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特許7191690Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療するための試薬及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-09
(45)【発行日】2022-12-19
(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療するための試薬及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20221212BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221212BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221212BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221212BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221212BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20221212BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221212BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 ZNA
A61K31/7105
A61K35/76
A61K48/00
A61P1/16
A61P31/20
C12N15/63
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2018509947
(86)(22)【出願日】2016-05-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-06-14
(86)【国際出願番号】 AU2016050340
(87)【国際公開番号】W WO2016176745
(87)【国際公開日】2016-11-10
【審査請求日】2019-05-07
【審判番号】
【審判請求日】2021-08-06
(31)【優先権主張番号】2015901617
(32)【優先日】2015-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(31)【優先権主張番号】62/319,971
(32)【優先日】2016-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517385092
【氏名又は名称】ベニテック バイオファーマ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マオ，ティン
(72)【発明者】
【氏名】カオ，シー－チュー
(72)【発明者】
【氏名】シュイ，デビッド
(72)【発明者】
【氏名】グラハム，マイケル
【合議体】
【審判長】冨永 みどり
【審判官】森井 隆信
【審判官】馬場 亮人
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／１５９１０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／０５５３６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１０９７９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５０７９３３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００
ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の核酸を含むＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトであって、（ａ）配列番号４に示す配列によってコードされるＲＮＡ転写物に相補的であるか、または１、２、３もしくは４塩基のミスマッチを除いて配列番号４に示す配列によってコードされるＲＮＡ転写物に相補的である少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列を含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む第１の核酸；
（ｂ）配列番号９に示す配列によってコードされるＲＮＡ転写物に相補的であるか、または１、２、３もしくは４塩基のミスマッチを除いて配列番号９に示す配列によってコードされるＲＮＡ転写物に相補的である少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号５８に示す配列によってコードされるＲＮＡ転写物に相補的であるか、または１、２、３もしくは４塩基のミスマッチを除いて配列番号５８に示す配列によってコードされるＲＮＡ転写物に相補的である少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第３の核酸
を含む、
前記ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
【請求項2】
第１の核酸が、配列番号２８に示す配列に相補的であるか、または１、２、３もしくは４塩基のミスマッチを除いて配列番号２８に示す配列に相補的であるエフェクター配列であって、ただし配列番号２８に示す配列とデュプレックスを形成できるエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項3】
第１の核酸が、配列番号２８に示す配列に相補的であるエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項4】
第１の核酸が、配列番号２７に示すエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項5】
第１の核酸が、配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項6】
第２の核酸が、配列番号４８に示す配列に相補的であるか、または１、２、３もしくは４塩基のミスマッチを除いて配列番号４８に示す配列に相補的であるエフェクター配列であって、ただし配列番号４８に示す配列とデュプレックスを形成できるエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項7】
第２の核酸が、配列番号４８に示す配列に相補的であるエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項8】
第２の核酸が、配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項9】
第３の核酸が、配列番号５８に示す配列に相補的であるエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項10】
第３の核酸が、配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項11】
（ａ）配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、第１の核酸；（ｂ）配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、第３の核酸
を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項12】
（ａ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸；（ｂ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸
を含む、請求項１１に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項13】
ｓｈＲＮＡをコードする各核酸の上流にＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含んでいる、請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項14】
前記または各ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターから選択される、請求項１３に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
【請求項15】
請求項１～請求項１４のいずれか１項に記載されるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる、発現ベクター。
【請求項16】
（ｉ）前記発現ベクターは、プラスミドまたは小環であり、または（ｉｉ）前記発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群より選択されるウイルスベクターであり、
任意選択で、前記発現ベクターは、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマーと複合体をなしている、
請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項17】
（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクター、ならびに（ｉｉ）１種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項18】
対象のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療する方法に使用するための医薬組成物であって、（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクター、ならびに（ｉｉ）１種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項19】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を患う対象において１種以上のＨＢＶ遺伝子の発現を低下させる方法に使用するための医薬組成物であって、（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクター、ならびに（ｉｉ）１種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項20】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を患う対象のＨＢＶウイルス負荷を低下させる方法に使用するための医薬組成物であって、（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクター、ならびに（ｉｉ）１種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項21】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を患う対象のＨＢＶ感染に関連する１つ以上の症状の重症度を軽減する方法に使用するための医薬組成物であって、（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクター、ならびに（ｉｉ）１種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項22】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を患う対象のＨＢＶの感染力を低下させる方法に使用するための医薬組成物であって、（ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または請求項１５もしくは１６に記載の発現ベクター、ならびに（ｉｉ）１種以上の製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項23】
前記対象は、急性ＨＢＶ感染を患っている、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項24】
前記対象は、慢性ＨＢＶ感染を患っている、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０１５年５月６日出願の豪州特許仮出願第２０１５９０１６１７号及び２０１６年４月８日出願の米国特許仮出願第６２／３１９，９７１号の優先権を主張し、それらの内容を参照としてすべて本明細書に援用する。
本願は、２０１５年５月６日出願の豪州特許仮出願第２０１５９０１６１７号及び２０１６年４月８日出願の米国特許仮出願第６２／３１９，９７１号の優先権を主張し、それらの内容を参照としてすべて本明細書に援用する。
【0002】
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬、これを含む組成物、及びＨＢＶに感染した個体を治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ＨＢＶは深刻かつ一般的な感染性の肝疾患であり、世界的に多数の人が影響を受けている。ＨＢＶは、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科に属する肝臓指向性ＤＮＡウイルスである。このウイルスゲノムの全長は約３．２ｋｂであり、表面抗原（「Ｓ遺伝子」）、コア抗原（「Ｃ遺伝子」）、ＤＮＡポリメラーゼ（「Ｐ遺伝子」）、及び機能が未解明の「Ｘ遺伝子」と呼ばれる遺伝子の４つのオープン読み枠（ＯＲＦ）を有する。世界中で２０億人を上回る人が一生のうちどこかの時点でＨＢＶに感染しているが、そのうち約３億５千万～４億人が持続感染しウイルスのキャリアとなっている。ＨＢＶ感染が原因で急性Ｂ型肝炎や慢性Ｂ型肝炎が生じることがあり、やがて慢性肝不全、肝硬変、肝細胞癌を発症することもある。さらに、ＨＢＶキャリアはこの疾患を長年にわたり伝染させる可能性もある。慢性のＨＢＶ感染者、すなわちキャリアが肝細胞癌を発症するリスクは非キャリアよりも少なくとも１２倍は高く、ＨＢＶは世界の原発肝臓癌の原因の６０～８０％を占めている。その結果、ＨＢＶは、既知のヒト発癌物質としてはタバコに次いで第二位に位置している。
【0004】
ＨＢＶにはワクチンがあるが、人口におけるＨＢＶ感染率は依然として高い。さらに、現在の慢性ＨＢＶ感染の諸治療法では、慢性的に感染している患者の大多数において、ウイルス遺伝子の発現と複製の阻害に限られた効果しかない。慢性ＨＢＶ感染の既存の治療法には、ウイルスが薬剤耐性になるという制限もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
これらの理由から、ＨＢＶ感染の新治療剤が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、ＨＢＶ感染の治療及び／または予防のための既存のワクチン及び治療剤は、たとえばウイルスに薬剤耐性ができるせいで長期治療を要する場合及び／またはＨＢＶの種々の遺伝子型によって奏功性にばらつきがある場合など、その有効性が限られている、という認識に一部基づくものである。本開示は、ＨＢＶゲノムによって生産されるＲＮＡ転写物の保存領域、すなわち複数の異なるＨＢＶ遺伝子型間で保存されている１つ以上の領域を標的とするＲＮＡｉ試薬を提供する。発明者らは、これらのＲＮＡｉ試薬がＨＢＶに感染した細胞内でのＨＢＶ遺伝子、たとえばＨＢＶ ｐｏｌ遺伝子の発現の阻害に有効であることを示している。たとえば、本開示の例示的ＲＮＡｉ試薬は、活性ＨＢＶを有するＨｅｐＧ２．２．１５細胞においてＨＢＶ遺伝子転写物の発現を阻害または低下させることを示している。また、本開示の例示的ＲＮＡｉ試薬は、ＨＢＶを接種したヒト肝細胞やＨＢＶに感染したＰＸＢキメラマウスにおいてＨＢＶ遺伝子転写物の発現を阻害または低下させ、細胞内及び細胞外ＨＢＶ ＤＮＡを減少させ、ＨＢＶ共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を減少させることも示している。発明者らのこのような知見は、ＨＢＶによる核酸の発現及び／またはタンパク質の発現を阻害または低下させる新規の化合物、及びそのような化合物の使用、たとえば対象のＨＢＶ感染を治療することを提供するものである。
【0007】
したがって、本開示は、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むＲＮＡを提供し、該エフェクター配列はＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、該領域は配列番号１～１０のいずれかに示す配列を含んでいる。たとえば、エフェクター配列は、３０ヌクレオチド長よりも短い。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0008】
このエフェクター配列は、これがほぼ相補的である配列番号１～１０のいずれかに示す配列に対する４塩基対のミスマッチを含むことができる。別の例では、このエフェクター配列は、これがほぼ相補的である配列番号１～１０のいずれかに示す配列に対する３塩基対のミスマッチを含んでいる。別の例では、このエフェクター配列は、これがほぼ相補的である配列番号１～１０のいずれかに示す配列に対する２塩基対のミスマッチを含んでいる。別の例では、このエフェクター配列は、これがほぼ相補的である配列番号１～１０のいずれかに示す配列に対する１塩基対のミスマッチを含んでいる。さらに別の例では、このエフェクター配列は、配列番号１～１０のいずれかに示す配列内の同じ長さの領域に１００％相補的である。
【0009】
一例では、ＲＮＡは、以下からなる群より選択することができる：
（ｉ）配列番号１２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号５０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号５０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
（ｉ）配列番号５２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号５２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ。
（ｉ）配列番号１２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号１８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号２８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号２８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号３８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号３８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４４に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４４に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４６に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４６に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号４８に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号４８に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
（ｉ）配列番号５０に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号５０に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
（ｉ）配列番号５２に示す配列に相補的なエフェクター配列であって、配列番号５２に示す配列とデュプレックスを形成できるならば１、２、３または４塩基のミスマッチを有していてもよい、エフェクター配列；及び（ｉｉ）該エフェクター配列にほぼ相補的な配列を含むエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ。
【0010】
別の例では、ＲＮＡは、以下からなる群より選択することができる：
配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号１９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号２９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号３９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号４９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ。
配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号１９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号２９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号３９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４３に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４５に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４７に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号４９に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５１に示す該配列にほぼ相補的であり該配列とデュプレックスを形成できるエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ。
【0011】
たとえば、本開示のあるＲＮＡのあるエフェクター相補配列は、同種のエフェクター配列とエフェクター相補配列とでデュプレックスを形成できるならば、対応するエフェクター配列に対し１つ、２つ、３つまたは４つのミスマッチを有することができる。
【0012】
別の例では、ＲＮＡは、以下からなる群より選択することができる：
配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号２０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号３０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号４０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号５０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ。
配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号２０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号３０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号４０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号５０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ。
【0013】
一例では、ＲＮＡは、ＲＮＡｉ試薬である。
【0014】
本開示のＲＮＡは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として提供することができる。本開示のＲＮＡがｓｈＲＮＡとして提供されるとき、エフェクター配列とエフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含むことができる。好適なループ配列は、当業界で既知のものから選択することができる。たとえば、本開示によるｓｈＲＮＡは、配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むことができる。
【0015】
あるいは、本開示のＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）デュプレックスまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として提供することができる。
【0016】
当業者であれば、本開示によるＲＮＡを他のＨＢＶ治療剤と併用でまたは組み合わせて使用できることを理解しよう。したがって、本開示は、１種以上の他のＨＢＶ治療剤と併用される、本明細書で説明するＲＮＡを提供する。一例では、
（ａ）本明細書で説明する少なくとも１つのＲＮＡ；及び
（ｂ）
（ｉ）本明細書で説明するＲＮＡと同じＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含む、複数のＲＮＡが提供され、
（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含んでいる。
（ａ）本明細書で説明する少なくとも１つのＲＮＡ；及び
（ｂ）
（ｉ）本明細書で説明するＲＮＡと同じＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含む、複数のＲＮＡが提供され、
（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含んでいる。
【0017】
一例では、本開示の複数のＲＮＡは、
（ａ）
配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号２０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号３０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号４０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号５０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される少なくとも１つのＲＮＡ：ならびに
（ｂ）
（ｉ）（ａ）に記載の群から選択されるＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含み、
（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含んでいる。
（ａ）
配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号２０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号３０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号４０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号５０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される少なくとも１つのＲＮＡ：ならびに
（ｂ）
（ｉ）（ａ）に記載の群から選択されるＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含み、
（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含んでいる。
【0018】
たとえば、配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的なエフェクター配列は、３０ヌクレオチド長よりも短くなる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0019】
本開示による複数のＲＮＡには、２つのＲＮＡ、３つのＲＮＡ、４つのＲＮＡ、５つのＲＮＡ、６つのＲＮＡ、７つのＲＮＡ、８つのＲＮＡ、９つのＲＮＡ、または１０のＲＮＡなど、最大１０のＲＮＡが含まれる場合もある。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの２つが含まれる。別の例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの３つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの４つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの５つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの６つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの７つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの８つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの９つが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明するＲＮＡのうちの１０が含まれる。
【0020】
一例では、本明細書で説明する複数のＲＮＡは、一組成物中に提供される。
【0021】
別の例では、本明細書で説明する複数のＲＮＡは、複数の組成物として提供される。たとえば、複数のＲＮＡはそれぞれ、別々に提供される場合もある。あるいは、複数のＲＮＡのうち、少なくとも１つのＲＮＡは別に提供され、２つ以上のＲＮＡは一緒に組成物中に提供される場合もある。
【0022】
本明細書で説明するように、配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的なエフェクター配列を含むＲＮＡは、
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡからなる群より選択することができる。
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡからなる群より選択することができる。
【0023】
本明細書で説明する複数のＲＮＡのうちの少なくとも１つまたはその各々は、ｓｈＲＮＡとして存在することができる。たとえば、本開示は、複数のｓｈＲＮＡを提供することができる。したがって、複数のＲＮＡのうちの１つ以上は、対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含むことができる。好適なループ配列は、当業界で既知のものから選択することができる。あるいは、好適なステムループを新たに開発してもよい。
【0024】
一例では、本開示による複数のＲＮＡは、
（ａ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡである少なくとも１つのＲＮＡ；及び
（ｂ）
（ｉ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡであるＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡであるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含むことができ、
（ａ）のｓｈＲＮＡと（ｂ）のｓｈＲＮＡは異なっている。
（ａ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡである少なくとも１つのＲＮＡ；及び
（ｂ）
（ｉ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡであるＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡであるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含むことができ、
（ａ）のｓｈＲＮＡと（ｂ）のｓｈＲＮＡは異なっている。
【0025】
本開示は、本明細書で示す１つ以上のＲＮＡをコードする配列を含む核酸も提供する。一例では、該核酸は、ＤＮＡ配列を含む。一例では、該核酸はＤＮＡである。
【0026】
本開示はまた、
（ａ）本明細書で説明するＲＮＡをコードする配列を含む第１の核酸；及び
（ｂ）第２の核酸であって、
（ｉ）本明細書で説明するＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択されるＲＮＡをコードする配列を含む第２の核酸
を含む複数の核酸を提供し、
該第１の核酸によってコードされるＲＮＡと該第２の核酸によってコードされるＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含んでいる。たとえば、該第２の核酸によってコードされるＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含んでいる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
（ａ）本明細書で説明するＲＮＡをコードする配列を含む第１の核酸；及び
（ｂ）第２の核酸であって、
（ｉ）本明細書で説明するＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択されるＲＮＡをコードする配列を含む第２の核酸
を含む複数の核酸を提供し、
該第１の核酸によってコードされるＲＮＡと該第２の核酸によってコードされるＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含んでいる。たとえば、該第２の核酸によってコードされるＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含んでいる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0027】
一例では、第１の核酸と第２の核酸は、同じポリヌクレオチドの別々の部分を形成する（すなわち、連続する共有結合ヌクレオチド残基）。別の例では、第１の核酸と第２の核酸は、別のポリヌクレオチドの部分を形成する。
【0028】
本明細書で説明するように、配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的なエフェクター配列を含むＲＮＡは、
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択することができる。
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択することができる。
【0029】
一例では、１種以上の核酸がｓｈＲＮＡをコードする。たとえば、各核酸はｓｈＲＮＡをコードする。一例では、該または各核酸は、エフェクター配列とエフェクター相補配列の間に配置されたループ配列もコードする。好適なループ配列は、当業者には明らかになり、かつ／または本明細書で説明される。
【0030】
一例では、複数の核酸は、
（ａ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含む第１の核酸；及び
（ｂ）第２の核酸であって、
（ｉ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ
から選択されるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む第２の核酸
を含み、
該第１の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡと該第２の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡは異なっている。
（ａ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含む第１の核酸；及び
（ｂ）第２の核酸であって、
（ｉ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ
から選択されるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む第２の核酸
を含み、
該第１の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡと該第２の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡは異なっている。
【0031】
本開示による該または各核酸は、１つ以上の転写終結配列を含むかまたはそれと機能的に連結されている場合もある。たとえば、該または各核酸は、ＲＮＡをコードする配列の３’末端に転写終結（ターミネーター）配列を含むことができる。そのような配列は、当業者には明らかであろうが、『ＴＴＴＴＴ』または『ＴＴＴＴＴＴ』を含むことができる。
【0032】
あるいは、またはさらに、本開示による該または各核酸は、転写開始配列を含むかまたはそれと機能的に連結されている場合もある。たとえば、該または各核酸は、ＲＮＡをコードする配列の５’末端に転写開始（イニシエーター）配列を含むことができる。そのような配列は、当業者には明らかであろうが、『Ｇ』を含むことができる。
【0033】
あるいは、またはさらに、本開示による該または各核酸は、たとえば核酸（複数可）をクローン化してクローニング・ベクターまたは発現ベクターにするのを容易にするために、１つ以上の制限部位を含むことができる。たとえば、本明細書で説明する核酸は、本開示のＲＮＡをコードする配列の上流及び／または下流に制限部位を含むことができる。好適な制限酵素認識配列は当業者には明らかであろう。しかし、一例では、本開示の核酸（複数可）は、ＲＮＡをコードする配列の５’末端すなわち上流にＢａｍＨ１制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）を、ＲＮＡをコードする配列の３’末端すなわち下流にＥｃｏＲ１制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含むことができる。
【0034】
本開示による核酸は、該核酸によってコードされる本開示の１つ以上のＲＮＡを発現できるＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトとして、またはそれに含めて提供することもできる。この点で、本開示の核酸を含む１つ以上のｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供される。
【0035】
別の例では、本明細書で説明するｓｈＲＮＡをそれぞれがコードする複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、
（ａ）該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つが、本明細書で説明する複数の核酸のうちの第１の核酸を含み；かつ
（ｂ）該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つが、本明細書で説明する複数の核酸のうちの第２の核酸を含み、
該第１の核酸と該第２の核酸は互いに異なっている。
（ａ）該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つが、本明細書で説明する複数の核酸のうちの第１の核酸を含み；かつ
（ｂ）該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つが、本明細書で説明する複数の核酸のうちの第２の核酸を含み、
該第１の核酸と該第２の核酸は互いに異なっている。
【0036】
さらに別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは少なくとも２つのｓｈＲＮＡをコードし、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含む第１のｓｈＲＮＡをコードする核酸；及び
（ｂ）第２のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸であって、該第２のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物の領域にほぼ相補的である、核酸
を含み、
該第１のｓｈＲＮＡと該第２のｓｈＲＮＡは異なっている。
（ａ）配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含む第１のｓｈＲＮＡをコードする核酸；及び
（ｂ）第２のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸であって、該第２のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物の領域にほぼ相補的である、核酸
を含み、
該第１のｓｈＲＮＡと該第２のｓｈＲＮＡは異なっている。
【0037】
たとえば、第２のｓｈＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含んでいる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0038】
一例では、少なくとも２つのｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書で説明する複数の核酸を含んでいる。
【0039】
さらに別の例では、少なくとも２つのｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、第３のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含み、該第３のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物のある領域にほぼ相補的であり、該第３のｓｈＲＮＡは該第１のｓｈＲＮＡとも該第２のｓｈＲＮＡとも異なっている。
【0040】
たとえば、第３のｓｈＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含んでいる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0041】
本開示の一例示的形態では、第３のｓｈＲＮＡをコードしている核酸は、本明細書で説明する複数の核酸のいずれかの核酸から選択される核酸である。
【0042】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの一例には、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸：
（ｂ）本明細書で説明する複数の核酸のいずれかの核酸から選択される核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸
が含まれ、
（ｂ）の核酸は、（ａ）の核酸及び（ｃ）の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡとは異なるｓｈＲＮＡをコードする。
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸：
