特許 7190196 時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびこれを用いた測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-07

(45)【発行日】2022-12-15

(54)【発明の名称】時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびこれを用いた測定方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20221208BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20221208BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20221208BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20221208BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20221208BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20221208BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 B

C12Q1/6837 Z

C12Q1/70

G01N33/543 521

G01N33/543 501A

G01N33/53 M

G01N33/569 L

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2020158772

(22)【出願日】2020-09-23

(65)【公開番号】P2021145666

(43)【公開日】2021-09-27

【審査請求日】2020-09-23

(31)【優先権主張番号】10-2020-0034017

(32)【優先日】2020-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】519249701

【氏名又は名称】プレシジョンバイオセンサー インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】朴 智 慧

(72)【発明者】

【氏名】金 ▲ヒョン▼ 貞

(72)【発明者】

【氏名】黄 奎 淵

(72)【発明者】

【氏名】朴 鍾 勉

(72)【発明者】

【氏名】金 漢 信

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１１－０７８３５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－０１４６１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３２２２１２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／０８４２６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５３１２０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０７８８０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－２４０２０７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｇ０１Ｎ ３３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

同一な現場の同一なテスト試料に対して少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群を同時に独立して検出可能である一つのノロウイルス側方流動分析装置において、
一つのノロウイルス側方流動分析装置は、上部および下部ケースの間に配置され、かつ、一つの多孔性膜に対して幅方向に平行に隔離配置される、第１ノロウイルス遺伝子群を検出するための第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと、第２ノロウイルス遺伝子群を検出するための第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールとを含み、
前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールはそれぞれ、前記多孔性膜上に幅方向に平行に配置され、約１μｓより長い蛍光放出寿命を有する蛍光標識が結合された第１および第２固相検出ラインに対して励起光を照射して少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群を同時に独立して検出測定し、
前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールとは、サンプル試料が投入されるサンプルパッドと、前記サンプルパッドに投入されたサンプル試料に存在する第１および第２ノロウイルス遺伝子群に結合されるプローブを有する吸着パッドと、前記吸着パッドと流体連通して前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群と前記プローブの結合による第１および第２ノロウイルス遺伝子群複合体をそれぞれ固定する検出ラインと矯正ラインを有する前記多孔性膜を含み、
前記吸着パッドは前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群複合体を形成する結合物質が標識された捕獲抗体を提供する第１吸着パッドと、前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群複合体を形成する蛍光物質で標識された検出抗体、前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群に非特異的な蛍光物質で標識された抗体を提供する第２吸着パッドを含み、
前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールの間を離隔遮断するための離隔空間を有する遮断モジュールをさらに含む、時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置。

【請求項2】

前記遮断モジュールは、前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールを収容する、請求項１に記載のノロウイルス側方流動分析装置。

【請求項3】

前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールは、前記サンプルパッドをそれぞれ独立して備えるかまたは前記サンプルパッドを一つを共有して、前記サンプルパッド上の前記テスト試料から前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールそれぞれの前記吸着パッドと前記多孔性膜に移動させる、請求項１に記載の時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置。

【請求項4】

前記結合物質はビオチンで前記捕獲抗体に標識されて前記検出ラインに塗布されたストレプトアビジンと特異結合し、前記蛍光物質はユウロピウムである、請求項３に記載の時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置。

【請求項5】

前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールは、第３ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと交替可能であり、
前記第１ノロウイルス遺伝子群はＧＩ遺伝子群であり、前記第２ノロウイルス遺伝子群はＧＩＩ遺伝子群であり、第３ノロウイルス遺伝子群はＧＩＶ遺伝子群である、請求項１に記載の時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置。

【請求項6】

請求項１～５のうちのいずれか一項による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置を用いたノロウイルス検出測定方法において、
ＧＩ、ＧＩＩ遺伝子群を含むサンプル試料を準備する段階と、前記準備されたサンプル試料を側方流動分析装置のサンプルパッドに注入する段階と、
前記サンプルパッドに隣接した吸着パッドに移動させながら蛍光物質が標識された第１ノロウイルス遺伝子群複合体と、蛍光物質が標識された第２ノロウイルス遺伝子群複合体を形成して前記吸着パッドに流体連動する多孔性膜に毛細管移動させる段階と、
前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール全ての検出ラインと矯正ラインに時間分解蛍光検査機を用いて光照射する段階と、
前記検出ラインと矯正ラインとの第１ノロウイルス遺伝子群に対するそれぞれの蛍光信号を比較してサンプル試料の第１ノロウイルス遺伝子群を検出し、かつ、前記検出ラインと矯正ラインとの第２ノロウイルス遺伝子群に対するそれぞれの蛍光信号を比較してサンプル試料の第２ノロウイルス遺伝子群を検出する段階であって、サンプル試料の第１ノロウイルス遺伝子群と第２ノロウイルス遺伝子群とをそれぞれを独立して検出する段階を含む、ノロウイルス検出測定方法。

