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特許7191361産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助するための方法、産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法、及び産婦人科疾患の診断用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-09
(45)【発行日】2022-12-19
(54)【発明の名称】産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助するための方法、産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法、及び産婦人科疾患の診断用キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20221212BHJP
G01N 33/573 20060101ALI20221212BHJP
C12Q 1/00 20060101ALI20221212BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20221212BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/573 A
C12Q1/00
C12N9/00
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2018152478
(22)【出願日】2018-08-13
(65)【公開番号】P2020027052
(43)【公開日】2020-02-20
【審査請求日】2021-06-16
(73)【特許権者】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】水野 由美
(72)【発明者】
【氏名】梶原 健
(72)【発明者】
【氏名】田丸 俊輔
(72)【発明者】
【氏名】三井 智美
(72)【発明者】
【氏名】栗▲崎▼ 智美
【審査官】小澤 理
(56)【参考文献】
【文献】特表２００３－５３１５８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２９５８０３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２５１７１８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】RUAN, H.-Y. et al.，Downregulation of ACSM3 promotes metastasis and predicts poor prognosis in hepatocellular carcinoma，Am J Cancer Res，2017年，Vol.7, No.3，p.543-553
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ｇ０１Ｎ ３３／５７３
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｃ１２Ｎ ９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体由来の試料における中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素３（ＡＣＳＭ３）及び中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素５（ＡＣＳＭ５）の少なくともいずれかの量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性に関する医師による判定を補助するための指標として提供する提供工程とを含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助するための方法。
【請求項2】
前記提供工程が参照量と比較する処理を含み、前記参照量が、脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量以上の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記提供工程が参照量と比較する処理を含み、前記参照量が、産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が多い場合及びＡＣＳＭ５の量が少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記提供工程が参照量と比較する処理を含み、前記参照量が、産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記被験体由来の試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記産婦人科疾患が、不妊症及び習慣性流産のいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
更に、前記被験体由来の脱落膜化した試料におけるＩＧＦＢＰ１の量を、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性に関する医師による判定を補助するための指標として提供する工程を含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
被験体由来の試料における中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素３（ＡＣＳＭ３）及び中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素５（ＡＣＳＭ５）の少なくともいずれかの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法。
【請求項9】
更に、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を参照量と比較する比較工程を含む請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記比較工程における参照量が、脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量以上の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記比較工程における参照量が、産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が多い場合及びＡＣＳＭ５の量が少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記比較工程における参照量が、産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記被験体由来の試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種である請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記産婦人科疾患が、不妊症及び習慣性流産のいずれかである請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
更に、前記被験体由来の脱落膜化した試料におけるＩＧＦＢＰ１の量を測定する工程を含む請求項８から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素３（ＡＣＳＭ３）遺伝子検出用プライマーセット、中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素５（ＡＣＳＭ５）遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする産婦人科疾患の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法、産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法、及び産婦人科疾患の診断用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、生殖補助医療の発達により、良好胚の選択が可能になり、多くの不妊症カップルの妊娠・出産が可能となった。しかし、良好胚を移植しても着床・妊娠に至らない着床不全と考えられる症例や、うまく着床しても流産を繰り返す習慣性流産とみられる症例が多く存在している。これらのような症例を明確に診断できる診断マーカーや直接的に治療する方法は確立されていないのが現状である。
【0003】
脱落膜は妊娠の成立に伴い変化し、妊娠の終結に伴い胎盤とともに剥脱する子宮内膜組織の一部と定義される。子宮内膜間質細胞が妊卵の着床に伴い形態学的及び機能的に分化する過程を脱落膜化といい、この分化過程は絨毛細胞の浸潤の制御、さらには胎盤形成に重要な役割を果たしている。着床不全や習慣性流産等の産婦人科疾患には、この脱落膜化過程での異常が関わっていると考えられるが、その詳細な発症メカニズムに関してはまだ解明されていない。
【0004】
これまでに、着床前期胚の正常な発育には、中鎖脂肪酸であるオクタン酸が必要であることが報告されている（非特許文献１参照）。この報告では、胚培養に使う培地中の中鎖脂肪酸の有無が胚発生の進行・停止に関わることが示されている。
しかしながら、生体内において胚への中鎖脂肪酸の供給が、どこからどのように行われているのかは不明である。
しかしながら、生体内において胚への中鎖脂肪酸の供給が、どこからどのように行われているのかは不明である。
【0005】
