特許 7191869 分子を経膜送達するための化合物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-09

(45)【発行日】2022-12-19

(54)【発明の名称】分子を経膜送達するための化合物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20221212BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221212BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20221212BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20221212BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20221212BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221212BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221212BHJP

   C07J 9/00 20060101ALI20221212BHJP

【ＦＩ】

A61K47/54

A61K31/7088

A61K31/711

A61K31/713

A61K38/02

A61K48/00

A61P43/00 105

C07J9/00

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2019572458

(86)(22)【出願日】2018-07-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-27

(86)【国際出願番号】 IL2018050714

(87)【国際公開番号】W WO2019008574

(87)【国際公開日】2019-01-10

【審査請求日】2021-06-25

(31)【優先権主張番号】15/641,251

(32)【優先日】2017-07-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】15/662,665

(32)【優先日】2017-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】15/679,192

(32)【優先日】2017-08-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】15/691,821

(32)【優先日】2017-08-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505467867

【氏名又は名称】アポセンス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＰＯＳＥＮＳＥ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001379

【氏名又は名称】特許業務法人 大島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジヴ、イーラン

(72)【発明者】

【氏名】ドュブロフスキー、ヨセフ

(72)【発明者】

【氏名】グリムベルグ、ハギット

【審査官】伊藤 良子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０２９６６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００３５３６２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５０９７１０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の化学式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物。

【化1】

ここで、
Ｄは、生体膜を横断して送達される薬物であり、低分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び、天然の若しくは修飾された、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択され；
ｙ、ｚ、及びｗは、互いに独立して、０、１、２、３、及び４からなる群より選択される整数であり、ｙ、ｚ、ｗ、またはそれらの任意の組み合わせが０である場合は、そのＥ部分がヌルであることを意味し；ｙ、ｚ、及びｗの少なくとも１つは０ではなく；
Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´部分は、互いに同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、下記の化学式（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）若しくは（Ｖｃ´´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレートであり；

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【化16】

前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、１つまたは２つの結合点を介して１つのＤ部分に結合され得る。

【請求項2】

薬学的組成物であって、
請求項１に記載のコンジュゲートと、
薬学的に許容される塩または担体とを含む、薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年７月４日に出願された米国特許出願第１５／６４１、２５１号の一部継続出願であるところの、２０１７年７月２８日に出願された米国特許出願第１５／６６２、６６５号の一部継続出願であるところの、２０１７年８月１７日に出願された米国特許出願第１５／６７９、１９２号の一部継続出願である。これらの米国特許出願の内容は、参照により本明細書に援用される。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、化合物及び高分子を含む化合物及びコンジュゲート、送達システム、並びに、分子及び高分子をインビトロ及びインビボで使用される細胞内に生体膜を横断して送達する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

「オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ：Oligonucleotide Drug）」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの配列を含む高分子薬物である。ＯＤは、多くの医学的疾患の革新的な医学的処置に有望である。ＯＤは、当技術分野で既知のように、一本鎖若しくは二本鎖の、天然の若しくは修飾されたＲＮＡ分子若しくはＤＮＡ分子、またはそれらの組み合わせである。ＯＤの例は、とりわけ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ダイサー酵素のｓｉＲＮＡ基質（ｄｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）薬物、または、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）として機能するように設計されたＤＮＡ配列であり、これらは全て、標的遺伝子の発現の下方制御に活性がある。

【0004】

臨床診療でのＯＤの実施における大きな課題は、ＯＤの血漿タンパク質、特にアルブミンへの結合の最適化に関連している。修飾されていない（「裸の」）オリゴヌクレオチドは、血漿タンパク質に有意に結合しない。対照的に、ＯＤの経膜送達にしばしば必要とされる修飾である、コレステロールなどの親油性部分を付加することによるＯＤの修飾は、血漿タンパク質への（主にアルブミンへの）強力な結合をもたらす。ＯＤが血漿タンパク質に強く結合すると、標的細胞の膜へのＯＤの結合能力が阻害され、それにより、細胞へのＯＤの効果的な取り込みが阻害され、ＯＤの効力の欠如につながる恐れがある。現在、ＯＤのための多くの送達システムはこの課題を克服することができず、そのため、ＯＤの生物活性を保持するためには、無血清条件を必要とする。しかし、無血清条件は、インビトロでの組織培養には適用できるが、ＯＤが必然的に血漿タンパク質と密接に接触することとなるインビボでは実行不可能である。したがって、血漿タンパク質の存在下または非存在下の両方において、遺伝学的薬物を細胞内に疎水性のリン脂質膜を横断して送達することができるＯＤの送達システムが求められている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）と結合（conjugated）したときに、ＯＤを細胞内にリン脂質膜を横断して送達することができ、かつ、無血清条件［（Ｓ－）条件］及び血清存在条件［（Ｓ＋）条件］の両方において遺伝子サイレンシングの活性がある分子送達システム［化学式（ＩＩ）に示す（ＭＤＳ：Molecular Delivery System）］を提供する。実施例６において例示するように、同様の構造を有するがＭＤＳを欠いている化学物質は、（例えば遺伝子サイレンシングにおいて）完全に生物学的に不活性であるか、あるいは、（Ｓ－）条件下では活性があるが、（Ｓ＋）条件下では活性が低いかまたは不活性である。

【0006】

本発明の一実施形態では、下記の化学式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート（conjugate）、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物が提供される。

【0007】

【化1】

【0008】

ここで、
Ｄは、生体膜を横断して送達される薬物であり、低分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び、天然の若しくは修飾された、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択され；
ｙ、ｚ、及びｗは、互いに独立して、０、１、２、３、及び４からなる群より選択される整数であり、ｙ、ｚ、ｗ、またはそれらの任意の組み合わせが０である場合は、そのＥ部分がヌルであることを意味し；ｙ、ｚ、及びｗの少なくとも１つは０ではなく；
Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´部分は、互いに同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、下記の化学式（ＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0009】

【化2】

【0010】

ここで、
Ｕ及びＱは、互いに独立して、一方はヌルであり、他方は、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ_３）－、－Ｎ（ＣＨ_２－ＣＨ_３）－、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_２－ＮＨ－、及び－Ｎ（ＣＨ_３）－（ＣＨ_２）_２－Ｎ（ＣＨ_３）－からなる群より選択され；
Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４部分は、互いに独立して、水素、メチル、及びエチルからなる群より選択され；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４部分は、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４部分の少なくとも２つは水素原子であり；
Ｚは、ヌル、エーテル、エステル、アミン、及びアミドからなる群より選択され；
ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、及び７からなる群より選択される整数であり、０＝ヌルであり；ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、互いに同一であっても異なっていてもよく；
ｅ及びｆは、互いに独立して、１、２、及び３からなる群より選択される整数であり；ｅ及びｆは、互いに同一であっても異なっていてもよく；
ａまたはｂが≧２である場合、その炭化水素鎖は、飽和であって非飽和であってもよく；
Ｗは、ヌル、ヒドロキシル、ジ－ヒドロキシル、天然ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、及び下記の化学式（ＩＩ´）に示す構造を有する化合物からなる群より選択される。

【0011】

【化3】

【0012】

ここで、
Ｊは、ヌル、－ＣＨ_２－、第二級アミン、第三級アミン、及び酸素からなる群より選択され；
化学式（ＩＩ´）の部分は、ヌル；水素；Ｄ；本明細書で定義される保護基（例えば、アルコールの保護基）；リン酸基、硫酸基、またはカルボキシル基；及び固体支持体からなる群より選択されるいずれかに結合され；
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、１つまたは２つの結合点を介して１つのＤ部分に結合される。

【0013】

本発明の一実施形態では、Ｗは、天然のまたは修飾された、アデニン、シトシン、チミン、またはウラシルから選択されるヌクレオシドであり、糖部分は、リボースまたは２´－デオキシリボースである。

【0014】

本発明の別の実施形態では、Ｗは、２´－デオキシウリジンである。

【0015】

本発明のさらに別の実施形態では、Ｗは、上記の化学式（ＩＩ´）に示した構造を有し、Ｊは、－ＣＨ_２－である。

【0016】

本発明の一実施形態では、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0017】

【化4】

【0018】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｚ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びＷは、上記の化学式（ＩＩ）において定義したとおりである。

【0019】

本発明の一実施形態では、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＶｂ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0020】

【化6】

【0021】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＩＩ）において定義したとおりである。

【0022】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｂ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｂ´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0023】

【化11】

【0024】

上記の化学式（Ｖｂ´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８と称される。この化合物は、ホスホロアミダイト基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８前駆体と称される。

【0025】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｂ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｂ´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0026】

【化12】

【0027】

上記の化学式（Ｖｂ´´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３と称される。この化合物は、ホスホロアミダイト基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３前駆体と称される。

【0028】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＩＩ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＶｃ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0029】

【化7】

【0030】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＩＩ）において定義したとおりであり；
Ｊは、ヌル、－ＣＨ_２－、及び酸素からなる群より選択される。

【0031】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｃ´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0032】

【化15】

【0033】

上記の化学式（Ｖｃ´´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３と称される。この化合物は、ホスホロアミダイト基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３前駆体と称される。

【0034】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｃ´´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0035】

【化16】

【0036】

上記の化学式（Ｖｃ´´´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３と称される。この化合物は、ホスホロアミダイト基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３前駆体と称される。

【0037】

いくつかの実施形態では、本明細書で定義されるように、１以上のアルコールの保護基に結合された、本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含む前駆体が提供される。保護基は、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のカーゴ薬物（例えば、高分子薬物）への結合中に除去または修飾される。

【0038】

一実施形態では、下記の化学式（ＩＶａＰ）に示す構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物を含む前駆体分子が提供される。

【0039】

【化17】

【0040】

Ｚ、Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＶｃ）において定義したとおりである。この前駆体分子は、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端または３´末端のいずれか、あるいはオリゴヌクレオチド鎖内の内部位置において、Ｅ、Ｅ´またはＥ´´部分と結合する働きをする。

【0041】

別の実施形態では、上記の化学式（ＩＶａＰ）の前駆体分子は、下記の化学式（ＰＰ－２）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0042】

【化21】

【0043】

この前駆体分子は、Ｅ、Ｅ´またはＥ´´部分を、５´末端または３´末端のいずれか、あるいはオリゴヌクレオチド鎖内の内部位置に結合させる役割を果たす。上記の化学式（ＩＶａＰ）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３前駆体と称される。

【0044】

別の実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃＰ）の前駆体分子は、下記の化学式（ＰＰ－３）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0045】

【化22】

【0046】

上記の化学式（ＰＰ－３）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３前駆体と称される。

【0047】

本明細書の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１２）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0048】

【化34】

【0049】

上記の化学式（Ｃｎ－１２）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ｂと称される。

【0050】

本明細書の一実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有し、かつ、化学式（Ｖｃ´´´）に示したＥ´´部分が、オリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置に結合されたコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１４）に示す構造を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物を含む。

