特許 7191076 ＦＧＦ２１突然変異体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-08

(45)【発行日】2022-12-16

(54)【発明の名称】ＦＧＦ２１突然変異体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221209BHJP

   C07K 14/50 20060101ALI20221209BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20221209BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20221209BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20221209BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20221209BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20221209BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221209BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20221209BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20221209BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20221209BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20221209BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/50 ZNA

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

C12N15/62 Z

A61P3/00

A61P3/10

A61P3/04

A61K38/18

A61P43/00 111

A61K47/60

A61K47/64

A61K47/65

A61K47/68

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2020204106

(22)【出願日】2020-12-09

(62)【分割の表示】P 2019085051の分割

【原出願日】2009-06-03

(65)【公開番号】P2021052780

(43)【公開日】2021-04-08

【審査請求日】2021-01-05

(31)【優先権主張番号】61/058,861

(32)【優先日】2008-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/058,919

(32)【優先日】2008-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/164,364

(32)【優先日】2009-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/175,736

(32)【優先日】2009-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】エドワード・ジヨン・ベロウスキ

(72)【発明者】

【氏名】ムリール・マリー・エリソン

(72)【発明者】

【氏名】アグネス・エバ・ハンバーガー

(72)【発明者】

【氏名】ランデイー・アイラ・ヘクト

(72)【発明者】

【氏名】ユエ－シヨン・リー

(72)【発明者】

【氏名】マーク・レオ・マイケルズ

(72)【発明者】

【氏名】ジヨンフン・スン

(72)【発明者】

【氏名】ジーン・シユイ

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５０６６３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５３５３０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５３１７１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／０４２７４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００６／０６５５８２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、位置９８にアルギニン、位置１７１にグリシン、及び位置１８０にグルタミン酸を含み、血糖、インスリン、トリグリセリド又はコレステロール値低下能；体重減少能；及び、耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性向上能から選択される野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、野生型ＦＧＦ２１と比べて半減期が延長している、ポリペプチド。

【請求項2】

（ａ）位置１７９にフェニルアラニン、プロリン、アラニン、セリン、若しくはグリシン、又は
（ｂ）位置１８１にリジン、グリシン、スレオニン、アラニン、ロイシン、若しくは、プロリン
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

ポリペプチドのＣ末端に融合した１～１０個のアミノ酸残基をさらに含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

一又は複数のポリマーと共有結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

ポリマーが、ＰＥＧである、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

ＩｇＧ定常ドメイン又はその断片と融合した請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。

【請求項7】

ポリペプチドが、ＩｇＧ定常ドメイン又はその断片に、リンカーによって融合している、請求項６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

リンカーが、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）からなる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項9】

リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）からなる、請求項７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項10】

ＩｇＧ定常ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項11】

請求項６～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを２コピー以上含む、マルチマー。

【請求項12】

請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項１１に記載のマルチマーと、医薬的に許容可能な製剤用物質とを含む、医薬組成物。

【請求項13】

請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項１１に記載のマルチマーを含む、代謝性疾患を治療するための医薬組成物。

【請求項14】

代謝性疾患が２型糖尿病である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

代謝性疾患が肥満である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項16】

代謝性疾患が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項17】

代謝性疾患の治療を必要とするヒト患者における代謝性疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項１１に記載のマルチマーの使用。

【請求項18】

代謝性疾患が２型糖尿病である、ポリペプチド、融合ポリペプチド、又はマルチマーの請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

代謝性疾患が肥満である、ポリペプチド、融合ポリペプチド、又はマルチマーの請求項１７に記載の使用。

【請求項20】

代謝性疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、ポリペプチド、融合ポリペプチド、又はマルチマーの請求項１７に記載の使用。

【請求項21】

請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項１１に記載のマルチマーを含む、患者のトリグリセリドレベルの減少、患者の耐糖能の改善、患者の体重の減少、又は患者のインスリンレベルの減少のための医薬組成物。

【請求項22】

請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項６～１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。

【請求項23】

請求項２２に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項24】

請求項２３に記載の核酸分子を含む宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２００８年６月４日提出の米国特許仮出願第６１／０５８，８６１号、２００８年６月４日提出の米国特許仮出願第６１／０５８，９１９号、米国特許仮出願第６１／０５８，９１９号、２００９年３月２７日提出の米国特許仮出願第６１／１６４，３６４号及び２００９年５月５日提出の米国特許仮出願第６１／１７５，７３６号（これらはそれぞれ、その全体において本明細書中に組み込まれる。）の優先権を主張する。

【0002】

本発明は、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドをコードする核酸分子、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドを含む医薬組成物及びこのような核酸、ポリペプチド又は医薬組成物を用いて代謝性疾患を治療するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３を含む繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌性ポリペプチドである（Ｉｔｏｈら、２００４、Ｔｒｅｎｄ Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３－６９）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン非依存性であり、グルコース、脂質及びエネルギー代謝の制御におけるホルモンとして機能するという点で、非定型のＦＧＦである。

【0004】

ＦＧＦ２１は、肝臓分泌因子として肝臓ｃＤＮＡライブラリから単離された。これは、肝臓及び膵臓で非常に多く発現され、肝臓で主に発現される唯一のＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、成長速度が遅く、血漿グルコース及びトリグリセリド値が低く、加齢に伴う２型糖尿病、膵島過形成及び肥満がないという代謝表現型を示す。
げっ歯類及び霊長類モデルにおける組み換えＦＧＦ２１タンパク質の医薬投与の結果、血漿グルコース値が正常となり、トリグリセリド及びコレステロール値が低下し、耐糖能、インスリン感受性が改善する。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体活動度及び新陳代謝率の向上により、体重及び体脂肪を減少させる。実験的研究から、ヒトにおける２型糖尿病、肥満、脂質異常症及びその他の代謝状態又は疾患の治療のためのＦＧＦ２１の医薬投与が支持される。

【0005】

ヒトＦＧＦ２１のインビボでの半減期は短い。マウスにおいて、ヒトＦＧＦ２１の半減期は１時間から２時間であり、カニクイザルにおいて、半減期は２．５時間から３時間である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｉｔｏｈ他、Ｔｒｅｎｄ Ｇｅｎｅｔ．２０、２００４年、ｐ．５６３－６９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

２型糖尿病の治療における治療薬としての使用のためのＦＧＦ２１タンパク質を開発することにおいて、半減期を延長させることが望ましい。半減期が延長されたＦＧＦ２１タンパク質により、タンパク質を投与されている患者の投与頻度を少なくすることができる。このようなタンパク質を本明細書中で述べる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、位置４５のアラニン残基、位置８６のロイシン残基、位置９８のロイシン残基、位置１１１のアラニン残基、位置１２９のアラニン残基、位置１７０のグリシン残基、位置１７１のプロリン残基又は位置１７２のセリン残基に対する何らかのアミノ酸の置換及びそれらの組み合わせをさらに含む、単離ポリペプチドを提供する。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、位置９８のロイシン残基、１７１のプロリン残基又は、位置９８のロイシン残基及び位置１７１のプロリン残基の両方に対する何らかのアミノ酸の置換を含む。別の実施形態において、本単離ポリペプチドは、位置９８のロイシン残基及び位置１７１のプロリン残基の両方に対する何らかのアミノ酸の置換を含む。

【0009】

本開示はまた、（ａ）（ｉ）位置１９の、グルタミン、イソロイシンもしくはリジン残基；（ｉｉ）位置２０の、ヒスチジン、ロイシンもしくはフェニルアラニン残基；（ｉｉｉ）位置２１の、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンもしくはバリン残基；（ｉｖ）位置２２の、イソロイシン、フェニルアラニンもしくはバリン残基；（ｖ）位置１５０の、アラニンもしくはアルギニン残基；（ｖｉ）位置１５１の、アラニンもしくはバリン残基；（ｖｉｉ）位置１５２の、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはバリン残基；（ｖｉｉｉ）位置１７０の、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、プロリンもしくはセリン残基；（ｉｘ）位置１７１の、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン、トリプトファンもしくはチロシン残基；（ｘ）位置１７２の、ロイシンもしくはスレオニン残基；又は（ｘｉ）位置１７３の、アルギニンもしくはグルタミン酸残基である、少なくとも１つのアミノ酸置換；及び（ｂ）（ｉ）位置２６の、アルギニン、グルタミン酸もしくはリジン残基；（ｉｉ）位置４５の、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、リジンもしくはスレオニン残基；（ｉｉｉ）位置５２のスレオニン残基；（ｉｖ）位置５８の、システイン、グルタミン酸、グリシンもしくはセリン残基；（ｖ）位置６０の、アラニン、アルギニン、グルタミン酸もしくはリジン残基；（ｖｉ）位置７８の、アラニン、アルギニン、システインもしくはヒスチジン残基；（ｖｉｉ）位置８６の、システインもしくはスレオニン残基；（ｖｉｉｉ）位置８８の、アラニン、アルギニン、グルタミン酸、リジンもしくはセリン残基；（ｉｘ）位置９８の、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、リジンもしくはスレオニン残基；（ｘ）位置９９の、アルギニン、アスパラギン酸、システインもしくはグルタミン酸残基；（ｘｉ）位置１１１の、リジンもしくはスレオニン残基；（ｘｉｉ）位置１２９の、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンもしくはリジン残基；又は（ｘｉｉｉ）位置１３４の、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジンもしくはチロシン残基である、少なくとも１つのアミノ酸置換；及びそれらの組み合わせを有する、配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドも提供する。ある実施形態において、位置９８の残基はアルギニンであり、位置１７１の残基はプロリンであり、別の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み得る（しかし、この場合、（ａ）（ｉ）－（ｘｉ）及び（ｂ）（ｉ）－（ｘｉｉｉ）の少なくとも１つのアミノ酸置換はさらに修飾されない。）。

【0010】

本開示は、さらに、（ａ）位置１９の、グルタミン、リジンもしくはイソロイシン残基；（ｂ）位置２０の、ヒスチジン、ロイシンもしくはフェニルアラニン残基；（ｃ）位置２１の、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンもしくはバリン残基；（ｄ）位置２２の、イソロイシン、フェニルアラニンもしくはバリン残基；（ｅ）位置１５０の、アラニンもしくはアルギニン残基；（ｆ）位置１５１の、アラニンもしくはバリン残基；（ｇ）位置１５２の、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはバリン残基；（ｈ）位置１７０の、アラニン、アスパラギン酸、システインもしくはプロリン残基；（ｉ）位置１７１の、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン、トリプトファンもしくはチロシン残基；（ｊ）位置１７２のロイシン残基；又は（ｋ）位置１７３の、アルギニンもしくはグルタミン酸残基；及びそれらの組み合わせである少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを提供する。ある実施形態において、位置１７１の残基はプロリンであり、別の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み得る（しかし、この場合、（ａ）－（ｋ）の少なくとも１つのアミノ酸置換はさらに修飾されない。）。

【0011】

本開示は、（ａ）位置２６の、アルギニン、グルタミン酸もしくはリジン残基；（ｂ）位置４５の、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、リジンもしくはスレオニン残基；（ｃ）位置５２のスレオニン残基；（ｄ）位置５８の、グルタミン酸、グリシンもしくはセリン残基；（ｅ）位置６０の、アラニン、アルギニン、グルタミン酸もしくはリジン残基；（ｆ）位置７８の、アラニン、アルギニンもしくはヒスチジン残基；（ｇ）位置８８のアラニン残基；（ｈ）位置９８の、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、リジンもしくはスレオニン残基；（ｉ）位置９９の、アルギニン、アスパラギン酸、システインもしくはグルタミン酸残基；（ｊ）位置１１１の、リジンもしくはスレオニン残基；（ｋ）位置１２９の、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンもしくはリジン残基；又は（ｌ）位置１３４の、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジンもしくはチロシン残基；及びそれらの組み合わせである少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドをさらに提供する。ある実施形態において、位置９８の残基はアルギニンであり、別の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み得る（しかし、この場合、（ａ）－（ｌ）の少なくとも１つのアミノ酸置換はさらに修飾されない。）。

【0012】

様々な実施形態において、本明細書中で開示されるポリペプチドは、（ａ）位置１７９の、フェニルアラニン、プロリン、アラニン、セリンもしくはグリシン；（ｂ）位置１８０の、グルタミン酸、グリシン、プロリンもしくはセリン；又は（ｃ）位置１８１の、リジン、グリシン、スレオニン、アラニン、ロイシンもしくはプロリンである、少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み得、本ポリペプチドのＣ末端に融合される１から１０個のアミノ酸残基をさらに含み得、何らかのアミノ酸（例えばグリシン、プロリン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の残基）であり得る。

【0013】

様々な実施形態において、本明細書中で開示されるポリペプチドは、（ａ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；（ｂ）１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；又は（ｃ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮及び１２個を超えないカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）を含み得る。

【0014】

ある実施形態において、本明細書中で開示されるポリペプチドは、ＰＥＧなどの１以上のポリマーに共有結合され得る。その他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、場合によってはＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）などのリンカーを介して、異種アミノ酸配列に融合され得る。この異種アミノ酸配列は、配列番号１３のアミノ酸配列などの、ＩｇＧ定常ドメイン又はその断片であり得る。本明細書中で開示されるこのような融合ポリペプチドは、マルチマーも形成し得る。

【0015】

本開示はまた、本明細書中で開示されるポリペプチドと、医薬的に許容可能な製剤用物質と、を含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、代謝性疾患を治療するための方法において使用され得、本方法は、代謝性疾患を治療することを必要とするヒト患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む。治療され得る代謝性疾患には、糖尿病及び肥満が含まれる。

【0016】

本明細書中で開示されるポリペプチドをコードする単離核酸分子ならびにこのような核酸分子を含むベクター及びこのような核酸分子を含む宿主細胞も提供される。

【0017】

配列番号４のポリペプチドの短縮型も開示される。様々な実施形態において、本ポリペプチドは、（ａ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；（ｂ）１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；又は（ｃ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮及び１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）を含み得る。

【0018】

本開示は、さらに、（ａ）ＩｇＧ定常ドメイン；（ｂ）ＩｇＧ定常ドメインに融合されたリンカー配列；及び（ｃ）リンカー配列に融合され、配列番号４のアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１突然変異体（ここで、アルギニン残基が位置９８のロイシン残基に対して置換され、グリシン残基が位置１７１のプロリン残基に対して置換されている。）を含み得る単離融合タンパク質を提供する。ある実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）を含み、別のものにおいて、ＩｇＧ定常ドメインは配列番号１３を含み得る。別の実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）を含み、ＩｇＧ定常ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、リンカーのＮ末端がＩｇＧ定常ドメインのＣ末端に融合され、ＦＧＦ２１突然変異体のＮ末端がリンカーのＣ末端に融合される。開示される融合タンパク質はマルチマーを形成し得る。

【0019】

本融合タンパク質の様々な実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異体成分は、（ａ）位置１７９の、フェニルアラニン、プロリン、アラニン、セリンもしくはグリシン；（ｂ）位置１８０の、グルタミン酸、グリシン、プロリンもしくはセリン；又は（ｃ）位置１８１の、リジン、グリシン、スレオニン、アラニン、ロイシンもしくはプロリンである、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得、ＦＧＦ２１突然変異体のＣ末端に融合される１から１０個のアミノ酸残基をさらに含み得、１から１０個のアミノ酸残基は、何らかのアミノ酸、例えば、グリシン、プロリン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の残基であり得る。

【0020】

本融合タンパク質のさらにその他の実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異成分は、（ａ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；（ｂ）１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；又は（ｃ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮及び１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）を含み得る。別の実施形態において、融合タンパク質のＦＧＦ２１突然変異成分は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み得る（しかし、アルギニン及びグリシン残基はさらに修飾されない。）。

【0021】

本開示はまた、本明細書中で開示される融合タンパク質と、医薬的に許容可能な製剤用物質と、を含む、医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、代謝性疾患を治療するための方法において使用することができ、本方法は、代謝性疾患を治療することを必要とするヒト患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む。治療され得る代謝性疾患には糖尿病及び肥満が含まれる。

【0022】

本明細書中で開示される融合タンパク質をコードする単離核酸分子ならびにこのような核酸分子を含むベクター及びこのような核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。

【0023】

次の、ある種の実施形態及び特許請求の範囲のより詳細な説明から、本発明の具体的な実施形態が明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】ＦＧＦ２１短縮突然変異体７－１８１及び８－１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮突然変異体１－１７２、１－１７１、１－１６９及び１－１６４（図１Ｂ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図1B】ＦＧＦ２１短縮突然変異体７－１８１及び８－１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮突然変異体１－１７２、１－１７１、１－１６９及び１－１６４（図１Ｂ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図2】ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１短縮突然変異体３－１８１、４－１８１、５－１８１、７－１８１、８－１８１、１－１８０、１－１７８、１－１７７、１－１７６、１－１７５、１－１７４、１－１７３、１－１７２、９－１８１及び１－１４９において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。

【図3】ＰＢＳ（黒いバー）、ヒトＦＧＦ２１対照（白色のバー）又はＦＧＦ２１短縮突然変異体８－１８１（灰色のバー）及び９－１８１（点描付きのバー）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。

【図4】ＰＢＳ（黒丸）、Ｆｃ－ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）（白丸）又はアミノ酸残基５－１８１（黒三角）もしくは７－１８１（白三角）を含む短縮型Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。

【図5】ＰＢＳ（黒丸）、ＦＧＦ２１－Ｆｃ対照（ＷＴ）（白丸）、残基１－１７５を含む短縮型ＦＧＦ２１－Ｆｃ融合タンパク質（黒三角）又はアミノ酸残基１－１７１を含む短縮型Ｆｃ－ＦＧＦ２１タンパク質（白三角）を注射したマウスで測定した血糖値の％変化を示す。

【図6A】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果を示す。

【図6B】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果を示す。

【図6C】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果を示す。

【図6D】ヒトＦｃ（５）ＦＧＦ２１対照試料（図６Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（５）ＦＧＦ２１の試料の、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果を示す。

【図7A】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図7B】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図7C】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図7D】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１（３）Ｆｃ対照試料（図７Ａ）及び、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（３）ＦｃのＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図8A】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図8B】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図8C】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図8D】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図８Ａ）及び、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１の試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図9A】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図9B】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図9C】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図9D】ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ対照試料（図９Ａ）及び、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図10A】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号３８）及びＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号２５）融合タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析により同定される切断部位を示す。

【図10B】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号３８）及びＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号２５）融合タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析により同定される切断部位を示す。

【図11】ＰＢＳ（黒色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（点描付きのバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ／Ｓ１７２Ｌ（黒地の水平線模様のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１５１Ａ（白地の斜線模様のバー）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。

【図12】ＰＢＳ（黒丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（白三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ／Ｓ１７２Ｌ（白菱型）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１５１Ａ（黒四角）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。

【図13】ＰＢＳ（黒色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ（灰色地の斜線模様のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｓ１７２Ｌ（白地の斜線模様のバー）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。

【図14】ＰＢＳ（黒四角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（白四角）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ（黒逆三角形）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白逆三角形）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｓ１７２Ｌ（白丸）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。

【図15】ＰＢＳ（黒色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ａ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｃ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｄ（灰色及び白色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｎ（黒地の斜線模様のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｓ（白地の斜線模様のバー）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。

【図16】ＰＢＳ（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ａ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｃ（白三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｄ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｎ（白菱型）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｓ（黒逆三角）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。

【図17】ＰＢＳ（黒色のバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ（灰色のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｈ（黒地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｑ（白地の斜線模様のバー）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（点描付きのバー）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ（灰色地の斜線模様のバー）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。

【図18】ＰＢＳ（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｈ（白三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｑ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（白菱型）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ（黒四角）を注射したマウスにおいて測定した血糖値の％変化を示す。