【請求項7】

前記抗体は蛍光標識と結合物質にそれぞれ結合し、前記蛍光標識はユウロピウムであり、前記結合物質はビオチンを使用し、前記検出ラインには前記結合物質と特異結合するストレプトアビジンが固定された、請求項６に記載のノロウイルス検出測定方法。

【請求項8】

ＧＩ遺伝子群ノロウイルスの抗原濃度が５０ｐｇ／ｍｌ以上である場合と、ＧＩＩ遺伝子群ノロウイルスの抗原濃度が１０ｐｇ／ｍｌ以上である場合に対して、ＧＩ遺伝子群ノロウイルスとＧＩＩ遺伝子群ノロウイルスの検出が可能である、請求項６に記載のノロウイルス検出測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびこれを用いた測定方法に関するものであって、より詳しくは、少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶを分離して独立に時間分解蛍光分析を用いて検出測定することによって微量の少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶに対しても高敏感度に分析することができる時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびこれを用いた測定方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）は食品および水質媒介病原体であって、飲食物や水などを通じて摂取するようになる場合、人に感染性胃腸炎を起こす腸管系ウイルス（Ｅｎｔｅｒｉｃ ｖｉｒｕｓ）の一種類である。

【0003】

図１に示したように、ノロウイルスはＲＮＡウイルスで７つ（ＧＩ～ＧＶＩＩ）の遺伝子群に分類され、これらのうち、人体感染は主に遺伝子群ＧＩの８個遺伝子型、ＧＩＩの１７個遺伝子型によると知られている。

【0004】

ノロウイルスは粒子１００個程度のみ摂取してもヒトに下痢、腹痛、嘔吐などの症状を誘発することがあり、前記症状によって排出される嘔吐物や排泄物などに約１億個のノロウイルス粒子が含まれていて、強力な感染力および速い伝染速度を有している。よって、食品や水質に存在することがある微量のノロウイルスを高敏感度に検出および予防することができる技術がさらに要求されている。

【0005】

一般的なノロウイルス検出方法として電子顕微鏡、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ方法が使用されてきたが、最も一般的な検出方法としてはＲＴ－ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）などが広範囲に用いられている。

【0006】

電子顕微鏡を使用して確認する場合、約１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ、ＥＩＡとＥＬＩＳＡの場合、約１０５－１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬまで検出が可能である。これに反し、ＲＴ－ＰＣＲを使用して検出する場合、約２０－１００ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎのＬＯＤ（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）効率を有し、これらは多様で複雑な試料前処理技術が要求され、検出まで多くの時間と費用がかかるという問題点があり、高価の特殊装備使用でセンサー装置を小型化しにくく現場でリアルタイムに使用しにくい。

【0007】

また、食品内に汚染されたノロウイルス検出時、低濃度に存在するノロウイルスを検出するのに限界があった。

【0008】

また、ノロウイルスの迅速診断キット（ｒａｐｉｄ ｋｉｔ）で抗原－抗体反応を用いた免疫検査方式があるが、ゴールドを信号発現物質として使用して肉眼検査を行う方式である。

【0009】

このようなゴールド基盤の迅速診断キットは敏感度に限界があって、図２に示されているように、ゴールド基盤の迅速診断キットを用いてノロウイルスを検出すれば、ＧＩに対して検出ラインがＧ１遺伝子群抗原濃度が１０００ｐｇ／ｍＬ程度になるように検出されなく、ＧＩＩに対しては検出ラインがＧＩＩ遺伝子群抗原濃度が１０００ｐｇ／ｍＬになった場合に信号が発現されるなど人体感染を主に起こす遺伝子群ＧＩとＧＩＩに対してさえも低濃度に存在する場合には検出できないという問題点がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明はこのような問題点を解決しようと案出されたものであって、本発明の目的は、食品や水質に存在することがあるノロウイルスＧＩに対して０．０５ｎｇ／ｍＬ濃度で、ＧＩＩに対しては０．０１ｎｇ／ｍＬ濃度で存在しても高敏感度を有して現場で急速に検出することができる時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびその製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の一実施形態による少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群を同時に独立して検出測定する一つのノロウイルス側方流動分析装置は、第１ノロウイルス遺伝子群を検出するための第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール；および第２ノロウイルス遺伝子群を検出するための第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールを含み、前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュールと第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュールはそれぞれ互いに異なる多孔性膜上に約１μｓより長い蛍光放出寿命を有する蛍光標識が結合された第１および第２固相検出ラインに対して光を照射し所定時間以後蛍光信号を測定して少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群を同時に独立して検出測定することを特徴とする。

