特許 7191132 超精製ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ、ならびにそれらの作製及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-08

(45)【発行日】2022-12-16

(54)【発明の名称】超精製ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ、ならびにそれらの作製及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/245 20060101AFI20221209BHJP

   C07K 1/36 20060101ALI20221209BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20221209BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20221209BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221209BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20221209BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20221209BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20221209BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20221209BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20221209BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20221209BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20221209BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20221209BHJP

【ＦＩ】

C07K14/245 ZNA

C07K1/36

C07K16/12

C07K16/40

C12N15/13

C12N9/02

C12P21/02 C

G01N30/88 J

G01N30/02 B

G01N30/06 Z

B01J20/281 X

G01N30/34 E

C12N15/31

C12N15/53

C12P21/08

【請求項の数】 20

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021001186

(22)【出願日】2021-01-07

(62)【分割の表示】P 2017546779の分割

【原出願日】2016-03-04

(65)【公開番号】P2021078502

(43)【公開日】2021-05-27

【審査請求日】2021-02-05

(31)【優先権主張番号】62/129,701

(32)【優先日】2015-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ウォン， マーク

(72)【発明者】

【氏名】イー， リリアーナ ティー．

(72)【発明者】

【氏名】リム， エイミー

(72)【発明者】

【氏名】フォン， クリス ビー．

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５３５４６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平１０－５０８２０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００６／００３００２２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Biochemistry，1995年，Vol.34，pp.5075-5089

【文献】The EMBO Journal，1994年，Vol.13, No.8，pp.2013-2020

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物からの前記ＤｓｂＣポリペプチドの精製方法であって、
ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、約０．０１％～約１．０％、任意選択的に０．１％、の最終濃度になるまで、前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、
ｂ）遠心分離により前記細胞溶解物を浄化することと、
ｃ）前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む前記浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
ｄ）前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料から前記ＤｓｂＣポリペプチドを溶出させて、前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、
ｅ）前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料に適用し、任意選択的に前記陰イオン交換材料を１０ｍＭ ＭＯＰＳで洗浄することと、
ｆ）前記ＨＩＣ材料から前記ＤｓｂＣポリペプチドを溶出させて、ＨＩＣ溶出物を生成することと、
ｇ）前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む前記ＨＩＣ溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに適用することと、
ｈ）前記サイズ排除クロマトグラフィーから、少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む精製されたＤｓｂＣを含む画分を収集することと、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記陰イオン交換クロマトグラフィー材料が弱陰イオン交換体であり、好ましくは第四級アミンを含み、より好ましくは架橋アガロースに結合している第四級アミンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＤｓｂＣが、塩勾配を使用して前記陰イオンクロマトグラフィー材料から溶出され、好ましくは前記塩勾配が直線勾配であり、より好ましくは前記塩勾配が１５カラム体積にわたる約０％～約６０％の１０ｍＭ ＭＯＰＳ及び２５０ｍＭ ＮａＣｌ勾配である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

（ｉ）ステップｂ）の前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前に０．２２μｍのフィルターに通される、
（ｉｉ）ステップｂ）の前記ＤｓｂＣポリペプチドを含む前記浄化された溶解物が、陰イオン交換クロマトグラフィー前にｐＨ約８．０に調整される、
（ｉｉｉ）前記陰イオン交換溶出物が画分で収集され、任意選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析され、任意選択的に少なくとも約２５％のＤｓｂＣを含む画分がさらなる精製のために選択される、
（ｉｖ）前記陰イオン交換溶出物が、ＨＩＣクロマトグラフィー前に約０．５４Ｍ硫酸ナトリウム及び約５０ｍＭ ＰＯ_４（約ｐＨ７）を含有するように条件付けられる、
（ｖ）前記ＤｓｂＣが、水を使用して前記ＨＩＣ材料から溶出される、または
（ｖｉ）前記ＨＩＣ溶出物が画分で収集され、好ましくはＤｓｂＣを含む画分がプールされる
のうちの１つ以上を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＨＩＣ材料がフェニル部分を含み、好ましくは前記フェニル部分が架橋アガロースに結合している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記サイズ排除クロマトグラフィー材料が、架橋アガロースとデキストランとの球状複合体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＤｓｂＣポリペプチドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤｓｂＣポリペプチドであり、任意選択的に前記ＤｓｂＣポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含むまたは前記ＤｓｂＣポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＤｓｂＣがＥ． ｃｏｌｉ細胞で発現され、任意選択的に前記細胞がＤｓｂＣの内因性発現を超えるレベルでＤｓｂＣを発現するように操作される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗ＤｓｂＣ抗体を含む組成物を支持材料に結合している、少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む超高純度ＤｓｂＣを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、前記クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、前記抗ＤｓｂＣ抗体を溶出させることと、を含み、任意選択的に前記ＤｓｂＣが請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって調製され、任意選択的に、前記抗体の約１％未満が非ＤｓｂＣ化合物に特異的に結合する、方法。

【請求項10】

試料中のＤｓｂＣの定量化方法であって、検出システムを使用して前記試料中のＤｓｂＣを検出することと、前記試料中で検出されたＤｓｂＣの量を超高純度ＤｓｂＣ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含み、前記超高純度ＤｓｂＣ参照標準が少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含み、前記超高純度ＤｓｂＣ参照標準が請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって調製される、方法。

【請求項11】

前記検出システムが免疫アッセイである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記免疫アッセイが９５％ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ＤｓｂＣの存在及び／または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して前記試料中のＤｓｂＣを検出することと、前記試料中で検出されたＤｓｂＣの量を、少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む超高純度ＤｓｂＣ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含み、前記超高純度ＤｓｂＣ参照標準が請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって調製される、方法。

【請求項14】

前記免疫アッセイが９５％ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

９５％ＤｓｂＣに特異的に結合する前記抗体が、ポリクローナル抗体であり、前記免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される、かつ／または検出抗体として使用される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＤｓｂＣに特異的に結合する前記抗体が請求項１２に記載の方法に従って調製される、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ＤｓｂＣがＥ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記組換えポリペプチドが宿主細胞、任意選択的にＥ．ｃｏｌｉ細胞、さらに任意選択的にＤｓｂＣを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞内で調製される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記組換えポリペプチド調製物が最終精製産物であり、任意選択的に抗体またはイムノアドヘシンである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＣの検出のためのキットであって、試料中のＤｓｂＣを定量化するための標準曲線の生成における参照標準として使用するため、かつ／または陽性対照として使用するための、ＤｓｂＣを含む組成物であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法にしたがって調製され、少なくとも９５％の単量体ＤｓｂＣを含む組成物を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年３月６日出願の米国仮特許出願第６２／１２９，７０１号の利益を主張するものであり、この開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０２６０４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年３月４日、サイズ：９ＫＢ）。

【0003】

本発明は、ジスルフィドオキシドレダクターゼＡ（ＤｓｂＡ）及びジスルフィドオキシドレダクターゼＣ（ＤｓｂＣ）ポリペプチドの非常に高いレベルの純度での産生方法を提供する。超高純度ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ、ならびに、例えば、細菌中に産生された生物製剤からのＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの除去を示すための免疫アッセイで使用するためのそれらの使用方法も提供される。

【背景技術】

【0004】

発酵条件下における細菌宿主細胞での発現によって大量に産生される真核生物ポリペプチドの産生収率及び品質は、多くの場合、分泌ヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の適切な集合及び折り畳みを改善するように修正される。ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを含むジスルフィドオキシドレダクターゼ（Ｄｓｂ）タンパク質等のシャペロンタンパク質の過剰発現により、細菌宿主細胞内で産生された抗体等の異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解が容易になる。ＤｓｂＡは、強力なチオール酸化剤であり、ジスルフィドの中間供与体は、分泌タンパク質に結合する。ＤｓｂＣは、ジスルフィド結合の異性化を触媒し、誤って折り畳まれたジスルフィド結合をシャッフルすることができる。Ｄｓｂタンパク質は、細菌におけるジスルフィド結合形成及び異性化の一次触媒であり、タンパク質の正しいタンパク質折り畳みを促進する。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５、Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３、Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０。

【0005】

ヒト患者への投与に許容される組換え生物薬剤学的タンパク質の場合、製造及び精製プロセスによって生じる残留不純物が最終生物学的産物から除去されることが重要である。これらのプロセス成分としては、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ、及び宿主細胞タンパク質が挙げられる。これらの宿主細胞不純物は、プロセス特異的宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み、ＨＣＰは、組換えＤＮＡ技術から得られる生物学的産物中のプロセス関連不純物、例えば、過剰発現されてタンパク質折り畳みを容易にするＤｓｂＡ及びＤｓｂＣシャペロンである。ＨＣＰが典型的には最終薬物物質中に少量で（目的とする組換えポリペプチド１ミリグラム当たり１００万分の１またはナノグラム単位で）存在する一方で、ＨＣＰが望ましくなく、それらの量が最小限に抑えられるべきであることが認識されている。例えば、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）は、ヒトにおけるインビボ使用を目的とする生物薬剤が可能な限り外来不純物を含むべきではないことを要求しており、また、ＨＣＰ等の潜在的不純物の検出及び定量の試験を要求している。加えて、日米欧医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）は、生物工学的／生物学的産物の試験手順及び受け入れ基準についてのガイドラインを提供している。このガイドラインは、ＨＣＰの場合、広範囲のタンパク質不純物を検出することができる高感度免疫アッセイが利用されるべきであることを示唆している。免疫グロブリン、ＤＮＡ、内毒素、ウイルス、及び全ＨＣＰ、例えば、全Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質（ＥＣＰ）を検出するためのアッセイ及び試薬が開発されているが、かかるアッセイ及び試薬は、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ等の付属タンパク質を正確に検出しない。典型的には細菌で高レベルでは発現されないが、組換え細菌宿主細胞で過剰発現されて生物学的産物の折り畳み及び分泌を容易にし得るＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ等のタンパク質の検出及び定量化に十分な特異度及び感度を有する市販試薬または分析方法は、現在のところ存在しない。

【0006】

ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの検出のための試薬、方法、及びキットが、十分な一貫性、感度、特異度、または効率を有する既存のアッセイ及び試薬が存在しない場合に特に必要とされている。本明細書に記載の発明は、上述の必要性をいくらか満たし、他の利点を提供する。

【0007】

特許出願及び公報を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【発明の概要】

【0008】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物からのＤｓｂＡポリペプチドの精製方法であって、ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、約０．０１％～約１．０％の最終濃度になるまで、ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、ｂ）遠心分離により細胞溶解物を浄化することと、ｃ）ＤｓｂＡポリペプチドを含む浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＡポリペプチドを溶出させて、ＤｓｂＡポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、ｅ）ＤｓｂＡポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、ｆ）陽イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＡポリペプチドを溶出させて、精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む陽イオン交換溶出物を生成することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物は、陰イオン交換クロマトグラフィー前にＰＥＩ中に少なくとも約１６時間保持される。いくつかの実施形態では、溶解物中のＰＥＩの最終濃度は、約０．１％である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチド及びＰＥＩを含む溶解物は、ｐＨ約７．０である。

【0009】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陰イオン交換体である。いくつかの実施形態では、強陰イオン交換体は、第四級アミンを含む。さらなる実施形態では、第四級アミンは、架橋アガロースに結合している。いくつかの実施形態では、陰イオン交換体は、ＱＳＦＦ陰イオン交換体である。

【0010】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、塩勾配を使用して陰イオンクロマトグラフィー材料から溶出される。さらなる実施形態では、塩勾配は、段階勾配である。いくつかの実施形態では、浄化された溶解物は、ｐＨ７．１の１０ｍＭ ＭＯＰＳを含む。

【0011】

いくつかの実施形態または上述の実施形態では、ＤｓｂＡは、以下のステップで陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出される：約４カラム体積の約１５％の約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ（約ｐＨ９．２）、約４カラム体積の約２０％の約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ（約ｐＨ９．２）、ＤｓｂＡがカラムから溶出するまで約２５％の約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ（約ｐＨ９．２）。

【0012】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ステップｂ）のＤｓｂＡポリペプチドを含む浄化された溶解物は、陰イオン交換クロマトグラフィー前に０．２２μｍのフィルターに通される。いくつかの実施形態では、ステップｂ）のＤｓｂＡポリペプチドを含む浄化された溶解物は、陰イオン交換クロマトグラフィー前にｐＨ約９．０に調整される。

【0013】

いくつかの実施形態では、陰イオン交換溶出物は、画分で収集される。いくつかの実施形態では、画分は、約０．３～約１．０カラム体積（ＣＶ）である。いくつかの実施形態では、画分は、陽イオン交換クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される。いくつかの実施形態では、少なくとも約５５％のＤｓｂＡを含む画分が、さらなる精製のために選択される。

【0014】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、スルホプロピル部分を含む。いくつかの実施形態では、スルホプロピル部分は、架橋ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）マトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、陽イオン交換媒体は、ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０または等価物である。いくつかの実施形態では、ステップｄ）の陰イオン交換溶出物は、陽イオン交換クロマトグラフィー前にｐＨ約５．０に調整される。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、塩勾配を使用して陽イオンクロマトグラフィー材料から溶出される。いくつかの実施形態では、陽イオンクロマトグラフィー材料は、５カラム体積の１２．５ｍＭ ＭＥＳで洗浄される。いくつかの実施形態では、塩勾配は、１５カラム体積にわたる約０％～約６０％の１２．５ｍＭ ＭＥＳ及び１Ｍ ＮａＣｌ勾配である。いくつかの実施形態では、陽イオン交換溶出物は、画分で収集される。いくつかの実施形態では、画分は、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析される。いくつかの実施形態では、少なくとも約９５％のＤｓｂＡを含む画分がプールされる。

【0016】

上述の実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤｓｂＡポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、細胞で発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＤｓｂＡの内因性発現を超えるレベルでＤｓｂＡを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、微小流動化剤を使用して溶解される。

【0017】

いくつかの態様では、本発明は、上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも約９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも約９８％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、約２％未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１％未満の高分子量種を含む。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＡポリペプチドの割合は、サイズ排除クロマトグラフィーによって検出される。いくつかの実施形態では、組成物は、約５％未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、不純物は、天然または所望のＤｓｂＡに対して高分子量及び／または低分子量のポリペプチド種である。いくつかの実施形態では、不純物は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質（ＥＣＰ）、ＤｓｂＡ凝集体、ＤｓｂＡ断片、核酸、または細胞培養培地成分のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、１回以上の凍結融解サイクルに対して安定している。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回を超える凍結融解サイクルに対して安定している。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡは、例えば、試験試料中のＤｓｂＡの量または濃度を決定するための参照標準として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡは、例えば、あるアッセイにおいて試料中のＤｓｂＡの存在及び／または分量を決定するための陽性対照として使用される。

【0018】

いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＡポリペプチドの純度は、クロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはウエスタンブロット分析によって測定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＡポリペプチドの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＡポリペプチドの純度は、蛍光タンパク質染色または銀染色を使用してＳＤＳゲル電気泳動によって測定される。いくつかの実施形態では、組成物中の非ＤｓｂＡポリペプチドの存在は、ウエスタンブロット分析により示される抗ＤｓｂＡ抗体と免疫反応しないゲル電気泳動によって特定される種の存在によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＡポリペプチドの凝集体の存在は、ウエスタンブロット分析による天然ＤｓｂＡを超える分子量を有する種の存在によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＡポリペプチドの断片の存在は、ウエスタンブロット分析による天然ＤｓｂＡ未満の分子量を有する種の存在によって特定される。

【0019】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体の生成方法であって、動物を上述のように精製された超高純度ＤｓｂＡに曝露することを含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本方法は、動物から血清を収集することを含み、血清は、ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ＤｓｂＡに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、本発明は、血清から単離された１つ以上のモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである。

【0020】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗ＤｓｂＡ抗体を含む組成物を支持材料に結合している超高純度ＤｓｂＡを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、抗ＤｓｂＡ抗体を溶出させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡは、少なくとも約９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡは、約５％未満の不純物、約１％未満の不純物、または約０．１％未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製される。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って調製される。いくつかの実施形態では、抗体の１％未満が、非ＤｓｂＡ化合物に特異的に結合する。

【0021】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、該ポリクローナル抗体が動物を上述のＤｓｂＡ組成物のうちのいずれかに曝露することによって生成される、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体は、動物の血清から収集される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物であって、該モノクローナル抗体が動物を上述のＤｓｂＡ組成物のうちのいずれかに曝露することによって生成される、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである。

【0022】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＡの存在及び／または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して試料中のＤｓｂＡを検出することと、試料中で検出されたＤｓｂＡの量を超高純度ＤｓｂＡ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、参照標準ＤｓｂＡのいくつかの異なる濃度が、検出レベルと参照標準中のＤｓｂＡの濃度との間の相関関係を確立するために試験される。試験試料中のＤｓｂＡの濃度は、試験試料中のＤｓｂＡの検出レベルを参照標準中のＤｓｂＡの既知の濃度の検出と比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％未満の不純物のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡ参照標準は、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、約１％未満の非ＤｓｂＡ化合物のうちのいずれかに結合する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、検出抗体として使用される。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出剤（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）内で調製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤｓｂＡを過剰発現する（例えば、ＤｓｂＡを過剰発現したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物であるか、または組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。

【0023】

いくつかの態様では、本発明は、例えば試料中のＤｓｂＡの検出のための免疫アッセイ方法であって、試料が組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株から得られ、本方法が、（ａ）ＤｓｂＡに結合する捕捉抗体を試料と接触させ、それにより試料－捕捉抗体組み合わせ材料を生成することと、（ｂ）ＤｓｂＡに結合する検出抗体を試料－捕捉抗体組み合わせ材料と接触させることと、（ｃ）試料－捕捉抗体組み合わせ材料に結合している抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本方法は、標準滴定曲線を使用して結合している検出抗体のレベルを定量化することを含む。さらなる実施形態では、本方法は、結合している検出抗体のレベルに基づいて試料中に存在するＤｓｂＡの量を計算することを含む。いくつかの実施形態では、試料中に存在するＤｓｂＡの量は、標準滴定曲線を超高純度ＤｓｂＡ組成物で生成された標準滴定曲線と比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡ組成物は、少なくとも約９５％の単量体ＤｓｂＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡ組成物は、約５％未満の不純物、約１％未満の不純物、または約０．１％未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、組成物中の超高純度ＤｓｂＡは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製される。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、検出抗体は、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡに結合する検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、サンドイッチアッセイである。さらなる実施形態では、サンドイッチアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株は、Ｅ．ｃｏｌｉから得られる。いくつかの実施形態では、宿主細胞株は、ＤｓｂＡを過剰発現する（例えば、ＤｓｂＡを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物中に含有される組換えポリペプチドは、抗体またはイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

【0024】

いくつかの実施形態では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイであって、放出アッセイが、薬学的組成物を本明細書に記載の免疫アッセイに供することを含み、免疫アッセイにおけるＤｓｂＡの検出が、薬学的組成物が動物への治療的投与に好適ではないことを示す、品質アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、約１ｐｐｍ未満の薬学的組成物中のＤｓｂＡの量は、薬学的組成物が動物への投与に好適であることを示す。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から調製される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ＤｓｂＡを過剰発現する。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物中に含有される組換えポリペプチドは、抗体またはイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

【0025】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物からのＤｓｂＣポリペプチドの精製方法であって、ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、約０．０１％～約１．０％の最終濃度になるまで、ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、ｂ）遠心分離により細胞溶解物を浄化することと、ｃ）ＤｓｂＣポリペプチドを含む浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＣポリペプチドを溶出させて、ＤｓｂＣポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、ｅ）ＤｓｂＣポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料に適用することと、ｆ）ＨＩＣ材料からＤｓｂＣポリペプチドを溶出させて、ＨＩＣ溶出物を生成することと、ｇ）ＤｓｂＣポリペプチドを含むＨＩＣ溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに適用することと、ｈ）サイズ排除クロマトグラフィーから精製されたＤｓｂＣポリペプチドを含む画分を収集することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物は、陰イオン交換クロマトグラフィー前にＰＥＩ中に少なくとも約１６時間保持される。いくつかの実施形態では、溶解物中のＰＥＩの最終濃度は、約０．１％である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチド及びＰＥＩを含む溶解物は、ｐＨ約７．０である。

【0026】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、弱陰イオン交換体である。なおさらなる実施形態では、弱陰イオン交換体は、第四級アミンを含む。なおさらなる実施形態では、第四級アミンは、架橋アガロースに結合している。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、塩勾配を使用して陽イオンクロマトグラフィー材料から溶出される。さらなる実施形態では、塩勾配は、線形勾配である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、１０ｍＭ ＭＯＰＳ中で洗浄される。いくつかの実施形態では、塩勾配は、１５カラム体積にわたる約０％～約６０％の１０ｍＭ ＭＯＰＳ及び２５０ｍＭ ＮａＣｌ勾配である。

【0028】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ステップｂ）のＤｓｂＣポリペプチドを含む浄化された溶解物は、陰イオン交換クロマトグラフィー前に０．２２μｍのフィルターに通される。いくつかの実施形態では、ステップｂ）のＤｓｂＣポリペプチドを含む浄化された溶解物は、陰イオン交換クロマトグラフィー前にｐＨ約８．０に調整される。

【0029】

いくつかの実施形態では、陰イオン交換溶出物は、画分で収集される。いくつかの実施形態では、画分は、疎水性相互作用クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される。いくつかの実施形態では、少なくとも約２５％のＤｓｂＣを含む画分が、さらなる精製のために選択される。

【0030】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ＨＩＣ材料は、フェニル部分を含む。さらなる実施形態では、フェニル部分は、架橋アガロースに結合している。いくつかの実施形態では、陰イオン交換溶出物は、ＨＩＣクロマトグラフィー前に約０．５４Ｍ硫酸ナトリウム及び約５０ｍＭ ＰＯ_４（約ｐＨ７）を含有するように条件付けられる。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、水を使用してＨＩＣ材料から溶出される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出物は、画分で収集される。さらなる実施形態では、ＤｓｂＣを含む画分がプールされる。

【0031】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー材料は、架橋アガロースとデキストランとの球状複合体を含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除貫流物は、画分で収集される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出物は、サイズ排除クロマトグラフィー前に限外濾過される。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣを含む画分がプールされる。

【0032】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤｓｂＣポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一である。

【0033】

上述の実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、細胞で発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＤｓｂＣの内因性発現を超えるレベルでＤｓｂＣを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、微小流動化剤を使用して溶解される。

【0034】

いくつかの態様では、本発明は、上述の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって精製されたＤｓｂＣポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、精製されたＤｓｂＣポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも約９５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約９８％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約９９％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約９９．５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２％未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１％未満の高分子量種を含む。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＣポリペプチドの割合は、サイズ排除クロマトグラフィーによって検出される。いくつかの実施形態では、不純物は、天然または所望のＤｓｂＣに対して高分子量及び／または低分子量のポリペプチド種である。いくつかの実施形態では、不純物は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質（ＥＣＰ）、ＤｓｂＣ凝集体、ＤｓｂＣ断片、核酸、または細胞培養培地成分のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、１回以上の凍結融解サイクルに対して安定している。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回を超える凍結融解サイクルに対して安定している。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣは、例えば、試験試料中のＤｓｂＣの量または濃度を決定するための参照標準として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣは、例えば、あるアッセイにおいて試料中のＤｓｂＣの存在及び／または分量を決定するための陽性対照として使用される。