以上のように、着床不全や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の発症メカニズムは未だ解明されておらず、また、それらの疾患の診断に有用な方法も未だ提供されていないのが現状であり、産婦人科疾患の診断に有用な方法の速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ２， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ９３０ （２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、産婦人科疾患の罹患可能性を判定することができる産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法、産婦人科疾患の罹患可能性の診断に有用なデータを収集することができる産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法、及び産婦人科疾患の診断に用いることができる産婦人科疾患の診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、複数存在する中鎖脂肪酸合成酵素のうち、中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素３（ａｃｙｌ－ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ３：ＡＣＳＭ３）及び中鎖アシル補酵素Ａ合成酵素５（ａｃｙｌ－ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ５：ＡＣＳＭ５）が子宮内膜間質細胞において発現していること、並びにこれらの発現量が、脱落膜化していない子宮内膜間質細胞と、脱落膜化した子宮内膜間質細胞とで有意に異なることを知見した。
【0009】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標として、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性の判定を補助する判定補助工程とを含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法である。
＜２＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法である。
＜３＞ ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする産婦人科疾患の診断用キットである。
＜１＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標として、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性の判定を補助する判定補助工程とを含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法である。
＜２＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法である。
＜３＞ ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする産婦人科疾患の診断用キットである。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、産婦人科疾患の罹患可能性を判定することができる産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法、産婦人科疾患の罹患可能性の診断に有用なデータを収集することができる産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法、及び産婦人科疾患の診断に用いることができる産婦人科疾患の診断用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
（産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法）
本発明の産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法（以下、「判定補助方法」と称することがある。）は、測定工程と、判定補助工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法（以下、「判定補助方法」と称することがある。）は、測定工程と、判定補助工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0013】
＜測定工程＞
前記判定補助方法における測定工程は、被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する工程である。
前記判定補助方法における測定工程は、被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する工程である。
【0014】
－被験体由来の試料－
前記被験体としては、産婦人科疾患に罹患しているか否か不明な被験体が挙げられる。
前記被験体の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
前記被験体としては、産婦人科疾患に罹患しているか否か不明な被験体が挙げられる。
前記被験体の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
【0015】
前記被験体由来の試料としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記試料は、脱落膜化した状態の被験体由来のものが好ましい。
前記被験体由来の試料の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記試料は、更にＲＮＡ調製処理、ｃＤＮＡ調製処理、タンパク質調製処理などが施されてもよい。
前記被験体由来の試料の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記試料は、更にＲＮＡ調製処理、ｃＤＮＡ調製処理、タンパク質調製処理などが施されてもよい。
【0016】
－ＡＣＳＭ３－
前記ＡＣＳＭ３は、中鎖脂肪酸合成酵素の１つである。前記ＡＣＳＭ３遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＣＳＭ３遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＮＣＢＩにおいて、ＮＭ＿００５６２２、ＮＭ＿２０２０００で登録されている。前記ＡＣＳＭ３にはアイソフォームが存在するが、前記測定工程ではいずれのアイソフォームを測定してもよい。
前記ＡＣＳＭ３は、中鎖脂肪酸合成酵素の１つである。前記ＡＣＳＭ３遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＣＳＭ３遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＮＣＢＩにおいて、ＮＭ＿００５６２２、ＮＭ＿２０２０００で登録されている。前記ＡＣＳＭ３にはアイソフォームが存在するが、前記測定工程ではいずれのアイソフォームを測定してもよい。
【0017】
－ＡＣＳＭ５－
前記ＡＣＳＭ３は、中鎖脂肪酸合成酵素の１つである。前記ＡＣＳＭ５遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＣＳＭ５遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＮＣＢＩにおいて、ＮＭ＿００１３２４３７１、ＮＭ＿００１３２４３７２、ＮＭ＿００１３２４３７３、ＮＭ＿０１７８８８で登録されている。前記ＡＣＳＭ５にはアイソフォームが存在するが、前記測定工程ではいずれのアイソフォームを測定してもよい。
前記ＡＣＳＭ３は、中鎖脂肪酸合成酵素の１つである。前記ＡＣＳＭ５遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＣＳＭ５遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は、ＮＣＢＩにおいて、ＮＭ＿００１３２４３７１、ＮＭ＿００１３２４３７２、ＮＭ＿００１３２４３７３、ＮＭ＿０１７８８８で登録されている。前記ＡＣＳＭ５にはアイソフォームが存在するが、前記測定工程ではいずれのアイソフォームを測定してもよい。
【0018】
－測定－
前記被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡの量を測定する態様、タンパク質の量を測定する態様などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡの量を測定する態様、タンパク質の量を測定する態様などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0019】
前記ｍＲＮＡの量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法などが挙げられる。
【0020】
前記ＰＣＲ法の具体例としては、前記試料から抽出したトータルＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、定量ＰＣＲにより測定する方法などが挙げられる。
前記定量ＰＣＲでは、測定したデータから、デルタデルタｃＴ法により、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）やβ－アクチン等の内在性コントロール遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量の比により、ｍＲＮＡの量を算出することができる。
