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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-08
(45)【発行日】2022-12-16
(54)【発明の名称】アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20221209BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20221209BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
C12Q1/25 ZNA
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019544509
(86)(22)【出願日】2018-09-07
(86)【国際出願番号】 JP2018033156
(87)【国際公開番号】W WO2019065156
(87)【国際公開日】2019-04-04
【審査請求日】2021-09-01
(31)【優先権主張番号】P 2017187385
(32)【優先日】2017-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000210067
【氏名又は名称】池田食研株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】510108951
【氏名又は名称】公立大学法人広島市立大学
(74)【代理人】
【識別番号】100216286
【弁理士】
【氏名又は名称】篠崎 史典
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 大祐
(72)【発明者】
【氏名】中柄 朋子
(72)【発明者】
【氏名】青木 秀之
(72)【発明者】
【氏名】喜田 幹子
(72)【発明者】
【氏名】山田 健太
(72)【発明者】
【氏名】金子 昌二
(72)【発明者】
【氏名】釘宮 章光
【審査官】中村 直子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００６－１６６７０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０１６４２６４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】KUGIMIYA, A ET AL.，Flow analysis of amino acids by using a newly developed aminoacyl-tRNA synthetase-immobilized, small reactor column-based assay，APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY，2015年11月10日，vol. 178，924 - 931
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ｃ１２Ｑ １／２５
Ｇ０１Ｎ ３３／００－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（工程Ｉ－１）二価イオン又はポリアミンの存在下、試料中のＬ体及び／又はＤ体のアミノ酸（Ｌ－ＡＡ及び／又はＤ－ＡＡ）、該ＡＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；（工程Ｉ－２）反応１又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ複合体にアミノ酸再生試薬が作用して、該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ－ＡＡ及び／又はＤ－ＡＡ）が遊離する反応（反応２）を含む工程；
（工程Ｉ－３）反応２で遊離されたアミノ酸（Ｌ－ＡＡ及び／又はＤ－ＡＡ）及び／又はＡＡＲＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
（工程Ｉ－４）工程Ｉ－２及び工程Ｉ－３を繰り返す工程、並びに、
工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきＬ体及び／又はＤ体のアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）を含み、
工程（Ｉ）の反応液中のＡＡＲＳ濃度が５．３μＭ以上であるアミノ酸定量方法であって、
工程（I）の反応液中にグリセロール、エチレングリコールおよびジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも１種の極性溶媒を添加することを特徴とするアミノ酸定量方法。
【請求項2】
ＡＡＲＳ濃度が５．３μＭ～７０μＭの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項3】
工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及び／又はアルカリ性化合物であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項4】
試料中のアミノ酸の濃度が３００μＭ～１，０００μＭの範囲である、請求項１～３のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項5】
工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド、二価イオン、該アミノ酸に対応するＡＡＲＳ及び／又は極性溶媒を含む、前記キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット等に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）は、生体内のタンパク質の構成成分として重要な役割を担っており、その種類は２０種類である。Ｌ－アミノ酸の機能性に関し多くの研究がなされ、Ｌ－アミノ酸は、医薬品、加工食品、健康食品など様々な産業で使用されている。例えば、食品中の遊離のＬ－アミノ酸は、味、加熱後の香り、保存性、摂取後の生体調節機能等に関係しており、食品科学や栄養科学分野における重要な要素として注目されている。また、近年、疾病により血液中のＬ－アミノ酸濃度が変化することが見いだされ、血液中のアミノ酸濃度を測定することで、肺がん、胃がん、大腸がんなどのがん診断を可能とするバイオマーカーとしても活用されている。
【0003】
また、アミノ酸には、Ｌ-アミノ酸の光学異性体であるＤ-アミノ酸（Ｄ-ＡＡ）が存在し、その種類は１９種類である。Ｄ-アミノ酸は、生体内に存在するも、その生理機能が明確に分かっていなかった。しかし、近年、分析技術の進展により、Ｄ-アミノ酸が分析可能となり、例えば、Ｄ-セリンが、アルツハイマー患者の脳脊髄中で多くなっている、Ｄ-アスパラギン酸が、肌の老化と共に減少する、Ｄ-アラニンが、カニ、エビの甘味に関与していることなどが分かり、Ｄ-アミノ酸の生理機能が注目されている。その為、Ｌ体やＤ体のアミノ酸定量技術は、アミノ酸を使用する製品開発、品質管理、診断などの様々な分野で必要不可欠な技術となっている。
【0004】
Ｌ-アミノ酸のアミノ酸定量技術として、アミノ酸を液体クロマトグラフィーで分離し、ニンヒドリンや蛍光誘導体化剤オルトフタルアルデヒドによる呈色反応で検出する方法が知られている。また、Ｄ-アミノ酸のアミノ酸定量技術として、Ｄ-アミノ酸を蛍光誘導体化剤オルトフタルアルデヒドとキラル誘導体化剤Ｎアシル－Ｌ－システインを加えてジアステレオマー蛍光誘導化し、液体クロマトグラフィーで分析するジアステレオマー法や２次元液体クロマトグラフィー法が知られている（非特許文献１）。しかし、該方法は、１検体の分析時間が２時間程度必要なため分析時間がかかり、多数の検体を測定するには不向きであるという問題点があった。
【0005】
別のアミノ酸定量技術として、Ｌ-アミノ酸やＤ-アミノ酸に作用する酵素を利用するアミノ酸の測定方法が知られている（特許文献１）。しかし、該方法は目的基質とするアミノ酸に対する選択性が低く、目的以外のアミノ酸にも反応する、また、２０種類（Ｄ-アミノ酸の場合、１９種類）のアミノ酸に対応する酵素がないという問題点があった。
【0006】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）は、生体内のタンパク質合成に係る酵素であり、以下の反応式１及び２に従って、アミノアシルｔＲＮＡを産生する。２０種類のＬ-アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）に対し特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在する。その為、標的とするアミノ酸及びｔＲＮＡに対する選択性が極めて高い酵素であるとされている。
【化1】
【0007】
当該反応では、ピロリン酸（ＰＰｉ）が産生されると共に、ＡＡＲＳにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、Ｌ-アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）が１分子ずつ作用することで、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）-ＡＡＲＳ複合体という反応中間体を形成する。該複合体に於いて、アミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合しているため、ｔＲＮＡ又は求核剤（アミン類）を加えて複合体を分解しない限り上記のＡＡＲＳ反応は進まないとされている（特許文献２、非特許文献２～３）。また、当該反応の反応式１において、多量のピロリン酸が産生された場合、反応式１の逆反応であるアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体がピロリン酸により分解され、アミノ酸、ＡＡＲＳ及びＡＴＰが産生されるＡＴＰ-ＰＰｉ交換反応が生じることが知られている（非特許文献４）。
【0008】
このようなＡＡＲＳが関与する反応（ＡＡＲＳ反応）を利用したＬ-アミノ酸の定量技術がこれまで開発されてきた。例えば、以下の反応式３で示される反応に基づくアミノ酸の分析方法が特許文献３に記載されている。
【化2】
【0009】