【発明の効果】

【0012】

本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびその製造方法によれば、食品や水質に存在することがある少量のノロウイルスに対しても高敏感度を有して現場で急速に検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ノロウイルスの多様な遺伝子群を示す分類表である。

【図2】従来ゴールド基盤の迅速診断キットを用いたノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ抗原濃度による検出有無写真である。

【図3a】本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の概略的な概念図である。

【図3b】本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の分析原理を示す図である。

【図3c】本発明の変形実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の概略的な概念図である。

【図4a】それぞれ本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の遮断モジュールを示す図である。

【図4b】それぞれ本発明の変形実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の遮断モジュールを示す図である。

【図5】ノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ分離単独測定時と、ノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ混合測定時の敏感度の比較グラフである。

【図6】本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置検査順序を説明するフローチャートである。

【図7】本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置のノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ検出敏感度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置およびその製造方法について図面を参照して詳しく説明する。

【0015】

本発明の一実施形態は、本発明を説明するために提供され、本発明を限定しようとするのではない。事実上、当該技術分野の通常の技術者には、本発明の思想や範囲から逸脱しないながら発明に多様な修正と変更を行うことができるという点が明白なはずである。

【0016】

本明細書において、“ノロウイルス”は、例えば人のような動物を感染させるノロウイルスの任意の菌株、血清型または分離菌であり得る。ノロウイルスは、遺伝子型ＧＩ、ＧＩＩおよびＧＩＶまたは任意の他の遺伝子型（例えば、ＧＩＩＩまたはＧＶ）のような人間宿主で一般に発見される遺伝子型であり得る。

【0017】

また、“テスト試料（ｔｅｓｔ ｓａｍｐｌｅ）”は、ノロウイルスを含有することの疑われる物質をいう。テスト試料は、供給源から得られたそのまままたは試料の特性をろ過、沈殿、希釈、蒸留、濃縮、干渉成分の不活性化および試薬の添加などによって改質する前処理後に使用することができる。

【0018】

図３ａ～図４ｂを参照して、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置について説明する。

【0019】

図３ａ～図３ｃは本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の概略的な概念図、その分析原理を示す図、および本発明の変形実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の概略的な概念図であり、図４ａおよび図４ｂはそれぞれ本発明の一実施形態と変形実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置の遮断モジュールを示す図である。

【0020】

本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１は、テスト試料に存在するノロウイルスの存在を検出するための多孔性膜基盤デバイスで励起された蛍光標識によって生成された信号を時間分解蛍光を使用してノロウイルスを検出する。

【0021】

本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１は、パルス発光ダイオード（ＬＥＤ）およびイメージングカメラを含む蛍光検査機５０によって光を照射して蛍光標識を刺激し蛍光を検出する。

【0022】

図３ａ～図４ｂに示されているように、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１は、第１ノロウイルス遺伝子群（ＧＩ）を検出するための第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と、第２ノロウイルス遺伝子群（ＧＩＩ）を検出するための第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００をそれぞれ備え、前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００の間を分離するための離隔空間４０を有する遮断モジュール２００を含むことができる。

【0023】

図４ａに示されているように、前記遮断モジュール２００は前記離隔空間４０を置いて、前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０、１００を収容するための上部および下部ケース２０１、２０３を含むことができ、前記離隔空間４０に前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０、１００を遮断分離するための遮断ウォール４１をさらに有することができ、前記多孔性膜１８、１１８の検出領域２０、１２０に対応して部分的に突出した突出部４３をさらに含んでもよい。

【0024】

前記上部ケース２０１には、前記多孔性膜１８、１１８の検出領域２０、１２０を露出させるための開口２０５から前記検出領域２０、１２０に向かって突出し、前記開口２０５周囲に形成されるフランジ湾曲部２４３がさらに形成されて、前記多孔性膜１８、１１８上のテスト試料の毛細管移動を助け、前記第１または第２ノロウイルス遺伝子群検出のための試薬またはノロウイルスサンプルの汚染を防止することができる。