【図19A】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図19B】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図19C】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図19D】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ）及び、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図20A】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図20B】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図20C】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図20D】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ）及び、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図21A】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図21B】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図21C】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図21D】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ）及び、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図22A】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図22B】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図22C】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図22D】Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ）及び、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌの試料の、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す。

【図23A】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。

【図23B】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。

【図23C】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。

【図23D】マウスに注射した、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号３８）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号３９）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号４０）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析により同定された切断部位を示す。

【図24A】ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１ Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図24B】ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１ Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図24C】ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１ Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図25A】Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図25B】Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図25C】Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図25D】Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示し、各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。

【図26A】野生型成熟ＦＧＦ２１及び様々なＦＧＦ２１突然変異体に対する時間の関数としての凝集を表し；図２６Ａは、１、２及び４日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ、黒菱型）及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（黒丸）に対する％凝集の変化を示し、図２６Ｂは、１、６及び１０日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）及びＦＧＦ２１ Ｐ７８Ｃ、Ｐ７８Ｒ、Ｌ８６Ｔ、Ｌ８６Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｒ、Ａ１１１Ｔ、Ａ１２９Ｄ、Ａ１２９Ｑ、Ａ１２９Ｋ、Ａ１３４Ｋ、Ａ１３４Ｙ及びＡ１３４Ｅ（全てプロット上で標識）に対する％凝集の変化を示す。

【図26B】野生型成熟ＦＧＦ２１及び様々なＦＧＦ２１突然変異体に対する時間の関数としての凝集を表し；図２６Ａは、１、２及び４日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ、黒菱型）及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（黒丸）に対する％凝集の変化を示し、図２６Ｂは、１、６及び１０日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質を温置した後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）及びＦＧＦ２１ Ｐ７８Ｃ、Ｐ７８Ｒ、Ｌ８６Ｔ、Ｌ８６Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｒ、Ａ１１１Ｔ、Ａ１２９Ｄ、Ａ１２９Ｑ、Ａ１２９Ｋ、Ａ１３４Ｋ、Ａ１３４Ｙ及びＡ１３４Ｅ（全てプロット上で標識）に対する％凝集の変化を示す。

【図27】ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ、ＦＧＦ２１ Ｌ５２Ｔ及びＦＧＦ２１ Ｌ５８Ｅにおいて行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。

【図28A】１、４及び８日間にわたり４℃で温置した後の、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ ６－１８１／Ｇ１７０Ｅ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（白四角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（ｘ印）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白三角）及びＦＧＦ２１対照（黒丸）に対する凝集レベルの変化を示すプロットであり、図２８Ｂは、温置の結果も示す棒グラフである。

【図28B】１、４及び８日間にわたり４℃で温置した後の、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ ６－１８１／Ｇ１７０Ｅ（黒菱型）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（白四角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ（黒三角）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ（ｘ印）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ（白三角）及びＦＧＦ２１対照（黒丸）に対する凝集レベルの変化を示すプロットであり、図２８Ｂは、温置の結果も示す棒グラフである。

【図29】ＰＢＳ（ビヒクル）（黒丸）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（白丸）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角）又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（白三角）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。

【図30】ヒトＦＧＦ２１（黒丸、黒線）、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（白丸、黒線）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角、点線）において行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すプロットである。

【図31A】ＦＧＦ２１（黒丸、黒線）、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（白丸、黒線）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角、点線）に対して、室温（図３１Ａ）及び４℃（図３１Ｂ）で９日後に観察される％高分子量凝集体を示すプロットである。

【図31B】ＦＧＦ２１（黒丸、黒線）、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（白丸、黒線）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ（黒三角、点線）に対して、室温（図３１Ａ）及び４℃（図３１Ｂ）で９日後に観察される％高分子量凝集体を示すプロットである。

【図32】１６８時間にわたる様々な点でのＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇにおける、観察される変化を示す一連のＭＡＬＤＩ質量分析トレースである。

【図33】ＰＢＳビヒクル対照（白丸）、野生型成熟ＦＧＦ２１（黒四角）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（黒逆三角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ（白菱型）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ（黒丸）のそれぞれに対する、ｄｂ／ｄｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。

【図34】ＰＢＳビヒクル対照（黒丸）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（黒三角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ（白三角）、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ（黒菱型）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ（白菱型）のそれぞれに対する、ｏｂ／ｏｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。

【図35】ＰＢＳビヒクル対照（白丸）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（黒四角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ（白三角）、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ（黒逆三角）、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８０Ｓ（白菱型）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ（黒丸）のそれぞれに対する、ｄｂ／ｄｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。

【図36】ＰＢＳビヒクル対照（黒丸）及びＦＧＦ２１突然変異体Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ（白四角）；Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ（黒三角）及びＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ（白菱型）のそれぞれに対する、ｄｂ／ｄｂマウスでの血糖値の％変化を示すプロットである。

【図37】アカゲザルで行われた６週間の用量漸増実験に対する研究計画を図示するダイアグラムであり、この図面において、網掛けの印は、絶食状態での採血を示し、点描のある印は給餌状態での採血を示した。

【図38A】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。

【図38B】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。

【図38C】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。

【図38D】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットであり、図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、点線は群Ｃに相当し、図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに相当し、黒丸、黒線は、群Ｂに相当し、白丸、黒線は群Ｃに相当し、図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当し、図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、点描付きのバーは群Ａに相当し、網掛けのバーは群Ｂに相当し、白色のバーは群Ｃに相当する。

【図39】アカゲザルでの体重における、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示すプロットであり；網掛けのバー１及び２は、低用量での第１及び２週に相当し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に相当し、黒色のバー５及び６は、高用量での第５及び６週に相当し、点描付きのバー７、８及び９は、休薬期間中の第７－９週に相当する。

【図40】アカゲザルでの空腹時インスリン値における、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）のベースラインに対する空腹時インスリンの％変化を示すプロットであり、網掛けのバー１及び２は低用量での第１及び２週に相当し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に相当し、黒色のバー５及び６は高用量での第５及び６週に相当し、点描付きのバー７及び８は薬期間中の第７及び８週に相当する。

【図41】この試験の第５及び６週の間に得られたアカゲザルの給餌状態でのインスリン値における、高用量でもたらされる、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示すプロットであり、黒色のバーは第５週に相当し、網掛けのバーは第６週に相当する。

【図42】Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）での２週間の高用量治療の終了時に行ったＯＧＴＴ５のグルコースプロファイルを示すプロットであり、黒丸、黒線は、ビヒクルに相当し、白四角、点線は、ＦＧＦ２１に相当し、黒三角、黒線は、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）に相当する。

【図43】Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）での２週間の高用量治療の終了時に行ったＯＧＴＴ５のインスリンプロファイルを示すプロットであり、黒丸、黒線は、ビヒクルに相当し、白四角、点線は、ＦＧＦ２１に相当し、黒三角、黒線は、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）に相当する。

【図44】アカゲザルの各投与期間（低、中及び高用量）の終了時に測定した、グルコースＯＧＴＴ ＡＵＣ１－３を示すプロットであり、白色のバーは、ＯＧＴＴ３中のグルコース測定値から計算したＡＵＣ３に相当し、黒色のバーは、ＯＧＴＴ４中のグルコース測定値から計算したＡＵＣ４に相当し、網掛けのバーは、ＯＧＴＴ５中のグルコース測定値から計算したＡＵＣ５に相当する。

【図45】アカゲザルの各群からの空腹時血漿トリグリセリド値のベースラインからの％変化におけるビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示すグラフであり；網掛けのバー１及び２は、低用量での第１及び２週に相当し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に相当し、黒色のバー５及び６は、高用量での第５及び６週に相当し、点描付きのバー７、８及び９は、薬期間中の第７－９週に相当する。

【図46】ビヒクル、高用量のＦＧＦ２１又はＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）での治療の第５及び６週の間に測定した場合の、アカゲザルの各群からの給餌状態での血漿トリグリセリド値を示すグラフであり、網掛けのバーは第５週に相当し、黒色のバーは第６週に相当する。

【図47】各注射からおよそ２１時間後に得た試料による、投与前及び５、１２、１９及び２６日に測定した、個々のサルのＦＧＦ２１レベルを示すプロットである。

【図48】各注射からおよそ５日後に得た試料による、投与前及び５、１２、１９及び２６日に測定した、個々のサルのＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）レベルを示すプロットである。

【図49】低、中及び高用量のそれぞれの投与後に行われた３回のＯＧＴＴから測定されたＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）レベルの平均濃度を示すプロットであり；網掛けのバーは低用量でのＯＧＴＴ３に相当し、黒色のバーは中程度の用量でのＯＧＴＴ４に相当し、白色のバーは高用量でのＯＧＴＴ５に相当する。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本明細書中で開示される方法及び標準的な分子生物学的方法を用いて、半減期延長及び／又は凝集低下などの特性が強化されているヒトＦＧＦ２１タンパク質を調製することができる。場合によっては、野生型ＦＧＦ２１配列のＮ末端又はＣ末端に抗体又はその一部を融合させることにより、半減期をさらに延長させることができる。タンパク質にアミノ酸置換を導入することにより、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の半減期をさらに延長させるか又は凝集を低下させることも可能である。このような修飾タンパク質は、本明細書中で、突然変異体又はＦＧＦ２１突然変異体と呼ばれ、本発明の実施形態を形成する。

【0026】

実施例におけるものを含む、本明細書中で使用される組み換え核酸法は、全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）（両者ともあらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されているものである。

【0027】

１．一般的定義
「単離核酸分子」という用語は、（１）全体的な核酸が起源細胞から単離される際に、一緒に天然に見出される、タンパク質、脂質、炭水化物又はその他の物質の少なくとも約５０％から分離されているか、（２）「単離核酸分子」が天然で連結されるポリヌクレオチドの全て又は一部に連結されていないか、（３）それが天然では連結されないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか又は（４）より大きいポリヌクレオチド配列の一部としては天然に生じない、本発明の核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、実質的に、あらゆるその他の夾雑核酸分子又は、ポリペプチド産生又はその治療、診断、予防又は研究用途でのその使用を妨害する、その天然の環境で見出されるその他の夾雑物を含まない。

【0028】

「ベクター」という用語は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される何らかの分子（例えば、核酸、プラスミド又はウイルス）を指すために使用される。

【0029】

「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適切であり、挿入された異種核酸配列の発現を支配及び／又は調節する核酸配列を含有するベクターを指す。発現には、以下に限定されないが、遺伝子移入、翻訳及びＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）などのプロセスが含まれる。

【0030】

「操作可能に連結される」という用語は、そのように記載されるフランキング配列がそれらの通常の機能を発揮するように構成されるか又は組み立てられる、フランキング配列の配置を指すために本明細書中で使用される。従って、コード配列に操作可能に連結されるフランキング配列は、コード配列の、複製、遺伝子移入及び／又は翻訳をもたらすことが可能であり得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の遺伝子移入を支配できる場合、プロモーターに操作可能に連結される。フランキング配列は、それが正確に機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。従って、例えば、介在する、非翻訳であるが転写される配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在し得、それでもなお、プロモーター配列は、コード配列に「操作可能に連結される」とみなされ得る。

【0031】

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されているか又は核酸配列で形質転換され、次いで関心のある選択された遺伝子を発現させることが可能である、細胞を指すために使用される。この用語には、その子孫が形態的に又は遺伝子構成について元の親と同一であるにしてもないにしても、選択された遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫が含まれる。

【0032】

「単離ポリペプチド」という用語は、（１）起源細胞から単離される際に、それが天然に一緒に見出される、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又はその他の物質の少なくとも約５０％から分離されているか、（２）「単離核酸分子」が天然で連結されるポリペプチドの全て又は一部に（共有又は非共有結合により）連結されていないか、（３）天然では連結されないポリペプチドに（共有又は非共有結合により）操作可能に連結されているか又は（４）天然では生じない、本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、本単離ポリペプチドは、実質的に、あらゆるその他の夾雑ポリペプチド又は、その治療、診断、予防又は研究での使用を妨害する、その天然の環境で見出されるその他の夾雑物を含まない。

【0033】

「天然の」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生体物質と関連して使用される場合、天然で見出され、人により操作されていない物質を指す。同様に、「非天然の」とは、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか又は人により構造的に修飾もしくは合成された物質を指す。ヌクレオチドと関連して使用される場合、「天然の」という用語は、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を指す。アミノ酸と関連して使用される場合、「天然の」という用語は、２０個のアミノ酸、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）及びチロシン（Ｙ）を指す。

【0034】

「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現される天然の野生型ポリペプチドを指す。この開示の目的に対して、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、何らかの全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば、配列番号２（２０９個のアミノ酸残基からなり、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされる。）；ポリペプチドの何らかの成熟型、例えば、配列番号４（１８１個のアミノ酸残基からなり、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされ、全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（即ち、シグナルペプチドを構成する。）の２８個のアミノ酸残基が除去されている。）及びそれらの変異体を指すために交換可能に使用され得る。

【0035】

「ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体」及び「ＦＧＦ２１突然変異体」という用語は、天然のＦＧＦ２１アミノ酸配列が修飾されている、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を指す。このような修飾には、以下に限定されないが、非天然のアミノ酸類似体での置換を含む１以上のアミノ酸置換及び短縮が含まれる。従って、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体には、以下に限定されないが、本明細書中に記載のような、部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体、短縮型ＦＧＦ２１ポリペプチド、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体、凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体、ＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体及びＦＧＦ２１融合タンパク質が含まれる。本発明のＦＧＦ２１突然変異体の具体的な短縮及びアミノ酸置換を識別するために、短縮されるか又は突然変異されたアミノ酸残基の付番は、成熟型１８１残基ＦＧＦ２１ポリペプチドのものに対応する。

【0036】

本発明のその他の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、この場合、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体に対して所望の特性、例えば、タンパク質分解耐性、半減期延長又は凝集性低下特性及びそれらの組み合わせを与える特異的な残基はさらに修飾されていない。言い換えると、タンパク質分解耐性、凝集性低下又はその他の特性をもたらすために修飾されたＦＧＦ２１突然変異配列における残基を除き、ＦＧＦ２１突然変異配列中の全てのその他のアミノ酸残基の約１５％が修飾され得る。例えば、ＦＧＦ２１突然変異体Ｑ１７３Ｅにおいて、位置１７３のグルタミンに対して置換されたグルタミン酸残基を除き、全アミノ酸残基の最大で１５％が修飾され得る。さらにその他の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、この場合、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体のタンパク質分解耐性又は凝集性低下特性をもたらす特異的な残基はさらに修飾されていない。このようなＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。

【0037】

本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体に対して所望の特性、例えば、タンパク質分解耐性、半減期延長又は凝集性低下特性及びそれらの組み合わせを与える特異的な残基がさらに修飾されていない、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体をコードする核酸分子も包含する。言い換えると、タンパク質分解耐性、凝集性低下又はその他の特性をもたらすために修飾されたＦＧＦ２１突然変異配列における残基をコードするヌクレオチドを除き、ＦＧＦ２１突然変異配列中の全てのその他のヌクレオチドの約１５％が修飾され得る。例えば、ＦＧＦ２１突然変異体Ｑ１７３Ｅにおいて、位置１７３のグルタミンに対して置換されたグルタミン酸残基をコードするヌクレオチドを除き、全ヌクレオチドの最大で１５％が修飾され得る。本発明は、さらに、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体のタンパク質分解耐性又は凝集性低下特性をもたらす特異的な残基がさらに修飾されていない、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体をコードする核酸分子を包含する。このようなＦＧＦ２１突然変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。

【0038】

本発明はまた、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも約８５％同一であるヌクレオチド配列を含むが、コードされるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体のタンパク質分解耐性、凝集性低下特性又はその他の特性をもたらすアミノ酸残基をコードするヌクレオチドがさらに修飾されていない、核酸分子も包含する。言い換えると、タンパク質分解耐性、凝集性低下又はその他の特性もたらすために修飾されたＦＧＦ２１突然変異配列における残基を除き、ＦＧＦ２１突然変異配列中の全てのその他のアミノ酸残基の約１５％が修飾され得る。例えば、ＦＧＦ２１突然変異体Ｑ１７３Ｅにおいて、位置１７３のグルタミンに対して置換されたグルタミン酸残基を除き、全アミノ酸残基の最大で１５％が修飾され得る。本発明は、さらに、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含むが、コードされるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体のタンパク質分解耐性又は凝集性低下特性をもたらすアミノ酸残基をコードするヌクレオチドがさらに修飾されていない、核酸分子を包含する。このような核酸分子は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドをコードする。

【0039】

「生物学的活性のあるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体に導入された修飾のタイプ又は数に関係なく、血糖、インスリン、トリグリセリド又はコレステロール低下能；体重減少能；及び耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性向上能など、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を保持する本明細書中に記載の何らかのＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体を指す。野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較して、ＦＧＦ２１活性のレベルがある程度低下したＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、それでもなお、生物学的活性のあるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体とみなされ得る。

【0040】

「有効量」及び「治療的有効量」という用語はそれぞれ、血糖、インスリン、トリグリセリド又はコレステロール低下能；体重減少能；及び耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性向上能など、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１以上の生物学的活性の観察可能なレベルを維持するために使用されるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の量を指す。

【0041】

「医薬的に許容可能な担体」又は「生理学的に許容可能な担体」とは、本明細書中で使用される場合、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の送達を遂行又は促進するために適切な１以上の製剤用物質を指す。

【0042】

「抗原」という用語は、抗体により結合可能であり、さらに、抗原のエピトープに結合可能である抗体を作製するために動物において使用可能である、分子又は分子の一部を指す。抗原は、１以上のエピトープを有し得る。

【0043】

「ネイティブＦｃ」という用語は、単量体であれ、マルチマー形態であれ、全抗体の消化の結果得られるか又はその他の手段により作製される非抗原結合断片の配列を含む、分子又は配列を指し、ヒンジ領域を含有し得る。ネイティブＦｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、何らかの免疫グロブリンであり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃ分子は、共有（即ちジスルフィド結合）及び非共有結合により二量体又はマルチマー形態に連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１及びＩｇＧＡ２）に依存して、１から４の範囲である。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化の結果得られるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１－９）。「ネイティブＦｃ」という用語は、本明細書中で使用される場合、単量体、二量体及びマルチマー形態に対する総称である。Ｆｃポリペプチド配列の例は配列番号１３で与えられる。

【0044】

「Ｆｃ変異体」という用語は、ネイティブＦｃから修飾されるが、依然としてサルベージ受容体、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を含む分子又は配列を指す。国際公開ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８は、代表的なＦｃ変異体ならびにサルベージ受容体との相互作用を述べ、参照により本明細書によって組み込まれる。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化される分子又は配列を含み得る。さらに、ネイティブＦｃは、本発明のＦＧＦ２１突然変異体の融合分子に必要ではない構造的特性又は生物学的活性をもたらすので除去され得る領域を含む。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、１以上のネイティブＦｃ部位又は残基を欠くか又は１以上のＦｃ部位又は残基が修飾されており、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択される宿主細胞との不適合性、（３）選択される宿主細胞での発現時のＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響を与えるか又はこれらに関与する、分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体を本明細書中、下記でさらに詳述する。

【0045】

「Ｆｃドメイン」という用語は、上記で定義されるような、ネイティブＦｃ及びＦｃ変異体及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及びネイティブＦｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されたものであれ又はその他の手段により作製されたものであれ、単量体又はマルチマー形態の分子を含む。本発明のある実施形態において、Ｆｃドメインは、例えばＦｃドメインとＦＧＦ２１配列との間の共有結合を介して、ＦＧＦ２１又はＦＧＦ２１突然変異体（ＦＧＦ２１の短縮型又はＦＧＦ２１突然変異体を含む。）に融合され得る。このような融合タンパク質は、Ｆｃドメインの結合を介してマルチマーを形成し得、これらの融合タンパク質及びそれらのマルチマーの両者とも本発明の態様である。

