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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-09
(45)【発行日】2022-12-19
(54)【発明の名称】ミュータンス菌の検出法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20221212BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20221212BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20221212BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
C12N15/11 Z
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2018168408
(22)【出願日】2018-09-10
(65)【公開番号】P2020039284
(43)【公開日】2020-03-19
【審査請求日】2021-09-07
(73)【特許権者】
【識別番号】591167430
【氏名又は名称】株式会社ＫＲＩ
(72)【発明者】
【氏名】保川 清
(72)【発明者】
【氏名】多田 孝清
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５０８６６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】RNA増幅法を用いたミュータンス菌の検出，Journal of Biological Macromolecules，2018年09月01日，Vol. 18, No. 2，p. 36, II-3
【文献】Caries Research，2010年，Vol. 44，pp. 485-497
【文献】Oral Microbiology and Immunology，2003年，Vol. 18，pp. 50-53
【文献】Letters in Applied Microbiology，2003年，Vol. 37，pp. 66-69
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ミュータンス菌ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号１の１－１４８２に対応する１４８２ヌクレオチド）の一部を標的とするＲＮＡ増幅法を用いてミュータンス菌を検出するミュータンス菌の検出法であって、増幅されるＲＮＡの塩基数が１６０～２５０ｂｐであり、第一のプライマーが配列番号１の１～１２０の一部の配列からなり、第二のプライマーが配列番号１の１６１～２８０の一部の配列とプロモーター配列からなり、
第一のプライマーとして下記（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
（ｄ）配列番号：５の配列、
のいずれかを、
第二のプライマーとして下記（ｅ）～（ｈ）：
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
（ｇ）配列番号：８の配列、
（ｈ）配列番号：９の配列、
のいずれかを用いる、
ことを特徴とするミュータンス菌の検出法。
【請求項2】
人から採取した唾液を検体とすることを特徴とする請求項１に記載のミュータンス菌の検出法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡ増幅法を用いたミュータンス菌の検出法に関する。
【背景技術】
【0002】
口腔状態を正しく知ることは、口腔疾患の予防や治療において重要である。特にう蝕の原因菌であるミュータンス菌の迅速高感度な検出は、口腔状態を知る上で最も重要と考えられている。
【0003】
これまで、ミュータンス菌の検出法として、口腔内から得られた唾液やうがい液をミュータンス菌に選択的な培地に摂取し培養する方法（非特許文献１）、プレートに摂取して培養しミュータンス菌が有する酵素の活性を測定する方法（特許文献１）が用いられてきたが、検出に２日間を要するため、迅速性に問題点があった。
【0004】
口腔内から得られた唾液やうがい液中のミュータンス菌が発現するタンパク質を抗体により検出する方法（特許文献２）も開発されたが、感度が低いという問題点があった。
【0005】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いてミュータンス菌を検出する方法（非特許文献２）は上記の問題点を解決するものであるが、ＰＣＲは温度の上げ下げに高価な装置が必須であり、大病院に限定されることから、一般の歯科医院には普及しなかった。
【0006】
ＲＮＡ増幅法は２種類のＤＮＡプライマーと逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いて一定温度（４１～４４℃）で標的ＲＮＡを増幅させる方法である。