【0025】

前記遮断ウォール４１に対応して、遮断空間２４１が前記検出領域２０、１２０を分離離隔するためにさらに備えられてもよい。

【0026】

前記遮断モジュール２００は前記遮断空間２４１を中間に置いてそれぞれ少なくとも２種以上の収容空間２０１ａ、２０１ｂを並んで備え、前記少なくとも２種以上の収容空間２０１ａ、２０１ｂ内に前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０、１００を収容することができ、第３ノロウイルス遺伝子群分析モジュールで交替することもできる。

【0027】

前記遮断モジュール２００に追加の収容空間がさらに形成される場合に、第３～第４のノロウイルス遺伝子群分析モジュールが収容されてＧＩＶノロウイルスに対しても同時に分析を行うことができる。

【0028】

本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１において、このように前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００を分離して備える理由について図５および実験例１を参照して説明する。

【実施例】

【0029】

［実験例１］
前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００に対してそれぞれ約１μｓより長い蛍光放出寿命を有する蛍光標識を結合させて互いに異なる第１および第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０、１００に対して光を照射して少なくとも２種以上のノロウイルス遺伝子群を分離して単独測定した場合と、ノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩを一つの分析モジュールに混合測定した場合に対して、抗原濃度別蛍光信号検出強度を実験した。

【0030】

図５は、ノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ分離単独測定時と、ノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ混合測定時との敏感度の比較グラフである。

【0031】

図５に示されているように、ＧＩ抗原に対してＧＩ抗体を単独で使用した場合とＧＩ抗体とＧＩＩ抗体を混合した場合のＧＩノロウイルス抗原濃度による蛍光検出強度を見てみれば、ＧＩ抗体とＧＩＩ抗体を混合した場合にはＧＩ抗原が低濃度区間０－１００ｐｇ／ｍＬで測定された蛍光信号強度傾きが平らな程度であるが、ＧＩ抗体のみ分離して独立に使用した場合にはＧＩ抗原低濃度である０－１００ｐｇ／ｍＬ対しても蛍光信号強度の傾きが急であるのが分かり、このような現象は低濃度信号区分力が増加したということを意味する。

【0032】

同様に、ＧＩＩ抗原に対してＧＩＩ抗体を単独で使用した場合とＧＩＩ抗体とＧＩ抗体を混合した場合のＧＩＩノロウイルス抗原濃度による測定された蛍光信号強度を見てみれば、ＧＩ抗体とＧＩＩ抗体を混合した場合よりＧＩＩ抗体のみ分離して独立に使用した場合にＧＩＩ抗原低濃度０－１００ｐｇ／ｍＬ区間の蛍光信号強度傾きが増加することが分かった。

【0033】

即ち、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１を用いて、前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と前記第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００を用いてＧＩ抗原に対してＧＩ抗体を単独で使用して検出し、ＧＩＩ抗原に対してＧＩＩ抗体を単独で使用してＧＩとＧＩＩをそれぞれ分けて検出することが低濃度に対して高敏感度を有してＧＩとＧＩＩを測定できるのが分かる。

【0034】

以下、再度図３ａ～図４ｂを参照して、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１の第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００の細部構成について詳細に説明する。

【0035】

本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１において、前記第１ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０と第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１００それぞれは独立してノロウイルスを含むテスト試料が塗布されるサンプルパッド１４、１１４（図３ａにない）と、前記サンプルパッド１４、１１４下流に設置されて前記サンプルパッド１４、１１４から移動するテスト試料中のＧＩ～ＧＩＶノロウイルスと混合されて検出領域２０、１２０の検出ライン２１、１２１で検出が可能なノロウイルス複合体を形成するプローブが含まれている吸着パッド１６、１１６と、前記吸着パッド１６、１１６に対して流体連通して前記ノロウイルス複合体を検出領域２０、１２０に移動させるための多孔性膜１８、１１８を含む。

【0036】

前記サンプルパッド１４、１１４は、図３ａおよび図４ａに示されているように、前記第１および第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール１０、１００それぞれに独立して含まれてもよく、図３ｃおよび図４ｂに示されているように、前記サンプルパッド１４、１１４一つを共有して前記サンプルパッド１４、１１４一つから前記吸着パッド１６、１１６に連結されて、前記テスト試料を同時に同一に前記一つのサンプルパッド１４、１１４に投入した後、前記一つのサンプルパッド１４、１１４から分岐させてそれぞれの多孔性膜１８、１１８に流れるようにすることができる。