前記定量ＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、対象とする遺伝子の塩基配列を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、適宜設計したものや市販品を用いることができ、例えば、後述する実施例の項目に記載のプライマーセットなどが挙げられる。
前記定量ＰＣＲでは、測定したデータから、デルタデルタｃＴ法により、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）やβ－アクチン等の内在性コントロール遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量の比により、ｍＲＮＡの量を算出することができる。
前記定量ＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、対象とする遺伝子の塩基配列を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、適宜設計したものや市販品を用いることができ、例えば、後述する実施例の項目に記載のプライマーセットなどが挙げられる。
【0021】
前記タンパク質の量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、免疫学的測定法、質量分析法などが挙げられる。
【0022】
前記免疫学的測定法の具体例としては、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法、免疫組織化学染色法、フローサイトメトリーなどが挙げられる。
前記免疫学的測定法に用いる抗体としては、対象とするタンパク質を検出することができるものであれば、特に制限はなく、公知の方法により調製したものや市販品を用いることができ、例えば、ＡＣＳＭ３の抗体としては「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ；１０１６８－２－ＡＰ」、ＡＣＳＭ５の抗体としては「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃ；１６５９１－１－ＡＰ」などが挙げられる。前記抗体は、必要に応じて蛍光物質の標識などを含んでいてもよい。また、前記抗体の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。
前記免疫学的測定法に用いる抗体としては、対象とするタンパク質を検出することができるものであれば、特に制限はなく、公知の方法により調製したものや市販品を用いることができ、例えば、ＡＣＳＭ３の抗体としては「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ；１０１６８－２－ＡＰ」、ＡＣＳＭ５の抗体としては「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃ；１６５９１－１－ＡＰ」などが挙げられる。前記抗体は、必要に応じて蛍光物質の標識などを含んでいてもよい。また、前記抗体の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。
【0023】
＜判定補助工程＞
前記判定補助工程は、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標（以下、「基準」と称することもある。）として、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性の判定を補助する工程である。
前記判定補助工程は、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標（以下、「基準」と称することもある。）として、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性の判定を補助する工程である。
【0024】
後述する実施例の項目で示すように、ＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５は脱落膜化によって発現量が変動する。したがって、被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標とすることで、被験体が産婦人科疾患に罹患する可能性があるか否か（罹患しているか否かを含む）の判定を補助することができる。
前記指標は、ＡＣＳＭ３の量及びＡＣＳＭ５の量のいずれか一方を用いてもよいし、両方を用いてもよい。
前記指標は、ＡＣＳＭ３の量及びＡＣＳＭ５の量のいずれか一方を用いてもよいし、両方を用いてもよい。
【0025】
－参照量と比較する処理－
前記判定補助工程は、参照量と比較する処理を含むことが好ましい。
前記判定補助工程は、参照量と比較する処理を含むことが好ましい。
【0026】
前記参照量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（Ｉ）脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量、（ＩＩ）産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量、（ＩＩＩ）産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量などが挙げられる。
【0027】
前記処理では、前記参照量が（Ｉ）脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量の場合には、（ｉ）前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３の量が前記対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３の量と同量以上の場合、及び（ｉｉ）前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ５の量が前記対照由来の試料におけるＡＣＳＭ５の量と同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする。
前記脱落膜化していない対照は、前記被験体と同一の個体であってもよいし、異なる個体であってもよいが、同一の個体が好ましい。
前記脱落膜化していない対照は、前記被験体と同一の個体であってもよいし、異なる個体であってもよいが、同一の個体が好ましい。
【0028】
また、前記参照量が（ＩＩ）産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量の場合には、（ｉｉｉ）前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３の量が前記対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３の量より多い場合、及び（ｉｖ）前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ５の量が前記対照由来の試料におけるＡＣＳＭ５の量より少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする。
前記産婦人科疾患に罹患していない対照は、脱落膜化した状態のものであってもよいし、脱落膜化していない状態のものであってもよいが、脱落膜化した状態のものが好ましい。
前記産婦人科疾患に罹患していない対照は、脱落膜化した状態のものであってもよいし、脱落膜化していない状態のものであってもよいが、脱落膜化した状態のものが好ましい。
【0029】
また、前記参照量が（ＩＩＩ）産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量の場合には、（ｖ）前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３の量が前記対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３の量と同量の場合、及び（ｖｉ）前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ５の量が前記対照由来の試料におけるＡＣＳＭ５の量と同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする。
前記産婦人科疾患に罹患している対照は、脱落膜化した状態のものであってもよいし、脱落膜化していない状態のものであってもよいが、脱落膜化した状態のものが好ましい。
前記産婦人科疾患に罹患している対照は、脱落膜化した状態のものであってもよいし、脱落膜化していない状態のものであってもよいが、脱落膜化した状態のものが好ましい。
【0030】
前記参照量は、前記判定補助方法を実施する際に測定したものを用いてもよいし、予め測定したものを用いてもよい。
【0031】
－産婦人科疾患－
前記産婦人科疾患とは、産婦人科領域の疾患をいう。前記産婦人科疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不妊症、妊娠高血圧症候群、胎児発育不全、習慣性流産、子宮内膜症、子宮体癌などが挙げられる。
前記不妊症としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、着床不全（「着床障害」と称することもある。）などが挙げられる。
これらの中でも、本発明の方法は不妊症、習慣性流産に好適に用いることができ、着床不全、習慣性流産により好適に用いることができる。
前記産婦人科疾患とは、産婦人科領域の疾患をいう。前記産婦人科疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不妊症、妊娠高血圧症候群、胎児発育不全、習慣性流産、子宮内膜症、子宮体癌などが挙げられる。
前記不妊症としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、着床不全（「着床障害」と称することもある。）などが挙げられる。