【0007】
これまでにＲＮＡ増幅法としてＮＡＳＢＡ法（非特許文献３）、ＴＭＡ法（非特許文献４）、ＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（非特許文献５）が報告されている。また、発明者らは、ＴＲＣ法を用いて人免疫不全ウイルスＩ型のＲＮＡ増幅を行う方法を特許出願している（特許文献３）
【0008】
ＲＮＡ増幅法は増幅に有する時間が数十分と短く、温度の上げ下げが不要であり高価な装置を必要としないため、ミュータンス菌の検出に適していると考えられる。しかし、ＲＮＡ増幅法は反応温度が低いだけでなく、一方のプライマーの５´末端に２８塩基のプロモーター認識配列を付加させるため、プライマーのミスアニーリングが起こりやすく、その設計が著しく困難である。また、ｒＲＮＡの細菌間の配列は似ており、ＲＮＡ増幅法でミュータンス菌だけを特異的に検出することは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特開２００３－３８１８７号公報
【文献】特開２００５－２４１３３５号公報
【文献】特開２０１６－６３７９７号公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９７３年発行、第１８巻、ｐｐ．１３５７－１３６４
【文献】新しいＳ．ｍｕｔａｎｓ菌検査キットのＰＣＲ法を用いた臨床的有用性評価．小児歯科学雑誌 ２００６年発行、第４４巻、ｐｐ．３７９－３８４
【文献】Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（ＮＡＳＢＡ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１０年発行、第３５巻、ｐｐ．２７３－２８６
【文献】Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｓｐｕｔｕｍ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒＲＮＡ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９３年発行、第３１巻、ｐｐ．２４１０－２４１６
【文献】保川清：ＴＲＣ反応によるＲＮＡの増幅とリアルタイム検出、医学のあゆみ、２００３年発行、第２６６巻、ｐｐ．４７９－４８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＲＮＡ増幅法によりミュータンス菌を特異的に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者は、ミュータンス菌およびその類縁菌のｒＲＮＡを詳細に解析した結果、５´側領域（配列番号１の１－２８０の領域）では他の領域よりも菌間でのＲＮＡ配列の相同性が低いことを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の技術的手段から構成される。
すなわち、本発明は、以下の技術的手段から構成される。
【0013】
〔１〕 ミュータンス菌ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号１の１－１４８２に対応する１４８２ヌクレオチド）の一部を標的とするＲＮＡ増幅法を用いてミュータンス菌を検出するミュータンス菌の検出法であって、増幅されるＲＮＡの塩基数が１６０～２５０ｂｐであり、第一のプライマーが配列番号１の１～１２０の一部の配列からなり、第二のプライマーが配列番号１の１６１～２８０の一部の配列とプロモーター配列からなることを特徴とするミュータンス菌の検出法。
〔２〕 第一のプライマーとして下記（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
（ｄ）配列番号：５の配列、
のいずれかを、
第二のプライマーとして下記（ｅ）～（ｈ）：
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
（ｇ）配列番号：８の配列、
（ｈ）配列番号：９の配列、
のいずれかを用いる［１］に記載のミュータンス菌の検出法。
〔３〕 人から採取した唾液を検体とすることを特徴とする前記［１］又は前記［２］に記載のミュータンス菌の検出法。
〔２〕 第一のプライマーとして下記（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
（ｄ）配列番号：５の配列、
のいずれかを、
第二のプライマーとして下記（ｅ）～（ｈ）：
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
（ｇ）配列番号：８の配列、
（ｈ）配列番号：９の配列、
のいずれかを用いる［１］に記載のミュータンス菌の検出法。
〔３〕 人から採取した唾液を検体とすることを特徴とする前記［１］又は前記［２］に記載のミュータンス菌の検出法。
【発明の効果】
【0014】