該方法に於いては、ＡＡＲＳがＡＴＰ及びＬ-アミノ酸と結合する際に生じるピロリン酸を指標とすることによりＬ-アミノ酸を分析する。しかしながら、反応式３からも分かるように、当該方法ではＡＡＲＳが1分子のＬ-アミノ酸とＡＴＰと反応し、1分子のアミノアシルＡＭＰを産生するため、試料中のＬ-アミノ酸と同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない（非特許文献５、６、７）。
【0010】
更に、反応式３では、ＡＡＲＳが触媒として機能してＡＴＰ、Ｌ-アミノ酸が1分子ずつ反応することでアミノアシルＡＭＰとピロリン酸が産生されるように表記されているが、特許文献３に記載の反応系にはｔＲＮＡが含まれていないので反応式２が進行せず、実際には、反応式１によってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体が形成されているものと考えられる（特許文献２、段落番号００１３～００１６）。その結果、1分子のＡＡＲＳから1分子のピロリン酸しか産生されないと考えられる。従って、ピロリン酸を測定することで試料中に含まれるＬ-アミノ酸の定量を可能とするには多量のＡＡＲＳが必要とされることが、特許文献２の上記箇所に加えて、特許文献３の発明者自身によっても認められている（特許文献３の段落番号００４６、非特許文献５）。
【0011】
以上の結果、Ｌ-アミノ酸に対して産生されるピロリン酸の量が少ないため、該方法のアミノ酸の定量範囲は、イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）法では３００μＭ～９００μＭとアミノ酸の高濃度領域で定量可能であり、また、アミノ酸低濃度領域の測定では、多段階酵素反応を用いた蛍光法による高感度分析を行うことによって、１μＭ～２５０μＭの範囲での定量が可能となっている（非特許文献６、７、８）。しかしながら、高感度分析はコストがかかる上に、ピロリン酸を多段階の酵素反応により検出しているため、煩雑であるとともに、血中の夾雑物やその他の外部要因により各酵素が影響を受けやすいことが懸念される。
【0012】
更に、反応式１と２のＡＡＲＳ反応に基づくＬ-アミノ酸の定量方法が上記の特許文献２に記載されている。即ち、前述の通りアミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合してアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成している。そこで、この方法では、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンなどのアミン類（求核剤）を添加することで、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とし、その結果、少量のＡＡＲＳでＬ-アミノ酸を定量することを特徴とする。該方法のアミノ酸の定量範囲は、５μＭ～２００μＭであるとされている。しかしながら、特許文献２に記載の方法は、該複合体分解試薬が複合体のＬ-アミノ酸と反応して化合物が産生される（例えば、特許文献２の段落番号００３７に示されるように、該複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンを使用した場合は、「アミノ酸ヒドロキサム酸」が産生される）ため、Ｌ-アミノ酸は再利用することが出来ず、その結果、試料中のＬ-アミノ酸と同等量の産生物であるピロリン酸しか得られない（特許文献２の段落番号００２３）。さらに該方法は、ＡＡＲＳ反応で生じたピロリン酸を多段階の酵素反応により検出しているため、煩雑であるとともに、血中の夾雑物やその他の外部要因により各酵素が影響を受けやすいことが懸念される。
【0013】
一方、別のＡＡＲＳ反応としては、例えば、以下の反応式４と５の反応が知られている。当該反応では、ＡＡＲＳにＡＴＰ及びＬ-アミノ酸が１分子ずつ作用することで、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成する。次いで該複合体にＡＴＰ、ＧＴＰ等を作用させることによって、医薬品や医薬品原料として期待されているジアデノシン四リン酸（Ａｐ４Ａ）等のジアデノシンポリリン酸（ＡｐｎＡ）及びアデノシングアノシンテトラリン酸（Ａｐ４Ｇ）等が合成・製造されている（特許文献４、特許文献５、非特許文献９、非特許文献１０）。
【化3】
【0014】
これら公知文献には、ＡＡＲＳの種類によってＡｐｎＡの合成能は異なり、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のトリプトファンやアルギニンのＡＡＲＳでは、反応式５の反応が進まずＡｐ４Ａが合成されないことが記載されている。また、当該反応の反応式４は、ピロリン酸の存在下では逆反応が促進され、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からアミノ酸、ＡＡＲＳ及びＡＴＰが産生される。その為、当該反応を進めるためには、逆反応を生じなくさせる必要があり、上記の公知文献に記載の技術では、反応式４で産生されるピロリン酸を分解するため、ピロリン酸を分解する無機ピロホスファターゼが使用されている。更に、これら公知文献に記載された技術は、あくまで、ＡｐｎＡ及びＡｐ４Ｇ等の合成・製造に関するものであって、アミノ酸の定量に関する技術的課題を解決することを目的とするものではない。実際に、これら公知文献には、上記の反応式４と５のＡＡＲＳ反応を活用したアミノ酸の定量については何ら言及されておらず、反応式５に於いて生じるアミノ酸及びＡＡＲＳの再利用に関しても一切触れられていない。
【0015】
ＡＡＲＳは、２０種類のＬ-アミノ酸に対し特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在することが知られている。このＡＡＲＳが、Ｄ-アミノ酸に対し作用することは一部のＡＡＲＳに関し報告されている（非特許文献１１）。しかし、該文献は、ＡＡＲＳがＤ-アミノ酸に作用し、ｔＲＮＡに受け渡すことに関するものであって、Ｄ-アミノ酸の定量に関する技術的課題を解決することを目的とするものではない。実際に、該文献には、上記の反応式４と５のＡＡＲＳ反応を活用したＤ-アミノ酸の定量については何ら言及されておらず、反応式５に於いて生じるＤ-アミノ酸及びＡＡＲＳの再利用に関しても一切触れられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0016】
【文献】特開２０１３－１４６２６４号公報
【文献】特許５３０５２０８号明細書
【文献】特開２０１１－５０３５７号公報
【文献】特開２０００－６９９９０号公報
【文献】特許３１３５６４９号明細書
【非特許文献】
【0017】
【文献】“化学と生物”、（日本）、２０１５年、Ｖｏｌ.５３、ｐ．１９２－１９７
【文献】“ヴォート 生化学（下）”、（日本）、第３版、１０２４－１０２９
【文献】Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ., ２４１, ８３９－８４５, １９６６
【文献】“日本結晶学会誌”、（日本）、２０１０年、Ｖｏｌ.５２、ｐ．１２５－１３２
【文献】“広島市立大学情報科学研究科創造科学専攻 釘宮章光”[online]、 広島市立大ホームページ、［2016/01/13検索］、インターネット（URL:http://rsw.office.hiroshima-cu.ac.jp/Profiles/2/000129/profile.html）
【文献】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ., ４４３, ２２－２６, ２０１３
【文献】Ａｐｐl. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏl., １７４, ２５２７－２５３６, ２０１４
【文献】Ｊ．Ｃｈｅｍ.Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．６，３９７－４００，２０１２
【文献】“東京医科大学雑誌”、（日本）、１９９３年、Ｖｏｌ.５１、ｐ．４６９－４８０
【文献】Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ５３, ６１５－６２３, １９８９
【文献】Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ６９, １０４０－１０４１, ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明は、上記のＬ体及びＤ体のアミノ酸定量法に関する従来技術に於ける様々な問題点を解決し、ＡＡＲＳを用いて、測定対象のＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸を、選択的且つ簡便、短時間及び高感度で、広範囲なアミノ酸濃度範囲で定量することが出来る方法、及びアミノ酸定量用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0019】
発明者らは、種々の検討を行った結果、ＡＡＲＳを用いて試料中のアミノ酸量を定量する方法に於いて、図１に示すように、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物が、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生され得ることを見出し、本発明を完成させた。
【0020】
本発明は、以下の［１］～［７］の態様に関する。
［１］（工程Ｉ－１）二価イオン又はポリアミンの存在下、試料中のＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）、該ＡＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ－２）反応１又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体にアミノ酸再生試薬が作用して、該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）が遊離する反応（反応２）を含む工程；
（工程Ｉ－３）反応２で遊離されたアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）及び/又はＡＡＲＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