これらの中でも、本発明の方法は不妊症、習慣性流産に好適に用いることができ、着床不全、習慣性流産により好適に用いることができる。
【0032】
＜その他の工程＞
前記判定補助方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試料調製工程などが挙げられる。
前記判定補助方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試料調製工程などが挙げられる。
【0033】
＜＜試料調製工程＞＞
前記判定補助方法における試料調製工程は、前記被験体由来の試料を調製する工程であり、試料の種類に応じて、公知の方法を適宜選択することができる。
前記判定補助方法における試料調製工程は、前記被験体由来の試料を調製する工程であり、試料の種類に応じて、公知の方法を適宜選択することができる。
【0034】
本発明の判定補助方法は、前記ＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５以外の遺伝子の前記被験体由来の試料における量と組み合わせて行ってもよい。
【0035】
本発明の判定補助方法によれば、着床不全や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の罹患可能性を簡易に精度高く判定することを補助することができる。
【0036】
（産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法）
本発明の産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法（以下、「データ収集方法」と称することがある。）は、測定工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法（以下、「データ収集方法」と称することがある。）は、測定工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0037】
＜測定工程＞
前記データ収集方法における測定工程は、被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する工程であり、上記した本発明の判定補助方法における測定工程と同様にして行うことができる。
前記データ収集方法における測定工程は、被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する工程であり、上記した本発明の判定補助方法における測定工程と同様にして行うことができる。
【0038】
＜その他の工程＞
前記データ収集方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、比較工程、試料調製工程などが挙げられる。
前記データ収集方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、比較工程、試料調製工程などが挙げられる。
【0039】
＜＜比較工程＞＞
前記比較工程は、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を参照量と比較する工程であり、上記した本発明の判定補助方法における判定補助工程の参照量と比較する処理と同様にして行うことができる。
前記比較工程は、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を参照量と比較する工程であり、上記した本発明の判定補助方法における判定補助工程の参照量と比較する処理と同様にして行うことができる。
【0040】
＜＜試料調製工程＞＞
前記データ収集方法における試料調製工程は、被験体由来の試料を調製する工程であり、上記した本発明の判定補助方法における試料調製工程と同様にして行うことができる。
前記データ収集方法における試料調製工程は、被験体由来の試料を調製する工程であり、上記した本発明の判定補助方法における試料調製工程と同様にして行うことができる。
【0041】
本発明のデータ収集方法は、前記ＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５以外の遺伝子の前記被験体由来の試料における量の測定と組み合わせて行ってもよい。
【0042】
本発明のデータ収集方法によれば、着床不全や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の罹患可能性を簡易に精度高く診断するために有用なデータを収集することができる。
【0043】
（産婦人科疾患の診断用キット）
本発明の産婦人科疾患の診断用キットは、ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明の産婦人科疾患の診断用キットは、ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0044】
＜産婦人科疾患＞
前記産婦人科疾患は、上記した本発明の判定補助方法における判定補助工程の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記産婦人科疾患は、上記した本発明の判定補助方法における判定補助工程の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
【0045】
＜ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット＞
前記ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセットとしては、ＡＣＳＭ３遺伝子の塩基配列を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、適宜設計したものや市販品を用いることができ、例えば、以下のプライマーセットなどが挙げられる。
・ フォワードプライマー ： ５’－ＣＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）
・ リバースプライマー ： ５’－ＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡ－３’（配列番号１２）
前記ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセットとしては、ＡＣＳＭ３遺伝子の塩基配列を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、適宜設計したものや市販品を用いることができ、例えば、以下のプライマーセットなどが挙げられる。
・ フォワードプライマー ： ５’－ＣＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）
・ リバースプライマー ： ５’－ＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡ－３’（配列番号１２）
【0046】
＜ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット＞
前記ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセットとしては、ＡＣＳＭ５遺伝子の塩基配列を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、適宜設計したものや市販品を用いることができ、例えば、以下のプライマーセットなどが挙げられる。
・ フォワードプライマー ： ５’－ＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＡＡ－３’（配列番号１５）
・ リバースプライマー ： ５’－ＧＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣ－３’（配列番号１６）
前記ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセットとしては、ＡＣＳＭ５遺伝子の塩基配列を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、適宜設計したものや市販品を用いることができ、例えば、以下のプライマーセットなどが挙げられる。
・ フォワードプライマー ： ５’－ＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＡＡ－３’（配列番号１５）
・ リバースプライマー ： ５’－ＧＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣ－３’（配列番号１６）
【0047】
＜ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体＞
前記ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体としては、ＡＣＳＭ３タンパク質を検出することができるものであれば、特に制限はなく、適宜調製したものや市販品を用いることができ例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ；１０１６８－２－ＡＰ」などが挙げられる。
前記ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体としては、ＡＣＳＭ３タンパク質を検出することができるものであれば、特に制限はなく、適宜調製したものや市販品を用いることができ例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ；１０１６８－２－ＡＰ」などが挙げられる。
【0048】
＜ＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体＞