【0035】

いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＣポリペプチドの純度は、クロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動またはウエスタンブロット分析によって測定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＣポリペプチドの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）である。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＣポリペプチドの純度は、蛍光タンパク質染色または銀染色を使用してＳＤＳゲル電気泳動によって測定される。いくつかの実施形態では、組成物中の非ＤｓｂＣポリペプチドの存在は、ウエスタンブロット分析により示される抗ＤｓｂＣ抗体と免疫反応しないゲル電気泳動によって特定される種の存在によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＣポリペプチドの凝集体の存在は、ウエスタンブロット分析による天然ＤｓｂＣを超える分子量を有する種の存在によって特定される。いくつかの実施形態では、組成物中のＤｓｂＣポリペプチドの断片の存在は、ウエスタンブロット分析による天然ＤｓｂＣ未満の分子量を有する種の存在によって特定される。

【0036】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体の生成方法であって、動物を上述のように精製された超高純度ＤｓｂＣに曝露することを含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本方法は、動物から血清を収集することを含み、血清は、ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ＤｓｂＣに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、本発明は、血清から単離された１つ以上のモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである。

【0037】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗ＤｓｂＣ抗体を含む組成物を支持材料に結合している超高純度ＤｓｂＣを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、抗ＤｓｂＣ抗体を溶出させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣは、約９５％を越える単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣは、約５％未満の不純物、約１％未満の不純物、または約０．１％未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製される。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに従って調製される。いくつかの実施形態では、抗体の１％未満が、非ＤｓｂＣ化合物に特異的に結合する。

【0038】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＣに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、ポリクローナル抗体が動物を上述のＤｓｂＣ組成物のうちのいずれかに曝露することによって生成される、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体は、動物の血清から収集される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＣに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物であって、モノクローナル抗体が動物を上述のＤｓｂＣ組成物のうちのいずれかに曝露することによって生成される、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである。

【0039】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＣの存在及び／または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して試料中のＤｓｂＣを検出することと、試料中で検出されたＤｓｂＣの量を超高純度ＤｓｂＣ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、参照標準ＤｓｂＣのいくつかの異なる濃度が、検出レベルと参照標準中のＤｓｂＣの濃度との間の相関関係を確立するために試験される。試験試料中のＤｓｂＣの濃度は、試験試料中のＤｓｂＣの検出レベルを参照標準中のＤｓｂＣの既知の濃度の検出と比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％未満の不純物のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣ参照標準は、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、約１％未満の非ＤｓｂＣ化合物のうちのいずれかに結合する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、検出抗体として使用される。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出剤（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）内で調製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤｓｂＣを過剰発現する（例えば、ＤｓｂＣを過剰発現したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物であるか、または組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。

【0040】

いくつかの態様では、本発明は、例えば試料中のＤｓｂＣの検出のための免疫アッセイ方法であって、試料が組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株から得られ、本方法が、（ａ）ＤｓｂＣに結合する捕捉抗体を試料と接触させ、それにより試料－捕捉抗体組み合わせ材料を生成することと、（ｂ）ＤｓｂＣに結合する検出抗体を試料－捕捉抗体組み合わせ材料と接触させることと、（ｃ）試料－捕捉抗体組み合わせ材料に結合している抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、本方法は、標準滴定曲線を使用して結合している検出抗体のレベルを定量化することを含む。さらなる実施形態では、本方法は、結合している検出抗体のレベルに基づいて試料中に存在するＤｓｂＣの量を計算することを含む。いくつかの実施形態では、試料中に存在するＤｓｂＣの量は、標準滴定曲線を超高純度ＤｓｂＣ組成物で生成された標準滴定曲線と比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣ組成物は、少なくとも約９５％の単量体ＤｓｂＣポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣ組成物は、約５％未満の不純物、約１％未満の不純物、または約０．１％未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、組成物中の超高純度ＤｓｂＣは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製される。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、検出抗体は、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣに結合する検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、サンドイッチアッセイである。さらなる実施形態では、サンドイッチアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物または宿主細胞株は、Ｅ．ｃｏｌｉから得られる。いくつかの実施形態では、宿主細胞株は、ＤｓｂＣを過剰発現する（例えば、ＤｓｂＣを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物中に含有される組換えポリペプチドは、抗体またはイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

【0041】

いくつかの実施形態では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイであって、放出アッセイが、薬学的組成物を本明細書に記載の免疫アッセイに供することを含み、免疫アッセイにおけるＤｓｂＣの検出が、薬学的組成物が動物への治療的投与に好適ではないことを示す、品質アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、約１ｐｐｍ未満の薬学的組成物中のＤｓｂＣの量は、薬学的組成物が動物への投与に好適であることを示す。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から調製される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ＤｓｂＣを過剰発現する。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物中に含有される組換えポリペプチドは、抗体またはイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

【0042】

いくつかの態様では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＡの検出のためのキットであって、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製された抗ＤｓｂＡ抗体、または本明細書に記載の抗ＤｓｂＡ抗体のうちのいずれかの組成物を含む、キットを提供する。

【0043】

いくつかの態様では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＣの検出のためのキットであって、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製された抗ＤｓｂＣ抗体、または本明細書に記載の抗ＤｓｂＣ抗体のうちのいずれかの組成物を含む、キットを提供する。

【0044】

いくつかの態様では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの検出のためのキットであって、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって調製された抗ＤｓｂＡ抗体及び抗ＤｓｂＣ抗体、または本明細書に記載の抗ＤｓｂＡ抗体のうちのいずれか及び抗ＤｓｂＣ抗体のうちのいずれかの組成物を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、試料中のＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準として使用するための超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、試料中のＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを検出するためのあるアッセイにおける陽性対照として使用するための超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣをさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】ＤｓｂＡの精製のためのＱＳＦＦ画分のサイズ排除クロマトグラフィーを示すクロマトグラムを示す。上から下に、クロマトグラムは、以下の画分：装填物、画分３、画分７、画分１０、画分１１、及び画分１５を表す。

【図2】ＤｓｂＡの精製のためのＰｏｒｏｓ ＨＳプール画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す。

【図3】ＤｓｂＡの精製のためのＰｏｒｏｓ装填物及びＰｏｒｏｓプール画分のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラフ。

【図4】ＤｓｂＡ Ｐｏｒｏｓ ＨＳプール画分のウエスタンブロットを示す。模擬プールは、ＤｓｂＡ分子を主に含有する。

【図5】ＤｓｂＣの精製のための画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動である。

【図6A】ＤｓｂＣの精製のためのＤＥＡＥ ＦＦクロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。

【図6B】図６Ａに提示される溶出部分の拡大を示す。

【図7】ＤｓｂＣの精製のためのＤＥＡＥ－ＦＦ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図8A】ＤｓｂＣの精製時のクロマトグラフィー試料の電気泳動を示す。図８Ａは、検出剤として抗ＤｓｂＣ－ＨＲＰを使用したウエスタンブロットである。

【図8B】図８Ｂは、クマシーブルーで染色された画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥである。

【図9】ＳＰＦＦ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図10】ＤｓｂＣの精製のためのＨＩＣクロマトグラフィーのスクリーニングに使用されたＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図11】ＤｓｂＣの精製のためのＨＩＣクロマトグラフィーのスクリーニングに使用されたＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図12】ＤｓｂＣの精製時のＨＩＣクロマトグラフィー画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図13】ＤｓｂＣのｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラフィー画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図14】製剤化されたＤｓｂＣの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を示すクロマトグラムを示す。

【図15】ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。非還元試料が左側のカラムに提供されている。還元試料が右側のカラムに提供されている。

【図16】直接結合ＥＬＩＳＡにおける抗ＤｓｂＣ親和性プールの比較を示す。正方形が分画材料（９４％主ピーク）を表し、円形が非分画材料（７８％主ピーク）を表す。

【図17】低凝集体Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 抗ＤｓｂＣ親和性プールを使用したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの超高純度組成物の生成方法を提供する。かかる組成物を使用して、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに高度に特異的な抗体を生成する。本抗体は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣが過剰発現されて組換えポリペプチドの折り畳み及び集合を容易にする細菌発酵培養物内で調製された組換えポリペプチド中のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの検出に有用である。例えば、本抗体は、抗体等の組換えポリペプチドの薬学的製剤の開発における放出アッセイにおいて有用であり得る。

【0047】

Ｉ．定義
「検出」という用語は、標的分子の質的測定及び量的測定の両方を含むために本明細書で最も広義に使用される。検出は、単に試料中の標的分子の存在を特定すること、ならびに標的分子が検出可能なレベルで試料中に存在するかを決定することを含む。

【0048】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体を具体的に包含する。

【0049】

「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドがその天然環境下で存在するよりも純粋な形態で存在するように、かつ／または実験室条件下で最初に合成及び／もしくは増幅されたときにポリペプチドの純度が増加することを意味する。純度は、相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。

【0050】

本明細書で使用されるとき、「超高純度ＤｓｂＡ」及び「超高純度ＤｓｂＣ」とは、組成物中のタンパク質の少なくとも約９５％が所望のタンパク質、単量体ＤｓｂＡまたは単量体ＤｓｂＣであるＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ組成物を指す。いくつかの例では、超高純度ＤｓｂＡ及び超高純度ＤｓｂＣは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の単量体ＤｓｂＡまたは単量体ＤｓｂＣを含む。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＡまたは単量体ＤｓｂＣは、ＳＥＣによって決定される。

【0051】

ポリペプチドに関して使用されるとき、「Ｄｓｂ」タンパク質とは、細菌ジスルフィドオキシドレダクターゼを指す。細菌ジスルフィドオキシレダクターゼは、酵素のジスルフィド結合ファミリーのメンバーである。Ｄｓｂファミリーのメンバーとしては、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及びＤｓｂＧが挙げられる。ＤｓｂＡは、ペプチドが細胞のペリプラズム内に出現すると鎖内ジスルフィド結合を形成し、ＤｓｂＣは、細胞のペリプラズムにおける酸化的タンパク質折り畳み中にジスルフィド結合イソメラーゼとしての機能を果たす。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「ＤｓｂＡ」は、ペリプラズムタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＩとしても知られ得る。例示的なＤｓｂＡタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿４１８２９７（配列番号１）によって提供されており、Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｓｂＡ遺伝子の核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿０００９１３．３またはＥｃｏＧｅｎｅ：ＥＧ１１２９７（配列番号２）によって提供されている。

【0053】

本明細書で使用されるとき、「ＤｓｂＣ」は、ペリプラズムタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＩＩとしても知られ得る。例示的なＤｓｂＣタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿４１７３６９．１（配列番号３）によって提供されており、Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｓｂＣ遺伝子の核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿０００９１３．３またはＥｃｏＧｅｎｅ：ＥＧ１１０７０（配列番号４）によって提供されている。

【0054】

「試料」とは、より大量の材料のわずか一部を指す。一般に、本明細書に記載の方法に従う試験は、試料で行われる。試料は、典型的には、例えば、培養された組換えポリペプチド発現細胞株（本明細書で「産物細胞株」とも称される）から、または培養された宿主細胞から得られる組換えポリペプチド調製物から得られる。本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、目的とする組換えポリペプチドまたは産物の発現のための遺伝子を含有しない。試料は、例えば、採取された細胞培養液から、精製プロセスのある特定のステップでのインプロセスプールから、または最終精製産物から得られ得るが、これらに限定されない。

【0055】

「捕捉抗体」とは、試料中の標的分子に特異的に結合する抗体を指す。ある特定の条件下で、捕捉抗体は、標的分子と複合体を形成し、これにより、抗体－標的分子複合体が試料の残りから分離され得る。ある特定の実施形態では、かかる分離は、捕捉抗体に結合しなかった試料中の物質または材料を洗い流すことを含み得る。ある特定の実施形態では、捕捉抗体は、例えば、プレートまたはビーズ等であるが、これらに限定されない固体支持体表面に結合し得る。

【0056】

「検出抗体」とは、試料または試料－捕捉抗体組み合わせ材料中の標的分子に特異的に結合する抗体を指す。ある特定の条件下で、検出抗体は、標的分子または標的分子－捕捉抗体複合体と複合体を形成する。検出抗体は、増幅され得る標識を用いて直接、または例えば標識され、かつ検出抗体に結合する別の抗体を使用して間接的にのいずれかで検出されることができる。直接標識の場合、検出抗体は、典型的には、例えば、ビオチンまたはルテニウムを含むが、これらに限定されない、いくつかの手段によって検出可能な部分にコンジュゲートされる。

【0057】

「標識」または「検出可能な標識」という用語は、検出または定量される物質に結合し得る任意の化学基または部分、例えば、抗体を指す。典型的には、標識は、物質の高感度検出または定量化に好適な検出可能な標識である。検出可能な標識の例としては、発光標識、例えば、蛍光、リン光、化学発光、生物発光、及び電気化学発光標識、放射性標識、酵素、粒子、磁性物質、電気活性種等が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、検出可能な標識は、特異的結合反応に関与することによってその存在をシグナル伝達し得る。かかる標識の例としては、ハプテン、抗体、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｈｉｓタグ、ニトリロ三酢酸、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、グルタチオン等が挙げられる。

【0058】

「検出手段」という用語は、あるアッセイで後に読み取られるシグナル報告により検出可能な抗体の存在を検出するために使用される部分または技法を指す。典型的には、検出手段は、マイクロタイタープレート上で捕捉される標識等の固定化標識を増幅する試薬、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン－ＨＲＰを用いる。

【0059】

「光ルミネセンス」とは、材料がその材料による光（あるいは、電磁放射線とも称される）の吸収後に発光するプロセスを指す。蛍光及びリン光は、２つの異なる種類の光ルミネセンスである。「化学発光」プロセスは、化学反応による発光種の作製を伴う。「電気化学発光」または「ＥＣＬ」とは、ある種、例えば、ある抗体が、適切な周辺化学環境下でその種の電気化学的エネルギーへの曝露時に発光するプロセスである。

【0060】

目的とする抗原、例えば、宿主細胞タンパク質に「結合する」抗体は、その抗体が、アッセイ試薬、例えば、捕捉抗体または検出抗体として有用であるように十分な親和性で抗原に結合するものである。典型的には、かかる抗体は、他のポリペプチドと有意に交差反応しない。

【0061】

ポリペプチドの標的分子への結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープの「特異的結合」、またはそれに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造を有する分子である対照分子の結合と比較して標的分子の結合を決定することによって測定され得る。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体の調製物は、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに特異的に結合する。例えば、ポリクローナル抗体調製物中の抗体の少なくとも約９９％が、所望のポリペプチド（例えば、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）に結合する。

【0062】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載の方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。

【0063】

本明細書における「活性な」または「活性」とは、天然のまたは天然に存在するポリペプチドの生物学的及び／または免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態（複数可）を指し、「生物学的」活性とは、天然のまたは天然に存在するポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の天然のまたは天然に存在するポリペプチドによって引き起こされる生物学的機能（阻害または刺激のいずれか）を指し、「免疫学的」活性とは、天然のまたは天然に存在するポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指す。

【0064】

「アンタゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を含む。同様の様式で、「アゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニストまたはアンタゴニストの分子としては、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニストの抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異形等が挙げられる。ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの特定方法は、ポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させることと、ポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。

【0065】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に包含するが、これは、それらが所望の生物学的活性を呈する場合に限る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と同義に使用される。

【0066】

抗体は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子であり、それらの構造は全て免疫グロブリン折り畳みに基づく。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域が抗体の抗原結合特異性を決定する一方で、Ｃ領域は、構造的支持を提供し、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体または抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の能力である。

【0067】

抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域によって分離される１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域によって連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接近して一緒に保持され、他方の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。

【0068】

各Ｖ領域は、典型的には、３つの相補性決定領域（各々が「超可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、有意な親和性で特定の所望の抗原に結合するのに必要な最小構造単位である抗体結合部位は、典型的には、それらの３つのＣＤＲと、それらの間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含み、適切な立体配座にＣＤＲを保持して提示する。古典的な４つの鎖抗体は、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインによって協働して定義される抗原結合部位を有する。ラクダ及びサメ抗体等のある特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成された結合部位に依存する。結合部位がＶ_ＨとＶ_Ｌとの間の協働の不在下で重鎖のみまたは軽鎖のみによって形成された単一ドメイン操作免疫グロブリンが調製され得る。

【0069】

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメインでも重鎖可変ドメインでもいずれにおいても超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域によって連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接近して一緒に保持され、他方の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。

【0070】

「超可変領域」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｖ_Ｌでは残基約２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７（Ｌ３）前後、Ｖ_Ｈでは約３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）前後（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、ならびに／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、Ｖ_Ｌでは残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、及び９１～９６（Ｌ３）、Ｖ_Ｈでは２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含み得る。

【0071】

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0072】

抗体または半抗体との関連での「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸展と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖内Ｓ－Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列し得る。

【0073】

Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、通常、ヒンジ領域のすぐＣ末端にある残基の伸展、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３～２３９と定義される。本発明の前は、ＦｃγＲ結合は、概して、ＩｇＧ Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域におけるアミノ酸残基に起因するものであった。

【0074】

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＩｇＧの残基約２３１から約３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合されないという点で特有である。むしろ、２つのＮ結合分岐状炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５）。

【0075】

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基約３４１からアミノ酸残基約４４７）の残基の伸展を含む。

【0076】

「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミノボディ、一本鎖抗体分子；抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３，（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ、またはタンデム（ｄｉ，ｔｒｉ）－ｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない）；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ）が挙げられる。

【0077】

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して表記される１つの残留「Ｆｃ」断片とが産生される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）とともに全Ｌ鎖、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片が産出され、これは、概して、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有する点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

【0078】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、密接な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位を定義する。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な超可変領域を３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。

【0079】

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

【0080】

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。

【0081】

抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。インタクトな抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は周知である。

【0082】

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。

【0083】

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）内の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結している重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖上のこれらの２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）により完全に記載されている。

【0084】

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を具体的に包含する。かかる多重特異性抗体としては、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む抗体（Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位がポリエピトープ特異性を有する）、２つ以上のＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインを有する抗体（各Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位が異なるエピトープに結合する）、２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体（各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する）、全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三機能的抗体、共有結合している抗体断片または共有結合していない抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」とは、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。一実施形態によれば、多重特異性抗体は、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。

【0085】

「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、一般に、単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）が抗原結合を付与し得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要はない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科動物（ラマ及びラクダ）ならびに軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）由来の抗体、ならびにヒト及びマウス抗体由来の組換え方法から得られる抗体が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４－５４６、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３－５６、Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ（２００１）２６：２３０－２３５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）：２１：４８４－４９０、ＷＯ２００５／０３５５７２、ＷＯ０３／０３５６９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９９４）３３９：２８５－２９０、ＷＯ００／２９００４、ＷＯ０２／０５１８７０）。

【0086】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異形は除外され、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本明細書に提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）が最初に説明したハイブリドーマ方法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技法を使用してファージ抗体ライブラリから単離され得る。

【0087】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種由来であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種由来であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、及びかかる抗体の断片を具体的に含むが、これは、それらが所望の生物学的活性を呈する場合に限る（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的とするキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザル等の旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。

【0088】

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（供与体抗体）の超可変領域由来の残基に置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも供与体抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリンの定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。

【0089】

本明細書では、「インタクトな抗体」とは、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異形であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。

【0090】

「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に結合している一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端（Ｖ_Ｌ）に可変ドメインを有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。

【0091】

「ネイキッド抗体」は、細胞毒性部分等の異種分子または放射性標識にコンジュゲートされない（本明細書に定義される）抗体である。

【0092】

本明細書で使用されるとき、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（このアミノ酸配列は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比較して「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣＨ２及び／またはＣＨ３配列）との融合物を含む。例示的なアドヘシン配列としては、目的とするタンパク質に結合する受容体またはリガンドの一部分を含む連続したアミノ酸配列が挙げられる。アドヘシン配列は、目的とするタンパク質に結合するが、受容体またはリガンド配列ではない配列（例えば、ペプチボディにおけるアドヘシン配列）でもあり得る。かかるポリペプチド配列は、ファージディスプレイ技法及びハイスループット選別方法を含む様々な方法によって選択または特定され得る。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、またはＩｇＧ－４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得られ得る。

【0093】

いくつかの実施形態では、抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異形Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプにより異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体の下方調節が挙げられる。

【0094】

「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、同種抗原と複合した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイが行われ得る。

【0095】

「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４貢の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のアッセイ等のインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるモデル等の動物モデルで評価され得る。

【0096】

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。

【0097】

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これらの受容体の対立遺伝子変異形及び選択的スプライシング形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に概説されている。今後特定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母体ＩｇＧｓの胎児への移行に関与する新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

【0098】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が中に導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられ、これらは、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一ではないが、変異を含み得る。元来形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。

【0099】

本明細書で使用される「不純物」という用語は、所望のポリペプチド産物とは異なる材料または物質を指す。不純物としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞タンパク質（ＥＣＰ）等の宿主細胞物質；浸出タンパク質Ａ；核酸；所望のポリペプチドの変異形、断片、凝集体、または誘導体；別のポリペプチド；内毒素；ウイルス汚染物質；細胞培養培地成分等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、不純物は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（例えば、ＥＣＰ）等の細菌細胞であるが、これらに限定されない細胞由来の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であり得る。いくつかの実施形態では、不純物は、クリップされたＤｓｂＡもしくはＤｓｂＣ及び／またはＤｓｂＡもしくはＤｓｂＣの凝集体であり得る。

【0100】

「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0101】

参照ポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントを達成するために配列を整列させ、かつ必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザ文書とともに申請されており、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変動しない。

【0102】

ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される。
１００×画分Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性値％は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。

【0103】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般に、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む同様の構造を有する（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して単離されて、それぞれ、相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。

【0104】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び中に導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。

【0105】

クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「順次」という用語は、第１のクロマトグラフィーに続いて第２のクロマトグラフィーを有することを指す。さらなるステップが第１のクロマトグラフィーと第２のクロマトグラフィーとの間に含まれ得る。

【0106】

クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「連続」という用語は、直接または第１のクロマトグラフィー材料と第２のクロマトグラフィー材料との間の連続流を可能にするいくつかの他の機構を介して接続されたこれらの２つのクロマトグラフィー材料を有することを指す。

【0107】

「装填密度」とは、クロマトグラフィー材料の体積（例えば、リットル）と接触した組成物の量（例えば、グラム）を指す。いくつかの例では、装填密度は、ｇ／Ｌで表わされる。