【0037】

このように前記サンプルパッド１４、１１４一つを共有して前記サンプルパッド１４、１１４一つから前記吸着パッド１６、１１６それぞれに連結することによって分析しようとするテスト試料の同一性と同時性を確保することもできる。

【0038】

ここで、“プローブ”とは、ノロウイルスと特異的に結合する抗体、前記抗体に標識されて結合座を形成する結合物質、前記抗体に標識されて蛍光信号を発生させる蛍光物質、ノロウイルスに非特異的な抗体を含むことができる。

【0039】

前記吸着パッド１６、１１６は少なくとも２種以上のプローブが独立して順次に提供される第１および第２吸着パッド１５、１１５、１６、１１６に分けられ、前記ノロウイルス複合体を形成する結合物質が標識された抗体（捕獲抗体）を提供する第１吸着パッド１５、１１５と、前記複合体を形成する蛍光標識された抗体（検出抗体）、ノロウイルス非特異的な蛍光物質標識された抗体を提供する第２吸着パッド１６、１１６を含むことができる。

【0040】

前記検出領域２０、１２０には、前記ノロウイルス複合体と化学的および物理的結合を形成することができる固定化された捕獲試薬が塗布された検出ライン２１、１２１とノロウイルスに非特異的な抗体と結合を形成することができる固定化された捕獲試薬が塗布された矯正ライン２３、１２３が形成できる。

【0041】

前記固定化された捕獲試薬には、前記結合物質に特異的に結合できる抗体を含有することができる。

【0042】

また、前記吸着パッド１６、１１６は、結合物質なく蛍光標識された抗体（検出抗体）を含むことができる。このような場合、検出ライン２１、１２１にはノロウイルス捕獲抗体を捕獲試薬で固定化させて、ノロウイルス－検出抗体複合体と反応するようにする。

【0043】

前記サンプルパッド１４、１１４は、前記多孔性膜１８、１１８と直接接触せず前記吸着パッド１６、１１６によって連結されて前記サンプルパッド１４、１１４を通じて投入されたテストサンプルが前記吸着パッド１６、１１６を過ぎて前記多孔性膜１８、１１８と流体連通するように構成できる。

【0044】

前記サンプルパッド１４、１１４には一つ以上の分析前処理試薬を含んでもよく、前記サンプルパッド１４、１１４と吸着パッド１６、１１６はテスト試料が通過できる多孔性ガラス繊維材質から形成できる。

【0045】

前記検出ライン２１、１２１と前記矯正ライン２３、１２３をますます多くの流体が通過することによって蛍光信号大きさが変化される。前記矯正ライン２３、１２３は、蛍光物質で標識されたノロウイルスと反応しない非特異抗体と反応し、ノロウイルス存在有無と関係なく蛍光信号が発現されて当該テストが有効であるのを立証する。

【0046】

前記検出ライン２１、１２１は、結合物質に特異的な捕獲試薬あるいはノロウイルス特異抗体を含有してノロウイルス複合体のみを捕獲する。テスト試料は矯正ライン２３、１２３を通過した後、最終目的地として吸収パッド２４、１２４に到達する。前記吸収パッド２４、１２４は、毛細管作用および流体流れを促進させることを助け、廃棄物収集器として作用する。

【0047】

本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置１０において、前記検出ライン２１、１２１には捕獲試薬としてストレプトアビジンを使用し、前記プローブの特異的結合物質であるビオチンに対して特異結合できて好ましい。

【0048】

前記時間分解蛍光検査機５０は、前記検出ライン２１、１２１および前記矯正ライン２３、１２３に対して同時にパルス光を放出するように構成されて、前記検出ライン２１、１２１および前記矯正ライン２３、１２３で蛍光物質から放出された蛍光信号を同時に受信することができる。

【0049】

前記時間分解蛍光検査機５０は、パルス化励起源および光検出器を用いることができる。

【0050】

本明細書において、蛍光物質は１マイクロ秒以上の長い放出寿命を有するものであって、散乱光および自体蛍光のような多くの原因からの背景妨害が実質的に除去されるように比較的に長い放出寿命と比較的大きなストークスシフトを全て有するサマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））、ユウロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））、およびテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタン族キレートを用いることができる。

【0051】

したがって、前記時間分解蛍光検査機５０は、簡単で高くないデザインを有することができる。例えば、パルス発光ダイオード（ＬＥＤ）およびイメージングカメラを用いて蛍光物質を正確に励起させてモノクロメータまたは狭い放出帯幅光学フィルターのような高価の部品を使用しなくても検出ライン２１、１２１および矯正ライン２３、１２３の蛍光を検出することができる。