前記ＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体としては、ＡＣＳＭ５タンパク質を検出することができるものであれば、特に制限はなく、適宜調製したものや市販品を用いることができ例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃ；１６５９１－１－ＡＰ」などが挙げられる。
前記ＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体としては、ＡＣＳＭ５タンパク質を検出することができるものであれば、特に制限はなく、適宜調製したものや市販品を用いることができ例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃ；１６５９１－１－ＡＰ」などが挙げられる。
【0049】
前記各抗体は、必要に応じて蛍光物質の標識などを含んでいてもよい。また、前記各抗体の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられる。
【0050】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法に用いる試薬、免疫学的測定法に用いる試薬、キットの取扱説明書、産婦人科疾患を診断するための説明書等の添付文書などが挙げられる。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法に用いる試薬、免疫学的測定法に用いる試薬、キットの取扱説明書、産婦人科疾患を診断するための説明書等の添付文書などが挙げられる。
【0051】
本発明の産婦人科疾患の診断用キットによれば、着床不全や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の罹患可能性を簡易に精度高く診断することができる。
【実施例】
【0052】
以下に本発明の試験例等を説明するが、本発明は、これらの試験例等に何ら限定されるものではない。
【0053】
（調製例１）
＜ヒト子宮内膜組織の採取＞
ヒト子宮内膜組織は、埼玉医科大学病院ＩＲＢの承認を受け、採取した。採取は、埼玉医科大学病院にて子宮全摘出を受ける良性疾患の患者で、ホルモン治療を受けていない症例を対象として行った。採取した子宮内膜組織は、下記組成の継代用培養液に直ちに入れた。
［継代用培養液組成］
・ Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（ナカライテスク） ・・・ ５００ｍＬ
・ ウシ胎児血清（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｃｈａｒｃｏａｌ（ＤＣＣ） ｔｒｅａｔｅｄ ＦＢＳ） ・・・ ５０ｍＬ
・ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ Ｌ－グルタミン×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ １０ｍｇ／ｍＬ インスリン（ＳｉｇｍａＩ１８８２） ・・・ １００μＬ
・ １０－４Ｍ β－エストラジオール（Ｓｉｇｍａ Ｅ２７５８） ・・・ １０μＬ
＜ヒト子宮内膜組織の採取＞
ヒト子宮内膜組織は、埼玉医科大学病院ＩＲＢの承認を受け、採取した。採取は、埼玉医科大学病院にて子宮全摘出を受ける良性疾患の患者で、ホルモン治療を受けていない症例を対象として行った。採取した子宮内膜組織は、下記組成の継代用培養液に直ちに入れた。
［継代用培養液組成］
・ Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（ナカライテスク） ・・・ ５００ｍＬ
・ ウシ胎児血清（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｃｈａｒｃｏａｌ（ＤＣＣ） ｔｒｅａｔｅｄ ＦＢＳ） ・・・ ５０ｍＬ
・ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ Ｌ－グルタミン×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ １０ｍｇ／ｍＬ インスリン（ＳｉｇｍａＩ１８８２） ・・・ １００μＬ
・ １０－４Ｍ β－エストラジオール（Ｓｉｇｍａ Ｅ２７５８） ・・・ １０μＬ
【0054】
＜ヒト子宮内膜間質細胞の分離・培養＞
前記ヒト子宮内膜組織を前記継代用培養液から取り出し、メスで細かく刻んだ。
培養用フラスコに、ＤＮａｓｅＩとコラゲナーゼＩａが入ったＦＢＳ不含培養液（下記組成参照）を用意し、刻んだヒト子宮内膜組織を入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーターに６０分置いた。なお、途中、２回ほど激しく振って細胞が均一に別れるようにした。
次いで、１００μｍのナイロンメッシュでろ過した。
その後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
分離したヒト子宮内膜間質細胞（以下、「子宮内膜細胞」と称することがある。）は、前記継代用培養液が入った培養フラスコにて培養した。
［ＦＢＳ不含培養液組成］
・ Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（ナカライテスク） ・・・ ５００ｍＬ
・ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ １０ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５０２５） ・・・ １００μＬ
・ ５０ｍｇ／ｍＬ コラゲナーゼＩａ（Ｓｉｇｍａ Ｃ２６７４） ・・・ １００μＬ
前記ヒト子宮内膜組織を前記継代用培養液から取り出し、メスで細かく刻んだ。
培養用フラスコに、ＤＮａｓｅＩとコラゲナーゼＩａが入ったＦＢＳ不含培養液（下記組成参照）を用意し、刻んだヒト子宮内膜組織を入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーターに６０分置いた。なお、途中、２回ほど激しく振って細胞が均一に別れるようにした。
次いで、１００μｍのナイロンメッシュでろ過した。
その後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
分離したヒト子宮内膜間質細胞（以下、「子宮内膜細胞」と称することがある。）は、前記継代用培養液が入った培養フラスコにて培養した。
［ＦＢＳ不含培養液組成］
・ Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（ナカライテスク） ・・・ ５００ｍＬ
・ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ １０ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５０２５） ・・・ １００μＬ
・ ５０ｍｇ／ｍＬ コラゲナーゼＩａ（Ｓｉｇｍａ Ｃ２６７４） ・・・ １００μＬ
【0055】
（試験例１）
＜子宮内膜細胞の脱落膜化＞
継代した子宮内膜細胞の培養液を下記組成の脱落膜化用培養液に交換して、３日間又は６日間培養し、脱落膜化処理を行った。なお、６日間培養した場合は、培養開始から３日目に培地交換を行った。
また、下記脱落膜化用培養液組成からｂｒ－ｃＡＭＰ及びメドロキシプロゲステロンを除いた培養液を用いて培養したものを対照とした。
［脱落膜化用培養液組成］
・ Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（ナカライテスク） ・・・ ５００ｍＬ
・ ウシ胎児血清（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｃｈａｒｃｏａｌ（ＤＣＣ） ｔｒｅａｔｅｄ ＦＢＳ） ・・・ １０ｍＬ
・ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ Ｌ－グルタミン×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ １００ｍＭ ８ｂｒ－ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ Ｂ７８８０） ・・・ 培養液総量の１／２００
・ １０－２Ｍ メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｍ１６２９） ・・・ 培養液総量の／１，０００
＜子宮内膜細胞の脱落膜化＞
継代した子宮内膜細胞の培養液を下記組成の脱落膜化用培養液に交換して、３日間又は６日間培養し、脱落膜化処理を行った。なお、６日間培養した場合は、培養開始から３日目に培地交換を行った。
また、下記脱落膜化用培養液組成からｂｒ－ｃＡＭＰ及びメドロキシプロゲステロンを除いた培養液を用いて培養したものを対照とした。
［脱落膜化用培養液組成］
・ Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（ナカライテスク） ・・・ ５００ｍＬ
・ ウシ胎児血清（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｃｈａｒｃｏａｌ（ＤＣＣ） ｔｒｅａｔｅｄ ＦＢＳ） ・・・ １０ｍＬ
・ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ Ｌ－グルタミン×１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５ｍＬ
・ １００ｍＭ ８ｂｒ－ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ Ｂ７８８０） ・・・ 培養液総量の１／２００
・ １０－２Ｍ メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｍ１６２９） ・・・ 培養液総量の／１，０００
【0056】
＜＜脱落膜化の確認＞＞
－形態学的評価－
顕微鏡（ニコンＴＳ－１００）を用いて培養した細胞を観察した。脱落膜化処理を行っていない対照の細胞の一例を図１Ａに示し、脱落膜化処理を行った細胞の一例を図１Ｂに示す。