【0108】

本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

【0109】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形例が、態様及び変形例「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」を含むことが理解される。

【0110】

ＩＩ．精製方法
ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの超高純度調製物の生成方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、調製物は、約９５．０％、約９６．０％、約９７．０％、約９８．０％、約９９．０％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％のうちのいずれかを超える純度のＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを含む。いくつかの実施形態では、９９％の純度のＤｓｂＡまたは９９％の純度のＤｓｂＣである調製物は、調製物中の材料の１％未満がＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの産生中に存在する細胞または細胞溶解物中に存在する物質（例えば、タンパク質、核酸、脂質等）であることを示す。ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの９９％の純度の調製物は、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの精製または製剤化に使用される緩衝液、塩、または他の賦形剤を含有し得る。

【0111】

Ａ．ＤｓｂＡの精製
いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡの超高純度調製物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物等の細菌発酵培養物でＤｓｂＡを過剰発現することによって産生される。発酵後、細菌細胞が収集及び遠心分離される。結果として生じる細胞ペーストが溶解緩衝液（例えば、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１））中に再懸濁され、溶解される（例えば、微小流動化剤を使用して）。いくつかの実施形態では、細胞溶解物がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１．０％のうちのいずれかを超える最終濃度で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、または約２４時間のうちのいずれかを超える時間で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約０℃、約４℃、または約２１℃のうちのいずれかを超える温度で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、周囲温度（約２１℃）で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＩで条件付けられた溶解物が遠心分離されて、粒子状物質を除去する。いくつかの実施形態では、ＰＥＩで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に濾過される。いくつかの実施形態では、ＰＥＩで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に２２μｍのフィルターを介して濾過される。

【0112】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物からのＤｓｂＡポリペプチドの精製方法であって、ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、約０．０１％～約１．０％の最終濃度になるまで、ＤｓｂＡポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、ｂ）遠心分離により細胞溶解物を浄化することと、ｃ）ＤｓｂＡポリペプチドを含む浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＡポリペプチドを溶出させて、ＤｓｂＡポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、ｅ）ＤｓｂＡポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、ｆ）陽イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＡポリペプチドを溶出させて、精製されたＤｓｂＡポリペプチドを含む陽イオン交換溶出物を生成することと、を含む、方法を含む。

【0113】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、正に荷電しており、かつ固相を通るか、または通過した水溶液中の陰イオンとの交換のために遊離陰イオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。一実施形態では、陰イオン交換材料は、樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、または第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、またはジエチルアミノアエチル（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｅｔｈｙｌ）官能基を含み得る。上述のいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムである。上述のいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー膜である。

【0114】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、負に荷電しており、かつ固相を通るか、または通過した水溶液中の陽イオンとの交換のために遊離陽イオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、樹脂であり得る。陽イオン交換材料は、例えば、スルホン酸塩、カルボキシル、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、またはオルトリン酸塩であるが、これらに限定されないカルボン酸官能基またはスルホン酸官能基を含み得る。上述のいくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。上述のいくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー膜である。本発明のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料ではない。

【0115】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、イオン交換材料は、従来のクロマトグラフィー材料または対流クロマトグラフィー材料を利用し得る。従来のクロマトグラフィー材料としては、例えば、灌流材料（例えば、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散材料（例えば、架橋アガロース樹脂）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂は、Ｐｏｒｏｓ樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、架橋アガロース樹脂は、スルホプロピル－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（「ＳＰＳＦＦ」）樹脂であり得る。対流クロマトグラフィー材料は、膜（例えば、ポリエーテルスルホン）またはモノリス材料（例えば、架橋ポリマー）であり得る。ポリエーテルスルホン膜は、Ｍｕｓｔａｎｇであり得る。架橋ポリマーモノリス材料は、架橋ポリ（グリシジルメタクリレート－コ－エチレンジメタクリレート）であり得る。

【0116】

陰イオン交換材料の例は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（ＱＳＦＦ）、及びＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、弱陰イオン交換材料、例えばＤＥＡＥである。他の実施形態では、陰イオン交換材料は、強陰イオン交換材料、例えば、ＱＳＦＦである。

【0117】

陽イオン交換材料の例は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、ＳＯ３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ ２０、ＳＰＳＦＦ、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ（ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ３、もしくはＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ ５０である。いくつかの実施形態では、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ樹脂は、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ ５０μｍ粒子またはＰｏｒｏｓ ＨＳ ２０μｍ粒子であり得る。いくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、弱陽イオン交換材料、例えば、ＣＭ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）またはその等価物である。他の実施形態では、陽イオン交換材料は、強陽イオン交換材料、例えば、ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０またはその等価物である。

【0118】

ＤｓｂＡを含む組成物のクロマトグラフィー材料への装填は、不純物からのＤｓｂＡ産物の分離のために最適化され得る。いくつかの実施形態では、組成物のクロマトグラフィー材料への装填は、不純物のクロマトグラフィー材料への結合のために最適化される。例えば、組成物は、装填緩衝液の伝導度を一定に保ちながら、いくつかの異なるｐＨの装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料、例えば、クロマトグラフィーカラムに装填され得る。あるいは、組成物は、装填緩衝液のｐＨを一定に保ちながら、いくつかの異なる伝導度の装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料に装填され得る。組成物をクロマトグラフィー材料に装填し、クロマトグラフィー材料から産物をプール画分中に溶出させた時点で、プール画分中の汚染物質の量は、所与のｐＨまたは伝導度での産物の不純物からの分離に関する情報を提供する。

【0119】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＡを含む組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィー材料の約１０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか以下のポリペプチドの装填密度で陰イオン交換クロマトグラフィー材料に装填される。組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィー材料の約１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約６ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ～約８ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約９ｍｇ／ｍＬ、または約９ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかのポリペプチドの装填密度で陰イオンクロマトグラフィー材料に装填され得る。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、アガロースに架橋した第四級アミン、例えば、ＱＳＦＦである。

【0120】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＡを含む組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィー材料の約１０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか以下のポリペプチドの装填密度で陽イオン交換クロマトグラフィー材料に装填される。組成物は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料の約１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約６ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ～約８ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約９ｍｇ／ｍＬ、または約９ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかのポリペプチドの装填密度で陽イオンクロマトグラフィー材料に装填され得る。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）マトリックスに架橋したスルホプロピル部分、例えば、ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０またはその等価物である。

【0121】

クロマトグラフィー材料からのＤｓｂＡの溶出は、最小不純物及び最小プール体積でのＤｓｂＡの産出のために最適化され得る。例えば、組成物は、装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料、例えば、クロマトグラフィーカラムに装填され得る。装填が完了した時点で、産物は、溶出緩衝液の伝導度を一定に保ちながら、いくつかの異なるｐＨの緩衝液で溶出される。あるいは、産物は、溶出緩衝液のｐＨを一定に保ちながら、いくつかの異なる伝導度の溶出緩衝液中のクロマトグラフィー材料から溶出され得る。クロマトグラフィー材料からの産物の溶出が完了した時点で、プール画分中の汚染物質の量は、所与のｐＨまたは伝導度での産物の不純物からの分離に関する情報を提供する。多数の画分（例えば、８カラム体積）における産物の溶出は、溶出プロファイルの「テーリング」を示す。本発明のいくつかの実施形態では、溶出のテーリングが最小限に抑えられる。

【0122】

例えば、緩衝液の所望のｐＨ、緩衝液の所望の伝導度、目的とするタンパク質の特徴、及び精製方法に応じて用いられ得る様々な緩衝液。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、緩衝液を使用することを含む。緩衝液は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、または洗浄緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上が同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液は異なる。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、緩衝液は塩を含む。装填緩衝液は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、塩化ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。

【0123】

装填物とは、本明細書で使用されるとき、クロマトグラフィー材料に装填された組成物である。装填緩衝液は、ＤｓｂＡを含む組成物をクロマトグラフィー材料に装填するために使用される緩衝液である。クロマトグラフィー材料は、精製される組成物の装填前に平衡化緩衝液で平衡化され得る。いくつかの例では、洗浄緩衝液は、組成物をクロマトグラフィー材料に装填した後、かつ目的とするポリペプチドを固相から溶出させる前に使用される。

【0124】

溶出とは、本明細書で使用されるとき、クロマトグラフィー材料からの産物、例えば、ＤｓｂＡの除去である。溶出緩衝液は、クロマトグラフィー材料から目的とするポリペプチドまたは他の産物を溶出させるために使用される緩衝液である。多くの場合、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる物理的特徴を有する。例えば、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる伝導度または装填緩衝液とは異なるｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも低い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも高い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも低いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる伝導度及び異なるｐＨを有する。溶出緩衝液は、より高いまたはより低い伝導度及びより高いまたはより低いｐＨの任意の組み合わせを有し得る。

【0125】

伝導度とは、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を指す。溶液中で、電流は、イオン輸送により流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、この溶液は、より高い伝導度を有するようになる。伝導度の尺度の基本単位は、ジーメンス（またはｍｈｏ）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、様々なモデルのＯｒｉｏｎ伝導度計等の伝導度計を使用して測定され得る。電解質伝導度が電流を搬送する溶液中のイオンの能力であるため、溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更され得る。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度及び／または塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム）の濃度は、所望の伝導度を達成するために変更され得る。好ましくは、様々な緩衝液の塩濃度は、所望の伝導度を達成するために修正される。

【0126】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。伝導度は、約４ｍＳ／ｃｍ～約１７ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ～約７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ～約１７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍ、または約５ｍＳ／ｃｍ～約７ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、伝導度は、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかである。一態様では、伝導度は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液の伝導度である。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び洗浄緩衝液のうちの１つ以上の伝導度が同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液の伝導度は、洗浄緩衝液及び／または平衡化緩衝液の伝導度とは異なる。

【0127】

いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液の伝導度を超える伝導度を有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ、約３５ｍＳ／ｃｍ、約４０ｍＳ／ｃｍ、約４５ｍＳ／ｃｍ、約５０ｍＳ／ｃｍ、約５５ｍＳ／ｃｍ、約６０ｍＳ／ｃｍ、約６５ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ、約７５ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、約８５ｍＳ／ｃｍ、約９０ｍＳ／ｃｍ、約９５ｍＳ／ｃｍ、または約１００ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。いくつかの実施形態では、上述の溶出緩衝液は、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーに使用される。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液の伝導度は、溶出緩衝液の塩濃度を変更することによって変更される。

【0128】

上述の実施形態のうちのいずれかのいくつかの態様では、溶出緩衝液の伝導度は、段階勾配または線形勾配により装填物及び／または洗浄緩衝液から均一濃度で変化したものである。

【0129】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、以下のステップで陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出される：１）約４カラム体積の約１５％の約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ（約ｐＨ９．２）、２）約４カラム体積の約２０％の約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ（約ｐＨ９．２）、３）ＤｓｂＡがカラムから溶出するまで約２５％の約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ及び約２５０ｍＭ ＮａＣｌ（約ｐＨ９．２）。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、１５カラム体積にわたる約０％，～約６０％の１２ｍＭ ＭＥＳ及び１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーから溶出される。

【0130】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換装填緩衝液は、約１０、約９、約８、約７、約６、または約５のうちのいずれか未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約４、約５、約６、約７、約８、または約９のうちのいずれかを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上のｐＨが同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液のｐＨは、平衡化緩衝液及び／または洗浄緩衝液のｐＨとは異なる。

【0131】

いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液のｐＨ未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２のうちのいずれか未満のｐＨを有する。溶出緩衝液のｐＨは、約４～約９、約４～約８、約４～約７、約４～約６、約４～約５、約５～約９、約５～約８、約５～約７、約５～約６、約６～約９、約６～約８、約６～約７のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７／０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０のうちのいずれかである。

【0132】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陽イオン交換装填緩衝液は、約４、約５、約６、または約７のうちのいずれか未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約４、約５、約６、または約７のうちのいずれかを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上のｐＨが同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液のｐＨは、平衡化緩衝液及び／または洗浄緩衝液のｐＨとは異なる。

【0133】

いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液のｐＨを超えるｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５、約６、約７、約８、または約９のうちのいずれかを超えるｐＨを有する。溶出緩衝液のｐＨは、約４～約９、約５～約９、約６～約９、約７～約９、約８～約９、約４～約８、約５～約８、約６～約８、約７～約８、約４～約７、約５～約７、及び約６～約７のうちのいずれかであり得る。

【0134】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、流量は、約５０ＣＶ／時間、約４０ＣＶ／時間、または約３０ＣＶ／時間のうちのいずれか未満である。流量は、約５ＣＶ／時間～約５０ＣＶ／時間、約１０ＣＶ／時間～約４０ＣＶ／時間、または約１８ＣＶ／時間～約３６ＣＶ／時間のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、流量は、約９ＣＶ／時間、約１８ＣＶ／時間、約２５ＣＶ／時間、約３０ＣＶ／時間、約３６ＣＶ／時間、または約４０ＣＶ／時間のうちのいずれかである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、流量は、約２００ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、または約５０ｃｍ／時間のうちのいずれか未満である。流量は、約２５ｃｍ／時間～約２００ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間～約１７５ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間～約１５０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間～約１００ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間～約１００ｃｍ／時間、または約６５ｃｍ／時間～約８５ｃｍ／時間のうちのいずれかであり得る。

【0135】

床高さとは、使用されるクロマトグラフィー材料の高さである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、床高さは、約３ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、または約５０ｃｍのうちのいずれかを超える。床高さは、約３ｃｍ～約５０ｃｍ、約５ｃｍ～約３５ｃｍ、約３ｃｍ～約３５ｃｍ、または約５ｃｍ～約５０ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、床高さは、装填物中のポリペプチドまたは不純物の量に基づいて決定される。

【0136】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、約１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、または２００ｍＬを超える体積を有するカラム容器内で行われる。

【0137】

本発明のいくつかの実施形態では、画分は、クロマトグラフィーから収集される。いくつかの実施形態では、収集される画分は、約０．０１ＣＶ、０．０２ＣＶ、０．０３ＣＶ、０．０４ＣＶ、０．０５ＣＶ、０．０６ＣＶ、０．０７ＣＶ、０．０８ＣＶ、０．０９ＣＶ、０．１ＣＶ、０．２ＣＶ、０．３ＣＶ、０．４ＣＶ、０．５ＣＶ、０．６ＣＶ、０．７ＣＶ、０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、１．０ＣＶ、２．０ＣＶ、３．０ＣＶ、４．０ＣＶ、５．０ＣＶ、６．０ＣＶ、７．０ＣＶ、８．０ＣＶ、９．０ＣＶ、または１０．０ＣＶを超える。いくつかの実施形態では、産物、例えば、ポリペプチドを含有する画分がプールされる。いくつかの実施形態では、装填画分及び溶出画分からのポリペプチドを含有する画分がプールされる。画分中のポリペプチドの量は、当業者によって決定され得、例えば、画分中のポリペプチドの量は、紫外分光法によって決定され得る。いくつかの実施形態では、検出可能なポリペプチド断片を含有する画分がプールされる。いくつかの実施形態では、画分中のＤｓｂＡの存在及び純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される。

【0138】

例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＡの超高純度調製物を産生するための以下の例示的ではあるが非限定的な方法を提供する。ＤｓｂＡは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現される。細胞ペーストが１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１）中に懸濁され（５０ｇ細胞ペースト／１Ｌ）、懸濁液が均質になるまで混合される。細胞溶解が、室内圧力（約７０００ｐｓｉ）での３回通過の微小流動化剤１１０Ｆを使用して行われる。均等物が（１０％ＰＥＩストック溶液を使用して）０．１％ＰＥＩになるように条件付けられ、周囲温度（約２１℃）で３０分間混合される。懸濁液が、「ＧＳＡ」回転子を使用してＳｏｒｖａｌ ＲＣ－５Ｂ＋遠心分離機内で、８５００ｒｐｍで３０分間遠心分離される。遠心分離物が収集され、０．２２ｕｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルターを介して濾過される。

【0139】

（ａ）Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ステップ
細胞溶解物が結合及び溶出モードでＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（ＧＥ）に適用される。カラム高さは、約２０～３０ｃｍであり、流量は、１５０ｃｍ／時間であり、装填密度は、６ｍｇ／ｍＬ以下である。カラムは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．２、８６ｍＳ／ｃｍ、４カラム体積（ＣＶ））で事前平衡化される。カラムは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．１、０．３ｍＳ／ｃｍ、４ＣＶ）で平衡化される。ＤｓｂＡを含む遠心分離物が水（１：１）で希釈され、その後、ｐＨが１．５Ｍ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ９．０、伝導度約１．０ｍＳ／ｃｍ、６ｍｇ／ｍＬ以下）で９．０に調整される。その後、カラムが６ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄される。ＤｓｂＡが、塩濃度の段階勾配増加を使用してカラムから溶出される。緩衝液Ｂは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．２、２６ｍＳ／ｃｍである。ＤｓｂＡは、まず４ＣＶの１５％緩衝液Ｂ、その後、４ＣＶの２０％緩衝液Ｂ、最後に溶出相の残りの２５％緩衝液Ｂを適用することによってカラムから溶出される。これらのプールがＳＥＣによってアッセイされ、最大量のＤｓｂＡを含有する画分に基づいてプールされる。

【0140】

（ｂ）ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０ステップ
その後、プールされたＱＳＦＦ画分が結合及び溶出モードでＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０カラムに適用される。ＱＳＦＦ画分が２．０Ｍ酢酸でｐＨ５．０に調整される。カラム高さは、約２０～３０ｃｍであり、流量は、約１５０ｃｍ／時間であり、装填密度は、約６ｍｇ／ｍＬ以下である。ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０カラムは、１２．５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５、０．４ｍＳ／ｃｍ、４ＣＶ）で最初に平衡化される。２Ｍ酢酸でｐＨ５．０に調整され、その後、水（１：２）で希釈されたＱＳＦＦプール（ｐＨ５．０、０．４ｍＳ／ｃｍ）が、ＰＯＲＯＳ ＨＳ ５０カラムに装填される。その後、カラムが５ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄される。ＤｓｂＡが塩勾配でカラムから溶出される。緩衝液Ｂは、１２．５ｍＭ ＭＥＳ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ５．５、２５ｍＳ／ｃｍである。勾配は、１５ＣＶにわたる０～６０％Ｂである。１ＣＶの画分がピーク収集される。画分がＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びＳＥＣによって分析され、純度に基づいてプールされる。ＰＯＲＯＳプールが、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ－３Ｂ 遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍで約３０分間遠心分離される１０ｋＤのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約３．０ｍｇ／ｍＬに濃縮される。

【0141】

Ｂ．ＤｓｂＣの精製
いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＣの超高純度調製物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物等の細菌発酵培養物でＤｓｂＣを過剰発現することによって産生される。発酵後、細菌細胞が収集及び遠心分離される。結果として生じる細胞ペーストが溶解緩衝液（例えば、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１））中に再懸濁され、溶解される（例えば、微小流動化剤を使用して）。いくつかの実施形態では、細胞溶解物がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、または約１．０％のうちのいずれかを超える最終濃度で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、または約２４時間のうちのいずれかを超える時間で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、約０℃、約４℃、または約２１℃のうちのいずれかを超える温度で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、周囲温度（約２１℃）で、ＰＥＩで条件付けられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＩで条件付けられた溶解物が遠心分離されて、粒子状物質を除去する。いくつかの実施形態では、ＰＥＩで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に濾過される。いくつかの実施形態では、ＰＥＩで条件付けられた溶解物がクロマトグラフィー前に２２μｍのフィルターを介して濾過される。

【0142】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物からのＤｓｂＣポリペプチドの精製方法であって、ａ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、約０．０１％～約１．０％の最終濃度になるまで、ＤｓｂＣポリペプチドを含む細胞溶解物に添加することと、ｂ）遠心分離により細胞溶解物を浄化することと、ｃ）ＤｓｂＣポリペプチドを含む浄化された細胞溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー材料からＤｓｂＣポリペプチドを溶出させて、ＤｓｂＣポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を生成することと、ｅ）ＤｓｂＣポリペプチドを含む陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料に適用することと、ｆ）ＨＩＣ材料からＤｓｂＣポリペプチドを溶出させて、ＨＩＣ溶出物を生成することと、ｇ）ＤｓｂＣポリペプチドを含むＨＩＣ溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに適用することと、ｈ）サイズ排除クロマトグラフィーから精製されたＤｓｂＣポリペプチドを含む画分を収集することと、を含む、方法を含む。

【0143】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、正に荷電しており、かつ固相を通るか、または通過した水溶液中の陰イオンとの交換のために遊離陰イオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。一実施形態では、陰イオン交換材料は、樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、または第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、またはジエチルアミノアエチル（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｅｔｈｙｌ）官能基を含み得る。上述のいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムである。上述のいくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー膜である。

【0144】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、従来のクロマトグラフィー材料または対流クロマトグラフィー材料を利用し得る。従来のクロマトグラフィー材料としては、例えば、灌流材料（例えば、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散材料（例えば、架橋アガロース樹脂）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂は、Ｐｏｒｏｓ樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、架橋アガロース樹脂は、スルホプロピル－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（「ＳＰＳＦＦ」）樹脂であり得る。対流クロマトグラフィー材料は、膜（例えば、ポリエーテルスルホン）またはモノリス材料（例えば、架橋ポリマー）であり得る。ポリエーテルスルホン膜は、Ｍｕｓｔａｎｇであり得る。架橋ポリマーモノリス材料は、架橋ポリ（グリシジルメタクリレート－コ－エチレンジメタクリレート）であり得る。

【0145】

陰イオン交換材料の例は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（ＱＳＦＦ）、及びＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、またはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、弱陰イオン交換材料、例えばＤＥＡＥである。他の実施形態では、陰イオン交換材料は、強陰イオン交換材料、例えば、ＱＳＦＦである。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣの精製に使用される陰イオン交換材料は、弱陰イオン交換材料である。いくつかの実施形態では、弱陰イオン交換材料は、第四級アミンを含む。いくつかの実施形態では、第四級アミンは、架橋アガロースに結合している。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣの精製に使用される陰イオン交換材料は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である。

【0146】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、生体分子を疎水性に従って分離する液体クロマトグラフィー技法である。ＨＩＣクロマトグラフィー材料の例としては、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ ６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒ Ｂｕｔｙｌ ６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ ６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０、Ｓｏｕｒｃｅ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉ－Ｔｒａｐ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。上述のいくつかの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、ＨＩＣクロマトグラフィーカラムである。上述のいくつかの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、ＨＩＣクロマトグラフィー膜である。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ材料は、フェニル部分を含む。いくつかの実施形態では、フェニル部分は、架橋アガロースに結合している。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣの精製に使用されるＨＩＣ材料は、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である。

【0147】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、生体分子をそれらのサイズ及び形状に従って分離する液体クロマトグラフィー技法である。サイズ排除クロマトグラフィー材料には、特定の重量範囲の効率的な分子分離のために様々な孔径のものがある。サイズ排除クロマトグラフィー材料の例としては、デキストラン、多孔質アガロース粒子、架橋アガロース、架橋アガロース及びデキストラン、ならびに架橋アクリルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。サイズ排除クロマトグラフィー材料の例としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、ＴＳＫｇｅｌ、及びＢｉｏ－Ｇｅｌが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除クロマトグラフィーが、ＤｓｂＣの精製に使用される。