本発明のＲＮＡ増幅法は、ミュータンス菌を特異的に検出するという優れた性質を有する。また、一定温度で反応を実施するため特別な装置を用いることなく、迅速にミュータンス菌を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列を発現ベクターに挿入したｐＥＴ２２ｂ－１６Ｓ（ＳＫ）の構造を示す。
【図2】ｐＥＴ２２ｂ－１６Ｓ（ＳＫ）をＥｃｏＲＩで切断した直鎖状ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写して得た標準ＲＮＡの２％アガロース電気泳動結果を示す写真である。
【図3】表１に示す４種類の第一のプライマーのいずれかと４種類の第二のプライマーのいずれかの１６種類の組合せ（組合せ番号１－１６）および標準ＲＮＡを用いてＲＮＡ増幅反応を６０分間行ったときの反応物の２％アガロース電気泳動による解析の結果を示す写真である。
【図4】表１に示す組合せ番号３、６、１１、１２および標準ＲＮＡを用いてＲＮＡ増幅反応を０－６０分間行ったときの反応物の２％アガロース電気泳動による解析の結果を示す写真である。
【図5】表１に示す組合せ番号６のプライマーを用いて、下記のａからｆの検体のＲＮＡ増幅反応を１０分間行い産生したＲＮＡ増幅産物を２％アガロース電気泳動により解析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明のミュータンス菌の検出法は、ミュータンス菌ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号１の１－１４８２に対応する１４８２ヌクレオチド）の一部を標的とするＲＮＡ増幅法を用いてミュータンス菌を検出するミュータンス菌の検出法であって、増幅されるＲＮＡの塩基数が１６０～２５０ｂｐであり、第一のプライマーが配列番号１の１～１２０の一部の配列からなり、第二のプライマーが配列番号１の１６１～２８０の一部の配列とプロモーター配列からなることを特徴とする．
【0017】
ミュータンス菌においては、配列番号の前段部分である１～２８０の部分が、口腔微生物との間で相同性が低いことを確認して第一のプライマーおよび第二のプライマーを設定した。このため、ミュータンス菌の特定的な検出に本配列を用いることが好ましい。
【0018】
好ましくは、前記第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせは、前記第一のプライマーと第二のプライマーにより増幅されるＲＮＡの塩基数が、１６０～２５０ｂｐであり、より好ましくは、１９０～２２０ｂｐである。増幅される塩基数が１６０ｂｐ以下および２５０ｂｐ以上の場合は，増幅反応がうまく進まずＲＮＡが増幅しにくいため好ましくない．
【0019】
また、前記第一のプライマーと第二のプライマーにより増幅されるＲＮＡの塩基数が、１６０～２５０ｂｐである組み合わせとしては、
第一のプライマーとして下記（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
（ｄ）配列番号：５の配列、
のいずれかを、第二のプライマーとして下記（ｅ）～（ｈ）：
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
（ｇ）配列番号：８の配列、
（ｈ）配列番号：９の配列、
のいずれかを用いることが好ましい。
第一のプライマーとして下記（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号：２の配列、
（ｂ）配列番号：３の配列、
（ｃ）配列番号：４の配列、
（ｄ）配列番号：５の配列、
のいずれかを、第二のプライマーとして下記（ｅ）～（ｈ）：
（ｅ）配列番号：６の配列、
（ｆ）配列番号：７の配列、
（ｇ）配列番号：８の配列、
（ｈ）配列番号：９の配列、
のいずれかを用いることが好ましい。
【0020】
上記のプライマーの組み合わせは、どのようなものであっても構わないが、その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、（ｂ）と（ｆ）、（ｃ）と（ｇ）及び（ｃ）と（ｈ）の組み合わせが、好ましい例であり、（ｂ）と（ｆ）を特に好ましい例として挙げることができる。
【0021】
本発明のＲＮＡ増幅方法は、ＲＮＡを鋳型として、最終増幅産物がＲＮＡである増幅法であれば、増幅法として制限されない。すなわち、基質試薬、標的遺伝子の増幅遺伝子部分の両端を特異的に結合できるＤＮＡを含む２種類のプライマー試薬及び逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼが含まれた酵素試薬からなる反応試薬に、標的のＲＮＡを加える反応条件のＲＮＡ増幅法でよく、ＮＡＳＢＡ法であってもよく、ＴＭＡ法でもよく、ＴＲＣ法であってもよい。
【0022】