図１Ａ及び１Ｂから、８ｂｒ－ｃＡＭＰ及びＭＰＡ刺激により、使用したヒト子宮内膜細胞が確かに脱落膜化したことが形態学的に確認された。
－形態学的評価－
顕微鏡（ニコンＴＳ－１００）を用いて培養した細胞を観察した。脱落膜化処理を行っていない対照の細胞の一例を図１Ａに示し、脱落膜化処理を行った細胞の一例を図１Ｂに示す。
図１Ａ及び１Ｂから、８ｂｒ－ｃＡＭＰ及びＭＰＡ刺激により、使用したヒト子宮内膜細胞が確かに脱落膜化したことが形態学的に確認された。
【0057】
－脱落膜化マーカーの発現量による評価－
既知の脱落膜化マーカーであるインスリン様増殖因子結合たん白質１（ＩＧＦＢＰ１）、プロラクチン（ＰＲＬ）及びＷＮＴ４（Ｗｎｔ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ４）のｍＲＮＡの発現量を、定量ＰＣＲ法を用い、以下のようにして測定した。
既知の脱落膜化マーカーであるインスリン様増殖因子結合たん白質１（ＩＧＦＢＰ１）、プロラクチン（ＰＲＬ）及びＷＮＴ４（Ｗｎｔ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ４）のｍＲＮＡの発現量を、定量ＰＣＲ法を用い、以下のようにして測定した。
【0058】
－－トータルＲＮＡの抽出－－
培養液を除いた後、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）に付属のＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔにて培養した細胞を融解した。次いで、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔの説明書の記載に従って、トータルＲＮＡを抽出した。
培養液を除いた後、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）に付属のＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔにて培養した細胞を融解した。次いで、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔの説明書の記載に従って、トータルＲＮＡを抽出した。
【0059】
－－ｃＤＮＡ合成－－
抽出したトータルＲＮＡの濃度をＮａｎｏ Ｄｒｏｐにて測定した。トータルＲＮＡ １μｇに対しＯｌｉｇｏ ｄＴ１２－１８Ｐｒｉｍｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， １８４１８０１２） １μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ） １μＬを入れ、滅菌水で総量を１０μＬにした。７０℃で５分間置いた後、４℃まで温度を下げた。ＢｉｏＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ， ＢＩＯ－２７０３６）に付属の５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、ＢｉｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを１μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ） １μＬ、及び滅菌水 ４μＬを加えて、４２℃で３０分間、次いで８５℃で１０分間置いた後、４℃に温度を下げた。
得られたｃＤＮＡは、５ｎｇ／μＬに濃度を調節した。
抽出したトータルＲＮＡの濃度をＮａｎｏ Ｄｒｏｐにて測定した。トータルＲＮＡ １μｇに対しＯｌｉｇｏ ｄＴ１２－１８Ｐｒｉｍｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， １８４１８０１２） １μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ） １μＬを入れ、滅菌水で総量を１０μＬにした。７０℃で５分間置いた後、４℃まで温度を下げた。ＢｉｏＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ， ＢＩＯ－２７０３６）に付属の５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、ＢｉｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを１μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ） １μＬ、及び滅菌水 ４μＬを加えて、４２℃で３０分間、次いで８５℃で１０分間置いた後、４℃に温度を下げた。
得られたｃＤＮＡは、５ｎｇ／μＬに濃度を調節した。
【0060】
－－定量ＰＣＲ－－
下記組成の反応液をマイクロプレートに入れ、ＰｉｋｏＲｅａｌ９６ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、下記プログラムでＰＣＲを行い、各遺伝子の発現量を測定した。
測定したデータは、デルタデルタｃＴ法により、ＧＡＰＤＨの発現量と目的遺伝子の発現量の比により計算した。結果を図１Ｃ～１Ｅに示す。
［反応液組成］
・ ｃＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ） ・・・ ２．５μＬ
・ フォワードプライマー（１μＭ） ・・・ １．０μＬ
・ リバースプライマー（１μＭ） ・・・ １．０μＬ
・ ＰｏｗｅｒＵＰ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５．０μＬ
・ ＤＮａｓｅ－ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ・・・ ０．５μＬ
［プログラム］
・ ５０℃、２分 → ９５℃、２分 → 「９５℃、１５秒 → ６０℃、１分」を４０サイクル
・ Ｒａｍｐ ｒａｔｅ １．６℃／秒
［プライマー］
・ ＩＧＦＢＰ１
フォワードプライマー ： ５’－ＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡ－３’（配列番号１）
リバースプライマー ： ５’－ＣＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣ－３’（配列番号２）
・ ＰＲＬ
フォワードプライマー ： ５’－ＣＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号３）
リバースプライマー ： ５’－ＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣ－３’（配列番号４）
・ ＷＮＴ４
フォワードプライマー ： ５’－ＣＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＧ－３’（配列番号５）
リバースプライマー ： ５’－ＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴ－３’（配列番号６）
・ ＧＡＰＤＨ
フォワードプライマー ： ５’－ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ－３’（配列番号７）
リバースプライマー ： ５’－ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ－３’（配列番号８）
下記組成の反応液をマイクロプレートに入れ、ＰｉｋｏＲｅａｌ９６ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、下記プログラムでＰＣＲを行い、各遺伝子の発現量を測定した。
測定したデータは、デルタデルタｃＴ法により、ＧＡＰＤＨの発現量と目的遺伝子の発現量の比により計算した。結果を図１Ｃ～１Ｅに示す。
［反応液組成］
・ ｃＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ） ・・・ ２．５μＬ
・ フォワードプライマー（１μＭ） ・・・ １．０μＬ
・ リバースプライマー（１μＭ） ・・・ １．０μＬ
・ ＰｏｗｅｒＵＰ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ・・・ ５．０μＬ
・ ＤＮａｓｅ－ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ・・・ ０．５μＬ
［プログラム］
・ ５０℃、２分 → ９５℃、２分 → 「９５℃、１５秒 → ６０℃、１分」を４０サイクル
・ Ｒａｍｐ ｒａｔｅ １．６℃／秒
［プライマー］
・ ＩＧＦＢＰ１
フォワードプライマー ： ５’－ＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡ－３’（配列番号１）
リバースプライマー ： ５’－ＣＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣ－３’（配列番号２）
・ ＰＲＬ
フォワードプライマー ： ５’－ＣＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号３）
リバースプライマー ： ５’－ＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＣ－３’（配列番号４）
・ ＷＮＴ４
フォワードプライマー ： ５’－ＣＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＴＣＣＡＡＧ－３’（配列番号５）
リバースプライマー ： ５’－ＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴ－３’（配列番号６）
・ ＧＡＰＤＨ