【0051】

【化36】

【0052】

上記の化学式（Ｃｎ－１２）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ｃと称される。

【0053】

本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡやダイサー酵素の基質（ｄｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡ二本鎖を含むコンジュゲートであって、ＲＮＡ二本鎖が、２７～２５または２７～２４のヌクレオチド長であり、その両端において、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示した構造をそれぞれが有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合するコンジュゲートが提供される。

【0054】

本発明の別の実施形態では、上記したコンジュゲートであって、次の（１）または（２）のいずれかのＥ、Ｅ´またはＥ´´部分を含むコンジュゲートが提供される。（１）ＲＮＡ鎖の末端に位置する２つのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分。（２）ＲＮＡ鎖の末端に位置するが、ｓｉＲＮＡ二本鎖内の内部位置にも位置する３以上のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分。Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、それぞれ、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示す構造を有する。

【0055】

本発明のいくつかの実施形態は、インビトロまたはインビボで、薬物を細胞に生体膜を横断して送達するための方法であって、細胞を、本明細書に記載したコンジュゲートに接触させるステップを含む、方法に関する。

【0056】

別の実施形態は、医学的疾患を治療する方法であって、本明細書に記載されたコンジュゲートを含む薬学的組成物の治療有効量を、治療を必要とする患者に投与するステップを含む、方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0057】

本特許または本出願は、少なくとも１つのカラー図面を含んでいる。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、要求し必要な手数料を支払うことで、特許商標庁により提供される。

【0058】

【図1A】それぞれｓｉＲＮＡの鎖の５´末端に位置する２つのＥ部分を含む本発明のコンジュゲートを示す。青及び茶色は、ｓｉＲＮＡのＲＮＡニ本鎖のそれぞれのオリゴヌクレオチド鎖を示している。黄色の原子は酸化還元感受性モジュールの硫黄原子であり、細胞質内の還元条件で分離し、ＭＤＳからＲＮＡを放出して遺伝子サイレンシング活性を発揮するように設計されている。灰色及び白の原子は、それぞれ炭素原子及び水素原子である。赤及び緑の原子は、それぞれ酸素及びフッ素の原子である。

【図1B】膜に到達したときのコンジュゲートを示し、ｓｉＲＮＡは、膜貫通送達プロセスの前に、膜表面に対して平行になっている。青及び茶色は、ｓｉＲＮＡのＲＮＡニ本鎖のそれぞれのオリゴヌクレオチド鎖を示している。黄色の原子は酸化還元感受性モジュールの硫黄原子であり、細胞質内の還元条件で分離し、ＭＤＳからＲＮＡを放出して遺伝子サイレンシング活性を発揮するように設計されている。灰色及び白の原子は、それぞれ炭素原子及び水素原子である。赤及び緑の原子は、それぞれ酸素及びフッ素の原子である。

【図2A】化学式（Ｖ´）による本発明のＥ部分の結合様式を例示し、化学式（Ｖａ´）によるＥ部分が内部位置で連結されているＲＮＡ鎖を示す。

【図2B】細胞質内で一般的であるような還元条件における、結果的なＲＮＡ薬物の放出を伴う、化学式（Ｖａ´）によるＥ部分のジスルフィド基の酸化還元媒介切断を例示する。

【図3A】本発明のコンジュゲートの作用機序（ＭＯＡ）を例示している。化学式（Ｃｎ－３）によるコンジュゲートが例示され、ＲＮＡ二本鎖は２５／２７ヌクレオチド長のダイサー基質であり、リン酸基がパッセンジャー鎖の５´末端に結合している。細胞質において一般的な還元条件でのＥ、Ｅ´、Ｅ´´部分の切断及び除去を示す。

【図3B】ＲＮＡ二本鎖とダイサーエンドヌクレアーゼとの相互作用を示し、二本鎖切断を引き起こし、２１／２１ＲＮＡ二本鎖を残し、Ｅ部分の１つの残りの残基がパッセンジャー鎖の５´末端に結合している。

【図3C】酵素ヘリカーゼ（すなわち、ＲＮＡ鎖を分離することができる細胞質酵素）によるセンス鎖の除去を示す。

【図3D】図３Ｃのイベントにより、２番目のＥ部分の断端の残基が除去され、インタクトのアンチセンス鎖が解放され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に侵入し、所望の遺伝子サイレンシングが誘導される。

【図4A】本発明のコンジュゲートの作用機序（ＭＯＡ）を例示している。化学式（Ｃｎ－８）によるコンジュゲートが例示され、ＲＮＡ二本鎖は２５／２７ヌクレオチド長のダイサー基質であり、リン酸基がパッセンジャー鎖の５´末端に結合している。細胞質において一般的な還元条件でのＥ、Ｅ´、Ｅ´´部分の切断及び除去を示す。

【図4B】ＲＮＡ二本鎖とダイサーエンドヌクレアーゼとの相互作用を示し、二本鎖切断を引き起こし、２１／２１ＲＮＡ二本鎖を残し、Ｅ部分の１つの残りの残基がパッセンジャー鎖の５´末端に結合している。

【図4C】酵素ヘリカーゼ（すなわち、ＲＮＡ鎖を分離することができる細胞質酵素）によるセンス鎖の除去を示す。

【図4D】図４Ｃのイベントにより、２番目のＥ部分の断端の残基が除去され、インタクトのアンチセンス鎖が解放され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に侵入し、所望の遺伝子サイレンシングが誘導される。

【図5】それぞれがＥＧＦＰ遺伝子のサイレンシングに特異的な、１つの２５ヌクレオチド長鎖と１つの２７ヌクレオチド長鎖とからなるＲＮＡ二本鎖のゲル電気泳動を示す（実施例６に記載）。電気泳動は、水（レーンＡ）、または１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下（レーンＢ）のいずれかで溶解したコンジュゲートで行った。これらの二本鎖は、非共役であるか（レーン１）、２つのコントロールＡｐｏ－Ｓｉ－Ｓ－１のＥ部分に共役しているか（レーン２）、本発明の２つのＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３のＥ部分に共役しているか（レーン３）、または本発明の２つのＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８のＥ部分に共役している（レーン４）。図示されているように、電気泳動中、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｓ－１コンジュゲートはアルブミンへの強い結合を示し、したがって無アルブミン画分を有していなかったが、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８コンジュゲートはアルブミン結合画分（矢印＃１）と、無アルブミン画分（矢印＃２）との両方を示した。

【発明を実施するための形態】

【0059】

本発明は、コンジュゲート（conjugate）及びその前駆体であって、オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）などの高分子薬物と結合したときに、該薬物を細胞内にリン脂質生体膜を横断して送達し、無血清条件下及び血漿タンパク質存在下の両方において生物学的性能を発揮させることができる分子送達システム（ＭＤＳ）を構成するコンジュゲート及びその前駆体に関する。この分子送達システムは、遺伝学的薬物などの高分子薬物、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、または治療用タンパク質の膜貫通送達（経膜送達）を可能にする。血漿タンパク質存在下での活性は、本発明のコンジュゲートをインビボで使用し、生きている動物またはヒト対象に対して局所投与または全身投与（例えば静脈注射によって）するために、特に重要である。

【0060】

本発明の一実施形態では、下記の化学式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物が提供される。

【0061】

【化1】

【0062】

ここで、
Ｄは、生体膜を横断して送達される薬物（すなわち、カーゴ薬物）であり、低分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び、天然の若しくは修飾された、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択され；
ｙ、ｚ、及びｗは、互いに独立して、０、１、２、３、及び４からなる群より選択される整数であり、ｙ、ｚ、ｗ、またはそれらの任意の組み合わせが０である場合は、そのＥ部分がヌルであることを意味し；ｙ、ｚ、及びｗの少なくとも１つは０ではなく；
Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´部分は、互いに同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、下記の化学式（ＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0063】

【化2】

【0064】

ここで、
Ｕ及びＱは、互いに独立して、一方はヌルであり、他方は、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ_３）－、－Ｎ（ＣＨ_２－ＣＨ_３）－、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_２－ＮＨ－、及び－Ｎ（ＣＨ_３）－（ＣＨ_２）_２－Ｎ（ＣＨ_３）－からなる群より選択され；
Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４部分は、互いに独立して、水素、メチル、及びエチルからなる群より選択され；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４部分は、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４部分の少なくとも２つは水素原子であり；
Ｚは、ヌル、エーテル、エステル、アミン、及びアミドからなる群より選択され；
ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、及び７からなる群より選択される整数であり、０＝ヌルであり；ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、互いに同一であっても異なっていてもよく；
ｅ及びｆは、互いに独立して、１、２、及び３からなる群より選択される整数であり；ｅ及びｆは、互いに同一であっても異なっていてもよく；
ａまたはｂが≧２である場合、その炭化水素鎖は、飽和であって非飽和であってもよく；
Ｗは、ヌル、ヒドロキシル、ジ－ヒドロキシル、天然ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、及び下記の化学式（ＩＩ´）に示す構造を有する化合物からなる群より選択される。

【0065】

【化3】

【0066】

ここで、
Ｊは、ヌル、－ＣＨ_２－、第二級アミン、第三級アミン、及び酸素からなる群より選択され；
上記の化学式（ＩＩ´）の部分は、ヌル；水素；Ｄ；本明細書で定義される保護基（例えば、アルコールの保護基）；リン酸基、硫酸基、またはカルボキシル基；及び固体支持体からなる群より選択されるいずれかに結合され；
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、１つまたは２つの結合点を介して１つのＤ部分に結合される。

【0067】

本発明の一実施形態では、Ｗは、天然のまたは修飾された、アデニン、シトシン、チミン、またはウラシルから選択されるヌクレオシドであり、糖部分は、リボースまたは２´－デオキシリボースである。

【0068】

本発明の別の実施形態では、Ｗは、２´－デオキシウリジンである。本発明のさらの別の実施形態では、Ｗは、上記の化学式（ＩＩ´）に示した構造を有し、Ｊは、－ＣＨ_２－である。

【0069】

（Ｓ＋）条件と（Ｓ－）条件との両方において、本発明のコンジュゲートの膜貫通送達を可能にすることにおける、上記の化学式（ＩＩ）に示した化学部分の役割は、実施例６に例示される。この実施例は、上記の化学式（ＩＩ）の構造に適合するＥ部分が、細胞膜を横断しての細胞内への送達、及び、例えば遺伝子サイレンシングなどの生物学的作用の誘導の両方において、それに関連するコンジュゲートのロバストな性能を発揮することを示す。この性能は、（Ｓ－）条件と（Ｓ＋）条件との両方で観察される。実施例６は、本発明の２つのコンジュゲートを説明する。この２つのコンジュゲートは両方とも、上記の化学式（ＩＩ）に適合するＥ部分を有し、Ｅ部分は、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の遺伝子の発現をサイレンシングするように設計された二本鎖であるダイサー基質に結合されている。この２つのコンジュゲートの一方は、上記の化学式（Ｖｂ´）に示したＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８の２つのＥ部分を有するＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８コンジュゲートであり、他方は、上記の化学式（Ｖｂ´´）に示したＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３の２つのＥ部分を有するＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３コンジュゲートである。この実施例は、遺伝子サイレンシングにおけるこれらのコンジュゲートの性能を、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９部分、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗ部分、及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇ部分を含む３つの構造的に関連する対照コンジュゲートの性能と比較する。これらの３つの部分は、本発明のＥ部分と構造的に類似しているが、上記の化学式（ＩＩ）と完全には適合せず、血漿タンパク質存在下［Ｓ（＋）条件］での細胞への送達及び遺伝子サイレンシングにおいて効果的に機能しない。