【0148】

ＤｓｂＣを含む組成物のクロマトグラフィー材料への装填は、不純物からのＤｓｂＣ産物の分離のために最適化され得る。いくつかの実施形態では、組成物のクロマトグラフィー材料への装填は、不純物のクロマトグラフィー材料への結合のために最適化される。例えば、組成物は、装填緩衝液の伝導度を一定に保ちながら、いくつかの異なるｐＨの装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料、例えば、クロマトグラフィーカラムに装填され得る。あるいは、組成物は、装填緩衝液のｐＨを一定に保ちながら、いくつかの異なる伝導度の装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料に装填され得る。組成物をクロマトグラフィー材料に装填し、クロマトグラフィー材料から産物をプール画分中に溶出させた時点で、プール画分中の汚染物質の量は、所与のｐＨまたは伝導度での産物の不純物からの分離に関する情報を提供する。

【0149】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＣを含む組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィー材料の約１０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか以下のポリペプチドの装填密度で陰イオン交換クロマトグラフィー材料に装填される。組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィー材料の約１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約６ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ～約８ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約９ｍｇ／ｍＬ、または約９ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかのポリペプチドの装填密度で陰イオンクロマトグラフィー材料に装填され得る。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、アガロースに架橋した第四級アミン、例えば、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である。

【0150】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＤｓｂＣを含む組成物は、ＨＩＣ材料の約１０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか以下のポリペプチドの装填密度でＨＩＣ材料に装填される。組成物は、ＨＩＣ材料の約１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約６ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ～約８ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約９ｍｇ／ｍＬ、または約９ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかのポリペプチドの装填密度でＨＩＣ材料に装填され得る。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ材料は、架橋アガロースに架橋したフェニル部分、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）である。

【0151】

クロマトグラフィー材料からのＤｓｂＣの溶出は、最小不純物及び最小プール体積でのＤｓｂＣの産出のために最適化され得る。例えば、組成物は、装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料、例えば、クロマトグラフィーカラムに装填され得る。装填が完了した時点で、産物は、溶出緩衝液の伝導度を一定に保ちながら、いくつかの異なるｐＨの緩衝液で溶出される。あるいは、産物は、溶出緩衝液のｐＨを一定に保ちながら、いくつかの異なる伝導度の溶出緩衝液中のクロマトグラフィー材料から溶出され得る。クロマトグラフィー材料からの産物の溶出が完了した時点で、プール画分中の汚染物質の量は、所与のｐＨまたは伝導度での産物の不純物からの分離に関する情報を提供する。多数の画分（例えば、８カラム体積）における産物の溶出は、溶出プロファイルの「テーリング」を示す。本発明のいくつかの実施形態では、溶出のテーリングが最小限に抑えられる。

【0152】

例えば、緩衝液の所望のｐＨ、緩衝液の所望の伝導度、目的とするタンパク質の特徴、及び精製方法に応じて用いられ得る様々な緩衝液。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、緩衝液を使用することを含む。緩衝液は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、または洗浄緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上が同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液は異なる。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、緩衝液は塩を含む。装填緩衝液は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、塩化ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。

【0153】

装填物とは、本明細書で使用されるとき、クロマトグラフィー材料に装填された組成物である。装填緩衝液は、ＤｓｂＣを含む組成物をクロマトグラフィー材料に装填するために使用される緩衝液である。クロマトグラフィー材料は、精製される組成物の装填前に平衡化緩衝液で平衡化され得る。いくつかの例では、洗浄緩衝液は、組成物をクロマトグラフィー材料に装填した後、かつ目的とするポリペプチドを固相から溶出させる前に使用される。

【0154】

溶出とは、本明細書で使用されるとき、クロマトグラフィー材料からの産物、例えば、ＤｓｂＣの除去である。溶出緩衝液は、クロマトグラフィー材料から目的とするポリペプチドまたは他の産物を溶出させるために使用される緩衝液である。多くの場合、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる物理的特徴を有する。例えば、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる伝導度または装填緩衝液とは異なるｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも低い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも高い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも低いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる伝導度及び異なるｐＨを有する。溶出緩衝液は、より高いまたはより低い伝導度及びより高いまたはより低いｐＨの任意の組み合わせを有し得る。

【0155】

伝導度とは、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を指す。溶液中で、電流は、イオン輸送により流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、この溶液は、より高い伝導度を有するようになる。伝導度の尺度の基本単位は、ジーメンス（またはｍｈｏ）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、様々なモデルのＯｒｉｏｎ伝導度計等の伝導度計を使用して測定され得る。電解質伝導度が電流を搬送する溶液中のイオンの能力であるため、溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更され得る。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度及び／または塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム）の濃度は、所望の伝導度を達成するために変更され得る。好ましくは、様々な緩衝液の塩濃度は、所望の伝導度を達成するために修正される。

【0156】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換装填緩衝液は、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。伝導度は、約４ｍＳ／ｃｍ～約１７ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ～約７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ～約１７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍ、または約５ｍＳ／ｃｍ～約７ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、伝導度は、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかである。一態様では、伝導度は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液の伝導度である。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び洗浄緩衝液のうちの１つ以上の伝導度が同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液の伝導度は、洗浄緩衝液及び／または平衡化緩衝液の伝導度とは異なる。

【0157】

いくつかの実施形態では、陰イオン交換溶出緩衝液は、装填緩衝液の伝導度を超える伝導度を有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ、約３５ｍＳ／ｃｍ、約４０ｍＳ／ｃｍ、約４５ｍＳ／ｃｍ、約５０ｍＳ／ｃｍ、約５５ｍＳ／ｃｍ、約６０ｍＳ／ｃｍ、約６５ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ、約７５ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、約８５ｍＳ／ｃｍ、約９０ｍＳ／ｃｍ、約９５ｍＳ／ｃｍ、または約１００ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液の伝導度は、溶出緩衝液の塩濃度を変更することによって変更される。

【0158】

いくつかの実施形態では、ＨＩＣ装填緩衝液は、溶出緩衝液の伝導度を超える伝導度を有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＨＩＣ装填緩衝液は、約５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約２０ｍＳ／ｃｍ、約２５ｍＳ／ｃｍ、約３０ｍＳ／ｃｍ、約３５ｍＳ／ｃｍ、約４０ｍＳ／ｃｍ、約４５ｍＳ／ｃｍ、約５０ｍＳ／ｃｍ、約５５ｍＳ／ｃｍ、約６０ｍＳ／ｃｍ、約６５ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ、約７５ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、約８５ｍＳ／ｃｍ、約９０ｍＳ／ｃｍ、約９５ｍＳ／ｃｍ、または約１００ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液の伝導度は、溶出緩衝液の塩濃度を変更することによって変更される。

【0159】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出緩衝液は、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれか未満の伝導度を有する。

【0160】

上述の実施形態のうちのいずれかのいくつかの態様では、溶出緩衝液の伝導度は、段階勾配または線形勾配により装填物及び／または洗浄緩衝液から均一濃度で変化したものである。

【0161】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、１５カラム体積にわたる約０％～約６０％の１０ｍＭ ＭＯＰＳ及び２５０ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配で陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出される。いくつかの実施形態では、塩勾配は、１０カラム体積にわたる約０％～約６０％の１０ｍＭ ＭＯＰＳ及び２５０ｍＭ ＮａＣｌである。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、ＤｓｂＣがＨＩＣ材料から溶出するまで精製水を使用してＨＩＣ材料から溶出される。

【0163】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、陰イオン交換装填緩衝液は、約１０、約９、約８、約７、約６、または約５のうちのいずれか未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約４、約５、約６、約７、約８、または約９のうちのいずれかを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上のｐＨが同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液のｐＨは、平衡化緩衝液及び／または洗浄緩衝液のｐＨとは異なる。

【0164】

いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液のｐＨ未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２のうちのいずれか未満のｐＨを有する。溶出緩衝液のｐＨは、約４～約９、約４～約８、約４～約７、約４～約６、約４～約５、約５～約９、約５～約８、約５～約７、約５～約６、約６～約９、約６～約８、約６～約７のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７／０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣを含む組成物は、ｐＨ８の装填緩衝液中の陰イオン交換材料に装填され、ｐＨ約７．０または７．１の溶出緩衝液中の陰イオン交換材料から溶出される。

【0165】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＨＩＣ装填緩衝液は、約６、約７、または約８のうちのいずれか未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約６、約７、または約８のうちのいずれかを超えるｐＨを有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上のｐＨが同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液のｐＨは、平衡化緩衝液及び／または洗浄緩衝液のｐＨとは異なる。

【0166】

いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、貫流モードで使用される。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーに使用される緩衝液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．０±０．４）である。

【0167】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、流量は、約５０ＣＶ／時間、約４０ＣＶ／時間、または約３０ＣＶ／時間のうちのいずれか未満である。流量は、約５ＣＶ／時間～約５０ＣＶ／時間、約１０ＣＶ／時間～約４０ＣＶ／時間、または約１８ＣＶ／時間～約３６ＣＶ／時間のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、流量は、約９ＣＶ／時間、約１８ＣＶ／時間、約２５ＣＶ／時間、約３０ＣＶ／時間、約３６ＣＶ／時間、または約４０ＣＶ／時間のうちのいずれかである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、流量は、約２００ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、または約５０ｃｍ／時間のうちのいずれか未満である。流量は、約２５ｃｍ／時間～約２００ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間～約１７５ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間～約１５０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間～約１００ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間～約１００ｃｍ／時間、または約６５ｃｍ／時間～約８５ｃｍ／時間のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、流量は約０．１ｍＬ／分、約０．２５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分、約０．７５ｍＬ／分、約１ｍＬ／分、約２ｍＬ／分、約３ｍＬ／分、約４ｍＬ／分、約５ｍＬ／分、約６ｍＬ／分、約７ｍＬ／分、約８ｍＬ／分、約９ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分、約１１ｍＬ／分、約１２ｍＬ／分、約１３ｍＬ／分、約１４ｍＬ／分、約１５ｍＬ／分、約２０ｍＬ／分、約２５ｍＬ／分、及び約５０ｍＬ／分を超える。いくつかの実施形態では、流量は、約０．１ｍＬ／分～約１ｍＬ／分、約１ｍＬ／分～約５ｍＬ／分、約１ｍＬ／分～約１０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分～約１０ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分～約１５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分～約２５ｍＬ／分、及び約１５ｍＬ／分～約２５ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣの陰イオン交換クロマトグラフィーの流量は、約１３．３ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣの疎水性相互作用クロマトグラフィーの流量は、約１３．２ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣのサイズ排除クロマトグラフィーの流量は、約１ｍＬ／分である。

【0168】

床高さとは、使用されるクロマトグラフィー材料の高さである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、床高さは、約３ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、約５０ｃｍ、約６０ｃｍ、約７０ｃｍ、約８０ｃｍ、約９０ｃｍ、または約１００ｃｍのうちのいずれかを超える。床高さは、約３ｃｍ～約５０ｃｍ、約５ｃｍ～約３５ｃｍ、約３ｃｍ～約３５ｃｍ、または約５ｃｍ～約５０ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、床高さは、装填物中のポリペプチドまたは不純物の量に基づいて決定される。

【0169】

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、約１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、または２００ｍＬを超える体積を有するカラム容器内で行われる。

【0170】

本発明のいくつかの実施形態では、画分は、クロマトグラフィーから収集される。いくつかの実施形態では、収集される画分は、約０．０１ＣＶ、０．０２ＣＶ、０．０３ＣＶ、０．０４ＣＶ、０．０５ＣＶ、０．０６ＣＶ、０．０７ＣＶ、０．０８ＣＶ、０．０９ＣＶ、０．１ＣＶ、０．２ＣＶ、０．３ＣＶ、０．４ＣＶ、０．５ＣＶ、０．６ＣＶ、０．７ＣＶ、０．８ＣＶ、０．９ＣＶ、１．０ＣＶ、２．０ＣＶ、３．０ＣＶ、４．０ＣＶ、５．０ＣＶ、６．０ＣＶ、７．０ＣＶ、８．０ＣＶ、９．０ＣＶ、または１０．０ＣＶを超える。いくつかの実施形態では、産物、例えば、ポリペプチドを含有する画分がプールされる。いくつかの実施形態では、装填画分及び溶出画分からのポリペプチドを含有する画分がプールされる。画分中のポリペプチドの量は、当業者によって決定され得、例えば、画分中のポリペプチドの量は、紫外分光法によって決定され得る。いくつかの実施形態では、検出可能なポリペプチド断片を含有する画分がプールされる。いくつかの実施形態では、画分中のＤｓｂＣの存在及び純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される。

【0171】

例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＣの超高純度調製物を産生するための以下の例示的ではあるが非限定的な方法を提供する。ＤｓｂＣは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現される。細胞ペーストが１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１）中に懸濁され（５０ｇ細胞ペースト／１Ｌ）、懸濁液が均質になるまで混合される。細胞溶解が、室内圧力（約７０００ｐｓｉ）での３回通過の微小流動化剤１１０Ｆを使用して行われる。均等物が（１０％ＰＥＩストック溶液を使用して）０．１％ＰＥＩになるように条件付けられ、周囲温度（約２１℃）で３０分間混合される。懸濁液が、「ＧＳＡ」回転子を使用してＳｏｒｖａｌ ＲＣ－５Ｂ＋遠心分離機内で、８５００ｒｐｍで３０分間遠心分離される。遠心分離物が収集され、０．２２ｕｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルターを介して濾過される。

【0172】

（ａ）ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
浄化された遠心分離物（１．５Ｍ Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ８．０に条件付けられたもの）が、結合及び溶出モードでＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムに装填される。カラムは、以下の特性を有する。カラムは、直径２８．４ｃｍ×２．６ｃｍ、体積１５１ｍＬ、タンパク質容量５０ｍｇ／ｍＬ以下の樹脂であった。カラムは、３ＣＶの２５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１、伝導度６．２ｍＳ／ｃｍ）で事前平衡化され、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１、伝導度０．３ｍＳ／ｃｍ）で平衡化される。装填の終わりに、カラムは、１２ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄される。ＤｓｂＣは、１５ＣＶの０～６０％緩衝液Ｂの勾配を使用して溶出される。溶出は、溶出緩衝液への１５ＣＶにわたる０～６０％緩衝液Ｂの線形勾配である。画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析される。

【0173】

（ｂ）Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
その後、プールされたＤＥＡＥ画分が結合及び溶出モードでＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）クロマトグラフィーに適用される。カラムは、以下の特性を有する。カラムは、直径２０ｃｍ×２．６ｃｍ、体積１０６ｍＬ、タンパク質容量２０ｍｇ／ｍＬ以下の樹脂であった。カラムは、０．６Ｍ硫酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化される。ＤｓｂＣを含む条件付けられたＤＥＡＥプールは、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに装填され、その後、１．２Ｍ硫酸ナトリウム（１：１）、１Ｍリン酸ナトリウム（１：２０）で希釈され、装填前にｐＨ７．０、約６８ｍＳ／ｃｍに調整される。その後、カラムは、７ＣＶの０．６Ｍ硫酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗浄され、次いで、７ＣＶの０．６Ｍ硫酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗浄される。ＤｓｂＣは、精製水でカラムから溶出される。画分が収集され、カラム画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって分析される。

【0174】

（ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
その後、プールされたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分がＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５を使用してサイズ排除クロマトグラフィーに供される。このステップを使用して、任意の残留高分子量種及び低分子量種を除去し、ＤｓｂＣを製剤化する。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５は、ＤｓｂＣ等のより小さいタンパク質（約２４ｋＤａ）により適した分画範囲（５ｋＤａ～７０ｋＤａ）を有する。カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５であり、以下の特性を有する。カラムは、直径６０ｃｍ×２．６ｃｍ、体積３２０ｍＬ、装填体積１６ｍＬ以下であった。ＨＩＣプール（画分７～１１）は、遠心分離フィルターを使用して１６ｍＬ以下（ＳＥＣ ＣＶの５％以下）の体積に濃縮される。これらの装置は、２０分間隔で臨床遠心分離機を使用して目標体積に到達するまで４０００ｒｐｍで遠心分離される。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラムは、３ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．０±０．４）で平衡化される。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分は、カラムに装填され、ＰＢＳ（ｐＨ７．０±０．４）で、１ｍＬ／分の流量で溶出される。

【0175】

Ｃ．ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの純度の決定方法
ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの調製物の純度の決定方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、調製物中のＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの純度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される。いくつかの実施形態では、調製物中のＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの純度は、高速液体クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ ＳＥＣ）によって決定される。いくつかの実施形態では、調製物中のＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決定される。いくつかの実施形態では、ＳＤＳＰＡＧＥゲル上のタンパク質は、蛍光タンパク質染色を使用して特定される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質染色は、Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色である。いくつかの実施形態では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のタンパク質は、Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ銀染色を使用して可視化される。他の実施形態では、ＤｓｂＡ分子またはＤｓｂＣ分子の同一性は、Ｎ末端配列分析、ペプチド質量フィンガープリント法（ＰＭＦ）、ＣＨＩＰ ＴＯＦによるインタクト／還元質量、及びウエスタンブロット分析を含むが、これらに限定されない特徴付けアッセイを使用して確認される。

【0176】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＡの超高純度調製物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、単量体ＤｓｂＡが調製物の少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．５％のうちのいずれかを構成するＤｓｂＡの調製物を提供する。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＡは、調製物の約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、及び／または約９９．５％のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％、または約０．０１％のうちのいずれか未満の不純物を含む。不純物としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞タンパク質等の宿主細胞タンパク質、核酸、ウイルス、細胞培養培地成分等の細胞培養成分、及びＤｓｂＡの凝集体またはＤｓｂＡの断片（例えば、ＤｓｂＡの非機能的断片）が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、調製物は、約２％、約１．５％、または約１％のうちのいずれか未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、０．５％、または０．１％未満の高分子量種を含む。いくつかの実施形態では、高分子量種は、検出不能である。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＡ、低分子量種、及び／または高分子量種の存在は、ＳＥＣによって検出される。

【0177】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＣの超高純度調製物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、単量体ＤｓｂＣが調製物の少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．５％のうちのいずれかを構成するＤｓｂＣの調製物を提供する。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＣは、調製物の約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、及び／または約９９．５％のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％、または約０．０１％のうちのいずれか未満の不純物を含む。不純物としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞タンパク質等の宿主細胞タンパク質、核酸、ウイルス、細胞培養培地成分等の細胞培養成分、及びＤｓｂＣの凝集体またはＤｓｂＣの断片（例えば、ＤｓｂＣの非機能的断片）が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、約０．５％、または約０．１％のうちのいずれか未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、０．５％、または０．１％未満の高分子量種を含む。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＣ、低分子量種、及び／または高分子量種の存在は、ＳＥＣによって検出される。

【0178】

宿主細胞ＤＮＡ等のＤＮＡの測定方法は、当該技術分野で既知であり、実施例の項に記載される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＤＮＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％のうちのいずれかを超えて低減される。ＤＮＡの量は、約１０％～約９９％、約３０％～約９５％、約３０％～約９９％、約５０％～約９５％、約５０％～約９９％、約７５％～約９９％、または約８５％～約９９％のうちのいずれかで低減され得る。ＤＮＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかで低減され得る。いくつかの実施形態では、低減は、精製ステップ（複数可）から回収された組成物中のＤＮＡの量を精製ステップ（複数可）前の組成物中のＤＮＡの量と比較することによって決定される。

【0179】

細胞培養培地成分とは、細胞培養培地中に存在する成分を指す。細胞培養培地は、細胞の採取時の細胞培養培地であり得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地成分は、ゲンタマイシンである。ゲンタマイシンの量は、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞培養培地成分の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％のうちのいずれかを超えて低減される。細胞培養培地成分の量は、約１０％～約９９％、約３０％～約９５％、約３０％～約９９％、約５０％～約９５％、約５０％～約９９％、約７５％～約９９％、または約８５％～約９９％のうちのいずれかで低減され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地成分の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９８％のうちのいずれかで低減される。いくつかの実施形態では、低減は、精製ステップ（複数可）から回収された組成物中の細胞培養培地成分の量を精製ステップ（複数可）前の組成物中の細胞培養培地成分の量と比較することによって決定される。

【0180】

ＩＩＩ．ポリペプチド－ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ
本発明は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの超高純度調製物の生成方法を提供する。「Ｄｓｂ」タンパク質という用語は、細菌ジスルフィドオキシドレダクターゼを指す。ＤｓｂＡは、ペプチドが細胞のペリプラズム内に出現すると鎖内ジスルフィド結合を形成し、ＤｓｂＣは、細胞のペリプラズムにおける酸化的タンパク質折り畳み中にジスルフィド結合イソメラーゼとしての機能を果たす。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣは、細菌由来である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣポリペプチドである。他の実施形態では、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏａｒｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｍｏｎａｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａの任意の種由来である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0181】

本明細書に記載の方法を使用して精製されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣポリペプチドは、一般に、組換え技法を使用して産生される。細菌中での組換えポリペプチドの産生方法は、当該技術分野で既知である。組換え技法を使用する場合、ポリペプチドは、細胞内で産生され得るか、ペリプラズム空間に産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣをコードする核酸は、ポリペプチドを過剰発現するために宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、プラスミドから発現される。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡをコードする核酸は、配列番号２の核酸配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかの同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣをコードする核酸は、配列番号４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣをコードする核酸は、配列番号３の核酸配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかの同一性を有する核酸配列を含む。

【0182】

ポリペプチドは、培養培地または宿主細胞溶解物から回収され得る。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的または化学的手段、例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤によって破壊され得る。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、第１のステップとして、粒子状残屑、宿主細胞または溶解された断片のいずれかが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌されるポリペプチドを単離するための手順について記載している。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって融解される。細胞残屑が遠心分離によって除去され得る。ポリペプチドが培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清が、一般に、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濃縮される。タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性汚染物質の成長を阻止するための抗生物質が含まれてもよい。

【0183】

ＩＶ．産生時にＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣが使用され得るポリペプチド
タンパク質折り畳み及び集合がＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの過剰発現によって支援され得る細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生され得るポリペプチドの例としては、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカイン、及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの例としては、哺乳類タンパク質、例えば、レニン等；ホルモン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ－鎖；インスリンＢ－鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、正常Ｔ細胞が発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；レラキシンＡ－鎖；レラキシンＢ－鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；酵素；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、または－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、またはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－ｂ；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；表皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５；インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；サイトカイン；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；融合ポリペプチド、すなわち、２つ以上の異種ポリペプチドまたはその断片から成り、組換え核酸によってコードされるポリペプチド；Ｆｃ含有ポリペプチド、例えば、第２のポリペプチドに融合した免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、またはその断片；免疫コンジュゲート；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、－ベータ、及び－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）、またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３、もしくはＨＥＲ４受容体；イムノアドヘシン；ならびに上述のタンパク質のうちのいずれかの断片及び／または変異形、ならびにタンパク質、例えば、上述のタンパク質のうちのいずれか等に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0184】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアッセイ方法のうちのいずれかで使用するためのポリペプチド調製物は、目的とする抗体を含有する。すなわち、宿主細胞によって産生される組換えポリペプチドは抗体である。