フォワードプライマー ： ５’－ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡ－３’（配列番号７）
リバースプライマー ： ５’－ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ－３’（配列番号８）
【0061】
図１Ｃ～１Ｅは、それぞれＩＧＦＢＰ１、ＰＲＬ、ＷＮＴ４の発現量を測定した結果を示す。各図中、「ＣＴＬ」は脱落膜化処理を行っていない対照の細胞を示し、「８－ｂｒ－ｃＡＭＰ／ＭＰＡ」は脱落膜化処理を行った細胞を示し、「＊＊」はｐ＜０．０１を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す。
図１Ｃ～１Ｅから、対照と比べて、８ｂｒ－ｃＡＭＰ及びＭＰＡ刺激を行った細胞では、既知の脱落膜化マーカーであるＩＧＦＢＰ１、ＰＲＬ及びＷＮＴ４の発現量が有意に上昇しており、定量ＰＣＲによっても、使用したヒト子宮内膜細胞が確かに脱落膜化したこと確認された。
図１Ｃ～１Ｅから、対照と比べて、８ｂｒ－ｃＡＭＰ及びＭＰＡ刺激を行った細胞では、既知の脱落膜化マーカーであるＩＧＦＢＰ１、ＰＲＬ及びＷＮＴ４の発現量が有意に上昇しており、定量ＰＣＲによっても、使用したヒト子宮内膜細胞が確かに脱落膜化したこと確認された。
【0062】
（試験例２）
胚の正常な発生にはオクタン酸が必要であることが知られている（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ２， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ９３０ （２０１２））。
オクタン酸は中鎖脂肪酸の１種であることから、試験例１で得られた脱落膜化処理を行った細胞及び脱落膜化処理を行っていない対照の細胞における中鎖脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現量を定量ＰＣＲにて測定した。
測定した中鎖脂肪酸合成酵素は、ＡＣＳＭ２Ａ、ＡＣＳＭ３、ＡＣＳＭ４及びＡＣＳＭ５であり、定量ＰＣＲは下記プライマーを用いた以外は試験例１と同様にして行った。結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。
［プライマー］
・ ＡＣＳＭ２Ａ
フォワードプライマー ： ５’－ＡＣＴＧＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧ－３’（配列番号９）
リバースプライマー ： ５’－ＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）
・ ＡＣＳＭ３
フォワードプライマー ： ５’－ＣＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）
リバースプライマー ： ５’－ＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡ－３’（配列番号１２）
・ ＡＣＳＭ４
フォワードプライマー ： ５’－ＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＴ－３’（配列番号１３）
リバースプライマー ： ５’－ＴＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号１４）
・ ＡＣＳＭ５
フォワードプライマー ： ５’－ＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＡＡ－３’（配列番号１５）
リバースプライマー ： ５’－ＧＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣ－３’（配列番号１６）
胚の正常な発生にはオクタン酸が必要であることが知られている（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ２， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ９３０ （２０１２））。
オクタン酸は中鎖脂肪酸の１種であることから、試験例１で得られた脱落膜化処理を行った細胞及び脱落膜化処理を行っていない対照の細胞における中鎖脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現量を定量ＰＣＲにて測定した。
測定した中鎖脂肪酸合成酵素は、ＡＣＳＭ２Ａ、ＡＣＳＭ３、ＡＣＳＭ４及びＡＣＳＭ５であり、定量ＰＣＲは下記プライマーを用いた以外は試験例１と同様にして行った。結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。
［プライマー］
・ ＡＣＳＭ２Ａ
フォワードプライマー ： ５’－ＡＣＴＧＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧ－３’（配列番号９）
リバースプライマー ： ５’－ＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＡ－３’（配列番号１０）
・ ＡＣＳＭ３
フォワードプライマー ： ５’－ＣＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）
リバースプライマー ： ５’－ＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡ－３’（配列番号１２）
・ ＡＣＳＭ４
フォワードプライマー ： ５’－ＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＴ－３’（配列番号１３）
リバースプライマー ： ５’－ＴＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＡＡ－３’（配列番号１４）
・ ＡＣＳＭ５
フォワードプライマー ： ５’－ＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＡＡ－３’（配列番号１５）
リバースプライマー ： ５’－ＧＧＡＧＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣ－３’（配列番号１６）
【0063】
図２Ａ及び２Ｂは、それぞれＡＣＳＭ３、ＡＣＳＭ５の発現量を測定した結果を示す。各図中、「ＣＴＬ１」は脱落膜化処理を行っていない対照の細胞を示し、「８－ｂｒ－ｃＡＭＰ／ＭＰＡ」は脱落膜化処理を行った細胞を示し、「＊」はｐ＜０．０５を示す。
図２Ａ及び２Ｂから、中鎖脂肪酸合成酵素のうち、ＡＣＳＭ３とＡＣＳＭ５が脱落膜化によって発現が変動することがわかった。また、ＡＣＳＭ３は脱落膜化により発現量が低下し、一方、ＡＣＳＭ５は脱落膜化により発現量が上昇していた。
ＡＣＳＭ２ＡとＡＣＳＭ４は、脱落膜化の有無に関わらず、ヒト子宮内膜細胞での発現は見られなかった。
図２Ａ及び２Ｂから、中鎖脂肪酸合成酵素のうち、ＡＣＳＭ３とＡＣＳＭ５が脱落膜化によって発現が変動することがわかった。また、ＡＣＳＭ３は脱落膜化により発現量が低下し、一方、ＡＣＳＭ５は脱落膜化により発現量が上昇していた。
ＡＣＳＭ２ＡとＡＣＳＭ４は、脱落膜化の有無に関わらず、ヒト子宮内膜細胞での発現は見られなかった。
【0064】
（試験例３）
試験例１で示したように、ＩＧＦＢＰ１は脱落膜化に伴い発現量が上昇する遺伝子である。このＩＧＦＢＰ１の脱落膜化における役割は明確ではないが、その発現量には個体差があることが知られている。また、ＩＧＦＢＰ１の発現量が低値の場合には、着床不全を含む不妊症や習慣性流産等が生じる傾向にあることも知られている。
そこで、試験例１の脱落膜化処理された細胞において、ＩＧＦＢＰ１の発現量が高値であった検体１と、ＩＧＦＢＰ１の発現量が低値であった検体２のそれぞれにおけるＡＣＳＭ３とＡＣＳＭ５の発現量を比較した。結果を図３Ａ～３Ｃに示す。
試験例１で示したように、ＩＧＦＢＰ１は脱落膜化に伴い発現量が上昇する遺伝子である。このＩＧＦＢＰ１の脱落膜化における役割は明確ではないが、その発現量には個体差があることが知られている。また、ＩＧＦＢＰ１の発現量が低値の場合には、着床不全を含む不妊症や習慣性流産等が生じる傾向にあることも知られている。
そこで、試験例１の脱落膜化処理された細胞において、ＩＧＦＢＰ１の発現量が高値であった検体１と、ＩＧＦＢＰ１の発現量が低値であった検体２のそれぞれにおけるＡＣＳＭ３とＡＣＳＭ５の発現量を比較した。結果を図３Ａ～３Ｃに示す。
【0065】
図３Ａは、ＩＧＦＢＰ１の発現量を比較した結果を示し、図３Ｂ及び３Ｃは、それぞれＡＣＳＭ３、ＡＣＳＭ５の発現量を比較した結果を示す。各図中、黒の棒グラフはＩＧＦＢＰ１の発現量が高値であった検体１の結果を示し、白の棒グラフは発現量が低値であった検体２の結果を示し、「ＣＴＬ」は脱落膜化処理を行っていない対照の細胞を示し、「８－ｂｒ－ｃＡＭＰ／ＭＰＡ」は脱落膜化処理を行った細胞を示す。
図３Ａ～３Ｃの結果から、試験例２において脱落膜化によって発現量が低下することが確認されたＩＧＦＢＰ１の発現量と逆相関を示すＡＣＳＭ３は、ＩＧＦＢＰ１が高値の検体１では、ＩＧＦＢＰ１が低値の検体２よりも低い発現量となっており、関連が見られた。また、試験例２において脱落膜化によって発現量が亢進することが確認されたＩＧＦＢＰ１の発現量と相関を示すＡＣＳＭ５は、ＩＧＦＢＰ１が高値の検体１では、ＩＧＦＢＰ１が低値の検体２よりも高い発現量となっており、こちらも関連が見られた。
以上のように、ＩＧＦＢＰ１の発現量が低値であり、着床不全が生じる傾向にあると考えられる検体２では、着床不全が生じる傾向にないと考えられる検体１と比べて、ＡＣＳＭ３の発現量が多く、またＡＣＳＭ５の発現量が少ないことが確認された。
図３Ａ～３Ｃの結果から、試験例２において脱落膜化によって発現量が低下することが確認されたＩＧＦＢＰ１の発現量と逆相関を示すＡＣＳＭ３は、ＩＧＦＢＰ１が高値の検体１では、ＩＧＦＢＰ１が低値の検体２よりも低い発現量となっており、関連が見られた。また、試験例２において脱落膜化によって発現量が亢進することが確認されたＩＧＦＢＰ１の発現量と相関を示すＡＣＳＭ５は、ＩＧＦＢＰ１が高値の検体１では、ＩＧＦＢＰ１が低値の検体２よりも高い発現量となっており、こちらも関連が見られた。