（ｂ）本明細書で説明する複数の核酸のいずれかの核酸から選択される核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸
が含まれ、
（ｂ）の核酸は、（ａ）の核酸及び（ｃ）の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡとは異なるｓｈＲＮＡをコードする。
【0043】
別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
【0044】
さらに別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
【0045】
本開示の一例示的ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’の方向に、
（ａ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
（ａ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
【0046】
本開示のさらなる例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’の方向に、
（ａ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
（ａ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
【0047】
一例では、本明細書で説明するｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本開示のｓｈＲＮＡをコードする該または各核酸に機能的に連結された１つのプロモーターを含んでいる。
【0048】
別の例では、本開示のｓｈＲＮＡをコードする各核酸は、別のプロモーターに機能的に連結されている。たとえば、プロモーター（複数可）は、ｓｈＲＮＡ（複数可）をそれぞれコードする核酸（複数可）の上流に配置されている。複数のプロモーターを含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトでは、これらのプロモーターは同じでも異なっていてもよい。例示的なプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター系のたとえばＵ６及びＨ１プロモーターなどである。
【0049】
３つのｓｈＲＮＡをコードする、それぞれ別のプロモーターに連結されている核酸を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトの一例では、核酸のうちの２つは同種のプロモーターに連結されているが、第３の核酸は異なるプロモーターに連結されている。たとえば、上述のｓｈＲＮＡをコードする３つの核酸を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトの場合、第１の核酸と第３の核酸は別の同種のプロモーターに連結され、第２の核酸は異なるプロモーターに連結されている。
【0050】
３つのｓｈＲＮＡをコードする、それぞれ別のプロモーターに連結されている核酸を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトの一例では、プロモーターはすべて同種である。
【0051】
本開示の一例示的ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’の方向に、
（ａ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
（ａ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
【0052】
本開示のさらなる例示的ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’の方向に、
（ａ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
（ａ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）Ｕ６プロモーターに機能的に連結された、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸を含んでいる。
【0053】
本開示は、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる発現ベクターも提供する。
【0054】
本開示は、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトをそれぞれが含んでいる複数の発現ベクターも提供する。たとえば、該複数の発現ベクターのうちの１つ以上が、本明細書で説明する複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる。別の例では、該複数の発現ベクターのそれぞれが、本明細書で説明する複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる。さらなる例では、該複数の発現ベクターのそれぞれが、本明細書で説明する１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる。この段落で述べたどの例でも、該複数の発現ベクターは本開示による複数のｓｈＲＮＡを集合的に発現することができる。
【0055】
一例では、該または各発現ベクターは、プラスミドまたは小環である。
【0056】
一例では、プラスミドまたは小環または発現ベクターまたはｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマーとの複合体である。
【0057】
別の例では、該または各発現ベクターは、ウイルスベクターである。たとえば、該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群より選択される。
【0058】
本開示は、本明細書で説明するｄｄＲＮＡｉコンストラクト及び／または発現ベクターを含む組成物も提供する。一例では、該組成物は、１種以上の製薬上許容される担体及び／または希釈剤も含むことができる。
【0059】
本開示は、対象のＨＢＶ感染を治療する方法も提供し、該方法は、本明細書で説明する治療有効量のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物を該対象に投与することを含む。
【0060】
本開示は、ＨＢＶ感染した対象のＨＢＶウイルス負荷を低下させる方法も提供し、該方法は、本明細書で説明する治療有効量のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物を該対象に投与することを含む。
【0061】
本開示は、ＨＢＶ感染に苦しむ対象のＨＢＶ関連の１つ以上の症状の重症度を軽減する方法も提供し、該方法は、本明細書で説明する治療有効量のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物を該対象に投与することを含む。
【0062】
本開示は、ＨＢＶに感染した対象のＨＢＶ感染力を低下させる方法も提供し、該方法は、本明細書で説明する治療有効量のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物を該対象に投与することを含む。
【0063】
本開示は、ＨＢＶ感染に苦しんでいる対象が慢性肝不全、肝硬変、及び／または肝細胞癌を発症するリスクを低下させる方法も提供し、該方法は、本明細書で説明する治療有効量のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物を該対象に投与することを含む。
【0064】
本明細書で説明するいずれの方法においても、一例では、対象は急性ＨＢＶ感染に苦しんでいる。あるいは、一例では、対象は慢性ＨＢＶ感染に苦しんでいる。
【0065】
一例では、本明細書で説明する方法は、対象におけるＨＢＶゲノムによってコードされる１つ以上の転写物の発現を阻害することを含む。
【0066】
一例では、本開示のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物が投与される対象は、ＨＢＶ感染のため既に別の治療剤の治療を受けている。たとえば、該対象及び／またはＨＢＶは、ＨＢＶ感染の治療で知られている他剤での治療に耐性または抵抗性がある。
【0067】
別の例では、本開示のＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物は、ＨＢＶ感染の治療で知られている別の治療剤すなわち補助治療剤と組み合わせて投与される。
【0068】
一例では、本開示の組成物はキットとして提供される。たとえば、本開示の組成物は、ＨＢＶ感染の治療で知られている１種以上の他の治療剤と一緒に梱包されている。そのような他の治療剤は、当業者には明らかであろう。別の例では、組成物は、本開示の方法の使用上の注意と一緒に梱包されている。
【0069】
本開示は、たとえば対象のＨＢＶ感染を治療するための及び／または本明細書で説明する方法でＨＢＶ感染を治療するための調製物または治療薬における、本明細書で説明するＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物の使用も提供する。一例では、対象は急性ＨＢＶ感染に苦しんでいる。ある代替例では、対象は慢性ＨＢＶ感染に苦しんでいる。
【0070】
本開示は、本明細書で説明するＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物の治療用途も提供する。たとえば、該ＲＮＡ、複数のＲＮＡ、核酸、複数の核酸、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、発現ベクター、複数の発現ベクター及び／または組成物を、対象のＨＢＶ感染を治療するため及び／または本明細書で説明する方法でＨＢＶ感染を治療するために使用することができる。対象は急性ＨＢＶ感染に苦しんでいる場合もある。ある代替例では、対象は慢性ＨＢＶ感染に苦しんでいる場合もある。
【0071】
本明細書で説明するどの例におけるＨＢＶ治療も、対象のＨＢＶウイルス負荷の低下、ＨＢＶ感染に関連する症状の重症度の軽減及び／または対象のＨＢＶ感染力の低下のうちの１つ以上を含むことができる。一例では、治療薬はこれが投与される対象においてＨＢＶ遺伝子転写産物を減少させることになる。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】ＨＢＶゲノムのマップ、及びｓｉＲＮＡ標的領域の位置を示す図である。内側の円はＨＢＶゲノムを表し、それらの周りのボックスは、記載のタンパク質コード配列を示し、外側の曲線矢印は、ＨＢＶ ｍＲＮＡを表す。表１に挙げた保存性の高い領域（領域１～領域１０）の位置と、表４のさらなるｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ３、８及び１１）が標的とする領域を破線で示す。
【図2】ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系における、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１５、及びｓｈＲＮＡ２７それぞれのアンチセンス配列及びセンス配列を有するｓｉＲＮＡのＨＢＶ阻害活性を例示する図である。
【図3】ＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２７及びｓｈＲＮＡ２７それぞれのアンチセンス配列及びセンス配列を有するｓｉＲＮＡがＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域からのＨＢＶ転写物を阻害する活性を例示する図である。
【図4】ポリメラーゼ遺伝子及びＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇそれぞれに対するＨＢＶ ｓｉＲＮＡの相対的な位置を例示する図である。
【図5a】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ１８、ｓｈＲＮＡ３５、ｓｈＲＮＡ３６、ｓｈＲＮＡ３９とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系においてルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図5b】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ１８、ｓｈＲＮＡ３５、ｓｈＲＮＡ３６、ｓｈＲＮＡ３９とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系においてルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図5c】ｓｈＲＮＡ５、ｓｈＲＮＡ６、ｓｈＲＮＡ７、ｓｈＲＮＡ８、ｓｈＲＮＡ３５、ｓｈＲＮＡ２６、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ４０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにおいてルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図5d】ｓｈＲＮＡ５、ｓｈＲＮＡ６、ｓｈＲＮＡ７、ｓｈＲＮＡ８、ｓｈＲＮＡ３５、ｓｈＲＮＡ２６、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ４０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにおいてルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図5e】ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１０、ｓｈＲＮＡ１１、ｓｈＲＮＡ１２、ｓｈＲＮＡ３３、ｓｈＲＮＡ３４、ｓｈＲＮＡ１９、ｓｈＲＮＡ２０、ｓｈＲＮＡ２３、ｓｈＲＮＡ２４とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにおいてルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図5f】ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１０、ｓｈＲＮＡ１１、ｓｈＲＮＡ１２、ｓｈＲＮＡ３３、ｓｈＲＮＡ３４、ｓｈＲＮＡ１９、ｓｈＲＮＡ２０、ｓｈＲＮＡ２３、ｓｈＲＮＡ２４とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにおいてルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6a】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6b】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6c】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6d】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6e】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6f】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6g】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6h】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6i】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図6j】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7a】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7b】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7c】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7d】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7e】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7f】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7g】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7h】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7i】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図7j】ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8a】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8b】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8c】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8d】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8e】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8f】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8g】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8h】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8i】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図8j】ＨＥＫ２９３細胞中、一定レベルのＤＮＡを細胞にトランスフェクションできるように非特異的フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図9a】ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１３、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ２０、ｓｈＲＮＡ２１、ｓｈＲＮＡ２２とされる各ｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図9b】ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１３、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ２０、ｓｈＲＮＡ２１、ｓｈＲＮＡ２２とされる各ｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系において、用量依存的にルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を例示する図である。
【図10】ＨＢＶ ＡｄＶを形質導入後の細胞１個当たりの発現ｓｈＲＮＡの数を決定するｑＰＣＲにより得られた標準曲線を示す図である。
【図11a】ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの、（ｉ）様々なＭＯＩで、それぞれのｓｈＲＮＡを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における発現のレベルを示す図である。
【図11b】ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの、（ｉ）様々なＭＯＩで、それぞれのｓｈＲＮＡを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における発現のレベルを示す図である。
【図11c】ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの、（ｉ）様々なＭＯＩで、それぞれのｓｈＲＮＡを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における発現のレベルを示す図である。
【図11d】ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの、（ｉ）様々なＭＯＩで、それぞれのｓｈＲＮＡを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを同時に形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における発現のレベルを示す図である。
【図12a】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域の、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図12b】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域の、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図12c】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域の、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図12d】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域の、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図12e】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域の、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図12f】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）様々なＭＯＩで、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡを発現する３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域の、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図13a】（ｉ）ＭＯＩ １００でｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７またはｓｈＲＮＡ２８それぞれを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現のレベルを示す図である。
【図13b】（ｉ）ＭＯＩ １００でｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７またはｓｈＲＮＡ２８それぞれを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現のレベルを示す図である。
【図13c】（ｉ）ＭＯＩ １００でｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７またはｓｈＲＮＡ２８それぞれを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現のレベルを示す図である。
【図13d】（ｉ）ＭＯＩ １００でｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７またはｓｈＲＮＡ２８それぞれを個別に発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；（ｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞；及び（ｉｉｉ）ＭＯＩ １００で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞における、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現のレベルを示す図である。
【図14a】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図14b】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図14c】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図14d】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図14e】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図14f】（ａ）ｓｈＲＮＡ１４を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｂ）ｓｈＲＮＡ１５を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｃ）ｓｈＲＮＡ３７を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｄ）ｓｈＲＮＡ２８を発現するＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；（ｅ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター；及び（ｆ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞中、ＧＡＰＤＨの発現に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを例示する図である。
【図15a】ＨＢＶ接種され、ＭＯＩ １０で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理されたヒト肝細胞に関する（ａ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現レベル；（ｂ）ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベル；（ｃ）細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのレベル；（ｄ）ＨＢＶ抗原ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対応する領域での細胞外ＨＢＶ転写物のレベル；及び（ｅ）ｃｃｃＤＮＡのレベルを示す図である。
【図15b】ＨＢＶ接種され、ＭＯＩ １０で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理されたヒト肝細胞に関する（ａ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現レベル；（ｂ）ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベル；（ｃ）細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのレベル；（ｄ）ＨＢＶ抗原ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対応する領域での細胞外ＨＢＶ転写物のレベル；及び（ｅ）ｃｃｃＤＮＡのレベルを示す図である。
【図15c】ＨＢＶ接種され、ＭＯＩ １０で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理されたヒト肝細胞に関する（ａ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現レベル；（ｂ）ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベル；（ｃ）細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのレベル；（ｄ）ＨＢＶ抗原ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対応する領域での細胞外ＨＢＶ転写物のレベル；及び（ｅ）ｃｃｃＤＮＡのレベルを示す図である。
【図15d】ＨＢＶ接種され、ＭＯＩ １０で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理されたヒト肝細胞に関する（ａ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現レベル；（ｂ）ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベル；（ｃ）細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのレベル；（ｄ）ＨＢＶ抗原ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対応する領域での細胞外ＨＢＶ転写物のレベル；及び（ｅ）ｃｃｃＤＮＡのレベルを示す図である。
【図15e】ＨＢＶ接種され、ＭＯＩ １０で、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる３つのｓｈＲＮＡを発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理されたヒト肝細胞に関する（ａ）ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡの発現レベル；（ｂ）ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベル；（ｃ）細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのレベル；（ｄ）ＨＢＶ抗原ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対応する領域での細胞外ＨＢＶ転写物のレベル；及び（ｅ）ｃｃｃＤＮＡのレベルを示す図である。
【図16】（ｉ）食塩水のみで処置した第１群（コントロール）、（ｉｉ）中用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第２群、及び（ｉｉｉ）高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第３群の動物における５６日間の細胞外ＨＢＶ ＤＮＡの血清レベル（Ｌｏｇ複製物／ｍＬで表す）を示すプロットである。
【図17】（ｉ）食塩水のみで処置した第１群（コントロール）、（ｉｉ）中用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第２群、及び（ｉｉｉ）高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第３群の動物における５６日間の細胞外ＨＢＶ ＤＮＡの血清レベル（複製物／ｍＬで表す）を示すプロットである。
【図18】（ｉ）食塩水のみで処置した第１群（コントロール）、（ｉｉ）中用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第２群、及び（ｉｉｉ）高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第３群の動物における５６日間のＨＢｓＡｇの血清レベル（ＩＵ／ｍＬ）を示すプロットである。
【図19】（ｉ）食塩水のみで処置した第１群（コントロール）、（ｉｉ）中用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第２群、及び（ｉｉｉ）高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第３群の動物における５６日間のＨＢｅＡｇの血清レベル（ＩＵ／ｍＬ）を示すプロットである。
【図20】（ｉ）食塩水のみで処置した第１群（コントロール）、（ｉｉ）中用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第２群、及び（ｉｉｉ）高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第３群の動物における処理後５６日目の細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ（細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ複製物／１００ｎｇ ＤＮＡ）のレベルを示す図である。この図は、コントロール食塩水処置に対し相対的な、中用量及び高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターによる細胞内ＨＢＶ ＤＮＡの阻害のレベルを例示する。
【図21】（ｉ）食塩水のみで処置した第１群（コントロール）、（ｉｉ）中用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第２群、及び（ｉｉｉ）高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処置した第３群の動物における処理後５６日目の細胞内ｃｃｃＤＮＡ（ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ複製物／１００ｎｇ ＤＮＡ）のレベルを示す図である。この図は、コントロール食塩水処置に対し相対的な、中用量及び高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターによるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの阻害のレベルを例示する。
【図22】中用量及び高用量のトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターでの処置後５６日目に、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターにより発現された各ｓｈＲＮＡ（それぞれｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７、及びｓｈＲＮＡ２８）に対応するＨＢＶウイルス転写物の阻害のレベルを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【0073】
配列表の一覧
配列番号１：領域１とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号２：領域２とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号３：領域３とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号４：領域４とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号５：領域５とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号６：領域６とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号７：領域７とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号８：領域８とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号９：領域９とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号１０：領域１０とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号１１：ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２：ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３：ｓｈＲＮＡ２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１４：ｓｈＲＮＡ２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１５：ｓｈＲＮＡ３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１６：ｓｈＲＮＡ３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１７：ｓｈＲＮＡ５及びｓｈＲＮＡ６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１８：ｓｈＲＮＡ５及びｓｈＲＮＡ６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１９：ｓｈＲＮＡ７及びｓｈＲＮＡ８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２０：ｓｈＲＮＡ７及びｓｈＲＮＡ８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２１：ｓｈＲＮＡ９及びｓｈＲＮＡ１０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２２：ｓｈＲＮＡ９及びｓｈＲＮＡ１０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２３：ｓｈＲＮＡ１１及びｓｈＲＮＡ１２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２４：ｓｈＲＮＡ１１及びｓｈＲＮＡ１２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２５：ｓｈＲＮＡ１３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２６：ｓｈＲＮＡ１３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列
配列番号２７：ｓｈＲＮＡ１４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２８：ｓｈＲＮＡ１４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列
