特許 7190567 間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-07

(45)【発行日】2022-12-15

(54)【発明の名称】間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20221208BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20221208BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20221208BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221208BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20221208BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20221208BHJP

   C12Q 1/28 20060101ALN20221208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53 ZNA

C12Q1/6813 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/02

C12N5/0775

G01N33/53 M

C12Q1/28

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2021525205

(86)(22)【出願日】2019-11-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 KR2019014959

(87)【国際公開番号】W WO2020096339

(87)【国際公開日】2020-05-14

【審査請求日】2021-05-10

(31)【優先権主張番号】10-2018-0137579

(32)【優先日】2018-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520493429

【氏名又は名称】コアステム カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＥＳＴＥＭ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100170900

【弁理士】

【氏名又は名称】大西 渉

(72)【発明者】

【氏名】ギム ギョンスク

(72)【発明者】

【氏名】イ テヨン

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０６３７０８５５（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２００９－１６５３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Lei Huang et al.，Stem Cell Research & Therapy，2015年，Vol. 6, No. 77，p. 1-18

【文献】So Yong Kim et al.，The Journal of Biological Chemistry，2008年11月28日，Vol. 283, No. 48，p. 33563-33568

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バイオマーカーとしてのペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６を測定するための製剤を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物。

【請求項2】

前記ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６は、間葉系幹細胞のインテグリンβ３を調節することを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物。

【請求項3】

前記ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６が過発現する場合、細胞増殖および移動能力が増加することを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物。

【請求項4】

前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤は、前記バイオマーカーに特異的に結合するプライマーペア、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物。

【請求項5】

請求項１に記載の組成物を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キット。

【請求項6】

前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競争的ＲＰ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、定量的ＲＴ－ＰＣＲキットまたはＤＮＡチップキットであることを特徴とする請求項５に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キット。

【請求項7】

対象の生物学的試料からバイオマーカーとしてのペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６の発現水準を測定した後、比較対照群試料の当該バイオマーカーの発現水準と比較する段階を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法。

【請求項8】

前記バイオマーカー発現水準を測定する方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡチップ方法（ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）または免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）であることを特徴とする請求項７に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法。

【請求項9】

バイオマーカーとしてのペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６の発現量を測定して、細胞増殖および移動能力に優れた間葉系幹細胞をスクリーニングする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１８年１１月９日に出願された韓国特許出願第１０－２０１８－０１３７５７９号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。

【0002】

本発明は、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途に関し、より詳細には、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６を含む間葉系幹細胞の増殖または移動能力予測用バイオマーカーとその用途に関する。

【背景技術】

【0003】

幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）する前段階の未分化細胞を総称して言う言葉であり、特定の分化刺激（環境）によって特定の細胞への分化が進行される。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化した細胞とは異なって、細胞分裂により自分と同じ細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）することができて、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）する特性があり、また、分化刺激が加えられると、特定の細胞に分化するが、他の環境または他の分化刺激により他の細胞にも分化することができて、分化に柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることが特徴である。

【0004】

このような幹細胞の多分化性は、ヒトの発生過程の研究のための良い実験モデル（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ）を提供する。幹細胞から得られた均質なヒトの組織や、細胞を対象に薬物検査、毒性検査を行うと、新薬の開発が容易になりえる。ひいては、損傷された組織を代替できる細胞や組織を多量で得ることができるようになって、難治性疾病の治療に利用することができる。

【0005】

間葉系幹細胞は、幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）と自己再生能（ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗａｌ）を維持し、多様な間葉組織に分化できる能力（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有する細胞である。骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、骨組織（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）、膝蓋下脂肪体（ｉｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒ ｆａｔ ｐａｄ）等から抽出することができる。間葉系幹細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球の活性、増殖を抑制し、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＮＫ ｃｅｌｌ）の活性を抑制し、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）とマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の機能を調節する免疫調節能力を有しているので、同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）と異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）が可能な細胞である。また、間葉系幹細胞は、軟骨、骨組織、靭帯、骨髄基質など多様な結合組織に分化できる能力を有する。特に脂肪組織に由来する脂肪由来の間葉系幹細胞は、ＡＳＣ（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）やＡＤＡＳ（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の名前で細分化され、外傷や、腫瘍除去手術、火傷などによってできた軟部組織欠損を治療する生体材料の生産に応用され得る。

【0006】

一方、ペルオキシレドキシン（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ、ＰＲＤＸ）は、過酸化物を還元する過酸化酵素（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）であり、ＰＲＤＸは、多くの組織に発現しており、多量存在していて、生体内で重要な役割を担当していることが予想される。哺乳動物のＰＲＤＸは、シトソール（ｃｙｔｏｓｏｌ）内総タンパク質の０．２～０．４％になるほど多量存在している。哺乳動物は、１２種類のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が報告され、代表的に６つの類型（ＰＲＤＸ１～６）に分離している。ＰＲＤＸ１～５は、２－システイン（２－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を有する構造であり、還元剤としてチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）を使用し、ＰＲＤＸ６は、１－システイン（１－ｃｙｓｔｅｉｎ）を有する構造であり、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を還元剤として使用する。