【0070】

本発明のコンジュゲート及び対照コンジュゲートの両方を含む全てのコンジュゲートのＥ部分は、ステロール骨格と、ノナ－フルオロテール－ブタノール残基とを含む。しかしながら、明らかに、これは、無血清条件下でさえ、生物活性（例えば遺伝子サイレンシング）を与えるのに十分ではない。例えば、実施例６で説明するように、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗのコンジュゲートは、血漿タンパク質の存在下でも非存在下でも不活性であった。各Ｅ部分にジスルフィド基を追加することにより、無血清条件下で活性を発揮した本発明のコンジュゲートの性能及び対照コンジュゲートＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇの性能に反映されるように、無血清条件下で活性（例えば遺伝子サイレンシング）があった。しかしながら、ジスルフィド部分の追加自体は、血漿タンパク質存在下での性能（活性）を可能にするのには十分ではなかった。対照的に、各Ｅ部分に、ヌルでない１つのＱまたはＵ部分を追加することにより、血漿タンパク質存在下で活性を与えることができ、これは、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８部分またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３部分を含むコンジュゲートによって発揮される、血清（＋）条件下での遺伝子サイレンシングの有効な性能に反映された。

【0071】

まとめると、これらのデータは、上記の化学式（ＩＩ）が、実際に、オリゴヌクレオチド薬物の膜貫通送達に必要な、及びその薬物の好ましい生物学的性能（例えば遺伝子サイレンシング）を発揮するために必要な種々の決定因子の間の、ユニークで、新規かつ予測不可能なバランスを表すという見解を支持する。本発明における「薬物」または「カーゴ薬物（cargo drug）」（すなわち、Ｄ部分）は、本発明のコンジュゲートによって送達される分子であって、低分子薬物または高分子薬物、例えば、タンパク質、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチド薬物などを指す。

【0072】

本発明における「薬物」または「薬剤」は、疾患を患っている対象（患者）に投与されたときに、対象に有益な効果をもたらすことができる化学物質を指す。有益な効果は、症状の改善、または、疾患プロセスに関与する因子または物質の効果を打ち消すことであり得る。薬物は、遺伝子発現を阻害するために投与される、低分子または高分子、例えば、タンパク質や、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡなどを含み得る。とりわけ、薬物は、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯを含み得る。いくつかの実施形態では、薬物は、変性疾患、癌、虚血性傷害、感染症、毒性傷害、または免疫介在性疾患の治療を目的としている。

【0073】

本発明における「オリゴヌクレオチド薬物」（以降、「ＯＤ」とも称する）は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む薬物を指す。オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）の例は、一本鎖または二本鎖の、天然のまたは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡである。ＯＤの例は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ダイサー酵素の基質（ｄｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）として機能するように設計されたＤＮＡ配列である。ＯＤのヌクレオチド構成要素間の結合は、とりわけ、リン酸－トリエステル結合、またはホスホロチオエート結合によりなされる。ＯＤのより具体的な実施形態において、本発明は以下を開示する。

【0074】

「ｓｉＲＮＡ」は、各ＲＮＡ鎖が１９～２１ヌクレオチド長のＲＮＡ二本鎖であり、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）タンパク質複合体を介して遺伝子発現をサイレンシングすることを目的としている。

【0075】

ダイサー酵素のｓｉＲＮＡ基質（「ｄｓｉＲＮＡ」）は、各ＲＮＡ鎖が２４～３０ヌクレオチド長のＲＮＡ二本鎖である。一実施形態では、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖は、一方の鎖が２５ヌクレオチドからなり、他方の鎖が２７ヌクレオチドからなる。別の実施形態では、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖は、一方の鎖が２４ヌクレオチドからなり、他方の鎖が２７ヌクレオチドからなる。

【0076】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）」は、合成の、一本鎖の、天然の、または修飾された、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、通常１５～２０ヌクレオチド長である。ＡＳＯの配列は、アンチセンスである。すなわち、ＡＳＯの配列は、タンパク質の特定のｍＲＮＡのセンス配列に相補的であり、その合成を阻害しようとする。ＡＳＯがこの相補配列に結合すると、リボソームのｍＲＮＡに沿って移動する能力が阻害され、その結果、タンパク質の合成が妨げられるか、または、ｍＲＮＡの分解速度が速くなる。

【0077】

本発明における「ヌクレオシド」は、窒素含有塩基（核酸塩基）、及び、５個または６個の炭素原子の糖（例えば、リボース、デオキシリボース）を含む化学部分として定義される。核酸塩基は、天然若しくは修飾プリン（例えば、アデニン、グアニン）、または、天然若しくは修飾ピリミジン（例えば、チミン、シトシン、ウラシル）から選択される。核酸塩基は、当分野で既知のように、様々な修飾によって修飾することができる（例えば、メチル化、アセチル化）。加えて、ヌクレオシドの糖部分も、当分野で既知の方法で修飾することができる（例えば、２´－デオキシ誘導体、リボースの２´位のメチル化、２´－フルオロ原子の取り付け、または、２´酸素と４´炭素原子とを連結するブリッジを設けることによるロック核酸（ＬＮＡ）の生成）。したがって、このような修飾ヌクレオシドの使用も本発明の範囲に含まれる。一実施形態では、ヌクレオシドは、天然のまたは修飾されたシトシン、チミン及びウラシルから選択されるピリミジン誘導体を含み、糖部分は、リボースまたはデオキシリボースのいずれかである。

【0078】

本発明においては、「ヌクレオチド」は、リン酸基に結合された、上記に定義したヌクレオシドである。ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの構成要素である。

【0079】

本発明における「前駆体分子」は、本発明の上記の化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分として定義され、下記に定義される保護基と結合する。

【0080】

本発明における「保護基」は、コンジュゲートの合成中に除去または修飾される化学基として定義される。このような除去または修飾は、合成の様々な段階で行われ得る。例えば、これに限定しないが、Ｄがオリゴヌクレオチド薬物などの高分子薬物である場合は、このような除去または修飾は、Ｅ、Ｅ´またはＥ´´部分をＤに結合させる段階で行われる。本発明の好ましい態様では、保護基は、下記に定義されるアルコールの保護基である。

【0081】

本発明における「アルコールの保護基」は、当分野で既知のように、特定の化学反応中にヒドロキシル基を「マスク」するためにヒドロキシル基に結合され、かつその後に除去可能な化学基を指す。このような保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β－メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル［ビス（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ－メトキシ－ベンジルエーテル（ＰＭＢ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）、シリルエーテル［例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ－イソ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル］、エトキシエチルエーテル（ＥＥ）、ホスホロアミダイト、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。アルコールの保護基としてよく使用されるのは、ジメトキシトリチル［ビス（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、及びホスホルアミダイトである。

【0082】

本発明における「固体支持体への取り付け」という用語は、化学合成中の固体支持体へのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分の結合点を意味する。例えば、本発明のコンジュゲートの合成中にオリゴヌクレオチドの３´末端に結合するための固体支持体として、ＣＰＧ（Controlled Pore Glass）を使用することができる。

【0083】

本発明における「生体膜」という用語は、生物学的システムに関連する任意のリン脂質膜を指す。このようなリン脂質膜の例は、細胞の形質膜、細胞内膜、または、血液胎盤関門などの生物学的障壁（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）、血液眼球関門（ＢＯＢ）、または血液胎児関門）に関連するリン脂質膜である。

【0084】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＩ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0085】

【化4】

【0086】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｚ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びＷは、上記の化学式（ＩＩ）において定義したとおりである。

【0087】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＩＩ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＶａ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0088】

【化5】

【0089】

ここで、
Ｚ、Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＩＩ）において定義したとおりである。

【0090】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＩＩ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＶｂ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0091】

【化6】

【0092】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＩＩ）において定義したとおりである。

【0093】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＩＩ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（ＩＶｃ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0094】

【化7】

【0095】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＩＩ）において定義したとおりであり；
Ｊは、ヌル、－ＣＨ_２－、及び酸素からなる群より選択される。

【0096】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶａ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖａ´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0097】

【化8】

【0098】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶａ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖａ´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0099】

【化9】

【0100】

この化合物は、ホスホルアミダイト及びＤＭＴ基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－２９－Ｄ前駆体と称される。

【0101】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶａ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖａ´´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0102】

【化10】

【0103】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｂ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｂ´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0104】

【化11】

【0105】

上記の化学式（Ｖｂ´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８と称される。この化合物は、ホスホルアミダイトと結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８前駆体と称される。

【0106】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｂ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｂ´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0107】

【化12】

【0108】

上記の化学式（Ｖｂ´´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３と称される。この化合物は、ホスホルアミダイトと結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３前駆体と称される。

【0109】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｂ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｂ´´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0110】

【化13】

【0111】

上記の化学式（Ｖｂ´´´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１１と称される。この化合物は、ホスホルアミダイトと結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１１前駆体と称される。

【0112】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｃ´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0113】

【化14】

【0114】

上記の化学式（Ｖｃ´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０と称される。この化合物は、ホスホルアミダイト及びＤＭＴ基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０前駆体と称される。

【0115】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｃ´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物である。

【0116】

【化15】

【0117】

上記の化学式（Ｖｃ´´）に示すこのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３と称される。この化合物は、ホスホルアミダイト及びＤＭＴ基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３前駆体と称される。

【0118】

本発明の一実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の化学式（Ｖｃ´´´）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物である。

【0119】

【化16】

【0120】

上記の化学式（Ｖｃ´）に示すＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３と称される。この化合物は、ホスホルアミダイト及びＤＭＴ基と結合した場合には、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３前駆体と称される。

【0121】

一実施形態では、本発明は、上記の化学式（ＩＶａ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含み、かつ下記の化学式（ＩＶａＰ）に示す構造を有する前駆体分子、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物を提供する。

【0122】

【化17】

【0123】

Ｚ、Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＶａ）において定義したとおりである。この前駆体分子は、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端または３´末端のいずれか、あるいはオリゴヌクレオチド鎖内の内部位置において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合する働きをする。

【0124】

別の実施形態では、本開示は、上記の化学式（ＩＶｂ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含み、かつ下記の化学式（ＩＶｂＰ）に示す構造を有する前駆体分子、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物を提供する。

【0125】

【化18】

【0126】

ここで、
Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＶｂＰ）において定義したとおりである。

【0127】

さらに別の実施形態では、本発明は、上記の化学式（ＩＶｃ）に示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含み、かつ下記の化学式（ＩＶｃＰ）に示す構造を有する前駆体分子、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物を提供する。

【0128】

【化19】

【0129】

ここで、
Ｚ、Ｕ、Ｑ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、上記の化学式（ＩＶｃ）において定義したとおりである。この前駆体分子は、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端または３´末端のいずれか、あるいはオリゴヌクレオチド鎖内の内部位置において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合する働きをする。