【0185】

かかる抗体の分子標的は、ＣＤタンパク質及びそれらのリガンド、例えば、（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９？（ＣＤ７９ａ）、及びＣＤ７９？（ＣＤ７９ｂ）；（ｉｉ）ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体；（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、及びαｖ／β３インテグリン（それらのアルファサブユニットまたはベータサブユニットのいずれか（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）を含む）；（ｉｖ）成長因子、例えば、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；タンパク質Ｃ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７等；ならびに（ｖ）細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載のものを含む。

【0186】

他の例示的な抗体としては、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ－２抗体、抗Ｅ－カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５－３抗体、抗ＣＡ１９－９抗体、抗ｃ－ｅｒｂＢ－２抗体、抗Ｐ－糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ癌タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ－６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ－ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク質抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ－１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、及び抗Ｔｎ－抗原抗体から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0187】

ポリクローナル抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入によって動物において産生される。二機能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１が異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるポリペプチド、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。

【0188】

動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのポリペプチドまたはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３体積の完全フロイントアジュバントと混合し、この溶液を複数の部位で皮内注入することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注入によって完全フロイントアジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５～１／１０で追加免疫される。７～１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。動物は、力価がプラトーに到達するまで追加免疫される。いくつかの実施形態では、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるポリペプチドにコンジュゲートされ、かつ／または異なる架橋試薬によりコンジュゲートされたもので追加免疫される。コンジュゲートは、ポリペプチド融合物として組換え細胞培養で作製することもできる。ミョウバン等の凝集剤も免疫応答を増強するために好適に使用される。

【0189】

モノクローナル抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られる。すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異形は除外され、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、別個の抗体またはポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。

【0190】

例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）が最初に説明したハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。

【0191】

ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物が本明細書に記載されるように免疫化されて、免疫化に使用されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化される。その後、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。

【0192】

そのように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。

【0193】

いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を示すものである。これらのうち、いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手可能なＳＰ－２またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞由来のものである。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。

【0194】

ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。

【0195】

モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。

【0196】

所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手技によってサブクローニングされ、標準の方法によって成長し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。

【0197】

サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手技、例えば、ポリペプチドＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。

【0198】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離及び配列決定される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源としての機能を果たす。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター内に置かれ得て、その後、これが宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンポリペプチドを産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組換え発現についての総説論文としては、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６－２６２（１９９３）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１－１８８（１９９２）が挙げられる。

【0199】

さらなる一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載の技法を使用して生成された抗体ファージライブラリから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリを使用したマウス抗体及びヒト抗体の単離について記載している。続報は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２））、ならびに非常に大きいファージライブラリを構築するための戦略としての組み合わせ感染及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５－２２６６（１９９３））について記載している。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法の実行可能な代替案である。

【0200】

ＤＮＡは、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによっても修飾され得る。

【0201】

典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、ある抗体の定常ドメインの代わりに用いられるか、またはある抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられて、ある抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。

【0202】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。

【0203】

抗体断片
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞から直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、「直鎖状抗体」であってもよい。かかる直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。

【0204】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される。

【0205】

ポリペプチド変異形及び修飾
ある特定の実施形態では、本明細書におけるタンパク質のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、タンパク質の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。タンパク質のアミノ酸配列変異形は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。

【0206】

変異形ポリペプチド
「ポリペプチド変異形」とは、ポリペプチドの全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義されるポリペプチド、例えば、活性ポリペプチドを意味する。かかるポリペプチド変異形としては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、ポリペプチド変異形は、全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちのいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異形ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して１つ以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個のうちのいずれか以下の保存的アミノ酸置換を有する。

【0207】

変異形ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端で切断され得るか、または例えば、全長天然ポリペプチドと比較して、内部残基を欠き得る。ある特定の変異形ポリペプチドは、所望の生物学的活性にとって不可欠ではないアミノ酸残基を欠き得る。切断、欠失、及び挿入を有するこれらの変異形ポリペプチドは、いくつかの従来の技法のうちのいずれかによって調製され得る。所望の変異形ポリペプチドは、化学的に合成されたものであり得る。別の好適な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の変異形ポリペプチドをコードする核酸断片の単離及び増幅することを伴う。核酸断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマー及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、変異形ポリペプチドは、本明細書に開示の天然ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／または免疫学的活性を共有する。

【0208】

アミノ酸配列挿入としては、長さが１残基から１００以上の残基の範囲を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異形としては、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。

【0209】

例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ポリペプチドのアミノ酸配列変異形は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる修飾としては、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達するが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化は、ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後プロセスも改変することができ、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化することができる。

【0210】

どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際の手引きは、ポリペプチドの配列を同種の既知のポリペプチド分子の配列と比較し、かつ相同性の高い領域のアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。

【0211】

変異誘発の好ましい位置であるポリペプチド（例えば、抗体）のある特定の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９）によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基または標的残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。その後、置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置は、さらなるまたは他の変異形を置換部位に、またはそこの代わりに導入することによって洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されている一方で、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、発現した抗体変異形が所望の活性についてスクリーニングされる。

【0212】

別の種類の変異形は、アミノ酸置換変異形である。これらの変異形は、異なる残基に置き換えられた抗体分子内に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発に関する最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も企図される。かかる置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的な置換」と表示されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされ得る。
表１．

【0213】

ポリペプチドの生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくは螺旋立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの影響が著しく異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って群分けされ得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）

【0214】

あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

【0215】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのあるメンバーと別のクラスとの交換を伴う。

【0216】

抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も一般にセリンで置換されて、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を阻止することができる。逆に、システイン結合（複数可）がポリペプチドに付加されて、その安定性を改善することができる（具体的には、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。

【0217】

置換変異形の一例は、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択された結果として生じる変異形（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異形を生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７つの部位）が変異されて、各部位に全ての想定されるアミノ置換を生成する。そのように生成された抗体変異形は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として線維状ファージ粒子から一価様式でディスプレイされる。その後、ファージディスプレイされた変異形は、本明細書に開示のそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング変異誘発が行われ、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と標的との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技法に従う置換の候補である。かかる変異形が生成されると、変異形のパネルが本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。

【0218】

ポリペプチドの別の種類のアミノ酸変異形は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含み得る。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化され得る。かかるグリコシル化は、宿主細胞または宿主生物でのポリペプチドの発現中に天然に生じ得るか、またはヒト介入に起因する計画的な修飾であり得る。改変とは、ポリペプチドに見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／またはポリペプチド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。

【0219】

ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖類であるＮ－アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用され得る。

【0220】

グリコシル化部位のポリペプチドへの付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。改変は、（Ｏ結合グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によっても行われ得る。

【0221】

ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的としての機能を果たすアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンド－及びエキソ－グリコシダーゼの使用によって達成され得る。

【0222】

他の修飾としては、それぞれ、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基それぞれへの脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のγ－アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

【0223】

キメラポリペプチド
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。かかるエピトープタグ形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用してポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。

【0224】

多重特異性抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方は、ｃ－ｍｅｔに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ｃ－ｍｅｔの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、細胞毒性薬を、ｃ－ｍｅｔを発現する細胞に限局させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。

【0225】

多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照のこと）、及び「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照のこと）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと）、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。

【0226】

「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照のこと）。

【0227】

本明細書における抗体または断片としては、ｃ－ｍｅｔ、及びＥＧＦＲ等の別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も挙げられる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照のこと）。

【0228】

二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で既知である。従来、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づいており、これらの２つの重鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常親和性クロマトグラフィーステップによって行われる正しい分子の精製は、幾分煩雑であり、産物収率は低い。同様の手技が、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に開示されている。

【0229】

異なるより好ましいアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合物のうちの少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖融合物をコードするＤＮＡが別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築時に使用される不均等な比率の３つのポリペプチド鎖が最適収率を提供する場合、実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する際に優れた柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合に、またはそれらの比率が特に重要でない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖をコードする配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。

【0230】

このアプローチの好ましい一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにある（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対から成る。二重特異性分子の半分のみでの免疫グロブリン軽鎖の存在により容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造が望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。

【0231】

別のアプローチに従って、抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる（ノブまたは隆起）。大きい側鎖（複数可）と同一または同様の大きさの補償「空洞」（ホール）は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって第２の抗体分子の界面上に作製される。これにより、ホモ二量体等の他の望ましくない最終産物と比べてヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。ノブ及びホールは、本明細書にさらに記載されている。

【0232】

ノブインホール
多重特異性抗体及び／または一アーム抗体及び／またはイムノアドヘシンの産生方法としてノブイントゥホール（Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）を使用することは、当該技術分野で周知である。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された米国特許第５，７３１，１６８号（１９９８年３月２４日付与）、Ａｍｇｅｎに譲渡されたＰＣＴ公開第ＷＯ２００９０８９００４号（２００９年７月１６日公開）、及びＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡された米国特許公開第２００９０１８２１２７号（２００９年７月１６日公開）を参照されたい。Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｃｉａ（２００５）２６（６）：６４９－６５８及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：１－９も参照されたい。簡潔な考察が本明細書に提供されている。

【0233】

「隆起」とは、第１のポリペプチドの界面から突出し、それ故に隣接した界面（すなわち、第２のポリペプチドの界面）の補償空洞内に位置付け可能になり、これにより、例えば、ヘテロ多量体を安定させ、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が好都合になる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。通常、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、隆起をコードするように改変される。これを達成するために、第１のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。置き換えられる元の残基の数の上限は、第１のポリペプチドの界面における残基の総数である。様々なアミノ残基の側鎖体積が以下の表に示される。
表２．アミノ酸の特性

^ａ水の分子量を差し引いたアミノ酸の分子量。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，４３ｒｄ ｅｄ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９６１からの値。
^ｂＡ．Ａ．Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０７－１２３，１９７２からの値。
^ｃＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１－１４，１９７５からの値。アクセス可能な表面積は、この参考文献の図６～２０に定義されている。

【0234】

隆起の形成に好ましい移入残基は、一般に、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。トリプトファン及びチロシンが最も好ましい。一実施形態では、隆起を形成するための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン等の小さい側鎖体積を有する。隆起を形成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｗ置換が挙げられるが、これに限定されない。

【0235】

「空洞」とは、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、それ故に隣接する第１のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。通常、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように改変される。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。置き換えられる元の残基の数の上限は、第２のポリペプチドの界面における残基の総数である。様々なアミノ残基の側鎖体積が上の表２に示されている。空洞の形成に好ましい移入残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。セリン、アラニン、またはトレオニンが最も好ましい。一実施形態では、空洞を形成するための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファン等の大きい側鎖体積を有する。空洞を生成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｌ３６８Ａ置換、及びＹ４０７Ａ置換が挙げられるが、これらに限定されない。

【0236】

「元の」アミノ酸残基とは、元の残基よりも小さいまたは大きい側鎖体積を有し得る「移入」残基に置き換えられるものである。移入アミノ酸残基は、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸残基であり得るが、好ましくは、天然に存在するアミノ酸残基である。「天然に存在する」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによってコードされ、上の表２に列記される残基である。「天然に存在しない」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基（複数可）に共有結合することができる残基を意味する。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び他のアミノ酸残基類似体、例えば、Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１－３３６（１９９１）に記載されるもの等である。かかる天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（上記参照）の手技が使用され得る。簡潔には、これは、天然に存在しないアミノ酸残基を有するサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化、その後のＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を伴う。本発明の方法は、少なくとも１つの元のアミノ酸残基の置き換えを伴うが、２つ以上の元の残基が置き換えられ得る。通常、第１または第２のポリペプチドの界面における合計残基より多くが、置き換えられる元のアミノ酸残基を含むことはない。典型的には、置き換えられる元の残基は「埋められる」。「埋められる」とは、残基が溶媒に本質的にアクセス不能であることを意味する。一般に、移入残基は、ジスルフィド結合の起こり得る酸化または誤対合を阻止するために、システインではない。

【0237】

隆起は、空洞内で「位置付け可能」であり、これは、それぞれ、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの界面の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐ等の隆起が、典型的には、界面の軸から垂直に延びず、好ましい立体配座を有しないため、隆起と対応する空洞との整列は、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるもの等の三次元構造に基づく隆起／空洞対のモデリングに依存する。これは、当該技術分野で広く受け入れられている技法を使用して達成され得る。

【0238】

「元のまたは鋳型核酸」とは、隆起または空洞をコードするように「改変され」得る（すなわち遺伝子操作され得るか、または変異させられ得る）目的とするポリペプチドをコードする核酸を意味する。元のまたは開始核酸は、天然に存在する核酸であり得るか、または事前改変されている核酸（例えば、ヒト化抗体断片）を含み得る。核酸を「改変する」とは、元の核酸が目的とするアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンの挿入、欠失、または置き換えによって変異させられることを意味する。通常、元の残基をコードするコドンは、移入残基をコードするコドンに置き換えられる。この様式でＤＮＡを遺伝子修飾するための技法は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．（１９９１）に概説されており、例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発を含む。元の／鋳型核酸を変異させることによって、元の／鋳型核酸によってコードされた元の／鋳型ポリペプチドがそれに従って対応して改変される。

【0239】

隆起または空洞は、合成手段によって、例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成、前述の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するための技法、ペプチドの酵素または化学的カップリング、またはこれらの技法のいくつかの組み合わせによって、第１または第２のポリペプチドの界面に「導入され」得る。したがって、「導入される」隆起または空洞は、「天然に存在しない」または「非天然」であり、これは、それが天然または元のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）には存在しないことを意味する。

【0240】

一般に、隆起を形成するための移入アミノ酸残基は、比較的小数の「回転異性体」（例えば、約３～６つ）を有する。「回転異性体」とは、アミノ酸側鎖のエネルギー的に好ましい立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数は、Ｐｏｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５－７９１（１９８７）に概説されている。

【0241】

一実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、界面で接触する／相互作用する。第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドが界面で接触するいくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドの界面（配列）は、第１のＦｃポリペプチドの界面（配列）の空洞（「ホール」とも称される）内に位置付け可能な隆起（「ノブ」とも称される）を含む。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、または第２のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、またはこれらの両方である。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されており、第２のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されている。一実施形態では、第２のＦｃポリペプチドの界面は、第１のＦｃポリペプチドの界面の空洞内に位置付け可能な隆起を含み、空洞もしくは隆起、またはこれらの両方が、それぞれ、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの界面に導入されている。第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドが界面で接触するいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド（配列）の界面は、第２のＦｃポリペプチドの界面（配列）の空洞内に位置付け可能な隆起を含む。一実施形態では、第２のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、または第１のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、またはこれらの両方である。一実施形態では、第２のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されており、第１のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されている。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドの界面は、第２のＦｃポリペプチドの界面の空洞内に位置付け可能な隆起を含み、隆起もしくは空洞、またはこれらの両方が、それぞれ、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの界面に導入されている。

【0242】

一実施形態では、隆起及び空洞は各々、天然に存在するアミノ酸残基を含む。一実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの界面由来の元の残基を、元の残基よりも大きい側鎖体積を有する移入残基で置き換えることによって生成される。一実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、前記ポリペプチドの界面由来の元の残基をコードするポリヌクレオチドが元の残基よりも大きい側鎖体積を有する移入残基をコードするポリヌクレオチドで置き換えられるステップを含む方法によって生成される。一実施形態では、元の残基は、トレオニンである。一実施形態では、元の残基は、Ｔ３６６である。一実施形態では、移入残基は、アルギニン（Ｒ）である。一実施形態では、移入残基は、フェニルアラニン（Ｆ）である。一実施形態では、移入残基は、チロシン（Ｙ）である。一実施形態では、移入残基は、トリプトファン（Ｗ）である。一実施形態では、移入残基は、Ｒ、Ｆ、Ｙ、またはＷである。一実施形態では、隆起は、鋳型／元のポリペプチドの２つ以上の残基を置き換えることによって生成される。一実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンのトリプトファンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（ｐｐ．６８８－６９６ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１（１９９１；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。

【0243】

いくつかの実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの界面の元の残基を、元の残基よりも小さい側鎖体積を有する移入残基で置き換えることによって生成される。例えば、空洞を含むＦｃポリペプチドは、前記ポリペプチドの界面由来の元の残基をコードするポリヌクレオチドが元の残基よりも小さい側鎖体積を有する移入残基をコードするポリヌクレオチドで置き換えられるステップを含む方法によって生成され得る。一実施形態では、元の残基は、トレオニンである。一実施形態では、元の残基は、ロイシンである。一実施形態では、元の残基は、チロシンである。一実施形態では、移入残基は、システイン（Ｃ）ではない。一実施形態では、移入残基は、アラニン（Ａ）である。一実施形態では、移入残基は、セリン（Ｓ）である。一実施形態では、移入残基は、トレオニン（Ｔ）である。一実施形態では、移入残基は、バリン（Ｖ）である。空洞は、鋳型／元のポリペプチドの１つ以上の元の残基を置き換えることによって生成され得る。例えば、一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、トレオニン、ロイシン、及びチロシンからなる群から選択される２つ以上の元のアミノ酸の置き換えを含む。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群から選択される２つ以上の移入残基を含む。いくつかの実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、トレオニン、ロイシン、及びチロシンからなる群から選択される２つ以上の元のアミノ酸の置き換えを含み、前記元のアミノ酸は、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群から選択される移入残基で置き換えられる。いくつかの実施形態では、置き換えられる元のアミノ酸は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及び／またはＹ４０７である。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンのセリンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、３６８位のロイシンのアラニンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、４０７位のチロシンのバリンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸置き換えを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。これらの抗体断片のいくつかの実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンのトリプトファンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。

【0244】

一実施形態では、本抗体は、ＷＯ２００５／０６３８１６に記載されるように「ノブ」及び「ホール」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、ホール変異は、ＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、及び／またはＹ４０７Ｖのうちの１つ以上であり得、ノブ変異は、Ｔ３６６Ｗであり得る。

【0245】

Ｖ．ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを使用した異種ポリペプチド（例えば、抗体）の組換え産生の場合、それをコードする核酸は、単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。ポリペプチド（例えば、抗体）をコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物起源のいずれかのものである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解される。

【0246】

Ａ．原核生物宿主細胞を使用した抗体の生成：
ｉ．ベクター構築
本発明のポリペプチド（例えば、抗体）のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得られ得る。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技法を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、かつ当該技術分野で既知である多くのベクターが本発明で使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて様々な成分を含有する。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。

【0247】

一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、それ故に形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内因性タンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターも含有し得るか、またはそれを含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。

【0248】

加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ＧＥＭ（商標）－１１等のバクテリオファージが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換するために使用され得る組換えベクターを作製する際に利用され得る。

【0249】

本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター－シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス、誘導プロモーター及び構成プロモーターに分けられる。誘導プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答してその制御下で増加したレベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。

【0250】

様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、かつ単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に結合し得る。天然プロモーター配列も多くの異種プロモーターもいずれも、標的遺伝子の増幅及び／または発現を誘導するために使用され得る。いくつかの実施形態では、異種プロモーターが一般に天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して発現された標的遺伝子のより大きい転写及びより高い収率をもたらすため、異種プロモーターが利用される。

【0251】

原核生物宿主との使用に好適なプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーター等）も好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それにより、当業者が、任意の必要とされる制限部位を提供するためにリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに作動可能に連結することが可能になっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。

【0252】

翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、タンパク質の全体の翻訳レベルの主要な決定因子である。ＴＩＲは、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含み、シャイン・ダルガノ配列の直上流から開始コドンのおよそ２０ヌクレオチド下流まで延びている。一般に、このベクターは、ＴＩＲを含み、ＴＩＲ及び変異形ＴＩＲは、当該技術分野で既知であり、ＴＩＲの生成方法は、当該技術分野で既知である。一連の核酸配列変異形がある範囲の翻訳強度で作製され、それにより多くの異なるポリペプチドの最適な分泌のためにこの因子を調整するための便利な手段を提供することができる。ＰｈｏＡ等のこれらの変異形に融合するレポーター遺伝子の使用により、異なる翻訳開始領域の相対翻訳強度の定量方法が提供される。変異形または変異体ＴＩＲがプラスミドベクターのバックグラウンドに提供され、それにより、成熟ポリペプチドの最大発現の翻訳強度の最適範囲を確立するように目的とする遺伝子が挿入される一組のプラスミド及び測定されるその発現を提供することができる。変異形ＴＩＲは、ＵＳＰ８，２４１，９０１に開示されている。

【0253】

本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたる発現ポリペプチドの転位を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明で選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに特有のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、本発明のシグナルポリペプチドから選択された原核生物シグナル配列により置換される。加えて、ベクターは、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択されるシグナル配列を含み得る。

【0254】

一態様では、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）が、抗体を集合的にコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、抗体の軽鎖をコードし、別個のポリヌクレオチドが、抗体の重鎖をコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、抗体の軽鎖及び重鎖をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）が、一アーム抗体を集合的にコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、（ａ）一アーム抗体の軽鎖及び重鎖、ならびに（ｂ）Ｆｃポリペプチドをコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、一アーム抗体の軽鎖及び重鎖をコードし、別個のポリヌクレオチドが、Ｆｃポリペプチドをコードする。一実施形態では、別個のポリヌクレオチドが、それぞれ、一アーム抗体の軽鎖成分、一アーム抗体の重鎖成分、及びＦｃポリペプチドをコードする。一アーム抗体の産生については、例えば、ＷＯ２００５０６３８１６に記載されている。

【0255】

本発明の抗体の発現に好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌等のＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、本発明の宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する株３３Ｄ３（米国特許第５，６３９，６３５号）、ならびに株６３Ｃ１及び６４Ｂ４等）が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、６２Ａ７（ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＬ８、ｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ΔｄｅｇＰ ｉｌｖＧ修復型）と名付けられたＷ３１１０誘導体である。他の株及びその誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ λ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体の構築方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。一般に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して適切な細菌を選択することが必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０等の周知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が宿主として好適に使用され得る。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素しか分泌すべきでなく、さらなるプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物に組み込まれることが望ましくあり得る。

【0256】

細菌培養におけるポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、細菌細胞が修飾され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切な集合及び折り畳みを改善するために、細菌宿主細胞は、宿主原核生物細胞を共形質転換するために使用され得るＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）等のシャペロンタンパク質を過剰発現するさらなるベクターを含み得る。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解を容易にすることが実証されている。

【0257】

ｉｉ．抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。

【0258】

形質転換とは、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になるように、ＤＮＡを原核生物宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換がかかる細胞に適切な標準の技法を使用して行われる。一般に、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるなお別の技法は、電気穿孔である。