前記基質試薬は、通常、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌなどのｐＨ緩衝効果のある成分と、塩化マグネシウム、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤、ＤＴＴなどの還元剤、デオキシＡＴＰ、デオキシＧＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＴＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＩＴＰを含む水溶液である。
【0023】
前記第一のプライマー試薬は，ＲＮＡ増幅対象部分の端の塩基配列を基に有機合成した核酸鎖である。前記第二のプライマー試薬は，ＲＮＡ増幅対象部分の塩基配列にプロモーター配列を付加した配列を基に有機合成した核酸鎖である．
【0024】
酵素試薬を構成する前記逆転写酵素としてはＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ鎖を伸長できる酵素活性を有することで、増幅対象のＲＮＡに相補的なＤＮＡを形成できる効果を有するものであれば特に制限はないが、耐熱性を有するＭＭＬＶ ＲＴと耐熱性を有するトリ骨髄芽球症状ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）を好ましい例として挙げることができる。
【0025】
酵素試薬を構成する前記ＲＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌や酵母、人などさまざまなＲＮＡポリメラーゼを用いることが可能であるが、本ＲＮＡ増幅法ではＲＮＡ増幅活性が高い大腸菌由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
【0026】
反応試薬を構成する基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬を混合する順番は特に限定されるものではない。
また、標的ＲＮＡを含むＲＮＡは溶液の状態で反応試薬と混合して反応溶液として増幅反応させる。標的ＲＮＡ溶液と反応試薬の混合は、標的ＲＮＡ溶液を基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬を含む反応試薬と混合しても良いし、標的ＲＮＡ溶液を反応試薬を構成する基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬のいずれかに予め混合しておいても良い。
また、標的ＲＮＡを含むＲＮＡは溶液の状態で反応試薬と混合して反応溶液として増幅反応させる。標的ＲＮＡ溶液と反応試薬の混合は、標的ＲＮＡ溶液を基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬を含む反応試薬と混合しても良いし、標的ＲＮＡ溶液を反応試薬を構成する基質試薬、２種類のプライマー試薬及び酵素試薬のいずれかに予め混合しておいても良い。
【0027】
反応時間は、一定温度で、ＲＮＡが増幅するために要する時間を保持すればよく、数分から数時間でよい。
【0028】
ＲＮＡ増幅法に必要な基質試薬とプライマー試薬と酵素試薬とを別々に揃えて、キットとして提供してもよく、あるいは、それらを混合して利用可能な反応試薬として提供して、対象とする生物の検出キットとしてもよい。
【0029】
次に、本発明は、前記したＲＮＡ増幅法を用いることにより、ミュータンス菌検出方法を提供することができる。
【0030】
本発明のＲＮＡ増幅法のミュータンス菌検出方法への適用は、人から採取した唾液から取り出した検体に前記した本発明のＲＮＡ増幅法によって行うことができる。
【0031】
検体を取り出す方法の一例を示すと、まず、人から唾液を採取し検体とすることができる。より望ましくは、唾液を、ＲＮＡ分解酵素の阻害処理を行って、タンパク質除去操作を行い核酸溶液を得る。核酸溶液を得るためには、東ソー社製のＥＸＴＲＡＧＥＮ ＩＩや、ＱＩＡＧＥＮ社製の ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ ｋｉｔなどの試薬キットを用いてもよい。
【0032】
取り出した検体に前記〔１〕～〔３〕のＲＮＡ増幅法により、ミュータンス菌ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号１の１－１４８２に対応する１４８２ヌクレオチド）の一部を標的としてＲＮＡを増幅することによりミュータンス菌を検出することができる。
【0033】
次に、前記検体からミュータンス菌の増幅対象の遺伝子由来のＲＮＡを増幅する方法の好ましい一例を示す。
【0034】
検体がミュータンス菌陽性の患者由来の試料であれば、前記核酸溶液には、増幅対象
のＲＮＡが含まれる。その核酸溶液と前記基質試薬の溶液を混合する。その混合溶液に、
塩化カリウムやＤＭＳＯを含む前記２種類のプライマー試薬の溶液を添加する。その後、
酵素試薬を添加して反応させる。
のＲＮＡが含まれる。その核酸溶液と前記基質試薬の溶液を混合する。その混合溶液に、
塩化カリウムやＤＭＳＯを含む前記２種類のプライマー試薬の溶液を添加する。その後、