【0130】

特定の実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃＰ）に示した前駆体分子は、下記の化学式（ＰＰ－１）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0131】

【化20】

【0132】

この前駆体分子は、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端または３´末端のいずれか、あるいはオリゴヌクレオチド鎖内の内部位置において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合する働きをする。上記の化学式（ＰＰ－１）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０前駆体と称される。

【0133】

別の特定の実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃＰ）に示した前駆体分子は、下記の化学式（ＰＰ－２）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0134】

【化21】

【0135】

この前駆体分子は、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端または３´末端のいずれか、あるいはオリゴヌクレオチド鎖内の内部位置において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合する働きをする。上記の化学式（ＰＰ－２）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３前駆体と称される。

【0136】

さらに別の特定の実施形態では、上記の化学式（ＩＶｃＰ）に示した前駆体分子は、下記の化学式（ＰＰ－３）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0137】

【化22】

【0138】

上記の化学式（ＰＰ－３）に示すこの前駆体分子は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３前駆体と称される。

【0139】

上記の化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示した化合物は、Ｄと結合するための、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分としての役割を果たすことができ、これにより、細胞への膜貫通送達における生物学的性能にとって望ましい本発明のコンジュゲートを形成する。Ｄがオリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）である場合、コンジュゲートは、次の（ｉ）～（ｉｖ）の選択肢のいずれかに従うことができる。
（ｉ）Ｄは、単一のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合する。
（ｉｉ）Ｄは、互いに同一のまたは異なる２つのＥ及びＥ´部分と結合する；任意選択で、各オリゴヌクレオチド鎖の一端（例えば、５´末端）で結合する。
（ｉｉｉ）Ｄは、互いに同一のまたは異なるＥ、Ｅ´、及びＥ´´部分と結合する。Ｅ及びＥ´部分は、各オリゴヌクレオチド鎖の末端（例えば、５末端で）と結合し、Ｅ´´は、オリゴヌクレオチド鎖内の内部位置と結合する。
（ｉｖ）Ｄは、互いに同一のまたは異なるいくつかの（ｎ＞３）Ｅ部分に結合される；Ｅ部分は、各オリゴヌクレオチド鎖の末端（例えば、５末端で）に結合され、いくつかの他のＥ部分は、オリゴヌクレオチド鎖に沿ったいくつかの内部位置に結合される。

【0140】

本発明の一実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖａ´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0141】

【化23】

【0142】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0143】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´）に示した２つのＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－２）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0144】

【化24】

【0145】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0146】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－３）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0147】

【化25】

【0148】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0149】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－４）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0150】

【化26】

【0151】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0152】

本発明の別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＤとして含むコンジュゲートであって、天然または修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートヌクレオチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、１５～２５ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－５）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0153】

【化27】

【0154】

ここで、
Ｙ及びＹ´は、互いに独立して、水素、－ＣＨ_２－Ｚ、－ＣＨ_２－Ｚ´、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｚ、及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｚ´からなる群より選択され；
Ｚ及びＺ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、カルボキシル基、１´、２´－ジデオキシリボース、ヌクレオチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
ｇは、０、１、２、３、４、５及び６からなる群より選択される整数である。

【0155】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖａ´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－６）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0156】

【化28】

【0157】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0158】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－７）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0159】

【化29】

【0160】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0161】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´）にしたＥ及びＥ´部分との結合を有し、かつ、化学式（Ｖａ´´）に示したＥ´´部分が、オリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置に結合されたコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－８）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0162】

【化30】

【0163】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0164】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有し、かつ、上記の化学式（Ｖｃ´´）に示したＥ´´部分が、オリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置に結合されたコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－９）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0165】

【化31】

【0166】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0167】

本発明の別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＤとして含むコンジュゲートであって、天然または修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートヌクレオチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、１５～２５ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１０）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0168】

【化32】

【0169】

ここで、
Ｙ及びＹ´は、互いに独立して、水素、－ＣＨ_２－Ｚ、－ＣＨ_２－Ｚ´、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｚ、及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｚ´からなる群より選択され；
Ｚ及びＺ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、カルボキシル基、１´、２´－ジデオキシリボース、ヌクレオチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
ｇは、０、１、２、３、４、５及び６からなる群より選択される整数である。

【0170】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖａ´´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１１）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0171】

【化33】

【0172】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0173】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１２）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0174】

【化34】

【0175】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。上記の化学式（Ｃｎ－１２）に示すこのコンジュゲートは、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ｂと称される。

【0176】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有し、かつ、上記の化学式（Ｖａ´´）に示したＥ´´部分が、オリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置に結合されたコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１３）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0177】

【化35】

【0178】

ここで、
Ｒ及びＲ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、及びカルボキシル基からなる群より選択される。

【0179】

本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ二本鎖の５´末端において、Ｄと、上記の化学式（Ｖｃ´´´）に示したＥ及びＥ´部分との結合を有し、かつ、上記の化学式（Ｖｃ´´´）に示したＥ´´部分が、オリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置に結合されたコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１４）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0180】

【化36】

【0181】

上記の化学式（Ｃｎ－１４）に示すこのコンジュゲートは、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ｃと称される。

【0182】

本発明の別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＤとして含むコンジュゲートであって、天然または修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートヌクレオチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、１５～２５ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｃｎ－１５）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは上記塩の溶媒和物若しくは水和物である。

【0183】

【化37】

【0184】

ここで、
Ｙ及びＹ´は、互いに独立して、水素、－ＣＨ_２－Ｚ、－ＣＨ_２－Ｚ´、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｚ、及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｚ´からなる群より選択され；
Ｚ及びＺ´は、互いに独立して、水素、リン酸、硫酸、カルボキシル基、１´、２´－ジデオキシリボース、ヌクレオチド、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
ｇは、０、１、２、３、４、５及び６からなる群より選択される整数である。

【0185】

本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡやダイサー酵素の基質（ｄｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡ二本鎖を含むコンジュゲート、またはそれを含む薬学的組成物であって、ＲＮＡ二本鎖が、２７～２５または２７～２４のヌクレオチド長であり、その両端において、上記の化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示した構造をそれぞれが有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合し、パッセンジャー（センス）鎖の５´末端、及び／またはガイド（アンチセンス）鎖の５´末端において、リン酸、硫酸またはカルボキシル基の潜在的な追加的結合を有する、コンジュゲート、またはそれを含む薬学的組成物が提供される。

【0186】

本発明の別の実施形態では、上述したコンジュゲートであって、ｓｉＲＮＡ二本鎖の両端、及びｓｉＲＮＡ二本鎖内の１以上の内部位置において、上記の化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示した構造をそれぞれ有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分と結合し、パッセンジャー（センス）鎖の５´末端及び／またはガイド（アンチセンス）鎖の５´末端におけるリン酸、硫酸、またはカルボキシル基の潜在的な追加的結合を有する、コンジュゲートが提供される。

【0187】

本発明の実施形態はまた、治療を必要とする対象における医学的疾患を治療するためのタンパク質またはＯＤ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯ）などの治療上有用な薬物を含む本発明によるコンジュゲートの使用に関する。医学的疾患は、これに限定しないが、特定のタンパク質が疾患の原因または発症のいずれかに関与する、変性疾患、癌、血管疾患、代謝疾患、外傷性傷害、毒性傷害、虚血性傷害、感染症（例えば、ウイルス性感染症、細菌性感染症）、または免疫媒介性疾患であり得る。このような医学的疾患については、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス機構を介した各遺伝子の発現の調節、または、治療用タンパク質（例えば、抗体、シグナル伝達において機能するタンパク質、またはタンパク質置換療法）による各タンパク質の活性の調節によって、疾患関連プロセスの阻害または疾患の根底原因の治療において有益な効果を有し得る。

【0188】

例えば、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、またはそれをタンパク質に翻訳するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれかに結合する一本鎖または二本鎖核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的類似体）の投与を含む医療形態である、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｄｓｉＲＮＡ療法として使用され得る。この療法は、疾患関連遺伝子の発現を阻害するように作用し、それによって、疾患の原因または発症に関与し得る疾患関連タンパク質の産生を阻害する。あるいは、本発明のコンジュゲートは、遺伝子編集を行うことができる治療用タンパク質、またはＣａｓ９－ＲＮＡ複合体などのタンパク質／核酸複合体を含み得る。

【0189】

本発明の実施形態は、本明細書に記載されたコンジュゲートと、薬学的に許容される担体または塩とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート及び薬学的組成物は、臨床現場においてインビボで使用され得る。

【0190】

本発明の別の実施形態では、それを必要とする対象における医学的疾患の治療に使用するための、本発明のコンジュゲート、または本発明のコンジュゲートを含む薬学的組成物を含む。本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における医学的疾患を治療するための医薬組成物を作製するための本発明のコンジュゲートの使用を含む。いくつかの実施形態では、医学的疾患は、癌、代謝疾患、感染症、変性疾患、血管疾患、または免疫媒介疾患である。

【0191】

本発明の実施形態によるコンジュゲートは、本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含まない同様の治療薬物の性能と比較して、細胞膜または生物学的障壁（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）など）を介した、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、または治療用タンパク質（例えば抗体など）の送達の改善において有利である。したがって、本発明のコンジュゲートは、例えば、効力、毒性、または薬物動態などの１以上の側面において、高分子薬物の性能を改善することができる。

【0192】

Ｄ部分がオリゴヌクレオチドである本発明のコンジュゲートは、これに限定しないが、次の方法によって合成することができる。まず、サイレンシングするべき遺伝子が、疾患の原因または発症におけるその遺伝子の役割に基づき選択される。次いで、当分野で既知のバイオインフォマティクス手法に基づき、コンジュゲートに組み込まれるヌクレオチド配列が設計され、決定される［一般的には、ＲＩＳＣ基質では１９～２１塩基対の二本鎖ｓｉＲＮＡ、ダイサー基質では２４～２９塩基対の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）］。合成は、オリゴヌクレオチドの３´～５´方向において行われる。固相合成が、保護された２´－デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、または化学的に修飾されたヌクレオシド、例えば［ＬＮＡ（ロック核酸）またはＢＮＡ（ブリッジ核酸）］から誘導された、保護された構成要素を使用して適用される。この構成要素はヌクレオシド前駆体として提供され、５´－ヒドロキシル基及び３´－ヒドロキシル基は、ＤＭＴ及びホスホルアミダイトによってそれぞれ保護される。これらのヒドロキシル基は、ヌクレオチドを、成長するオリゴヌクレオチド鎖にカップリングさせる反応中に、所望のヌクレオチド配列によって決定される順序で、連続的に除去される。