【0007】

現在までペルオキシレドキシン１を肺癌診断用タンパク質マーカーとしてまたは乳癌診断用マーカーとして利用したり、ペルオキシレドキシン２を癌の診断および治療に利用する技術およびペルオキシレドキシン６の癌の浸潤または転移標的としての用途（韓国公開特許第１０－２００９－００９５３０４号）等については知られているが、間葉系幹細胞の増殖および移動能力を予測するためのバイオマーカーとしてのペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６の用途については報告されたことはない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】韓国特許公開第１０－２００９－００９５３０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６を含む間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーを提供する。

【0010】

また、本発明は、前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物を提供する。

【0011】

また、本発明は、前記組成物を含む間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キットを提供する。

【0012】

また、本発明は、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法を提供する。

【0013】

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーを提供する。

【0015】

前記ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６は、間葉系幹細胞のインテグリンβ３を調節することができる。

【0016】

前記ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６が過発現する場合、細胞増殖および移動能力が増加することができる。

【0017】

また、本発明は、前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物を提供する。

【0018】

前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤は、前記バイオマーカーに特異的に結合するプライマーペア、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むことを特徴とする、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物を提供する。

【0019】

また、本発明は、前記組成物を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キットを提供する。

【0020】

前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競争的ＲＰ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、定量的ＲＴ－ＰＣＲキットまたはＤＮＡチップキットでありうる。

【0021】

また、本発明は、対象の生物学的試料から請求項１に記載のバイオマーカーの発現水準を測定した後、比較対照群試料の当該バイオマーカーの発現水準と比較する段階を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法を提供する。

【0022】

前記バイオマーカー発現水準を測定する方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡチップ方法（ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）または免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）でありうる。

【0023】

また、本発明は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６の発現量を測定して、細胞増殖および移動能力に優れた間葉系幹細胞をスクリーニングする方法を提供する。

【発明の効果】

【0024】

本発明は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーに関し、前記バイオマーカーの発現水準を測定することによって、間葉系幹細胞の増殖および移動能力を予測することができる。また、間葉系幹細胞の増殖および移動能力を予測することによって、治療用に投与された幹細胞が標的組織や部位に到達して治療効能を従来よりさらに高めることができるので、これに対する観点から細胞治療効能を改善させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓と腎臓内ＰＲＤＸ６発現度を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図2】ＭＳＣでのＰＲＤＸ６発現程度を分析したものである。

【図3】ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが細胞増殖および細胞死に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図4】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣが過酸化水素に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図5】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣが細胞付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図6】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣが運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）および浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図7】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣが移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図8】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣと、インテグリンおよびＭＭＰとの関連性を分析したものである。

【図9】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣが免疫抑制能に及ぼす影響を分析したものである。

【図10】ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣの特徴を分析したものである。

【図11】ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣが細胞増殖に及ぼす影響を分析したものである。

【図12】ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣが運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）および浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図13】ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣが免疫抑制能に及ぼす影響を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【図14】ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣとＰＧＥ２との関連性を分析したものである（^＊ｐ＜０．０１）。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明をより詳細に説明する。

【0027】

（間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカー）
本発明は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーを提供する。前記ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６は、間葉系幹細胞のインテグリンβ３を調節することができる。前記ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６が過発現する場合、細胞増殖および移動能力が増加することができ、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６が低発現する場合、細胞増殖および移動能力が減少することができる。

【0028】

本明細書で使用される用語「過発現」は、調査対象の試料（例えば、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞）での対象となるヌクレオチド配列の発現程度が野生型間葉系幹細胞の平均発現値と比較して高い場合（好ましくは、１．５倍以上）を意味する。

【0029】

前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、臍帯血、胎盤、臍帯血、または血液由来の幹細胞でありうる。

【0030】

（間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物）
本発明は、前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物を提供する。

【0031】

具体的に前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤は、前記バイオマーカーに特異的に結合するプライマーペア、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むことができる。本発明による組成物は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６のポリヌクレオチドのセンスおよびアンチセンスプライマーを利用してＰＣＲ増幅を実施して、所望の生成物の生成有無を通じて間葉系幹細胞の増殖および移動能力を予測することができ、ＰＣＲ条件、センスおよびアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知となったものを基礎として変形することができる。また、本発明のプライマーは、ホスホロアミダイト固体支持体方法またはその他広く公知された方法を使用して化学的に合成することができ、このような核酸配列は、また、当該分野に公知となった多くの手段を利用して変形させることができる。このような変形の非制限的例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド１つ以上の同族体への置換、およびヌクレオチド間の変形、例えば、荷電しない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、カルバメートなど）または荷電した連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオアートなど）への変形がある。

【0032】

（間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キット）
本発明は、前記組成物を含む間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キットを提供する。前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競争的ＲＰ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、定量的ＲＴ－ＰＣＲキットまたはＤＮＡチップキットでありうる。

【0033】

具体的に、前記バイオマーカーの発現水準を測定するためのキットは、ＲＴ－ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットでありうる。ＲＴ－ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマーペアの他にも、テストチューブまたは他の適切なコンテナ、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ－ポリメラーゼおよび逆転写酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ－水（ＤＥＰＣ－ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。

【0034】

また、本発明のキットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含む間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用遺伝子を検出するためのキットでありうる。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡがプローブに付着している基板を含み、基板は、定量対照群遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡを含むことができる。