（工程Ｉ－４）工程Ｉ－２及び工程Ｉ－３を繰り返す工程、並びに、
工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）を含む、試料中のアミノ酸定量方法であって、
工程（I）の反応液中のＡＡＲＳ濃度が５.３μＭ以上であることを特徴とする、前記アミノ酸定量方法。
［２］ＡＡＲＳ濃度が５.３μＭ～７０μＭの範囲であることを特徴とする、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［３］工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及び/又はアルカリ性化合物であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載のアミノ酸定量方法。
［４］工程（I）の反応液中に極性溶媒を添加することを特徴とする、［１］～［３］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［５］試料中のアミノ酸の濃度が３００μＭ～１，０００μＭの範囲である、［１］～［４］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［６］工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［７］［１］～［６］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド、二価イオン、該アミノ酸に対応するＡＡＲＳ及び／又は極性溶媒を含む、前記キット。
［１］（工程Ｉ－１）二価イオン又はポリアミンの存在下、試料中のＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）、該ＡＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ－２）反応１又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体にアミノ酸再生試薬が作用して、該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）が遊離する反応（反応２）を含む工程；
（工程Ｉ－３）反応２で遊離されたアミノ酸（Ｌ-ＡＡ及び/又はＤ-ＡＡ）及び/又はＡＡＲＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
（工程Ｉ－４）工程Ｉ－２及び工程Ｉ－３を繰り返す工程、並びに、
工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきＬ体及び/又はＤ体のアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）を含む、試料中のアミノ酸定量方法であって、
工程（I）の反応液中のＡＡＲＳ濃度が５.３μＭ以上であることを特徴とする、前記アミノ酸定量方法。
［２］ＡＡＲＳ濃度が５.３μＭ～７０μＭの範囲であることを特徴とする、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［３］工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及び/又はアルカリ性化合物であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載のアミノ酸定量方法。
［４］工程（I）の反応液中に極性溶媒を添加することを特徴とする、［１］～［３］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［５］試料中のアミノ酸の濃度が３００μＭ～１，０００μＭの範囲である、［１］～［４］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［６］工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［７］［１］～［６］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド、二価イオン、該アミノ酸に対応するＡＡＲＳ及び／又は極性溶媒を含む、前記キット。
【発明の効果】
【0021】
本発明に係るアミノ酸定量方法に於いては、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸（Ｌ体及び／又はＤ体のアミノ酸）を遊離させ、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることができる。その結果、従来技術に比べてより簡便な手段でこれら反応産生物を測定する場合であっても、短時間且つ、従来技術の多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲以上の広い範囲での定量が可能となる。
【0022】
従って、本発明によって、ＡＡＲＳを用いた、測定対象のアミノ酸を選択的且つ簡便、短時間、高感度、例えば、３００μＭ～１，０００μＭのような高濃度の範囲を含む、広範囲なアミノ酸定量範囲を可能とする定量方法及びアミノ酸定量用キットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明の反応工程を示す図である。
【図2-1】本発明とＡＡＲＳ低濃度条件でのＬ－アミノ酸を用いたＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸産生量の比較を示す図である。
【図2-2】同上。
【図3-1】モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるＬ－アミノ酸での検量線を示す図である。
【図3-2】同上。
【図4】極性溶媒添加と非添加におけるＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸産生量の比較を示す図である。
【図5】本発明とＡＡＲＳ低濃度条件でのＤ－アミノ酸を用いたＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸産生量の比較を示す図である。
【図6】モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるＤ－アミノ酸での検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明方法の反応１及び反応３では、アミノ酸、該アミノ酸に対応するＡＡＲＳ、及びＡＴＰを反応させて、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成させる。本発明方法に使用するＡＡＲＳは、２０種類のアミノ酸に対し特異的に作用するＡＡＲＳを用いる。例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）であれば、ヒスチジンに特異的に作用するＡＡＲＳ（ＨｉｓＲＳ）、セリン（Ｓｅｒ）であれば、セリンに特異的に作用するＡＡＲＳ（ＳｅｒＲＳ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）であれば、トリプトファンに特異的に作用するＡＡＲＳ（ＴｒｐＲＳ）などが挙げられる。また、本発明に使用するＡＡＲＳは、ウシ、ラット、マウスなどの動物由来、Ｌｕｐｉｎ Ｓｅｅｄ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｕｓなどの植物由来、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属（好熱菌）及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属（好熱菌）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの微生物由来など、生物由来のＡＡＲＳであれば、いずれのＡＡＲＳでも良く、特に取扱及び生産性の面の観点から、微生物由来のＡＡＲＳが好ましい。また、組換え型ＡＡＲＳでも良く、合成したＡＡＲＳでも良い。可溶性酵素が好ましいが、不溶性酵素に界面活性剤を組み合わせても良く、可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素でも良い。ＡＡＲＳの公知のアミノ酸配列を利用でき、組換え型のＡＡＲＳは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の同一性を有する配列を有し、ＡＡＲＳ活性を有する蛋白質を使用しても良い。
【0025】
本発明に使用するＡＡＲＳの調製方法としては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、ＡＡＲＳを含む対象物に加水し、粉砕機、超音波破砕機などで粉砕後、破砕した破砕物を遠心分離、濾過などで固形物を取り除いた抽出物、さらに当該抽出物をカラムクロマトグラフィーなどにより精製、単離したＡＡＲＳなどを用いることができる。即ち、本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体中からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させて、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、ＡＡＲＳの調製方法は何ら限定されるものではない。
【0026】