配列番号２９：ｓｈＲＮＡ１５及びｓｈＲＮＡ１８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３０：ｓｈＲＮＡ１５及びｓｈＲＮＡ１８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３１：ｓｈＲＮＡ１６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３２：ｓｈＲＮＡ１６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３３：ｓｈＲＮＡ１７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３４：ｓｈＲＮＡ１７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３５：ｓｈＲＮＡ１９及びｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３６：ｓｈＲＮＡ１９及びｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３７：ｓｈＲＮＡ２１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３８：ｓｈＲＮＡ２１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３９：ｓｈＲＮＡ２２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４０：ｓｈＲＮＡ２２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４１：ｓｈＲＮＡ２３及びｓｈＲＮＡ２４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４２：ｓｈＲＮＡ２３及びｓｈＲＮＡ２４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４３：ｓｈＲＮＡ２５及びｓｈＲＮＡ２６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４４：ｓｈＲＮＡ２５及びｓｈＲＮＡ２６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４５：ｓｈＲＮＡ２７及びｓｈＲＮＡ３０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４６：ｓｈＲＮＡ２７及びｓｈＲＮＡ３０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４７：ｓｈＲＮＡ２８及びｓｈＲＮＡ３１とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４８：ｓｈＲＮＡ２８及びｓｈＲＮＡ３１とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４９：ｓｈＲＮＡ２９及びｓｈＲＮＡ３２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５０：ｓｈＲＮＡ２９及びｓｈＲＮＡ３２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５１：ｓｈＲＮＡ３３及びｓｈＲＮＡ３４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５２：ｓｈＲＮＡ３３及びｓｈＲＮＡ３４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５３：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５４：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５５：ｓｈＲＮＡ３６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５６：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５７：ｓｈＲＮＡ３７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５８：ｓｈＲＮＡ３７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５９：ｓｈＲＮＡ３８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６０：ｓｈＲＮＡ３８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６１：ｓｈＲＮＡ３９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６２：ｓｈＲＮＡ３９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６３：ｓｈＲＮＡ４０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６４：ｓｈＲＮＡ４０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６５：ｓｈＲＮＡ１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号６６：ｓｈＲＮＡ２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号６７：ｓｈＲＮＡ３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号６８：ｓｈＲＮＡ４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号６９：ｓｈＲＮＡ５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７０：ｓｈＲＮＡ６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７１：ｓｈＲＮＡ７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７２：ｓｈＲＮＡ８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７３：ｓｈＲＮＡ９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７４：ｓｈＲＮＡ１０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７５：ｓｈＲＮＡ１１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７６：ｓｈＲＮＡ１２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７７：ｓｈＲＮＡ１３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７８：ｓｈＲＮＡ１４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７９：ｓｈＲＮＡ１５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８０：ｓｈＲＮＡ１６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８１：ｓｈＲＮＡ１７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８２：ｓｈＲＮＡ１８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８３：ｓｈＲＮＡ１９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８４：ｓｈＲＮＡ２０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８５：ｓｈＲＮＡ２１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８６：ｓｈＲＮＡ２２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８７：ｓｈＲＮＡ２３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８８：ｓｈＲＮＡ２４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８９：ｓｈＲＮＡ２５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９０：ｓｈＲＮＡ２６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９１：ｓｈＲＮＡ２７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９２：ｓｈＲＮＡ２８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９３：ｓｈＲＮＡ２９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９４：ｓｈＲＮＡ３０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９５：ｓｈＲＮＡ３１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９６：ｓｈＲＮＡ３２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９７：ｓｈＲＮＡ３３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９８：ｓｈＲＮＡ３４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９９：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１００：ｓｈＲＮＡ３６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０１：ｓｈＲＮＡ３７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０２：ｓｈＲＮＡ３８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０３：ｓｈＲＮＡ３９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０４：ｓｈＲＮＡ４０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０５：ｐＢＬ１８３＿ＨＢＶ＿トリプル＿Ｖ２のＤＮＡ配列
配列番号１０６：ｐＢＬ１８３＿ＨＢＶ＿トリプル＿Ｖ１のＤＮＡ配列
配列番号１：領域１とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号２：領域２とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号３：領域３とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号４：領域４とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号５：領域５とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号６：領域６とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号７：領域７とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号８：領域８とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号９：領域９とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号１０：領域１０とされるＨＢＶゲノム内の標的領域のＤＮＡ配列。
配列番号１１：ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１２：ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１３：ｓｈＲＮＡ２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１４：ｓｈＲＮＡ２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１５：ｓｈＲＮＡ３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１６：ｓｈＲＮＡ３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１７：ｓｈＲＮＡ５及びｓｈＲＮＡ６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号１８：ｓｈＲＮＡ５及びｓｈＲＮＡ６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号１９：ｓｈＲＮＡ７及びｓｈＲＮＡ８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２０：ｓｈＲＮＡ７及びｓｈＲＮＡ８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２１：ｓｈＲＮＡ９及びｓｈＲＮＡ１０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２２：ｓｈＲＮＡ９及びｓｈＲＮＡ１０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２３：ｓｈＲＮＡ１１及びｓｈＲＮＡ１２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２４：ｓｈＲＮＡ１１及びｓｈＲＮＡ１２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号２５：ｓｈＲＮＡ１３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２６：ｓｈＲＮＡ１３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列
配列番号２７：ｓｈＲＮＡ１４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号２８：ｓｈＲＮＡ１４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列
配列番号２９：ｓｈＲＮＡ１５及びｓｈＲＮＡ１８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３０：ｓｈＲＮＡ１５及びｓｈＲＮＡ１８とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３１：ｓｈＲＮＡ１６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３２：ｓｈＲＮＡ１６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３３：ｓｈＲＮＡ１７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３４：ｓｈＲＮＡ１７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３５：ｓｈＲＮＡ１９及びｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３６：ｓｈＲＮＡ１９及びｓｈＲＮＡ２０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３７：ｓｈＲＮＡ２１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号３８：ｓｈＲＮＡ２１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号３９：ｓｈＲＮＡ２２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４０：ｓｈＲＮＡ２２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４１：ｓｈＲＮＡ２３及びｓｈＲＮＡ２４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４２：ｓｈＲＮＡ２３及びｓｈＲＮＡ２４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４３：ｓｈＲＮＡ２５及びｓｈＲＮＡ２６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４４：ｓｈＲＮＡ２５及びｓｈＲＮＡ２６とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４５：ｓｈＲＮＡ２７及びｓｈＲＮＡ３０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４６：ｓｈＲＮＡ２７及びｓｈＲＮＡ３０とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４７：ｓｈＲＮＡ２８及びｓｈＲＮＡ３１とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号４８：ｓｈＲＮＡ２８及びｓｈＲＮＡ３１とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号４９：ｓｈＲＮＡ２９及びｓｈＲＮＡ３２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５０：ｓｈＲＮＡ２９及びｓｈＲＮＡ３２とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５１：ｓｈＲＮＡ３３及びｓｈＲＮＡ３４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５２：ｓｈＲＮＡ３３及びｓｈＲＮＡ３４とされる各ｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５３：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５４：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５５：ｓｈＲＮＡ３６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５６：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５７：ｓｈＲＮＡ３７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号５８：ｓｈＲＮＡ３７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号５９：ｓｈＲＮＡ３８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６０：ｓｈＲＮＡ３８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６１：ｓｈＲＮＡ３９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６２：ｓｈＲＮＡ３９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６３：ｓｈＲＮＡ４０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号６４：ｓｈＲＮＡ４０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号６５：ｓｈＲＮＡ１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列。
配列番号６６：ｓｈＲＮＡ２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号６７：ｓｈＲＮＡ３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号６８：ｓｈＲＮＡ４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号６９：ｓｈＲＮＡ５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７０：ｓｈＲＮＡ６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７１：ｓｈＲＮＡ７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７２：ｓｈＲＮＡ８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７３：ｓｈＲＮＡ９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７４：ｓｈＲＮＡ１０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７５：ｓｈＲＮＡ１１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７６：ｓｈＲＮＡ１２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７７：ｓｈＲＮＡ１３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７８：ｓｈＲＮＡ１４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号７９：ｓｈＲＮＡ１５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８０：ｓｈＲＮＡ１６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８１：ｓｈＲＮＡ１７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８２：ｓｈＲＮＡ１８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８３：ｓｈＲＮＡ１９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８４：ｓｈＲＮＡ２０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８５：ｓｈＲＮＡ２１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８６：ｓｈＲＮＡ２２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８７：ｓｈＲＮＡ２３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８８：ｓｈＲＮＡ２４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号８９：ｓｈＲＮＡ２５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９０：ｓｈＲＮＡ２６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９１：ｓｈＲＮＡ２７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９２：ｓｈＲＮＡ２８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９３：ｓｈＲＮＡ２９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９４：ｓｈＲＮＡ３０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９５：ｓｈＲＮＡ３１とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９６：ｓｈＲＮＡ３２とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９７：ｓｈＲＮＡ３３とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９８：ｓｈＲＮＡ３４とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号９９：ｓｈＲＮＡ３５とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１００：ｓｈＲＮＡ３６とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０１：ｓｈＲＮＡ３７とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０２：ｓｈＲＮＡ３８とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０３：ｓｈＲＮＡ３９とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０４：ｓｈＲＮＡ４０とされるｓｈＲＮＡのＲＮＡ配列
配列番号１０５：ｐＢＬ１８３＿ＨＢＶ＿トリプル＿Ｖ２のＤＮＡ配列
配列番号１０６：ｐＢＬ１８３＿ＨＢＶ＿トリプル＿Ｖ１のＤＮＡ配列
【0074】
詳細な説明
一般事項
本明細書の全体で、特に別途記載しない限り、また内容的に必要のない限り、１つのステップ、特徴、物質の組成、諸ステップ群、または物質の諸特性や諸組成の群への言及は、そういった諸ステップ、諸特性、物質の諸組成、諸ステップ群、物質の諸特性や諸組成の諸群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含するものとする。
一般事項
本明細書の全体で、特に別途記載しない限り、また内容的に必要のない限り、１つのステップ、特徴、物質の組成、諸ステップ群、または物質の諸特性や諸組成の群への言及は、そういった諸ステップ、諸特性、物質の諸組成、諸ステップ群、物質の諸特性や諸組成の諸群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含するものとする。
【0075】
当業者であれば理解しようが、本開示は、具体的に説明している以外にも変更や改変の余地がある。本開示はそういった変更や改変をすべて含むものと理解すべきである。本開示はまた、本明細書で単独でまたはまとめて言及するかまたは示す諸ステップ、諸特性、諸組成物及び諸化合物のすべて、ならびにこれらの諸ステップや諸特性のあらゆる組合せまたは任意の２つ以上を含む。
【0076】
本開示は、本明細書で例示目的でのみ説明している具体的な諸例によってその範囲を限定されない。機能的に等価な産物、組成物及び方法が本開示の範囲内であることは明白である。
【0077】
本明細書では、特に断らない限り、本開示のいずれの例も必要に応じて変更を加えて本開示の他の任意の例に応用できるものとする。
【0078】
特に別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、当業界（たとえば細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、生化学など）で当業者が通常使用するのと同じ意味をもつものとする。
【0079】
特に断らない限り、本開示で用いる組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技法は当業者によく知られた標準的な手順である。そのような技法は、Ｊ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９８４）， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）， Ｔ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ （編纂）， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）， Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ （編纂）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９５ ａｎｄ １９９６）， ａｎｄ Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （編纂）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８， 現在までのすべての最新情報を含む）， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （編纂） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８８） 及びＪ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （編纂） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （現在までのすべての最新情報を含む）などの文献資料で説明されている。
【0080】
本明細書の全体で、内容的に他の意味を必要としない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」またはその変化形である「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語は、記載のステップまたはエレメントまたは整数またはステップ群またはエレメント群または整数群を含む意味があるが、任意の他のステップまたはエレメントまたは整数またはエレメント群または整数群を排除するものではないと理解されたい。
【0081】
「及び／または」という用語、たとえば「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解すべきであり、両方または片方の意味を明白に支持するために用いるものとする。
【0082】
定義
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボ－フラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一部精製ＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより生産されたＲＮＡ、及び１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／または改変によって天然のＲＮＡとは異なるように改変されたＲＮＡが含まれる。そのような改変としては、たとえばｓｉＮＡの末端（複数可）に、または内部に、たとえばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドに、非ヌクレオチド物質を付加することであってもよい。本開示のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、たとえば自然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変されたＲＮＡは、アナログ、または天然ＲＮＡのアナログと呼ぶこともできる。一例では、ＲＮＡの全残基はリボヌクレオチドである。
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボ－フラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一部精製ＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより生産されたＲＮＡ、及び１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／または改変によって天然のＲＮＡとは異なるように改変されたＲＮＡが含まれる。そのような改変としては、たとえばｓｉＮＡの末端（複数可）に、または内部に、たとえばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドに、非ヌクレオチド物質を付加することであってもよい。本開示のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、たとえば自然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変されたＲＮＡは、アナログ、または天然ＲＮＡのアナログと呼ぶこともできる。一例では、ＲＮＡの全残基はリボヌクレオチドである。
【0083】
本明細書では、「ＲＮＡｉ試薬」という用語は、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」を誘発できるＲＮＡを指す。
【0084】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、広くは、細胞の細胞質において二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって開始される遺伝子発現のＲＮＡ依存性サイレンシングを指す。ｄｓＲＮＡ分子は標的核酸配列の転写産物を減じまたは阻害し、そうすることで遺伝子発現を抑制（サイレンシング）する。
【0085】
本明細書では、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、二重構造をもつ、互いに長さが同じエフェクター配列とエフェクター相補配列とを含むＲＮＡ分子を指す。エフェクター配列とエフェクター相補配列は、一本鎖ＲＮＡ中にあっても、別々のＲＮＡ鎖中にあってもよい。「エフェクター配列」（「ガイド鎖」と呼ばれることも多い）は、標的配列にほぼ相補的であり、標的配列とはこの場合はＨＢＶゲノムのＲＮＡ転写産物のある領域である。「エフェクター配列」は「アンチセンス配列」と呼ばれる場合もある。「エフェクター相補配列」は、エフェクター配列にアニールしてデュプレックスを形成できるように、エフェクター配列に対し十分な相補性がある。この点で、エフェクター相補配列は、標的配列のある領域と実質的に相同となる。当業者には明白になろうが、「エフェクター相補配列」という用語は、「エフェクター配列の相補配列」またはセンス配列と呼ぶこともできる。
【0086】
本明細書では、「デュプレックス」という用語は、２つの相補的もしくはほぼ相補的な核酸（たとえばＲＮＡ）中の領域、あるいは一本鎖核酸（たとえば、ＲＮＡ）中の２つの相補的もしくはほぼ相補的な領域を指し、ワトソン・クリック塩基対形成により、または相補的もしくはほぼ相補的なヌクレオチド配列間で安定したデュプレックスが形成される任意の他の様式により、互いに塩基対を形成している。当業者であれば理解しようが、デュプレックス領域において１００％の相補性は必要ではなく、実質的な相補性があればよい。実質的な相補性としては、７９％以上の相補性を挙げることができる。たとえば、１９塩基対からなるデュプレックス領域中１つのミスマッチ（すなわち、１８塩基対と１ミスマッチ）は、９４．７％の相補性ということになり、デュプレックス領域はほぼ相補的である。別の例では、１９塩基対からなるデュプレックス領域中２つのミスマッチ（すなわち、１７塩基対と２ミスマッチ）は、８９．５％相補性ということになり、デュプレックス領域はほぼ相補的である。さらに別の例では、１９塩基対からなるデュプレックス領域中３つのミスマッチ（すなわち、１６塩基対と３ミスマッチ）は、８４．２％相補性ということになり、デュプレックス領域はほぼ相補的である、などである。
【0087】
ｄｓＲＮＡは、ステムループと呼ばれる少なくとも２ヌクレオチドの配列によって連結されたエフェクター配列とエフェクター相補配列で構成されるデュプレックス領域を有する、ヘアピンまたはステムループ構造として提供することができる。ｄｓＲＮＡがヘアピンまたはステムループ構造で提供されるとき、これを「ヘアピンＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡｉ剤」または「ｓｈＲＮＡ」と呼ぶことができる。
【0088】
本明細書では、ある配列に関する「相補的」という用語は、該配列に対しワトソン・クリック塩基対形成による相補的な配列を指し、したがってグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対をなし、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）かチミン（Ｔ）と対をなす。配列は別の配列の全長に相補的な場合もあるし、別の配列の特定の部分に相補的な場合もある。当業者であれば、ＵはＲＮＡにおいて、ＴはＤＮＡにおいて存在できることを知っている。したがって、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列のＡは、ＲＮＡ配列のＵと、あるいはＤＮＡ配列のＴと対をなすことができる。
【0089】
本明細書では、「ほぼ相補的」という用語は、核酸配列間、たとえばエフェクター配列とエフェクター相補配列の間に、またはエフェクター配列と標的配列の間に安定した特異的な結合が生じるような、十分な相補性があることまたは対形成が正確になされることを指すのに用いられる。核酸の配列は、その標的または相補配列に１００％相補的である必要はないと理解されている。この用語は、オーバーハングを除く、別の配列に相補的な配列を包含している。いくつかの場合には、配列は１つ～２つのミスマッチを除いて他方の配列に相補的である。いくつかの場合には、配列は１ミスマッチを除いて相補的である。いくつかの場合には、配列は２ミスマッチを除いて相補的である。ほかの場合には、配列は３ミスマッチを除いて相補的である。さらに他の場合には、配列は４ミスマッチを除いて相補的である。
【0090】
本開示のＲＮＡに関連して使われる「コードされ（てい）る」という用語は、ＲＮＡがＤＮＡテンプレートから転写できることを意味すると理解すべきである。したがって、本開示のＲＮＡをコードする核酸は、それぞれのＲＮＡの転写テンプレートとなるＤＮＡ配列を含む。
【0091】
「ＤＮＡ指向性ＲＮＡｉコンストラクト」または「ｄｄＲＮＡｉコンストラクト」という用語は、転写されるとＲＮＡｉを誘発するＲＮＡ分子を生産するＤＮＡ配列を含む核酸を指す。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも２ヌクレオチドのステムループによって連結されたデュプレックス領域を有するヘアピン構造へと自己アニールできる単一のＲＮＡすなわちｓｈＲＮＡとして転写される核酸、または複数のｓｈＲＮＡを有する単一のＲＮＡとして転写される核酸、またはそれぞれが単一のｓｈＲＮＡとしてフォールディングできる複数のＲＮＡ転写物として転写される核酸を含むことができる。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは発現ベクター内にあってもよく、すなわち、たとえばプロモーターに機能的に連結されている「ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト」であってもよい。一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトはＤＮＡだけを含む。
【0092】
本明細書では、「機能的に連結される」または「機能的連結」という（あるいはそれらと類似の）用語は、コード核酸配列が、該コード配列の発現を促進するように、制御配列たとえばプロモーターに連結されているかまたはそれと結合していることを意味する。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、及び当業界で認められている、コード配列の発現を指令するように選択される他の発現制御エレメントが挙げられる。
【0093】
「ベクター」は、核酸を細胞に導入するためのビヒクルを意味すると理解される。ベクターとしては、限定ではないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、細菌、及びウイルスや細菌ソース由来のビヒクルが挙げられる。「プラスミド」は円形の二本鎖ＤＮＡ分子である。本開示での使用に便利なタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、１つ以上のウイルス遺伝子または一部分を削除するように修飾可能なウイルスゲノムに異種ＤＮＡ配列が挿入される。一部のベクターは、宿主細胞内で自己複製できる（たとえば、宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞のゲノムに安定的に取り込まれ、そうすることでホストゲノムと一緒に複製される。本明細書では、「発現ベクター」という用語は、本開示のＲＮＡ分子を発現できるベクターを意味すると理解される。
【0094】
本明細書では、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療、処理、処置）」「ｔｒｅａｔ」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」という用語及びその変化形は、治療対象の個体または細胞が臨床病理学的に自然に辿る経路を変更するように設計された臨床的介入を指す。望ましい治療効果としては、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善もしくは緩和、及び寛解もしくは良好な予後が挙げられる。したがって、ＨＢＶ感染の治療としては、ＨＢＶ感染した対象のＨＢＶウイルス負荷の低下、ＨＢＶ感染に関連する症状の重症度の軽減、及び対象のＨＢＶ感染力の低下が挙げられる。たとえば、このような治療結果のうちの１つ以上が得られた場合、その個体の「治療」は成功した、といえる。
【0095】
「治療有効量」は、特定の疾患（たとえばＨＢＶ感染）の測定可能な改善が得られるのに必要な、少なくとも最低限の濃度または量である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別及び体重、ならびにＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトがその個体の所望の応答を誘発する能力といった要因によって異なることもある。治療有効量は、ＲＮＡ、ｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトのあらゆる毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果のほうが勝る量でもある。
【0096】
本明細書では、「対象」または「患者」は、ＨＢＶ感染したヒトの場合も非ヒト動物の場合もある。「非ヒト動物」は、霊長類、家畜（たとえばヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ）、コンパニオン動物（たとえばイヌやネコなどのペット）、実験動物（たとえばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、芸などをする動物（たとえば競走馬、ラクダ、グレイハウンド）または飼育下の野生動物であってもよい。一例では、対象または患者は哺乳類である。一例では、対象または患者は霊長類である。一例では、対象または患者はヒトである。
【0097】
「発現が減少した」「発現の減少」という用語または同様の用語は、標的遺伝子たとえばＨＢＶ ｐｏｌ遺伝子または他のＨＢＶ遺伝子からのタンパク質及び／またはｍＲＮＡ産物の不存在または観察可能なレベルの減少を指す。この減少は完全である必要はなく、本開示のＲＮＡによるＲＮＡｉの結果として検出可能または観察可能な変化をもたらすのに十分な部分的減少の場合もある。この減少は、ＲＮＡ、 、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトまたは発現コンストラクトをもたない細胞と比較しての標的核酸からのｍＲＮＡ及び／またはタンパク質産物レベルの減少を決定することにより測定でき、１％、５％または１０％と僅かな場合もあれば、完全な減少、すなわち１００％阻害である場合もある。この減少の効果は、外向きの特性、すなわち細胞または生物の表現型の量及び／または質の調査によって決定することもできるし、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクト投与後のウイルス負荷の評価も含む場合もある。
【0098】
ＲＮＡｉの諸剤
一例では、本開示は、ＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供し、該ＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は表１に示すＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、本開示のＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含むことになる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
一例では、本開示は、ＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供し、該ＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は表１に示すＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、本開示のＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含むことになる。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0099】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0100】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域２によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域２によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域２によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域２によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域２によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域２によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0101】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域３によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域３によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域３によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域３によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域３によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域３によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0102】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域４によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0103】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域５によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0104】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域６によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0105】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域７によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域７によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域７によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域７によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域７によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域７によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0106】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域８によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域８によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域８によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域８によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域８によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域８によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0107】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域９によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0108】