【0259】

本発明のポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、当該技術分野で既知であり、かつ選択された宿主細胞の培養に好適な培地で成長する。好適な培地の例としては、必要な栄養素補助剤を含むルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターを含有する原核生物細胞の成長を選択的に許容するために、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるための培地に添加される。

【0260】

炭素、窒素、及び無機リン酸塩源に加えて、任意の必要な補助剤も、単独で、または複合窒素源等の別の補助剤もしくは培地との混合物として導入される適切な濃度で含まれ得る。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。

【0261】

原核生物宿主細胞は、好適な温度で培養される。Ｅ．ｃｏｌｉ成長の場合、例えば、好ましい温度は、約２０℃～約３９℃の範囲、より好ましくは約２５℃～約３７℃の範囲、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５～約９の範囲の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは、好ましくは約６．８～約７．４、より好ましくは約７．０である。

【0262】

誘導プロモーターが本発明の発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸塩制限培地で培養される。好ましくは、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．方法（２００２），２６３：１３３－１４７を参照のこと）、またはＷＯ２００２／０６１０９０に記載の培地である。様々な他の誘導因子が、当該技術分野で既知の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。

【0263】

一実施形態では、本発明の発現ポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、それから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解等の手段による微生物の破壊を伴う。細胞が破壊されると、細胞残屑または全細胞は、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製される。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞が培養物から除去され得、培養上清が、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濾過及び濃縮される。発現ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイ等の一般に既知の方法を使用してさらに単離及び特定され得る。

【0264】

本発明の一態様では、抗体産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。様々な大規模供給バッチ発酵手技が組換えポリペプチドの産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分布させるために撹拌インペラーを使用する。小規模発酵とは、一般に、容積がおよそ１００リットル以下であり、約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る発酵槽での発酵を指す。

【0265】

発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が所望の密度、例えば、約１８０～２２０のＯＤ５５０になるまで好適な条件下で成長した後に開始され、その段階で、細胞は、初期静止期にある。様々な誘導因子が、当該技術分野で既知の上述の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。細胞は、誘導前により短い期間成長し得る。細胞は、通常、約１２～５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間も使用され得る。

【0266】

本発明のポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、様々な発酵条件が修正され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切な集合及び折り畳みを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）等のシャペロンタンパク質を過剰発現するさらなるベクターを使用して、宿主原核生物細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解を容易にすることが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１－１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５、Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３、Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡ及びＣは、細菌宿主細胞で発現される。

【0267】

発現異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株が本発明に使用され得る。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせをコードする遺伝子において遺伝子変異（複数可）をもたらすように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）（上記参照）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載されている。

【0268】

一実施形態では、タンパク質分解酵素が欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株が、本発明の発現系における宿主細胞として使用される。

【0269】

ｉｉｉ．抗体精製
当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手技：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥ等のシリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用したゲル濾過が、好適な精製手技の例示である。

【0270】

一態様では、固相に固定化されたタンパク質Ａが、本発明の抗体産物の免疫親和性精製に使用される。タンパク質Ａは、高親和性で抗体のＦｃ領域に結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３。タンパク質Ａが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、より好ましくは、制御孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの適用では、カラムは、不純物の非特異的結合を阻止するためにグリセロール等の試薬でコーティングされている。

【0271】

精製の第１のステップとして、上述のように細胞培養から得られた調製物がタンパク質Ａ固定化固相に適用されて、目的とする抗体のタンパク質Ａへの特異的結合を可能にする。その後、固相が洗浄されて、固相に非特異的に結合している不純物を除去する。最後に、目的とする抗体が、溶出により固相から回収される。

【0272】

本発明のいくつかの実施形態では、精製ステップのうちの１つ以上から得られる画分は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの除去について分析される。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの除去は、免疫アッセイ、例えば、本明細書に記載の免疫アッセイによって決定される。

【0273】

本発明は、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）等の細胞毒性薬にコンジュゲートされる本明細書に記載の抗体のうちのいずれかを含む免疫コンジュゲート（同義に「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称される）も提供する。

【0274】

ＶＩ．ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの組成物
いくつかの態様では、本発明は、超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、約９５．０％、約９６．０％、約９７．０％、約９８．０％、約９９．０％、または約９９．５％のうちのいずれかを超える単量体ＤｓｂＡであるＤｓｂＡを含む。いくつかの実施形態では、９５％の単量体ＤｓｂＡを含む組成物は、調製物中の材料の５％未満が、ＤｓｂＡの産生中に存在する細胞または細胞溶解物（例えば、タンパク質、核酸、脂質等）中に存在した他の物質である組成物である。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＡポリペプチドの割合は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって測定される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡを含む組成物は、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、または約０．１％のうちのいずれか未満の低分子量種（例えば、ＳＥＣまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定される、単量体ＤｓｂＡ未満の分子量を有する種）を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡを含む組成物は、約２％未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡを含む組成物は、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、または約０．１％のうちのいずれか未満の高分子量種（例えば、ＳＥＣまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定される、単量体ＤｓｂＡを超える分子量を有する種）を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡを含む組成物は、約１％未満の高分子量種を含む。

【0275】

いくつかの実施形態では、組成物は、約９５．０％、約９６．０％、約９７．０％、約９８．０％、約９９．０％、または約９９．５％のうちのいずれかを超える単量体ＤｓｂＣであるＤｓｂＣを含む。いくつかの実施形態では、９５％の単量体ＤｓｂＣを含む組成物は、調製物中の材料の５％未満が、ＤｓｂＣの産生中に存在する細胞または細胞溶解物（例えば、タンパク質、核酸、脂質等）中に存在した他の物質である組成物である。いくつかの実施形態では、単量体ＤｓｂＣポリペプチドの割合は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって測定される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣを含む組成物は、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、または約０．１％のうちのいずれか未満の低分子量種（例えば、ＳＥＣまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定される、単量体ＤｓｂＣ未満の分子量を有する種）を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣを含む組成物は、約２％未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣを含む組成物は、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、または約０．１％のうちのいずれか未満の高分子量種（例えば、ＳＥＣまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定される、単量体ＤｓｂＣを超える分子量を有する種）を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣを含む組成物は、約１％未満の高分子量種を含む。

【0276】

いくつかの実施形態では、高度に精製されたＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを含む組成物が、使用のために製剤化される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを含む組成物は、例えば、アジュバントを添加して免疫応答の生成を容易にすることによって、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに対する抗体を生成するように動物の免疫化するために製剤化される。他の実施形態では、超高純度ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを含む組成物は、免疫アッセイでの使用、例えば、陽性対照または標準曲線としての使用のために製剤化される。

【0277】

ＶＩＩ．ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣに対する抗体の生成
ある特定の態様では、本発明は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの存在について組換えポリペプチド試料を分析するための免疫アッセイで使用するための抗体（例えば、ポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体）を生成するために免疫原として使用するための超高純度ＤｓｂＡ及び超高純度ＤｓｂＣを提供する。例えば、本抗体は、組換えポリペプチドがＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを過剰発現する細菌細胞で産生された組換えポリペプチド試料中のＤｓｂＡ及びまたはＤｓｂＣを検出及び／または定量するための免疫アッセイで使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合するポリクローナル抗体及び／または超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合するポリクローナル抗体を提供する。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの異なるエピトープに特異的に結合し、それ故に、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ断片、変異形、誤って折り畳まれたタンパク質等を検出するための有用性を提供する。免疫アッセイで測定される試料中のＤｓｂＡまたはＤｓｂＣのレベルの過剰定量をもたらし得る宿主細胞タンパク質不純物に対するウサギ抗体の生成を最小限に抑えるために、動物（例えば、ウサギ）が超高純度ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣで免疫化される。

【0278】

本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体及びＤｓｂＣに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入によって動物において産生される。二機能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１が異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるポリペプチド、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。

【0279】

動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのポリペプチドまたはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３体積の完全フロイントアジュバントと混合し、この溶液を複数の部位で皮内注入することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注入によって完全フロイントアジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５～１／１０で追加免疫される。７～１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。動物は、力価がプラトーに到達するまで追加免疫される。いくつかの実施形態では、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるポリペプチドにコンジュゲートされ、かつ／または異なる架橋試薬によりコンジュゲートされたもので追加免疫される。コンジュゲートは、ポリペプチド融合物として組換え細胞培養で作製することもできる。ミョウバン等の凝集剤も免疫応答を増強するために好適に使用される。

【0280】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣで免疫化される動物は、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである。

【0281】

いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られる。すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異形は除外され、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、別個の抗体またはポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。上述のように、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）が最初に説明したハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。

【0282】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗ＤｓｂＡ抗体を含む組成物を支持材料に結合している超高純度ＤｓｂＡを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、抗ＤｓｂＡ抗体を溶出させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、支持材料に結合している超高純度ＤｓｂＡは、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０５％、約０．０１％のうちのいずれか未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡは、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＡに特異的に結合するポリクローナル抗体の精製方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体の約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０５％、約０．０１％のうちのいずれか未満が、非ＤｓｂＡ化合物に特異的に結合する。

【0283】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗ＤｓｂＣ抗体を含む組成物を支持材料に結合している超高純度ＤｓｂＣを含むクロマトグラフィー材料と接触させることと、クロマトグラフィー材料を洗浄して、結合していない化合物を除去することと、抗ＤｓｂＣ抗体を溶出させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、支持材料に結合している超高純度ＤｓｂＡは、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０５％、約０．０１％のうちのいずれか未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣは、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＣに特異的に結合するポリクローナル抗体の精製方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体の約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０５％、約０．０１％のうちのいずれか未満が、非ＤｓｂＣ化合物に特異的に結合する。

【0284】

いくつかの実施形態では、抗ＤｓｂＡ及び／または抗ＤｓｂＣ抗体は、抗体を、クロマトグラフィー材料に固定化された超高純度ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ（例えば、活性化グリセリル制御孔ガラスに固定化された超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣ）と接触させることによって精製される。いくつかの実施形態では、抗体は、固定化ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣとの接触前に、例えば、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮される。いくつかの実施形態では、抗体が固定化ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに結合し、その後、固定化ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ－抗体複合体が洗浄されて、結合していない不純物を除去する。さらなる実施形態では、抗体は、装填緩衝液として異なるｐＨの緩衝液で溶出することによって固定化ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣから溶出し、例えば、抗体は、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．２）の固定化ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに結合し、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２．０）で溶出される。いくつかのさらなる実施形態では、抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体に対して、さらなるクロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを行う。いくつかの実施形態では、精製された抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体（例えば、ポリクローナル抗体）は、それぞれ、超高純度ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣへのそれらの結合についてアッセイされる。

【0285】

ＶＩＩＩ．ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣに対する抗体を使用した免疫アッセイ
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＡの存在及び／または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して試料中のＤｓｂＡを検出することと、試料中で検出されたＤｓｂＡの量を超高純度ＤｓｂＡ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％、または約０．０１％のうちのいずれか未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡ参照標準は、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％、または約０．０１％のうちのいずれか未満の非ＤｓｂＡ化合物に結合する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、検出抗体として使用される。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出剤（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）内で調製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤｓｂＡを過剰発現する（例えば、ＤｓｂＡを過剰発現したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物であるか、または組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＡに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて、約５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、及び／または約１．５ｎｇ／ｍＬ未満、及び／またはそれらのうちのいずれかのＤｓｂＡを検出することができる。

【0286】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＤｓｂＣの存在及び／または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して試料中のＤｓｂＣを検出することと、試料中で検出されたＤｓｂＣの量を超高純度ＤｓｂＣ参照標準の１つ以上の濃度の検出と比較することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、調製物は、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％、または約０．０１％のうちのいずれか未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣ参照標準は、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％、または約０．０１％のうちのいずれか未満の非ＤｓｂＣ化合物に結合する。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて、約５０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ、及び／または約１ｎｇ／ｍＬ未満、及び／またはそれらのうちのいずれかのＤｓｂＣを検出することができる。いくつかの実施形態では、超高純度ＤｓｂＣに特異的に結合する抗体は、検出抗体として使用される。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出剤（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）内で調製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤｓｂＣを過剰発現する（例えば、ＤｓｂＣを過剰発現したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物であるか、または組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。

【0287】

いくつかの態様では、本発明は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ検出及び定量化のための免疫アッセイ方法を提供する。かかる方法は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣが過剰発現されてポリペプチド折り畳み及び集合を容易にする、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えポリペプチド調製物中のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの検出及び定量化のために使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫アッセイ方法は、本明細書に記載の捕捉及び検出抗ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ抗体を使用する。いくつかの実施形態では、本抗体は、サンドイッチアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイ、電気化学的アッセイ（ＥＣＬ）アッセイ、磁気免疫アッセイを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の免疫アッセイ方法で使用される。ある特定の実施形態では、本方法は、抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体のＤｓｂＡまたはＤｓｂＣへの結合を許容する条件下で、組換えポリペプチド調製物の試料を本明細書に記載の抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体と接触させることと、複合体が、それぞれ、抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体とＤｓｂＡまたはＤｓｂＣとの間に形成されたかを検出することと、を含む。

【0288】

ある特定の実施形態では、標識された抗ＤｓｂＡ及び／または抗ＤｓｂＣ抗体が提供される。標識としては、直接検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、電子密度の高い標識、化学発光標識、及び放射性標識等）、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用により検出される酵素またはリガンド等の部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン等のフルオロフォア及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、蛍ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ等）とカップリングした複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0289】

ある特定の実施形態では、捕捉抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体は、固相に固定化される。いくつかの実施形態では、固定化のために使用される固相は、例えば、表面、粒子、多孔質マトリックス、ビーズ等の形態の支持体を含む、本質的に水不溶性であり、かつ免疫測定アッセイに有用な任意の不活性支持体または担体である。一般に使用されている支持体の例としては、小シート、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、ゲル、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等から製造されたアッセイプレートまたは試験管、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート、ならびに濾紙等の粒子材料、アガロース、架橋デキストラン、及び他の多糖が挙げられる。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号、同３，６９１，０１６号、同４，１９５，１２８号、同４，２４７，６４２号、同４，２２９，５３７号、及び同４，３３０，４４０号に記載の反応性水不溶性マトリックス、例えば、臭化シアン活性化炭水化物、及び反応性基質が、捕捉－試薬固定化に好適に用いられる。いくつかの実施形態では、固定化捕捉試薬は、一度にいくつかの試料を分析するために使用され得るマイクロタイタープレート上にコーティングされる。例示的なマイクロタイタープレートとしては、ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ（登録商標）、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）、ＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＢ（登録商標）、及びＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。固相は、非共有結合もしくは共有結合相互作用、または所望の場合、物理的結合によって結合し得る、上で定義された捕捉試薬でコーティングされる。結合技法としては、米国特許第４，３７６，１１０号及びそこに引用される参考文献が挙げられる。共有結合の場合、プレートまたは他の固相が、室温で１時間等の当該技術分野で周知の条件下で、捕捉試薬と一緒に架橋剤とインキュベートされる。いくつかの実施形態では、プレートが積み重ねられ、アッセイ自体のかなり前にコーティングされ、その後、アッセイが、手動で、半自動で、または自動で、例えば、ロボット工学を使用して、いくつかの試料で同時に行われる。

【0290】

いくつかの実施形態では、コーティングされたプレートは、結合部位に非特異的に結合してそれを飽和させる遮断剤で処理されて、遊離リガンドのプレートのウェル上の過剰部位への望ましくない結合を阻止する。この目的に適切な遮断剤の例としては、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂乳が挙げられるが、これらに限定されない。遮断処理は、典型的には、周囲温度である期間、典型的には、約１～４時間の条件下で行われる。

【0291】

いくつかの実施形態では、コーティング及び遮断後、分析される、適切には、希釈される試料が固定化相に添加される。この目的のために希釈に使用され得る例示的な緩衝液としては、（ａ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ ＴＷＥＥＮ ２０（登録商標）洗剤（Ｐ２０）、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００抗生物質、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ３－（（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）界面活性剤、０．２％ベータ－ガンマグロブリン、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；（ｂ）０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ Ｐ２０、及び０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００を含有するＰＢＳ（ｐＨ７）；（ｃ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｐ２０、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ６．３５）；（ｄ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｐ２０、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ベータ－ガンマグロブリン、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ；ならびに（ｅ）０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｐ２０、０．０５％ ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ＣＨＡＰＳ、及び０．３５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳが挙げられるが、これらに限定されない。

【0292】

試料及び固定化捕捉試薬のインキュベーションの条件は、アッセイの感度を最大にし、解離を最小限に抑えるように、かつ試料中に存在する目的とする任意の検体（ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ等）が固定化捕捉試薬に確実に結合するように選択される。任意に、試料は、固定化捕捉試薬から分離されて（例えば、洗浄によって）、捕捉されていない材料を除去する。洗浄に使用される溶液は、一般に、緩衝液（例えば、「洗浄緩衝液」）である。架橋剤または他の好適な薬剤もこの段階で添加されて、目的とする捕捉された材料がその後のステップである程度解離されるという懸念がある場合に、目的とする結合した材料（例えば、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）が捕捉試薬に共有結合することを可能にし得る。

【0293】

存在する目的とする任意の結合した材料を有する固定化捕捉試薬が、検出抗ＤｓｂＡまたは抗ＤｓｂＣ抗体と接触する。いくつかの実施形態では、検出抗体は、ビオチン化される。いくつかの実施形態では、ビオチン化標識のための検出手段は、アビジンまたはストレプトアビジン－ＨＲＰである。いくつかの実施形態では、検出手段の読み出しは、蛍光または比色である。

【0294】

捕捉試薬に結合している試料由来の目的とする任意の遊離材料（例えば、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）のレベルは、検出抗体の検出手段を使用して測定または定量化される。いくつかの実施形態では、測定または定量化は、上述のステップの結果として生じる反応を標準曲線と比較して、目的とする材料（例えば、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）のレベルを既知の量と比較して決定することを含む。

【0295】

固定化捕捉試薬に添加される抗体は、直接標識されるか、または過剰な第１の抗体を洗い流した後に第１の抗体の動物種のＩｇＧに対して指向されたモル過剰の第２の標識抗体を添加することによって間接的に検出されるかのいずれかである。後者の間接アッセイでは、第１の抗体に対する標識された抗血清が試料に添加されて、標識抗体をインサイチュで産生する。

【0296】

第１の抗体または第２の抗体のいずれかに使用される標識は、目的とする遊離材料（例えば、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）の第１の抗体または第２の抗体への結合を妨害しない任意の検出可能な機能性である。好適な標識の例としては、免疫アッセイでの使用に既知のもの、例えば、上に列挙されるものが挙げられる。

【0297】

これらの標識をタンパク質またはポリペプチドに共有結合させる従来の方法が利用可能である。例えば、カップリング剤、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス－イミデート、ビス－ジアゾ化ベンジジン等を使用して、抗体を、上述の蛍光標識、化学発光標識、及び酵素標識でタグすることができる。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光測定法）及び米国特許第３，６４５，０９０号（酵素）、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４－１０２１（１９７４）、Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０：２１９－２３０（１９８１）、ならびにＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７－４１２（１９８２）を参照されたい。いくつかの実施形態では、標識は、検出手段としてストレプトアビジン－ＨＲＰを使用するビオチンである。

【0298】

酵素等のかかる標識の抗体へのコンジュゲーションは、免疫アッセイ技法の技術者にとって標準の操作手技である。例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ，Ｖｏｌ．７３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８１），ｐｐ．１４７－１６６を参照されたい。

【0299】

最後に標識された抗体を添加した後、結合している抗体の量は、過剰な結合していない標識抗体を洗浄により除去し、その後、標識に適切な検出方法を使用して結合した標識の量を測定または定量化し、測定された量を生物学的試料中の目的とする抗体の量と相関させることによって決定される。例えば、酵素の場合、発現及び測定された色の量は、存在する目的とする抗体の量の定量化を可能にする直接測定値となる。一実施形態では、ＨＲＰは、標識であり、色は、基質ＯＰＤを４９０ｎｍの吸光度で使用して検出される。

【0300】

一例では、第１の標識されていない抗体に対して指向された酵素標識された第２の抗体が固定化相から洗浄された後、色または化学発光が、固定化捕捉試薬を酵素基質とインキュベートすることによって発現及び測定される。その後、目的とする材料（例えば、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）の濃度が、並行して標準実行によって生成された色または化学発光と比較することによって計算される。

【0301】

いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質の折り畳み及び集合を容易にするためのＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを含む細菌内で調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを過剰発現する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを過剰発現したＥ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、品質アッセイは、組換えポリペプチドを含む組成物の試料を免疫アッセイに供して、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを検出することを含み、ある特定の量を超えるＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの検出は、治療用ポリペプチドの薬学的組成物が動物への投与に好適ではないことを示す。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドを含む組成物の試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、組換えポリペプチドを含む組成物から得られ、組換えポリペプチドは、１つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドを含む組成物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、約５０ｐｐｍ、約４０ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、または約０．１ｐｐｍのうちのいずれか未満のＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの濃度は、薬学的組成物が動物への投与に好適であることを示す。

【0302】

ＩＸ．製品及びキット
本明細書に記載の方法によって精製されるポリペプチド及び／または本明細書に記載の方法によって精製されるポリペプチドを含む製剤は、製品に含まれ得る。いくつかの実施形態では、製品は、本明細書に記載の超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣポリペプチドを使用して生成された抗体を含む。製品は、ポリペプチド、抗体、ポリペプチド製剤、及び／または抗体製剤を収容する容器を含み得る。好ましくは、製品は、（ａ）本明細書に記載のポリペプチド、抗体、ポリペプチド製剤、及び／または抗体製剤を含む組成物を容器内に含む容器、ならびに（ｂ）ポリペプチド及び／または抗体の使用に関する指示を有する添付文書を含む。

【0303】

製品は、容器と、容器上のまたは容器に関連するラベルまたは添付文書と、を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、製剤を保持または収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルであり得る）。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、シリンジである。いくつかの実施形態では、シリンジは、注入デバイス内にさらに収容される。いくつかの実施形態では、注入デバイスは、自己注入器である。

【0304】

「添付文書」は、ポリペプチド、抗体、ポリペプチド製剤、及び／または抗体製剤の使用に関する情報を含む治療薬の商業用パッケージ内に習慣的に含まれる指示を指すために使用される。

【0305】

いくつかの実施形態では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＡの検出のためのキットであって、本明細書に記載の抗ＤｓｂＡ抗体を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＣの検出のためのキットであって、本明細書に記載の抗ＤｓｂＣ抗体を含む、キットを提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの検出のためのキットであって、本明細書に記載の抗ＤｓｂＡ抗体及び本明細書に記載の抗ＤｓｂＣ抗体を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のＤｓｂＡの検出のためのキットを提供し、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを過剰発現する。いくつかの実施形態では、キットは、使用に関する指示を含む。いくつかの実施形態では、キットは、試料中のＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準として使用するための超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、試料中のＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを検出するためのあるアッセイにおける陽性対照として使用するための超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣをさらに含む。

【0306】

本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。

【0307】

本発明のさらなる詳細が、以下の非限定的な実施例によって例証されている。本明細書における全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【実施例】