本発明に使用する試料に特に制限はなく、例えば、血液、生鮮食品、加工食品及び飲料などがあげられる。各試料中のアミノ酸濃度は、各アミノ酸により異なる。例えば、血液中のアミノ酸濃度は、グルタミン酸は、１１～４４ｎｍｏｌ／ｍＬ、メチオニンは、１９～３３ｎｍｏｌ／ｍＬ、トリプトファンは、４１～６６ｎｍｏｌ／ｍＬ、チロシンは、５０～８３ｎｍｏｌ／ｍＬ、セリンは、９２～１６２ｎｍｏｌ／ｍＬ、ヒスチジンは、６８～９７ｎｍｏｌ／ｍＬ、リジンは、１１９～２５７ｎｍｏｌ／ｍＬ、グルタミンは、４８８～７３３ｎｍｏｌ／ｍＬ、アラニンは、２４０～５１０ｎｍｏｌ／ｍＬなどである。生鮮食品中の遊離アミノ酸含量は、例えば、ニンニクでは、リジンは、５ｍｇ／１００ｇ、アルギニンは、１３６ｍｇ／１００ｇ、セリンは、６ｍｇ／１００ｇなどである。トマトでは、グルタミンは、９４ｍｇ／１００ｇ、プロリンは、１０６ｍｇ／１００ｇなどである。乾燥シイタケでは、グルタミン酸は、３８６ｍｇ／１００ｇ、スレオニンは、２６８ｍｇ／１００ｇ、セリンは、４６ｍｇ／１００ｇなどである。また、果物のＬ体とＤ体のアミノ酸含量は、リンゴでは、Ｌ体のアスパラギンは、２,０７１μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のアスパラギンは、１５μｍｏＬ／Ｌ、Ｌ体のアラニンは、１０５μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のアラニンは、３μｍｏＬ／Ｌ、パイナップルでは、Ｌ体のアスパラギンは、３,１０９μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のアスパラギンは、２５μｍｏＬ／Ｌ、Ｌ体のバリンは、２０２μｍｏＬ／Ｌ、Ｄ体のバリンは、２μｍｏＬ／Ｌなどである。加工食品や飲料中の遊離アミノ酸含量は、例えば、醤油では、リジンは、２１３ｍｇ／１００ｇ、ヒスチジンは、１０４ｍｇ／１００ｇ、グルタミン酸は、７８２ｍｇ／１００ｇなどである。煎茶では、セリンは、１０７ｍｇ／１００ｇ、アルギニンは、３１４ｍｇ／１００ｇ、グルタミン酸は、２５８ｍｇ／１００ｇなどである。コーヒー生豆ロブスタ種の完熟では、リジンは、１０ｍｇ／１００ｇ、ヒスチジンは、４８ｍｇ／１００ｇ、セリンは、４３ｍｇ／１００ｇなどである。これら各試料中の予想されるアミノ酸濃度によって、適宜、希釈調製し、本発明の試料として使用できる。
【0027】
本発明に使用する試料中のアミノ酸には、Ｌ体及びＤ体が混在してもよい。そのような場合には、例えば、本発明方法における前処理として、Ｌ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去するのが好ましい。Ｌ体又はＤ体の何れか一方を除去する方法として、カラムクロマトグラフィー又は適当な酵素によるＬ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去する等、当業者に公知の任意の方法が挙げられる。尚、生体試料には、Ｌ体及びＤ体が混在するが、哺乳類体内中の殆どのＤ体アミノ酸は、Ｌ体アミノ酸の０.１～１.０％程度、果物では、Ｄ体アミノ酸は、Ｌ体アミノ酸の３.０％以下であり、生体試料中のＤ体アミノ酸含量は、Ｌ体アミノ酸の定量に影響を与えるほど含有していない。
【0028】
本発明方法の工程（I）の当該反応に使用される反応液中のＡＡＲＳ濃度は５.３μＭ以上であることを特徴とし、試料の種類、推定される試料中のアミノ酸濃度、ＡＴＰ濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属などの微生物由来のＡＡＲＳの濃度は、好ましくは７.０μＭ以上、より好ましくは１０．０μＭ以上、さらに好ましくは１５．０μＭ以上、特に好ましくは５０．０μＭ以上、最も好ましくは７０.０μＭ以上とすることができる。本発明方法では、ＡＡＲＳを繰り返し使用されるので、ＡＡＲＳ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。従って、反応液中のＡＡＲＳ濃度は、例えば、５.３μＭ～７０μＭの範囲とすることが出来る。
【0029】
本発明方法の反応１又は反応３ではＡＡＲＳと共にＡＴＰ、二価イオンを用いる。本発明に使用するＡＴＰは、ナトリウム塩、リチウム塩などが使用できる。当該反応に使用される反応液中のＡＴＰの濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ヌクレオチド濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、予想される試料中のアミノ酸濃度に対して過剰となるように添加するのが好ましい。例えば試料が血液の場合、ＡＴＰ濃度は、好ましくは２５ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上、更に好ましくは１５０ｍＭ以上、最も好ましくは２５０ｍＭ以上とすることができる。尚、ＡＴＰ濃度の上限は、経済性及び反応系の平衡条件なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
【0030】
本発明に使用する二価イオンは、マグネシウム、マンガン、コバルト、カルシウム、亜鉛などが使用できる。二価イオンは、ＡＡＲＳにより要求性が異なるため、使用するＡＡＲＳに適した二価イオンを適宜使用すれば良いが、ＡＡＲＳ共通に要求性のあるマグネシウムの使用がより好ましい。さらには二価イオンと同様な作用をするスペルミン、スペリミジン、プトレッシンなどのポリアミンも使用できる。当該反応に使用される反応液中の二価イオンの濃度は、適宜決められるが、ＡＴＰ濃度に対して同等以上に添加するのが好ましい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属などの微生物由来のＡＡＲＳにおけるＡＴＰ濃度：二価イオン濃度の比率は、少なくとも１：１以上、より好ましくは少なくとも１：３以上、さらに好ましくは少なくとも１：５以上、特に好ましくは少なくとも１：７以上、最も好ましくは少なくとも１：１０以上とすることができる。
【0031】
続いて、本発明方法の反応２では、反応１及び反応３で形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体に対しアミノ酸再生試薬が作用し、該複合体が分解されて該複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸が遊離する。当該反応のアミノ酸再生試薬としては、ＡＴＰ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）などから任意に選択される一種又はそれらの組み合わせからなるヌクレオチドや、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム及び緩衝剤などの水酸化物イオンを発生するアルカリ性化合物を使用できる。当該反応に使用される反応液中のアミノ酸再生試薬の濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ＡＴＰ濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、反応１で使用するＡＴＰと当該反応に使用するヌクレオチドの総量は試料中のアミノ酸濃度に対して過剰に添加するのが好ましい。例えば試料が血液の場合、ヌクレオチド濃度は、好ましくは２５ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上、更に好ましくは１５０ｍＭ以上、最も好ましくは２５０ｍＭ以上とすることができる。ヌクレオチド濃度の上限は、経済性及び反応系の平衡条件なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。また、アルカリ性化合物は、反応の場（反応系）をｐＨ７以上にできれば良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のＡＡＲＳの場合では、好ましくはｐＨ７.０以上、より好ましくはｐＨ７.５以上、さらに好ましくは、ｐＨ８.０以上とすることができる。尚、反応ｐＨは、当業者に公知の任意の緩衝剤である、ＨＥＰＥＳバッファー、ＣＨＥＳバッファー、ＣＡＰＳバッファー、ＴＲＩＳバッファー、ＭＯＰＳバッファーなどを使用して調整することが出来る。従って、本発明方法では、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とさせるために、特許文献２に記載されているようなアミン類等のアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬を添加する必要がなく、更に、遊離したアミノ酸が該試薬と反応することがないので、遊離したアミノ酸をアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に再び利用することができる。
【0032】
本発明方法の反応３では、反応２で遊離したアミノ酸及び/又はＡＡＲＳを反応１において再び使用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体反応を形成させる。更に、本発明方法の工程（Ｉ）において、当業者に公知の任意の方法によって、反応１又は３で生じたピロリン酸及び反応系中のＡＭＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸ジキナーゼとを反応させることによって産生されるＡＴＰを、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体形成及び該複合体からのＡＡＲＳ及びアミノ酸の遊離に再利用すること、及び/又は、反応２でヌクレオチドから生成されるＡｐ４Ａに対しＡｐ４Ａピロホスホヒドラーゼを作用させることによって産生されるＡＤＰを、反応２におけるヌクレオチドとして再利用することもできる。
【0033】
例えば、反応２で作用するヌクレオチドとしてＡＴＰを選択し、更に、上記のような反応を利用してＡＴＰの再産生をしない場合には、本明細書の実施例に示されるように、工程（Ｉ）の反応系全体では、上記に示したＡＴＰ及びヌクレオチドの夫々の濃度を合計したより高濃度のＡＴＰを添加することが好ましい。
【0034】
以上の結果、前述のアミノ酸再生試薬（ＡＴＰなどのヌクレオチド及び/又は、アルカリ性化合物）及び該アミノ酸に対応するＡＡＲＳの組成等の反応条件において、工程（Ｉ）に於ける反応の結果、ピロリン酸及び/又は水素イオン等の夫々の反応産生物の各々について、試料中に含まれている測定対象のアミノ酸のモル数より多いモル数の分子が産生され得る。その結果、本発明方法では、簡便な測定方法を用いた場合でも従来技術より高濃度である１ｍＭ程度の極めて高いアミノ酸濃度まで定量可能となる。従って、この点は従来技術と比較して本発明の顕著な効果といえる。
【0035】
本発明方法の工程（Ｉ）における反応温度は、各反応が生じるような任意の温度で良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のＡＡＲＳの場合、好ましくは１０～８０℃、より好ましくは２０～７０℃、最も好ましくは３０～６０℃とすることが適している。Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のＡＡＲＳの場合では、好ましくは１０～１００℃、より好ましくは、３０～９８℃、最も好ましくは、５０～９５℃とすることが適している。また、当該反応時間も試料中のアミノ酸とＡＡＲＳ反応が生じるような任意の時間で良いが、好ましくは３０秒以上、より好ましくは４５秒以上、さらに好ましくは、１分以上、特に好ましくは５分以上、最も好ましくは１０分以上であることが望ましい。