【0035】

（間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法）
本発明は、対象の生物学的試料から前記バイオマーカーの発現水準を測定した後、比較対照群試料の当該バイオマーカーの発現水準と比較する段階を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法を提供する。

【0036】

前記バイオマーカー発現水準を測定する方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡチップ方法（ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）または免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）でありうる。

【0037】

本明細書で使用される用語「生物学的試料」とは、本発明のバイオマーカーの発現が検出され得る個体から得られるすべての試料を意味する。例えば、骨髄、脂肪組織または末梢血液などから得られるが、これに制限されるものではなく、本発明の技術分野における通常的に使用される方法で処理して準備され得る。

【0038】

（細胞増殖および移動能力に優れた間葉系幹細胞をスクリーニングする方法）
本発明は、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６の発現量を測定して、細胞増殖および移動能力に優れた間葉系幹細胞をスクリーニングする方法を提供する。ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６が過発現する場合、間葉系幹細胞の増殖、移動、付着能力が増加し、ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）６が低発現する場合は、間葉系幹細胞の増殖、移動、付着能力が減少する。

【0039】

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。本発明の目的、特徴、長所は、以下の実施例を通じて容易に理解され得る。本発明は、ここで説明する実施例に限定されず、他の形態で具体化されることもできる。ここで紹介される実施例は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に本発明の思想が十分に伝達され得るようにするために提供されるものである。したがって、以下の実施例によって本発明が制限されてはならない。

【実施例】

【0040】

＜材料および実験方法＞
（材料）
Ｆｅｍａｌｅ ＭＲＬ／ＭｐＪ－Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ（以下、ＭＲＬ／ｌｐｒと命名する）マウスは、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスの飼育環境は、温度２１～２４℃、湿度４０～６０％、明暗周期は１２時間（点灯：０８時、消灯：２０時）であり、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）状態を維持した。固形飼料と飲水は滅菌して自由給餌させ、すべての実験動物は、１週間動物室で適応させた後、実験に使用した。

【0041】

Ｈｕｍａｎ ＭＳＣ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、以下ｈＭＳＣと命名する）とｍｏｕｓｅ ＭＳＣ（以下ｍＭＳＣと命名する）は、ヒトまたはマウスの脛骨（ｔｉｂｉａｅ）および大腿骨（ｆｅｍｕｒｓ）のＢＭ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）細胞から収得した。ｈＭＳＣは、ＢＭ細胞は、ＣＳＢＭ－Ａ０６ ｍｅｄｉｕｍ（コアステム（株）、Ｋｏｒｅａ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含む培地で３７℃、７％ＣＯ_２条件で培養した。

【0042】

ＰＲＤＸ６－ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、Ｋｏｒｅａ）と呼ばれる１２－２１ ｍｅｒのｄｓＲＮＡにより配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象を利用して、４８時間の間培養してＰＲＤＸ６－ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）反応を誘導した。

【0043】

（ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ）
ＩＦＮ－γの測定は、Ｒ＆Ｄ（＃ＤＹ２８５－０５）で提供された試験方法によって進めた。ＥＬＩＳＡ用９６ ｗｅｌｌに捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とコーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を１：２５０の割合で希釈して４℃で１８時間コーティングした。２００μｌの洗浄溶液（ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して２回洗浄し、ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）２５０μｌをウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、室温で２時間反応させた。その後、２００μｌの洗浄溶液（ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して２回洗浄し、試料をアッセイバッファー（ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）（１Ｘ）に希釈してサンプルを準備した。各ウェル（ｗｅｌｌ）にアッセイバッファー（１ｘ）９０μｌ、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）５０μｌおよびスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）またはサンプル（ｓａｍｐｌｅ）１０μｌを入れて室温で３時間反応させた。反応が終わると、洗浄溶液（ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して洗浄した。基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを各ｗｅｌｌに入れた後、５分間反応させ、停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌを入れて反応を中止させた。最後に４５０ｎｍ～５７０ｎｍで値を測定した。

【0044】

（トリゾール方法（Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ）を利用したＲＮＡ分離）
細胞（Ｃｅｌｌ）が７０～８０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）となった時点でＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）０．１２５％で処理した後、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下に培養した。物質処理２４時間後、細胞を回収して、ＴＲＩＺＯＬ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を利用してｔｏｔａｌ ＲＮＡをｃｅｌｌから分離し、２６０ｎｍで吸光度の測定を通じてトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を定量した。

【0045】

（ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ））
細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を利用して細胞をｉｃｅに載置した状態で溶解した。４℃で１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してタンパク質を得た。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬を利用してタンパク質を定量して２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を利用して７５Ｖで電気泳動を実施した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）を９５Ｖで９０分間ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した後、０．５％ツイン（Ｔｗｅｅｎ）２０が含まれたＴＢＳ（ＴＴＢＳ）に５％ ｎｏｎｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋを添加して１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）後、１次抗体が含まれた５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳにメンブレンを入れ、４℃で１日間シェイキング（ｓｈａｋｉｎｇ）した。翌日、ＴＴＢＳでメンブレンを洗浄した後、２次抗体が入っている５％ＢＳＡ／ＴＴＢＳにメンブレンを入れて、常温で９０分間２次抗体を付着した。ＴＴＢＳでメンブレンを洗浄し、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）とｍｅｍｂｒａｎｅを反応させた後、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＸＲＳ^＋ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してタンパク質発現程度を測定した。