【0046】

２．部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体
「部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体」又は「置換ＦＧＦ２１突然変異体」という用語は、天然のＦＧＦ２１ポリペプチド配列のアミノ酸配列（例えば、配列番号２及び４及びその変異体）とは異なるアミノ酸配列を有するＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドを指す。部位特異的ＦＧＦ２１突然変異体は、ＦＧＦ２１ポリペプチドの特定の位置に、保存的又は非保存的の何れかのアミノ酸置換を導入することにより、及び天然もしくは非天然のアミノ酸を用いて、作製することができる。

【0047】

「保存アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に殆ど又は全く影響がないような、非ネイティブ残基（即ち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列のある一定の位置で見出されない残基）でのネイティブアミノ酸残基（即ち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列のある一定の位置で見出される残基）の置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生体系での合成によるものではなく化学的ペプチド合成により一般に組み込まれる非天然のアミノ酸残基も包含する。これらは、ペプチド模倣物及びアミノ酸部分のその他の反転型（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｆｏｒｍ）又は逆転型（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｆｏｒｍ）を含む。

【0048】

天然の残基は、共通の側鎖の特性に基づきクラスに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0049】

保存的置換には、これらのクラスのうち１つのメンバーの、同じクラスの別のメンバーに対する交換が含まれ得る。非保存置換には、これらのクラスのうち１つのメンバーの、別のクラスからのメンバーに対する交換が含まれ得る。

【0050】

所望のアミノ酸置換（保存的であるか又は非保存的であるか）は、置換が所望されるような時に当業者により決定され得る。アミノ酸置換の代表的（であるが限定的でない）一覧を表１で示す。

【0051】

【表1】

【0052】

３．短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド
本発明のある実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの短縮型に関する。本発明のこの実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの非短縮型に対して同様である、いくつかの例においてはそれを上回る、活性を提供することが可能である短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドを同定するための取り組みから得られた。

【0053】

本明細書中で使用される場合、「短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（又はＮ末端）から除去されているか、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのカルボキシル末端（又はＣ末端）から除去されているか又はアミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシル末端の両方から除去されている、ＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。本明細書中の実施例３及び６に記載のように本明細書中で開示される様々な短縮型を調製した。

【0054】

実施例４に記載のようなインビトロＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイを用いて、Ｎ末端が短縮されたＦＧＦ２１ポリペプチド及びＣ末端が短縮されたＦＧＦ２１ポリペプチドの活性をアッセイすることができる。短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を調べるために使用することができるインビトロアッセイの具体的な詳細は実施例４で見出すことができる。

【0055】

本発明の短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、実施例５及び７で示されるようなｏｂ／ｏｂマウスなど、インビボアッセイで評価することもできる。一般に、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ活性を評価するために、試験動物にその短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドを腹腔内投与し得る。所望の温置時間（例えば１時間以上）後、血液試料を採取し、血糖値を測定することができる。短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を調べるために使用することができるインビボアッセイの具体的な詳細は実施例５及び７で見出すことができる。

【0056】

ａ．Ｎ末端短縮
本発明のある実施形態において、Ｎ末端短縮は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ末端からの１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基を含む。例えば、実施例５及び図３で示されるように、９アミノ酸残基未満のＮ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの、個体における血糖低下能を保持する。従って、特定の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基のＮ末端短縮がある、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド又はＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の短縮型を包含する。

【0057】

ｂ．Ｃ末端短縮
本発明のある実施形態において、Ｃ末端短縮は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸残基を含む。例えば、実施例４及び図１Ｂで示されるように、１３アミノ酸残基未満のＣ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、インビトロＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイにおいて、野生型ＦＧＦ２１の効力の少なくとも５０％の効力を示し、このことから、これらのＦＧＦ２１突然変異体は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの、個体中での血糖低下能を保持する。従って、特定の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸残基のＣ末端短縮がある、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド又はＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の短縮型を包含する。

【0058】

ｃ．Ｎ末端及びＣ末端短縮
本発明のある実施形態において、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端短縮の組み合わせを有し得る。Ｎ末端及びＣ末端短縮の組み合わせを有する短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端又はＣ末端短縮の何れかのみがある対応する短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドと共通の活性を有する。言い換えると、９アミノ酸残基未満のＮ末端短縮及び１３アミノ酸残基未満のＣ末端短縮の両方がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、９アミノ酸残基未満のＮ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド又は１３アミノ酸残基未満のＣ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドと同様であるか又はより高い血糖低下能を保持する。従って、特定の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基のＮ末端短縮及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のアミノ酸残基のＣ末端短縮の両方を有する、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド又はＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の短縮型を包含する。

【0059】

本発明の全てのＦＧＦ２１突然変異体と同様に、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、場合によっては、アミノ末端メチオニン残基を含み得、これは、定方向突然変異により又は細菌発現プロセスの結果として導入され得る。

【0060】

本発明の短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、実施例３及び６に記載のように調製され得る。標準的な分子生物学的技術に精通している当業者は、本開示と組み合わせて、本発明の短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドを作製し、使用するためにその知識を使用することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記（これは、あらゆる目的のために参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照。酵素反応及び精製技術は、製造者の説明書に従い、当技術分野で一般的に遂行されるように又は本明細書中に記載のように行われ得る。別段の定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医薬化学に関連して利用される命名法及びこれらの実験室での手順及び技術は、周知のものであり、当技術分野で一般的に使用される。化学合成；化学分析；医薬調製、製剤及び送達；及び患者の治療に対して標準的技術を使用することができる。

【0061】

本発明の短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドはまた、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドにさらなる特性を付与し得る別の物体に融合させることができる。本発明のある実施形態において、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドをＦｃ配列に融合させることができる。このような融合は、公知の分子生物学的方法及び／又は本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法を本明細書中でさらに詳しく考察する。

【0062】

４．タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体
実施例８に記載のように、成熟ＦＧＦ２１は、インビボ分解を受けることが分かり、これは、最終的には、タンパク質分解性攻撃から生じることが突き止められた。成熟ＦＧＦ２１のインビボ分解により、有効半減期が短縮されることが分かり、これは、分子の治療可能性に悪影響を与え得る。従って、タンパク質分解に耐性を示すＦＧＦ２１突然変異体を同定するために直接的な実験（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｕｄｙ）を行った。この実験の結果として、特にタンパク質分解を受けやすいと判定された成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドにおける部位には、位置４－５、２０－２１、１５１－１５２及び１７１－１７２のアミノ酸残基の間のペプチド結合が含まれる。

【0063】

タンパク質の活性に許容できない程度まで影響を及ぼすことなく、観察されるタンパク質分解効果を消去する特定の置換を同定するために、幅広いが集中的であり直接的な実験を行った。表８及び１１は、調製し、試験した突然変異体のいくつかに脚光を当てる。例えば実施例１３及び１４に記載のように、全てのＦＧＦ２１突然変異体が、理想的プロファイルを示した訳ではなく；いくつかの突然変異体は、ＦＧＦ２１活性を減弱させるが、タンパク質分解耐性をもたらした。その他の突然変異体は、ＦＧＦ２１活性を保持したが、タンパク質分解耐性をもたらさなかった。例えば、ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｇを含むいくつかの突然変異体は、野生型ＦＧＦ２１と同レベルの活性を保持し、一方で、タンパク質分解性分解に対する耐性も示した。

【0064】

所望のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体を同定するためのある選択基準は、ＦＧＦ２１突然変異の活性が、基本的に野生型ＦＧＦ２１の活性と同じであるか又はそれより大きいということであった。従って、本発明の別の実施形態は、タンパク質分解に耐性があり、基本的に野生型ＦＧＦ２１と同じであるか又はそれより大きい活性を依然として保持する、ＦＧＦ２１突然変異体に関する。場合によってはあまり所望されないが、タンパク質分解に耐性があるが、ある程度の活性低下を示すＦＧＦ２１突然変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合により、タンパク質分解の程度を維持することが所望され得、結果として、ある程度のタンパク質分解が起こるＦＧＦ２１突然変異体も、本発明の別の実施形態を形成する。

【0065】

本発明の全てのＦＧＦ２１突然変異体と同様に、本発明のタンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１突然変異体は、本明細書中に記載のように調製することができる。当業者、例えば、標準的分子生物学技術に精通している者は、本開示と組み合わせて、本発明のタンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１突然変異体を作製し、使用するためにその知識を使用することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記を参照（これは、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる。）。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるように又は本明細書中に記載のように、製造者の説明書に従い行われ得る。具体的な定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医薬化学と関連して利用される命名法及びこれらの実験室での手順及び技術は、周知のものであり、当技術分野で一般的に使用される。化学合成；化学分析；医薬調製、製剤及び送達；及び患者の治療に対して標準的技術を使用することができる。

【0066】

本発明のタンパク質分解耐性のＦＧＦ２１突然変異体は、タンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１突然変異体にさらなる特性をもたらし得る別のものと融合され得る。本発明のある実施形態において、タンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１突然変異体は、ＩｇＧ Ｆｃ配列、例えば、配列番号１３と融合され得る。このような融合は、公知の分子生物学的方法及び／又は本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法は公知であり、本明細書中でさらに詳しく考察する。

【0067】

５．凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体
実施例１５に記載のように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドのある特性は、その凝集傾向である。約５ｍｇ／ｍＬを超える濃度では、凝集速度は室温において高い。本明細書中で示され、記載されるように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドに対する凝集速度は、濃度及び温度の両方に依存する。

【0068】

治療製剤に関連してなど、これらの濃度で野生型ＦＧＦ２１を用いて作業する場合、凝集が課題であることが判明し得る。従って、ＦＧＦ２１凝集の低下を示すＦＧＦ２１突然変異体を同定するために、直接的試験（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｕｄｙ）を行った。次に、結果として得られたＦＧＦ２１突然変異体を、様々な濃度での凝集傾向について試験した。

【0069】

野生型ＦＧＦ２１の観察される凝集的影響をなくすか又は軽減するが、一方で許容できない程度までタンパク質の活性に影響を与えない特定の置換を同定するために、幅広いが集中的で直接的な試験（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｕｄｙ）を行った。適切な凝集性低下突然変異体を同定するためのアプローチを実施例１５に記載する。表１６は、調製し、試験した突然変異体のいくつかに脚光を当てる。例えば、実施例１７で記載されるように、ＦＧＦ２１突然変異体の全てが理想的プロファイルを示した訳ではなかった。ＦＧＦ２１ Ｌ５８Ｅなどのいくつかの突然変異体は、ＦＧＦ２１活性を低下させ、さらに試験しなかった。ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｅなどのその他の突然変異体は、ＦＧＦ２１活性を保持したが、凝集特性低下は示さなかった。ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒなどのいくつかの突然変異体は、ＦＧＦ２１活性を保持し、また凝集性低下も示した。ある突然変異体、ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋは、驚くべきことに、ＦＧＦ２１活性が向上し、一方で凝集特性低下も示した。

【0070】

所望の凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体を同定するためのある選択基準は、基本的にＦＧＦ２１突然変異体の活性が、基本的に野生型ＦＧＦ２１の活性と同じであるか又はそれより大きいということであった。従って、本発明の別の実施形態は、野生型ＦＧＦ２１と同等であるか又はそれより大きいＦＧＦ２１活性を依然として保持しながら、凝集特性低下を示すＦＧＦ２１突然変異体に関する。場合によってはあまり所望されないが、凝集特性が低下しているが、ある程度のＦＧＦ２１活性低下を示すＦＧＦ２１突然変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合により、凝集度を維持することが所望され得、結果として、ある程度の凝集が起こるＦＧＦ２１突然変異体も、本発明の別の実施形態を形成する。

【0071】

本発明の全てのＦＧＦ２１突然変異体と同様に、本発明の凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体は、本明細書中に記載のように調製され得る。標準的分子生物学的技術に精通している当業者は、本開示と組み合わせて、本発明の凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体を作製し、使用するためにその知識を使用することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記を参照（これは、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる。）。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるように又は本明細書中に記載のように、製造者の説明書に従い行われ得る。具体的な定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医薬化学と関連して利用される命名法及びこれらの実験室での手順及び技術は、周知のものであり、当技術分野で一般的に使用される。標準的技術は、化学合成；化学分析；医薬調製、製剤及び送達；及び患者の治療に対して使用され得る。

【0072】

本発明の凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体は、凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体にさらなる特性をもたらし得る別のものに融合され得る。本発明のある実施形態において、凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体は、ＩｇＧ Ｆｃ配列、例えば、配列番号１３に融合され得る。このような融合は、公知の分子生物学的方法及び／又は本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法を本明細書中でさらに詳しく考察する。

【0073】

６．ＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体
本明細書中に記載のように、野生型ＦＧＦ２１配列は、ＦＧＦ２１が治療用分子として使用される場合、重大な課題をもたらし得るいくつかの特性を有する。これらの課題の中でも、タンパク質の分解に対する感受性及び高濃度でのその凝集傾向が挙げられる。これらの各課題を克服するＦＧＦ２１ポリペプチドを同定するための多大な努力の後、野生型ＦＧＦ２１の活性と同等であるか又はそれより大きい活性レベルを維持しながら、タンパク質分解耐性をもたらすアミノ酸置換及び凝集性低下特性をもたらすアミノ酸置換が、単一のポリペプチド配列で付加的又は相乗的に組み合わせられ得るか否かを調べるために、直接的試験（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｔｕｄｙ）を行った。ある一定のポリペプチドにおける複数の突然変異の導入が、ときにタンパク質の発現、活性及び続く製造に悪影響を与え得ることが当技術分野で知られているので、これは相当に困難な課題であった。

【0074】

驚くべきことに、例えば、実施例１９及び２０で示されるように、製薬学的特性が向上したＦＧＦ２１突然変異体を作製するために、いくつかのＦＧＦ２１突然変異体の所望の特性が実際に相加的又は相乗的に組み合わせられ得ることが分かった。タンパク質分解に対する耐性があるＦＧＦ突然変異体は、凝集速度が低下しており、これは、本明細書中で開示される野生型ＦＧＦ２１と同等であるか又はそれより大きい活性を以前として保持する。

【0075】

所望のＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体を同定するためのある選択基準は、ＦＧＦ２１突然変異の活性が、野生型ＦＧＦ２１の活性と同等であるか又はそれより大きいことであった。従って、本発明の別の実施形態は、タンパク質分解耐性があり、野生型ＦＧＦ２１と同等であるか又はそれより大きいＦＧＦ２１活性を以前として保持しながら、凝集特性が低下しているＦＧＦ２１突然変異体に関する。場合によってはあまり所望されないが、タンパク質分解耐性があり、凝集性が低下しているが、ある程度のＦＧＦ２１活性低下を示すＦＧＦ２１突然変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合により、タンパク質分解度及び／又は凝集度を維持することが所望され得、結果として、ある程度のタンパク質分解及び／又は凝集が起こるＦＧＦ２１突然変異体も、本発明の別の実施形態を形成する。

【0076】

本発明の全てのＦＧＦ２１突然変異体と同様に、本発明のＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体は、本明細書中に記載のように調製することができる。標準的分子生物学的技術に精通している当業者は、本開示と組み合わせて、本発明のＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体を作製し、使用するためにその知識を使用することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記を参照（これは、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる。）。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるように又は本明細書中に記載のように、製造者の説明書に従い行われ得る。具体的な定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医薬化学と関連して利用される命名法及びこれらの実験室での手順及び技術は、周知のものであり、当技術分野で一般的に使用される。化学合成；化学分析；医薬調製、製剤及び送達；及び患者の治療に対して標準的技術を使用することができる。

【0077】

本発明のＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体は、ＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体にさらなる特性をもたらし得る別のものと融合することができる。本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体は、ＩｇＧ Ｆｃ配列、例えば、配列番号１３に融合され得る。このような融合は、公知の分子生物学的方法及び／又は本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法を本明細書中でさらに詳しく考察する。

【0078】

７．ＦＧＦ２１融合タンパク質
本明細書中で使用される場合、「ＦＧＦ２１融合ポリペプチド」又は「ＦＧＦ２１融合タンパク質」という用語は、本明細書中に記載の何らかのＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体のＮ末端又はＣ末端での１以上のアミノ酸残基（異種タンパク質又はペプチドなど）の融合を指す。

【0079】

異種ペプチド及びポリペプチドには、以下に限定されないが、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の検出及び／又は単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質又はその一部、例えば、細胞外ドメイン又は膜貫通及び細胞内ドメインなど；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンド又はその一部；触媒的に活性のある酵素又はその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチド又はペプチド、例えばロイシンジッパードメインなど；安定性を向上させる、ポリペプチド又はペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域など；機能的もしくは非機能的抗体又はその重もしくは軽鎖など；及び本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体とは異なる、治療活性などの活性を有するポリペプチドが含まれる。また、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合されたＦＧＦ２１突然変異体も本発明に包含される。

【0080】

ＦＧＦ２１融合タンパク質は、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体のＮ末端又はＣ末端の何れかに異種配列を融合することにより作製され得る。本明細書中に記載のように、異種配列は、アミノ酸配列又は非アミノ酸含有ポリマーであり得る。異種配列は、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体に直接又はリンカーもしくはアダプター分子を介して融合され得る。リンカー又はアダプター分子は、１以上のアミノ酸残基（又は－マー）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９残基（又は－マー）、好ましくは１０から５０アミノ酸残基（又は－マー）、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０残基（又は－マー）及びより好ましくは１５から３５アミノ酸残基（又は－マー）であり得る。リンカー又はアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに対するか又はプロテアーゼに対する切断部位とともに設計することもできる。

【0081】

ａ．Ｆｃ融合物
本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分、抗原に結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体活性化及び食細胞による攻撃などのエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として知られる定常ドメインと、を含む。Ｆｃは、血清半減期が長く、一方でＦａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５－３１）。治療用タンパク質と一緒に連結される場合、Ｆｃドメインは、半減期を延長させ得るか又はＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合及びおそらくは胎盤移行などの機能を組み込み得る（Ｃａｐｏｎら、１９８９）。

【0082】

インビボでの薬理学的分析から、ヒトＦＧＦ２１の半減期は、急速なクリアランス及びインビボでの分解のためにマウスにおいて約１時間と短いことが示された。従って、ＦＧＦ２１の半減期を延長させるために、Ｆｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合させた。野生型ＦＧＦ２１へのＦｃ領域の融合、特に野生型ＦＧＦ２１のＮ末端へ融合されるＦｃによって、予想通りに半減期は延長されなかったが、しかし、これにより、インビボでのＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解の研究及びこのような分解に耐性があったＦＧＦ２１突然変異体の同定につながった。このような突然変異体は、例えば実施例８及び１１に記載されており、この半減期は野生型ＦＧＦ２１よりも長い。これら及びその他のＦＧＦ２１融合タンパク質は、本発明の実施形態を形成する。

【0083】

本開示を通じて、Ｆｃ－ＦＧＦ２１は、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＮ末端に融合されている融合タンパク質を指す。同様に、本開示を通じて、ＦＧＦ２１－Ｆｃは、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合されている融合タンパク質を指す。

【0084】

結果的に得られるＦＧＦ２１融合タンパク質は、例えば、プロテインＡアフィニティーカラムの使用により、精製することができる。Ｆｃ領域に融合されたペプチド及びタンパク質は、未融合のものよりもインビボで半減期が実質的に長くなることが分かった。また、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化／マルチマー化が可能となる。Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域であり得るか又は、治療的な質、循環時間又は凝集低下など、ある種の質を向上させるために改変され得る。