【0036】
更に、本発明方法の工程（I）の反応系に極性溶媒を添加する(共存させる)ことによって、更に、反応産生物の量を増加させることが出来る。極性溶媒としては、プロトン性極性溶媒であるグリセロール、エチレングリコールなど、非プロトン性極性溶媒であるジメチルスルホキシドなど当業者に公知の化合物が使用できる。当該反応に使用される反応液中の極性溶媒の濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ヌクレオチド濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば試料が血液の場合、極性溶媒濃度は、好ましくは１～７０重量％、より好ましくは、５～６０重量％、最も好ましくは、１０～５０重量％とすることが適している。
【0037】
本発明方法の工程（Ｉ）に含まれる各工程で使用する試薬・酵素等の各反応成分は、ＡＡＲＳ反応が生じる添加方法である限り、当業者に公知の任意の手段・手順等で反応系に添加することができる。例えば、各成分を反応開始前に一度に反応系に予め添加するか、又は、ＡＡＲＳ又はアミノ酸を最後に添加し反応させても良い。
【0038】
本発明方法の工程（ＩＩ）では、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸及び水素イオン等の各反応産生物の夫々の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定する。工程（ＩＩ）は、測定方法等に応じて、工程（Ｉ）に於ける試料中のアミノ酸とＡＡＲＳとの反応を、例えば、トリクロロ酢酸を反応系に添加する等の当業者に公知の任意の方法・手段で停止させた後、あるいは、工程（Ｉ）に於ける反応が進行中の任意の段階で適宜、実施することが出来る。
【0039】
本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸量の測定には、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、モリブデン酸とピロリン酸を反応させ産生した青色の錯体の吸光度を測定するモリブデンブルー法、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒドロゲナーゼを組み合わせる方法、ルミノールと無機ピロホスファターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを組み合わせ産生物の発光を測定する方法などのピロリン酸を測定できる酵素法などが使用できる。また、酵素反応などで酸化還元反応を起こし、その酸化還元反応に由来する電流値を検出する多電極電位計測計により電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。さらに、当該反応で産生された水素イオンの測定には、水素イオンを検出するガラス電極やイオン感応性電界効果トランジスタにより電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、水素イオンなどは、反応溶液から分離し、測定することができる。反応溶液からのピロリン酸、水素イオンなどの分離方法としては、測定に影響の無い方法であれば特に限定されないが、例えば、酸処理による除タンパク質、ペーパークロマトグラフィー分離、マイクロ流体デバイスでの分離などが挙げられる。本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体中からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させて、これら化合物を、再度、該複合体の形成に繰り返し利用することにより、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させ、かつ１～１,０００μＭの低濃度から高濃度の広い範囲のアミノ酸を短時間に定量するものであり、反応産生物の量の測定方法は何ら限定されるものではない。
【0040】
本発明は、上記の本発明方法を実施するための、試料中のアミノ酸定量に必要な前述の各成分を含む、アミノ酸定量用キットを提供する。当該キットは、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めても良い。測定に影響の無い成分であれば特に限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、糖類、糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、酸化防止剤、界面活性剤、又は酵素と作用性のないアミノ酸類等を例示できる。また、当該キットの一例として前述のピロリン酸や水素イオンを測定するためのキットを挙げることが出来る。
【実施例】
【0041】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例1】
【0042】
（大腸菌由来のＡＡＲＳの調製）
大腸菌Ｋ１２由来の変異株（ＮＢＲＣ３９９２）のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を形質転換し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、ＩＰＴＧを添加して２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。さらに遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＴｙｒＲＳ（配列番号１）、ＶａｌＲＳ（配列番号２）、ＴｒｐＲＳ（配列番号３）、ＩｌｅＲＳ（配列番号４）、及びＬｙｓＲＳ（配列番号５）を得た。
大腸菌Ｋ１２由来の変異株（ＮＢＲＣ３９９２）のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を形質転換し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、ＩＰＴＧを添加して２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。さらに遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＴｙｒＲＳ（配列番号１）、ＶａｌＲＳ（配列番号２）、ＴｒｐＲＳ（配列番号３）、ＩｌｅＲＳ（配列番号４）、及びＬｙｓＲＳ（配列番号５）を得た。
【実施例2】
【0043】
（好熱菌由来のＡＡＲＳの調製）
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８（ＮＢＲＣ１００８２６、ＪＣＭ１００９９、ＡＴＣＣ４３５８９、ＤＳＭ３１０９）由来のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を形質転換し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。調製した無細胞抽出液を７０℃、１５分の熱処理を行った後、遠心分離を行った。得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで 残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＨｉｓＲＳ（配列番号６）を得た。
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８（ＮＢＲＣ１００８２６、ＪＣＭ１００９９、ＡＴＣＣ４３５８９、ＤＳＭ３１０９）由来のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株を形質転換し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＴＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。調製した無細胞抽出液を７０℃、１５分の熱処理を行った後、遠心分離を行った。得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで 残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＨｉｓＲＳ（配列番号６）を得た。
【実施例3】
【0044】
（Ｌ－アミノ酸を用いたピロリン酸産生量の比較）
５０ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、５３０ｍＭ ＡＴＰ、１，０６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５.３μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液、又は、５０ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、４２４ｍＭ ＡＴＰ、１，５９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５.３μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１及び２を調製した。
５０ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、５３０ｍＭ ＡＴＰ、１，０６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５.３μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液、又は、５０ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、４２４ｍＭ ＡＴＰ、１，５９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５.３μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１及び２を調製した。
【0045】
（比較例１）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１を調製した。