【0193】

本発明のコンジュゲートの合成の目的のために、Ｅ基は前駆体分子として提供され、各々は、上述したように、保護基に結合された本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分である。保護基は、当分野で既知のヒドロキシルのための任意の保護基であり得るが、ホスホルアミダイト及びＤＭＴ［ジメトキシトリチルビス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］が、オリゴヌクレオチド合成において慣用的に使用される。本発明のコンジュゲートの主な利点は、上記の化学式（ＩＶａ）及び（ＩＶｃ）について説明したように、オリゴヌクレオチド鎖の５´－末端、オリゴヌクレオチド鎖の３´－末端、またはオリゴヌクレオチドに沿った内部位置のいずれかにＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を結合する選択肢を提供することである。これにより、本発明に係るＥ部分を、任意の固有の天然オリゴヌクレオチド構成要素と同様に、オリゴヌクレオチド鎖内に一体化させることができる。鎖の組み立てが完了すると、生成物は固体支持体から溶液中に放出され、脱保護され、回収される。次いで、所望のコンジュゲートを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離し、本発明の所望のコンジュゲートを高純度で得る。ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡの場合、相補的ＲＮＡ鎖の各々を別々に合成し、次いで、２つの鎖のアニーリングを当分野で既知の標準的な条件下で行い、所望の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡを得る。得られたｓｉＲＮＡは、その後、精製及びアリコートに供される。

【0194】

本発明の一実施形態では、細胞膜及び生物学的障壁からなる群より選択されるリン脂質生体膜を横断して薬物を送達する方法であって、細胞を本発明のコンジュゲートと接触させるステップを含む方法が提供される。生物学的障壁は、血液脳関門、血液眼球関門、または血液胎児関門から選択される。

【0195】

本発明の一実施形態では、薬物を生物学的細胞に送達する方法をであって、細胞を本発明のコンジュゲートまたはそれを含む医薬組成物と接触させるステップを含む方法が提供される。細胞は、培養物、生きている動物、またはヒト対象中の細胞である。

【0196】

本発明の一実施形態では、本発明に係る上記の化学式（Ｉ）に示したコンジュゲート、またはそれを含む医薬組成物であって、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、互いに独立して、上記の化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに記載の構造を有するコンジュゲート、またはそれを含む医薬組成物が提供される。

【0197】

本発明はまた、インビトロまたはインビボで、遺伝子発現を特異的に阻害するための方法を含む。本発明の一実施形態では、本方法は、上記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、（Ｖｃ´´´）、（Ｃｎ－１）、（Ｃｎ－２）、（Ｃｎ－３）、（Ｃｎ－４）、（Ｃｎ－５）、（Ｃｎ－６）、（Ｃｎ－７）、（Ｃｎ－８）、（Ｃｎ－９）、（Ｃｎ－１０）、（Ｃｎ－１１）、（Ｃｎ－１２）、（Ｃｎ－１３）、（Ｃｎ－１４）、または（Ｃｎ－１５）のいずれかに記載の構造を有するコンジュゲート、またはその薬学的組成物の使用を含み得る。この場合、Ｄは、特定の遺伝子の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、疾患の病因または発症に関与する病原性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｄは、治療用タンパク質である。

【0198】

本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、非限定的な態様で、生体膜内でエンドサイトーシスまたはフリップフロップを誘導するための方法を提供する。この方法は、本発明のコンジュゲート、またはそれを含む薬学的組成物を、生物学的膜と接触させるステップを含む。コンジュゲートは、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡ二本鎖を含み、ｓｉＲＮＡ二本鎖内の両端、あるいは、ｓｉＲＮＡ二本鎖内の内部位置において、上記の化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、または（Ｖｃ´´´）のいずれかに示したＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合される。本発明のコンジュゲートのこの構造に起因して、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡは、膜の表面に平行に接近し、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、膜の表面に対して垂直な膜コアに向けて配向される（図１に示す）。その結果、高度に負に荷電したＲＮＡが膜表面に接近することとなり、これにより、細胞内に膜小胞が形成され（エンドサイトーシスにより生成されるエンドソーム）、また、コンジュゲートが一方の膜リーフレットから他方のリーフレットへと移動する（フリップフロップ）。両方のプロセスは、本発明のｓｉＲＮＡまたは他の高分子薬物の細胞内への膜貫通送達の開始及び／または伝播に非常に有用であり得る。

【0199】

本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的疾患の治療に使用され得る。本発明の実施形態は、治療を必要とする対象に対して、上記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、（Ｖｃ´´´）、（Ｃｎ－１）、（Ｃｎ－２）、（Ｃｎ－３）、（Ｃｎ－４）、（Ｃｎ－５）、（Ｃｎ－６）、（Ｃｎ－７）、（Ｃｎ－８）、（Ｃｎ－９）、（Ｃｎ－１０）、（Ｃｎ－１１）、（Ｃｎ－１２）、（Ｃｎ－１３）、（Ｃｎ－１４）、または（Ｃｎ－１５）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲートを含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、治療方法を提供する。上記の化学式の式中のＤは、医学的疾患の治療に有用な薬物である。

【0200】

一実施形態では、この治療方法は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯを使用した遺伝的医療のためのものである。この治療方法は、治療を必要とする対象に対して、上記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、（Ｖｃ´´´）、（Ｃｎ－１）、（Ｃｎ－２）、（Ｃｎ－３）、（Ｃｎ－４）、（Ｃｎ－５）、（Ｃｎ－６）、（Ｃｎ－７）、（Ｃｎ－８）、（Ｃｎ－９）、（Ｃｎ－１０）、（Ｃｎ－１１）、（Ｃｎ－１２）、（Ｃｎ－１３）、（Ｃｎ－１４）、または（Ｃｎ－１５）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲートを含む治療有効量の医薬組成物を、に投与するステップを含む。上記の化学式の式中のＤは、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、または治療用タンパク質であり、遺伝子の発現の阻害、または、特定の対象（患者）の疾患に関与するタンパク質の活性の阻害に有用である。

【0201】

本発明の別の実施形態では、本発明は、上記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、（Ｖｃ´´´）、（Ｃｎ－１）、（Ｃｎ－２）、（Ｃｎ－３）、（Ｃｎ－４）、（Ｃｎ－５）、（Ｃｎ－６）、（Ｃｎ－７）、（Ｃｎ－８）、（Ｃｎ－９）、（Ｃｎ－１０）、（Ｃｎ－１１）、（Ｃｎ－１２）、（Ｃｎ－１３）、（Ｃｎ－１４）、または（Ｃｎ－１５）のいずれかに示す構造を有する本発明のコンジュゲートによって疾患を治療する方法を含む。上記の化学式の式中のＤは、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、または治療用タンパク質であり、リン脂質生体膜、または生物学的障壁（例えば、血液脳関門など）を横断して細胞内に送達する必要がある。細胞は、インビトロでの細胞培養物、またはインビボでの生きている動物若しくはヒト対象のいずれかである。いくつかの実施形態では、細胞は、新生物細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、転移内の細胞である。細胞は、真核細胞、発癌性因子によってトランスフェクトされた真核細胞、ヒト細胞、前癌細胞である細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。細胞は、インビトロ、すなわち細胞培養物中の細胞、エクスビボ、すなわち生きている対象から取り出された細胞、またはインビボ、すなわち生きている動物またはヒト対象中の細胞であり得る。

【0202】

本発明のさらに別の実施形態では、Ｄは、置換療法として、生理学的ニーズに対処するために、例えば変異した機能不全タンパク質を置換するために投与されるタンパク質である。別の実施形態では、Ｄは、遺伝子調節に関与するタンパク質であり、とりわけ、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集（特定の遺伝子の配列の追加、分断または変更）に関与するタンパク質を含む。一実施形態では、上記のタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連タンパク質のメンバーであり得る。具体的には、上記のタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼ酵素、またはその類似体であり、そのガイドオリゴヌクレオチド配列が潜在的にロードされている。

【0203】

本発明の一実施形態では、医学的疾患の遺伝学的治療のための方法であって、治療を必要とする対象に対して、上記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有する本発明のコンジュゲートを含む治療有効量の医薬組成物を、投与するステップを含む方法が提供される。上記の化学式の式中のＤは、例えばＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲタンパク質であり、適切なガイドオリゴヌクレオチドと共に投与され、これにより、ガイドオリゴヌクレオチドがロードされたタンパク質の細胞内への送達が達成され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそのゲノム編集活性を発揮することができる。この場合のガイドオリゴヌクレオチドは、Ｃａｓ９タンパク質をＤＮＡ上の特定の遺伝子座（部位）に誘導し、その部位での二本鎖ＤＮＡ切断を誘導して遺伝物質の局所的欠陥の修復を可能にするＲＮＡまたはＤＮＡの配列である。Ｃａｓ９の場合、ガイドオリゴヌクレオチドはＲＮＡの短いセグメントであり、その配列は標的ＤＮＡ遺伝子座の配列に対して相補的である。

【0204】

したがって、本発明の実施形態による各コンジュゲート、各医薬組成物、及び各方法は、とりわけ、癌、毒性傷害、代謝疾患、虚血性疾患、感染症、血管疾患、タンパク質貯蔵疾患、外傷、免疫媒介疾患、または変性疾患から選択される医学的疾患の治療において有益であり得る。

【0205】

したがって、本願発明の一実施形態では、医学的疾患の治療方法であって、治療を必要とする対象に対して、上記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｖａ´）、（Ｖａ´´）、（Ｖａ´´´）、（Ｖｂ´）、（Ｖｂ´´）、（Ｖｂ´´´）、（Ｖｃ´）、（Ｖｃ´´）、（Ｖｃ´´´）、（Ｃｎ－１）、（Ｃｎ－２）、（Ｃｎ－３）、（Ｃｎ－４）、（Ｃｎ－５）、（Ｃｎ－６）、（Ｃｎ－７）、（Ｃｎ－８）、（Ｃｎ－９）、（Ｃｎ－１０）、（Ｃｎ－１１）、（Ｃｎ－１２）、（Ｃｎ－１３）、（Ｃｎ－１４）、または（Ｃｎ－１５）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲートを含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む方法が提供される。上記の化学式の式中のＤは、医学的疾患の治療に有用な薬物である。

【0206】

いくつかの実施形態では、医学的疾患は癌である。本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞の典型的な特徴、例えば、制御されていない増殖、特殊機能の喪失、不死性、有意な転移能、抗アポトーシス活性の有意な増加、急速な増殖及び増殖速度、または特定の特徴的な形態及び細胞マーカーなどを示す細胞の存在を指す。一般的に、癌細胞は腫瘍の形態であり、動物の体内に局所的に存在するか、または、例えば白血病細胞などの独立細胞として血流中を循環する。

【0207】

神経学的疾患の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、アルツハイマー病、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性疾患の治療に有用であり得る。

【0208】

感染症の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、抗生物質または抗ウイルス剤を細菌またはウイルス病原体に送達するのに有用であり得る。したがって、本発明のコンジュゲートは、抗感染性を有し得、そのため、例えば細菌感染症またはウイルス感染症などの感染症の治療に有用である。本発明のコンジュゲートが有用であり得るウイルス感染の例は、これに限定しないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの肝親和性ウイルス；インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣなどのオルトミクソウイルス感染；またはパラインフルエンザウイルスによる感染である。したがって、本発明の一実施形態は、抗ウイルス剤または抗菌剤に結合されたＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分のコンジュゲートである。このような薬物は、とりわけ、病原体の遺伝物質と相互作用して、病原体の複製、代謝、感染性、または生存に関与する遺伝的プロセスを阻害することを目的とする遺伝子配列であり得る。そのような遺伝子配列は、ウイルス遺伝子の発現を抑制するように特別に設計されたｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡであり得る。