【0046】

（逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）－ＰＣＲ）
トータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡ ０．３μｇの濃度を利用し、４２℃で１時間、９５℃で５分間合成した。合成されたｃＤＮＡ ３μｌとｐｒｉｍｅｒ １０ｐＭを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行った。この反応の基本過程は、ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｈａｓｅ、９４℃、５分を行い、ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｈａｓｅ、９４℃で３０秒、ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｐｈａｓｅ、５６℃で３０秒、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ、７２℃で１分を行い、ｐｏｓｔ－ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅを７２℃で５分の条件で実施した。１％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）を作って電気泳動を実施した。

【0047】

（ＲＴ－ＰＣＲ）
ＰＲＤＸ６、ＣＯＸ－２、ｉＮＯＳ、ＩＤＯ、ＴＧＦ－β、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２に対するｍＲＮＡの発現水準をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を通じて分析した。各サンプルの相対的なｍＲＮＡ量は、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）であるβ－ａｃｔｉｎのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）と比較した臨界周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ，Ｃｔ）を基準として計算された。

【0048】

（プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）配列情報）
使用されたプライマー情報は、次の通りである。ＣＣＬ２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＴＧ Ｔ－３’、ＣＣＬ２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＴＧ ＣＴＴ Ｇ－３’、ＣＣＬ３ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＴＴ－３’、ＣＣＬ３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＣＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＣＡ Ｔ－３’、ＣＣＬ４ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＡ ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＡ ＧＣ－３’、ＣＣＬ４ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＣＣ－３’、ＣＣＬ５ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＡＧ－３’、ＣＣＬ５ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＣ ＣＧＡ ＡＣＣ ＣＡＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＣＴ－３’、ＣＸＣＬ１０ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＴ－３’、ＣＸＣＬ１０ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＡＴＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＡ－３’、ＣＸＣＬ１２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＧＴＣ Ｇ－３’、ＣＸＣＬ１２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＣＣ Ｇ－３’、ＰＲＤＸ６ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＣＴＧ ＣＴＴ Ｃ－３’、ＰＲＤＸ６ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＡＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＡ ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＣ－３’、ＣＯＸ－２ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＴ－３’、ＣＯＸ－２ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ－３’、ｉＮＯＳ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＣＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＣ－３’、ｉＮＯＳ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＡ－３’、ＩＤＯ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＡＧＣＣ ＴＧＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＧ－３’、ＩＤＯ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＧ－３’、ＴＧＦ－β ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＡＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ－３’、ＴＧＦ－β ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＴＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＡ ＴＧＴ ＧＴＴ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ－３’、β－ａｃｔｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’－ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＡ－３’。

【0049】

（アネキシンＶ染色（ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｓｔａｉｎｉｎｇ））
冷たいＰＢＳで２回細胞を洗浄（ｗａｓｈ）した後にバインディングバッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に１×１０^６ ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で細胞を溶解した。その後、５ｍｌ培養チューブ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｕｂｅ）に１００μｌの量を移した後、５μｌの量のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）を利用して２５℃、常温、暗い条件で１５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）過程を経て細胞を染色した。その後、４００μｌバインディングバッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）溶液を添加した後に、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用して測定した。

【0050】

（［^３Ｈ］－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ分析）
５％ＣＯ_２が供給される３７℃培養器で５４時間の間培養した後、［^３Ｈ］－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を１μＣｉ／ｗｅｌｌになるように処理した。１８時間培養後、ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｉｎｏｔｅｃｈ，Ｄｏｔｔｉｋｏｎｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を利用して細胞中の［^３Ｈ］－Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの量をＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｙ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。

【0051】

（タイム－ラプスイメージング（Ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ））
細胞移動を確認するためのイメージ撮影のためにμ－ｄｉｓｈ^３５ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈｅｓ（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、ＭＳＣ ３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを２４時間の間分注した。細胞が安定化すると、ｉｎｓｅｒｔを除去した後、Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ ＩＭ－Ｑ（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｙｋｏ，Ｊａｐａｎ）を利用して撮影した。この実験は、１２時間の間２分間隔で撮影を実施し、データ分析は、Ｉｍａｒｉｓ ７．２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｗｉｎｄｏｒ，ＣＴ ＵＳＡ）を利用した。

【0052】

（ケモタキシスアッセイ（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｓｓａｙ））
ＭＳＣの移動は、５μｍ ｉｎｓｅｒｔ ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌがある２４－ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を利用した。下部チャンバー（ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）には、特定のケモカインが入った培地を分注し、上部チャンバー（ｕｐｐｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）には、１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＭＳＣを分注した。５％ＣＯ_２が供給される３７℃培養器に１．５時間の間培養した後、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを利用して下部チャンバー（ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）に移動したＭＳＣの細胞数をカウント（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）して値を表現した。

【0053】

（ＭＳＣ運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）および浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）測定）
ＭＳＣ運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）の測定は、ｈＭＳＣ（１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にｓｉＲＮＡを処理した後、トランスウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に２４時間の間分注して培養した。その後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ；Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）染色を実施して分析した。ＭＳＣ浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の測定は、トランスウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１５％マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を２４時間の間コーティングした後、ｈＭＳＣ（１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４時間の間分注して培養した。その後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を実施して分析した。