【実施例4】
【0046】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＣｏＣｌ２、１００μＭ Ｌ-トリプトファン、７０μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３を調製した。
【0047】
（比較例２）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品２を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品２を調製した。
【実施例5】
【0048】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭ ＡＴＰ、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-ヒスチジン、５.３μＭ ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品４を調製した。
【0049】
（比較例３）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-ヒスチジン、５μＭ ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品３を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-ヒスチジン、５μＭ ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品３を調製した。
【実施例6】
【0050】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＣｏＣｌ２、１００μＭ Ｌ-リジン、１０μＭ ＬｙｓＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品５を調製した。
【0051】
（比較例４）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＡＴＰ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-リジン、５μＭ ＬｙｓＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品４を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＡＴＰ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ｌ-リジン、５μＭ ＬｙｓＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品４を調製した。
【実施例7】
【0052】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：ピロリン酸産生量の比較）
実施例３、４、５、６及び比較例１、２、３、４で調製した実施品１～５及び比較品１～４の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、Ｌ-アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図２に示す通り、実施品１～５では比較品１～４（５μＭのＡＡＲＳを使用）の２倍以上、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値の５倍以上のピロリン酸が産生されていた。従って、高濃度のＡＡＲＳ、及びそれに応じた高濃度のＡＴＰ及び/又は二価イオンを使用する本発明の方法によれば、比較例に比べ、ピロリン酸産生量を著しく増幅できることが示された。
実施例３、４、５、６及び比較例１、２、３、４で調製した実施品１～５及び比較品１～４の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、Ｌ-アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図２に示す通り、実施品１～５では比較品１～４（５μＭのＡＡＲＳを使用）の２倍以上、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値の５倍以上のピロリン酸が産生されていた。従って、高濃度のＡＡＲＳ、及びそれに応じた高濃度のＡＴＰ及び/又は二価イオンを使用する本発明の方法によれば、比較例に比べ、ピロリン酸産生量を著しく増幅できることが示された。
【実施例8】
【0053】
（反応時間の比較）
２００ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、８２．５ｍＭ ＡＴＰ、３８５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５.５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品６を調製した。
２００ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、８２．５ｍＭ ＡＴＰ、３８５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５.５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品６を調製した。
【0054】
（比較例５）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、１０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品５を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、１０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品５を調製した。
【実施例9】
【0055】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＣｏＣｌ２、５０μＭ Ｌ-トリプトファン、５.５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、２．５分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品７を調製した。
【0056】
（比較例６）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｌ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、１２分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品６を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｌ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、１２分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品６を調製した。
【実施例10】
【0057】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：反応時間の比較）
実施例８、９及び比較例５、６で調製した実施品６、７及び比較品５、６のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、表１及び表２に示す通り、実施品６、７は比較品５、６（５μＭのＡＡＲＳを使用）に比べ３分の１以下の短時間で同量のピロリン酸が産生された。従って、高濃度のＡＡＲＳ、及びそれに応じた高濃度のＡＴＰ濃度及び/又は二価イオンを使用する本発明の方法によれば、比較例に比べ短時間でアミノ酸濃度の測定が可能であることが示された。
実施例８、９及び比較例５、６で調製した実施品６、７及び比較品５、６のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、表１及び表２に示す通り、実施品６、７は比較品５、６（５μＭのＡＡＲＳを使用）に比べ３分の１以下の短時間で同量のピロリン酸が産生された。従って、高濃度のＡＡＲＳ、及びそれに応じた高濃度のＡＴＰ濃度及び/又は二価イオンを使用する本発明の方法によれば、比較例に比べ短時間でアミノ酸濃度の測定が可能であることが示された。
【0058】
【表1】
【0059】
【表2】
【実施例11】
【0060】
（Ｌ－アミノ酸を用いたアミノ酸の測定範囲の比較）
１５０ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、３１８ｍＭ ＡＴＰ、１,０６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、６００μＭ、８００μＭまたは１,０００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５．３μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品８）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、６００μＭ、８００μＭまたは１,０００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品７）。その結果、図３に示す通り、５μＭのＴｙｒＲＳしか使用しない比較品７の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.８６に低下したが、５．３μＭのＴｙｒＲＳを使用し、それに応じてＡＴＰ濃度及び二価イオン濃度を高めた本発明の方法では、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９６）が認められた。