【0085】

抗体の「Ｆｃ」ドメインとの融合によるタンパク質治療薬の有用な修飾は国際公開ＷＯ００／０２４７８２（その全体において参照により本明細書によって組み込まれる。）で詳細に考察されている。この文書は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン又はＦｃ領域などの「ビヒクル」への連結を考察する。

【0086】

ｂ．融合タンパク質リンカー
本発明の融合タンパク質を形成させる場合、必要ではないが、リンカーを使用することができる。存在する場合、リンカーは主にスペーサーとして使用されるので、リンカーの化学構造は重要ではないことがある。このリンカーは、ペプチド結合により一緒に連結されるアミノ酸から構成され得る。本発明のある実施形態において、このリンカーは、ペプチド結合により連結される１から２０個のアミノ酸から構成され、この場合、このアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸から選択される。様々な実施形態において、１から２０個のアミノ酸は、アミノ酸、グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。ある実施形態において、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの立体障害のないアミノ酸から主に構成される。ある実施形態において、リンカーは、ポリグリシン（（Ｇｌｙ）_４（配列番号２９）及び（Ｇｌｙ）_５（配列番号３０）など）、ポリアラニン、グリシン及びアラニンの組み合わせ（ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）など）又はグリシン及びセリンの組み合わせ（ポリ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）など）である。その他の適切なリンカーには、（Ｇｌｙ）_５－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）_３－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）_４－Ｓｅｒ（配列番号２３）、（Ｇｌｙ）_４－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）_４－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）_４－Ｓｅｒ（配列番号３１）、（Ｇｌｙ）_３－Ｌｙｓ－（Ｇｌｙ）_４（配列番号３２）、（Ｇｌｙ）_３－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）_２（配列番号３３）、（Ｇｌｙ）_３－Ｃｙｓ－（Ｇｌｙ）_４（配列番号３４）及びＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号３５）が含まれる。１５個のアミノ酸残基のリンカーが、ＦＧＦ２１融合タンパク質に対して特に良好に役立つことが分かったが、その一方で、本発明は、あらゆる長さ又は組成のリンカーを企図する。

【0087】

本明細書中に記載のリンカーは典型例であり、それよりかなり長い、及びその他の残基を含むリンカーが本発明により企図される。非ペプチドリンカーもまた、本発明により企図される。例えば、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_Ｓ－Ｃ（Ｏ）－（ここで、ｓ＝２から２０である。）などのアルキルリンカーが使用され得る。これらのアルキルリンカーは、以下に限定されないが、低級アルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２又はフェニルを含む、何らかの立体障害とならない基によりさらに置換され得る。典型的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカーであり、このリンカーの分子量は、１００から５０００ｋＤ、例えば１００から５００ｋＤである。

【0088】

８．化学的に修飾されたＦＧＦ２１突然変異体
本明細書中に記載のＦＧＦ２１の短縮型を含む、本明細書中に記載のＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の化学的修飾形態は、本明細書中に記載の開示を前提として、当業者により調製され得る。このような化学的修飾ＦＧＦ２１突然変異体は、化学的修飾ＦＧＦ２１突然変異体が、ＦＧＦ２１突然変異体に天然に結合される分子のタイプ又は場所の何れかにおいて、非修飾ＦＧＦ２１突然変異体とは異なるように改変される。化学的修飾ＦＧＦ２１突然変異体は、１以上の天然に結合される化学基の欠失により形成される分子を含み得る。

【0089】

ある実施形態において、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、１以上のポリマーの共有結合により修飾され得る。例えば、選択されるポリマーは、一般に、それが結合されるタンパク質が生理的環境などの水性環境中で沈殿しないように、水溶性である。ポリマーの混合物は適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成調製物の治療的使用のために、そのポリマーは医薬的に許容可能であろう。本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体に結合された非水溶性ポリマーも本発明の態様を形成する。

【0090】

典型的なポリマーはそれぞれ、あらゆる分子量のものであり得、分岐又は非分岐型であり得る。このポリマーはそれぞれ、一般に、約２ｋＤａから約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製物中で、ある分子は言及された分子量よりも大きく、ある分子はそれより小さいことを示す。）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａから約５０ｋＤａの間、より好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａの間、及び最も好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａの間である。

【0091】

適切な水溶性ポリマー又はそれらの混合物には、以下に限定されないが、Ｎ－結合型又はＯ結合型炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ－（Ｃ_１－Ｃ_１０）、アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態を含む。）、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤの低分子量のデキストランなど）、セルロース又はその他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）及びポリビニルアルコールが含まれる。共有結合したＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体マルチマーを調製するために使用することができる二官能性架橋分子も本発明に包含される。ポリシアル酸に共有結合したＦＧＦ２１突然変異体も本発明に包含される。

【0092】

本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異体は、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールを含む、１以上の水溶性ポリマーを含むように共有結合により又は化学的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；及び同第４，１７９，３３７号参照。本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異体は、以下に限定されないが、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物に基づくポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール又はこのようなポリマーの混合物を含む、１以上のポリマーを含む。

【0093】

本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異体は、ＰＥＧサブユニットによって共有結合により修飾される。ある実施形態において、１以上の水溶性ポリマーが、ＦＧＦ２１突然変異体の１以上の具体的な位置（例えばＮ末端）に結合される。ある実施形態において、１以上の水溶性ポリマーが、ＦＧＦ２１突然変異体の１以上の側鎖に無作為に結合される。ある実施形態において、ＦＧＦ２１突然変異体の治療能を向上させるために、ＰＥＧが使用される。ある種のこのような方法は、例えば米国特許第６，１３３，４２６号（あらゆる目的のために参照により本明細書によって組み込まれる。）で考察される。

【0094】

本発明の実施形態において、ポリマーがＰＥＧである場合、このＰＥＧ基は、何らかの都合の良い分子量のものであり得、直線状又は分岐状であり得る。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは約２ｋＤから約１００ｋＤａ及びより好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲、例えば、１０、２０、３０、４０又は５０ｋＤａである。このＰＥＧ基は、一般に、ＦＧＦ２１突然変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基）に対する、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通じたアシル化又は還元的アルキル化を介して、ＦＧＦ２１突然変異体に結合される。

【0095】

本発明のＦＧＦ２１突然変異体を含むポリペプチドのＰＥＧ付加は、具体的に、当技術分野で公知のＰＥＧ付加反応の何れかを用いて遂行することができる。このような反応は、例えば、次の文献：Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４－１０；欧州特許第０ １５４ ３１６号及び同第０ ４０１ ３８４号；及び米国特許第４，１７９，３３７号に記載されている。例えば、ＰＥＧ付加は、本明細書中に記載のような反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）を用いて、アシル化反応又はアルキル化反応を介して行うことができる。アシル化反応の場合、選択されたポリマーは、１個の反応性エステル基を有するはずである。還元的アルキル化の場合、選択されたポリマーは、１個の反応性アルデヒド基を有するはずである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは耐水性である。）又モノＣ_１－Ｃ_１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）。

【0096】

本発明のある実施形態において、ポリペプチドへのＰＥＧ基の結合のための有用なストラテジーは、溶液中での抱合体結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ）の形成を通じて、他方のＰＥＧに対して互いに反応性がある特別な官能性をそれぞれが有する、ペプチド及びＰＥＧ部分を組み合わせることを含む。このペプチドは、従来からの固相合成により容易に調製することができる。このペプチドは、特定の部位で適切な官能基で「予め活性化」されている。ＰＥＧ部分と反応させる前に、前駆体を精製し、完全に特性評価する。ＰＥＧでのペプチドの結合は通常、水相で行われ、逆相分析的ＨＰＬＣにより容易に監視することができる。ＰＥＧ付加ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製し、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析により特性評価することができる。

【0097】

多糖ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる水溶性ポリマーの別のタイプである。従って、多糖ポリマーに融合された本発明のＦＧＦ２１突然変異体は、本発明の実施形態を形成する。デキストランは、α１－６結合により主に連結されるグルコースの個々のサブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストランそれ自身は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、それ単独での又は別のビヒクル（例えばＦＣ）と組み合わせた、ビヒクルとしての使用に適切な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開ＷＯ９６／１１９５３参照。治療用又は診断用免疫グロブリンに結合されたデキストランの使用が報告されている。例えば、欧州特許公開第０ ３１５ ４５６（参照により本明細書によって組み込まれる。）参照。本発明は、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランの使用も包含する。

【0098】

一般に、化学修飾は、活性化ポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される何らかの適切な条件下で行うことができる。化学的修飾ポリペプチドを調製するための方法は、一般に、（ａ）ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体が１以上のポリマー分子に結合されるようになる条件下で、活性化ポリマー分子（ポリマー分子の反応性エステル又はアルデヒド誘導体など）とポリペプチドを反応させ、（ｂ）反応産物を得る、段階を含む。最適反応条件は、既知のパラメーター及び所望の結果に基づき決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きいほど、結合されるポリマー分子の割合が高くなる。本発明のある実施形態において、化学的修飾ＦＧＦ２１突然変異体は、アミノ末端に１個のポリマー分子部分を有し得る（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号参照）。

【0099】

本発明の別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体をビオチンに化学的にカップリングすることができる。次に、ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体をアビジンに結合させ、その結果として、アビジン、四価アビジン／ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体が得られる。ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体をジニトロフェノール（ＤＮＰ）又はトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合によりカップリングすることもでき、得られた複合体を抗－ＤＮＰ又は抗－ＴＮＰ－ＩｇＭで沈降させ、１０価の１０マー複合体を形成させる。

【0100】

一般に、本化学的修飾ＦＧＦ２１突然変異体の投与により改善させるか又は調整することができる状態には、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体に対して本明細書中に記載されるものが含まれる。しかし、本明細書中で開示される化学的修飾ＦＧＦ２１突然変異体は、非修飾ＦＧＦ２１突然変異体と比較した場合、さらなる活性を有し得、生物活性又はその他の特性（半減期の短縮又は延長など）の低下又は向上があり得る。

【0101】

９．ＦＧＦ２１突然変異体の治療組成物及びその投与
ＦＧＦ２１突然変異体を含む治療組成物は本発明の範囲内であり、特性の向上を示すいくつかの突然変異ＦＧＦ２１配列の識別を踏まえて、具体的に企図される。このようなＦＧＦ２１突然変異体医薬組成物は、投与方式との適合性のために選択された医薬的に又は生理学的に許容可能な製剤用物質と合わせて、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の治療的有効量を含み得る。

【0102】

許容可能な製剤用物質は、好ましくは、使用される投与量及び濃度で受容者に対して無毒性である。

【0103】

本医薬組成物は、例えば、本組成物の、ｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着又は浸透を、修飾、維持又は保存するための製剤用物質を含有し得る。適切な製剤用物質には、以下に限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸又はその他の有機酸など）、増量剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）、着色料、香味料及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）、縣濁剤、界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などのポリソルベート；トライトン；トロメタミン；レシチン；コレステロール又はチロキサパルなど）、安定性促進剤（スクロース又はソルビトールなど）、等張性促進剤（ハロゲン化アルカリ金属－好ましくは塩化ナトリウム又はカリウム－又はマンニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又は医薬アジュバント（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）及びその改訂版（あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる。）参照）。

【0104】

最適な医薬組成物は、例えば、意図する投与経路、送達方式及び所望の投与量に依存して、熟練者により決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記参照。）。このような組成物は、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の、物理学的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。

【0105】

医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、実際は、水性又は非水性であり得る。例えば、注射用の適切なビヒクル又は担体は、水、生理的食塩水又は人工脳脊髄液であり得、おそらく、非経口投与用の組成物中で一般的なその他の材料が追加され得る。中性緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる典型的ビヒクルである。その他の典型的医薬組成物は、ｐＨ約７．０－８．５のＴｒｉｓ緩衝液又はｐＨ約４．０－５．５の酢酸緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトール又は適切な代替物を含み得る。本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体組成物は、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で、最適な製剤用物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と所望の純度を有する選択された組成物を混合することによって保存用に調製され得る。さらに、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体産物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として処方され得る。

【0106】

非経口送達のために、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体医薬組成物を選択することができる。あるいは、本組成物を吸入のために又は消化管を通じた送達（経口など）のために選択することができる。このような医薬的に許容可能な組成物の調製は当技術分野の技術の範囲内である。

【0107】

製剤成分は、投与部位に対して許容可能である濃度で存在する。例えば、生理的ｐＨに又は僅かに低いｐＨ、通常は約５から約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために、緩衝液を使用する。

【0108】

非経口投与が企図される場合、本発明での使用のための治療用組成物は、医薬的に許容可能なビヒクル中で所望のＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体を含む、発熱物質不含の非経口投与に対して許容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のための特に適切なビヒクルは、無菌の蒸留水であり、この中で、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体が、的確に保存される、無菌、等張溶液として処方される。さらに別の調製は、デポー注射を介して送達され得る産物の制御又は持続性放出を可能とする、注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなどの物質との、所望の分子の処方を含み得る。ヒアルロン酸を使用することもでき、これは、循環中の持続時間を延長させる効果を有し得る。所望の分子の導入のためのその他の適切な手段には、移植可能な薬物送達装置が含まれる。

【0109】

ある実施形態において、医薬組成物を吸入用に処方することができる。例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、吸入用の乾燥粉末として処方することができる。エアロゾル送達用の推進剤とともにＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体吸入溶液を処方することもできる。また別の実施形態において、溶液を霧状化できる。肺投与は、化学修飾タンパク質の肺送達について記載する国際公開ＷＯ９４／２００６９にさらに記載されている。

【0110】

ある一定の製剤を経口投与することができることも企図される。本発明のある実施形態において、この方式で投与されるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体は、錠剤及びカプセルなどの固体投与形態の調合において通常使用される担体とともに又これらを使用せずに、処方することができる。例えば、バイオアベイラビリティーが最大となり、全身送達前の分解（ｐｒｅ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小となる胃腸管中の時点で、処方物の活性部分を放出するように、カプセルを設計することができる。ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の吸収を促進するために、さらなる物質が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、縣濁化剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用できる。

【0111】

別の医薬組成物は、錠剤の製造に適切である無毒性賦形剤との混合物中で、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の有効量を含み得る。滅菌水又は別の適切なビヒクル中で錠剤を溶解させることにより、単位用量形態で、溶液を調製することができる。適切な賦形剤には、以下に限定されないが、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウムなど）又は結合剤（デンプン、ゼラチン又はアカシアなど）又は潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなど）が含まれる。さらなるＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体医薬組成物は、持続性又は制御送達製剤中にＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体を含む製剤を含め、当業者にとって明らかである。リポソーム担体、生体内分解性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポー注射など、様々なその他の持続性又は制御送達手段を処方するための技術も当業者にとって公知である（例えば、国際公開ＷＯ９３／１５７２２（これは、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載）及びＷｉｓｃｈｋｅ＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８－３２７及びＦｒｅｉｂｅｒｇ ＆ Ｚｈｕ、２００４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１－１８（これらは、ミクロスフェア／微粒子調製及び使用について考察）参照）。

【0112】

持続性放出製剤のさらなる例には、造形品の形態の半透性ポリマーマトリクス、例えばフィルム又はマイクロカプセルが含まれる。持続性放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許第０ ０５８ ４８１号）、Ｌ－グルタミン酸及びγエチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７－５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、上記）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０ １３３ ９８８）を含み得る。持続性放出組成物は、リポソームも含み得る（これは、当技術分野で公知のいくつかの方法の何れかにより調製され得る。）。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－９２；及び欧州特許第０ ０３６ ６７６号、同第０ ０８８ ０４６号及び同第０ １４３ ９４９号参照。

【0113】

インビボ投与で使用しようとするＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体医薬組成物は、一般に、無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過により行い得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に行い得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、通常、無菌のアクセスポートがある容器（例えば、皮下注射用注射針により穿孔可能なストッパーがある、静脈溶液バッグ又はバイアル）に入れられる。

【0114】

医薬組成物を処方したら、溶液、縣濁液、ゲル、エマルジョン、固形物として又は無水もしくは凍結乾燥粉末として、これを無菌バイアル中で保存することができる。このような処方物は、即時使用形態で又は投与前に再構成を必要とする形態（例えば凍結乾燥）で保存することができる。

【0115】

具体的な実施形態において、本発明は、単回投与単位を調製するためのキットに関する。本キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第一の容器及び水性の処方物を有する第二の容器の両方を含有し得る。単腔型及び多室型のプレフィルドシリンジ（例えば液体シリンジ及びリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットも本発明の範囲内に含まれる。

【0116】

治療で使用しようとするＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体医薬組成物の有効量は、例えば治療内容及び目的に依存する。従って、当業者にとって当然のことながら、治療のための適切な投与量レベルは、送達される分子、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体が使用される適応症、投与経路及び患者の体格（体重、身体表面又は器官の大きさ）及び状態（年齢及び全身的健康）に一部依存して変動する。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投与量を滴定し、投与経路を変更することができる。
典型的投与量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。その他の実施形態において、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。さらにその他の実施形態において、投与量は、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、２０００μｇ／ｋｇ、３０００μｇ／ｋｇ、４０００μｇ／ｋｇ、５０００μｇ／ｋｇ、６０００μｇ／ｋｇ、７０００μｇ／ｋｇ、８０００μｇ／ｋｇ、９０００μｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇであり得る。

【0117】

投与頻度は、使用される処方物でのＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の薬物動態学的パラメーターに依存する。通常、臨床家は、投与量が所望の効果を達成するまで、組成物を投与する。従って、単回投与として、長期にわたる２回以上の投与（所望分子の同じ量を含有しても又はしなくてもよい。）として、又は移植デバイスもしくはカテーテルを介した連続的点滴として、本組成物を投与することができる。適切な投与量のさらなる改善は、当業者により日常的になされ、当業者により日常的に行われる業務の領域の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量－反応データの使用を通じて確定され得る。

【0118】

医薬組成物の投与経路は、例えば、経口による；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内又は病巣内経路による注射を通じた；（注射もされ得る）持続性放出系による；又は移植装置による、公知の方法に従う。必要に応じて、ボーラス注射により又は連続的に点滴により又は移植装置により、組成物を投与することができる。

【0119】

あるいは又はさらに、本組成物は、所望の分子が吸収されているか又は封入されている、膜、スポンジ又はその他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植装置を使用する場合、何れかの適切な組織又は器官にこの装置を移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス又は連続的投与を介するものであり得る。

【0120】

１０．ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体の治療での使用
代謝性疾患を含む（しかし、これに限定されない。）、多くの疾患、障害又は状態を、治療、診断、改善又は予防するために、ＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体を使用することができる。ある実施形態において、治療しようとする代謝性疾患は、糖尿病、例えば２型糖尿病である。別の実施形態において、この代謝性疾患は肥満である。その他の実施形態は、脂質異常症；高血圧；脂肪肝、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）など；心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症など；及び加齢などの、代謝状態又は疾患を含む。

【0121】

適用において、糖尿病又は肥満などの疾患又は状態は、治療的有効用量の量で治療を必要とする患者に本明細書中に記載のようなＦＧＦ２１ポリペプチド突然変異体を投与することにより治療され得る。この投与は、ＩＶ注射、腹腔内注射、筋肉内注射又は錠剤もしくは液体製剤の形態での経口投与によるなど、本明細書中に記載のように行うことができる。殆どの状況において、所望の投与量は、本明細書中に記載のように、臨床家により決定され得、これはＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの治療的有効量に相当し得る。当業者にとって当然のことながら、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの治療的有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、核酸分子又はポリペプチドがその他の治療薬と組み合わせて投与されるか否か、免疫状態及び受容者の健康に依存する。「治療的有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、研究者、医師又はその他の臨床家により求められている、組織系、動物又はヒトにおける、生物学的又は医学的反応（治療される疾患又は障害の症状の改善を含む。）を誘発するＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの量を意味する。