酵素試薬を添加して反応させる。
【0035】
検体試料由来の核酸溶液と基質試薬とプライマー溶液と有機溶媒の混合試料を５分程度の一定時間、４１℃などの一定温度で保持した後、酵素試薬を添加して、核酸伸長反応と増幅反応を開始させる。
一定温度で６０分程度の一定時間保持すれば、検体にミュータンス菌が内在していれば、ミュータンス菌の増幅対象の遺伝子由来のＲＮＡを増幅することができる。
一定温度で６０分程度の一定時間保持すれば、検体にミュータンス菌が内在していれば、ミュータンス菌の増幅対象の遺伝子由来のＲＮＡを増幅することができる。
【0036】
増幅したＲＮＡの確認は、アガロースゲル電気泳動などの方法で、設計通りの分子サイズのＲＮＡが増幅されているかどうかを確認することができる。
リアルタイムＰＣＲや塩基配列分析操作で用いられている核酸の蛍光標識試薬の技術を
利用して、増幅ＲＮＡ量が増加することによる蛍光信号強度の増加を検出することによっても、増幅したＲＮＡの確認ができる。
あるいは、増幅ＲＮＡをメンブレンに転写固定して、ノーザンブロティングハイブリダイゼーションで検出確認してもよく、あるいは、核酸チップでのハイブリダイゼーションで検出してもよい。あるいは，増幅ＲＮＡに相補的な遺伝子を固相化した核酸クロマトグラフィー法により簡易に検出してもよい．
リアルタイムＰＣＲや塩基配列分析操作で用いられている核酸の蛍光標識試薬の技術を
利用して、増幅ＲＮＡ量が増加することによる蛍光信号強度の増加を検出することによっても、増幅したＲＮＡの確認ができる。
あるいは、増幅ＲＮＡをメンブレンに転写固定して、ノーザンブロティングハイブリダイゼーションで検出確認してもよく、あるいは、核酸チップでのハイブリダイゼーションで検出してもよい。あるいは，増幅ＲＮＡに相補的な遺伝子を固相化した核酸クロマトグラフィー法により簡易に検出してもよい．
【0037】
本発明のミュータンス菌検出方法は、ＲＮＡ増幅法を用いるため、温度の上げ下げは不要で反応温度を４１℃から４４℃と低い温度で診断することができるため、簡易で安価な装置により実施できる。また、装置がなくても反応させることができることから，病院以外にも家庭や職場などでミュータンス菌の検出が可能となる。
【実施例】
【0038】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【0039】
（標準ＲＮＡの調製）
ミュータンス菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ １６Ｓ ＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入したｐＥＴ２２ｂ－１６Ｓ（ＳＫ）（図１）をＥｃｏＲＩで切断し直鎖状ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写をＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。インビトロ転写反応物をＤＮａｓｅ Ｉで処理した後、プロパノール沈殿およびエタノール沈殿によりＲＮＡを精製し、標準ＲＮＡとして以下の実験に用いた。図２は、ｐＥＴ２２ｂ－１６Ｓ（ＳＫ）をＥｃｏＲＩで切断した直鎖状ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写して得た標準ＲＮＡの２％アガロース電気泳動結果を示す写真である。図２中の矢印で示した部分に精製ＲＮＡのバンドが出現している。
ミュータンス菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ １６Ｓ ＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入したｐＥＴ２２ｂ－１６Ｓ（ＳＫ）（図１）をＥｃｏＲＩで切断し直鎖状ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写をＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。インビトロ転写反応物をＤＮａｓｅ Ｉで処理した後、プロパノール沈殿およびエタノール沈殿によりＲＮＡを精製し、標準ＲＮＡとして以下の実験に用いた。図２は、ｐＥＴ２２ｂ－１６Ｓ（ＳＫ）をＥｃｏＲＩで切断した直鎖状ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写して得た標準ＲＮＡの２％アガロース電気泳動結果を示す写真である。図２中の矢印で示した部分に精製ＲＮＡのバンドが出現している。
【0040】
（反応試薬）
下記（ａ）～（ｃ）の試薬を調製した。
（ａ）基質試薬
水：２５．９μＬ
１Ｍ ＭｇＣｌ２：５．６μＬ
１．９Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．６）：１９．８μＬ
４０Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ）０．６μＬ