【0209】

感染対策における本発明のコンジュゲートの有用性は、治療的に有用な薬物を、生体膜を横断してホスト（例えばヒト患者）の細胞に送達すること、及び、生体膜を横断して病原体（例えば、細菌またはウイルス）の細胞に送達することのうちの少なくとも一方であり得る。

【0210】

代謝疾患の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、代謝障害に関与する１または複数の遺伝子の発現を下方制御することを目的とする遺伝子送達治療、または疾患の病因または発症に関与する欠陥変異タンパク質を置換するためのタンパク質の投与に有用である。

【0211】

他の実施形態では、本発明は、リン脂質膜を横断しての化合物の細胞内への送達を向上させるための、本発明の化合物の使用に関するものであり、このため、農業での利用に有益である。結合された化合物及び所望の兆候（症状）に応じて、このような送達は、様々な有用な用途を有し得る。例えば、植物においては、このような送達は、とりわけ、植物の遺伝子を改良したり、様々な昆虫、細菌、菌類を根絶したりすることによって、作物の品質と量の向上を助けることができる。

【0212】

実施例

【0213】

本発明をさらに説明するため、及び本発明の実施形態が実際にどのように実施され得るかを示すために、以下にいくつかの例を説明する。

【0214】

実施例１：Ｄ部分がオリゴヌクレオチドである、本発明の実施形態によるコンジュゲートを合成するための一般的方法

【0215】

まず、疾患の原因または発症における役割に基づいて、サイレンシング（抑制）される遺伝子を選択した。次いで、当分野で既知のバイオ情報科学方法論に基づき、コンジュゲートに組み込まれるヌクレオチド配列を設計及び決定した（一般的に、ＲＩＳＣ基質の場合は１９～２１塩基対の二本鎖ｓｉＲＮＡ、ダイサー基質の場合は２４～２９塩基対の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ））。

【0216】

合成は、オリゴヌクレオチドの３´から５´の方向に行った。固相合成を、保護された２´－デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、または化学的に修飾されたヌクレオシド、例えばＬＮＡ（ロックされた核酸）またはＢＮＡ（架橋された核酸）、から誘導された保護された構成要素を用いて適用した。構成要素は、ヌクレオシド前駆体として提供され、５´－及び３´－ヒドロキシル基は、それぞれＤＭＴ及びホスホロアミダイトによって保護されていた。これらの基は、所望のヌクレオチド配列によって決定された順序でヌクレオチドを成長オリゴヌクレオチド鎖に結合する反応中に、順次除去された。

【0217】

本発明のコンジュゲートの合成の目的のために、Ｅ基は、それぞれ上述のように保護基に結合された本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分である前駆体分子として提供された。保護基は当該技術分野で既知のヒドロキシルに対する任意の保護基であり得るが、ホスホロアミダイト及びＤＭＴ（ジメトキシトリチル ビス－（４－メトキシフェニル）フェニルメチル）はオリゴヌクレオチド合成において慣例的に使用されている。本発明のコンジュゲートの主な利点は、上記の化学式（ＩＶａ）及び（ＩＶｃ）に示すように、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分をオリゴヌクレオチド鎖の５´末端、オリゴヌクレオチド鎖の３´末端、またはオリゴヌクレオチドに沿った内部位置のいずれかに結合させるオプションを提供することである。それにより、本発明のＥ部分を、任意の固有の天然のオリゴヌクレオチド構成要素と同様に、オリゴヌクレオチド鎖内に組み込むことができる。鎖の組み立てが完了すると、生成物が、固体支持体から溶液中に放出され、脱保護され、集められた。次に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって所望のコンジュゲートを単離することによって、所望の本発明のコンジュゲートが高純度で得られた。ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡの場合、相補的なＲＮＡ鎖の各々は別々に合成され、その後、２つの鎖のアニーリングを当分野で既知の標準的な条件下で行うことによって、所望の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡが得られ、その後、それらを精製及び分注した。

【0218】

実施例２：本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含む前駆体分子の化学合成方法

【0219】

実施例２ａ：アポ－Ｓｉ－Ｋ－２９Ｅ－前駆体の合成

【0220】

【化38】

【0221】

２ａＡ．フェノール２の合成

【0222】

エストラジオールを、アセトニトリルとメタノールとの混合物中の臭化ベンジル及び炭酸カリウムで処理した。完全かつクリーンな変換をもたらす溶解性を促進するために、メタノールを共溶媒として使用した。濾過及び濾液の濃縮後、粗生成物（２）を次のステップで使用した。

【0223】

【化39】

【0224】

化合物２を過剰の水素化ナトリウムで処理した後、アリルブロミドを添加すると、化合物３へ完全に変換した。アリル誘導体２をＯｓＯ４及びＮａＩＯ_４で処理すると、アルデヒド４が得られた。アルデヒド４とＮ－メチルアミノエタノールとの間の還元的アミノ化によってもたらされたアルコール５を、その後、光延条件下でペルフルオロ－ｔ－ＢｕＯＨと反応させて化合物６を得た。最後に、ベンジル保護基を水素化によって除去し、フェノール２を得た。

【0225】

２ａＡ１．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－ベンジルオキシ－１７－ヒドロキシエストラ－１、３、５（１０）－トリエン（２）

【0226】

アセトン（２Ｌ）及びＭｅＯＨ（０．５Ｌ）中のエストラジオール（２，３００ｇ、１．１ｍｏｌ）、臭化ベンジル（２００ｍＬ、１．６８ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（３０４ｇ、２．２ｍｏｌ）の混合物を１８時間加熱還流した。室温で冷却後、反応混合物を濾過し、真空中で濃縮した。濃縮物を熱トルエン中で溶解し、減圧下で濃縮した。粗物質（化合物２、５０８ｇ）をそのまま次の反応で使用した。

【0227】

２ａＡ２．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－アリルオキシ－３－ベンジルオキシエストラ－１、３、５（１０）－トリエン（３）

【0228】

無水ＴＨＦ（４Ｌ）中の粗アルコール３（５０８ｇ、約１．１ｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（１１０ｇ、鉱オイル中の６０％分散液、２．７ｍｏｌ）を滴下した。約３０分後、臭化アリル（２４０ｍＬ、２．７ｍｏｌ）及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（４０ｇ、１０８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を約１８時間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却させ、水（１Ｌ）で注意深くクエンチし、混合物を部分的に濃縮した。混合物をＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）中で溶解し、水（３ｘ５００ｍＬ）で洗浄した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して、次のステップのために十分な純度の粗化合物３（５５０ｇ、１．３６ｍｏｌ）を得た。

【0229】

２ａＡ３．２－（（（１３Ｓ、１７Ｓ）－３－（ベンジルオキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル）オキシ）アセトアルデヒド（４）

【0230】

ジエチルエーテル（３０ｍＬ）及び水（３０ｍＬ）中の化合物３（２．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、２、６－ルチジン（１．３３ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）、過ヨウ素酸ナトリウム（４．２６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、及びｔＢｕＯＨ（２ｍＬ）中のＯｓＯ_４の２．５％溶液を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。相を分離し、水層をジエチルエーテルで２回抽出した。組み合わせた有機層をチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液及びブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。さらに精製すると、アルデヒド４（１．５１ｇ、３．７ｍｍｏｌ）が、７５％の収率で透明なオイルとして得られた。

【0231】

２ａＡ４．２－（（２－（（（１３Ｓ、１７Ｓ）－３－（ベンジルオキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エタン－１－オール（５）

【0232】

ジクロロエタン（１００ｍＬ）中の化合物４（２．０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）の溶液に、２－（メチルアミノ）エタン－１－オール（０．７９ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ、２当量）を加え、得られた混合物を１５分間撹拌した。次に、ＡｃＯＨ（０．５６ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ、２当量）を加え、混合物をさらに１０分間撹拌した。ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（４．２ｇ、１９．６ｍｍｏｌ、４当量）を加え、得られた混合物を一晩撹拌した。ＮａＯＨ（１Ｍ、４００ｍＬ）を加え、混合物を振盪し、層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ、３００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して化合物５（２．４ｇ、４．９ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た。

【0233】

２ａＡ５．２－（（（１３Ｓ、１７Ｓ）－３－（ベンジルオキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル）オキシ）－Ｎ－（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（６）

【0234】

テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍＬ）中のアルコール５（２．４ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液に、ペルフルオロ－ｔ－ブタノール（０．９３ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ、１．３当量）、ＰＰｈ３（２．１ｇ、８．０ｍｍｏｌ、１．６当量）、及びジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）（１．３ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ、１．３当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を濃縮し、粗物質をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＋１％ＮＥｔ３）で精製して、化合物６を、徐々に固化する無色のオイル（２．１ｇ、３．１ｍｍｏｌ、６２％）として得た。

【0235】

２ａＡ６．（１３Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール（フェノール２）

【0236】

化合物６（７．５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、１５０ｍＬ）中で溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（９００ｍｇ ＡＢＣＲ＋９００ｍｇ Ｍｅｒｃｋ）を加えた。混合物を５バールの水素雰囲気下で１６時間撹拌した。懸濁液をセライトの短い経路で濾過し、濃縮した。フェノール２（５．７ｇ、９．６ｍｍｏｌ）が、無色のオイルとして分離された。

【0237】

２ａＢ．Ｋ－１－７の合成

【0238】

フェノール２をさらに誘導体化するには、構成要素Ｋ－１－７が必要であった。この化合物を、９－フルオレニルメチル Ｎ－スクシンイミジルカーボネート（ＦｍｏｃＯＳｕ）を使用したフルオレニル基の、塩基性条件を使用したチオールとの結合によって調製した。

【0239】

【化40】

【0240】

（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル）チオ）－３－メチルブタン－１－オール（Ｋ－１－７）

【0241】

Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００ｍＬ）中の３－メチル－３－チオブタノール（１３．６ｇ、１１３ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（２４ｇ、３４０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＦｍｏｃＯＳｕ（２５．２ｇ、７５．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で２時間撹拌した後、室温まで冷却した。酢酸エチル（２００ｍＬ）及びヘプタン（４００ｍＬ）を加え、混合物を水で洗浄し（３ｘ２００ｍＬ）、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル（ヘプタン中のＥｔＯＡｃ））を使用したさらなる精製によって、化合物Ｋ－１－７（１７．０ｇ、５７．２ｍｍｏｌ）を収率７６％で粘着性のオイルとして得た。

【0242】

２ａＣ．Ｋ－２９Ｕの合成

【0243】

構成要素Ｋ－２９Ｕの合成を、スキーム３に示すように実行した。

【0244】

【化41】

【0245】

ＨＮＯ_３の存在下において、２－デオキシウリジンをＩ_２で処理して、デオキシウリジンＵ－１のヨード誘導体を得た。ヨウ化物Ｕ－１は、ヘック反応を使用してメチルアクリレートに結合することによって、カラムクロマトグラフィーによる精製後にメチルエステルＵ－２をもたらした。Ｕ－２のメチルエステルをＮａＯＨで加水分解し、得られた化合物Ｕ－３をＰｄ／Ｃ及びＨ_２を使用して水素化して中間体Ｕ－４を得た。カップリング試薬として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を使用して中間体Ｕ－４及びＵ－５（市販）をカップリングし、塩化物Ｕ－６を得た。塩化物Ｕ－６を、高温で、チオトシル酸カリウムで処理して、構成要素Ｋ－２９Ｕを得た。