１５０ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、３１８ｍＭ ＡＴＰ、１,０６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、６００μＭ、８００μＭまたは１,０００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５．３μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品８）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、６００μＭ、８００μＭまたは１,０００μＭ Ｌ-チロシン二ナトリウム二水和物、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品７）。その結果、図３に示す通り、５μＭのＴｙｒＲＳしか使用しない比較品７の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.８６に低下したが、５．３μＭのＴｙｒＲＳを使用し、それに応じてＡＴＰ濃度及び二価イオン濃度を高めた本発明の方法では、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９６）が認められた。
【実施例12】
【0061】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＣｏＣｌ２、０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、６００μＭまたは８００μＭ Ｌ-トリプトファン、７０μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品９）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭまたは６００μＭ Ｌ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品８）。その結果、図３に示す通り、５μＭのＴｒｐＲＳしか使用しない比較品８の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.９１に低下したが、７０μＭのＴｒｐＲＳを使用した本発明の方法は、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９７）が認められた。
【実施例13】
【0062】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭ ＡＴＰ、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭまたは６００μＭ Ｌ-ヒスチジン、１５μＭ ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品１０）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、または６００μＭ Ｌ-ヒスチジン、５μＭ ＨｉｓＲＳ（好熱菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、７０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品９）。その結果、図３に示す通り、５μＭのＨｉｓＲＳしか使用しない比較品９の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.８１に低下したが、１５μＭのＨｉｓＲＳを使用した本発明の方法は、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９６）が認められた。
【実施例14】
【0063】
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＣｏＣｌ２、０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭまたは６００μＭ Ｌ-リジン、１０μＭ ＬｙｓＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品１１）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＡＴＰ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、または６００μＭ Ｌ-リジン、５μＭ ＬｙｓＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品１０）。その結果、図３に示す通り、５μＭのＬｙｓＲＳしか使用しない比較品１０の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.８９に低下したが、１０μＭのＬｙｓＲＳを使用した本発明の方法は、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９７）が認められた。
【実施例15】
【0064】
（極性溶媒添加の影響）
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＡＴＰ、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＺｎＳＯ4、１００μＭ Ｌ-バリン、１０μＭ ＶａｌＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液（比較品１１）、及び、１００Ｍ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＡＴＰ、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＺｎＳＯ4、１００μＭ Ｌ-バリン、１０μＭ ＶａｌＲＳ（大腸菌由来）に更に、５０％ グリセロール、１０％ エチレングリコール、又は、１０％ ジメチルスルホキシドを含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１２～１４を調製した。
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＡＴＰ、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＺｎＳＯ4、１００μＭ Ｌ-バリン、１０μＭ ＶａｌＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液（比較品１１）、及び、１００Ｍ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ ＡＴＰ、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＺｎＳＯ4、１００μＭ Ｌ-バリン、１０μＭ ＶａｌＲＳ（大腸菌由来）に更に、５０％ グリセロール、１０％ エチレングリコール、又は、１０％ ジメチルスルホキシドを含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１２～１４を調製した。
【実施例16】
【0065】
１００ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、４０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、３０μＭ Ｌ-イソロイシン、１０μＭ ＩｌｅＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液（比較品１２）、及び、１００ｍＭ ＭＯＰＳ－ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、４０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、３０μＭ Ｌ-イソロイシン、１０μＭ ＩｌｅＲＳ（大腸菌由来）に更に、６０％ グリセロール、３０％ エチレングリコール、又は、３０％ ジメチルスルホキシドを含む反応溶液を２００μＬ調製し、６０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１５～１７を調製した。
【実施例17】
【0066】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：極性溶媒添加の影響）
実施例１５、１６で調製した実施品１２～１７及び比較品１１、１２のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図４に示す通り、極性溶媒を添加しない場合に比べ、極性溶媒を添加した場合、ピロリン酸生産量が増加していた。このことから、極性溶媒が、ＡＡＲＳ反応でのピロリン酸産生量を増加させることが示された。
実施例１５、１６で調製した実施品１２～１７及び比較品１１、１２のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図４に示す通り、極性溶媒を添加しない場合に比べ、極性溶媒を添加した場合、ピロリン酸生産量が増加していた。このことから、極性溶媒が、ＡＡＲＳ反応でのピロリン酸産生量を増加させることが示された。
【実施例18】
【0067】
（Ｄ－アミノ酸を用いたピロリン酸産生量の比較）
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、７５ｍＭ ＡＴＰ、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｄ-チロシン、１０μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１８を調製した。
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、７５ｍＭ ＡＴＰ、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｄ-チロシン、１０μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１８を調製した。
【0068】
（比較例７）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、４０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｄ-チロシン、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１３を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、４０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｄ-チロシン、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１３を調製した。