【0122】

１１．抗体
本発明のＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに特異的に結合するが、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドに特異的に結合しない、抗体及び抗体断片が企図され、これは本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的ポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組み換え；キメラ；ヒト化、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）移植など；ヒト；１本鎖；及び／又は二特異性；ならびにその、断片；変異体；又はその化学的修飾分子であり得る。抗体断片には、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド上のエピトープに特異的に結合する抗体の一部が含まれる。このような断片の例には、全長抗体の酵素切断により生成するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）断片が含まれる。その他の結合断片には、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組み換えプラスミドの発現などの組み換えＤＮＡ技術により作製されるものが含まれる。

【0123】

ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド及びアジュバントの複数回の皮下又は腹腔内注射によって、動物（例えば、ウサギ又はマウス）において産生される。キーホールリンペットへモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤など、免疫付与しようとする種において免疫原性である担体タンパク質にＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドを結合させることは有用であり得る。また、免疫反応を促進するために、ミョウバンなどの凝集剤も使用される。免疫付与後、動物から採血し、抗ＦＧＦ２１突然変異体抗体力価について血清をアッセイする。

【0124】

培養において継続的細胞株による抗体分子の作製をもたらす何らかの方法を用いて、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－９７のハイブリドーマ法及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、１９８７）が含まれる。また、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドとの反応性があるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も本発明により提供される。

【0125】

本発明のモノクローナル抗体は、治療薬としての使用のために修飾され得る。ある実施形態において、このモノクローナル抗体は、重（Ｈ）及び／又は軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の種由来であるか又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同であり、一方で、鎖の残りの部分が、別の種由来であるか又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である、「キメラ」抗体である。また、このような抗体の断片も、これらが所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１－５５参照。

【0126】

別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６２号参照。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からそれに導入される１以上のアミノ酸残基を有する。

【0127】

例えば、ヒト抗体の対応領域に対してげっ歯類相補性決定領域の少なくとも一部を置換することにより、当技術分野に記載の方法を用いてヒト化を行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－３６参照）。

【0128】

本発明のＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに結合されるヒト抗体も本発明により包含される。内因性の免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いて、場合によっては担体に結合される、ＦＧＦ２１突然変異体抗原（即ち少なくとも６連続アミノ酸を有する。）での免疫付与により、このような抗体が作製される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１－５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３参照。ある方法において、このようなトランスジェニック動物は、その中で重及び軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性の遺伝子座を不能にし、ヒト重及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することにより作製される。所望の免疫系の改変全てを有する動物を得るために、次に、一部改変動物、即ち完全に改変されていない動物を、異種交配する。免疫原を投与される場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的である可変領域を含む、（例えばマウスではなく）ヒトアミノ酸配列のある抗体を産生する。例えば、国際公開ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９４／０２６０２参照。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開ＷＯ９１／１０７４１及びＷＯ９０／０４０３６及び欧州特許第０ ５４６ ０７３に記載されている。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載のように、宿主細胞での組み換えＤＮＡの発現によるか又はハイブリドーマ細胞における発現によって作製することもできる。

【0129】

代替的実施形態において、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリから作製することもできる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１参照）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリーの提示及び続く、最適の抗原へのそれらの結合によるファージの選択を通じて、免疫選択を模倣する。あるこのような技術は、国際公開ＷＯ９９／１０４９４に記載されている（これは、このようなアプローチを用いた、ＭＰＬ－及びｍｓｋ－受容体に対する高親和性及び機能的アゴニスト性抗体の単離について記載。）。

【0130】

キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体は、一般に、組み換え法により作製される。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、本明細書中に記載の材料及び手順を用いて発現させる。ある実施形態において、抗体は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において産生される。モノクローナル（例えばヒト）抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現によって又は本明細書中に記載のようなハイブリドーマ細胞における発現によって作製することができる。

【0131】

ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの検出及び定量のために、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイ（例えば、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４７－１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）参照）などの何らかの公知のアッセイ法において本発明の抗ＦＧＦ２１突然変異抗体を使用することができる。本抗体は、使用されている本アッセイ法に適切である親和性で、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに結合する。

【0132】

診断的適用の場合、ある種の実施形態において、検出可能部分で抗ＦＧＦ２１突然変異体抗体を標識することができる。検出可能部分は、直接又は間接的に検出可能なシグナルを生成させることが可能である何れかのものであり得る。例えば、検出可能部分は、放射性同位体、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ又は^６７Ｇａなど；蛍光又は化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなど；又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなど（Ｂａｙｅｒら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８－６３）であり得る。

【0133】

競合的結合アッセイは、標識された標準物質（例えば、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド又は免疫学的反応性があるその一部）の、抗ＦＧＦ２１突然変異体抗体の限定量との結合に対する、試験試料検体（例えばＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド）との競合能に依存する。試験試料中のＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの量は、抗体に結合する標準物質の量と反比例する。結合する標準物質の量を決定することを促進するために、抗体に結合した標準物質及び検体を、都合よく、未結合のままである標準物質及び検体から分離することができるように、この抗体は、通常、競合前又は後に不溶化される。

【0134】

サンドイッチアッセイは、一般に、それぞれが検出及び／又は定量しようとするタンパク質の、異なる免疫原部分又はエピトープに結合可能である、２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験試料検体は、一般に、固体支持体上に固定化される第一の抗体と結合し、その後、第二の抗体は検体に結合し、従って不溶性の３部構成の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。二次抗体は、それ自身、検出可能部分で標識され得るか（直接サンドイッチアッセイ）又は検出可能部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプは、酵素免疫吸着測定法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合に検出可能部分は酵素である。

【0135】

本発明の抗ＦＧＦ２１突然変異体抗体はまた、インビボ画像解析に対しても有用である。検出可能部分で標識される抗体は、動物に対して、好ましくは血流及びアッセイされる宿主において標識される抗体の存在及び場所に、投与することができる。本抗体は、核磁気共鳴、放射線又は当技術分野で公知のその他の検出手段の何れによるものであれ、動物において検出可能である何らかの部分で標識され得る。

【0136】

本発明のＦＧＦ２１突然変異体抗体は、治療薬として使用され得る。これらの治療薬は、一般に、それらが、それぞれ、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを促進するか又は低下させるという点において、アゴニスト又はアンタゴニストである。ある実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに特異的に結合可能である、及び、インビボ又はインビトロでＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの機能的活性を阻害又は減弱可能である、抗体又はその結合断片である。ある実施形態において、本アンタゴニスト抗体は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの機能的活性を阻害する。別の実施形態において、本抗ＦＧＦ２１突然変異抗体は、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドとＦＧＦ受容体との間での相互作用を妨害可能であり、それにより、インビトロ又はインビボでＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド活性を阻害又は抑制する。アゴニスト及びアンタゴニスト抗ＦＧＦ２１突然変異抗体は、当技術分野で周知のアッセイをスクリーニングすることにより同定される。

【0137】

本発明はまた、ＦＧＦ２１突然変異体抗体と、生体試料中でＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドレベルを検出するために有用なその他の試薬と、を含むキットに関する。

【0138】

このような試薬は、検出可能標識、ブロッキング血清、陽性及び陰性対照試料及び検出試薬を含み得る。

【0139】

（実施例）
続く実施例は、本発明の具体的な実施形態及びその様々な使用の実例である。これらは、単に説明を目的として記されるものであり、何ら本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例1】

【0140】

ＦＧＦ２１発現コンストラクトの調製
成熟ＦＧＦ２１配列の５’及び３’末端に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする核酸配列を得た。表２は、成熟ＦＧＦ２１配列を増幅するために使用したプライマーを列挙する。

【0141】

【表2】

【0142】

ＦＧＦ２１発現コンストラクトを調製するために使用したプライマーにより、適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）又はｐＡＭＧ３３（Ａｍｇｅｎ；Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ））への配列の直接的クローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位が組み込まれた。発現ベクターｐＡＭＧ３３は、低コピー数Ｒ－１００複製起点、修飾されたｌａｃプロモーター及びカナマイシン－耐性遺伝子を含有する。発現ベクターｐＥＴ３０は、ｐＢＲ３２２由来複製起点、誘導性Ｔ７プロモーター及びカナマイシン－耐性遺伝子を含有する。ｐＡＭＧ３３からの発現がより高いことが分かった一方で、ｐＥＴ３０はより信頼性の高いクローニングベクターであることが分かった。従って、本願で記載されるコンストラクトの殆どは最初にｐＥＴ３０において作製し、効力についてスクリーニングした。さらなる増幅のために、次に、選択配列をｐＡＭＧ３３に遺伝子移入した。

【0143】

４０．６５μＬ ｄＨ_２Ｏ、５μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ反応緩衝液（１０ｘ）、１．２５μＬ ｄＮＴＰミックス（４０ｍＭ－４ｘ１０ｍＭ）、０．１μＬテンプレート（１００ｎｇ／ｍＬ）、１μＬプライマー１（１０μＭ）、１μＬプライマー２（１０μＭ）及び１μＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含有する反応混合物中でＦＧＦ２１配列を増幅させた。９５℃で２分間加熱し、次に、９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間（１サイクルごとに追加的に１℃ずつ低下させる。）及び７２℃で１５秒間／キロベース（所望の産物）を１０回繰り返し、続いて９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間及び７２℃で１５秒間／キロベース（所望の産物）を２０サイクル繰り返し、続いて、７２℃で３分間加熱することによって、増幅反応を行った。増幅産物を制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩ、ＤｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、適切なベクターに連結し、次いでコンピーテント細胞に形質転換した。

【実施例2】

【0144】

細菌からのＦＧＦ２１タンパク質の精製
続く実施例において、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１突然変異体及びＦＧＦ２１融合タンパク質を含む様々なＦＧＦ２１タンパク質を細菌発現系で発現させた。下記で述べる発現後、別段の断りがない限り、この実施例に記載のとおりにＦＧＦ２１タンパク質を精製した。

【0145】

野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドを精製するために、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ緩衝液中のグアニジン塩酸塩及びＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で、細菌の封入体、二重洗浄封入体（ＤＷＩＢ）からの短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド及びＦＧＦ２１突然変異体を可溶化し、次いで、室温で１時間混合し、ｐＨ９．５の、尿素、アルギニン、システイン及びシスタミン塩酸塩を含有するリフォールディング緩衝液に可溶化混合液を添加し、次いで、５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７－６３；Ｍａｎｎａｌｌら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３－３４；Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９７、「Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）５７－９９；及びＩｓｈｉｂａｓｈｉら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１－６参照）。

【0146】

可溶化及びリフォールディング後、０．４５ミクロンフィルターを通じて混合液をろ過した。次に、２０ｐｓｉの膜間圧（ＴＭＰ）で１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ Ｏｍｅｇａカセットを用いて、リフォールディングプールをおよそ１０倍濃縮し、２０ｐｓｉのＴＭＰで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の３カラム体積を用いてダイアフィルトレーション処理した。

【0147】

次に、ＱセファロースＨＰレジンを用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーに、透明化試料をかけた。ｐＨ８．０で５℃にて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ中０から２５０ｍＭ ＮａＣｌの直線的塩濃度勾配を実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりピーク分画を分析し、プールした。

【0148】

次に、フェニルセファロースＨＰレジンを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に、ＡＥＸ溶出プールをかけた。ｐＨ８．０及び周囲温度で、０．７Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの直線的な減少勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ピーク分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０－８５）により分析し、プールした。

【0149】

２０ｐｓｉのＴＭＰで７ｍｇ／ｍＬになるまで、１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ Ｏｍｅｇａ ０．２ｍ^２カセットでＨＩＣプールを濃縮した。２０ｐｓｉのＴＭＰで、１０ｍＭ ＫＰＯ_４、５％ソルビトール、ｐＨ８．０ ５カラム体積で濃縮液をダイアフィルトレーション処理し、回収した濃縮液を５ｍｇ／ｍＬに希釈した。最終的に、Ｐａｌｌ ｍｉｎｉ－Ｋｌｅｅｎｐａｃ ０．２μＭ Ｐｏｓｉｄｙｎｅ膜を通じて溶液をろ過した。

【0150】

細菌封入体からＦＧＦ２１融合タンパク質及びＦＧＦ２１融合突然変異タンパク質を精製するために、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ緩衝液中でグアニジン塩酸塩及びＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で、二重洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を可溶化し、次いで、室温で１時間混合し、ｐＨ９．５の、尿素、アルギニン、システイン及びシスタミン塩酸塩を含有するリフォールディング緩衝液に可溶化混合液を添加し、次いで５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７－６３；Ｍａｎｎａｌｌら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３－３４；Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９７、「Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）５７－９９；及びＩｓｈｉｂａｓｈｉら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１－６参照）。

【0151】

可溶化及びリフォールディング後、１０ｋＤ透析チューブを用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の５体積に対して、混合液を透析した。５０％酢酸を用いて、透析したリフォールディング液のｐＨを５．０に調整し、次いで、４Ｋで３０分間にわたり遠心により透明化した。

【0152】

次に、ＱセファロースＨＰレジンを用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーに、透明化試料をかけた。ｐＨ８．０で５℃にて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ中０から２５０ｍＭ ＮａＣｌの直線的塩濃度勾配を実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０－８５）によりピーク分画を分析し、プールした。

【0153】

次に、フェニルセファロースＨＰレジンを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に、ＡＥＸ溶出プールをかけた。ｐＨ８．０及び周囲温度で、０．６Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの直線的に減少する勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ピーク分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、プールした。

【0154】

ＨＩＣ段階後、次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．２％スクロース、３．３％ソルビトール、ｐＨ８．５ ６０体積でプールを透析した。ｊｕｍｂｏｓｅｐを用いて、透析プールを５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終的に、Ｐａｌｌ ｍｉｎｉ－Ｋｌｅｅｎｐａｃ ０．２μＭ Ｐｏｓｉｄｙｎｅ膜を通じてこの溶液をろ過した。

【実施例3】

【0155】

短縮ＦＧＦ２１タンパク質の調製及び発現
下記のような野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅によって、表３で列挙される短縮ＦＧＦ２１タンパク質をコードするコンストラクトを調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのコンストラクトは実施例１で記載する。）。

【0156】

【表3】

【0157】

欠失させようとするコドン（単数又は複数）の上流及び下流の領域と相同である配列を有するプライマーを用いて、短縮ＦＧＦ２１タンパク質コンストラクトを調製した（結果として短縮）。このような増幅反応で使用されるプライマーはまた、増幅された産物の再環状化を可能とするための重複配列のおよそ１５ヌクレオチドも与えた（即ち、ここで、ベクター全体は所望の突然変異を有する。）。

【0158】

表４で示されるプライマーを用いて、成熟ＦＧＦ２１配列の位置１のヒスチジン残基を欠くＦＧＦ２１タンパク質（即ち、２－１８１短縮突然変異体）をコードする代表的な短縮ＦＧＦ２１コンストラクトを調製した。

【0159】

【表4】

【0160】

表４で示されるプライマーにより、下記で示されるようにヒスチジン残基が欠失するようになるが、ここで、上の配列（配列番号１０）は、Ｎ末端メチオニンを含む成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの一部であり、第二の配列はセンスプライマー（配列番号７）であり、第三及び第四の配列（配列番号１１及び１２）はＦＧＦ２１発現コンストラクトの一部であり、第五の配列はアンチセンスプライマー（配列番号９）である：

【0161】

【化1】

【0162】

実施例１に記載のＰＣＲ条件を基本的に用いて、短縮ＦＧＦ２１タンパク質コンストラクトを調製した。制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで増幅産物を消化し、次いで、コンピーテント細胞に形質転換した。ポリメラーゼにより生じたエラーがないことを確認するために、得られたクローンの配列決定を行った。

【0163】

特定の短縮ＦＧＦ２１タンパク質をコードするコンストラクトでコンピーテントＢＬ２１（ＤＥ３）又はＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を形質転換することによって、短縮ＦＧＦ２１タンパク質を発現させた。通気を制限して、４０μｇ／ｍＬカナマイシンを追加したＴＢ培地中で形質転換体を一晩増殖させ、翌朝、空気を供給し、短い回復時間の後、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ中で誘導した。誘導から１８－２０時間後、ＦＧＦ２１突然変異体を遠心により回収した。

【実施例4】

【0164】

短縮ＦＧＦ２１タンパク質のインビトロ活性
ＥＬＫ－ルシフェラーゼインビトロアッセイにおいて野生型ＦＧＦ２１活性を保持する短縮ＦＧＦ２１タンパク質を同定するために実験を行った。表５は、Ｎ末端、Ｃ末端又はＮ末端及びＣ末端の両方に短縮があるＦＧＦ２１タンパク質に対して得られた結果をまとめる。組み換えヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を用いてＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイを行った（２９３Ｔ細胞はβ－ｋｌｏｔｈｏ及びルシフェラーゼレポーターコンストラクトを過剰発現する。）。これらのコンストラクトはまた、ＧＡＬ４－ＥＬＫ１及び５ｘＵＡＳ－Ｌｕｃ、Ｇａｌ４結合部位の５個のタンデムコピーを含有するプロモーターにより支配されるルシフェラーゼレポーターをコードする配列も含有する。β－ｋｌｏｔｈｏは、そのＦＧＦ受容体の活性化及び細胞内シグナル伝達の誘導（これにより、同様に、Ｅｒｋ及びＥＬＫリン酸化が導かれる。）のためにＦＧＦ２１により必要とされる共受容体である。ルシフェラーゼ活性は、リン酸化されたＥｒｋ／ＥＬＫ１のレベルにより制御され、ＦＧＦ２１活性を間接的に監視し定量するために使用される。

【0165】

６時間にわたり、野生型ＦＧＦ２１又はＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドの様々な濃度の存在下で２９３Ｔ細胞を培養し、次いでルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイすることによって、ＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイを行った。図１Ａ－１Ｂは、ＦＧＦ２１短縮突然変異体７－１８１及び８－１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮突然変異体１－１７２、１－１７１、１－１６９及び１－１６４（図１Ｂ）で行ったＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。ＦＧＦ２１短縮突然変異体３－１８１、４－１８１、５－１８１、７－１８１、８－１８１、１－１８０、１－１７８、１－１７７、１－１７６、１－１７５、１－１７４、１－１７３、１－１７２、９－１８１及び１－１４９のそれぞれに対してＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイにおいて得られた発光を図２で示す。

【0166】

野生型ＦＧＦ２１標準物質とＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドを比較し、野生型ＦＧＦ２１の効力の少なくとも５０％の効力を示す突然変異体を、ＦＧＦ２１活性を喪失しなかったものとみなし、表５で「＋」とした。

【0167】

【表5】

【0168】

まとめると、表５で与えられる結果から、１４以上のアミノ酸残基のＣ末端欠失（即ち、アミノ酸残基１－１６７からなるＣ末端短縮ＦＧＦ２１タンパク質及びより短いタンパク質）は、ＦＧＦ２１の活性を喪失することが示される。さらに、表５から、７以上のアミノ酸残基のＮ末端欠失（即ち、アミノ酸残基８－１８１からなるＮ末端短縮ＦＧＦ２１タンパク質及びより短いタンパク質）は、ＦＧＦ２１の活性を喪失することが示される。驚くことではないが、８から１４残基のＮ末端短縮及び１２又は３２残基のＣ末端短縮の両方がある短縮ＦＧＦ２１タンパク質は、ＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイにおいて活性を喪失していることが分かった。

【0169】

表５で与えられるデータと一致して、７アミノ酸残基未満のＮ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本発明の実施形態を構成する。同様に、１３アミノ酸残基未満のＣ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本発明の実施形態を構成する。