【0246】

２ａＣ１．１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－５－ヨードピリミジン－２、４（１Ｈ、３Ｈ）－ジオン（Ｕ－１）

【0247】

２－デオキシウリジン（１５ｇ、６６ｍｍｏｌ）及びＩ_２（１９ｇ、７３ｍｍｏｌ、１．１当量）をＣＨＣｌ_３（７５０ｍＬ）及びＨＮＯ_３（水溶液、１Ｍ、１５０ｍＬ）の混合物中で溶解し、得られた紫色の混合物を還流で５時間撹拌した後、沈殿物が形成された。混合物を、最初に空気で、次に氷浴で冷却した。冷却した混合物を濾過し、残留物を冷たいＣＨＣｌ_３で洗浄した。固体を収集し、真空中で乾燥させて、ヨウ化物Ｕ－１をオフホワイトの固体（２０ｇ、５７ｍｍｏｌ、８６％）として得た。

【0248】

２ａＣ２．メチル（Ｅ）－３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）アクリレート（Ｕ－２）

【0249】

ヨウ化物Ｕ－１（５．２ｇ、１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中で溶解し、混合物にＴＥＡ（４．１ｍＬ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）、アクリル酸メチル（８．０ｍＬ、８８．２ｍｍｏｌ、６当量）、ＰＰｈ３（０．７７ｇ、２．９ｍｍｏｌ、０．２当量）、及び酢酸パラジウム（０．３３ｇ、１．５ｍｍｏｌ、０．１当量）を加えた。得られた混合物を１００℃で４時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、濾液を濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中、１０％のＭｅＯＨ）で精製し、アクリレートＵ－２（４．０ｇ、１３ｍｍｏｌ、８７％）を、徐々に結晶化するオレンジ色のオイルとして得た。

【0250】

２ａＣ３．（Ｅ）－３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）アクリル酸（Ｕ－３）

【0251】

アクリレートＵ－２（５．０ｇ、１６ｍｍｏｌ）をＮａＯＨ（水溶液、２Ｍ、６０ｍＬ）中で溶解し、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、混合物がｐＨ１（ｐＨ紙で測定）付近になるまでＨＣｌ（３７％）を加えた。混合物を０℃で１時間撹拌した後、沈殿物が形成された。固形物を濾過によって収集し、フラスコに移した。粗物質をトルエンと２回共蒸発させて、粗生成物Ｕ－３（大量の水が存在する）をオフホワイトのわずかに茶色の固体（３．３ｇ、１１ｍｍｏｌ、６９％）として得た。

【0252】

２ａＣ４．３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパン酸（Ｕ－４）

【0253】

粗カルボン酸Ｕ－３（２８．６ｇ、９６ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ（５００ｍＬ）中で溶解した。すべてが溶解するまで、ＮａＯＨ（１０ｍＬ、１０Ｍ）を加えた。Ｐｄ／Ｃ（１０％、３ｇ）を加え、混合物を５バールのＨ_２下で一晩攪拌した。混合物をセライトで濾過し、濃縮して黄色のオイル（５０ｇ）を得た。混合物には塩が含まれていたため、最小量のＨ_２Ｏ（総量１３０ｍＬ）中で溶解し、ｐＨ約２（ｐＨ紙）に酸性化した。粗混合物を、逆相クロマトグラフィーを使用して脱塩した。生成物を含む画分をプールし、濃縮し、凍結乾燥して、カルボン酸Ｕ－４（１０ｇ、３３ｍｍｏｌ、３５％）をふわふわした白い固体として得た。

【0254】

２ａＣ５．Ｎ－（２－（３－クロロプロポキシ）エチル）－３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシル－メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパンアミド（Ｕ－６）

【0255】

３５０ｍＬのＤＭＦ中のウリジンカルボン酸誘導体Ｕ－４（５．５ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）及びアミンＵ－５（３．２ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（１０．３ｍＬ、７３．５ｍｍｏｌ、４当量）、ＨＯＢｔ（３．１ｇ、２０．２ｍｍｏｌ、１．１当量）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、３．９ｇ、２０．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。得られた懸濁液を室温で５日間撹拌した後、ほとんどの物質が溶解した。混合物を真空中で濃縮した。粗混合物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の７～８％ＭｅＯＨ）によって精製して、アミドＵ－６（７．２ｇ、１７ｍｍｏｌ、９３％）を、徐々に固化する黄色／オレンジ色のオイルとして得た。

【0256】

２ａＣ８．Ｓ－（３－（２－（３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパンアミド）エトキシ）プロピル）４－メチルベンゼンスルホノチオエート（Ｋ－２９Ｕ）

【0257】

塩化物Ｕ－６（３．６ｇ、８．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中で溶解し、ＴＢＡＩ（０．３２ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）及びトルエンチオスルホン酸カリウム（２．９ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８０℃で４０時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）及びＨ_２Ｏ（３００ｍＬ）を加えて、層を分離した。有機層をブラインで洗浄した。組み合わせた水層をＥｔＯＡｃ（４ｘ２５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。粗混合物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３～７％ＭｅＯＨ）を使用して精製し、チオトシレートＫ－２９Ｕ（１．７５ｇ、３．１ｍｍｏｌ、３６％）を粘着性の固体として得た。

【0258】

２ａＤ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－２９Ｅ－前駆体の合成の完了

【0259】

フェノール２と構成要素Ｋ－１－７とを光延条件下で結合させ、保護されたチオールＫ－２９Ｅ－１を得た。フルオレニル基を、Ｋ－２９Ｕの存在下で、ＮａＯＭｅによりインサイチュで除去し、ジスルフィドＫ－２９Ｅ－２を得た。当該技術分野で既知であるように、標準的な手順を用いて結合された標準的なホスホルアミデート部分を使用して、ＤＭＴ基を結合させた。

【0260】

【化42】

【0261】

２ａＤ１．２－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－（３－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル）チオ）－３－メチルブトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル）オキシ）－Ｎ－（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（Ｋ－２９Ｅ－１）

【0262】

ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のフェノール２（１．４７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、アルコールＫ－１－７（１．４８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．９１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．６ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した。濃縮後、混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃ及び１％Ｅｔ３Ｎ）を使用してさらに精製し、Ｋ－２９Ｅ－１（１．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を収率６７％で透明なオイルとして得た。

【0263】

２ａＤ２．Ｎ－（６－（（４－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）－３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパンアミド（Ｋ－２９Ｅ－２）

【0264】

ジクロロメタン中の化合物Ｋ－２９Ｅ－１（１当量）及びトシレートＫ－２９Ｕ（１．５当量）の溶液を、ＭｅＯＨ中の２Ｍ ＮａＯＭｅ（４当量）で処理した。混合物を室温で１６時間撹拌した。濁った懸濁液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュを用いたさらなる精製によって、化合物Ｋ－２９Ｅ－２が得られた。

【0265】

２ａＤ３．３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）－Ｎ－（６－（（４－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）プロパンアミド（Ｋ－２９Ｅ－３）

【0266】

ピリジン中のＫ－２９Ｅ－２（１当量）の溶液に、ＤＭＴ－Ｃｌ（２当量）及びＤＭＡＰ（０．１当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌し、その後、混合物を濃縮した。カラムクロマトグラフィーを用いて残渣を精製して、化合物Ｋ－２９Ｅ－３を得た。

【0267】

２ａＤ４．３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－（（（２－シアノエチル）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）－Ｎ－（６－（（４－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）プロパンアミドＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ２９Ｅ－前駆体）

【0268】

ジクロロメタン中の化合物Ｋ－２９Ｅ－３（１当量）の溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３当量）を加えた後、０．５ＭのＮ－メチルモルホリンの溶液、及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸を滴下した（ホスホロジアミダイト剤に対して１．３当量のＮ－メチルモルホリン）。得られた混合物を室温で２時間撹拌した後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチし、撹拌をさらに１０分間続けた。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを用いたさらなる精製によって、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－２９Ｅ－前駆体が得られた。

【0269】

実施例２ｂ：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－２９Ｄ前駆体の合成

【0270】

【化43】

【0271】

２ｂＡ．フェノール１の合成

【0272】

【化44】

【0273】

エストラジオールを過剰の水素化ナトリウムで処理した後、アリルブロマイドを添加すると、化合物３へクリーンに変換された。その後の１．５当量の９－ＢＢＮによるヒドロホウ素化によって、末端ヒドロキシ基のみが得られたが、ＢＨ３によるヒドロホウ素化は選択性がはるかに低く、付加物の混合がもたらされた。アルコール５を光延反応条件に供し、過フッ素化ｔｅｒｔ－ブタノールと結合させて化合物６を得た。化合物８のベンジル基の水素化分解によって、フェノール１が得られた。結論として、フェノール１は、５つの合成ステップによって、４５％の全収率でエストラジオールから調製された。

【0274】

２ｂＡ１．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－ベンジルオキシ－１７－ヒドロキシエストラ－１、３、５（１０）－トリエン（２）

【0275】

（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－ベンジルオキシ－１７－ヒドロキシエストラ－１、３、５（１０）－トリエン（２）の合成は、上記のセクション２ａＡ１に開示されている。

【0276】

２ｂＡ２．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－アリルオキシ－３－ベンジルオキシエストラ－１、３、５（１０）－トリエン（３）

【0277】

（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－アリルオキシ－３－ベンジルオキシエストラ－１、３、５（１０）－トリエン（３）の合成は、上記のセクション２ａＡ２に開示されている。

【0278】

２ｂＡ３．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－ベンジルオキシ－１７－（３－ヒドロキシプロポキシ）エストラ－１、３、５（１０）－トリエン（７）

【0279】

９－ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（８００ｍＬ、ＴＨＦ中の０．５Ｍ溶液、安定化、４００ｍｍｏｌ）を、粗アルケン３（１０１．２ｇ、２５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１Ｌ）溶液に０℃で滴下し、滴下の完了後、混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を０°Ｃに冷却し、３０％ＮａＯＨ水溶液（１５０ｍＬ、１．３ｍｏｌ）及び３５％水溶液（１２０ｍＬ、１．３ｍｏｌ）を徐々に同時に滴下し、得られた不均一混合物を室温で約１時間激しく撹拌した。その後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（２Ｌ）とブライン（５００ｍＬ）との間で分配した。有機相を追加の５００ｍＬのブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。この手順を同様の方法で繰り返し、両方の部分を組み合わせた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中２５％から３５％の勾配のＥｔＯＡｃ）による濃縮物のさらなる精製によって、アルコール５（１３０ｇ、３１０ｍｍｏｌ）が白色固体として収率６１％で得られた（３ステップ）。

【0280】

２ｂＡ４．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－ベンジルオキシ－１７－［３－（ペルフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシ）プロポキシ］エストラ－１、３、５（１０）－トリエン（８）