１００ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ） ３．３μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ３３．０μＬ
５８ｍＭ ＮＴＰ １７．１μＬ
２５０ｍＭ ＩＴＰ ４．８μＬ
（ｂ）プライマー試薬
プライマー試薬は表１に示す４種類の第一のプライマーのいずれかと４種類の第二のプライマーのいずれかの１６種類の組合せ（組合せ番号１－１６）を調製した．
水：３２．５μＬ
２Ｍ ＫＣｌ：２１．５μＬ
５０μＭ フォワードプライマー（配列番号：２～５のいずれか）：６．６μＬ
５０μＭ プロモータリバースプライマー（配列番号：６～９のいずれか）：６．６μＬ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：４２．９μＬ
（ｃ）酵素試薬
１０ｍｇ／μＬ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：４．０μＬ
２０，０００ｕｎｉｔｓ／μＬ ＡＭＶ－００７（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）：４．４μＬ
６０％ソルビトール：１１．１μＬ
Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ：３１．２μＬ
下記（ａ）～（ｃ）の試薬を調製した。
（ａ）基質試薬
水：２５．９μＬ
１Ｍ ＭｇＣｌ２：５．６μＬ
１．９Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．６）：１９．８μＬ
４０Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ）０．６μＬ
１００ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ） ３．３μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ３３．０μＬ
５８ｍＭ ＮＴＰ １７．１μＬ
２５０ｍＭ ＩＴＰ ４．８μＬ
（ｂ）プライマー試薬
プライマー試薬は表１に示す４種類の第一のプライマーのいずれかと４種類の第二のプライマーのいずれかの１６種類の組合せ（組合せ番号１－１６）を調製した．
水：３２．５μＬ
２Ｍ ＫＣｌ：２１．５μＬ
５０μＭ フォワードプライマー（配列番号：２～５のいずれか）：６．６μＬ
５０μＭ プロモータリバースプライマー（配列番号：６～９のいずれか）：６．６μＬ
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：４２．９μＬ
（ｃ）酵素試薬
１０ｍｇ／μＬ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：４．０μＬ
２０，０００ｕｎｉｔｓ／μＬ ＡＭＶ－００７（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）：４．４μＬ
６０％ソルビトール：１１．１μＬ
Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ：３１．２μＬ
【0041】
（実施例１）
前記標準ＲＮＡと前記反応試薬を用いて，前記ＲＮＡ増幅反応を下記（１）～（４）の手順で行った。
（１）１×１０１０コピー／μＬの標準ＲＮＡ溶液（２．５μＬ）、基質試薬（５．０μＬ）、プライマー試薬（５．０μＬ）の混合物を６５℃で５分間保温後、４１℃で５分間保温した。
（２）これに酵素試薬２．５μＬを加え、４１℃で６０分間保温した。
（３）反応後、反応液にＬｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２％アガロース電気泳動にかけた（１００Ｖで４０分間、泳動バッファーはＴＡＥ）。
（４）ゲルを１μｇ／μＬの臭化エチヂウムで染色した後、トランスイリミネータでバンドを解析した。
前記標準ＲＮＡと前記反応試薬を用いて，前記ＲＮＡ増幅反応を下記（１）～（４）の手順で行った。
（１）１×１０１０コピー／μＬの標準ＲＮＡ溶液（２．５μＬ）、基質試薬（５．０μＬ）、プライマー試薬（５．０μＬ）の混合物を６５℃で５分間保温後、４１℃で５分間保温した。
（２）これに酵素試薬２．５μＬを加え、４１℃で６０分間保温した。
（３）反応後、反応液にＬｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２％アガロース電気泳動にかけた（１００Ｖで４０分間、泳動バッファーはＴＡＥ）。
（４）ゲルを１μｇ／μＬの臭化エチヂウムで染色した後、トランスイリミネータでバンドを解析した。
【0042】
【0043】
（実施例２）
実施例１で得られた結果で、よりバンドの濃い結果を示した３、６、１１、１２の組み合わせについて更に検討を行った．
実施例１に記載したのと同じ試薬を用いて実施例１と同様のＲＮＡ増幅反応を手順（２）における保温時間について条件を変更して、保温時間の影響について検討を行った。保温時間は、０、１５、３０、４５、６０分間の５条件で検討した。