【実施例5】

【0170】

短縮ＦＧＦ２１タンパク質のインビボ活性
ＦＧＦ２１は、血糖、インスリン、トリグリセリド又はコレステロール値低下能；体重減少能；又は耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性向上能を含む、多くの生物学的活性を保持する。短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドをインスリン抵抗性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定の短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドの血糖低下能を測定することによって、インビボＦＧＦ２１活性について短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドをさらに分析した。試験しようとする短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に腹腔内注射し、１回の注射後、様々な時点で（例えば、注射から、０、６、２４、７２、１２０及び１６８時間後）血液試料を得た。ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で血糖値を測定し、血糖のベースライン値（即ち、時間０のもの）に対する血糖の％変化としてその結果を表した。

【0171】

ある実験の結果を図３で提供するが、これは、ＦＧＦ２１短縮突然変異体８－１８１及び９－１８１を注射したマウスにおいて検出された血糖の量を示す。この実験から、アミノ酸残基８－１８１を含む短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質はインビボで血糖低下活性を示し、また一方で注射から３及び６時間後に、その活性は野生型ＦＧＦ２１の活性より僅かに低いが、アミノ酸残基９－１８１を含む短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質はこのような活性を示さないことが明らかとなった。従って、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ分析により、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端からの７個以下のアミノ酸の欠失によって分子の生物学的活性は破壊されないことが示唆された（インビトロ分析で比較した場合。これは、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端からの７個のアミノ酸が欠失すると活性が破壊されることを示唆する。）。

【0172】

インビトロ及びインビボアッセイでの特定のＮ末端短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えばＦＧＦ２１ ８－１８１）により得られた異なる結果は、効果的なシグナル伝達におけるβ－ｋｌｏｔｈｏ及びＦＧＦ受容体とのＦＧＦ２１の相互作用により説明することができる。特に、ＦＧＦ２１は、共受容体β－ｋｌｏｔｈｏ及びＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を含む二重受容体複合体を活性化し、チロシンキナーゼを含むシグナル伝達カスケードを開始させる。ＦＧＦ２１のＮ末端は、ＦＧＦＲの結合及び活性化に関与し、一方でＦＧＦ２１のＣ末端はβ－ｋｌｏｔｈｏ相互作用に必要とされることが分かっている（Ｙｉｅら、２００９ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８３：１９－２４）。共受容体β－ｋｌｏｔｈｏが過剰発現され、ＦＧＦＲが正常レベルで発現されている２９３腎臓細胞において、ＥＬＫ－ルシフェラーゼインビトロアッセイを行う。ＦＧＦＲの量は、β－ｋｌｏｔｈｏの量に対して低く、従って、２９３細胞でのβ－ｋｌｏｔｈｏのＦＧＦＲに対する比は、非生理的であり、これは、受容体複合体形成、最終的にはリガンド結合及びＦＧＦＲの活性化に影響を与え得る。２９３インビトロ系は、Ｎ末端短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドに対してより脆弱であると思われ、従って、ＦＧＦ２１ ８－１８１などの試験Ｎ末端短縮突然変異体の一部に対して活性喪失という結果を引き起こしている可能性がある。従って、特定のＮ末端短縮ＦＧＦ２１突然変異体が野生型ＦＧＦ２１活性を保持したか否かを調べる上で、インビボアッセイでのそのＦＧＦ２１突然変異体の活性は解決の手がかりをもたらすものであると考えられた。従って、８個未満のアミノ酸残基のＮ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドは本発明により包含される。

【実施例6】

【0173】

短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質の調製及び発現
Ｆｃ配列にタンパク質を融合させることによってタンパク質の半減期を延長させることができるので、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製し、分析した。ＳＯＥｉｎｇ（重複伸長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲにより増幅されたＦＧＦ２１配列から、表６で列挙する短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製した。
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部（配列番号１３）がＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れかに融合されるように、ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製した。

【0174】

【表6】

【0175】

特に、基本的に実施例１に記載の反応条件を用いて、一連の３回の増幅反応において、ＦＧＦ２１融合タンパク質コンストラクト（短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質をコードするものを含む。）を調製した。第一の反応において、ＮｄｅＩクローニング部位、Ｆｃ領域及びリンカー配列を含有する配列を生成させるために、プライマー対を設計した。第二の反応において、リンカーの重複部分、ＦＧＦ２１コード配列の一部及びＥｃｏＲＩクローニング部位を含有する配列を生成させるために、プライマー対を設計した。最後に、第三の反応において、最初の２つの反応の生成物を連結する目的でプライマー対を設計した。Ｆｃ－ＦＧＦ２１ １－１８１の構築のためのプライマーの代表的なセットを表７で列挙する。

【0176】

【表7】

【0177】

制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで最終反応生成物を消化し、ｐＥＴ３０ベクターに結合させ、次いでコンピーテント細胞に形質転換した。ポリメラーゼにより生じたエラーがないことを確認するために、得られたクローンの配列決定を行った。

【実施例7】

【0178】

短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質のインビボ活性
Ｆｃ配列に融合された短縮ＦＧＦ２１配列を含む融合タンパク質を作製し、インビボ活性についてアッセイした。１つの連続配列を形成するために、ＩｇＧ１ Ｆｃ分子を短縮ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れかに融合させることにより、短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製した。Ｎ末端融合物とＣ末端融合物とを区別するために、Ｆｃ分子がＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に融合されたＦＧＦ２１融合タンパク質をＦｃ－ＦＧＦ２１と呼び、Ｆｃ分子がＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に融合されたＦＧＦ２１融合タンパク質をＦＧＦ２１－Ｆｃと呼ぶ。

【0179】

ＦＧＦ２１は、血糖、インスリン、トリグリセリド又はコレステロール値低下能；体重減少能；又は耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性向上能を含む、多くの生物学的活性を保持する。インビボでのＦＧＦ２１活性を評価するために、ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド及びＦＧＦ２１融合ポリペプチドをインスリン抵抗性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定のＦＧＦ２１タンパク質の血糖値低下能を測定した。試験しようとするＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチド又はＦＧＦ２１融合ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に腹腔内注射し、１回の注射後、様々な時点で（例えば、注射から、０、６、２４、７２、１２０及び１６８時間後）血液試料を得た。ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で血糖値を測定し、血糖のベースライン値（即ち時間０のもの）に対する血糖の％変化としてその結果を表した。

【0180】

ある実験の結果を図４で提供するが、これは、ＰＢＳ対照、アミノ酸残基１－１８１を含む野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１対照又はアミノ酸残基５－１８１もしくは７－１８１を含む短縮Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質を注射したマウスにおいて観察された血糖値の％変化を示す。この実験から、アミノ酸残基５－１８１又は７－１８１を含む短縮Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質が、注射から６時間後に、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１の活性と同様の血糖低下活性を示すことが分かった。このようにして、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドのインビボ分析から、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端からの６個以下のアミノ酸の欠失は分子の生物学的活性に影響を与えないことが示された。しかし、インビボ分析からまた、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチドの血糖低下能が低下し、血糖値がベースラインに戻るのは注射から２４時間後であることが示された（野生型ＦＧＦ２１で同様の結果が得られた。）。短いインビボ活性が、実施例８に記載のように、ＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解の結果であることが分かった。

【0181】

別の実験の結果を図５で提供するが、これは、ＰＢＳ対照、アミノ酸残基１－１８１を含む野生型ＦＧＦ２１－Ｆｃ対照、残基１－１７５を含む短縮ＦＧＦ２１－Ｆｃ融合タンパク質又はアミノ酸残基１－１７１を含む短縮Ｆｃ－ＦＧＦ２１タンパク質を注射したマウスにおいて観察される血糖値の％変化を示す。この実験から、アミノ酸残基１－１８１を含む野生型ＦＧＦ２１－Ｆｃが、持続的なグルコース低下活性（その結果、注射後２４時間から１２０時間の時間にわたり、およそ３０％、血糖値が低下する。）を有することが分かった。アミノ酸残基１－１７１を含む短縮Ｆｃ－ＦＧＦ２１タンパク質では、遅発性の血糖低下活性が注射から７２時間後でのみ明らかとなった。しかし、観察される活性は野生型ＦＧＦ２１－Ｆｃの活性と同じである。残基１－１７５を含む短縮ＦＧＦ２１－Ｆｃ融合タンパク質は、血糖を低下させることにおいてインビボで活性ではない。

【0182】

まとめると、本明細書中に記載の短縮実験から、Ｎ末端短縮がある短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質は、野生型ＦＧＦ２１融合タンパク質と同様の血糖低下活性を示し、さらに、Ｆｃ分子が短縮ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に融合されている短縮ＦＧＦ２１融合タンパク質は、Ｆｃ分子が短縮ＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に融合されている融合タンパク質よりも高い活性を示すことが分かった。

【実施例8】

【0183】

ＦＧＦ２１の実際のインビボ分解
ＦＧＦ２１分解は、最初に、実施例７に記載のように、ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質コンストラクトにより見られた。インビボ薬物動態学的分析から、ヒトＦＧＦ２１の半減期は、急速なクリアランス及びインビボ分解のために、マウスにおいて約１時間という短い時間であることが示された。従って、ＦＧＦ２１の半減期を延長させるために、Ｆｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ－又はＣ末端に融合させた。しかし、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ－又はＣ末端に融合された融合タンパク質（及び特にＦｃ－ＦＧＦ２１融合物、即ち、Ｆｃ配列が成熟ＦＧＦ２１のＮ末端に融合されているもの）は、予想されたインビボでの効力を示さず、それどころか、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて２４時間以上、血糖低下活性を維持しないことが分かったので、Ｆｃ領域の融合によって、半減期の問題は完全に解決されなかった。図４に記載のように、Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質は、注射から６時間後、約３０-４０％、血糖値を低下させ、一方で、血糖値は、２４時間でベースライン値に戻った。

【0184】

野生型ＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解を続いて調べ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質でのインビボ活性の急速な喪失は、ＦＧＦ２１のインビボ分解の結果であることが分かった。タンパク質分解性分解により、インビボで分子の生物学的活性が低下し、従って有効な半減期がより短くなるが、このような分解はその分子の治療での使用に悪影響を与える。従って、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質の分解が見られたことから、インビボでのＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解の研究及びこのような分解に対して耐性があるＦＧＦ２１突然変異体の同定に至った。

【0185】

分解の部位を調べるために、雄Ｃ５７Ｂ６マウスに注射後様々な時間点で得られた野生型ヒトＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質において、ＬＣ－ＭＳ分析及びエドマン配列解析を行った。エドマン配列解析は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端が分解を受けたか否かの確認に役立った。Ｆｃ配列がヒトＦＧＦ２１のＮ末端に融合されている場合、分解は、融合分子のヒトＦＧＦ２１部分の、アミノ酸残基１５１と１５２との間及びアミノ酸残基１７１と１７２との間のペプチド結合で起こることが分かった（上記の残基の付番は、成熟ＦＧＦ２１配列に基づいており、融合タンパク質のＦｃ部分を含まない。）。１７１－１７２での分解が最初に起こり、続いて１５１－１５２での分解が起こることが分かった。１７１－１７２での分解は、律速段階であると思われ、分子の半減期に関与する。Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合された場合、分解は、アミノ酸残基４と５との間及びアミノ酸残基２０と２１との間のペプチド結合で起こることが分かった。これらの実験の結果として、Ｆｃ配列が、分解から、Ｆｃ配列に隣接するＦＧＦ２１配列の部分を保護すると思われることが明らかになった。野生型ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質のインビボ分解の分析をカニクイザルにおいてさらに行った。これらの研究から、アミノ酸残基１７１－１７２でのＦＧＦ２１の切断部位がサルにおいて分解の主要な部位であり、この分解部位がマウスと霊長類との間で保存されていることが確認された。

【実施例9】

【0186】

ＦＧＦ２１タンパク質分解耐性突然変異体の同定
主要なタンパク質分解活性の部位である野生型ＦＧＦ２１配列の位置を実験的に調べることにより、適切なＦＧＦ２１突然変異体を同定し、特異的なアミノ酸置換をこれらの部位に導入した。アミノ酸置換は、（実施例８に記載のような）その他の種とのＦＧＦ２１配列保存及びその他のアミノ酸残基との生化学的保存に基づいた。野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入されたか又は導入することができるアミノ酸置換の一覧を表８で与えるが、表８は単なる例示であり、その他の置換を行うことができる。表８で与えられる位置の番号は、１８１アミノ酸残基からなる成熟ＦＧＦ２１タンパク質での残基の位置に対応する。

【0187】

【表8】

【実施例10】

【0188】

Ｆｃ－ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１－Ｆｃ分解のインビボ分析
融合タンパク質をマウスに注射し、様々な時間点でマウスから採血し、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により血清を分析することによって、インビボでのＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質の安定性を調べた。特に、（実施例２に記載のようにＥ．コリで発現させ、精製した）Ｆｃ（５）ＦＧＦ２１又は（標準的手順に従い、哺乳動物細胞で発現させ、精製した）ＦＧＦ２１（３）Ｆｃ １０ｍｇ／ｋｇをマウスに腹腔内注射した。注射から６、２４及び４８時間後にマウスから採血し（表９）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で前処理したＥＤＴＡチューブに回収した。１２，０００ｇで１０分間、試料を遠心することによって、血漿を分離した。抗ヒト－Ｆｃアガロースレジンを用いて、血液からＦＧＦ２１タンパク質をアフィニティー精製した。

【0189】

【表9】

【0190】

ＬＣ－ＭＳによりアフィニティー精製試料を分析する前に、参照物質としてＦｃ－ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１－Ｆｃタンパク質標準物質を分析した。タンパク質標準物質は、トリス［２－カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元したか又は還元しなかった。ＬＣＱ Ｃｌａｓｓｉｃイオントラップ質量分析装置にカラム流出液を噴霧し、ＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを用いて、ＬＣ－ＭＳにより、還元及び非還元標準物質を分析した。還元試料のノイズ除去スペクトルがより明瞭であったので、ＬＣ－ＭＳ分析前にアフィニティー精製試料を還元した。

【0191】

還元Ｆｃ（５）ＦＧＦ２１標準物質及び試料Ｄ６、Ｄ２４及びＤ４８に対する実測質量を図６Ａ－６Ｄで示す。還元ＦＧＦ２１（３）Ｆｃ標準物質及び試料Ｅ６、Ｅ２４及びＥ４８に対する実測質量を図７Ａ－７Ｄで示す。ＬＣ－ＭＳにより測定されたようなタンパク質及び断片のＮ末端を確認するために、標準物質及び試料溶出物のうちいくつかをエドマン配列解析にかけた。標準物質及び試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を表１０で示す。

【0192】

【表10】

【0193】

表１０で示されるように、アフィニティー精製試料全てが、僅か循環６時間後に、ある程度の分解を示した。循環２４時間後、Ｆｃ－ＦＧＦ２１の主要な産物は、アミノ酸残基１－４０４からなる断片であり、これはＤ及びＥ試料の両方で見られた。しかし、Ｅ試料において、ＦＧＦ２１－Ｆｃの主要な産物は、アミノ酸残基５－４１０からなる断片であった。両方の試験融合タンパク質について、融合タンパク質のＦＧＦ２１部分は、そのタンパク質のＦｃ部分よりも分解され易かった。

【実施例11】

【0194】

タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体及び融合タンパク質の調製及び発現
下記のような野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅によって、表１１で列挙されるＦＧＦ２１突然変異体をコードするコンストラクトを調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築は実施例１に記載する。）。これらの実験の目標は、タンパク質分解に耐性があり、半減期がより長いＦＧＦ２１突然変異体を作製することであった。

【0195】

【表11】

【0196】

突然変異を導入しようとするコドン（単数又は複数）の上流及び下流領域と相同である配列を有するプライマーを用いて、ＦＧＦ２１突然変異コンストラクトを調製した。このような増幅反応で使用したプライマーはまた、増幅産物の再環状化を可能とするための、重複配列のおよそ１５ヌクレオチドも与えた（即ち、ここでベクター全体は、所望の突然変異体を有する。）。

【0197】

表１２で示されるプライマーを用いて、ネイティブグリシン残基の代わりに位置１７０にグルタミン酸残基を有するＦＧＦ２１突然変異体をコードする典型的なＦＧＦ２１突然変異コンストラクト（即ちＧ１７０Ｅ突然変異体）を調製した。

【0198】

【表12】

【0199】

表１２で示されるプライマーにより、下記で示されるような、グルタミン酸残基でのグリシン残基の置換が可能になる（ここで、上の配列は、センスプライマー（配列番号１８）であり、第二及び第三の配列（配列番号２０及び２２）は、ＦＧＦ２１発現コンストラクトの一部であり、第四の配列はアンチセンスプライマー（配列番号２１）：

【0200】

【化2】

である。

【0201】

基本的に実施例１に記載のＰＣＲ条件を用いて、ＦＧＦ２１突然変異体コンストラクトを調製した。制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで増幅産物を消化し、次いで、コンピーテント細胞に形質転換した。ポリメラーゼにより生じたエラーがないことを確認するために、結果として得られるクローンの配列決定を行った。本明細書中、例えば実施例６に記載のように、Ｆｃ－ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１－Ｆｃ融合タンパク質を作製した。

【0202】

特定の突然変異体をコードするコンストラクトを用いてコンピーテントＢＬ２１（ＤＥ３）又はＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を形質転換することによって、ＦＧＦ２１突然変異体を発現させた。４０μｇ／ｍＬカナマイシンを追加したＴＢ培地中で通気を制限して、形質転換体を一晩増殖させ、翌日通気し、短時間の回復時間の後、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ中で誘導した。誘導から１８－２０時間後、遠心することによって、ＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドを回収した。

【0203】

ＦＧＦ２１突然変異体をまた、予想される免疫原性についても分析した。タンパク質に対する免疫反応は、抗原プロセシング及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合部位での提示により促進される。この相互作用は、タンパク質を認識する抗体の成熟におけるＴ細胞ヘルプに必要とされる。ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合部位の特徴が分かっているので、タンパク質が、一連の共通のヒト対立遺伝子に結合し得る特異的配列を有するか否かを予想することが可能である。直線状のアミノ酸ペプチド配列が免疫寛容性を破壊する可能性があるか否かを判断するために、参考文献及びＭＨＣクラスＩＩ結晶構造に基づき、コンピュータアルゴリズムを作成した。点突然変異、特にＦＧＦ２１突然変異体が殆どのヒトにおいて抗原特異的Ｔ細胞を増加させるか否かを調べるために、ＴＥＰＩＴＯＰＥコンピュータプログラムを使用した。各ＦＧＦ２１突然変異体の直線状タンパク質配列の分析に基づき、免疫原性を促進することが予想される突然変異体はなかった。

【実施例12】

【0204】

ＦＧＦ２１分解におけるリンカー配列の影響
Ｆｃ配列とＦＧＦ２１配列との間のより長いアミノ酸リンカーの存在が、ＦＧＦ２１分解に影響を与えるか否かを調べるために、Ｆｃ領域が、配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）を有する１５アミノ酸のリンカーによりＦＧＦ２１配列から分離されたＦＧＦ２１融合タンパク質をマウスに注射し、様々な時間点でそのマウスから採血し、ＬＣ－ＭＳにより血清を分析した。特に、２３ｍｇ／ｋｇのＦｃ（１５）ＦＧＦ２１又はＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ（Ｅ．コリから取得）をマウスに注射し、６、２４及び４８時間で採血し、抗ヒト－Ｆｃアガロースレジンを用いて採取血液をアフィニティー精製した。