以上のように、ＩＧＦＢＰ１の発現量が低値であり、着床不全が生じる傾向にあると考えられる検体２では、着床不全が生じる傾向にないと考えられる検体１と比べて、ＡＣＳＭ３の発現量が多く、またＡＣＳＭ５の発現量が少ないことが確認された。
【0066】
以上の結果から、ＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５は、着床障害や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の患者で異常値が出ると想定される。そのため、被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定することで、産婦人科疾患の罹患可能性を診断するために有用なデータを収集したり、ＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標とすることで、産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助したりすることが可能となると考えられる。
また、これまでの脱落膜化マーカーと異なる点として、ＡＣＳＭ５は胚へ供給されるオクタン酸の合成、ＡＣＳＭ３は胚の着床に関わる細胞の遊走能という着床に対する直接的な役割が想定されるため、着床障害や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の明確な診断に繋げられることが可能と考えられる。また、ＡＣＳＭ５やＡＣＳＭ３は治療標的の因子となり得るとも考えられる。
また、これまでの脱落膜化マーカーと異なる点として、ＡＣＳＭ５は胚へ供給されるオクタン酸の合成、ＡＣＳＭ３は胚の着床に関わる細胞の遊走能という着床に対する直接的な役割が想定されるため、着床障害や習慣性流産等を含む産婦人科疾患の明確な診断に繋げられることが可能と考えられる。また、ＡＣＳＭ５やＡＣＳＭ３は治療標的の因子となり得るとも考えられる。
【0067】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標として、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性の判定を補助する判定補助工程とを含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法である。
＜２＞ 前記判定補助工程が参照量と比較する処理を含み、
前記参照量が、脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量以上の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞ 前記判定補助工程が参照量と比較する処理を含み、
前記参照量が、産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が多い場合及びＡＣＳＭ５の量が少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜１＞に記載の方法である。
＜４＞ 前記判定補助工程が参照量と比較する処理を含み、
前記参照量が、産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜１＞に記載の方法である。
＜５＞ 前記被験体由来の試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ 前記産婦人科疾患が、不妊症及び習慣性流産のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法である。
＜８＞ 更に、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を参照量と比較する比較工程を含む前記＜７＞に記載の方法である。
＜９＞ 前記比較工程における参照量が、脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量以上の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜８＞に記載の方法である。
＜１０＞ 前記比較工程における参照量が、産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が多い場合及びＡＣＳＭ５の量が少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜８＞に記載の方法である。
＜１１＞ 前記比較工程における参照量が、産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜８＞に記載の方法である。
＜１２＞ 前前記被験体由来の試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種である前記＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ 前記産婦人科疾患が、不妊症及び習慣性流産のいずれかである前記＜７＞から＜１２＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞ ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする産婦人科疾患の診断用キットである。
＜１＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を指標として、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性の判定を補助する判定補助工程とを含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性の判定を補助する方法である。
＜２＞ 前記判定補助工程が参照量と比較する処理を含み、
前記参照量が、脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量以上の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞ 前記判定補助工程が参照量と比較する処理を含み、
前記参照量が、産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が多い場合及びＡＣＳＭ５の量が少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜１＞に記載の方法である。
＜４＞ 前記判定補助工程が参照量と比較する処理を含み、
前記参照量が、産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜１＞に記載の方法である。
＜５＞ 前記被験体由来の試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ 前記産婦人科疾患が、不妊症及び習慣性流産のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞ 被験体由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を測定する測定工程を含むことを特徴とする産婦人科疾患の罹患可能性を診断するためのデータを収集する方法である。
＜８＞ 更に、前記測定工程で測定されたＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量を参照量と比較する比較工程を含む前記＜７＞に記載の方法である。
＜９＞ 前記比較工程における参照量が、脱落膜化していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量以上の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量以下の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜８＞に記載の方法である。
＜１０＞ 前記比較工程における参照量が、産婦人科疾患に罹患していない対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が多い場合及びＡＣＳＭ５の量が少ない場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜８＞に記載の方法である。
＜１１＞ 前記比較工程における参照量が、産婦人科疾患に罹患している対照由来の試料におけるＡＣＳＭ３及びＡＣＳＭ５の少なくともいずれかの量であり、
前記参照量と比較して、ＡＣＳＭ３の量が同量の場合及びＡＣＳＭ５の量が同量の場合の少なくともいずれかの場合に、被験体の産婦人科疾患への罹患可能性が高いとする工程である前記＜８＞に記載の方法である。
＜１２＞ 前前記被験体由来の試料が、子宮内膜組織、子宮内膜間質細胞、及び子宮内腔液からなる群から選択される少なくとも１種である前記＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載の方法である。
＜１３＞ 前記産婦人科疾患が、不妊症及び習慣性流産のいずれかである前記＜７＞から＜１２＞のいずれかに記載の方法である。
＜１４＞ ＡＣＳＭ３遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ５遺伝子検出用プライマーセット、ＡＣＳＭ３タンパク質検出用抗体、及びＡＣＳＭ５タンパク質検出用抗体からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする産婦人科疾患の診断用キットである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【配列表】