反応物の解析の結果を示す写真を図４に示す。図４中の矢印はＲＮＡ増幅産物の位置を示す。組み合わせ番号６、１１及び１２では、反応時間１５分で確認できるバンドが出現しており、短時間でミュータンス菌の検出が可能であることがわかった。その中でも。組合せ番号６では他の組み合わせよりも濃いバンドが見られ、最も良い組み合わせである。
実施例１で得られた結果で、よりバンドの濃い結果を示した３、６、１１、１２の組み合わせについて更に検討を行った．
実施例１に記載したのと同じ試薬を用いて実施例１と同様のＲＮＡ増幅反応を手順（２）における保温時間について条件を変更して、保温時間の影響について検討を行った。保温時間は、０、１５、３０、４５、６０分間の５条件で検討した。
反応物の解析の結果を示す写真を図４に示す。図４中の矢印はＲＮＡ増幅産物の位置を示す。組み合わせ番号６、１１及び１２では、反応時間１５分で確認できるバンドが出現しており、短時間でミュータンス菌の検出が可能であることがわかった。その中でも。組合せ番号６では他の組み合わせよりも濃いバンドが見られ、最も良い組み合わせである。
【0044】
（実施例３）
標準ＲＮＡ溶液の種類を下記（ａ）～（ｆ）として、実施例１に記載したのと同じ基質試薬、表１の組合せ番号６のプライマー試薬を用いて、実施例１と同様のＲＮＡ増幅反応を実施例１の手順（２）における保温時間を１０分間に変更して行った。
（ａ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）のＲＮＡ
（ｂ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ（好酸性乳酸桿菌）のＲＮＡ
（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（乳酸菌）のＲＮＡ
（ｄ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス菌）のＲＮＡ
（ｅ）１×１０１０コピー／μＬの標準ＲＮＡ
（ｆ）水
標準ＲＮＡ溶液の種類を下記（ａ）～（ｆ）として、実施例１に記載したのと同じ基質試薬、表１の組合せ番号６のプライマー試薬を用いて、実施例１と同様のＲＮＡ増幅反応を実施例１の手順（２）における保温時間を１０分間に変更して行った。
（ａ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）のＲＮＡ
（ｂ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ（好酸性乳酸桿菌）のＲＮＡ
（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（乳酸菌）のＲＮＡ
（ｄ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス菌）のＲＮＡ
（ｅ）１×１０１０コピー／μＬの標準ＲＮＡ
（ｆ）水
【0045】
反応物の解析の結果を示す写真を図５に示す。
図５中のレーンｇには、標準ＲＮＡ溶液の種類を（ｆ）水として、上記プライマー試薬の代わりに水を用いて反応を行ったものをアプライした。
また、図５中の矢印はＲＮＡ増幅産物の位置を示す。
図５に示す結果から、ミュータンス菌ＲＮＡと標準ＲＮＡでは増幅バンドが見られたが、大腸菌ＲＮＡ、好酸性乳酸桿菌ＲＮＡ、乳酸菌ＲＮＡでは見られなかった。このことから本ＲＮＡ増幅系がミュータンス菌ＲＮＡを特異的に検出することが示された。
図５中のレーンｇには、標準ＲＮＡ溶液の種類を（ｆ）水として、上記プライマー試薬の代わりに水を用いて反応を行ったものをアプライした。
また、図５中の矢印はＲＮＡ増幅産物の位置を示す。
図５に示す結果から、ミュータンス菌ＲＮＡと標準ＲＮＡでは増幅バンドが見られたが、大腸菌ＲＮＡ、好酸性乳酸桿菌ＲＮＡ、乳酸菌ＲＮＡでは見られなかった。このことから本ＲＮＡ増幅系がミュータンス菌ＲＮＡを特異的に検出することが示された。
【配列表フリーテキスト】
【0046】
配列番号：１は、ミュータンス菌の１６Ｓリボソームの配列である。
配列番号：２は、ＳＭ－Ｆ１の配列である。
配列番号：３は、ＳＭ－Ｆ２の配列である。
配列番号：４は、ＳＭ－Ｆ３の配列である。
配列番号：５は、ＳＭ－Ｆ４の配列である。
配列番号：６は、ＳＭ－ＰＲ１の配列である。
配列番号：７は、ＳＭ－ＰＲ２の配列である。
配列番号：８は、ＳＭ－ＰＲ３の配列である。
配列番号：９は、ＳＭ－ＰＲ４の配列である。
配列番号：２は、ＳＭ－Ｆ１の配列である。
配列番号：３は、ＳＭ－Ｆ２の配列である。
配列番号：４は、ＳＭ－Ｆ３の配列である。
配列番号：５は、ＳＭ－Ｆ４の配列である。
配列番号：６は、ＳＭ－ＰＲ１の配列である。
配列番号：７は、ＳＭ－ＰＲ２の配列である。
配列番号：８は、ＳＭ－ＰＲ３の配列である。
配列番号：９は、ＳＭ－ＰＲ４の配列である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】