【0054】

（ＭＳＣ付着性（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張性（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の測定）
ＭＳＣ拡張性（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の測定は、対照群とＰＲＤＸ６発現が抑制されたｈＭＳＣをそれぞれＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、緑色）とＣＭＴＭＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、赤色）で染色した。その後、それぞれの細胞をｃｕｌｔｕｒｅ－Ｄｉｓｈ^３５ｍｍにｈＭＳＣ（０．２×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を分注して培養した後、タイム－ラプスイメージング（ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を２分間隔で４時間の間撮影した。ムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってｈＭＳＣの付着性（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張性（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を観察した。

【0055】

（統計分析）
実験データ統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）ソフトウェアを利用して分析を実施した。

【0056】

（実施例１．ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓と腎臓内のＰＲＤＸ６分析）
８週齢と２２週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓と腎臓を分離して、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を利用してトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離した後、ｑＰＣＲを行った。８週齢と２２週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓と腎臓を分離してタンパク質を獲得した後、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行った。

【0057】

ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、１０～１２週齢から病症が始まって２０週齢以内に死ぬことになるので、８週齢のマウスを病症初期と判断して、２２週齢に病症末期と判断してそれぞれ８週齢と２２週齢マウスの腎臓と脾臓を分離してＰＲＤＸ６の発現度を分析した。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓では、８週齢の発現度と２２週齢の発現度の差異がなく（図１のＡおよびＣ）、腎臓では、かえって病症がひどい場合、ＰＲＤＸ６の発現が減少した（図１のＢおよびＤ）。これを通じて、結論的にＰＲＤＸ６は、ループス疾病の診断および予測バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）として適切でないことを確認した。

【0058】

（実施例２．ＭＳＣで発現するＰＲＤＸ６分析）
Ｈｕｍａｎ ＭＳＣとｍｏｕｓｅ ＭＳＣで、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）を利用してトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離した後、ＲＴ－ＰＣＲ（図２のＡ）とｑＰＣＲ（図２のＢ）を通じて遺伝子発現を確認した（図２）。ＰＲＤＸ６は、組織に多量で存在しており、また、ｈｕｍａｎ ＭＳＣとｍｏｕｓｅ ＭＳＣでも発現していることをＲＴ－ＰＣＲ（図２のＡ）とｑＰＣＲ（図２のＢ）を通じて確認した。その後、ＭＳＣのＰＲＤＸ６の機能的な側面を確認するために、追加実験を進めた。

【0059】

（実施例３．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが細胞増殖および細胞死に及ぼす影響）
タイムコース（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）でｈＭＳＣにｓｉＲＮＡを処理した後、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行った（図３のＡ）。ｈＭＳＣを９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加した後、７２時間培養した。チミジン取り込み(ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ)（図３のＢ）と細胞カウント(ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）（図３のＣ）を通じて細胞増殖を測定し、トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じて細胞生存能（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定し（図３のＤ）、ｈＭＳＣを添加して７２時間後、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖで細胞を染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を通じて分析した（図３のＥ）。

【0060】

ｈＭＳＣのＰＲＤＸ６の機能を確認するために、ｓｉＲＮＡを処理してノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ，ＫＤ）させた後、実験を進めた結果、ｓｉＲＮＡを２４時間処理した後からＰＲＤＸ６の発現が減少することを確認し、以後の実験は、ｓｉＲＮＡを４８時間処理したことで進めた（図３のＡ）。ｈＭＳＣのＰＲＤＸ６をｓｉＲＮＡでノックダウンさせた後、チミジン取り込み(ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ)と細胞カウント(ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）を通じて増殖を測定した結果、対照群に比べてＰＲＤＸ６をノックダウン（ＫＤ）させたｈＭＳＣの増殖が抑制されることを確認した（図３のＢおよびＣ）。また、トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じて細胞生存能（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した結果、ＰＲＤＸ６がｈＭＳＣの生存能（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）に影響を及ぼさないことが確認された（図３のＤ）。活性酸素は、細胞の細胞死を誘導することが知られており、活性酸素のうち過酸化水素をＰＲＤＸ６が中和することが知られている。これにより、ｈＭＳＣのＰＲＤＸ６をノックダウン（ＫＤ）させた後、細胞死が観察されるか実験を進めた。アネキシンＶ染色（ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通した分析結果、ＰＲＤＸ６がノックダウン（ＫＤ）されたｈＭＳＣでは、細胞死が誘導されないことが確認され、陽性対照群として使用したシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＰ）は、ｈＭＳＣの細胞死を誘導することが確認された（図３のＥ）。結論的に、本実験を通じて、ｈＭＳＣのＰＲＤＸ６は、細胞増殖に影響があることを確認した。

【0061】

（実施例４．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが過酸化水素に及ぼす影響分析）
ｈＭＳＣにｓｉＲＮＡを処理した後、７２時間の間培養した後、ＤＣＦ－ＤＡ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｄｉａｃｅｔａｔｅ）を３０分間処理した後、ＦＡＣＳ分析を実施した（図４のＡ）。また、ｈＭＳＣを添加した後、過酸化水素を処理して７２時間後に、チミジン取り込み(ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ)を通じて細胞増殖を分析した（図４のＢ）。