【0052】

以下、図６および図７および実験例２を参照して、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置を用いたノロウイルス測定方法およびその効果について説明する。

【0053】

図６は本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置検査方法を説明するフローチャートであり、図７は本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置のノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ識別敏感度を示すグラフである。
＜実験例２＞
図６に示されているように、本発明の一実施形態による時間分解蛍光分析を用いたノロウイルス側方流動分析装置を用いたノロウイルス測定方法において、まず、サンプル試料を準備することができる（Ｓ１０）。

【0054】

サンプル試料は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液にノロウイルス遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ抗原濃度を異にしながら製作した。

【0055】

その次に、準備されたサンプル試料を第１側方流動分析モジュール１０と第２側面流動分析モジュール１００のサンプルパッド１０、１１０に８０μＬ注入する（Ｓ２０）。

【0056】

前記サンプルパッド１０、１１０一つを共有してサンプル試料が一度に提供されてもよく、前記サンプルパッド１０、１１０それぞれにサンプル試料が独立して提供されてもよい。

【0057】

ここで、前記第１側方流動分析モジュール１０と第２側方流動分析モジュール１００はそれぞれ吸着パッド１６、１１６に同一な蛍光物質と結合物質を有し、第１ノロウイルス遺伝子群と第２ノロウイルス遺伝子群に対するそれぞれの捕獲－検出抗体対を適用分離塗布している。

【0058】

次いで、前記吸着パッド１６、１１６を過ぎながら形成された蛍光標識されたノロウイルス遺伝子群ＧＩ複合体と、蛍光標識されたノロウイルス遺伝子群ＧＩＩ複合体がそれぞれの多孔性膜に毛細管移動する（Ｓ３０）。

【0059】

この時、前記第１側方流動分析モジュール１０と第２側方流動分析モジュール１００それぞれの検出ライン２１、１２１と矯正ライン２３、１２３に時間分解蛍光検査機５０を用いて光照射して蛍光標識された第１ノロウイルス遺伝子群複合体と、蛍光標識された第２ノロウイルス遺伝子群複合体を励起させて第１ノロウイルス遺伝子群と第２ノロウイルス遺伝子群それぞれに対する蛍光信号を発生させることができる（Ｓ４０）。

【0060】

前記検出ライン２１、１２１と矯正ライン２３、１２３の第１ノロウイルス遺伝子群と第２ノロウイルス遺伝子群に対するそれぞれの蛍光信号を比較してサンプル試料内に存在する第１および第２ノロウイルス遺伝子群をそれぞれ検出することができる（Ｓ５０）。

【0061】

本発明の一実施形態によるノロウイルス流動免疫分析デバイスを用いたノロウイルス測定方法は、側方流動分析法および時間分解蛍光技術を使用して試料でノロウイルス粒子を検出することである。

【0062】

したがって、ｉ）検出領域２０、１２０に近接して時間分解蛍光検査機５０を配置する段階であって、前記蛍光検査機はパルス励起源およびタイムゲーティングされた検出器を含む、段階；ｉｉ）パルス励起源で検出領域２０、１２０で蛍光標識を励起させて前記ノロウイルスＧＩ、ＧＩＩの蛍光標識が蛍光信号を放出するようにする段階；およびｉｉｉ）タイムゲーティングされた検出器で蛍光信号の強度を検出、分析する段階をさらに含むことができる。

【0063】

一方、図７に示されているように、本発明の一実施形態によるノロウイルス測定方法によれば、ノロウイルス遺伝子群ＧＩ抗原濃度が０と５０ｐｇ／ｍｌの蛍光強度差が大きいためＧＩ抗原５０ｐｇ／ｍｌを容易に検出することができる。

【0064】

また、ノロウイルス遺伝子群ＧＩＩ抗原濃度０と１０ｐｇ／ｍｌで蛍光強度差が大きいため遺伝子群ＧＩＩを容易に検出することができる。

【符号の説明】

【0065】

１０、１００：第１および第２ノロウイルス遺伝子群分析モジュール
１５、１１５：第１吸着パッド
１６、１１６：第２吸着パッド
１８、１１８：多孔性膜
２０、１２０：検出領域
２１、１２１：検出ライン
２３、１２３：矯正ライン
４０：離隔空間
５０：蛍光検査機

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図4a】

【図4b】

【図5】

【図6】

【図7】