【実施例19】
【0069】
２００ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＣｏＣｌ２、５０μＭ Ｄ-トリプトファン、１０μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１９を調製した。
【0070】
（比較例８）
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｄ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１４を調製した。
ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｄ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１４を調製した。
【実施例20】
【0071】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：ピロリン酸産生量の比較）
実施例１８、１９及び比較例７、８で調製した実施品１８、１９及び比較品１３、１４の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、Ｄ-アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図５に示す通り、実施品１８、１９では比較品１３、１４（５μＭのＡＡＲＳを使用）の約３倍以上、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値の５倍以上のピロリン酸が産生されていた。従って、高濃度のＡＡＲＳ、及びそれに応じた高濃度のＡＴＰ及び/又は二価イオンを使用する本発明の方法によれば、比較例に比べ、ピロリン酸産生量を著しく増幅できることが示された。
実施例１８、１９及び比較例７、８で調製した実施品１８、１９及び比較品１３、１４の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、Ｄ-アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図５に示す通り、実施品１８、１９では比較品１３、１４（５μＭのＡＡＲＳを使用）の約３倍以上、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値の５倍以上のピロリン酸が産生されていた。従って、高濃度のＡＡＲＳ、及びそれに応じた高濃度のＡＴＰ及び/又は二価イオンを使用する本発明の方法によれば、比較例に比べ、ピロリン酸産生量を著しく増幅できることが示された。
【実施例21】
【0072】
（Ｄ－アミノ酸を用いたアミノ酸の測定範囲の比較）
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、７５ｍＭ ＡＴＰ、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは１６０μＭ Ｄ-チロシン、１０μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例２０に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品２０）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、４０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは１６０μＭ Ｄ-チロシン、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例２０に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品１５）。その結果、図６に示す通り、５μＭのＴｙｒＲＳしか使用しない比較品１５の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.８６に低下したが、１０μＭのＴｙｒＲＳを使用し、それに応じてＡＴＰ濃度及び二価イオン濃度を高めた本発明の方法では、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９７）が認められた。
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、７５ｍＭ ＡＴＰ、５００ｍＭ ＭｇＣｌ２、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは１６０μＭ Ｄ-チロシン、１０μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、５０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例２０に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品２０）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、４０ｍＭ ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは１６０μＭ Ｄ-チロシン、５μＭ ＴｙｒＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例２０に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品１５）。その結果、図６に示す通り、５μＭのＴｙｒＲＳしか使用しない比較品１５の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.８６に低下したが、１０μＭのＴｙｒＲＳを使用し、それに応じてＡＴＰ濃度及び二価イオン濃度を高めた本発明の方法では、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９７）が認められた。
【実施例22】
【0073】
２００ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＣｏＣｌ２、０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭまたは６００μM Ｄ-トリプトファン、１０μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例２０に記載のモリブデンブルー法により測定した（実施品２１）。また、ＡＡＲＳ濃度を５μＭと低濃度にした反応条件として、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８）、２０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭまたは４００μＭ Ｄ-トリプトファン、５μＭ ＴｒｐＲＳ（大腸菌由来）を含む反応溶液を２００μＬ調製し、４０℃、３０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように４０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例２０に記載のモリブデンブルー法により測定した（比較品１６）。その結果、図６に示す通り、５μＭのＴｒｐＲＳしか使用しない比較品１６の場合には、アミノ酸を高濃度まで測定すると相関係数Ｒが０.９１に低下したが、１０μＭのＴｒｐＲＳを使用し、それに応じてＡＴＰ濃度及び二価イオン濃度を高めた本発明の方法では、広範囲のアミノ酸濃度範囲において、アミノ酸濃度とピロリン酸に相関関係（Ｒ＝０.９８）が認められた。
【0074】
以上の結果から、実施例３～７、実施例１８～２０に示されるように、例えば、５０μＭまたは１００μＭ程度の比較的高濃度のアミノ酸を含有する試料を測定対象とした際に、本発明方法では、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸の何れにおいても試料に含まれるアミノ酸のモル数より多いモル数の反応産生物を産生すると共に、低濃度（５μＭ）ＡＡＲＳを使用した方法と比べ、２倍以上のピロリン酸を産生しており、著しく反応産生物を増幅できることが示された。また、実施例８～１０に示されるように、本発明方法におけるＡＡＲＳ反応では、著しくピロリン酸が産生されることから、低濃度（５μＭ）ＡＡＲＳを使用した方法と同程度のピロリン酸をより短時間で産生させ、短時間でアミノ酸の定量が可能であることが分かった。更に、実施例１１～１４、実施例２１、２２に示されるように、本発明方法では、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸の何れにおいても各ＡＡＲＳにおいてアミノ酸濃度に依存して直線的にピロリン酸が増加する、即ちアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係があり、１～１,０００μＭの低濃度から高濃度の広い範囲でアミノ酸の定量が可能であった。この範囲は従来技術の多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲の１～２５０μＭより著しく広範囲でアミノ酸の定量が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【0075】
このように、本発明方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離し、再度それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、試料中に少ないアミノ酸しか含まれていない場合であっても、多量のピロリン酸や水素イオンを産生させることができるため、多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析は不必要であることが分かった。従って、本発明によって、ＡＡＲＳを用いて、測定対象のアミノ酸を、選択的且つ簡便、短時間及び高感度で、広範囲なアミノ酸濃度範囲で定量することが出来る方法、及びアミノ酸定量用キットを提供することが可能となった。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】