【0062】

ＰＲＤＸ６がｈＭＳＣ増殖を調節する機序を解明するために、細胞内過酸化水素の量を測定した。ＤＣＦ－ＤＡは、細胞内でＤＣＦに転換され、細胞内過酸化水素により蛍光を帯びる物質に変わり、これをＦＡＣＳを利用して測定することができる。ｈＭＳＣにＤＣＦ－ＤＡを処理した後、細胞内蛍光値をＦＡＣＳを利用して確認した結果、ＰＲＤＸ６がノックダウン（ＫＤ）されたｈＭＳＣは、対照群に比べて蛍光値が約２倍増加した（図４のＡ）。また、ｈＭＳＣに直接的に過酸化水素を処理した後、細胞増殖程度を測定した結果、過酸化水素は、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣと対照群ｈＭＳＣの増殖を減少させることが確認された（図４のＢ）。結論的に、本実験を通じて、ＰＲＤＸ６が過酸化水素を除去してｈＭＳＣの増殖を増加させることを確認することができる。

【0063】

（実施例５．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）に及ぼす影響分析）
ｈＭＳＣ（２×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にｓｉＲＮＡを処理した後、１時間の間添加した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）でウォシング（ｗａｓｈｉｎｇ）した後、顕微鏡を通じて細胞数を分析した（図５のＡ）。また、ｈＭＳＣ（２×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にｓｉＲＮＡを処理した後、４時間の間添加した後、ＰＢＳでウォシング（ｗａｓｈｉｎｇ）した後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）で染色し、顕微鏡を通じて細胞数を分析した（図５のＢ）。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＰＲＤＸ６－ＫＤ ｈＭＳＣをそれぞれＣＭＦＤＡ（ｇｒｅｅｎ）とＣＭＴＭＲ（ｒｅｄ）で染色した。培養皿（Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｄｉｓｈ^３５ｍｍ）にｈＭＳＣ（０．２×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を添加し、タイム－ラプスイメージング（ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を２分間隔で４時間の間撮影した。ムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってｈＭＳＣの付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を観察した（図５のＣ）。

【0064】

ｈＭＳＣは、付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）後、拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）され、増殖が行われる。このような特性を考慮してｈＭＳＣの付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）アッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。ｈＭＳＣを添加した後、１時間後に細胞付着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）を確認し、４時間後にクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を通じて細胞拡張（ｃｅｌｌ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を観察した結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣと過酸化水素を処理したｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞の付着（図５のＡ）と拡張（図５のＢ）が減少することが確認された。また、対照群ｈＭＳＣとＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣをそれぞれＣＭＦＤＡ（ｇｒｅｅｎ）とＣＭＴＰＸ（ｒｅｄ）で染色して４時間の間イメージ撮影を実施した結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）が減少することが確認された（図５のＣ）。結論的に、本実験を通じて、ｈＭＳＣの付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）後、拡張（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）にＰＲＤＸ６が影響を及ぼすことが確認された。

【0065】

（実施例６．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）および浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）に及ぼす影響分析）
ｈＭＳＣ（１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にｓｉＲＮＡを処理した後、トランスウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に２４時間の間添加し、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を実施して運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を分析した（図６のＡ）。また、トランスウェルプレート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１５％ｍａｔｒｉｇｅｌを２４時間の間コーティングした後、ｈＭＳＣ（１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４時間の間シーディングした後、クリスタルバイオレット染色を実施して浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を分析した（図６のＢ）。その後、Ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ ｍ－Ｄｉｓｈ^３５ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈを利用してｈＭＳＣ（７０μｌ ｏｆ ３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をシーディングし、タイム－ラプスイメージング（ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を１２時間の間撮影し、それぞれムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってボックスの範囲を測定し、ｈＭＳＣの移動を確認した（図６のＣ）。

【0066】

トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にｈＭＳＣを２４時間の間添加し、下部ウェル（ｌｏｗｅｒ ｗｅｌｌ）に１０％ＦＢＳが添加された培地（ｍｅｄｉａ）を入れた。実験結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）が減少することが確認された（図６のＡ）。また、浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）環境を作るために、実験前に１５％マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を２４時間の間上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にコーティングした後、実験を進めた。ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞の浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）が減少することが確認された（図６のＢ）。ｈＭＳＣの動きをイメージを通じて確認した結果、ＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞の動きが減少することが確認された（図６のＣ）。

【0067】

（実施例７．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に及ぼす影響分析）
ｈＭＳＣの移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）にもＰＲＤＸ６が影響を及ぼしたかを調べてみるために実験を進めた。ｈＭＳＣ（１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にｓｉＲＮＡを処理した後、トランスウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にｈＭＳＣを添加し、下部ウェル（ｌｏｗｅｒ ｗｅｌｌ）には、ＣＸＣＬ１０を入れた。２４時間後にクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を実施して分析した。

【0068】

ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）は、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を調節するタンパク質であるところ、ｈＭＳＣで発現するＣＸＣＲ３にマッチングするＣＸＣＬ１０に対する移動アッセイ（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にｈＭＳＣを２４時間の間添加した後、下部ウェル（ｌｏｗｅｒ ｗｅｌｌ）に組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＣＸＣＬ１０を入れた。実験結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が減少することが確認された（図７）。