【0205】

ＬＣ－ＭＳにより精製試料を分析する前に、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１（１５）Ｆｃタンパク質標準物質を参照物質として分析した。タンパク質標準物質は、ＴＣＥＰで還元したか又は還元しなかった。ＬＣＱ Ｃｌａｓｓｉｃイオントラップ質量分析装置にカラム流出液を噴霧して、ＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを用いて、ＬＣ－ＭＳにより、還元及び非還元標準物質の両方を分析した。還元試料のノイズ除去スペクトルがより明瞭であったので、ＬＣ－ＭＳ分析前にアフィニティー精製試料を還元した。

【0206】

還元Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１標準物質及び様々な時間点で採取した対応するアフィニティー精製試料に対する実測質量を図８Ａ－８Ｄで示す。還元ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃ標準物質及び様々な時間点で採取された対応するアフィニティー精製試料に対する実測質量を図９Ａ－９Ｄで示す。タンパク質のＮ末端を確認し、ＬＣ－ＭＳにより観察された断片が何であるか予想することを促進するために、標準物質及び試料溶出物のうちいくつかをエドマン配列解析にかけた。標準物質及び試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果及び予想される断片の指標を表１３で示す。

【0207】

【表13】

【0208】

表１３で示されるように、アフィニティー精製試料は全て、循環の僅か６時間後にある程度の分解を示した。循環の２４時間後、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１の主要な産物は、アミノ酸残基１－４１４（試料の８５％）及び１－３９４（試料の１５％）からなる断片であり、ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの主要な産物は、アミノ酸残基１－４２３（試料の４０％）、６－４２３（試料の３５％）及び２２－４２３（試料の２５％）からなる断片であった。Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１（１５）Ｆｃタンパク質に対する、同定される切断点をそれぞれ図１０Ａ及び１０Ｂで示す。

【実施例13】

【0209】

注射から１－７日後の、タンパク質分解耐性Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体のインビボ活性
本明細書中に記載のように、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質分解性切断は、Ｆｃ配列の位置に依存し、融合タンパク質のＦｃ末端は、融合タンパク質のＦＧＦ２１末端よりも安定であった（即ち、Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質のＮ末端部分及びＦＧＦ２１－Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端部分がより安定であることが分かった。）。例えば、ＦＧＦ２１－Ｆｃの位置５及び２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１の位置１５１及び１７１で切断が特定された。

【0210】

これらの観察の結果として、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体を同定するために、試験を行った。Ｆｃ－ＦＧＦ２１のＬＣ－ＭＳ分析から、インビボタンパク質分解性分解が、最初にアミノ酸残基１７１－１７２の間で起こり、続いてアミノ酸残基１５１－１５２の間で分解が起こることが明らかとなる。位置１７１でタンパク質分解性分解を阻止することによって、位置１５１での切断が妨げられ得、効果的にその分子の半減期が延長される。しかし、位置１５１での切断が妨げられている、タンパク質分解耐性のある突然変異体は、プロテアーゼ攻撃を受けやすい位置１７１の残基を依然として保持し得、それにより、結果として、共受容体β－ｋｌｏｔｈｏ（これは、リガンド受容体親和性及びインビトロ及びインビボ能力の決定因子である。）の結合に関与することが知られている、最後の１０アミノ酸がない分子が生じる。従って、成熟ＦＧＦ２１の位置１７１の周囲のアミノ酸残基の突然変異誘発は、分子の、インビボ安定性、効能及び効力を向上させるためにより重要であると思われる。

【0211】

ＦＧＦ２１突然変異体をｏｂ／ｏｂマウスに腹腔内注射し、注射から０、０．２５、１、３、５及び７日後に、注射したマウスから採血し、次いで試料中の血糖値を測定することにより、特定のタンパク質分解耐性Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体のインビボ活性をアッセイした。ある実験の結果を図１１で示すが、これは、ＰＢＳ対照、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ／Ｓ１７２Ｌ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１５１Ａを注射したマウスで測定した血糖値を示す。図１２は、この実験で測定した場合の、血糖値の％変化を示す。この実験から、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ／Ｓ１７２Ｌ突然変異体が、最長で５日間、持続的な血糖低下活性を示すことが明らかとなるが、これは、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１の活性を上回る。Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１５１Ａ突然変異体では、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質と比較した場合、血糖低下活性の持続時間の延長は不十分なものであった。驚くべきことに、Ｆｃ（１５）－ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ突然変異体は、タンパク質分解耐性突然変異体ではなく、従って、野生型Ｆｃ（１５）－ＦＧＦ２１ポリペプチドと同様の分解プロファイルを有するにもかかわらず、この突然変異体は、野生型Ｆｃ（１５）－ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較した場合、インビボでの効力が向上したことが分かった。

【0212】

別の実験の結果を図１３で示すが、これは、ＰＢＳ対照、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｓ１７２Ｌを注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。図１４は、この実験において測定した場合の、血糖値の％変化を示す。上述の実験でのように、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ突然変異体は、持続性の血糖低下活性を示さないが、おそらくこれは、１７１部位での分解が依然として生じ得るからであり、これらのタンパク質を注射した動物における血糖値は注射後２４時間でベースラインに戻った。しかし、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｐ１７１Ａ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ／Ｓ１７２Ｌは、注射後最長で５日、最大血糖低下活性を示し、これは、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合タンパク質及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１５０Ａ／Ｇ１５１Ａ／Ｉ１５２Ｖ突然変異体を上回る。

【0213】

別の実験の結果を図１５で示すが、これは、ＰＢＳ対照又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ａ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｃ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｄ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｎ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｓを注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。図１６は、この実験で測定した場合の、血糖値の％変化を示す。この実験で試験したＦＧＦ２１突然変異体は全て、注射後最長で５日間、持続性の血糖低下活性を示した。

【0214】

別の実験の結果を図１７で示すが、これは、ＰＢＳ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｈ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｑ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙを注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。図１８は、この実験で測定した場合の、血糖値の％変化を示す。この実験で試験したＦＧＦ２１突然変異体は全て、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１と比較した場合、血糖低下活性が向上していた。

【実施例14】

【0215】

注射から６から１２０時間後の、タンパク質分解耐性Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体のインビボ分解
ＦＧＦ２１突然変異体をマウスに注射し、様々な時間点でマウスから採血し、ＬＣ－ＭＳにより血清を分析することによって、選択したＦＧＦ２１突然変異体のインビボ安定性を分析した。特に、注射前にそれぞれ１０ｍＭ ＨＣｌおよそ１８０μＬ中で希釈したＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌ突然変異体（実施例２に記載のようにＥ．コリから取得）の何れかをマウスに注射し、６、２４、４８、７２及び１２０時間で採血した。抗ヒト－Ｆｃアガロースレジンカラムを使用して、採取血液から、ＦＧＦ２１タンパク質をアフィニティー精製した。１０ｍＭ ＨＣｌを使用して、カラムから試料を溶出させた。ＦＧＦ２１コンストラクトは全て、ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ末端にＦｃ領域及び１５アミノ酸のリンカーを含む。野生型ＦＧＦ２１対照もマウスに注射した。

【0216】

ＬＣ－ＭＳによりアフィニティー精製試料を分析する前に、未処理野生型ＦＧＦ２１及び未処理ＦＧＦ２１突然変異体を参照物質として分析した。全ての標準物質及び時間点試料をＴＣＥＰで還元し、次いで、ＬＣＱ Ｃｌａｓｓｉｃイオントラップ質量分析装置にカラム流出液を噴霧して、ＡＣＥシアノ０．３ｍｍ ｘ３０ｃｍカラムを用いて、ＬＣ－ＭＳにより分析した。酢酸アンモニウムでアフィニティー精製試料を希釈し、ＴＣＥＰで還元し、次いで上述のようにＬＣ－ＭＳにより分析した。

【0217】

注射から０、６、２４及び４８時間後の野生型Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１の実測質量をそれぞれ図１９Ａ－１９Ｄで示す。注射から０、６、２４及び４８時間後のＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅに対する実測質量をそれぞれ図２０Ａ－２０Ｄで示す。注射から０、６、２４及び４８時間後のＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａに対する実測質量をそれぞれ図２１Ａ－２１Ｄで示す。注射から０、６、２４及び４８時間後のＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌに対する実測質量をそれぞれ図２２Ａ－２２Ｄで示す。

【0218】

７２及び１２０時間に採取した試料は全て、残りのＦｃ（１５）ＦＧＦ２１融合タンパク質よりも遥かに多いフィブリノーゲンの高分子量（非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、＞２００ｋＤ）の成分を含有することが分かった。その他の標準物質及び試料のＬＣ－ＭＳ分析の結果を表１４で示す。

【0219】

【表14】

【0220】

表１４で示されるように、野生型Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１及びＳ１７２Ｌ突然変異体の分解は循環２４時間後の時点で同様であると思われ、融合タンパク質の主要な産物は、アミノ酸残基１－４１４からなる断片であった。Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ突然変異体の分解産物もまた、循環２４時間後に採取された試料が、７０－８０％の無傷のタンパク質（アミノ酸１－４２４）及びアミノ酸残基１－４２１からなる断片２０－３０％を含有するという点で同様であると思われる。４８時間後でさえも、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ突然変異体は依然として、無傷のタンパク質を保持し、一方で、アミノ酸残基１－４２１からなる断片量の増加を示した。Ｆｃ－ＦＧＦ２１コンストラクトの以前の分析で観察されたように、融合タンパク質のＦＧＦ２１部分の分解が検出され、Ｆｃ部分は安定なままであることが分かった。野生型、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｓ１７２Ｌに対して同定された切断部位をそれぞれ図２３Ａ－２３Ｄで示す。

【実施例15】

【0221】

凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体の同定
野生型ＦＧＦ２１のある特性は、その凝集傾向である。２つの仮説に基づき、凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体を同定した。第一の仮説は、ＦＧＦ２１に関して、凝集（又は二量体化）が、親水性の水性の溶媒環境に露出されている疎水性残基により引き起こされる、疎水性相互作用及びＦＧＦ２１分子間のファンデルワールス相互作用により惹起される、ということである。第二の仮説は、凝集性を低下させる点突然変異の変異体を作製するために、ＦＧＦ２１活性を損なうことなく、これらの露出された疎水性残基が置換され得る、ということである。

【0222】

ＦＧＦ２１における露出された疎水性残基を同定するために、系統的理論的タンパク質工学的方法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用した。露出した疎水性残基を同定するために使用することができるＦＧＦ２１の既知のＸ線又はＮＭＲ構造がなかったので、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ；Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）モデリングソフトウェアを用いてＦＧＦ２１の３Ｄホモロジーモデルを作成するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から得たＦＧＦ１９（ＩＰＷＡ）の高解像度（１．３Å）Ｘ線結晶構造を使用した。ＰＤＢに寄託されたタンパク質の中でも、ＦＧＦ１９はアミノ酸配列相同性に関してＦＧＦ２１と最も近縁のタンパク質であるので、テンプレートとしてＦＧＦ１９を選択した。

【0223】

ＭＯＥを使用した次の方法により、溶媒露出度を計算した。表面積の第一の尺度（ＳＡ１）は、Å^２での残基の露出表面積として定義する。特定のアミノ酸残基がタンパク質の一次配列で複数回出現する一方で、残基の各出現は、とりわけ、タンパク質表面に対する残基の近接性、残基の側鎖の配向及び隣接アミノ酸残基の空間的位置の相違ゆえに、異なる表面積を有し得る。従って、表面積の第二の尺度（ＳＡ２）がもたらされ、このとき、関心のある残基が、その残基に隣接するか又は近接する残基と一緒に、タンパク質構造から抽出される。これらの空間的に近接する残基の側鎖を除去するために、これらの空間的に近接する残基をコンピュータ上でグリシンに変異させ、次いで、関心のある残基に対するＳＡ２を計算する（その特定の立体構造におけるその残基に対する可能な総表面積の尺度を与える。）ＳＡ２に対するＳＡ１の比（ＳＡ１／ＳＡ２）から、実際に露出されるその残基に対する予想表面積のパーセンテージを計測し得る。

【0224】

さらなる分析のために溶媒に非常によく露出されているいくつかの疎水性残基を選択し、選択した残基をその他の天然のアミノ酸残基で置換するために、これらの残基に対してコンピュータ上で点突然変異を生成させた。ＦＧＦ２１モデル及び、ＣＵＰＳＡＴウェブサイトで提供される説明書に従い、相互交流型ウェブ利用プログラムＣＵＰＳＡＴ（Ｃｏｌｏｇｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ）を用いて、様々な置換の結果起こるタンパク質温度安定性の変化を計算した。Ｐａｒｔｈｉｂａｎら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：Ｗ２３９－４２；Ｐａｒｔｈｉｂａｎら、２００７、ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：５４参照。凝集性が低下した点突然変異体の設計において、著しく不安定化するか又は疎水性である突然変異を除外した。親水性及び／又はイオン性の特性を向上させる、安定化（又は、稀に若干不安定化する）置換を凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体の候補とみなした。

【0225】

この合理的タンパク質工学アプローチを通じて得られたデータのまとめを表１５で示すが、これはまた、タンパク質凝集性が低下し、安定性が向上していると予想される代表的ＦＧＦ２１突然変異体も列挙する。

【0226】

【表15】

【実施例16】

【0227】

凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体及び融合タンパク質の調製及び発現
実施例１１に記載のような野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅によって、表１６で列挙されるＦＧＦ２１突然変異体をコードするコンストラクトを調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築は実施例１に記載。）。本明細書中、例えば実施例６に記載のように、融合タンパク質を作製した。

【0228】

【表16】

【0229】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、野生型ＦＧＦ２１、短縮ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１突然変異体及びＦＧＦ２１融合タンパク質を含む、様々なＦＧＦ２１タンパク質の凝集をアッセイした。様々な時間点に対して、分析しようとする試料を４℃、室温又は３７℃で温置し、次いでＳＥＣ分析にかけた。ＳＥＣカラムを備えたＢｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣシステムにおいて実験を行った。野生型ＦＧＦ２１に対して、移動相として２％イソプロピルアルコールを含有する２ｘＰＢＳとともに、ＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＥＣカラムを使用した。ＦＧＦ２１ Ｆｃ融合タンパク質及びＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドに対して、移動相として２ｘＰＢＳとともに、ＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＥＣカラムを使用した。

【実施例17】

【0230】

凝集性低下ＦＧＦ２１突然変異体のインビトロ活性
ＥＬＫ－ルシフェラーゼインビトロアッセイにおいて野生型ＦＧＦ２１活性を保持する凝集性低下突然変異体を同定するために、実験を行った。実施例４に記載のように、ＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイを行った。図２４Ａ－２４Ｃは、ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｒ、ＦＧＦ２１ Ｌ９９Ｄ及びＦＧＦ２１ Ａ１１１Ｔ（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｑ及びＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｋ（図２４Ｂ）；及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｙ、ＦＧＦ２１ Ａ１３４Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ１２９Ｋ（図２４Ｃ）において行ったＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。これらの実験の結果から、凝集性低下突然変異体のうち一部は、ＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイでアッセイした場合にＦＧＦ２１活性に悪影響を与えなかったことが明らかになる。

【実施例18】

【0231】

より長い半減期及びより低い凝集レベルを示すＦｃ（１５）ＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体の調製及び発現
タンパク質分解性分解を阻止することにより、凝集性を低下させることならびに半減期を延長させることが示される突然変異を含有する、多くのＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体を調製し、ＩｇＧ１Ｆｃ分子と結合させた。これらのＦＧＦ２１突然変異体は、基本的に実施例１１に記載のように調製した。

【実施例19】

【0232】

より長い半減期及びより低い凝集レベルを示すＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体のインビトロ試験
ＥＬＫ－ルシフェラーゼインビトロアッセイにおいて野生型ＦＧＦ２１活性を保持するＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体を同定するために、実験を行った。ＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイは実施例４に記載のように行った。

【0233】

図２５Ａ－２５Ｄは、Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｓ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ－ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｗ及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ（図２５Ｄ）において行ったＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。これらの実験の結果から、安定性又は安定性及び溶解性の両方をを向上させるための突然変異は、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１と比較した場合に、インビトロ活性を損なわなかったことが明らかになる。興味深いことに、ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ突然変異体は、野生型Ｆｃ－ＦＧＦ２１と比較して効能の向上を示した。

【0234】

図２６Ａは、４℃での１、２及び４日間にわたる、６５ｍｇ／ｍＬタンパク質の温置後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）及びＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋに対する％凝集の変化を示す。このデータから、Ａ４５Ｋ突然変異によって、野生型タンパク質と比較して、タンパク質の凝集性が低下することが示唆された。

【0235】

図２６Ｂは、４℃での１、６及び１０日間にわたる、６５ｍｇ／ｍＬタンパク質の温置後の、ＦＧＦ２１対照（ＷＴ）及びＦＧＦ２１ Ｐ７８Ｃ、Ｐ７８Ｒ、Ｌ８６Ｔ、Ｌ８６Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｒ、Ａ１１１Ｔ、Ａ１２９Ｄ、Ａ１２９Ｑ、Ａ１２９Ｋ、Ａ１３４Ｋ、Ａ１３４Ｙ及びＡ１３４Ｅについての％凝集変化を示す。このデータから、Ｌ８６Ｒ、Ｌ９８Ｃ、Ｌ９８Ｒ、Ａ１１１Ｔ、Ａ１２９Ｑ及びＡ１２９Ｋにより、野生型タンパク質と比較して、タンパク質の凝集性が低下することが示唆された。

【0236】

図２７は、ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１突然変異体ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ、ＦＧＦ２１ Ｌ５２Ｔ及びＦＧＦ２１ Ｌ５８Ｅにおいて行われたＥＬＫ－ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す。この実験から、ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ突然変異体が、野生型ＦＧＦ２１の効力を完全に保持し、野生型ＦＧＦ２１よりもさらに大きい効能を示すことが明らかになる。しかし、ＦＧＦ２１ Ｌ５２Ｔ及びＦＧＦ２１ Ｌ５８Ｅ突然変異体は、野生型ＦＧＦ２１と比較した場合、効能及び効力の低下を示す。

【0237】

図２８Ａ－２８Ｂは、１、４及び８日間にわたり４℃で温置した後の、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ ６－１８１／Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ及びＦＧＦ２１対照についての凝集レベルの変化を示す。この実験から、８日間にわたり、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ突然変異体が、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｇ１７０Ｅ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｐ１７１Ｅ突然変異体よりも低い凝集性を示したが、全ての３種類の突然変異体が、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１対照よりも低い凝集性を示したことが明らかになる。表１７は、４℃又は室温での０、２、３、４又は７日間にわたる温置後の、Ｆｃ－ＦＧＦ２１対照及びＦｃ－ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ突然変異体に対して得られた％凝集性を示す。

【0238】

【表17】

【実施例20】

【0239】

Ｆｃ－ＦＧＦ２１融合組み合わせ突然変異体の調製及び発現
上述のように、特異的な短縮及びアミノ酸置換の導入を通じて、ＦＧＦ２１の安定性及び溶解性を調整することができる。さらに、このような修飾ＦＧＦ２１タンパク質をヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部分と融合させることによって、ＦＧＦ２１安定性をさらに促進することができる。さらに、上記修飾の組み合わせを導入することによって、安定性及び溶解性の両方が向上したＦＧＦ２１分子を作製することができる。上述の技術を用いて、表１８で列挙されるＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体をコードする核酸配列を調製した。

【0240】

【表18】

【0241】

図２９は、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１組み合わせ突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ａ４５Ｋ／Ｐ１７１Ｇ又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇを注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。

【0242】

別の実験において、ＦＧＦ２１突然変異体Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇを野生型成熟ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１と並行して試験した。ある実験において、６時間にわたり、ＦＧＦ２１、Ｆｃ－ＦＧＦ２１又はＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇの様々な濃度の存在下で、組み換え２９３Ｔ細胞株を培養した。次に、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解液をアッセイした。図３０で示されるように、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇは、Ｆｃ－ＦＧＦ２１と同様の活性を有し、このことから、２つの点突然変異の導入によって、分子のインビトロ活性が変化しなかったことが示唆された。