一例では、エフェクター配列は、表１に示す領域１０によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１０によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し４ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１０によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し３ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１０によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し２ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１０によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、それに対し１ミスマッチ塩基を含むことができる。たとえば、エフェクター配列は、表１に示す領域１０によってコードされるＲＮＡ転写物に１００％相補的な場合もある。
【0109】
一例では、本開示に含まれるＲＮＡは、本明細書で説明する表１に示す領域１、領域５、領域９、領域４または領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含むＲＮＡである。
【0110】
一例では、本開示のＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）デュプレックスまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。
【0111】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供し、各ＲＮＡは少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、各ＲＮＡのエフェクター配列は表１に示すＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。たとえば、複数のＲＮＡの各ＲＮＡは、３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含む。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0112】
本開示による複数のＲＮＡは、本明細書で説明するＲＮＡを最大１０まで含むことができる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する２つのＲＮＡが含まれる。別の例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する３つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する４つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する５つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する６つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する７つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する８つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する９つのＲＮＡが含まれる。一例では、複数のＲＮＡには、本明細書で説明する１０のＲＮＡが含まれる。
【0113】
したがって、本開示による該複数のＲＮＡは、表１に示すＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含む本明細書で説明するＲＮＡを１つ以上含むことができる。
【0114】
一例では、本明細書で説明する複数のＲＮＡは、１つの組成物として一緒に提供される。
【0115】
別の例では、本明細書で説明する複数のＲＮＡは、複数の組成物として提供される。たとえば、該複数のＲＮＡの各ＲＮＡは、別々に提供することができる。あるいは、組成物に、該複数のＲＮＡのうちの少なくとも１つのＲＮＡを別に提供し、該複数のＲＮＡのうちの２つ以上のＲＮＡを一緒に組成物中に提供することができる。
【0116】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0117】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0118】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0119】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0120】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0121】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、該複数のＲＮＡのうちの別のＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0122】
一例では、該複数のＲＮＡのうちのあるＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、該複数のＲＮＡのうちの別のＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、該複数のＲＮＡのうちの別のＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的である。
【0123】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供し、
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡが、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、各ＲＮＡのエフェクター配列は表１に示すＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、各ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる。
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡが、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、各ＲＮＡのエフェクター配列は表１に示すＨＢＶゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、各ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0124】
たとえば、各ＲＮＡは３０ヌクレオチド長よりも短いエフェクター配列を含む。たとえば、好適なエフェクター配列は、１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
【0125】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域１によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0126】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域５によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0127】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0128】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0129】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域６によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0130】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉ）の別のＲＮＡは表１の領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0131】
一例では、（ｉ）のＲＮＡは表１の領域９によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、（ｉ）の別のＲＮＡは表１の領域４によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的なエフェクター配列を含み、該複数のＲＮＡのうちの別のＲＮＡのエフェクター配列は、表１の領域５によってコードされるＲＮＡ転写物であり、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列を含む。一例では、（ｉｉ）のＲＮＡは配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0132】
本開示によるある例示的なＲＮＡは、エフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載のエフェクター相補配列にほぼ相補的である。
【0133】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし４塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列を含むＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供する。
【0134】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし３塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列を含むＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供する。
【0135】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし２塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列を含むＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供する。
【0136】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし１塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列を含むＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供する。
【0137】
本開示のＲＮＡが、１、２、３または４ミスマッチはあるが、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的なエフェクター配列を含む場合、該エフェクター配列は表２の対応するエフェクター相補配列とデュプレックスをなおも形成することができる。
【0138】
一例では、本開示は、エフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列に１００％相補的であるＲＮＡ、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供する。一例では、ＲＮＡのエフェクター相補配列は、そのエフェクター配列にほぼ相補的である。たとえばＲＮＡのエフェクター相補配列は、同種エフェクター配列に対し１、２、３または４ミスマッチを含む場合もあるが、該エフェクター配列とデュプレックスをなおも形成することができる。
【0139】
本開示による例示的なＲＮＡは、表２に記載の対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列を含む。一例では、ＲＮＡの対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列は、たとえばワトソン・クリック塩基対形成によってデュプレックス化する別々の核酸（ｄｓＲＮＡ）として提供することができる。
【0140】
一例では、本開示は、ＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できるＲＮＡを提供し、該ＲＮＡは、エフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該エフェクター配列は、表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる。一例では、該エフェクター相補配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなる。
【0141】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0142】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0143】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0144】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号１１に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号１２に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0145】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号４５に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４６に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0146】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号３５に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３６に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0147】
本開示のある例示的なＲＮＡは、配列番号２１に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２２に示す配列からなるエフェクター相補配列を含む。
【0148】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できる複数のＲＮＡを提供し、各ＲＮＡはエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、各ＲＮＡのエフェクター配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示すエフェクター相補配列にほぼ相補的である。表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示すエフェクター相補配列にほぼ相補的であるエフェクター配列を含む例示的ＲＮＡを本明細書で説明する。
【0149】
一例では、各ＲＮＡのエフェクター配列は、表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる。一例では、各ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなる。
【0150】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡを、すなわちＲＮＡｉを誘発できる複数のＲＮＡを提供し、
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は、表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなり（一例では、各ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなり）；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる（一例では、該ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる）。
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は、表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなり（一例では、各ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなり）；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は、表４の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる（一例では、該ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表４の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる）。
【0151】
本開示のある例示的な複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；及び
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡを含む。
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；及び
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡを含む。
【0152】
本開示のある例示的な複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡを含む。
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡを含む。
【0153】
本開示のある例示的な複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡを含む。
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡを含む。
【0154】
本開示のＲＮＡは、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ指向性ＲＮＡ（ｄｄＲＮＡ）を含むことができる。合成ＲＮＡは、一般的なオリゴヌクレオチド合成などの当業界で知られている方法によって製造することができ、半減期が延長されるように、及び／またはｓｉＲＮＡ剤の有効性が向上するように、及び／またはよりロバストな送達剤が可能になるように、化学修飾が組み込まれる場合がある。当業界ではオリゴヌクレオチドの修飾が多数知られており、詳しく記述されている。
【0155】
一例では、本開示のＲＮＡのヌクレオチドは実質的にすべて修飾されている。他の例では、本開示のＲＮＡのヌクレオチドはすべて修飾されている。「実質的にヌクレオチドがすべて修飾されている」本開示のＲＮＡは、全部ではないが大部分が修飾されており、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ以下の未修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【0156】
一例では、本開示のＲＮＡは、１つ以上のオーバーハング領域及び／またはキャッピング基を、片方のまたは両方のデュプレックス鎖の３’末端に、５’末端に、または両末端に含んでいる。オーバーハング領域は、１～６ヌクレオチド長、たとえば２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、または１～２ヌクレオチド長の場合がある。オーバーハングは、片方の鎖が他方の鎖よりも長い結果として、あるいは同じ長さの２本の鎖が互いに対しずれた結果として存在することができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成するか、または標的の遺伝子配列に相補的であるか、または別の配列である可能性がある。第１の鎖と第２の鎖は、たとえば追加の塩基によって連結してヘアピンを形成することもできるし、他の非塩基リンカーによって連結することもできる。
【0157】
一例では、ＲＮＡのオーバーハング領域のヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾または未修飾ヌクレオチドであり、限定ではないが２’－糖修飾、たとえば２－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、デオキシ－チミン（ｄＴ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組合せを含む。たとえば、ｄＴｄＴは、どちらの鎖のどちらの末端のオーバーハング配列にもなることができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成するか、または標的の遺伝子配列に相補的であるか、または別の配列である可能性がある。
【0158】
ＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の５’－または３’－オーバーハングをリン酸化することもできる。いくつかの例では、オーバーハング領域（複数可）は、２つのヌクレオチドを含み、これらの２つのヌクレオチド間にホスホチオアートを有しており、これらの２つのヌクレオチドは同じでも異なっていてもよい。
【0159】
一例では、ＲＮＡは、該ＲＮＡの全体的な安定性に影響することなく干渉活性を強化することができるオーバーハングを一つだけ含んでいる。たとえば、一本鎖オーバーハングは、エフェクター配列の３’末端に位置するか、あるいはエフェクター相補配列の３’末端に位置する。一例では、ＲＮＡは、エフェクター相補配列の５’末端（またはエフェクター配列の３’末端）に位置する平滑末端も含み、またはこの逆の場合もある。
【0160】
修飾としては、たとえば末端修飾、たとえば５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆位連結）もしくは３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位連結など）；塩基修飾、たとえば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは対形成相手のレパートリーが広い塩基での置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または結合塩基；糖修飾（たとえば、２’位または４’位）または糖の置換；及び／またはホスホジエステル連結の修飾または置換を含む主鎖修飾が挙げられる。本開示で有用なＲＮＡの具体例としては、限定ではないが、修飾主鎖を含むＲＮＡまたは天然のヌクレオシド間連結を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾主鎖を有するＲＮＡとしてはいろいろあるが、主鎖にリン原子を含まないものが挙げられる。本明細書の目的として、また当業界でも参照されることがあるが、ヌクレオシド間主鎖にリン原子をもたない修飾ＲＮＡもオリゴヌクレオシドとすることができる。ある例では、修飾ＲＮＡはヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。リンを含む連結の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定ではないが、米国特許第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；及び同第ＲＥ３９４６４号が挙げられる。
【0161】
リン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結によって形成された主鎖を有する。これらには、モルフォリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファマート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホナート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及びその他の混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有するものが含まれる。これらのオリゴヌクレオシドの例示的形態を教示している代表的な米国特許としては、限定ではないが、米国特許第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；及び同第５，６７７，４３９号が挙げられる。
【0162】
一例では、本開示のＲＮＡは、未修飾または天然の塩基だけを、たとえば以下に説明するようなものだけを含んでいる。
【0163】
他の例では、本開示のＲＮＡは、ＲＮＡ模倣体であるかまたはそれを含み、たとえばヌクレオチド単位の主鎖は新しい基で置換されている。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物のひとつ、優れたハイブリダイゼーション特性を有することを示しているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖主鎖はアミド含有主鎖で、具体的にはアミノエチルグリシン主鎖で、置換されている。核酸塩基は保持され、直接または間接的に主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定ではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号が挙げられる。
【0164】
修飾ＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分を含む場合もある。本明細書のＲＮＡ、たとえばｄｓＲＮＡは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの一つを２’位に含むことができ、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換または未置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ１）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ｎとｍは１～約１０である。
【0165】
ＲＮＡは核酸塩基（当業界では単に「塩基」と呼ぶことが多い）修飾または置換を含む場合もある。本明細書では、「未修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には他の合成及び天然の核酸塩基、たとえばデオキシ－チミン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル及び他のアデニンやグアニンのアルキル誘導体、２－プロピル及び他のアデニンやグアニンのアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（擬ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられる。＊
【0166】
ＲＮＡは、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾することもできる。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は２’と４’の炭素をつなぐ余分なブリッジを含んでいる。この構造は３’末端の立体構造でリボースを有効に「ロック」する。ロックド核酸をｓｉＲＮＡに付加すると、血清中ｓｉＲＮＡの安定性が増し、標的外効果が減少することが示されている（Ｅｌｍｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７）。
【0167】
ＲＮＡ末端を安定化させ得る修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’ ’－ホスファート、逆位塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などを挙げることができる。この修飾の開示は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１１／００５８６１に記載されている。
【0168】
別の例では、本開示の例示的なＲＮＡ（たとえば、表２及び／または表４に示すもの）は、各ＲＮＡが一つの連続配列を形成するように、エフェクター配列とエフェクター相補配列の間に配置されたステムループ配列を含む、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として提供することができる。ステムループ配列は、エフェクター配列とエフェクター相補配列が互いにアニールできる十分な長さである。好適なステムループ配列は、たとえば当業界で知られているなかから選択することができる。たとえば、本開示によるｓｈＲＮＡは、表３に示す配列（本明細書で説明するように修飾されていてもよい）を含むことができる。
【0169】
一例では、本開示のＲＮＡは化学的に合成される。オリゴヌクレオチド（たとえば、特定の修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドがない部分）は当業界では既知のプロトコルを用いて、たとえばＣａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１， ３－１９， ＷＯ ９９／５４４５９， Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ２６７７－２６８４， Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．， ７４， ５９， Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．， ６１， ３３－４５，及びＢｒｅｎｎａｎの米国特許第６，００１，３１１号で説明されるようなプロトコルを用いて合成される。オリゴヌクレオチドの合成は、一般的な核酸保護基及びカップリング基、たとえば５’末端のジメトキシトリチル、及び３’末端のホスホラミダイトなどを利用する。
【0170】
修飾なしのＲＮＡは、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０９， ７８４５； Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ５４３３で説明されている手順を用いて合成される。これらの合成では、本開示の特定のＲＮＡに使用することができる、一般的な核酸保護基及びカップリング基、たとえば５’末端のジメトキシトリチル、及び３’末端のホスホラミダイトなどを利用する。
【0171】
特定の例では、本開示のＲＮＡは、米国特許第６，９９５，２５９号、同第６，６８６，４６３号、同第６，６７３，９１８号、同第６，６４９，７５１号、及び／または同第６，９８９，４４２号で説明されている方法にしたがい合成され、脱保護され、分析される。
【0172】
ある代替例では、本開示のＲＮＡは、個別の構成成分として合成され、合成後にたとえばライゲーションにより連結される（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， ９９２３、またはＷＯ９３／２３５６９）か、または合成及び／または脱保護後のハイブリダイゼーションにより連結される。
【0173】
一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号９５に示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0174】
一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0175】
一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号８２に示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0176】
一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号６５に示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号６８に示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0177】
一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号９１に示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号９４に示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0178】
一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号８３に示す配列を含むかまたはそれからなる。一例では、ある例示的ｓｈＲＮＡは、配列番号８４に示す配列を含むかまたはそれからなる。
【0179】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0180】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0181】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0182】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号８２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0183】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号６５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0184】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号６８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0185】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0186】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９４に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0187】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号８３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0188】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号８４に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0189】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡ
を含む。
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡ
を含む。
【0190】
一例では、本開示の該他のＲＮＡは、配列番号７９、８２、６５、６８、９１、９４、８３または８４に示す配列を含むｓｈＲＮＡである。
【0191】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含むかまたはそれからなる。
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含むかまたはそれからなる。
【0192】
本開示はまた、複数のＲＮＡを提供し、該複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含むかまたはそれからなる。
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含むかまたはそれからなる。
【0193】
ｄｄＲＮＡｉ
本開示のＲＮＡは核酸から転写することができる。したがって、一例では、本開示は本開示のＲＮＡをコードする核酸を提供する。
本開示のＲＮＡは核酸から転写することができる。したがって、一例では、本開示は本開示のＲＮＡをコードする核酸を提供する。
【0194】
一例では、核酸はＤＮＡである。
【0195】
別の例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードする核酸を提供する。
【0196】
別の例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードする複数の核酸を提供する。たとえば、該複数の核酸の各核酸は、本明細書で説明する１つのＲＮＡをコードすることができる。別の例では、１つ以上の核酸が複数のＲＮＡをコードし、たとえば該複数の核酸のうちの１つの核酸が本開示の２つ以上のＲＮＡをコードし、該複数の核酸のうちの別の核酸が本開示の１つ以上のＲＮＡをコードする。
【0197】
一例では、本明細書で説明する複数の核酸は、たとえば一つの組成物中、一緒に提供される。
【0198】
別の例では、本明細書で説明する複数の核酸は、複数の成分として、たとえば複数の組成物として提供される。たとえば、該複数の核酸の各核酸は別々に提供することができる。あるいは、少なくとも３つの本開示の核酸が提供される一例では、これらの核酸のうちの少なくとも１つを別に提供し、該複数の核酸のうちの２つ以上を一緒に提供することができる。
【0199】
いくつかの例では、本開示の核酸は、たとえばＲＮＡの転写を促進するための、１つ以上の追加のエレメントを含む。たとえば、該核酸は、本開示のＲＮＡをコードする配列に機能的に連結されたプロモーターを含むことができる。他のエレメント、たとえば転写ターミネーターは、当業界で知られており、かつ／または本明細書で説明される。
【0200】
一例では、核酸は、ＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトである。
【0201】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、プロモーターに機能的に連結された、本開示のＲＮＡをコードする配列を含む。
【0202】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本開示のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列を含む。例示的なエフェクター配列とエフェクター相補配列を表２に示す。
【0203】
たとえば、それらの配列はプロモーターに機能的に連結されている場合がある。一例では、配列は両方とも同じプロモーターに機能的に連結されている場合がある。一例では、配列はそれぞれ異なるプロモーターに機能的に連結されている場合がある。
【0204】
一例では、本開示は、エフェクター配列をコードする配列、及びエフェクター相補配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該エフェクター配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載のエフェクター相補配列にほぼ相補的である。たとえば、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載のエフェクター相補配列にほぼ相補的であるエフェクター配列は、対応する表２のエフェクター相補配列とデュプレックス化されると、０、１、２、３または４ミスマッチを含む場合もある。
【0205】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし４塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列をコードする配列を含む、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
【0206】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし３塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列をコードする配列を含む、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
【0207】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし２塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列をコードする配列を含む、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