【0308】

以下の実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、それ故に、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供されている。

【0309】

実施例１．Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のアッセイは、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを適切に測定しない。
ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＤｓｂＡ）は、ジスルフィド結合を形成するためのチオール－ジスルフィド交換反応によってタンパク質中のシステインを酸化することができる強酸化剤である。これは、細菌におけるジスルフィド結合形成の一次触媒であり、タンパク質の正しいタンパク質折り畳みを促進する。同様に、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＤｓｂＣ）は、細胞のペリプラズムにおける酸化的タンパク質－折り畳み中のジスルフィド結合イソメラーゼである。ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉで高レベルでは発現されないが、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉが抗体（例えば、多重特異性抗体）を含むヘテロ多量体真核生物タンパク質の適切な集合及び折り畳みを改善するために使用されている。

【0310】

Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質（ＥＣＰ）のアッセイがＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの存在を適切に検出及び定量することができるかを決定するために、精製されたＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの試料を、アッセイ希釈剤（０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍ ＮａＰＯ_４／０．１％魚ゼラチン／０．０５％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０／０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００）に異なる濃度で添加し、ＥＣＰアッセイで試験した（Ｚｈｕ－Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．１１１：２３６７－２３７９）。Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のアッセイがウシ血清アルブミンを検出すべきではないため、この哺乳類タンパク質を陰性対照として使用した。結果を表３に示す。
表３．ＥＣＰアッセイ検出

【0311】

これらの結果は、ＥＣＰアッセイがＤｓｂＡまたはＤｓｂＣを適切に検出及び定量しないことを示す。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ内で調製された治療用タンパク質の放出アッセイの一部としてのＥ．ｃｏｌｉ残物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質及び核酸）を検出するための商業的アッセイは、これらのアッセイが、典型的には、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣ発現が最小限であるＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物に対するポリクローナル抗体を作製することによって生成されるため、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを特定しない。したがって、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣ検出アッセイを妨害し得る他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質及び／または核酸への反応性が最小限に抑えられたＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣに高度に特異的なポリクローナル抗体を生成するために超高純度ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを調製する必要がある。加えて、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣの超高純度調製物は、治療用ポリペプチド調製物中のＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣを正確に検出するためのＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣ標準の生成、ならびに研究及び商業的ポリペプチド産生のためのアッセイ品質を保証するためのＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣ陽性対照の生成に有用である。

【0312】

実施例２．超高純度ＤｓｂＡの精製
材料及び方法
抽出ステップ
ＤｓｂＡをＥ．ｃｏｌｉで発現させた（６２Ａ７ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＬ８、ｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ΔｄｅｇＰ ｉｌｖＧ修復型と名付けられたＷ３１１０誘導体）（Ｊｏｌｙ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ ＪＲ １９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：４２３１－４２３６、Ｊｏｌｙ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ ＪＲ １９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１００６７－１００７２、米国特許第５，７８９，１９９号）。細胞ペーストを１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．１）中に懸濁し（５０ｇ細胞ペースト／１Ｌ）、懸濁液が均質になるまで混合した。微小流動化剤１１０Ｆを７０００ｐｓｉで使用して細胞溶解を行った。均等物を（１０％ＰＥＩストック溶液を使用して）０．１％ＰＥＩになるように条件付け、周囲温度（約２１℃）で３０分間混合した。懸濁液を、８５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した遠心分離物を収集して、０．２２ｕｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルターを介して濾過した。

【0313】

精製方法
全てのカラムクロマトグラフィーステップをＧＥ製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒｓで行った。ＤｓｂＡを、均質化及び遠心分離を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから抽出した。遠心分離物を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^（登録商標）ＦＦ（ＱＳＦＦ）カラムを使用して結合及び溶出モードで陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。その後、ＱＳＦＦプールを、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳカラムを使用して結合及び溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。詳細な実行条件を表４及び５に記載する。

【0314】

Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ステップ
モード：結合及び溶出、樹脂：Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（ＧＥ）、カラム高さ：２０～３０ｃｍ、流量：１５０ｃｍ／時間、装填密度：６ｍｇ／ｍＬ以下）。
表４：ＱＳＦＦプロセス

【0315】

プール：プールをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってアッセイし、最大量のＤｓｂＡを含有する画分に基づいてプールした（データ示されず）。

【0316】

Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳステップ
モード：結合及び溶出、樹脂：Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カラム高さ：２０～３０ｃｍ、流量：１５０ｃｍ／時間、装填密度：６ｍｇ／ｍＬ以下）。
表５：Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳプロセス

【0317】

プール：画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びＳＥＣによって、純度に基づいて分析してプールした（図３及び４）。

【0318】

Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳプールの濃度
プールを、３０００ｒｐｍで約３０分間遠心分離した１０ｋＤのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約３．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0319】

分析方法
力価決定
ＤｓｂＡ遠心分離物の力価を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＳＥＣカラム（ＩＤ番号０６１９０８１）を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）アッセイで定量化した。カラムを周囲温度にて０．５ｍＬ／分で運転した。カラムを、０．２０Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム（ｐＨ６．２±０．１）を用いて０．５ｍＬ／分で６０分間平衡化した。吸光度を２８０ｎｍで監視し、溶出ピーク面積を定量化した。吸光度を、１．１５（ｍｇ／ｍＬ）－１^＊ｃｍ^－１の減衰係数を使用して３２０ｎｍのバックグラウンド吸光度を差し引いた２８０ｎｍで測定した。

【0320】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＤｓｂＡ異質性、高分子量パーセント、単量体、及び断片を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＳＥＣカラム（ＩＤ番号０６１９０８１）を使用して決定した。カラムを、０．２０Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム（ｐＨ６．２±０．１）中に、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）で周囲温度にて０．５ｍＬ／分で６０分間運転した。目標注入体積は５０μｇであり、吸光度を２８０ｎｍで監視した。ピーク面積を、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して計算した。

【0321】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２２）を用いて行った。ゲルを、Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ銀染色方法を使用して染色した。

【0322】

ウエスタンブロット
精製されたＤｓｂＡタンパク質を生成した。ウサギを免疫化し、最終採血をプールし、以下に記載されるように親和性精製した。

【0323】

免疫ブロット分析の場合、タンパク質を、半乾燥移行システム（ｉＢｌｏｔ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＳＤ１０００）を用いてＳＤＳゲルからニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロースを、１×ＮＥＴ（Ａ３０１７）、０．５％ゼラチン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７０－６５３９）溶液を使用して室温で３０分間遮断した。一次抗ＤｓｂＡ抗体を５０ｍＬの１×ＮＥＴ中に１：７００Ｋに希釈し、遮断されたニトロセルロースに添加し、一晩プローブした。抗ＤｓｂＡ抗体を、ウサギを精製されたＤｓｂＡで免疫化することによって産生した。ウサギ抗血清をプールし、親和性精製し、０．１％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．５のＰＢＳ中に保管した］。二次抗ウサギ－ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＮＡ９３４Ｖ）抗体を、１：１００Ｋに希釈し、洗浄されたニトロセルロースに２時間にわたって添加した。

【0324】

結果
ＤｓｂＡは、ｐＨ９．０の緩衝液を使用してカラムに結合し、装填することができた。ＱＳＦＦ溶出相は、３つの異なる溶出ピークを有した。溶出ピークにわたる選択されたＱＳＦＦプール画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＳＥＣカラムを使用して分析した（図１）。低分子量不純物は、第１のピークで溶出する（画分３）。第２のピークは、高分子量種から主に成り（画分７）、第３のピークは、標的ＤｓｂＡタンパク質を含有した（画分１０及び１１）。尾溶出ショルダーは、さらなる低分子量種及び微量のＤｓｂＡを含有した（画分１５）。ＤｓｂＡタンパク質を含有する画分をサイズ排除クロマトグラフィーデータに基づいてプールした。ＱＳＦＦステップが高分子量及び低分子量種の部分的還元をもたらしたが、さらなる下流精製ステップを実施してＤｓｂＡの純度をさらに改善した。

【0325】

Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ樹脂を実装してＱＳＦＦプールを精製した。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＳプール（画分４及び５）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、主ピークがＤｓｂＡタンパク質を含有することを示した（図２、レーン６及び７）。精製されたＤｓｂＡタンパク質を表す単一バンドは、先に精製されたＤｓｂＡプールと一致する分子量を有する（レーン２）。高分子量及び低分子量種は、勾配及び高塩洗浄で後に溶出した（レーン９及び１０）。代表的なＰｏｒｏｓ ５０ ＨＳ運転のＳＥＣデータを図３に示す。プールされたＰｏｒｏｓ ５０ ＨＳ画分（画分４及び５）は、高分子量及び低分子量が装填物から除去され、画分がＤｓｂＡタンパク質から主になったことを示した。凝集問題は精製されたＤｓｂＡ材料では観察されなかった。

【0326】

クロマトグラフィープロセスにより、超高純度ＤｓｂＡがもたらされた。ＤｓｂＡは、図４に示されるように９８％を超え、０．０％の高分子量種及び１．８％の低分子量種で９８．２％の主ピークがＳＥＣによって分析され、０．０％の高分子量種及び０．８％の低分子量で９９．２％の主ピークがＳＥＣによって分析された。不純物をＳＥＣにより定量し、図３にＰｏｒｏｓ装填物（Ｑプール）で示す。

【0327】

実施例３．超高純度ＤｓｂＣの精製
ＤｓｂＣを、二段階クロマトグラフィープロセスを使用して事前精製した（表６、プロセスＡ）。タンパク質は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）開発の参照標準を生成するために、かつ分子プローブとして使用するための（ウサギにおける）ＤｓｂＣに対する抗体を生成する免疫原として必要であった。

【0328】

二段階プロセスから精製されたＤｓｂＣバルクを、市販のウサギ抗ＤｓｂＣに対するウエスタンブロットにより分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＤｓｂＣがいくつかのより高い分子量（高分子量）宿主細胞関連タンパク質を含有したことを明らかにした（図５）。これらの不純物のために、ＥＬＩＳＡで測定される試料中のＤｓｂＣのレベルの過剰定量をもたらし得る宿主細胞タンパク質不純物に対するウサギ抗体の生成を最小限に抑えるために、新たなＤｓｂＣ材料が生成されて、より高いレベルのＤｓｂＣ純度を提供した。

【0329】

この所望のレベルの純度を達成するために、いくつかの異なるクロマトグラフィーステップ（ならびに精製プロセスにおけるそれらの相対位置付け）を評価した。異なるプロセスを、参照及び免疫原としての使用に好適な材料を生成する相対性能について評価した（表６）。
表６．ＤｓｂＣ精製プロセス

【0330】

細胞抽出
Ｅ．ｃｏｌｉ（６２Ａ７ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＬ８、ｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ΔｄｅｇＰ ｉｌｖＧ修復型と名付けられたＷ３１１０誘導体）（Ｊｏｌｙ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ ＪＲ １９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：４２３１－４２３６、Ｊｏｌｙ，ＪＣ ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ ＪＲ １９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１００６７－１００７２、米国特許第５，７８９，１９９号）細胞ペースト（ＤｓｂＣを含有するもの）を、溶解緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１０ｍＬの溶解緩衝液当たり１グラムの細胞ペースト）中に懸濁した。細胞溶解を、微小流動化剤（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して行った（７～８Ｋｐｓｉで４回通過）。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、綿状）を０．１％（ｍ／ｖ）の最終濃度になるまで溶解物に添加し、その後、室温で３０分間混合した。ＰＥＩ懸濁液を遠心分離し（１０Ｋｒｐｍ、４５分間、１８℃）、上清をクロマトグラフィー前に収集して、０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。

【0331】

精製：プロセスＡ
合計１．８Ｌの浄化された遠心分離物（１．５Ｍ Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ８．０に条件付けられたもの）を、表７に記載されるように、結合及び溶出モードでＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムに装填した。このステップの最後に、ＤｓｂＣを含有するタンパク質を６９４ｍｇ回収した。
表７．プロセスＡ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー

【0332】

ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（登録商標）の溶出プロファイルを図６に示す。１、２、及び３とラベル付けされたピークのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図７）は、ピーク１の画分がＤｓｂＣの予測モル質量（約２４ｋＤａ）に対応する顕著なバンドを含むことを示す。ピーク１の画分をプールし、その後、ウサギ抗ＤｓｂＣに対して免疫ブロットした。この免疫ブロットの結果（図８Ａ）は、ＤｓｂＣの存在を裏付けた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、いくつかのより高い分子量及びより低い分子量バンドが免疫ブロットで点灯しないことが明らかになり、それらがＤｓｂＣに関連せず、宿主細胞関連不純物であることを示す（図８Ｂ）。ＤｓｂＣのモル質量に近いモル質量を有するタンパク質が十分に分離されていないため、元のプロセス（プロセスＡ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、これらの不純物の全てではないがいくらかを除去することができるであろう。下流精製の代替手段を評価して、どの方法（複数可）及びステップ順序（複数可）が目標指示の要求される純度レベルまでのＤｓｂＣの精製に効果的であるかを調べた（試薬背景の項を参照して概説されている）。

【0333】

精製：プロセスＢ
強陽イオン交換クロマトグラフィー培地、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＳＰ－ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィープールからの宿主細胞タンパク質の除去について評価した。

【0334】

ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦのスクリーニングを５．０、５．５、及び６．０のｐＨ値で行った。装填密度は、５ｍｇ／ｍＬであった。緩衝液は、以下の通りであった：Ａ．平衡化／洗浄緩衝液：ｐＨ５が５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（３．１ｍＳ／ｃｍ）であり、ｐＨ５．５が５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（３．０５ｍＳ／ｃｍ）であり、ｐＨ６が２０ｍＭリン酸塩（３．１８ｍＳ／ｃｍ）であり、Ｂ．溶出緩衝液：ｐＨ５が平衡化Ａで１Ｍ ＮａＣｌ（９４ｍＳ／ｃｍ）であり、ｐＨ５．５が平衡化Ａで１Ｍ ＮａＣｌ（９２ｍＳ／ｃｍ）であり、ｐＨ６が平衡化Ａで１Ｍ ＮａＣｌ（８７ｍＳ／ｃｍ）であった。各々が１ｍＬのＳＰＦＦ樹脂を有する３つの滴下カラムを設定し、適切なｐＨ範囲で試験した。カラム（ＰＤ１０カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２５）を１０ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化した。装填物は、ｐＨ５、５．５、及び６の適切なＳＰ平衡化緩衝液で緩衝液交換されたＤＥＡＥプールであった。カラムを７ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。溶出は、５ＣＶであり、各々、１０％Ｂ、２０％Ｂ、４０％Ｂ、６０％Ｂ、８０％Ｂ、及び１００％Ｂであった。

【0335】

試験されたｐＨ値の各々のカラム画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価した。最良の結合状態がｐＨ５．０で観察された。ｐＨ値を増加させることにより、緩衝液交換したＤＥＡＥ－ＦＦプールのいくらか～全てのカラムへの貫流がもたらされた。宿主細胞不純物の全てではないがいくらかがｐＨ５．０で除去され、約２０ｋＤａの単一のより低い分子量バンドがカラム装填中に除去された。

【0336】

ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに増加させることにより、ＤｓｂＣの不完全溶出がもたらされたが、いくつかのより高い分子量バンドを除去した。ＮａＣｌの２００ｍＭへの増加により、残りのＤｓｂＣの大半が溶出したが、いくつかの他のタンパク質不純物も溶出した。

【0337】

ＳＰ－ＦＦの初期の結果により、ｐＨ５．０でのさらなる評価が必要とされた。残留宿主細胞タンパク質不純物を除去するＳＰ－ＦＦの潜在能力を評価するために、以下のパラメータを使用して小規模精製を行った：浄化された遠心分離物を、表８に記載されるように、結合及び溶出モードでＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを含有するカラムに装填した。ＳＰ－ＦＦカラム画分の分析は、初期評価で見られた除去と同じ２０ｋＤａの不純物の除去、及び勾配のより初期に溶出した３７ｋＤａでのバンドの除去を示した（図９）。ＤｓｂＣ画分は、このクロマトグラフィーステップからの増加した純度を示したが、残りのより高い分子量の不純物及び微量のより低い分子量の不純物を依然として含有した（図９）。ＨＰＬＣ－ＳＥＣによるプールされたＳＰ－ＦＦ画分の分析は、９５．２％の主ピーク、０．８％の高分子量種、及び４．０％の低分子量種を示した。ＳＰ－ＦＦゲルが残りの不純物を十分なレベルまで除去しなかったため、他の精製方法を評価した。
表８．ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー

【0338】

精製：プロセスＣ
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）をＳＰ－ＦＦプール中の残りの不純物の除去について評価した。プロセスＣの開発時、５つの潜在的なＨＩＣ培地（Ｈｉ Ｐｒｏｐｙｌ，Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（高置換）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、及びＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を、ＳＰ－ＦＦの初期評価について概説したもの（上述のプロセスＢ）と同じ１．０ｍＬカラムプロセスを使用して評価した。クロマトグラフィー条件を表９に詳述する。
表９．プロセスＣ：ＤＥＡＥ－ＳＰＦＦ－ＨＩＣ

【0339】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるカラム画分の分析は、評価したＨＩＣ培地の大部分について、宿主細胞不純物の大半がゲルに結合せず、装填及び洗浄ステップ中に除去されたことを示した。追加の不純物がこれらのＨＩＣ培地への結合の差異を示したが、減少塩勾配（５０ｍＭリン酸ナトリウム中０．５Ｍ硫酸ナトリウム～０．１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を使用した除去に成功した（図１０）。その後、ＤｓｂＣを精製水（ＰＷ）でＨＩＣ培地の各々から溶出させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、最大量の精製されたＤｓｂＣがＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（低置換）プール中に見られることを示す（図１０）。
精製：プロセスＤ

【0340】

プロセスＣのこれらの３つのクロマトグラフィーステップの順序は、初期ＤＥＡＥ－ＦＦステップで存在する残留宿主細胞不純物を除去して非常に超高純度のＤｓｂＣを産出する際に非常に効果的であった。さらなる評価を行って、ＨＩＣステップがＤＥＡＥ－ＦＦプールから宿主細胞不純物を除去するのに十分に頑強であるかを調べ、ＳＰ－ＦＦステップを排除し、ＤｓｂＣの精製プロセスを効果的に能率化した。

【0341】

第２の位置でのＨＩＣステップを評価するために、一定分量のＤＥＡＥ－ＦＦプールを、開発されたＨＩＣ条件（表６、プロセスＣ）を使用して条件付けして処理した。ＨＩＣプロセスのさらなる洗練は、中間洗浄ステップをより長い０．１Ｍ硫酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム洗浄ステップで置き換えることを含んだ。さらなる洗浄体積を実装してカラムから不純物を除去した後、ＤｓｂＣを精製水で溶出させた。

【0342】

第３の位置でのＨＩＣステップを評価するために、ＤＥＡＥ－ＦＦプールの代わりに強ＳＰ－ＦＦプールを使用して上述と同じ実験戦略を行った。これらの実験を以下のように行った：
実験スキーム：位置２でのＨＩＣ、ＤＥＡＥプール＞ＨＩＣ
位置３でのＨＩＣ、ＤＥＡＥプール＞ＳＰＦＦプール＞ＨＩＣ
形式：重力（滴下方法）
ＨＩＣ樹脂：Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）
装填密度：５ｍｇ／ｍＬ
緩衝液：
平衡化／洗浄１：０．６Ｍ硫酸ナトリウム＋５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）
洗浄２：０．１Ｍ硫酸ナトリウム＋５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）
溶出：ＰＷ（精製水）

【0343】

各々１ｍＬのＨＩＣ樹脂を含有する２つの滴下カラムを設定した。
平衡化（カラム）：１０カラム体積（ＣＶ）
装填：位置２でのＨＩＣ：５ｍｇのＤＥＡＥプールを取り込み、それを希釈して、０．６Ｍ硫酸ナトリウム／５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）の最終濃度を含有させた。最終ｐＨ７、約６８ｍＳ／ｃｍに調整した。
位置３でのＨＩＣ：５ｍｇのＳＰＦＦプールを取り込み、それを希釈して、０．６Ｍ硫酸ナトリウム／５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）の最終濃度を含有させた。最終ｐＨ７、約６８ｍＳ／ｃｍに調整した。
洗浄１：５ＣＶ
洗浄２：５ＣＶ
溶出：３ＣＶ
追加の３ＣＶ
塩基再生：０．１Ｎ ＮａＯＨ（２ＣＶ）

【0344】

画分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って、不純物除去を評価した。

【0345】

この二段階プロセスは、三段階プロセスと同様にＤｓｂＣからの望ましくない不純物の除去に効果的であった（図１１）。

【0346】

精製：プロセスＥ（最終プロセス）
ＤＥＡＥ－ＦＦプールの精製を、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（低置換）を使用して拡大した。表１０は、動作パラメータを列記する。主ピーク画分は、ＨＩＣステップの７、８、９、１０、及び１１であった。

【0347】

カラムは、結合及び溶出モードでのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＬＳ）であった。カラムに装填した質量は、５３６ｍｇであった。
表１０．Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー（低置換）

【0348】

カラム画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＨＩＣステップによる非常に良好な不純物除去を示した。２つの薄いバンド（１５ｋＤａ及び５０ｋＤａ）が個々のＨＩＣ画分のうちのいくつかで観察された。しかしながら、主画分のうちのいくつかまたは全てが組み合わせられると、ＤｓｂＣに対応するバンド主バンドが１つのみ観察された（図１２）。ＨＰＬＣ－ＳＥＣを使用した主ＤｓｂＣ画分（７～１１）の分析は、９７．０％の主ピーク、１．０％の低分子量、及び２．０％の高分子量の分布を示した。より狭い切片（画分８～１０）をとることにより、９８．２％の主ピーク、１．７％の低分子量、及び０．１％のより高い分子量種の分布がもたらされた。

【0349】

Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、任意の残留高分子量及び低分子量種を除去し、ＤｓｂＣを製剤化した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５の分画範囲（５ｋＤａ～７０ｋＤａ）がＤｓｂＣ等のより小さいタンパク質（約２４ｋＤａ）により適しているため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５を選択した。ＳＥＣカラムの動作パラメータを表１１に示す。

【0350】

サイズ排除クロマトグラフィーに備えて、ＨＩＣプール（画分７～１１）を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１６ｍＬ以下（ＳＥＣ ＣＶの５％以下）の体積に濃縮した。これらの装置を、２０分間隔で臨床遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して目標体積に達するまで４０００ｒｐｍで遠心分離した。
表１１．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除クロマトグラフィー