【0069】

（実施例８．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣの機序研究）
ｈＭＳＣにｓｉＲＮＡを処理した後、４８時間の間添加し、ｈＭＳＣのｍＲＮＡ水準とタンパク質水準をそれぞれＲＴ－ＰＣＲおよびウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じて分析した。ｈＭＳＣのインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）とＭＭＰのｍＲＮＡ水準をＲＴ－ＰＣＲを通じて分析し（図８のＡ）、ｈＭＳＣのインテグリンβ３とＲａｃ１の発現度をウェスタンブロットを通じて分析した（図８のＢおよびＣ）。また、ｈＭＳＣのＥＲＫ、ｐ３８そしてＪＮＫの発現度をウェスタンブロットを通じて分析した（図８のＤ）。

【0070】

細胞のインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）は、細胞の付着、移動および増殖に重要な役割をすることか知られた細胞膜受容体群である。インテグリンは、α４β１、α５β３等２つの単位体で構成される二量体であり、細胞外基質につくと、様々な種類の生化学的信号伝達が誘導される。また、細胞のＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）は、亜鉛依存性中性タンパク質分解酵素であり、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解に関与する役割をして、癌の転移に重要な役割をすることが知られているところ、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣの移動性がインテグリンとＭＭＰに関連しているかを調べてみるために実験を進めた。

【0071】

ＲＴ－ＰＣＲ（図８のＡ）とウェスタンブロット（図８のＢ）の分析結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞のインテグリンβ３が減少することが確認された。しかしながら、ＭＭＰの発現度の変化はなかった（図８のＡ）。インテグリンに付着すると、刺激を通じてＲａｃ１タンパク質が活性化して、細胞の前方に膜突出を誘導して細胞移動を誘導する。ウェスタンブロット分析結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞のＲａｃ１タンパク質が減少することが確認された（図８のＣ）。また、インテグリンは、細胞質内にＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）信号伝達体系にも関連して、細胞成長、増殖に影響を及ぼすことが知られている。ウェスタンブロット分析結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞のＭＡＰＫ中ＥＲＫのリン酸化が減少することが確認された（図８のＤ）。結論的に、本実験を通じて、ＰＲＤＸ６がｈＭＳＣのインテグリンβ３を調節して、Ｒａｃ１－ＥＲＫ信号伝達に影響を与えることによって、細胞の移動性と、ひいては細胞の増殖にも関与することが分かる。

【0072】

（実施例９．ＰＲＤＸ６－ＫＤ（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣが免疫抑制能に及ぼす影響分析）
ｈＭＳＣは、Ｔ細胞の機能を抑制することが知られているが、ＰＲＤＸ６がｈＭＳＣの免疫抑制能にも影響を及ぼすかを調べてみるために実験を進めた。ｈＭＳＣにｓｉＲＮＡを処理した後、ｈＭＳＣとＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）をＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、５ｕｇ／ｍｌ）と共に７２時間共培養後、上澄み液中にあるＩＦＮ－γのタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）水準をＥＬＩＳＡで分析した（図９のＡ）。また、ｈＭＳＣをトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）を利用してトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離した後、ＲＴ－ＰＣＲを通じて遺伝子発現を確認した（図９のＢ）。

【0073】

実験結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群ｈＭＳＣと同様に、Ｔ細胞のＩＦＮ－λの分泌を抑制することが確認された（図９のＡ）。また、ｈＭＳＣで免疫調節に関与する可溶性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）であるＣＯＸ－２、ＮＯ、ＩＤＯとケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）タンパク質であるＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１２の発現度を確認してみた結果、２つの細胞群の差異がないことを確認した（図１４のＢ）。すなわち、本実験を通じて、ＰＲＤＸ６は、ｈＭＳＣの免疫抑制機能に関与しないことが確認された。

【0074】

（実施例１０．ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣの特徴分析）
ＰＲＤＸ６が過発現したｍＭＳＣ（ｍｏｕｓｅ ＭＳＣ）を利用してＰＲＤＸ６の機能を検証した。ＰＲＤＸ６過発現トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ，Ｔｇ）マウスから骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）を分離して１６日間培養した後、細胞表現型をＦＡＣＳを通じて分析した（図１０のＡ）。ｍＭＳＣをトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）を利用してトータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを分離した後ＲＴ－ＰＣＲを通じて遺伝子発現を確認した（図９のＢ）。分析結果、ワイルドタイプ（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ，ＷＴ）－ｍＭＳＣとＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣの表現型は、差異がなかった（図１０のＡ）。また、ＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣが対照群のｍＭＳＣに比べてＰＲＤＸ６が過発現することが確認された（図１０のＢ）。

【0075】

（実施例１１．ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣが細胞増殖に及ぼす影響分析）
ｍＭＳＣを９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加した後、７２時間培養し、チミジン取り込み(ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ)（図１１のＡ）と細胞カウント(ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ）（図１１のＢ）を通じて細胞増殖を測定した。測定結果、ＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣが対照群に比べて細胞増殖が増加することを確認した（図１１のＡおよびＢ）。すなわち、ｍＭＳＣのＰＲＤＸ６が細胞増殖に影響があることを実験を通じて確認した。