【0208】
一例では、本開示は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的な、ただし１塩基のミスマッチを有する、エフェクター配列をコードする配列を含む、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
【0209】
一例では、本開示は、エフェクター配列及びエフェクター相補配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該エフェクター配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列に１００％相補的である。一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトによってコードされるエフェクター配列にほぼ相補的であるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0210】
本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、表２に記載の対応するエフェクター配列とエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0211】
一例では、本開示は、エフェクター配列をコードする配列、及びエフェクター相補配列をコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該エフェクター配列は、表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる。一例では、該エフェクター相補配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなる。
【0212】
本開示のある例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0213】
本開示の別の例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0214】
本開示のさらなる例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0215】
本開示のさらなる例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１１に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号１２に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0216】
本開示のさらなる例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号４５に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号４６に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0217】
本開示のさらなる例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号３５に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号３６に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0218】
本開示のさらなる例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号２１に示す配列からなるエフェクター配列をコードする配列、及び配列番号２２に示す配列からなるエフェクター相補配列をコードする配列を含む。
【0219】
別の例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードする、あるいはＲＮＡｉを誘発できる本開示のＲＮＡをコードする配列及び少なくとも他の１つのＲＮＡの配列を含む、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
【0220】
一例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、各ＲＮＡはエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、少なくとも１つの（または各）ＲＮＡのエフェクター配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列にほぼ相補的である。表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに記載の配列に「ほぼ相補的」であるエフェクター配列を含む本開示の例示的なＲＮＡについては既に説明しており、本開示のこの例に必要に応じて変更を加えて応用できるものとする。しかし、一例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、各ＲＮＡはエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、少なくとも１つの（または各）ＲＮＡのエフェクター配列は、表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる。一例では、少なくとも１つの（または各）ＲＮＡのエフェクター相補配列は、表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなる。
【0221】
一例では、本開示は、本開示の複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなり（一例では、各ＲＮＡのエフェクター相補配列は表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなり）；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は表４の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる（一例では、該ＲＮＡのエフェクター相補配列は表４の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる）。
（ｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は表２の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなり（一例では、各ＲＮＡのエフェクター相補配列は表２の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列からなり）；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡがエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、該ＲＮＡのエフェクター配列は表４の「エフェクター」と表示したコラムに示す配列からなる（一例では、該ＲＮＡのエフェクター相補配列は表４の「エフェクター相補配列」と表示したコラムに示す配列を含むかまたはそれからなる）。
【0222】
本明細書ではＲＮＡの例示的な組合せを説明しており、それらは本開示のこの例に必要に応じて変更を加えて応用できるものとする。
【0223】
本開示のある例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0224】
本開示のある例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0225】
たとえば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’方向に、
（ｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉ）配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
を含むことができる。
（ｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉ）配列番号２９に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号３０に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
を含むことができる。
【0226】
ｄｄＲＮＡｉコンストラクトの（ｉ）～（ｉｉｉ）のＲＮＡをコードする各ＤＮＡ配列は、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおいて、たとえばＵ６プロモーターやＨ１プロモーターなどの別のプロモーターに機能的に連結されている場合もある。
【0227】
本開示の別の例示的なｄｄＲＮＡｉは、
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0228】
たとえば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’方向に、
（ｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉ）配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
を含むことができる。
（ｉ）配列番号２７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号２８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉ）配列番号５７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号５８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号４７に示す配列からなるエフェクター配列、及び配列番号４８に示す配列からなるエフェクター相補配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
を含むことができる。
【0229】
ｄｄＲＮＡｉコンストラクトの（ｉ）～（ｉｉｉ）のＲＮＡをコードする各ＤＮＡ配列は、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおいて、たとえばＵ６プロモーターやＨ１プロモーターなどの別のプロモーターに機能的に連結されている場合もある。
【0230】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、プロモーターに機能的に連結された、本開示のｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。たとえば、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、たとえばＵ６プロモーターやＨ１プロモーターなどのプロモーターに機能的に連結された、表３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【0231】
たとえば、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0232】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号９５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0233】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0234】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0235】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号８２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0236】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号６５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0237】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号６８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0238】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号９１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0239】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号９４に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0240】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号８３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0241】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号８４に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0242】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、表３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。たとえば、該他のＲＮＡは、たとえば、表３または表５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡであってもよい。
【0243】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0244】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0245】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0246】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号８２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0247】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号６５に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0248】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号６８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0249】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0250】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号９４に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0251】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号８３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0252】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、配列番号８４に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ及び本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡを含む。
【0253】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉも提供し、該複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡ
を含む。
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡ
を含む。
【0254】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトによってコードされる該他のＲＮＡは、配列番号７９、８２、６５、６８、９１、９４、８３または８４に示す配列を含むｓｈＲＮＡである。
【0255】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含む。
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含む。
【0256】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該複数のＲＮＡは、
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含む。
（ｉ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡ
を含む。
【0257】
上述したように、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは通常、プロモーターに機能的に連結された本開示のＲＮＡ（たとえば、本開示のｓｈＲＮＡ）をコードする配列を含んでいる。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ベクター内、たとえば、プラスミドまたはミニプラスミドまたはウイルスベクター内にあることが多い。
【0258】
一例では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける複数のＲＮＡ（たとえば、ｓｈＲＮＡ）をコードする配列は、同じプロモーターに機能的に連結されている。たとえば、コンストラクトは、同じプロモーターの複数の複製物を含むことができ、各複製物は本開示の異なるＲＮＡをコードする配列に機能的に連結されている。
【0259】
別の例では、本開示のＲＮＡに機能的に連結されるプロモーターはそれぞれ異なっている。たとえば３つのＲＮＡ（たとえば、３つのｓｈＲＮＡ）をコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトでは、これらのＲＮＡをコードする３配列は、それぞれ異なるプロモーターに機能的に連結されている。
【0260】
さらなる例では、３つ以上のＲＮＡ（たとえば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトでは、該ＲＮＡをコードする２つ（または以上）の配列が同じプロモーターに連結され、該ＲＮＡをコードする１つ（または以上）の配列が異なるプロモーターに連結されている。
【0261】
一例では、プロモーターは、構成的プロモーターである。プロモーターに言及する際の「構成的」という用語は、該プロモーターが、特定の刺激（たとえば熱ショック、化学物質、光など）の非存在下で、機能的に連結された核酸配列の転写を指令できることを意味する。一般的には、構成的プロモーターは、実質的にあらゆる細胞及びあらゆる組織においてコード配列の発現を指令できる。本開示のＲＮＡの転写に用いられるプロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって制御されるユビキチン、ＣＭＶ、β－アクチン、ヒストンＨ４、ＥＦ－１αまたはｐｇｋ遺伝子のプロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩによって制御されるプロモーターエレメントが挙げられる。
【0262】
一例では、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｕ１、β－アクチンなどのＰｏｌ ＩＩプロモーターまたはハイブリッドＰｏｌ ＩＩプロモーターが用いられる。
【0263】
別の例では、Ｕ６プロモーター（Ｕ６－１、Ｕ６－８、Ｕ６－９）、Ｈ１プロモーター、７ＳＬプロモーター、ヒトＹプロモーター（ｈＹ１、ｈＹ３、ｈＹ４（Ｍａｒａｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（１５）：３０４５－５２（１９９４）を参照のこと）及びｈＹ５（Ｍａｒａｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４（１８）：３５５２－５９（１９９４）を参照のこと）、ヒトＭＲＰ－７－２プロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、ヒトｔＲＮＡプロモーター、または５ｓリボソームＲＮＡプロモーターなどの、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって制御されるプロモーターが用いられる。
【0264】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトで使用される好適なプロモーターが、米国特許第８，００８，４６８号及び同第８，１２９，５１０号で説明されている。
【0265】
一例では、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。たとえばプロモーターはＵ６プロモーターである。別の例では、プロモーターはＨ１プロモーターである。
【0266】
本開示の複数のＲＮＡ（たとえば、本開示のｓｈＲＮＡ）をコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトの場合、該ＲＮＡのうちの少なくとも１つのＲＮＡをコードする配列がＵ６プロモーターに機能的に連結され、該ＲＮＡのうちの少なくとも他の１つをコードする配列がＨ１プロモーターに機能的に連結されている。
【0267】
本開示の３つのＲＮＡ（たとえば、本開示のｓｈＲＮＡ）をコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトの場合、該ＲＮＡのうちの２つをコードする配列はそれぞれＵ６プロモーターに機能的に連結され、該ＲＮＡのうちの他の１つをコードする配列はＨ１プロモーターに機能的に連結されている。たとえば、５’から３’の方向で考えると、第１の配列と第３の配列はＵ６プロモーターに機能的に連結され、第２の配列はＨ１プロモーターに機能的に連結されている。
【0268】
別の例では、該ＲＮＡのうちの２つをコードする配列はそれぞれＨ１プロモーターに機能的に連結され、該ＲＮＡのうちの他のＲＮＡをコードする配列はＵ６プロモーターに機能的に連結されている。たとえば、５’から３’の方向で考えると、第１の配列と第３の配列はＨ１プロモーターに機能的に連結され、第２の配列はＵ６プロモーターに機能的に連結されている。
【0269】
一例では、コンストラクトのプロモーターはＵ６プロモーターである。たとえば、該プロモーターはＵ６－１プロモーターである。たとえば、該プロモーターはＵ６－８プロモーターである。たとえば、該プロモーターはＵ６－９プロモーターである。
【0270】
いくつかの例では、様々な長さのプロモーターが用いられる。たとえば、２つ以上の強力なプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩＩタイプのプロモーターなど）の使用は、たとえば利用可能なヌクレオチドまたは他の転写に必要な細胞成分のプールを枯渇させることにより、細胞の負担になる場合もある。さらに、または代わりに、数個の強力なプロモーターの使用により、細胞中に発現するＲＮＡｉ剤が有害レベルになる場合もある。したがって、いくつかの例では、複数プロモーターのｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおけるプロモーターの１つ以上がそのコンストラクト中の他のプロモーターよりも弱いか、またはそのコンストラクトの全プロモーターが最大発現率を下回るＲＮＡを発現させる。プロモーターも、様々な分子的技法を用いて、またはそうではなくたとえば様々な制限エレメントの修飾により、転写レベルをより強化または弱化するように修飾することができる。転写の減少を得る一つの手段は、プロモーター中のプロモーター活性を制御することがわかっている配列エレメントを修飾することである。たとえば近位配列因子（ＰＳＥ）はヒトＵ６プロモーターの活性を生じさせることが知られている（Ｄｏｍｉｔｒｏｖｉｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１： ２３４４－２３５２ （２００３）を参照のこと）。ヒトＵ６－１、Ｕ６－８またはＵ６－９プロモーターなどの強力なプロモーターのＰＳＥエレメントを、ヒトＵ６－７プロモーターなどの弱いプロモーター由来のエレメントで置き換えると、ハイブリッドＵ６－１、Ｕ６－８またはＵ６－９プロモーターの活性が低下する。この方法は本願で説明する諸例で用いているが、この結果を得るための他の手段も当業界では知られている。
【0271】
本開示のいくつかの例で有用なプロモーターは、組織特異的または細胞特異的とすることができる。プロモーターについて用いられる「組織特異的」という用語は、特定の種類の組織（たとえば肝臓組織）に対し目的とする核酸の選択的な転写を指令できるプロモーターを指し、これと同じ目的ヌクレオチド配列の発現は異なる種類の組織（たとえば筋肉）では見られない。プロモーターについて用いられる「細胞特異的」という用語は、特定の種類の細胞において目的の核酸の選択的な転写を指令できるプロモーターを指し、同じ組織内の異なる細胞ではこれと同じ目的ヌクレオチド配列の発現は見られない。
【0272】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡ（複数可）の発現を増加するために１つ以上のエンハンサーをさらに含むことができる。本開示の諸例で使用される適切なエンハンサーとしては、Ａｐｏ Ｅ ＨＣＲエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１－１７（２００３））及び当業者に知られている他のエンハンサーが挙げられる。本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトで使用される好適なエンハンサーは、米国特許第８，００８，４６８号で説明されている。
【0273】
さらなる例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本開示のＲＮＡをコードする核酸に連結されている転写ターミネーターを含むことができる。複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトの場合は、各核酸に連結されているターミネーターは、同一の場合もあるし異なる場合もある。一例では、ターミネーターは、連続する一続きの４つ以上、または５つ以上、または６つ以上のＴ残基である。
【0274】
異なるプロモーターが使われるいくつかの例では、ターミネーターは互いに異なる場合があり、ターミネーターが由来する遺伝子のプロモーターに合わせられる。そのようなターミネーターとしては、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ、ＡｄＶ ＶＡ１遺伝子、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、及びヒトｔ－ＲＮＡのターミネーターが挙げられる。さらに、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターとターミネーターで一般的に行われるようにプロモーターとターミネーターを混合することもできる。
【0275】
一例では、複数のＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトにおける各プロモーター／ＲＮＡコード配列／ターミネーター成分のプロモーター及びターミネーターは、成分同士でＤＮＡ組換えが生じる可能性を減じるために、すべて異なっている。
【0276】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、Ｕ６プロモーターに機能的に連結され、かつ少なくとも４つのチミジン残基、たとえば４つ、または５つ、または６つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている、本開示のＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、ＲＮＡをコードする配列は、１つのグアニンを含む転写イニシエーターにも連結されている。
【0277】
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、プロモーターたとえばＵ６プロモーターに機能的に連結されている、表３に示す配列からなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、たとえば４つ、または５つ、または６つのチミジン残基などの少なくとも４つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。
【0278】
１つの例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーター配列に機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【0279】
別の例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。別の例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。別の例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）プロモーターたとえばＵ６プロモーターに機能的に連結されている、表３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列、及び（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、（ｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、（ｉ）の配列は、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結され、かつたとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、（ｉｉ）の配列は、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結され、かつたとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉ）及び（ｉｉ）の配列は、それぞれ、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、（ｉ）及び（ｉｉ）の配列は、それぞれ、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉ）及び（ｉｉ）の配列は、それぞれ、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結され、かつたとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。
【0280】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。
【0281】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。
【0282】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトも提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0283】
一例では、（ｉｉｉ）の他のＲＮＡは表３または表５に示すｓｈＲＮＡである。
【0284】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉも提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0285】
たとえば、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’の方向に、
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0286】
複数のＲＮＡをコードする本開示の例示的なｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１０５に示す配列を含む。
【0287】
本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉも提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0288】
たとえば、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、５’から３’の方向に、
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列
を含む。
【0289】
複数のＲＮＡをコードする例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、配列番号１０６に示す配列を含む。
【0290】
別の例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）プロモーターたとえばＵ６プロモーターに機能的に連結されている、表３に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列及び（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、（ｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、（ｉ）の配列は、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結され、かつたとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、（ｉｉ）の配列は、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉｉ）の配列は、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結され、かつたとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉ）及び（ｉｉ）の配列は、それぞれ、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結されている。一例では、（ｉ）及び（ｉｉ）の配列は、それぞれ、たとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。一例では、（ｉ）及び（ｉｉ）の配列は、それぞれ、たとえば少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーターに連結され、かつたとえば１つのグアニン残基を含む転写イニシエーターに連結されている。
【0291】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。
【0292】
一例では、本開示は、複数のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている、配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列；及び（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている、本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含む。
【0293】
別の例では、本開示は、それぞれがＲＮＡをコードする、すなわちＲＮＡｉを誘発できる、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本開示のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクトである。たとえば、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのうちの少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、プロモーターたとえばＵ６プロモーターに機能的に連結されている、表３に記載のｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。
【0294】
一例では、本開示は、２つ以上のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含む複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、それぞれが本開示のＲＮＡをコードする配列を含む。たとえば、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの各ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、プロモーターたとえばＵ６プロモーターに機能的に連結されている、表３に記載のｓｈＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【0295】
一例では、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーター配列に機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；または
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーター配列に機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；または
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
【0296】
一例では、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；または
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；または
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
【0297】
別の例では、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；または
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；または
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
【0298】
本開示はまた、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉｉ）プロモーター、少なくとも５つのチミジン残基を含むターミネーター、及び任意選択の転写開始配列に機能的に連結されている本開示の少なくとも１つの他のＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
【0299】
本開示はまた、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
【0300】
本開示はまた、複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを提供し、該複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
（ｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；
（ｉｉ）Ｕ６プロモーター及び連続する６つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト；及び
（ｉｉｉ）Ｕ６プロモーター、１つのグアニン残基を含む転写開始配列、及び連続する５つのチミジン残基を含むターミネーターに機能的に連結されている配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする配列を含むｄｄＲＮＡｉコンストラクト
を含む。
【0301】
さらに、該または各ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、プロモーター、ＲＮＡコード配列及び／またはターミネーターエレメントが簡単に除去または置換できるように戦略的に配置されている１つまたは複数のクローニング部位及び／またはユニーク制限部位を含むことができる。該または各ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、戦略的に配置されている制限部位及び／または相補的粘着末端により、より小さいオリゴヌクレオチド成分の集合から構築することができる。本開示のあるアプローチのための塩基ベクターは、（絶対要件ではないが）全部位がユニークであるマルチリンカーを有するプラスミドを含む。順次、各プロモーターが所定のユニーク部位の間に挿入され、その結果として１つ以上のプロモーターを有する塩基カセットができ、これはすべて可変方向を有することができる。さらに、順次、アニールしたプライマー対が各プロモーターの下流のユニーク部位に挿入され、その結果としてシングル、ダブル、または複数発現カセットコンストラクトが生じる。これらのインサートは、シングル、ダブル、または複数発現カセットインサートに隣接する（互いに同じかまたは異なる）ユニーク制限酵素部位により、たとえばＡｄＶ主鎖へと移動させることができる。
【0302】
該または各コンストラクトの生成は、当業界で知られている任意の好適な遺伝子操作技法、たとえば限定ではないが、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製及びＤＮＡシーケンシングといった標準的な技法により達成することができる。該または各コンストラクトがウイルスコンストラクトである場合は、コンストラクトは、たとえば、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトをウイルス粒子にパッケージするのに必要な配列及び／またはｄｄＲＮＡｉコンストラクトを標的細胞ゲノムに組み込むことを可能にする配列を含む。いくつかの例では、該または各ウイルスコンストラクトはさらに、ウイルスの複製と増殖を可能にする遺伝子を含むが、そのような遺伝子はトランスで供給される。さらに、該または各ウイルスコンストラクトは、天然の形態でまたは修飾されて組み込まれる、任意の既知の生物のゲノム由来の遺伝子または遺伝子配列を含むことができる。たとえば、ウイルスコンストラクトは、細菌中でコンストラクトを複製するのに有用な配列を含むことができる。
【0303】