【0351】

濃縮ＨＩＣプールをＳＥＣカラムに装填し、装填を平衡化緩衝液で追跡した。カラムを平衡化緩衝液で展開し、ＳＥＣ ＣＶの２％（６．４ｍＬ）に相当する画分を収集した。合計２回のサイズ排除運転を行った。主画分（４７～５６）をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し（図１３）、ＤｓｂＣに対応する１つの主バンド（約２４ｋＤａ）を示した。同じ画分もＨＰＬＣ－ＳＥＣアッセイで試験した。最終製剤化ＤｓｂＣバルクは、後部にわずかなテーリングを有する単一の高度に対称性のピークを示す（図１４）。分取ＳＥＣステップは、不純物のさらなる除去及びＤｓｂＣバルクの最終製剤緩衝液への緩衝液交換に成功し、ＨＰＬＣ－ＳＥＣの使用は、９９．８５％の主ピーク、０．１０％の低分子量、及び０．０５％の高分子量の分布を示した。

【0352】

凍結融解安定性及び分析
製剤化バルクの安定性を、それを３回の凍結融解サイクルに－８０℃以下の温度で供することによって評価した。凍結融解試料の分析を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣを使用して行った。

【0353】

合計６００μＬの製剤化バルクをこの試験に使用し、各時点の４×１５０μＬの一定分量に分けた。１つの一定分量を冷室（２～８℃）（「０」凍結融解）に置いた。残りの３つの一定分量を－８０℃以下の冷凍室に置いた。４時間後、試料を室温で約１時間融解し、緩徐に混合した。試料のうちの１つを冷室に移し（「１回」凍結融解）、残りの試料を－８０℃以下の冷凍室内に再設置した。このプロセスを繰り返して、「２回」凍結融解試料を生成した。残りの試料（「３回」凍結融解）を－８０℃以下の冷凍室に一晩保管した。「３回」凍結融解試料を翌日融解した。非還元下及び還元下で実行したＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は、精製されたバルク及び全ての凍結融解試料においてＤｓｂＣに対応する１つのバンド（約２４ｋＤａ）を示す（データ示さず）。ＨＰＬＣ－ＳＥＣアッセイは、全ての試料が同等であり、０．１％の高分子量種及び９９．９％の主ピークとのプロファイルが重複しており、低分子量種は検出されないことを示す。分子は、３回の凍結／融解サイクル後にその物理的及び機能的特性を保持する。

【0354】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色
他の非ＤｓｂＣ不純物が最終製剤化バルク中に確実に存在しないようにするために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色を使用して画像化した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、図１５）。

【0355】

機能試験
ＤｓｂＣ分子の同一性を、一組の特徴付けアッセイ（Ｎ末端配列分析、ペプチド質量フィンガープリント法（ＰＭＦ）、ＣＨＩＰ ＴＯＦによるインタクト／還元質量）によって確認した。これらのアッセイにより、分子の正しい同一性が確認された。

【0356】

一定分量の精製されたＤｓｂＣバルク及び生成された凍結融解試料の機能試験を行い、４つの試料間の同等性を実証し、タンパク質が３回の凍結融解にわたって安定かつ機能的であることを示した（データ示さず）。精製されたＤｓｂＣを、抗ＤｓｂＣ抗体を生成するためのウサギ免疫化に許容可能なものと見なし、親和性クロマトグラフィーのリガンドとして後に使用してウサギ抗血清から抗ＤｓｂＣを精製した。

【0357】

実施例４．抗ＤｓｂＡ及び抗ＤｓｂＣ抗体の生成及び精製
超高純度ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣに対して生成されたポリクローナル抗体を、治療用ポリペプチドの調製においてＤｓｂＡ及びＤｓｂＣからの除去を測定するためのアッセイで使用するために生成した。以下の実施例は、ポリクローナルＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体を生成するために使用される精製方法を説明する。これらの重要な試薬は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ免疫原とともに、特異的ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ ＥＬＩＳＡの開発に必要であった。

【0358】

３匹のウサギ（１免疫原当たり）をＤｓｂＡまたはＤｓｂＣのいずれかで免疫化した。４２日目に、個々のウサギから採血し、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗血清を抗ＤｓｂＡ及び抗ＤｓｂＣ抗体の精製に使用した。

【0359】

分析方法
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を使用してＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体の相対純度を決定し、タンパク質のモル質量を確認した。電気泳動をジスルフィド結合還元を用いて、また用いずに行い、抗体の共有結合凝集について評価した。

【0360】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）４～２０％ ＴＧＸ（Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ｅＸｔｅｎｄｅｄ）Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ゲルを使用して行い、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅ（商標）画像化装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で画像化した。

【0361】

高速液体クロマトグラフィー－サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）を使用して、ＴＳＫ Ｇｅｌ ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した天然条件下でのＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体のサイズ不均一性を監視し、高分子量（高分子量）種、主ピーク（単量体）、及び低分子量（低分子量）種を分離した。

【0362】

ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体の精製
ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体の精製を、同じ抽出及びクロマトグラフィーステップを使用して並行して行った。このプロセスは、以下のものからなる。

【0363】

塩沈殿：６０％硫酸アンモニウム（ＡＳ）分画ステップを抗血清で行った。６０％硫酸アンモニウムペレットを親和性クロマトグラフィー前にリン酸緩衝液中に溶解する。

【0364】

固定化（免疫原）親和性クロマトグラフィー：６０％硫酸アンモニウムペレット中の残りの不純物から標的抗体を分離するように親和性クロマトグラフィーステップを設計した。精製されたＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ（ウサギを免疫化するために使用した試薬と同じロット）をリガンドとして使用して、別個の親和性支持体を構築した。各親和性支持体を、還元的アミノ化化学反応により特異的免疫原を活性化グリセリル－ＣＰＧ（制御孔ガラス、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に固定化することによって作製した。この種類の親和性クロマトグラフィーにより、標的抗体の高度の選択性がもたらされた。

【0365】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：分取ＳＥＣを使用して、標的抗体からより高い分子量（ＭＷ）種及びより低い分子量（ＭＷ）種を分離し、それらを好適な保管緩衝液に製剤化した。その後、抗体プールの機能性をそれらのそれぞれのＥＬＩＳＡによって決定して、目標アッセイ性能を確認した。

【0366】

特異的ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ ＥＬＩＳＡの開発での使用に好適な材料を生成するためのクロマトグラフィーステップを行い、評価した。

【0367】

抗血清の沈殿及び標的抗体の確認
ウサギ抗血清Ａ、Ｂ、Ｃをプールした（体積＝７２ｍＬ（抗ＤｓｂＡ）、７６ｍＬ（抗ＤｓｂＣ）。５２ｍＬの硫酸アンモニウム条件付け溶液（上記）を抗ＤｓｂＡ溶液に緩徐に添加し、５５ｍＬを添加中で緩徐に撹拌しながら抗ＤｓｂＣに添加した。溶液を１８℃の温度で４５分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。硫酸アンモニウムペレット（ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体を含有するもの）を、親和性クロマトグラフィーの準備が整うまで－６０℃以下で凍結させた。

【0368】

硫酸アンモニウム懸濁液、上清、及びペレットのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析では、上清は抗体が枯渇しており、ペレットはウサギ抗体の全てを含有することが確認された。ウサギ抗ＤｓｂＡ及び抗ＤｓｂＣ抗体は、約１３０ｋＤａのモル質量を示す。還元時、約１３０ｋＤａの主バンドが重鎖（約５０ｋＤａ）及び軽鎖（約２５ｋＤａ）に還元した。

【0369】

親和性クロマトグラフィー
抗ＤｓｂＡ及び抗ＤｓｂＣ ６０％硫酸アンモニウムペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）中で再構成した後に、それらのそれぞれのＤｓｂＡ－ＣＰＧまたはＤｓｂＣ－ＣＰＧ親和性カラムに装填した。

【0370】

親和性クロマトグラフィーステップを表１２に記載されるように行った。
樹脂は、ＤｓｂＡ－ＣＰＧまたはＤｓｂＣ－ＣＰＧであった。クロマトグラフィーは、結合及び溶出モードであった。床高さは、６．０ｃｍ（ＤｓｂＡ－ＣＰＧ）または５．０ｃｍ（ＤｓｂＣ－ＣＰＧ）であった。直径は、１．６ｃｍであり、体積は、１２．０ｍＬまたは１０．０ｍＬであった。
表１２．親和性クロマトグラフィー動作条件

【0371】

各カラム由来の結合したＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ抗体を５ＣＶの溶出緩衝液で溶出させ、抗体を濃縮Ｔｒｉｓ緩衝液中に収集した（７．０～７．５のｐＨを維持し、これにより、非常に低い溶出ｐＨに起因して抗体の凝集が最小限に抑えられるため）。溶出プールを、１７ｍＬの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を収容するビーカー中に収集した。

【0372】

抗ＤｓｂＣ親和性プールのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、標的ウサギ抗ＤｓｂＣ抗体ならびに他の産物に関連する可能性のあるより高い分子量種及びより低い分子量（７５ｋＤａ未満）種に対応する、約１３０ｋＤａで顕著なバンドを示した。還元条件下で、約１３０ｋＤａの主バンドは、２つのバンド、それぞれ、重鎖及び軽鎖に対応する約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａに還元される。同様のＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドパターンも抗ＤｓｂＡ親和性プールで観察された（データ示さず）。

【0373】

抗ＤｓｂＡプールのＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析は、７９％の主ピーク、１９％のより高い分子量種、及び２％のより低い分子量種の分布を示した。抗ＤｓｂＣプールの場合、７８％の主ピーク、１６％のより高い分子量種及び６％のより低い分子量種が観察された。７９％（主ピーク）の全体純度がこのステップで達成された。これらのプールの機能試験前に、一定分量のプールをさらに分画して、主ピークの量を濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィー前後のプールのアッセイ性能をＥＬＩＳＡで評価した。

【0374】

サイズ排除クロマトグラフィー：ＳＥＣ
より高いレベルの純度を得るために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。抗ＤｓｂＡ親和性プールの量が限られているため、一定分量の抗ＤｓｂＣ親和性プールを最初に分画した。ＳＥＣカラムの動作パラメータは、以下の通りであった。カラム体積は、１１２０ｍＬであり、装填体積は、６ｍＬ以下（１ＣＶの５％以下）であった。カラムを０．５ｍＬ／分の流量で３ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化した。装填は、１サイクル当たり６．０ｍＬ以下であった。１サイクルを抗ＤｓｂＡに実行し、２サイクルを抗ＤｓｂＣに実行した。カラムを０．５ｍＬ／分で１ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で展開した。各サイクルについて、ウサギ血清由来のｐＨ調整親和性プールを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０ｋＤａフィルターを使用して６．０ｍＬの最終体積に濃縮した。

【0375】

１０ｍｇの一定分量の抗ＤｓｂＣ親和性プールを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して６．０ｍＬ以下（１ＣＶの５％以下）の体積に濃縮した。

【0376】

濃縮抗ＤｓｂＣ親和性プールをＳＥＣカラムに装填し、装填を平衡化緩衝液で追跡した。カラムを平衡化緩衝液で展開し、２．４ｍＬの画分（ＳＥＣ ＣＶの２％）を収集した。主ピークプール画分は、３４～３７であった。

【0377】

いくつかの模擬プールをＨＰＬＣ－ＳＥＣアッセイで評価して、どの一連の画分が最も高度の純度をもたらしたかを決定した（表１３）。より狭い切片（画分３５～３６）が９５．１％の主ピーク、１．０％の高分子量、及び３．９％の低分子量種の分布を示した一方で、より広い切片（画分３４～３７）は、９３．９％の主ピーク、１．４％の高分子量、及び４．７％の低分子量種を示した。より狭いプールが純度を著しく改善せず、より低いタンパク質質量しか回収しなかったため、より広いプールスキームを選択した（表１３）。
表１３．抗ＤｓｂＣ模擬プールのＨＰＬＣ－ＳＥＣ

【0378】

濃度を模擬プールに基づいて予測する。

【0379】

ＴＳＫカラム：ＱＣ Ｐａｋ ＧＦＣ ３００、流量＝０．５ｍＬ／分、運転時間＝１５分間。

【0380】

ＳＥＣステップにより、単量体の量が７９％（親和性ステップで）から９４％に増加した。

【0381】

機能試験結果
抗ＤｓｂＣ親和性プール（非分画及び分画）を直接結合ＥＬＩＳＡ形式で評価して、より高い純度がより良好なアッセイ性能をもたらすのに必要であるかを判定した。２つのプール間で同等の用量応答曲線を達成し、高分子量種の除去が必要ではなかったことを示した（図１６）。

【0382】

上述の結果は、ＤｓｂＣ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）へのコンジュゲーションを必要とするより感度の高いＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイの追求を促した。この種類のコンジュゲーション（ビオチン化）の成功は、典型的には、抗体プールに高分子量種（凝集体）が少ないことを必要とする。

【0383】

このステップを評価するために、低凝集体親和性プールをＨＲＰにコンジュゲートした。低凝集体親和性プールをコートとして使用し、かつ検出のためにＨＲＰにコンジュゲートされた低凝集体親和性プールである低凝集体抗ＤｓｂＣプールを、ＤｓｂＣを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡでの使用に好適であると見なした（図１７）。

【0384】

最終決定は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ 抗ＤｓｂＣプール（凝集体がより少なく、主ピークでの濃縮がより高い）を使用することであった。この決定により、抗ＤｓｂＣプールの残りの半分及び全抗ＤｓｂＡプールを、ＳＥＣを使用してさらに分画した。

【0385】

プロセスＢ
ＳＥＣステップを最終クロマトグラフィーステップとして最終精製プロセス（Ｂ）に追加して、低レベルの凝集体でのより高度の純度を確実にした。

【0386】

抗ＤｓｂＡ親和性プール及び残りの抗ＤｓｂＣ親和性プールの分画を、上述のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを使用し、かつ上述と同じ動作パラメータを使用してＳＥＣによって行った。

【0387】

抗ＤｓｂＡの最終プール切片は、画分３５～３８であり、抗ＤｓｂＣの場合はファクション（ｆａｃｔｉｏｎ）３４～３７であった。これらのプール切片が高レベルの純度（主ピーク）及び最大産物収率を得るようにした。ＨＰＬＣ－ＳＥＣによってアッセイされた最終分画プールは、８７．３％の主ピーク（抗ＤｓｂＡ）及び９２．５％の主ピーク（抗ＤｓｂＣ）を含有した。ＳＥＣステップは、高分子量種及び低分子量種の除去による主ピークの濃縮、ならびにプールの最終製剤緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０±０．２）への緩衝液交換に成功した。

【0388】

ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの精製により、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ ＥＬＩＳＡ開発に成功した。

【0389】

実施例５．ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣのＥＬＩＳＡ検出
試薬
コート抗体（ポリクローナル抗ＤｓｂＡまたはポリクローナル抗ＤｓｂＣ）をＰＢＳで約１．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、－６０℃以下で保管した。融解後、コート抗体を、融解日から最大１週間、２～８℃で保管した。標準材料（ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣ）を１００μｇ／ｍＬに希釈し、－６０℃以下で保管した。アッセイ対照源を標準曲線の低面積及び高面積内に入るようにアッセイ希釈剤で希釈し、－６０℃以下で保管した。ＨＲＰ－コンジュゲート（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされるＤｓｂＡまたはＤｓｂＣに対する抗体）。融解後、ＨＲＰ－コンジュゲート抗体を、融解日から最大１週間、２～８℃で保管した。ＨＲＰ－コンジュゲート抗ＤｓｂＡストックＩを、－１０℃～－３０℃での保管のためにグリセロールでおよそ１：１に希釈した。ＨＲＰ－コンジュゲート抗ＤｓｂＣストックＩを、－６０℃での保管のためにアッセイ希釈剤でおよそ１：２０に希釈した。
アッセイ希釈剤：０．１５Ｍ塩化ナトリウム［ＮａＣｌ］／０．１Ｍリン酸ナトリウム［ＮａＰＯ４］／０．１％魚ゼラチン／０．０５％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０／０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００
洗浄緩衝液：ＰＢＳ／０．０５％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０
コーティング緩衝液：０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
基質溶液：ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ（商標）ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ［ＫＰＬ］、カタログ番号５３－００－００または等価物）
停止溶液：０．６Ｎ硫酸
標準、対照、及び試料調製

【0390】

標準曲線を調製した（１０００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８１、０ｎｇ／ｍＬ）。各対照の一定分量の対照調製物を使用日に融解した。未使用の融解された対照を処分した。試験試料を標準曲線の範囲内に入るようにアッセイ希釈剤で希釈した。

【0391】

手順
コート抗体ストックＩをコーティング緩衝液で希釈して、標準曲線濃度及び所望の応答範囲を得た。１００μＬの希釈コート抗体ストックＩをマイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで移し、２～８℃で１２～７２時間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、プレート洗浄機を使用しておよそ４００μＬの洗浄緩衝液で３回吸引し、完全にブロットした。プレートを廃棄物リザーバー上で反転させても溶液がウェルから除去されなかった。およそ２００μＬのアッセイ希釈剤を各ウェルに添加し、撹拌しながら周囲温度で１～２時間インキュベートした。洗浄ステップを繰り返した。

【0392】

１ウェル当たり１００μＬの希釈標準（二通り）、対照（二通り）、及び試料を適切なウェルにピペットで移した。撹拌しながら周囲温度で２時間±１０分間インキュベートした。ウェルを上述のように洗浄し、プレートを回転させ、洗浄ステップを繰り返した。

【0393】

ＨＲＰ－コンジュゲートストックＩをアッセイ希釈剤で希釈して、１．５～２．０ＯＤの最大ＯＤ値を目標とした最も高い標準と最も低い標準との間に有意なＯＤ範囲を得た。１００μＬの希釈ＨＲＰ－コンジュゲートストックＩを各ウェルにピペットで移し、撹拌しながら周囲温度で２時間±１０分間インキュベートした。ウェルを上述のように洗浄し、プレートを回転させ、洗浄ステップを繰り返した。

【0394】

１ウェル当たり１００μＬの基質溶液をウェルにピペットで移し、暗所にて周囲温度で十分な時間インキュベートして、最適標準曲線色発現を可能にした。１ウェル当たり１００μＬの０．６Ｎ硫酸をピペットで移した。

【0395】

ＯＤを、２つのフィルター（検出吸光度の場合４５０ｎｍ及び参照吸光度の場合６２０～６３０ｎｍ（参照波長は任意であった））を使用したプレートリーダーを使用して読み取った。

【0396】

計算及びデータ分析
試料濃度を、最低５パラメータのロジスティック曲線当てはめプログラムを有するデータ処理ソフトウェアを使用して決定した。

【0397】

ＥＬＩＳＡを使用して、実施例４に記載の抗体の精製中のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ除去を評価した。

【0398】

実施例５．モノクローナル抗体の精製中のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ除去の評価
ＭＡｂ１を、適切な折り畳み及びジスルフィド結合の生成を支援するＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを過剰発現したＥ．ｃｏｌｉ細胞で産生した。簡潔には、ＭＡｂ１、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を溶解して遠心分離し、溶解物を浄化した。その後、遠心分離物をＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅタンパク質Ａカラム（ＭＳＳ）に適用した。その後、ＭＡｂ１を含有する溶出したＭＳＳ画分をＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ（Ｃａｐｔｏ）混合モードクロマトグラフィー、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ陽イオン交換クロマトグラフィー、及びＱＳＦＦ陰イオン交換クロマトグラフィーに全て結合及び溶出モードで適用した。その後、ＭＡｂ１を含有するプールされたＱＳＦＦ画分を、限外濾過及び透析濾過を使用して濃縮して製剤化した。

【0399】

各精製ステップ由来の画分（遠心分離物、ＭＳＳタンパク質Ａ、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ、ＱＳＦＦ、ＵＦＤＦ）を、タンパク質濃度、以下に記載のＥ．ｃｏｌｉタンパク質の除去、ならびに実施例３に記載のＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの存在についてアッセイした。適格性確認を６回実行して結果を得た。

【0400】

宿主細胞タンパク質（ＥＣＰ）の除去
抗体の精製に使用した回収プロセスを、宿主細胞タンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質またはＥＣＰ）のレベルを低減するその能力について評価した。ＥＣＰの定量を、以下に記載のＥＬＩＳＡアッセイを使用してインプロセス試料及び濾過されたバルク試料で行った。これらのデータは、臨床抗体材料中のＥＣＰが回収プロセスによって５０ｎｇ／ｍｇ未満の抗体レベルまで著しく低減されたことを実証する。

【0401】

Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の多産物サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、プール試料中のＥＣＰのレベルを定量した。親和性精製されたヤギ抗全ＥＣＰ抗体をマイクロタイタープレートウェル上に固定化した。プール試料の希釈物をウェル中でインキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた親和性精製されたヤギ全ＥＣＰとインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素活性をｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩で検出した。ＥＣＰを、マイクロタイタープレートリーダーの吸光度を４９０ｎｍで読み取ることによって定量した。４パラメータコンピュータ曲線当てはめプログラムを使用して標準曲線を生成し、試料濃度を自動計算した。ＥＬＩＳＡのアッセイ範囲は、典型的には、ＤｓｂＡの場合は１．５６ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬであり、ＤｓｂＣの場合は１．０９ｎｇ／ｍＬ～３５ｎｇ／ｍＬであった。

【0402】

結果
各画分中に見られたタンパク質の総量を表１４に提示する。
表１４．精製画分の総タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）

【0403】

Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の除去を表１５に示す。
表１５．精製画分の総Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質（ｎｇのＥＣＰ／ｍｇの総タンパク質）

【0404】

各画分中で検出されたＤｓｂＡの総量を表１６に提示する。
表１６．精製画分の総ＤｓｂＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）

【0405】

各画分中のＤｓｂＡの相対量を、各画分中の総ＤｓｂＡ（表１６）を各画分中の総タンパク質（表１４）に正規化することによって決定した。正規化されたＤｓｂＡ含有量の結果を表１７に示す。結果を、ｎｇ／ｍＬのＤｓｂＡ／タンパク質濃度として提示する。
表１７．精製画分の総相対ＤｓｂＡ含有量（ｎｇのＤｓｂＡ／ｍｇの総タンパク質）

【0406】

各画分中で検出されたＤｓｂＣの総量を表１８に提示する。
表１８．精製画分の総ＤｓｂＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）

【0407】

各画分中のＤｓｂＣの相対量を、各画分中の総ＤｓｂＣ（表１８）を各画分中の総タンパク質（表１４）に正規化することによって決定した。正規化されたＤｓｂＣ含有量の結果を表１９に示す。結果を、ｎｇ／ｍＬのＤｓｂＡ／タンパク質濃度として提示する。
表１９．精製画分の総相対ＤｓｂＣ含有量（ｎｇのＤｓｂＣ／ｍｇの総タンパク質）

【0408】

ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣアッセイの結果は、ＤｓｂＡもＤｓｂＣもいずれも限外濾過／透析濾過ステップ前に取り除かれることを示す。ＤｓｂＡは、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅステップ後に取り除かれ、ＤｓｂＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅステップ後に取り除かれる。
配列
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡ
アミノ酸配列－リーダー配列なし

アミノ酸配列－リーダー配列あり（太字）

核酸配列

Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＣ
アミノ酸配列－リーダー配列なし

アミノ酸配列－リーダー配列あり（太字）

核酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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