【0243】

さらに別の実験において、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１と並行して、２種類の異なる温度、即ち室温及び４℃で、９日間にわたり、６５ｍｇ／ｍＬのＦｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇの安定性を評価した。温置時間後、次に、様々な温度での時間プロファイルに対する凝集性を調べるために、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで細胞溶解液を分析した。図３１Ａ及び３１Ｂで示されるデータから、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇにおいて、室温（図３１Ａの、黒三角、点線）及び４℃（図３１Ｂの、黒三角、点線）で、凝集形成速度が顕著に低下したことが示された。

【実施例21】

【0244】

Ｃ末端突然変異を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１突然変異体
組み合わせ突然変異体のインビボ安定性も試験した。具体的には、マウス及びカニクイザルにおいて、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇのインビボ安定性をＦｃ－ＦＧＦ２１の安定性と比較した。その結果は、両種において同様であることが分かった。カニクイザルの実験において、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ及びＦｃ－ＦＧＦ２１を２３．５ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射し、投与後８４０時間までの時間点で血清及び血漿の一定分量を回収した。１６８時間までの時間点を分析した。抗Ｆｃ試薬を用いて時間点試料をアフィニティー精製し、次いでＭＡＬＤＩ質量分析を用いて分析した。この結果は、この２つの分析間でよく相関した。

【0245】

免疫親和性ＭＡＬＤＩを用いて生成されたデータを分析して、Ｐ１７１部位での切断は、Ｐ１７１からＰ１７１Ｇの突然変異の結果として、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇ分子において解消されると思われた。しかし、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１ Ｌ９８Ｒ／Ｐ１７１Ｇに対して、３個以下のＣ末端残基の喪失の結果として生じる小さくゆっくりとした分解が観察された（図３２）。アミノ酸残基１７１と１７２との間のより切断が起こりやすい切断部位を図２０及び２１で示されるように妨害した後、その他のＦＧＦ２１突然変異体によっても、この３個のＣ末端残基での小さな切断が観察された。この３個のＣ末端残基切断は、連続した残基ごとのカルボキシペプチダーゼによるか又はアミノ酸残基１７９－１８０及び１８０－１８１で非特異的切断を伴うアミノ酸残基１７８及び１７９での特異的プロテアーゼ攻撃による分子のＣ末端からの切断の停止に相当し得る。Ｃ末端での２－３個のアミノ酸の喪失により、β－ｋｌｏｔｈｏ結合が減少し得、最終的にはその分子の効能及びインビボ活性が低下し得る。例えば、Ｙｉｅら、２００９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８３：１９－２４参照。Ｃ末端のカルボキシペプチダーゼ分解（と思われるもの）に対処するために、様々なＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドにアミノ酸残基「キャップ」を付加する影響を試験した。表１９で与えられるものを含む様々なコンストラクトを作製し、本明細書中に記載の技術を用いてアッセイした。表１９は、インビトロＥＬＫルシフェラーゼアッセイの結果をまとめる。

【0246】

適切なアミノ酸キャップは、１から１５アミノ酸長の間、例えば１、２、３、４、５、１０又は１５アミノ酸長であり得る。例えば、単一プロリン残基及び単一グリシン残基、２個のグリシン残基、５個のグリシン残基ならびにその他の組み合わせなど、キャップとして、アミノ酸の何らかの数及びタイプを使用することができる。キャップのさらなる例は、本実施例及び表１９で示す。

【0247】

さらに、アミノ酸残基１７８及び１７９におけるプロテアーゼ攻撃（と思われるもの）に対処するために、位置１７９、１８０及び１８１のアミノ酸残基の突然変異を試験した。再び、表１９で与えられるものを含む、様々なコンストラクトを作製し、本明細書中に記載の技術を用いてアッセイした。これらの部位でのキャップ及び突然変異の組み合わせの影響も調べた。表１９は、作製し、インビトロＥＬＫ－ルシフェラーゼアッセイで試験した（本明細書中に記載のように行った。）、代表的なコンストラクトをまとめる。本明細書中で使用される専門用語と一致して、ｈＦｃはヒトＦｃ配列（即ち、配列番号１３）を意味し、Ｌ１５は、１５残基を有するリンカー（即ち、配列番号２３）を指す。

【0248】

【表19】

【0249】

図３３は、ＰＢＳ対照、野生型ネイティブＦＧＦ２１、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）及び、プロリン又はグリシン残基の何れかがＣ末端に付加された２種類のキャップ付き分子、即ちＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の％変化を示す。本実施例において、野生型又は突然変異体ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端に残基を付加した場合、この残基は、得られたタンパク質におけるその位置で言及する。従って、「１８２Ｇ」は、成熟１８１残基野生型又は突然変異タンパク質のＣ末端にグリシン残基が付加されたことを指す。図３３は、ネイティブＦＧＦ２１が６時間にわたり血糖値を低下させ、一方で、試験した全ての３種類のＦｃ（１５）ＦＧＦ２１突然変異体が、少なくとも１２０時間にわたり、持続性の血糖低下活性を示したことを示す。融合分子のＦＧＦ２１成分のＣ末端にプロリン残基の付加を含む分子であるＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）は、最も効能が大きいと思われ、その結果、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）と比較して、最低血糖値が得られた。

【0250】

続く実験において、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）のインビボ活性を試験し、Ｃ末端に２個のグリシン付加を含むキャップ付き分子、即ちＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ １８３Ｇ）のインビボ活性と比較した。図３４は、その実験の結果を示す。図３４は、ＰＢＳ対照、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ １８３Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）を注射したｏｂ／ｏｂマウスで観察された血糖値の％変化を示す。

【0251】

図３４で示されるように、試験した分子は全て、ＰＢＳ対照と比較して、持続性のグルコース低下活性を示した。この実験により、Ｃ末端にプロリン付加のあるＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）のグルコース低下効力が、プロリンキャップなしの分子、例えばＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、若干向上したという以前の結果（図３３）が確認された。しかし、Ｃ末端での２個のグリシン残基の付加、例えばＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ １８３Ｇ）は、分子のインビボ効能を低下させ、インビボでのグルコース低下効果の持続時間を短縮するようであった。

【0252】

図３５は、ＰＢＳ対照又はＦＧＦ２１突然変異ポリペプチドＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｓ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の％変化を示す。全ての突然変異体が、同様の作用持続時間で同様のグルコース低下活性を示した。

【0253】

図３６は、ビヒクル対照、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）及びＦｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の％変化を示す。Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）は、血糖低下において効力が低かった。しかし、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（位置１８０のアミノ酸のアラニンがグルタミン酸に変異）は、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりも効力が高く、Ｆｃ（１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、血糖値をさらに２０％低下させた。これらのデータから、Ａ１８０Ｅ突然変異により、インビボでのＣ末端分解が減少し得、それにより、その分子のインビボ効能及び効力が向上することが示唆される。

【実施例22】

【0254】

アカゲザルの試験
本明細書中に記載の方法を用いて、Ｆｃ－リンカー－ＦＧＦ２１コンストラクトを作製した。このコンストラクトは、（Ｇｌｙ）５－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）３－Ｓｅｒ－（Ｇｌｙ）４－Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２３）にＣ末端で融合されたＩｇＧ１ Ｆｃ配列（配列番号１３）を含み、次にこれを成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端にＣ末端で融合させ、これに２つの突然変異Ｌ９８Ｒ及びＰ１７１Ｇを導入した。次に、本明細書中に記載のとおり、このコンストラクトを発現させ、精製し、タンパク質の二量体形態として単離した（この各単量体は、各単量体のＦｃ領域間の分子間ジスルフィド結合を介して連結された。）。この分子は、本実施例で「Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）」と呼び、配列番号３７によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を有する。この実施例において、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１の成熟型、即ち配列番号４を指す。

【0255】

２２．１ 試験計画
ＢＭＩ＞３５の非糖尿病雄アカゲザルに、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）コンストラクトを長期にわたり皮下（「ＳＣ」）投与した。成熟ＦＧＦ２１（即ち配列番号４）又はビヒクル対照の何れかでサルのその他の２つの群（１群あたりｎ＝１０）を処置した。

【0256】

何らかの試験化合物の投与前に４２日間動物を順応させ、次いで１０の群に分け、図３７で図示されるように、盲検で試験化合物又は対照物の複数回ＳＣ注射を行った。簡潔に述べると、各動物に化合物又はビヒクルを１日１回注射した。ＦＧＦ２１を毎日投与し、一方で、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）を週に１回投与した。図３７で示されるように、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）及びＦＧＦ２１用量を２週間ごとに漸増させた。この実験を通じて、体重及び摂餌を監視した。ＣＲＯに対して処置が分からないようにした。

【0257】

処置開始前に、２回の経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を行った。曲線下面積（ＡＵＣ）及び体重に基づく動物の分布が同様である３つの同等の群に動物を振り分けるために、ＯＧＴＴ１を使用した。第一のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ１）の群の振り分けを確認するために、第二のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ２）の結果を使用した。１回の試験（ＯＧＴＴ１）と次の試験（ＯＧＴＴ２）のＯＧＴＴプロファイルが一致しなかったサルは除外した。ＯＧＴＴ１及び２の結果を図３８Ａ及び３８Ｂで示し、ＡＵＣ測定は図３８Ｃで示す。ベースライン体重は図３８Ｄ、表２０で示す。

【0258】

低、中及び高用量の各用量処置の終了時に２週間ごとにＯＧＴＴ３、４及び５を行った。絶食動物から毎週血液試料を回収し、グルコース、インスリン、トリグリセリド値ならびに試験化合物レベルを測定するために使用した。３週間の休薬期間中も、血液試料を毎週回収した。

【0259】

ベースラインＯＧＴＴ１及びＯＧＴＴ２は、正常動物で見られるような予想グルコースプロファイルを示し、３０分で血漿グルコースが最大となり、３種類の異なる群に対する安定したＡＵＣが明らかになった。

【0260】

血漿化学に対する空腹時ベースライン値を表２０で示す。治療開始前に回収した血液試料において、血漿化学測定を行った。

【0261】

【表20】

【0262】

３種類の異なる用量レベルを選択し、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）に対して、それぞれ、低用量は、０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇであり、中程度の用量は、０．３及び１ｍｇ／ｋｇであり、高用量は、１及び５ｍｇ／ｋｇであった。マウスにおいて観察された用量反応に基づき、用量レベルを選択し、投与計画は、ヒトにおける予測注射頻度に基づいた。低及び中程度の用量に対してＦＧＦ２１の等モル用量を使用し、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）高用量を５ｍｇ／ｋｇに上昇させた（即ち、３ｍｇ／ｋｇの代わり（これは、１ｍｇ／ｋｇ ＦＧＦ２１用量に対して等モルであった。））。

【0263】

２２．２ 体重における試験化合物の影響
この実験において、毎週測定される体重における試験化合物の影響を調べるために、アカゲザルの異なる３つの群において、ベースラインからの％体重変化を毎週計算した。休薬期間の３週間の間も体重を測定した。表２０には、各群に対するベースライン体重値が含まれる。

【0264】

試験中、試験化合物の投与前後を通して、体重を追跡した。ビヒクル動物のベースラインからの体重％変化は、経時的に上昇し、一方で、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）及びＦＧＦ２１で処置した動物の体重は、図３９で示されるように、一連の６週間の処置期間にわたり、用量依存的に減少した。以前にげっ歯類で観察されたように（Ｘｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５８（１）：２５０－９（２００９））、ＦＧＦ２１での処置により、統計学的に有意に体重が減少した。Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）は、ＦＧＦ２１（それぞれ図４８及び図４７）よりも露出が大きく、これにより、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）がＦＧＦ２１よりも顕著な体重減少を示したという所見に対する考えられる理由が示される。

【0265】

２２．３．インスリン値における試験化合物の影響
一晩絶食させた後又は午後の食事の後に回収した血液試料中のインスリン値を測定した。

【0266】

ビヒクル、ＦＧＦ２１又はＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の何れかで処置したアカゲザルにおいて、及び３週間の休薬期間中に、毎週、アカゲザルの空腹時血漿インスリン値を測定した。最後のＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）注射からおよそ５日後及び最後のＦＧＦ２１注射からおよそ２１時間後に、空腹時血液試料を採取した。

【0267】

高用量処置中、ビヒクル又はＦＧＦ２１の何れかでの処置の第５及び第６週の間、給餌状態での血漿インスリン値をアカゲザルで測定した。Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）注射からおよそ３日後及び最後のＦＧＦ２１注射からおよそ２時間後に、給餌状態での血液試料を採取した。図４０は、全９週間の試験にわたる、空腹時インスリン値における、ビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の影響を示し、図４１は、第５及び６週の間に採取した試料から測定した、給餌状態でのインスリン値を示す。

【0268】

まとめると、２種類の最大用量で、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の両方が、統計学的に有意に空腹時及び給餌状態での血漿インスリン値を低下させた。グルコース値上昇が観察されることなく、ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）処置動物のインスリン値が低下したという所見から、インスリン感受性向上が示唆される。

【0269】

２２．４ ＯＧＴＴ（グルコース及びインスリン）における試験化合物の影響
処置開始後、３回のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ３、４及び５）を行った。、ビヒクル、ＦＧＦ２１又はＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）で６週間にわたり処置した動物において（高用量漸増計画の最後の２週間に相当）、ＯＧＴＴ５グルコース及びインスリン値プロファイルを測定した。最後のＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）注射からおよそ７日後及び最後のＦＧＦ２１注射からおよそ２１時間後に、ＯＧＴＴ５を遂行した。ＯＧＴＴ５グルコース及びインスリンプロファイルをそれぞれ図４２及び図４３で示す。図４２で示されるように、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）で処置した動物は、最大用量でのみ、最後の測定時間点で、ビヒクル処置動物と比較して、グルコースクリアランスが向上していた。最後の投与の終了時に、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）は、グルコースクリアランスの最強の改善を示した。ＦＧＦ２１ではグルコースクリアランスの向上が見られなかった。Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）は、ＦＧＦ２１よりも露出が大きく（それぞれ図４８及び図４７）、これにより、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）がＦＧＦ２１よりもグルコースクリアランスにおいて顕著な効果を示したという所見に対する可能な説明が与えられる。ＯＧＴＴ５中のインスリン値は、ビヒクルで処置した動物と比較して、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）で処置した動物において測定した最後の時間点で統計学的に有意に低下した。

【0270】

図４４で示されるように、アカゲザルの３つの異なる群における、低、中及び高用量のそれぞれの終了時に行った３回のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ３、４及び５）に対して、ベースラインからのグルコースＡＵＣ％変化を計算した。最後のＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）注射からおよそ７日後及び最後のＦＧＦ２１注射から２１時間後にＯＧＴＴ５を行い、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）が、統計学的に有意にＡＵＣ５を低下させたことが分かった。各群に対するベースラインＯＧＴＴ値を図３８Ｃで示す。

【0271】

ＯＧＴＴを行った日に空腹時血漿グルコース値を測定した。３つの動物群中で測定した空腹時血漿グルコース値において、統計学的有意差は見られなかった。

【0272】

２２．５ トリグリセリド値における試験化合物の影響
ビヒクル、ＦＧＦ２１又はＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の何れかで処置したアカゲザルで、及び３週間の休薬期間中に、毎週、アカゲザルにおいて、空腹時血漿トリグリセリド値の％変化を計算した。最後のＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）注射からおよそ５日後及び最後のＦＧＦ２１注射からおよそ２１時間後に、空腹時血液試料を採取した。処置開始後、毎週、トリグリセリド値を測定し、ベースラインからの％変化を図４５で示し、空腹時ベースライン値を表２０で示す。

【0273】

図４５示されるように、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）又はＦＧＦ２１の何れかで処置した動物は、トリグリセリド値の用量依存的低下を示し、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）は、ＦＧＦ２１と比較して、最大の低下効果を有した。

【0274】

図４６は、ビヒクル又はＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）又はＦＧＦ２１での治療の第５及び６週の間の、給餌状態でのアカゲザルから得た試料中の血漿トリグリセリド値を示す。Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）注射からおよそ３日後及び最後のＦＧＦ２１注射からおよそ２時間後に、給餌状態での血液試料を採取した。ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）で処置した動物における給餌状態での血漿トリグリセリド値は、ビヒクルで処置した動物のトリグリセリド値と比較して、統計学的に有意に低下した（図４６）。

【0275】

２２．６ 試験化合物の濃度
試験期間を通じておよそ等モル用量レベルで投与した試験化合物の曝露を評価した。投与前及び最後の注射からおよそ５日後に、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の濃度を測定した。投与前及び第５、１２、１９及び２６日に、ＦＧＦ２１レベルを測定した。最後の注射からおよそ２１時間後に、血液試料を採取した。

【0276】

各サルにおける試験化合物の個々の濃度を図４７及び４８で示す。図４７で示されるように、ＦＧＦ２１処置群の動物の大多数の濃度が定量限界に満たなかった。図４８は、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）処置群の動物では、各投与フェーズ中（同じ用量強度で２回の週用量）、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）のレベルが検出可能であったことを示す。各投与フェーズからの平均濃度は、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）に対して０．３から５ｍｇ／ｋｇに、ほぼ用量と比例して上昇した。両化合物に対して、各用量漸増フェーズ内での第一及び第二の週用量後に一定濃度であることにより実証されるように、僅かな蓄積がある。治療のない期間（休薬期間）中、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）レベルは、およそ第４７日（最終投与から１２日後）まで検出可能であり、その後は、定量（ＬＬＯＱ）の下限に満たなかった。

【0277】

各ＯＧＴＴ中、試験化合物の曝露も監視した。低及び中程度用量のＦＧＦ２１処置後、ＯＧＴＴ３及び４中、ＦＧＦ２１は検出可能ではなかった。しかし、高用量処置後、ＯＧＴＴ５中に、測定可能なレベルが観察された。図４９で示されるように、第三から第五のＯＧＴＴにわたり、漸増用量レベルで、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）レベルの用量比例的上昇が観察された。

【0278】

化合物レベルデータから、用量漸増方式で、各化合物、即ちＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の予想される量に動物が曝露されたことが確認される。測定されたＦＧＦ２１の量は大幅な変動が観察されたが、これは、最後の投与からおよそ２１時間後に試料採取が行われ、ＦＧＦ２１の半減期がおよそ１時間であることを考慮すると、予想される結果であった。

【0279】

２２．７ 結論
ＦＧＦ２１は、最高用量で、空腹時及び給餌状態での血漿トリグリセリド及びインスリン値を低下させ、体重を減少させた。Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）は、最高用量で、ＯＧＴＴを改善し、インスリン値を低下させ、用量依存的に空腹時及び給餌状態での血漿トリグリセリド値を低下させ、体重を減少させる。ＦＧＦ２１及びＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）の両者とも、非糖尿病アカゲザルにおいて多くの代謝パラメーターを低下させた。インスリン及びトリグリセリド値の低下は、給餌状態において、循環化合物レベルが同様の範囲である場合、ＦＧＦ２１とＦｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）との間で同一であった。その特性の向上ゆえに、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（ＲＧ）は、測定したパラメーターの殆どにおいてＦＧＦ２１を上回り、週に１回投与を行い、代謝パラメーターにおける効力を観察することができた。

【0280】

様々な実施形態に関して本発明を説明してきたが、当業者は変更及び改変に気付き得ることを理解されたい。

【0281】

従って、添付の特許請求の範囲は、主張されるような本発明の範囲内に入る全てのかかる同等の変更物を包含するものとする。さらに、本明細書中で使用されるセクション見出しは、単に構成を目的とするものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0282】

本願で引用される参考文献は全て、本明細書中に参照により明確に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【図38D】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【配列表】

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