【0076】

（実施例１２．ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣが運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）および浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）に及ぼす影響分析）
ＰＲＤＸ６がｍＭＳＣの運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）および移動性（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）にも影響があるかを調べてみるために実験を進めた。

【0077】

ｍＭＳＣ（５×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をトランスウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に２４時間の間添加した後、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を実施して分析した（図１２のＡ）。トランスウェルプレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１５％マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を２４時間コーティングした後、ｍＭＳＣ（５×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４時間の間添加し、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を実施して分析した（図１２のＢ）。Ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｓｅｒｔ ｍ－Ｄｉｓｈ^３５ｍｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈを利用してｍＭＳＣ（７０μｌ ｏｆ ３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をシーディングし、タイム－ラプスイメージング（ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を１２時間の間撮影し、それぞれのムービを時間帯別にスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）をとってボックスの範囲を測定し、ｍＭＳＣの移動を確認した（図１２のＣ）。

【0078】

運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）測定のために、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にｍＭＳＣを２４時間の間添加し、下部ウェル（ｌｏｗｅｒ ｗｅｌｌ）に１０％ＦＢＳが添加された培地（ｍｅｄｉａ）を入れた。測定結果、ＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣは、対照群に比べて細胞の運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）が増加することが確認された（図１２のＡ）。また、１５％マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を２４時間の間上部ウェル（ｕｐｐｅｒ ｗｅｌｌ）にコーティングした後、浸潤アッセイ（ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。ＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣは、対照群に比べて浸潤性（ｉｎｖａｓｉｏｎ）が増加することが確認された（図１２のＢ）。その後、ｍＭＳＣの動きをイメージを通じて確認した結果、ＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣは、対照群に比べて細胞の動きが増加することが確認された（図１２のＣ）。すなわち、本実験を通じて、ＰＲＤＸ６過発現がｍＭＳＣの動きを増加させることが確認された。

【0079】

（実施例１３．ＰＲＤＸ６－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｍＭＳＣが免疫抑制能に及ぼす影響分析）
ＰＲＤＸ６がｍＭＳＣの免疫抑制能にも影響を及ぼすかを調べてみるために実験を進めた。ｍＭＳＣにマウス脾臓細胞（ｍｏｕｓｅ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌ）をコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ，ＣｏｎＡ）と共に７２時間共培養後、上澄み液中にあるＩＦＮ－γのタンパク質水準をＥＬＩＳＡで分析した（図１３のＡ）。ｍＭＳＣをトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）を利用してトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離した後、ＲＴ－ＰＣＲを通じて遺伝子発現を確認した（図１３のＢ）。実験結果、ＰＲＤＸ６－Ｔｇ ｍＭＳＣは、対照群ｈＭＳＣと同様に、Ｔ細胞のＩＦＮ－λの分泌を抑制することが確認された（図１３のＡ）。また、ｍＭＳＣで免疫調節に関与する可溶性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）であるＣＯＸ－２、ＮＯ、ＩＤＯとケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）タンパク質であるＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２の発現度を確認してみた結果、２つの細胞群の差異がないことが確認された（図１３のＢ）。すなわち、ＰＲＤＸ６は、ｍＭＳＣの免疫抑制能に影響を与えないことが確認された。

【0080】

（実施例１４．ＰＲＤＸ６－ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣとＰＧＥ２と関連性分析）
ＰＲＤＸ６は、二官能性タンパク質（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）と知られている。ＰＲＤＸ６は、過酸化水素を除去する機能と共に、アラキドネート（ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ）でＰＧＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）を生成させるｉＰＬＡ２（Ｃａｌｃｉｕｍ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２）を活性化させる機能も有している。ＰＲＤＸ６－ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）ｈＭＳＣとＰＧＥ２との関連性を確認するために、ｈＭＳＣにｓｉＲＮＡを処理した後、上澄み液中にあるＰＧＥ２のタンパク質水準をＥＬＩＳＡで分析し（図１４のＡ）、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）を利用してｈＭＳＣでトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離した後、ＲＴ－ＰＣＲを通じて遺伝子発現を確認した（図１４のＢ）。その後、ｈＭＳＣを添加した後、ＰＧＥ２を処理してから７２時間後にチミジン取り込み(ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ)を通じて細胞増殖を分析した（図１４のＣ）。

【0081】

ＥＬＩＳＡを利用した分析結果、ＰＲＤＸ６がノックダウンされたｈＭＳＣは、対照群に比べて細胞のＰＧＥ２が減少することが確認された（図１４のＡ）。また、ＲＴ－ＰＣＲ分析結果、ｈＭＳＣは、ＰＧＥ２受容体であるプロスタグランジンＥ２受容体（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＰ）中でＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ４を発現することが確認された（図１４のＢ）。また、ｈＭＳＣにＰＧＥ２を直接処理した後、細胞増殖を測定したが、ＰＧＥ２は、ｈＭＳＣの増殖に影響を与えないことが確認された（図１４のＣ）。結論的に、ＰＲＤＸ６は、ｉＰＬＡ２活性を通じてＰＧＥ２を生成させるが、細胞増殖とは直接的な関連がないことが確認された。

【0082】

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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