該または各コンストラクトは、さらなる遺伝子エレメントを含むことができる。コンストラクトに含むことができるエレメントの種類は何ら限定されず、当業者が選択することができる。たとえば、さらなる遺伝子エレメントとしては、ＧＦＰまたはＲＦＰなど蛍光マーカータンパク質の１つ以上の遺伝子などのレポーター遺伝子；ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または分泌型胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）アルカリホスファターゼなど簡単にアッセイできる酵素；あるいはホルモンやサイトカインなど免疫アッセイが容易にできるタンパク質を挙げることができる。
【0304】
本開示の実施形態で使用可能な他の遺伝子エレメントとしては、アデノシンデアミナーゼ、ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｄｉｃホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼなどの選択的増殖利点を細胞に与えるタンパク質をコードするもの、薬物耐性、あるいは栄養要求株にはない生合成能力を提供するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。該または各コンストラクトと一緒にレポーター遺伝子が含まれる場合、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むことができる。一例では、さらなる遺伝子エレメントは、独立したプロモーター／エンハンサーと機能的に連結され、それによって制御されている。さらに、細菌中でコンストラクトが増殖するための好適な複製起点を用いることもできる。複製起点の配列は、一般に、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト及び他の遺伝子配列から隔離される。そのような複製起点は当業界では知られており、ｐＵＣ、ＣｏｌＥ１、２ミクロンまたはＳＶ４０複製起点が挙げられる。
【0305】
発現コンストラクト
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、発現コンストラクト内に含まれている。
一例では、本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、発現コンストラクト内に含まれている。
【0306】
一例では、発現コンストラクトは発現ベクターである。
【0307】
一例では、発現ベクターは、たとえば当業界でも知られているように、プラスミドである。一例では、好適なプラスミド発現ベクターは、たとえばＵ６プロモーター及び近位配列因子７（ＰＳＥ７）を有する、ｐＳｓｈベクターである。
【0308】
一例では、発現ベクターは小環ＤＮＡである。小環ＤＮＡは、米国公開特許第２００４／０２１４３２９号で説明されている。小環ＤＮＡは、核酸転写が持続的に高レベルなので有用である。環状ベクターは、発現を抑制する細菌配列をもたないという特徴がある。たとえば、小環ベクターは、たとえばβ－ラクタマーゼ、ｔｅｔなどの細菌プラスミドでは一般的な複製起点や薬物選択マーカーが欠けているという点で、細菌プラスミドベクターと異なっている。したがって、小環ＤＮＡはサイズも小さくなり、より高効率の送達が可能になる。
【0309】
一例では、発現ベクターはウイルスベクターである。
【0310】
任意の適切なウイルスに基づくウイルスベクターを、本開示のｄｄＲＮＡｉの送達に用いることができる。さらに、ハイブリッドウイルス系を使用することもできる。ウイルス送達系の選択は、送達の標的である組織、系の形質導入効率、病原性、免疫原性、及び毒性の懸念などの様々なパラメーターに依存する。
【0311】
遺伝子治療で一般的に使用されるウイルス系のクラスは、そのゲノムが宿主細胞クロマチンに組み込まれる（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）か、染色体外エピソームとして細胞核内に優勢的に残る（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス及びヘルペスウイルス）かによって、２つのグループに分類することができる。一例では、本開示のウイルスベクターは宿主細胞クロマチンに組み込まれる。別の例では、本開示のウイルスベクターは染色体外エピソームとして宿主細胞の核に残る。
【0312】
一例では、ウイルスベクターはアデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターである。アデノウイルスは中型の二本鎖の無エンベロープ型ＤＮＡウイルスであり、ゲノムは線形で２６～４８Ｋｂｐである。アデノウイルスは、受容体媒介結合と内部移行によって標的細胞に入り込み、非分裂細胞でも分裂細胞でも核内に侵入する。アデノウイルスは、生存と複製をホスト細胞に大きく依存し、脊椎動物の核内でホストの複製機構を使って複製ができる。
【0313】
一例では、ウイルスベクターはＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属する。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーは、小型の一本鎖の無エンベロープ型ＤＮＡウイルスであり、ゲノムはおよそ５０００ヌクレオチド長である。このファミリーのメンバーにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）がある。一例では、本開示のウイルスベクターはＡＡＶである。ＡＡＶは、増殖性の感染サイクルを開始し維持するために、通常は別のウイルス（一般にアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との同時感染を要する依存型のパルボウイルスである。そのようなヘルパーウイルスの非存在下でも、ＡＡＶは、受容体媒介結合と内部移行によって標的細胞に入り込み、非分裂細胞でも分裂細胞でも核内に侵入することによって、なおも感染または形質導入の能力がある。ヘルパーウイルスの非存在下ではＡＡＶ感染から子孫ウイルスが生産されないので、形質導入の範囲は、ウイルス感染した初代細胞に限定される。ＡＡＶのこの特徴は、本開示のベクターとして望ましいものである。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスなどと違って、ＡＡＶにはヒトに対する病原性や毒性がないとされている（Ｋａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ４２４： ２５１ （２００３））。そのゲノムは通常２つの遺伝子しかコードしないので、送達ビヒクルとしてのＡＡＶのパッケージング容量が一本鎖４．５キロベース（ｋｂ）に限られるのも驚きに値しない。しかし、このサイズ制限のせいで置換遺伝子療法で送達できる遺伝子数が限定されるにしても、ｓｈＲＮＡなどの短い配列のパッケージングと発現には悪影響がない。
【0314】
本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトに有用な別のウイルス送達系は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属するウイルスに基づく系である。レトロウイルスには、独特の２つの特性により特徴づけられる一本鎖ＲＮＡ動物ウイルスが含まれる。１つめの特性は、レトロウイルスのゲノムは２つのＲＮＡ複製物からなる二倍体である、ということである。２つめの特性は、このＲＮＡは、ビリオン関連酵素のリバーストランスクリプターゼによって二本鎖ＤＮＡへと転写されることである。この二本鎖ＤＮＡまたはプロウイルスは、次に、ホストゲノムに組み込まれ、ホストゲノムに安定的に組み込まれた要素として親細胞から子孫細胞へと伝えられることが可能になる。
【0315】
いくつかの例では、ウイルスベクターはレンチウイルスである。レンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルスグリコプロテイン（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｉｔｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＶＳＶ－Ｇ）とシュードタイプ化されることが多く、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヒツジの脳炎（ビスナ）や肺炎の原因となるｖｉｓａｎ－ｍａｅｄｉ；ウマの自己免疫性溶血性貧血や脳症の原因となるウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコの免疫不全の原因となるネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシのリンパ節腫やリンパ球増加症の原因となるウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及び非ヒト霊長類で免疫不全や脳症の原因となるサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来している。ＨＩＶに基づくベクターは、通常、親ゲノムの５％未満を保持し、このゲノムの２５％未満がパッケージングコンストラクトに組み込まれ、したがって復帰複製能力のあるＨＩＶが生成する可能性は最小限となる。ベクター動員に必要なパッケージングのシグナルの転写を排除する、下流の末端反復配列中の制限エレメントの欠失を含む自己不活化ベクターの開発によって、バイオセーフティーがさらに向上している。レンチウイルスベクターを使用する主な利点の一つは、形質導入された細胞の分裂後もほとんどの組織または組織種で遺伝子トランスファーが続くことである。
【0316】
本開示のＲＮＡの発現に用いられるレンチウイルスに基づくコンストラクトは、レンチウイルスの５’及び３’末端反復配列（ＬＴＲ）の配列を含む。一例では、ウイルスコンストラクトは、レンチウイルスの不活化または自己不活化３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲは、当業界で知られているどのような方法で自己不活化させてもよい。
【0317】
たとえば、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、たとえばＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１及びＮＦ－カッパＢ部位の欠失を含んでいる。自己不活化３’ＬＴＲの結果として、ホストゲノムに組み込まれたプロウイルスは、不活化５’ＬＴＲを含むことになる。ＬＴＲ配列は、あらゆる種のあらゆるレンチウイルスのＬＴＲ配列であってよい。レンチウイルスに基づくコンストラクトには、ＭＭＬＶもしくはＭＳＣＶ、ＲＳＶまたは哺乳類遺伝子の配列を組み込むこともできる。さらに、レンチウイルス５’ＬＴＲのＵ３配列を、ウイルスコンストラクト中のプロモーター配列で置き換えることができる。こうすることで、パッケージング細胞株から回収されるウイルス力価を増加させることができる。エンハンサー配列も含まれる場合がある。
【0318】
当業者に知られている他のウイルス系または非ウイルス系も、目的とする細胞に本開示のｄｄＲＮＡｉまたは核酸を送達するのに使用することができ、限定ではないが遺伝子欠失アデノウイルス－トランスポゾンベクター（Ｙａｎｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０：９９９－１００４ （２００２）を参照のこと）；シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルス由来の系（Ｐｅｒｒｉ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４（２０）：９８０２－０７ （２００２）を参照のこと）；ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルス由来の系が挙げられる。
【0319】
本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉコンストラクトの試験
細胞培養モデル
ＨＢＶは培養液中の細胞には感染しない。しかし、ＨＢＶ ＤＮＡを（ヘッド・トゥー・テールの二量体として、または１００％を上回る「オーバーレングス」ゲノムとして）ＨｕＨ７またはＨｅｐＧ２肝細胞にトランスフェクションすると、ウイルス遺伝子が発現し、ＨＢＶビリオンが生産され培地中に放出される。そのような細胞株の一例は、安定的に完全ＨＢＶゲノム（血清型ａｙｗ、遺伝子型Ｄ）を有するＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞株のサブ細胞株、ＨｅｐＧ２．２．１５である。ＨｅｐＧ２．２．１５は、全ＨＢＶウイルスＲＮＡ及びタンパク質を発現し、ウイルスゲノムを生産し、ウイルス様粒子を分泌する。本明細書で例示するように、本開示のＲＮＡの活性は、ＲＮＡを細胞に投与した後、ＨＢＶゲノムによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定することによって、決定される。細胞内ＨＢＶ遺伝子発現は、Ｔａｑｍａｎ（商標）アッセイか他のリアルタイムＰＣＲアッセイによりＨＢＶ ＲＮＡを、またはＥＬＩＳＡによりＨＢＶタンパク質を、検定することができる。細胞外ウイルスは、ＰＣＲによりＤＮＡを、またはＥＬＩＳＡによりタンパク質を、検定することができる。ＨＢＶ表面抗原とコアタンパク質の抗体は市販されている。当業界では、トランスフェクション効率及びサンプル回収率の差異を正規化する様々な手段が知られている。最近の初代ヒト肝細胞を用いる細胞培養系の進歩のおかげで、ＨＢＶ治療剤の活性の決定能も向上しよう。
細胞培養モデル
ＨＢＶは培養液中の細胞には感染しない。しかし、ＨＢＶ ＤＮＡを（ヘッド・トゥー・テールの二量体として、または１００％を上回る「オーバーレングス」ゲノムとして）ＨｕＨ７またはＨｅｐＧ２肝細胞にトランスフェクションすると、ウイルス遺伝子が発現し、ＨＢＶビリオンが生産され培地中に放出される。そのような細胞株の一例は、安定的に完全ＨＢＶゲノム（血清型ａｙｗ、遺伝子型Ｄ）を有するＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞株のサブ細胞株、ＨｅｐＧ２．２．１５である。ＨｅｐＧ２．２．１５は、全ＨＢＶウイルスＲＮＡ及びタンパク質を発現し、ウイルスゲノムを生産し、ウイルス様粒子を分泌する。本明細書で例示するように、本開示のＲＮＡの活性は、ＲＮＡを細胞に投与した後、ＨＢＶゲノムによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを測定することによって、決定される。細胞内ＨＢＶ遺伝子発現は、Ｔａｑｍａｎ（商標）アッセイか他のリアルタイムＰＣＲアッセイによりＨＢＶ ＲＮＡを、またはＥＬＩＳＡによりＨＢＶタンパク質を、検定することができる。細胞外ウイルスは、ＰＣＲによりＤＮＡを、またはＥＬＩＳＡによりタンパク質を、検定することができる。ＨＢＶ表面抗原とコアタンパク質の抗体は市販されている。当業界では、トランスフェクション効率及びサンプル回収率の差異を正規化する様々な手段が知られている。最近の初代ヒト肝細胞を用いる細胞培養系の進歩のおかげで、ＨＢＶ治療剤の活性の決定能も向上しよう。
【0320】
ＨＢＶゲノムによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現を本開示のＲＮＡの非存在下と比べて少なくとも５０％減少させる本開示のＲＮＡは、本開示の方法で有用であると考えられる。
【0321】
動物モデル
ＨＢＶ複製の研究に用いることができる小動物モデルがいくつかある。その一つは、放射線照射マウスへのＨＢＶ感染肝臓組織の移植である。ウイルス血症（エビデンスはＰＣＲでＨＢＶ ＤＮＡを測定）は、移植後８日目に最初に検出され、１８～２５日目にピークになる（Ｉｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２９， ５５３－５６２）。
ＨＢＶ複製の研究に用いることができる小動物モデルがいくつかある。その一つは、放射線照射マウスへのＨＢＶ感染肝臓組織の移植である。ウイルス血症（エビデンスはＰＣＲでＨＢＶ ＤＮＡを測定）は、移植後８日目に最初に検出され、１８～２５日目にピークになる（Ｉｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２９， ５５３－５６２）。
【0322】
ＨＢＶを発現する遺伝子導入マウスも、抗ウイルス剤候補を評価するためのモデルとして用いられている。ＨＢＶ ＤＮＡは遺伝子導入マウスの肝臓でも血清でも検出可能である（Ｍｏｒｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．， ４２， ９７－１０８， １９９９）。
【0323】
さらなるモデルは、ＨＢＶをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞を用いてヌードマウスに皮下腫瘍を作製することである。腫瘍は接種から約２週間で発生し、ＨＢＶ表面抗原とＨＢＶコア抗原を発現する。ＨＢＶ ＤＮＡ及び表面抗原は腫瘍マウスの循環血中でも検出される（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．， ３， １９－２２， １９９６）。
【0324】
さらなるモデルは、ＰＸＢマウス、つまり肝臓疾患をもつ免疫不全マウス（ｕＰＡ／ＳＣＩＤ）にヒト肝細胞を移植したキメラグループのマウスを用いることである。ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスは相当な肝臓毒性を示すため、健常ヒト細胞を移植すると、ヒト肝細胞で７０～９０％再配置された健常かつ機能的な肝臓をもつマウスを作ることができる。ＰＸＢマウスの肝臓は組織構造的に正常であり、ヒト肝臓細胞の特徴の多くを示すため、このようなマウスはキメラ肝臓組織において活性ＨＢＶ感染を維持することができる。
【0325】
さらなるモデルは、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂモデルの使用である。これは、三次元の細胞培養プラットフォームであり、ヒト肝細胞がこのモデルに供給されると、ヒト肝臓の構造と生理を模倣するように集合する。このモデルは肝細胞だけでできているので、初のＢ型肝炎の長期的に安定した全ヒト完全ウイルス生活環モデルとされており、ＨＢＶ感染性生活環の重要な特性をいくつか再現している。
【0326】
上述した動物モデルはいずれも、本開示のＲＮＡによるＨＢＶ感染の治療または軽減の有効性の決定に用いることができる。
【0327】
担体
いくつかの例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、担体を含む組成物中に存在する。
いくつかの例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、担体を含む組成物中に存在する。
【0328】
いくつかの例では、担体は、脂質ベースの担体、カチオン性脂質、またはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子またはそれらの混合物である。
【0329】
いくつかの例では、担体は、カチオン性ポリマーと核酸の複合体などのポリマーベースの担体である。
【0330】
さらなる例では、担体は、シクロデキストリンポリマーと核酸の複合体などのシクロデキストリンベースの担体である。
【0331】
さらなる例では、担体は、カチオン性ペプチドと核酸の複合体などのタンパク質ベースの担体である。
【0332】
別の例では、担体は、脂質ナノ粒子である。例示的なナノ粒子は、たとえばＵＳ７５１４０９９で説明されている。
【0333】
いくつかの例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ（たとえば４０／４８／２／１０の比率）、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ／ＤＳＰＣ（たとえば４０／４８／２／１０の比率）、またはカチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（たとえば６０／３８／２の比率）を含む脂質ナノ粒子組成物と一緒に製剤される。いくつかの例では、カチオン性脂質はＤＭＡ中オクチルＣＬ、ＤＭＡ中ＤＬ、Ｌ－２７８、ＫＣ２ＤＭＡ中ＤＬ、またはＭＣ３である。
【0334】
別の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、ＷＯ２０１０／０２１８６５；ＷＯ２０１０／０８０７２４；ＷＯ２０１０／０４２８７７；ＷＯ２０１０／１０５２０９またはＷＯ２０１１／０２２４６０に記載のいずれかのカチオン性脂質製剤と一緒に製剤される。
【0335】
別の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、たとえば該ＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトの送達を容易にするために、別の化合物とコンジュゲートされているかまたは複合体化されている。そのようなコンジュゲートの非限定的な例が、ＵＳ２００８／０１５２６６１及びＵＳ２００４／０１６２２６０で説明されている（たとえば、ＣＤＭ－ＬＢＡ、ＣＤＭ－Ｐｉｐ－ＬＢＡ、ＣＤＭ－ＰＥＧ、ＣＤＭ－ＮＡＧなど）。
【0336】
別の例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトに共有結合的に付着している。付着ＰＥＧはどのような分子量でもよく、たとえば、約１００～約５０，０００ダルトン（Ｄａ）である。
【0337】
さらに他の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、たとえば、ＷＯ９６／１０３９１；ＷＯ９６／１０３９０；またはＷＯ９６／１０３９２で説明されているような、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、または血中滞留型リポソームまたはステルスリポソーム）を含む担体と一緒に製剤される。
【0338】
いくつかの例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－ｔｒｉ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）誘導体など、ポリエチレンイミンまたはその誘導体と一緒に製剤または複合体化される場合もある。一例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号で説明されるように製剤される。
【0339】
他の例では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号で説明されるような膜破壊剤と複合体化される。
【0340】
他の担体としては、シクロデキストリン（たとえばＧｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １０， １０６８－１０７４；またはＷＯ０３／４６１８５を参照のこと）、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡマイクロスフィア（たとえばＵＳ２００２１３０４３０を参照のこと）が挙げられる。
【0341】
組成物及び治療方法
本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、ＨＢＶ感染の予防または治療のための組成物に使用される。本開示の治療組成物は、単独で使用することもできるし、他の抗ウイルス剤などの１種以上の物質と併用することもできる。現在ＨＢＶの治療で認可されているのは、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、及びインターフェロンアルファである。本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、他の認可薬とは異なる機構でＨＢＶに作用するので、本開示の剤と他の抗ウイルス剤の併用治療で治療の有効性は大きく向上する一方で、たとえば長期ラミブジン治療の大きな問題となっているラミブジン耐性の発生などの薬物耐性の発生は大きく抑制されることが期待される。
本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、ＨＢＶ感染の予防または治療のための組成物に使用される。本開示の治療組成物は、単独で使用することもできるし、他の抗ウイルス剤などの１種以上の物質と併用することもできる。現在ＨＢＶの治療で認可されているのは、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、及びインターフェロンアルファである。本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、他の認可薬とは異なる機構でＨＢＶに作用するので、本開示の剤と他の抗ウイルス剤の併用治療で治療の有効性は大きく向上する一方で、たとえば長期ラミブジン治療の大きな問題となっているラミブジン耐性の発生などの薬物耐性の発生は大きく抑制されることが期待される。
【0342】
組成物は、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトの生物学的安定性を向上させる物質及び／または組成物が選択的に肝細胞に侵入する能力を向上させる物質を含むことが望ましい。本開示の治療組成物は、投与形態や投与経路、及び標準的な製剤上の慣例に基づき選択される製薬上許容される担体（たとえば、生理食塩水）中で投与することができる。当業者であれば、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトを含む医薬組成物を容易に製剤することができる。いくつかの場合には、等張剤が用いられる。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。いくつかの場合には、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定化剤としては、ゼラチンやアルブミンが挙げられる。いくつかの例では、血管収縮剤が製剤に添加される。本開示による組成物は、滅菌されパイロジェンを含まない状態で提供される。好適な製薬上の担体、及び製薬に用いられる製薬上必要な物質は、この分野の標準的な参照資料であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （旧Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．及びＵＳＰ／ＮＦに記載されている。
【0343】
投与経路としては、限定ではないが、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、髄腔内、動脈内、眼内及び経口ならびに経皮または吸引もしくは坐薬などが挙げられる。例示的な投与経路としては、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、皮内、動脈内及び皮下注射が挙げられる。本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトを送達するための、標的とするインビボの肝細胞トランスフェクションは、本明細書で説明するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターと、ラクトシルスペルミン（モノラクトシル化またはトリラクトシル化）とコレステリルスペルミンの混合物（たとえば、３５％／６５％の比率）の複合体（対ＤＮＡチャージ比率０．８でスペルミンを含有）を含む組成物をＩＶ注射することで達成することができる。そのような組成物は、製剤用途に有用であり、非経口投与用の、たとえばＩＶ（ＩＶ点滴を含む）、ＩＭ、ＳＣ及び腹腔内投与用の、好適な滅菌の非発熱性ビヒクル、たとえば注射用緩衝食塩水中で容易に製剤することができる。特定の組成物では、標的スペルミンなしのコレステリルスペルミン単剤などのｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃスペルミンと複合体化された本開示のｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、腹腔内注射や点滴などのいくつかの投与経路で、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトの肝臓への送達及びトランスフェクション、ならびにＲＮＡの発現を、有効に達成することができる。
【0344】
特別調合された送達ビヒクル中の本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトを含む滅菌済み医薬組成物の腹腔内投与（たとえば、超音波誘導腹腔内注射）は、肝細胞を含めた肝臓細胞による吸収を促進する有益な送達経路となることができる。
【0345】
医薬組成物の量、濃度、及び配合、ならびに用量計画は、炎症反応などの毒性を最小限化しながら最大限に細胞送達ができるように、個別調整することができる。たとえば所望により、活性成分が低濃度となる比較的大きな体積（５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌまたはそれ以上）を用いることや、コルチコステロイドなどの抗炎症性化合物を含有させることもできる。
【0346】
ＨＢＶに感染した個体では、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、ウイルスに対する免疫性を高めるように設計された治療ワクチン・プロトコルと合わせた前治療として有用であると予想される。また、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトは、職業上またはそれ以外でＨＢＶに暴露する可能性があるかまたはそのリスクが高い人に対する定期的な投与計画での予防対策としても有用であると予想される。
【0347】
キット
本開示はまた、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトをキットで提供する。キットは、容器を含む場合がある。典型的なキットには、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトと、投与に関する指示とが含まれる。いくつかの例では、キットには、本開示の２種以上のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクト及び／または本開示の別のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトが含まれる。
本開示はまた、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトをキットで提供する。キットは、容器を含む場合がある。典型的なキットには、本開示のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトと、投与に関する指示とが含まれる。いくつかの例では、キットには、本開示の２種以上のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクト及び／または本開示の別のＲＮＡまたはｄｄＲＮＡｉまたは発現コンストラクトが含まれる。
【実施例】
【0348】
実施例１ ｄｄＲＮＡｉコンストラクト設計の標的領域
ｄｄＲＮＡｉコンストラクト設計の標的となり得る配列を、全長ＨＢＶゲノムから特定した。簡単に説明すると、占有登録のされていない公開されているドメインソースから検索した配列から、ＨＢＶ配列のデータベースを編纂した。最初のコレクションは、ＧｅｎｂａｎｋのＲｅｌｅａｓｅ２０２．０（２０１４年６月１５日）から検索ワード｛ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ｝及び｛ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ＋ ｇｅｎｏｔｙｐｅ｝で編纂し、ヒトＨＢＶ配列のみを含めた。最初の配列アラインメントを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＭＵＳＣＬＥ ａｎｄ ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ、Ｒｅｌｅａｓｅ ５．０．１／５．２を用いて実施した。最初のアラインメントは、フォーマット化による配列差異（たとえば、配列開始部位のばらつき）、人工的ウイルス配列（たとえば、ＨＢＶベースのコンストラクト）、明白な外れ値（たとえば、質の悪いアラインメントまたは配列の質が悪いことを意味するＮを有するアラインメント）及び二重のエントリーなどアノテーションに誤りのある配列をそれぞれ除去するように手動で精選した。全ＨＢＶ遺伝子型（Ａ～Ｈ）の４３４５配列を含む残りの配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（高速と低速の両方）及びＭｅｇａｌｉｇｎ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、Ｒｅｌｅａｓｅ１２で再度アラインメントした。アラインメント結果は、全遺伝子型で、最も保存性の高い領域（少なくとも１８／２０ヌクレオチド）をスキャンした。最も保存性の高い１０領域をｓｈＲＮＡ設計の標的として選択した。特定したこれらの標的領域の配列を表１に示す。
ｄｄＲＮＡｉコンストラクト設計の標的となり得る配列を、全長ＨＢＶゲノムから特定した。簡単に説明すると、占有登録のされていない公開されているドメインソースから検索した配列から、ＨＢＶ配列のデータベースを編纂した。最初のコレクションは、ＧｅｎｂａｎｋのＲｅｌｅａｓｅ２０２．０（２０１４年６月１５日）から検索ワード｛ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ｝及び｛ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ＋ ｇｅｎｏｔｙｐｅ｝で編纂し、ヒトＨＢＶ配列のみを含めた。最初の配列アラインメントを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＭＵＳＣＬＥ ａｎｄ ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ、Ｒｅｌｅａｓｅ ５．０．１／５．２を用いて実施した。最初のアラインメントは、フォーマット化による配列差異（たとえば、配列開始部位のばらつき）、人工的ウイルス配列（たとえば、ＨＢＶベースのコンストラクト）、明白な外れ値（たとえば、質の悪いアラインメントまたは配列の質が悪いことを意味するＮを有するアラインメント）及び二重のエントリーなどアノテーションに誤りのある配列をそれぞれ除去するように手動で精選した。全ＨＢＶ遺伝子型（Ａ～Ｈ）の４３４５配列を含む残りの配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（高速と低速の両方）及びＭｅｇａｌｉｇｎ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、Ｒｅｌｅａｓｅ１２で再度アラインメントした。アラインメント結果は、全遺伝子型で、最も保存性の高い領域（少なくとも１８／２０ヌクレオチド）をスキャンした。最も保存性の高い１０領域をｓｈＲＮＡ設計の標的として選択した。特定したこれらの標的領域の配列を表１に示す。
【0349】
実施例２ ｓｉＲＮＡデュプレックス
表１に記載の標的領域にほぼ相補的なエフェクター配列を含むｓｉＲＮＡデュプレックスを設計した。これを表２に示す。ｓｉＲＮＡデュプレックスは、２ヌクレオチドの３’ｄＴｄＴオーバーハングを用いて合成した。
表１に記載の標的領域にほぼ相補的なエフェクター配列を含むｓｉＲＮＡデュプレックスを設計した。これを表２に示す。ｓｉＲＮＡデュプレックスは、２ヌクレオチドの３’ｄＴｄＴオーバーハングを用いて合成した。
【0350】
実施例３ デュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにおけるｓｉＲＮＡの活性
本開示のｓｉＲＮＡがＨＢＶ転写物の発現をノックダウンする有効性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞でデュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを実施した。
本開示のｓｉＲＮＡがＨＢＶ転写物の発現をノックダウンする有効性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞でデュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを実施した。
【0351】
領域４、領域５または領域９をそれぞれ標的とするＨＢＶ ｓｉＲＮＡの、ｐＧＬ３ルシフェラーゼ・レポーター・ベクターに基づくプラスミド・レポーター・コンストラクトを作製した。ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトは、両端に２０ｂｐの隣接配列を有する領域４、領域５または領域９のＨＢＶ ｓｈＲＮＡ標的配列をｐＧＬ３コントロール・ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）に挿入して生成した。これらのインサートは、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の３’ＵＴＲ内でＦｓｅＩ制限酵素部位及びＸｂａＩ制限酵素部位を用いてサブクローン化した。
【0352】
ＨＥＫ２９３細胞でデュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを実施した。ＨＥＫ２９３細胞株はＡＴＣＣ社（バージニア州マナサス）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。
【0353】
リポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２７とされる各ｓｈＲＮＡのアンチセンス配列及びセンス配列を有するＨＢＶ ｓｉＲＮＡ、及び対応する各ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションの各ウェルは、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００を用いて、１または２ｐｍｏｌのＨＢＶ ｓｉＲＮＡのうちの１つ、１０ｎｇの対応するルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクト、及び１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）を、同時トランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、ｓｉＲＮＡの阻害効率を無関係のｓｉＲＮＡつまりｓｉＧｌｏコントロールに対し正規化して計算した。ＨＥＫ２９３細胞中の、ｓｉＧｌｏコントロールに対し相対的な、各ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１５及びｓｈＲＮＡ２７）のセンス鎖とアンチセンス鎖のＨＢＶレポーター・コンストラクトの阻害率を表８に示し、図２に例示する。
【0354】
表８と図２からわかるように、わずか１ｐｍｏｌという少量でも、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２７とされる各ｓｈＲＮＡのアンチセンス配列及びセンス配列を有する例示的なｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞中ｐＧＬ３ルシフェラーゼ・レポーター・ベクターから発現するルシフェラーゼのレベルを減少させた。
【0355】
実施例４ ＨｅｐＧ２．２．１５細胞中で発現するＨＢＶ抗原に対するｓｉＲＮＡの活性
本開示のｓｉＲＮＡがＨＢＶ遺伝子の発現をノックダウンする有効性を試験するために、ＨｅｐＧ２．２．１５に本開示の代表的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害を検定した。
本開示のｓｉＲＮＡがＨＢＶ遺伝子の発現をノックダウンする有効性を試験するために、ＨｅｐＧ２．２．１５に本開示の代表的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害を検定した。
【0356】
ＨｅｐＧ２．２．１５は、完全ＨＢＶゲノム（血清型ａｙｗ、遺伝子型Ｄ）を安定的に有するＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞株のサブ細胞株である。ＨｅｐＧ２．２．１５は全ＨＢＶウイルスＲＮＡ及びタンパク質を発現し、ウイルスゲノムを生産し、ウイルス様粒子を分泌する。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞はジョージタウン大学のＢｒｅｎｔ Ｋｏｒｂａ博士により提供された。このＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、４％ウシ胎児血清、４ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で維持し、３７℃の加湿インキュベーター内で、５％ＣＯ２の雰囲気下で増殖させた。
【0357】
リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用い、浮遊液中で、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ２７とされる各ｓｈＲＮＡのアンチセンス配列及びセンス配列を有するＨＢＶ ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションはメーカーの指示通りに行った。各トランスフェクションは、２４ウェルの培養プレートにＨｅｐＧ２．２．１５細胞を９ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種し、１．５ｕＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘを用いて、５ｐｍｏｌのＨＢＶ ｓｉＲＮＡのうちのいずれか１つをトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後、ＲＮＡを得るため細胞を回収した。
【0358】
全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離した。全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて定量化し、作業濃度１０ｎｇ／μｌになるまで希釈した。全ＲＮＡを１００ナノグラム用い、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに使用してｃＤＮＡを合成した。
【0359】
ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨｂｘＡｇ、及びＧＡＰＤＨ中の領域の定量的ＰＣＲ増幅を、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び以下の表９に示すプライマーセットを用いて実施した。使用した標準リアルタイムＰＣＲ条件は、初回変性は９５℃で１０分、その後４０サイクルの９５℃で１５秒、及び６０℃で１分であった。
【0360】
ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対して決定した。ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨｂｘＡｇ ｍＲＮＡ発現の阻害率は、ネガティブ・コントロール（この場合はｓｉＧｌｏ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社））に対し相対的に計算した。ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害のレベルを表１０に示し、図３に例示する。図４は、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子ならびに各ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対し相対的なＨＢＶ ｓｉＲＮＡの位置を示す。
【0361】
実施例５ デュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにおけるｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの活性
本開示のｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトがＨＢＶ転写物をノックダウンする有効性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞でデュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを実施した。
本開示のｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトがＨＢＶ転写物をノックダウンする有効性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞でデュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを実施した。
【0362】
初期スクリーニングを実施して、以下の２６の本開示のｓｈＲＮＡの鎖の優先性を決定した：ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ１８、ｓｈＲＮＡ３５、ｓｈＲＮＡ３６、ｓｈＲＮＡ３９、ｓｈＲＮＡ５、ｓｈＲＮＡ６、ｓｈＲＮＡ７、ｓｈＲＮＡ８、ｓｈＲＮＡ２５、ｓｈＲＮＡ２６、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ４０、ｓｈＲＮＡ９、ｓｈＲＮＡ１０、ｓｈＲＮＡ１１、ｓｈＲＮＡ１２、ｓｈＲＮＡ３３、ｓｈＲＮＡ３４、ｓｈＲＮＡ１９、ｓｈＲＮＡ２０、ｓｈＲＮＡ２３、及びｓｈＲＮＡ２４。
【0363】
これら２６のｓｈＲＮＡ配列それぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖のｐＧＬ３ルシフェラーゼ・レポーター・ベクターに基づくプラスミド・レポーター・コンストラクトを作製した。ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトは、両端に２０ｂｐの隣接配列を有する各ｓｈＲＮＡのセンス鎖配列またはアンチセンス鎖配列（適宜）をｐＧＬ３コントロール・ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）に挿入して生成した。これらのインサートは、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子に次いでＦｓｅＩ制限酵素部位及びＸｂａＩ制限酵素部位を用いてサブクローン化した。
【0364】
ＨＥＫ２９３細胞株はＡＴＣＣ社（バージニア州マナサス）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。
【0365】
各ｓｈＲＮＡについて、それぞれのｓｈＲＮＡ配列をＵ６プロモーター及び近位配列因子７（ＰＳＥ７）と一緒にｐＳｓｈベクターに挿入することによりｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを作製した。Ｕ６プロモーターは、ヒトＵ６－１、Ｕ６－８またはＵ６－９配列のいずれかに基づいた。トランスフェクションの各ウェルは、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、対応するｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトと２つのルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトのうちの１つを１０：１（ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト：ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクト）の割合で、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞には１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（トランスフェクション・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定した。レポーター発現の阻害率をネガティブ・コントロール（この場合はヒトまたはマウスの配列に相同性のないランダムな非標的化配列を発現するためにＵ６－９プロモーターを用いたコンストラクトであり、これをＵ６－９ｃｏｎｔと称する）に対し相対的に計算した。Ｕ６－９ｃｏｎｔは、配列ＣＧＴＣＧＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＣＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴを発現するように設計した。この実験は反復実験とした。
【0366】
【0367】
検定した２６のｓｈＲＮＡのうち、それぞれのルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトからのルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力に基づいて、ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３６、ｓｈＲＮＡ２７、ｓｈＲＮＡ３０、ｓｈＲＮＡ９及びｓｈＲＮＡ２０の７つを次の試験のために選択した。これらの７つのｓｈＲＮＡを９ポイントの用量反応曲線に供してヘアピンの機能亢進特性を評価した。２つの用量曲線実験を行った：
実験１：ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｈＲＮＡ：標的の比を１：１～１：５０００としてトランスフェクションした。
実験２：ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｈＲＮＡ：標的の比を１０：１～１：５００としてトランスフェクションした。
実験１：ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｈＲＮＡ：標的の比を１：１～１：５０００としてトランスフェクションした。
実験２：ＨＥＫ２９３細胞に、ｓｈＲＮＡ：標的の比を１０：１～１：５００としてトランスフェクションした。
【0368】
実験１と実験２のそれぞれで、７つのｓｈＲＮＡを、アンチセンス鎖によってルシフェラーゼ活性の阻害を検出するように設計された、すなわちセンス鎖配列を含むルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトに対して試験した。レポーター・コンストラクトは上述したように設計した。それぞれのｓｈＲＮＡのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトも上述したとおりであった。
【0369】
実験１
ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２．５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。７つのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの各々について、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、ＨＥＫ２９３細胞を含むウェルに、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、２．５ｎｇ、０．８３ｎｇ、０．２８ｎｇ、０．０９ｎｇ、０．０３ｎｇ、または０．０１ｎｇのそれぞれのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、及び５０ｎｇの対応するルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、同時トランスフェクションした。細胞には、１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの阻害効率を計算した。
ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２．５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。７つのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの各々について、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、ＨＥＫ２９３細胞を含むウェルに、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、２．５ｎｇ、０．８３ｎｇ、０．２８ｎｇ、０．０９ｎｇ、０．０３ｎｇ、または０．０１ｎｇのそれぞれのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、及び５０ｎｇの対応するルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、同時トランスフェクションした。細胞には、１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの阻害効率を計算した。
【0370】
【0371】
実験２
ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２．５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。７つのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの各々について、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、ＨＥＫ２９３細胞を含むウェルに、１００ｎｇ、５０ｎｇ、２０ｎｇ、５ｎｇ、１．６７ｎｇ、０．５６ｎｇ、０．１９ｎｇ、０．０６ｎｇ、または０．０２ｎｇのそれぞれのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、及び１０ｎｇの対応するルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、同時トランスフェクションした。細胞には、１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの阻害効率を計算した。
ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２．５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。７つのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの各々について、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、ＨＥＫ２９３細胞を含むウェルに、１００ｎｇ、５０ｎｇ、２０ｎｇ、５ｎｇ、１．６７ｎｇ、０．５６ｎｇ、０．１９ｎｇ、０．０６ｎｇ、または０．０２ｎｇのそれぞれのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、及び１０ｎｇの対応するルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、同時トランスフェクションした。細胞には、１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの阻害効率を計算した。
【0372】
【0373】
実施例６ フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションされたｄｄＲＮＡの機能亢進特性
実施例５で説明した７つのリードｄｄＲＮＡｉコンストラクトの機能亢進特性を、次に、ＨＥＫ２９３細胞にＵ６９－ＰＳＥ７ｆｉｘ－Ｒａｎｄｏｍ１００（ｐＢＬ－１５３）フィラー・プラスミドと同時トランスフェクトした場合について評価した。
実施例５で説明した７つのリードｄｄＲＮＡｉコンストラクトの機能亢進特性を、次に、ＨＥＫ２９３細胞にＵ６９－ＰＳＥ７ｆｉｘ－Ｒａｎｄｏｍ１００（ｐＢＬ－１５３）フィラー・プラスミドと同時トランスフェクトした場合について評価した。
【0374】
ｄｄＲＮＡｉコンストラクトの７つのｓｈＲＮＡ配列それぞれのセンス鎖とアンチセンス鎖の、ｐＧＬ３ルシフェラーゼ・レポーター・ベクターに基づくプラスミド・レポーター・コンストラクトを、上述したようにして調製した。
【0375】
ＨＥＫ２９３細胞を上述した方法にしたがい培養し、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２．５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。７つのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの各々について、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、ＨＥＫ２９３細胞を含むウェルに、（ｉ）５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、２．５ｎｇ、０．８３ｎｇ、０．２８ｎｇ、０．０９ｎｇ、０．０３ｎｇ、または０．０１ｎｇのそれぞれのｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、（ｉｉ）最終ＤＮＡ含量を５０ｎｇに調節するための様々な量のフィラー・プラスミド、及び（ｉｉｉ）５０ｎｇの対応するルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、同時トランスフェクションした。細胞には、１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトの阻害効率を計算した。
【0376】
フィラー・プラスミドと同時トランスフェクションしたときの、各ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトがそれぞれのルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトからのルシフェラーゼの発現を用量依存的に阻害する能力を、図８ａ～図８ｊに例示する。
【0377】
実施例７ バリアントｓｈＲＮＡのＨＢＶ阻害活性
２つのバリアントｓｈＲＮＡを設計し、ｓｈＲＮＡ９（配列番号７３）及びｓｈＲＮＡ２０（配列番号８４）とされる各ｓｈＲＮＡについて調製した。調製したバリアントは以下の通りであった：
ｓｈＲＮＡ１３（配列番号７７）；
ｓｈＲＮＡ１４（配列番号７８）；
ｓｈＲＮＡ２１（配列番号８５）；及び
ｓｈＲＮＡ２２（配列番号８６）。
２つのバリアントｓｈＲＮＡを設計し、ｓｈＲＮＡ９（配列番号７３）及びｓｈＲＮＡ２０（配列番号８４）とされる各ｓｈＲＮＡについて調製した。調製したバリアントは以下の通りであった：
ｓｈＲＮＡ１３（配列番号７７）；
ｓｈＲＮＡ１４（配列番号７８）；
ｓｈＲＮＡ２１（配列番号８５）；及び
ｓｈＲＮＡ２２（配列番号８６）。
【0378】
ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、一方はＵ６９－ＰＳＥ７－Ｕ６８ハイブリッドプロモーターを含み、他方はＵ６９－ＰＳＥ７プロモーターを含んでいる、２つのｐＰｓｈベクターに、オリジナルとバリアントの各ｓｈＲＮＡ配列を挿入することによって、調製した。次いでＨＥＫ２９３細胞でデュアルルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを実施して、様々なｓｈＲＮＡがＨＢＶ遺伝子の発現をノックダウンする有効性を試験した。
【0379】
各ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトのｓｈＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを上述の方法にしたがい調製した。
【0380】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベーター内で培養した。ＨＥＫ２９３細胞はトランスフェクションの１日前に、９６ウェルの培養プレートに２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。
【0381】
トランスフェクションの各ウェルについて、０．３ｕＬのリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いて、１０ｎｇの対応するｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、及び１００ｎｇの２つのルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトのうちの１つを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞には、５ｎｇのＲｅｎｉｌｌａレポーター・コンストラクト（ローディング・コントロールとした）もトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ライセートを回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で解析した。各ウェルのホタル／Ｒｅｎｉｌｌａの活性比を決定し、それぞれのｓｈＲＮＡの阻害効率を計算した。各ｓｈＲＮＡがそれぞれのルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトからのルシフェラーゼタンパク質の発現を阻害する能力を図９ａ～図９ｂに示す。
【0382】
実施例８ ＡｄＶ－ｓｈＲＮＡベクターの調製
ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ配列を合成し、修飾Ｕ６－１、Ｕ６－８、またはＵ６－９プロモーターの下流でクローン化した。発現カセット全体をＶｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ペンシルバニア州モルバーン）のウイルス生産用アデノウイルス（ＡｄＶ）コンストラクト中にサブクローン化した。
ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ配列を合成し、修飾Ｕ６－１、Ｕ６－８、またはＵ６－９プロモーターの下流でクローン化した。発現カセット全体をＶｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ペンシルバニア州モルバーン）のウイルス生産用アデノウイルス（ＡｄＶ）コンストラクト中にサブクローン化した。
【0383】
実施例９ ＨｅｐＧ２．２．１５細胞中ＨＢＶ転写物のｓｈＲＮＡによるノックダウン
実施例８にしたがい、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを調製した。
実施例８にしたがい、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを調製した。
【0384】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、実施例４で説明した後続のＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶ ベクターを用いる形質導入の方法にしたがい調製した。次いでＨｅｐＧ２．２．１５細胞を浮遊液中でＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターに感染させ、２４ウェル・プレートで培養した。簡単に説明すると、各ウェルは、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞１．０ｘ１０５個とＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶ ベクターのうちの１つをＭＯＩ ６、１５、３０、６０、９０、または１２０で含む浮遊液を収容した。トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ発現カセットでの治療をシミュレートするために、細胞培養液を、３つのＨＢＶ ｓｈＲＮＡアデノウイルスにもそれぞれＭＯＩ ２、５、１０、２０、３０、４０、６０、または９０で同時に感染させた。シミュレートしたトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ発現カセットは（ｉ）ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ１５／ｓｈＲＮＡ２８と（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８であった。形質導入後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間培養した後回収し、ＲＮＡとＤＮＡを、それぞれＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットとＱｉＡｍｐ ＤＮＡミニキット（カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。
【0385】
全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離した。全ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ １０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて定量化し、作業濃度１０ｎｇ／μｌになるまで希釈した。
【0386】
ＡｄＶベクターによるｓｈＲＮＡの生産を、Ｑｉａｇｅｎ社（カリフォルニア州バレンシア）のｍｉＳｃｒｉｐｔ ＰＣＲ装置を用いて測定した。各ＲＴ－ｑＰＣＲ解析では、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキットを用いて５０ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。次いでＱｉａｇｅｎ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲグリーンＰＣＲキットを表１１に示すカスタム・プライマーと一緒に用いてｓｈＲＮＡの定量ＰＣＲを行った。使用したリアルタイムＰＣＲ条件は、初回変性は９５℃で１５分、その後４０サイクルの９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７０℃で３０秒であった。
【0387】
様々なｓｈＲＮＡの発現レベルの決定を支援するために、ｓｈＲＮＡから処理されると予測されるガイドＲＮＡ配列（表１２）のｑＰＣＲ標準アッセイを開発した。
【0388】
これらのアッセイの標準曲線を、これらのガイドＲＮＡの既知量を増幅することにより作成した。これを図１０に示す。細胞１個当たりのＲＮＡ複製数を、各細胞中の全ＲＮＡ２０ｎｇという見積もりに基づき計算した。細胞１個当たりのｓｈＲＮＡ複製数は、様々なＭＯＩで個別に発現させたときと、様々なＭＯＩでトリプレットの組合せで同時発現させたときの、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８のそれぞれについて決定された（図１１ａ～１１ｄ）。全般的に、トリプレットのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶの組合せを形質導入した細胞中の個々のｓｈＲＮＡの発現は、シングルのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入した細胞よりも、等価用量たとえばＭＯＩ ３０対ＭＯＩ ３０＋３０＋３０で、１．５～２．０倍低かった。
【0389】
次いで、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを、各試料につきＨＢＶ ｍＲＮＡ転写物のレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対し正規化することによって、決定した。簡単に説明すると、１００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）をメーカーの指示通りに用いてｃＤＮＡを合成した。ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨｂｘＡｇ、及びＧＡＰＤＨ中の各領域の定量ＰＣＲ増幅を、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及び表９に挙げたプライマーセットを用いて実施した。使用した標準リアルタイムＰＣＲ条件は、初回変性は９５℃で１０分、その後４０サイクルの９５℃で１５秒、及び６０℃で１分であった。
【0390】
様々なＭＯＩで個別に発現させたときとトリプレットの組合せで同時発現させたときの、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８それぞれについて、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを、図１２ａ～図１２ｆに例示する。図１２ａ～図１２ｆから明白であるように、トリプレットの組合せは、特により低い等価の用量として形質導入したときに、シングルｓｈＲＮＡコンストラクトよりも優れたＨＢＶ ＲＮＡのノックダウンを示した。
【0391】
実施例１０ ＨｅｐＧ２．２．１５細胞中ＨＢＶ転写物のｓｈＲＮＡによるノックダウン
実施例８にしたがい、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡのシングルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを調製した。
実施例８にしたがい、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７、ｓｈＲＮＡ２８とされる各ｓｈＲＮＡのシングルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを調製した。
【0392】
また、それぞれがトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ発現カセットを含む２つのトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターも調製した。トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ発現カセットは、それぞれ、（ｉ）ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ１５／ｓｈＲＮＡ２８と（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８のコード配列、及びカセットの各ｓｈＲＮＡコード配列のすぐ上流に配置される３つの修飾Ｕ６プロモーター（すなわち、Ｕ６－１、Ｕ６－８、またはＵ６－９プロモーター）で構成した。トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ発現カセットをそれぞれ合成し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ社（ペンシルバニア州モルバーン）のウイルス生産用アデノウイルス（ＡｄＶ）コンストラクト中にサブクローン化した。
【0393】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は、実施例４で説明した方法にしたがい調製した。次いでＨｅｐＧ２．２．１５細胞を浮遊液中でシングルまたはトリプルのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターに感染させ、２４ウェル・プレートで培養した。簡単に説明すると、各ウェルは、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞１．２ｘ１０５個とシングルまたはトリプルのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターのうちの１つをＭＯＩ １００で含む浮遊液を収容した。形質導入後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間、９６時間、１２０時間、及び１４４時間培養した後回収し、ＲＮＡとＤＮＡをそれぞれＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットとＱｉＡｍｐ ＤＮＡミニキット（カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。
【0394】
全ＲＮＡを実施例９で説明した方法にしたがい単離し、調製した。ＡｄＶベクターによるｓｈＲＮＡの生産も実施例９で説明した方法にしたがい測定した。
【0395】
ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８それぞれについて、ＭＯＩ １００でシングルまたはトリプルのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター（複数可）から発現させたときの、細胞１個当たりのｓｈＲＮＡ複製物を決定した（図１３ａ～図１３ｄ）。全般的に、７２時間での、トリプレットＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入した細胞での個々のｓｈＲＮＡの発現は、シングルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを形質導入した細胞に匹敵した。ｓｈＲＮＡｌ５とｓｈＲＮＡ３７は形質導入から６日たっても蓄積し続けたが、ｓｈＲＮＡ１４とｓｈＲＮＡ２８の発現レベルは５日目に平坦化したようだった。
【0396】
ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを、各試料につきＨＢＶ ｍＲＮＡ転写物のレベルを実施例９で説明した方法にしたがいＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化することによって、決定した。
【0397】
７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間での、ＭＯＩ １００でシングルまたはトリプルのＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクター（複数可）から発現させたときの、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ１５、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８のそれぞれについて、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルに対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを、図１４ａ～図１４ｆに例示する。図１４ａ～図１４ｆからわかるように、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターは、７２時間（３日目）で、対応するシングルのｓｈＲＮＡベクターよりもかなり優れたＨＢＶ ＲＮＡのノックダウンを示した。すべてのシングルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターは、長時間を要してノックダウンの向上を示し、１４４時間（６日目）でトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターに匹敵した。１４４時間で、ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターは、ＨＢｓＡｇ領域とＨＢｘＡｇ領域で９０％以上のノックダウン率を達成し、ＨＢｃＡｇ領域でも８０％近いノックダウン率を示した。
【0398】
実施例１１ インビトロのＨＢＶ転写物の阻害
発明者らは、新規にＨＢＶ接種により感染させた細胞モデルで、ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターが共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の形成に及ぼす効果を決定した。
発明者らは、新規にＨＢＶ接種により感染させた細胞モデルで、ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターが共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の形成に及ぼす効果を決定した。
【0399】
ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを、実施例１０にしたがい調製した。
【0400】
ヒト肝細胞を、肝臓の大部分がヒト肝細胞で置換されている（すなわちヒト化肝臓をもつ）キメラマウスであるＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏマウスモデル（ＰＸＢマウス（登録商標））から単離した。この単離したヒト肝細胞（ＰＸＢ細胞）を、接種の１日前に、２４ウェルの培養プレートに４．０ｘ１０５細胞／ウェルの密度で播種した。次いで０日目に、ＰＸＢ細胞にＨＢＶを接種した。接種後、細胞を、（ｉ）ＭＯＩ １０、３０、６０及び１００でトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理、または（ｉｉ）ＭＯＩ １０、３０、６０及び１００でＡｄＶベクター主鎖で処理、または（ｉｉｉ）無処理とし、次いで３７℃、５％ＣＯ２で６日間、１１日間、及び１６日間培養してから回収し、ＲＮＡとＤＮＡを、それぞれＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットとＱｉＡｍｐ ＤＮＡミニキット（カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。
【0401】
ＭＯＩ １０でトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを接種したＰＸＢ細胞について、実施例９で説明した方法にしたがい、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８のそれぞれについて処理後６日目、１１日目、及び１６日目の細胞１個当たりのｓｈＲＮＡ複製物を決定した（図１５ａ）。トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターによる処理後６日目にＨＢＶ転写物の有効なノックダウン（７８～８５％）が観察され、その後の観察でこのノックダウンは１６日目に９７～９９％にまで増加したことが観察された。６日目から１６日目にかけてのこのＨＢＶ転写物ノックダウンの増加は、同時のＡｄＶベクターによるｓｈＲＮＡ生産の増加と一致していることが見出された。
【0402】
実施例９で説明した方法にしたがい、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理した細胞の、ＡｄＶ主鎖のみで処理した細胞に対し相対的な、ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＨｂｘＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物の阻害レベルを測定した（図１５ｂ）。
【0403】
トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターでの処理後の細胞内と細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのレベルも、リアルタイムＰＣＲアッセイで測定した。これを図１５ｃに例示する。処理後１１日目、細胞内ＨＢＶ ＤＮＡは８５％の減少が、細胞外ＨＢＶ ＤＮＡは１ ｌｏｇの減少が、観察された。
【0404】
ＨＢＶ抗原ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対応する領域のＨＢＶ転写物のレベルを、実施例９で説明した方法にしたがい測定した。その結果を図１５ｄに例示する。１１日目に、細胞外ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇのレベルは、ＡｄＶ主鎖コントロールと比べてトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理した細胞でおよそ９０％減少したことが観察された。
【0405】
トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターでの処理後、ＰＸＢ細胞中のｃｃｃＤＮＡのレベルも測定した。その結果を図１５ｅに例示する。処理後１１日目、ＡｄＶ主鎖コントロールで処理したＨＢＶ感染ＰＸＢ細胞及び無処理ＰＸＢ細胞と比べて、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターで処理したＨＢＶ感染ＰＸＢ細胞で６６％のｃｃｃＤＮＡの減少が観察された。
【0406】
実施例１２ ＨＢＶ転写物のインビボの阻害
ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターが（ｉ）ＨＢＶウイルス転写物の発現、（ｉｉ）細胞外ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ、（ｉｉｉ）細胞外及び細胞内のＨＢＶ ＤＮＡ、及び（ｉｖ）ｃｃｃＤＮＡの形成のそれぞれに及ぼすインビボの効果を、新規にＨＢＶ接種により感染させたＰＸＢマウスモデルで決定した。
ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターが（ｉ）ＨＢＶウイルス転写物の発現、（ｉｉ）細胞外ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ、（ｉｉｉ）細胞外及び細胞内のＨＢＶ ＤＮＡ、及び（ｉｖ）ｃｃｃＤＮＡの形成のそれぞれに及ぼすインビボの効果を、新規にＨＢＶ接種により感染させたＰＸＢマウスモデルで決定した。
【0407】
方法
ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを実施例１０にしたがい調製した。
ｓｈＲＮＡ１４／ｓｈＲＮＡ３７／ｓｈＲＮＡ２８を発現するトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを実施例１０にしたがい調製した。
【0408】
キメラＰＸＢマウス（ＰＸＢマウス（登録商標））をＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ社から入手した。全てのマウスは、実験の間中、温度２３±５℃、湿度５５±２５％下で個別に収容し、１２時間ごとの明暗サイクルに置き、自由に餌と水を取らせた。
【0409】
簡単に説明すると、１９～２３週齢の雄のＰＸＢマウスにＨＢＶ遺伝子型Ｃを接種し、４週間インキュベートして、ベースラインのＨＢＶ感染を作った。ベースラインのＨＢＶ感染を決定するために、マウスから－２８日目、－２１日目、－１４日目、及び－７日目（すなわち、それぞれ接種後０日目、７日目、１４日目、及び２１日目）に採血し、ヒトアルブミン（ｈ－Ａｌｂ）濃度、ならびにＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの血清濃度を決定した。
【0410】
各時点での動物からの採血は、後眼窩神経叢／洞を介するイソフルラン（Ｅｓｃａｉｎ（登録商標）、Ｍｙｌａｎ社、日本国大阪）麻酔下で、Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ（商標）ポリエチレンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、米国ニュージャージー州）を用いて実施した。
【0411】
血中ｈ－Ａｌｂ濃度を測定するために、２μＬの全血を食塩水で希釈し、臨床化学アナライザー（ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ（商標）シリーズＪＣＡ－ＢＭ６０５０、ＪＥＯＬ社、日本国東京）を使用して、ラテックス凝集免疫比濁法（ＬＺ試験「Ｅｉｋｅｎ」Ｕ－ＡＬＢ、Ｅｉｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、日本国東京）により、血中ｈ－Ａｌｂ濃度を測定した。
【0412】
ＨＢＶ ＤＮＡの定量化、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの解析のために全血を遠心分離して血清を分離した。
【0413】
血清ＨＢＶ ＤＮＡを測定するために、ＳＭＩＴＥＳＴＥＸ－Ｒ＆Ｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＥＤＩＣＡＬ＆ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社、日本国名古屋）を用いて５μＬの血清からＨＢＶ ＤＮＡを抽出した。次いで精製したＤＮＡをヌクレアーゼを含有しない水２０μＬ（Ａｍｂｉｏｎ）に溶解させた。ＨＢＶ感染ＰＸＢマウスから採取した血清をＨＢＶ ＤＮＡ標準として用いた。合成ＨＢＶ ＤＮＡを用いてＨＢＶ ＤＮＡの濃度を決定し、次いでこれを血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルの定量化に用いた。ＨＢＶ ＤＮＡ標準からＨＢＶ ＤＮＡを抽出し、適宜希釈した後リアルタイムＰＣＲに用いた。この試験で使用した標準の範囲は４．０Ｅ＋０４～２．０Ｅ＋０９複製物／ｍＬであった。
【0414】
血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を測定するため、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７５００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。抽出した５μＬのＤＮＡにＰＣＲ反応混合物を加えた。最初に５０℃で２分かけてウラシル－Ｎ－グリコシラーゼを活性化し、次いで９５℃で２０秒かけてポリメラーゼを活性化した。次のＰＣＲ増幅は、ＡＢＩ ７５００配列検出装置で、５３サイクルの９５℃で３秒の変性、及び１サイクルにつき６０℃で３２秒のアニーリング及び伸長からなった。血清ＨＢＶ ＤＮＡの平均レベルを２つの別のウェルの値から計算した。
【0415】
リアルタイムＰＣＲで用いたプライマーとプローブは以下の通りであった。
【0416】
このアッセイの定量化の下限は４．０Ｅ＋０４複製物／ｍＬ血清であった。
【0417】
