列番号３５）、ＰｙＣＳＰのＨ－２Ｋｄ拘束ＣＤ８^＋ Ｔ細胞エピトープで刺激した。

【0112】

各コホートの５×１０^５ 脾細胞あたりのＣＳＰ特異的、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の平均数±標準偏差を、図１３に示す。ＡｄＰｙＣＳＰ単独と比較した有意差を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して検出した（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊ｐ＜０．００５）。これらの結果は、ＬＤ０１（コホート３）およびＬＤ１０ｄａ（コホート４）が、インビボで機能的に活性であり、ＣＳＰ特異的、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８ Ｔ細胞の数を、ＡｄＰｙＣＳＰ単独（コホート１）と比較して、それぞれ、約１．５～２．５倍増加させることをさらに示す。さらに、ＬＤ１０ｄａ（コホート４）の免疫原性は、α－ＰＤ－１ ｍＡｂ（コホート６）での処置をわずかに上回った。

【0113】

実施例７． マウス敗血症モデルにおけるペプチドＬＤ０１の効果
ペプチドＬＤ０１の効果を、代表的な臨床上関連する敗血症モデル、すなわち、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）によって誘発された腹部内の腹膜炎を有するＣＤ１マウスにおいて研究した。

【0114】

ＣＤ１マウスに麻酔をかけ、腹部正中線切開を行い、盲腸を結紮し、穿刺し、次いで、その切開部を閉じた。２００μｇのペプチドＬＤ０１またはコントロールペプチド（配列番号２）を、手術後６時間、２４時間、および４８時間で腹腔内投与した。ペプチドＬＤ０１の投与は、生存の利益を与え、ペプチドＬＤ０１コホートは、コントロールペプチドの生存率の２倍を超える生存率を有した（それぞれ、７０％（７／１０） 対 ３０％（３／１０））。

【0115】

別個の研究では、敗血症の間のＴ細胞によるＩＦＮγ生成を増加させることに対するペプチドＬＤ０１の効果を評価した。ＣＬＰ手術後、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間に、マウスをペプチドＬＤ０１またはコントロールペプチドで処置した。２４時間後、マウスを安楽死させ、個々の脾臓を除去し、脾臓ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、脾細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を介して刺激した。２×１０^５ 脾細胞あたりのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を、図１４に示す。ペプチドＬＤ０１処置は、コントロールペプチドと比較して、ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数の増加を引き起こした。これは、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌の敗血症誘発性欠陥を逆転させることにおけるペプチドＬＤ０１の有用性を裏付ける。

【0116】

実施例８． ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（登録商標）チェックポイントシグナル伝達アッセイ
ペプチドを、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（登録商標）チェックポイントシグナル伝達アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用して、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合またはＣＴＬＡ－４へのＣＤ８６の結合を阻害するそれらの能力に関して試験した。

【0117】

ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（登録商標） ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１ならびにＣＴＬＡ４およびＣＤ８６細胞株を、標準的手順に従って冷凍ストックから拡大した。ＰＤ－１細胞を、ペプチドとともに予備インキュベートし、続いて、ＰＤ－Ｌ１細胞とともにインキュベートした。ＰＤ－１ Ｊｕｒｋａｔ細胞（２０，０００ 細胞／ウェル）を、総容積５０μＬにおいて、白色壁９６ウェルマイクロプレートへとアッセイ緩衝液中で播種した。ペプチドストックの段階希釈を行って、アッセイ緩衝液中に１１×サンプルを生成した。１０μＬの１１×サンプルをＰＤ－１細胞へと添加し、３７℃において６０分間インキュベートした。５０μＬ Ｕ－２ ＯＳ ＰＤ－Ｌ１細胞（アッセイ緩衝液中３０，０００ 細胞／ウェル）を添加し、その細胞を、室温において２時間共培養した。同様に、ＣＴＬＡ４細胞をペプチドとともに予備インキュベートし、続いて、ＣＤ８６細胞とともにインキュベートした。ＣＴＬＡ４ Ｊｕｒｋａｔ細胞（２０，０００ 細胞／ウェル）を、総容積５０μＬにおいて、白色壁９６ウェルマイクロプレートへとアッセイ緩衝液中で播種した。ペプチドストックの段階希釈を行って、アッセイ緩衝液中に１１×サンプルを生成した。１０μＬの１１×サンプルをＣＴＬＡ４細胞へと添加し、３７℃において６０分間インキュベートした。５０μＬ Ｕ－２ ＯＳ ＣＤ８６細胞（アッセイ緩衝液中３０，０００ 細胞／ウェル）を添加し、その細胞を、室温において４時間共培養した。

【0118】

化合物活性を、ＣＢＩＳデータ分析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ， ＣＡ）を使用して分析した。その結果を、表３および表４に示す。アンタゴニストモードアッセイのために、阻害有効性のパーセンテージを、以下の式を使用して計算した（ここでＲＬＵは、相対的発光単位を意味する）：

【数1】

【0119】

その試験したペプチドは、表３および表４に示されるように、ＰＤ－１において、およびＣＴＬＡ－４ ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（登録商標）アッセイにおいて、広い範囲の阻害有効性を示した。驚くべきことに、そのペプチドのうちの多くは、両方のアッセイにおいて高い有効性を示し、これは、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に関してそれらの二重特異性を示した。

【表3】

【表4】

【0120】

実施例９． ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌に対するＬＤ０１の効果
健康な個体に由来するヒトＰＢＭＣを、５ｎｇ／ｍｌのぶどう球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ） ＋／－ ＬＤ０１（１００μＭ）で刺激した。７２時間で、上清を集め、ＩＦＮγを、サイトメトリックビーズアレイによって測定した。その結果（図１５に示す）は、ＬＤ０１が、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌をＳＥＢ単独と比較して４倍増加させることを示す。

【0121】

参考文献

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【表5-6】

【表5-7】

【表5-8】

【表5-9】

【表5-10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4AB】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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