血清ＨＢｓＡｇ濃度は、Ａｂｂｏｔｔ社が開発したＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＳＹＳＴＥＭ）を使って、ＳＲＬ社（日本国東京）が決定した。希釈係数は３０であり、このアッセイの測定範囲は０．０５～２５０ＩＵ／ｍＬであった。３０倍希釈試料は、測定範囲が１．５～７５００ＩＵ／ｍＬとなるように調節された。
【0418】
血清ＨＢｅＡｇ濃度は、Ａｂｂｏｔｔ社が開発したＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＳＹＳＴＥＭ）を使って、ＳＲＬ社（日本国東京）が決定した。希釈係数は３０であり、このアッセイの定量化の下限は０．５Ｓ／ＣＯであった。３０倍希釈試料は、定量化下限が１５Ｓ／ＣＯとなるように調節された。
【0419】
動物は、以下の基準を満たしていれば次の処置実験に含めた。
（ｉ）－１日（すなわちＨＢＶ接種後２７日）時点で体重が１５ｇ以上である；
（ｉｉ）－７日（すなわちＨＢＶ接種後２１日）時点で血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度が少なくとも１．０Ｅ＋６複製物／ｍＬである；及び
（ｉｉｉ）－７日（すなわちＨＢＶ接種後２１日）時点でｈ－Ａｌｂ測定値が１０ｍｇ／ｍＬ以上である。
（ｉ）－１日（すなわちＨＢＶ接種後２７日）時点で体重が１５ｇ以上である；
（ｉｉ）－７日（すなわちＨＢＶ接種後２１日）時点で血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度が少なくとも１．０Ｅ＋６複製物／ｍＬである；及び
（ｉｉｉ）－７日（すなわちＨＢＶ接種後２１日）時点でｈ－Ａｌｂ測定値が１０ｍｇ／ｍＬ以上である。
【0420】
ベースラインＨＢＶ感染し、上記の基準を満たすマウスを３つの処置群、すなわち第１群～第３群（各群ｎ＝４）に分けた。群間のばらつきを最小限化するために、群の構成は、体重の相加平均値に基づき、かつ血中ｈ－Ａｌｂ濃度及び血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度の幾何平均値に基づき、ランダム化した。
【0421】
処置群は以下の通りであった：
第１群：無処置；
第２群：２．００Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬのトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを含有する１０μＬ／体重グラムの用量のシングルボーラスをＩＶ注射により尾静脈に送達；
第３群：２．００Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬのトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを含有する１０μＬ／体重グラムの用量のシングルボーラスをＩＶ注射により尾静脈に送達。
第１群：無処置；
第２群：２．００Ｅ＋１１ｖｇ／ｍＬのトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを含有する１０μＬ／体重グラムの用量のシングルボーラスをＩＶ注射により尾静脈に送達；
第３群：２．００Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬのトリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを含有する１０μＬ／体重グラムの用量のシングルボーラスをＩＶ注射により尾静脈に送達。
【0422】
各処置の投与（０日目）後、動物をさらに５６日間インキュベートした。この間、８週にわたり毎週採血し（処置後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、４９日目、及び５６日目）、細胞外ＨＢｓＡｇ、細胞外ＨＢｅＡｇ、及び細胞外ＨＢＶ ＤＮＡの血清濃度を上述した方法によりリアルタイムＰＣＲで決定した。
【0423】
５６日目の採血の終了後、生存動物をすべてイソフルラン麻酔下で心臓穿刺及び瀉血により安楽死させた。
【0424】
安楽死後、マウスから全肝臓を摘出し、計量した。左外側葉から厚さ３～５ｍｍの切片を得、これを一辺がおよそ１～２ｍｍの立方体に切った。これらの肝臓立方体を、できるだけ迅速に、ラベルを貼ったチューブに移し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）液（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に浸した。これらの肝臓の検体を５ボリューム以上のＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）中、４℃で一晩インキュベートして、組織に液を浸透させた。インキュベーション後、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）液を除去し、後の肝臓ＨＢＶ ＤＮＡレベルの定量化のために肝臓片を－８０℃で保管した。
【0425】
処置後の肝臓ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを決定するために、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）で保存した冷凍肝臓組織から、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、日本国東京）を用いてＨＢＶ ＤＮＡを抽出した。ヌクレアーゼを含有しない水２００μＬにＤＮＡを溶解させ、その後ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ６１３１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、日本国東京）を用いてＤＮＡ溶液の濃度を決定した。ＤＮＡ溶液の濃度は、ヌクレアーゼを含有しない水を用いて２０ｎｇ／μＬになるように調節した。
【0426】
次に、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７５００配列検出装置を用いてリアルタイムＰＣＲを実施して、肝臓ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ濃度を測定した。簡単に説明すると、ＰＣＲ反応混合物を５μＬの抽出ＤＮＡに加えた。ＰＣＲ反応は、Ｔａｋｋｅｎｂｅｒｇの条件に基づき実施した。最初に５０℃で２分かけてウラシル－Ｎ－グリコシラーゼを活性化し、次いで９５℃で２０秒かけてポリメラーゼを活性化した。次の５５サイクルのＰＣＲ増幅は、ＡＢＩ ７５００配列検出装置で各サイクルにつき９５℃で３秒、６０℃で３２秒で実施した。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの平均レベルを２つの別のウェルの値から計算した。ＨＢＶ完全ゲノム配列を含むプラスミドをＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ定量化の標準試料として用いた。使用した標準の範囲は１．０Ｅ＋０２～１．０Ｅ＋０５複製物／１００ｎｇ ＤＮＡであった。
【0427】
リアルタイムＰＣＲで使用したプライマー及びプローブは以下の通りであった。
【0428】
このアッセイの定量化の下限は、抽出ＤＮＡ溶液中、１．０Ｅ＋０２複製物／１００ｎｇ ＤＮＡであった。
【0429】
結果
処置の間中、どの動物も開始レベルの８０％以上の体重を維持した。さらに、第２群と第３群の体重の最低平均値は、処置を受けなかったコントロール群よりもわずかに低かった。
処置の間中、どの動物も開始レベルの８０％以上の体重を維持した。さらに、第２群と第３群の体重の最低平均値は、処置を受けなかったコントロール群よりもわずかに低かった。
【0430】
図１６及び図１７からわかるように、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターを受けた処置群の動物は、実験の間中、コントロール処置を受けた第１群の動物よりも安定して血清ＨＢＶ ＤＮＡの減少を見せた。５６日目、中用量処置を受けた動物（第２群）は平均０．５９ ｌｏｇ、７４．４％の血清ＨＢＶ ＤＮＡの減少を示し、高用量処置を受けた動物（第３群）は平均１．８３ ｌｏｇ、９８．５％の血清ＨＢＶ ＤＮＡの減少を示した。
【0431】
同様に、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターでの処置後のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの血清濃度（図１８及び図１９）も、コントロール処置を受けた第１群の動物よりも安定して減少した。５６日目、中用量処置を受けた動物（第２群）は、平均７８．４％の血清ＨＢｓＡｇレベルの減少、平均６３．６％の血清ＨＢｅＡｇレベルの減少を示し、高用量処置を受けた動物（第３群）は平均９７．６％の血清ＨＢｓＡｇレベルの減少、平均９２．６％の血清ＨＢｅＡｇレベルの減少を示した。
【0432】
５６日目の細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡのレベルも、中用量と高用量の処置群（それぞれ第２群と第３群）の動物は、コントロール処置を受けた第１群の動物よりも減少したことが示された。たとえば、図２０で例示するように、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターの中用量と高用量での処置の結果、５６日目の細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ複製数はそれぞれ４８．６％と９４．９％の減少となった。同様に、図２１は、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターの中用量と高用量での処置の結果、５６日目のｃｃｃＤＮＡ複製数はそれぞれ３６．９％と５７．７％の減少となったことを示している。
【0433】
トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターにより発現するｓｈＲＮＡ（すなわち、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８）に対応するＨＢＶウイルス転写物の阻害レベルも５６日目にリアルタイムＰＣＲで測定した。図２２に示すように、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８に対応するウイルスＲＮＡは、中用量で処置した第２群の動物で、コントロール処置を投与した第１群の動物におけるそれらのＨＢＶウイルス転写物の発現レベルに対し、３９．４％、３９．２％及び５３．３％減少した。同様に、図Ｙは、ｓｈＲＮＡ１４、ｓｈＲＮＡ３７及びｓｈＲＮＡ２８に対応するウイルスＲＮＡは、高用量で処置した第３群の動物で、コントロール処置を投与した第１群の動物におけるそれらのＨＢＶウイルス転写物の発現レベルに対し、８６．２％、８２．０％及び８９．１％減少したことを示している。
【0434】
本研究の結果に基づき、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターは、ヒト化肝臓をもつＨＢＶ感染ＰＸＢマウスに投与すると、血清ＨＢＶ ＤＮＡ、血清ＨＢｓＡｇ、血清ＨＢｅＡｇ及び肝臓ＨＢＶ ＤＮＡといったウイルスパラメーターに明白な影響を及ぼすことがわかった。これらの抗ウイルス効果は２．００Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（第２群）及び２．００Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ（第３群）といった用量で観察され、トリプルＨＢＶ ｓｈＲＮＡ ＡｄＶベクターの異なる用量での有効性が示された。
【0435】
当業者であれば、本開示の広い範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に多数の変化及び／または変更を加えることができることを理解しよう。したがって、これらの実施形態は、あらゆる点において例示であり、制限とはみなされない。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ 少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むＲＮＡであって、前記エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、前記領域は、配列番号１～１０のいずれかに示す配列を含んでいる、前記ＲＮＡ。
［２］ 配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号２０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号３０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号４０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号５０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される、［１］に記載のＲＮＡ。
［３］ 低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、［１］または［２］に記載のＲＮＡ。
［４］ 前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含んでいる、［３］に記載のＲＮＡ。
［５］ 前記ｓｈＲＮＡは配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含んでいる、［３］または［４］に記載のＲＮＡ。
［６］ 複数のＲＮＡであって、
（ａ）少なくとも１つの［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ；及び
（ｂ）
（ｉ）［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含み、
前記（ａ）のＲＮＡと前記（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含んでいる、
前記複数のＲＮＡ。
［７］ 前記（ｂ）（ｉｉ）のＲＮＡは、
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される、［６］に記載の複数のＲＮＡ。
［８］ 低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、［６］または［７］に記載の複数のＲＮＡ。
［９］ 前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含んでいる、［８］に記載の複数のＲＮＡ。
［１０］
（ａ）少なくとも１つのＲＮＡは［５］に記載のｓｈＲＮＡであり；
（ｂ）少なくとも１つのＲＮＡは
（ｉ）［５］に記載のｓｈＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ
から選択され、
前記（ａ）のｓｈＲＮＡと前記（ｂ）のｓｈＲＮＡは異なっている、
［８］または［９］に記載の複数のＲＮＡ。
［１１］ ［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、核酸。
［１２］ 複数の核酸であって、
（ａ）［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第１の核酸；及び
（ｂ）第２の核酸であって、
（ｉ）［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択されるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む前記第２の核酸
を含み、
前記第１の核酸によってコードされるＲＮＡと前記第２の核酸によってコードされるＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含んでいる、
前記複数の核酸。
［１３］ 前記（ｂ）（ｉｉ）のＲＮＡは、
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される、［１２］に記載の複数の核酸。
［１４］ 各核酸によってコードされる前記ＲＮＡは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、［１２］または［１３］に記載の複数の核酸。
［１５］ 各核酸によってコードされる前記ＲＮＡは、前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含んでいる、［１４］に記載の複数の核酸。
［１６］
（ａ）前記第１の核酸は、［５］に記載のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、
（ｂ）前記第２の核酸は、
（ｉ）［５］に記載のｓｈＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ
から選択されるｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、
前記第１の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡと前記第２の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡは異なっている、
［１４］または［１５］に記載の複数の核酸。
［１７］ ［１１］に記載の核酸を含んでいる、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
［１８］ 複数のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトであって、
（ａ）少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、［１２］（ａ）に定められる複数の核酸の第１の核酸を含み、
（ｂ）少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、［１２］（ｂ）に定められる複数の核酸の第２の核酸を含んでいる、
前記複数のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
［１９］ 少なくとも２つの低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトであって、
（ａ）第１のｓｈＲＮＡをコードする、［１１］に記載の核酸；及び
（ｂ）第２のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸であって、前記第２のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物のある領域にほぼ相補的である、前記核酸
を含み、
前記第１のｓｈＲＮＡと前記第２のｓｈＲＮＡは異なっている、
前記ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
［２０］ ［１２］～［１６］のいずれか一に記載の複数の核酸を含んでいる、［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２１］ 第３のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含み、前記第３のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物のある領域にほぼ相補的であり、
前記第３のｓｈＲＮＡは、前記第１のｓｈＲＮＡ及び前記第２のｓｈＲＮＡとは異なっている、
［１９］または［２０］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２２］ 前記第３のｓｈＲＮＡをコードする前記核酸は、［１２］～［１６］のいずれか一に記載の複数の核酸のうちのいずれかの核酸から選択される核酸である、［２１］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２３］
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸：
（ｂ）［１２］～［１６］のいずれか一に記載の複数の核酸のうちのいずれかの核酸から選択される核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸を含み、
前記ｓｈＲＮＡはそれぞれ、互いに異なっている、
［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２４］ ５’から３’の方向に、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸
を含んでいる、［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２５］ ５’から３’の方向に、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸
を含んでいる、［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２６］ ｓｈＲＮＡをコードする各核酸の上流にＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含んでいる、［１７］～［２５］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２７］ 前記または各ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターから選択される、［２６］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２８］ ［１７］～［２７］のいずれか一に記載されるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる、発現ベクター。
［２９］ 複数の発現ベクターであって、
（ａ）少なくとも１つの発現ベクターが、［１８］（ａ）に定められるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含み、
（ｂ）少なくとも１つの発現ベクターが、［１８］（ｂ）に定められるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる、
前記複数の発現ベクター。
［３０］ 前記または各発現ベクターは、プラスミドまたは小環である、［２８］に記載の発現ベクターまたは［２９］に記載の複数の発現ベクター。
［３１］ 前記または各発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、［２８］に記載の発現ベクターまたは［２９］に記載の複数の発現ベクター。
［３２］ 前記または各発現ベクターは、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマーと複合体をなしている、［２８］または［３０］に記載の発現ベクター、または［２９］または［３０］に記載の複数の発現ベクター。
［３３］ ［１１］～［２０］のいずれか一に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または［２１］～［２４］のいずれか一に記載の発現ベクターを含む、組成物。
［３４］ さらに、１種以上の製薬上許容される担体を含んでいる、［３３］に記載の組成物。
［３５］ 対象のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［３６］ 前記対象は、急性ＨＢＶ感染に苦しんでいる、［３５］に記載の方法。
［３７］ 前記対象は、慢性ＨＢＶ感染に苦しんでいる、［３５］に記載の方法
［３８］ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象のＢ型肝炎ウイルス負荷を低下させる方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［３９］ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に苦しむ対象のＨＢＶ関連の症状の重症度を軽減する方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［４０］ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した対象の感染力を低下させる方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［４１］ １種以上のＨＢＶ遺伝子の発現を阻害することを含んでいる、［３５］～［４０］のいずれか一に記載の方法。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ 少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むＲＮＡであって、前記エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムのある領域によってコードされるＲＮＡ転写物にほぼ相補的であり、前記領域は、配列番号１～１０のいずれかに示す配列を含んでいる、前記ＲＮＡ。
［２］ 配列番号１１に示すエフェクター配列、及び配列番号１２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１３に示すエフェクター配列、及び配列番号１４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１５に示すエフェクター配列、及び配列番号１６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１７に示すエフェクター配列、及び配列番号１８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号１９に示すエフェクター配列、及び配列番号２０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２１に示すエフェクター配列、及び配列番号２２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２３に示すエフェクター配列、及び配列番号２４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２５に示すエフェクター配列、及び配列番号２６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２７に示すエフェクター配列、及び配列番号２８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号２９に示すエフェクター配列、及び配列番号３０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３１に示すエフェクター配列、及び配列番号３２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３３に示すエフェクター配列、及び配列番号３４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３５に示すエフェクター配列、及び配列番号３６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３７に示すエフェクター配列、及び配列番号３８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号３９に示すエフェクター配列、及び配列番号４０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４１に示すエフェクター配列、及び配列番号４２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４３に示すエフェクター配列、及び配列番号４４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４５に示すエフェクター配列、及び配列番号４６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４７に示すエフェクター配列、及び配列番号４８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号４９に示すエフェクター配列、及び配列番号５０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号５１に示すエフェクター配列、及び配列番号５２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される、［１］に記載のＲＮＡ。
［３］ 低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、［１］または［２］に記載のＲＮＡ。
［４］ 前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含んでいる、［３］に記載のＲＮＡ。
［５］ 前記ｓｈＲＮＡは配列番号６５～９８のいずれかに示す配列を含んでいる、［３］または［４］に記載のＲＮＡ。
［６］ 複数のＲＮＡであって、
（ａ）少なくとも１つの［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ；及び
（ｂ）
（ｉ）［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択される少なくとも１つのＲＮＡ
を含み、
前記（ａ）のＲＮＡと前記（ｂ）のＲＮＡは異なるエフェクター配列を含んでいる、
前記複数のＲＮＡ。
［７］ 前記（ｂ）（ｉｉ）のＲＮＡは、
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される、［６］に記載の複数のＲＮＡ。
［８］ 低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、［６］または［７］に記載の複数のＲＮＡ。
［９］ 前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含んでいる、［８］に記載の複数のＲＮＡ。
［１０］
（ａ）少なくとも１つのＲＮＡは［５］に記載のｓｈＲＮＡであり；
（ｂ）少なくとも１つのＲＮＡは
（ｉ）［５］に記載のｓｈＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ
から選択され、
前記（ａ）のｓｈＲＮＡと前記（ｂ）のｓｈＲＮＡは異なっている、
［８］または［９］に記載の複数のＲＮＡ。
［１１］ ［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、核酸。
［１２］ 複数の核酸であって、
（ａ）［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第１の核酸；及び
（ｂ）第２の核酸であって、
（ｉ）［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ；または
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は配列番号５４、５６、５８、６０、６２及び６４のいずれかに示すＲＮＡ配列にほぼ相補的であるＲＮＡ
から選択されるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む前記第２の核酸
を含み、
前記第１の核酸によってコードされるＲＮＡと前記第２の核酸によってコードされるＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含んでいる、
前記複数の核酸。
［１３］ 前記（ｂ）（ｉｉ）のＲＮＡは、
配列番号５３に示すエフェクター配列、及び配列番号５４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５５に示すエフェクター配列、及び配列番号５６に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５７に示すエフェクター配列、及び配列番号５８に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号５９に示すエフェクター配列、及び配列番号６０に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；
配列番号６１に示すエフェクター配列、及び配列番号６２に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ；及び
配列番号６３に示すエフェクター配列、及び配列番号６４に示すエフェクター相補配列を含んでいるＲＮＡ
からなる群より選択される、［１２］に記載の複数の核酸。
［１４］ 各核酸によってコードされる前記ＲＮＡは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、［１２］または［１３］に記載の複数の核酸。
［１５］ 各核酸によってコードされる前記ＲＮＡは、前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列の間に配置されたループ配列を含んでいる、［１４］に記載の複数の核酸。
［１６］
（ａ）前記第１の核酸は、［５］に記載のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、
（ｂ）前記第２の核酸は、
（ｉ）［５］に記載のｓｈＲＮＡ；または
（ｉｉ）配列番号９９～１０４のいずれかに示す配列を含むｓｈＲＮＡ
から選択されるｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、
前記第１の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡと前記第２の核酸によってコードされるｓｈＲＮＡは異なっている、
［１４］または［１５］に記載の複数の核酸。
［１７］ ［１１］に記載の核酸を含んでいる、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
［１８］ 複数のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトであって、
（ａ）少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、［１２］（ａ）に定められる複数の核酸の第１の核酸を含み、
（ｂ）少なくとも１つのｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、［１２］（ｂ）に定められる複数の核酸の第２の核酸を含んでいる、
前記複数のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
［１９］ 少なくとも２つの低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトであって、
（ａ）第１のｓｈＲＮＡをコードする、［１１］に記載の核酸；及び
（ｂ）第２のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸であって、前記第２のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物のある領域にほぼ相補的である、前記核酸
を含み、
前記第１のｓｈＲＮＡと前記第２のｓｈＲＮＡは異なっている、
前記ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト。
［２０］ ［１２］～［１６］のいずれか一に記載の複数の核酸を含んでいる、［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２１］ 第３のｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含み、前記第３のｓｈＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含み、前記エフェクター配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるＲＮＡ転写物のある領域にほぼ相補的であり、
前記第３のｓｈＲＮＡは、前記第１のｓｈＲＮＡ及び前記第２のｓｈＲＮＡとは異なっている、
［１９］または［２０］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２２］ 前記第３のｓｈＲＮＡをコードする前記核酸は、［１２］～［１６］のいずれか一に記載の複数の核酸のうちのいずれかの核酸から選択される核酸である、［２１］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２３］
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸：
（ｂ）［１２］～［１６］のいずれか一に記載の複数の核酸のうちのいずれかの核酸から選択される核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする核酸を含み、
前記ｓｈＲＮＡはそれぞれ、互いに異なっている、
［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２４］ ５’から３’の方向に、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号１０１に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸
を含んでいる、［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２５］ ５’から３’の方向に、
（ａ）配列番号９２に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第１の核酸：
（ｂ）配列番号７９に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第２の核酸；及び
（ｃ）配列番号７８に示す配列を含むかまたはそれからなるｓｈＲＮＡをコードする第３の核酸
を含んでいる、［１９］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２６］ ｓｈＲＮＡをコードする各核酸の上流にＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含んでいる、［１７］～［２５］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２７］ 前記または各ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターから選択される、［２６］に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト。
［２８］ ［１７］～［２７］のいずれか一に記載されるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる、発現ベクター。
［２９］ 複数の発現ベクターであって、
（ａ）少なくとも１つの発現ベクターが、［１８］（ａ）に定められるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含み、
（ｂ）少なくとも１つの発現ベクターが、［１８］（ｂ）に定められるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを含んでいる、
前記複数の発現ベクター。
［３０］ 前記または各発現ベクターは、プラスミドまたは小環である、［２８］に記載の発現ベクターまたは［２９］に記載の複数の発現ベクター。
［３１］ 前記または各発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、［２８］に記載の発現ベクターまたは［２９］に記載の複数の発現ベクター。
［３２］ 前記または各発現ベクターは、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマーと複合体をなしている、［２８］または［３０］に記載の発現ベクター、または［２９］または［３０］に記載の複数の発現ベクター。
［３３］ ［１１］～［２０］のいずれか一に記載のＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクト、または［２１］～［２４］のいずれか一に記載の発現ベクターを含む、組成物。
［３４］ さらに、１種以上の製薬上許容される担体を含んでいる、［３３］に記載の組成物。
［３５］ 対象のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［３６］ 前記対象は、急性ＨＢＶ感染に苦しんでいる、［３５］に記載の方法。
［３７］ 前記対象は、慢性ＨＢＶ感染に苦しんでいる、［３５］に記載の方法
［３８］ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している対象のＢ型肝炎ウイルス負荷を低下させる方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［３９］ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に苦しむ対象のＨＢＶ関連の症状の重症度を軽減する方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［４０］ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した対象の感染力を低下させる方法であって、前記対象に、治療有効量の、［１］～［５］のいずれか一に記載のＲＮＡ、または［６］～［１０］のいずれか一に記載の複数のＲＮＡ、または［１１］に記載の核酸、または［１２］～［１７］のいずれか一に記載の複数の核酸、または［１８］もしくは［２０］～［２７］のいずれか一に記載のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［１９］に記載の複数のｄｄＲＮＡｉコンストラクト、または［２８］もしくは［３０］～［３２］のいずれか一に記載の発現ベクター、または［２９］～［３２］のいずれか一に記載の複数の発現ベクター、または［３３］もしくは［３４］に記載の組成物を投与することを含んでいる、前記方法。
［４１］ １種以上のＨＢＶ遺伝子の発現を阻害することを含んでいる、［３５］～［４０］のいずれか一に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図6f】
【図6g】
【図6h】
【図6i】
【図6j】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図7f】
【図7g】
【図7h】
【図7i】
【図7j】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図8f】
【図8g】
【図8h】
【図8i】
【図8j】
【図9a】
【図9b】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図12e】
【図12f】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図13d】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図14d】
【図14e】
【図14f】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図15e】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】