【0281】

アゾジカルボン酸ジイソプロピル（８０ｍＬ、４０７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、アルコール７（１３０ｇ、３０１ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１６２ｇ、６１８ｍｍｏｌ）、ペルフルオロ－ｔｅｒｔ－ブタノール（７０ｍＬ、４９７ｍｍｏｌ）、及び乾燥ＴＨＦ（２Ｌ）の撹拌混合物に滴下した。混合物を室温で約１８時間撹拌した。反応混合物を部分的に濃縮し、ヘプタン（１Ｌ）を加えた。ＴＨＦを完全に除去した後、沈殿が始まった。濾過を用いて固体を除去し、濾液を濃縮した。アセトニトリル（１．５Ｌ）を加え、沈殿が始まっている間に混合物を３０分間攪拌した。固体を濾過によって収集し、真空中で乾燥させた。化合物８（１６０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）が、白色固体として収率８１％で単離された。

【0282】

２ｂＡ５．（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－ヒドロキシ－１７－［３－（ペルフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシ）プロポキシ］エストラ－１、３、５（１０）－トリエン（フェノール１）

【0283】

Ｐａｒｒ社の容器に、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）中のベンジルエーテル８（１６０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）を入れ、それに１０％パラジウム炭素（４ｇ）を加えた。混合物を、室温で、水素圧（５バール）下で撹拌した。反応を^１Ｈ ＮＭＲでモニタリングした。約７２時間後、反応混合物をセライトパッド（ＥｔＯＡｃで洗い流した）を通して濾過し、炭の上の新鮮な１０％パラジウム（４ｇ）と共に水素雰囲気（５バール）に再投入した。約１６時間後、反応混合物をセライトパッド（ＥｔＯＡｃで洗い流した）を通して濾過し、濃縮して、フェノール１（１２５ｇ、２２８ｍｍｏｌ）を灰色がかった固体として９１％の収率で得た。

【0284】

２ｂＢ．Ｋ－２９Ｕの合成

【0285】

構成要素Ｋ－２９Ｕの合成については、上記のセクション２ａＣ（２ａＣ１－２ａＣ８）で説明した。

【0286】

２ｂＣ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－２９Ｄ－前駆体の合成の完了

【0287】

合成は、Ｂｏｃ保護されたメチルアミノエタノールとフェノール１との間の光延カップリングによって開始された。カップリング（結合）は、約５０％の変換をもたらした。しかしながら、カラムクロマトグラフィーを用いて、生成物（Ｋ－２９Ｃ－１）を分離し、出発物質を回収できた。ＴＦＡを使用したＢｏｃ基の除去により、アミンの酸保護の存在を可能にするための方法であるＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３を用いた後続の還元的アミノ化が可能になった。その後、チオアセテートのインサイチュ脱保護を用いたジスルフィドの形成が行われ、続いて、当該技術分野で既知の標準手順を使用して、ＤＭＴ基とホスホルアミデート部分との結合が行われた。

【0288】

【化45】

【0289】

２ｂＣ１．ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）カルバメート（Ｋ－２９Ｃ－１）

【0290】

フェノール１（５０ｇ、９１ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ Ｎ－メチルグリシノール（３２ｇ、１８２ｍｍｏｌ）の溶液にＰＰｈ３（３８ｇ、１４６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物をすべて溶解するまで攪拌した。ＤＩＡＤ（２３ｍＬ、１１８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を６４時間撹拌した。混合物を濃縮し、ヘプタンを加えた。得られた沈殿物を濾別し、濾液を濃縮した。粗物質を、カラムクロマトグラフィー（０．１％ＴＥＡを含む１０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）を用いて精製した（３回）。純粋な画分をプールし、濃縮し、化合物Ｋ－２９Ｃ－１（５１ｇ、７３ｍｍｏｌ、８０％）と回収されたフェノール１（５ｇ、９．５ｍｍｏｌ、１０％）とを得た。

【0291】

２ｂＣ２．２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（Ｋ－２９Ｃ－２）

【0292】

化合物Ｋ－２９Ｃ－１（５．６ｇ、７．９ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ中の２Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）中で溶解し、得られた溶液を一晩撹拌した。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１５０ｍＬ）を加え、すべてが溶解するまで激しく撹拌した。層を分離し、有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮してＫ－２９Ｃ－２（４．５ｇ、７．４ｍｍｏｌ、９４％）をピンク色のオイル性物質として得た。

【0293】

２ｂＣ３．Ｓ－（２－メチル－４－オキソブタン－２－イル）エタンチオエート（Ｋ－５）

【0294】

０℃のジメチルアクロレイン（２５ｍＬ、４３５ｍｍｏｌ）とチオ酢酸（４４ｍＬ、６０８ｍｍｏｌ、１．４当量）との混合物に、ＴＥＡ（３１ｍＬ、４３５ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＥｔＯＡｃ及びＮａＯＨ（１Ｍ）を加えた。層を分離し、有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の１０％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、Ｋ－５を黄色のオイルとして得た（２２ｇ、１３７ｍｍｏｌ、３２％）

【0295】

２ｂＣ４．Ｓ－（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）エタンチオエート（Ｋ－２９Ｃ－３）

【0296】

ジクロロエタン（１００ｍＬ）中のＫ－２９Ｃ－２（２．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｚ－８－１（１．１ｇ、６．６ｍｍｏｌ、２当量）、酢酸（０．５７ｍＬ、９．９ｍｍｏｌ、３当量）、及びＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（２．１ｇ、９．９ｍｍｏｌ、３当量）を加え、得られた混合物を４時間撹拌した。ＮａＨＣＯ_３（飽和、５００ｍＬ）を加え、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｘ、２００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中３０％ＥｔＯＡｃ＋０．１％ＮＥｔ_３）を用いて精製し、Ｋ－２９Ｃ－３（１．１ｇ、１．５ｍｍｏｌ、４４％）を得た。

【0297】

２ｂＣ４．Ｎ－（６－（（４－（（２－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）－３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパンアミド（Ｋ－２９Ｃ－４）

【0298】

ジクロロメタン中の化合物Ｋ－２９Ｃ－３（１当量）及びトシレートＫ－２９Ｕ（１．５当量）の溶液を、ＭｅＯＨ中の２Ｍ ＮａＯＭｅ（４当量）で処理した。混合物を室温で１６時間撹拌した。濁った懸濁液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。フラッシュを用いたさらなる精製によって、化合物Ｋ－２９Ｃ－４が得られた。

【0299】

２ｂＣ５．３－（１－（（２Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－２、４－ジオキソ－１、２、３、４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）－Ｎ－（６－（（４－（（２－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）プロパンアミド（Ｋ－２９Ｃ－５）

【0300】

ピリジン中のＫ－２９Ｃ－４（１当量）の溶液に、ＤＭＴ－Ｃｌ（２当量）及びＤＭＡＰ（０．１当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した後、混合物を濃縮した。粗物質を、カラムクロマトグラフィーを用いて精製して、化合物Ｋ－２９Ｃ－５を得た。

【0301】

２ｂＣ６．（２Ｒ、３Ｓ、５Ｒ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－５－（５－（３－（（６－（（４－（（２－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）アミノ）－３－オキソプロピル）－２、４－ジオキソ－３、４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ２９Ｄ－前駆体）

【0302】

ジクロロメタン中の化合物Ｋ－２９Ｃ－５（１当量）の溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３当量）を加えた後、０．５ＭのＮ－メチルモルホリンの溶液、及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸（ホスホロジアミダイト剤に対して１当量のＮ－メチルモルホリン）を滴下した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、撹拌をさらに１０分間続けた。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを用いたさらなる精製によって、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－２９Ｄ－前駆体が得られた。

【0303】

実施例２ｃ：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８－前駆体の合成

【0304】

【化46】

【0305】

２ｃＡ．フェノール２の合成

【0306】

フェノール２の合成は、上記のセクション２ａＡ（２ａＡ１－２ａＡ６）で説明した。

【0307】

２ｃＢ．Ｋ－１－７の合成

【0308】

構成要素Ｋ－１－７の合成は、上記のセクション２ａＢ（２ａＡ１－２ａＡ６）で説明した。

【0309】

２ｃＣ．Ｋ－６の合成

【0310】

最後の構成要素Ｋ－６は、チオトシル酸カリウムのクロロヘキサノールへの置換反応によって調製された。

【0311】

【化47】

【0312】

Ｓ－（６－ヒドロキシヘキシル）４－メチルベンゼンスルホノチオエート（Ｋ－６）

【0313】

３－クロロヘキサン－１－オール（５．０ｍＬ、３６．６ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１５０ｍＬ）及びカリウムｐ－トルエンチオスルホネート（ＫＳＴ、１２．４ｇ、５４．９ｍｍｏｌ、１．５当量）中で溶解し、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ、１．３５ｇ、３．６６ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。得られた混合物を８０℃で一晩撹拌した。Ｈ_２Ｏ（５００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ／ヘプタン（８００ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）を加えた。層を分離し、有機層をＨ_２Ｏ（３００ｍＬ）及びブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮してＫ－６（９．０ｇ、３１．２ｍｍｏｌ、８５％）を透明なオイルとして得た。

【0314】

２ｃＤ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８－前駆体の合成の完了

【0315】

フェノール２から開始するＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８の合成の完了をスキーム４に示す。構成要素Ｋ－１－７を、光延条件を用いてフェノール２にカップリングした。硫黄上のフルオレニル保護基を脱保護するためのいくつかの初期試験の後、Ｋ－６の存在下でＫ－１８－１をインサイチュで脱保護して、ジスルフィドＫ－１８－２を形成できることがわかった。

【0316】

【化48】

【0317】

適切なホスホロジアミデート剤を使用したホスホルアミデートの最終的な結合により、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８を簡単に入手できた。酸に不安定なホスホルアミデートへの曝露の前にＥｔ３Ｎで不活性化した後、フラッシュクロマトグラフィーを用いて、この材料が精製された。

【0318】

結論として、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８（２×３５０ｍｇ）は、フェノール２から合理的な全収率で、１１ステップでエストラジオールから調製された。

【0319】

２ｃＤ１．２－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－（３－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル）チオ）－３－メチルブトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－１７－イル）オキシ）－Ｎ－（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（Ｋ－１８－１）

【0320】

ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のフェノール２（１．４７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、アルコールＫ－１－７（１．４８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．９１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．６ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した。濃縮後、混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃ及び１％Ｅｔ３Ｎ）を用いてさらに精製し、Ｋ－１８－１（１．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を透明なオイルとして収率６７％で得た。

【0321】

２ｃＤ２．６－（（４－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキサン－１－オール（Ｋ－１８－２）

【0322】

ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の化合物Ｋ－１８－１（４００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及びトシレートＫ－６（３８８ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ（０．９ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）中の２Ｍ ＮａＯＭｅで処理した。混合物を室温で１６時間撹拌した。濁った懸濁液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中３０％～４０％ＥｔＯＡｃ＋１％Ｅｔ３Ｎ）を用いたさらなる精製によって、化合物Ｋ－１８－２（２２０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を無色のオイルとして収率５９％で得た。

【0323】

２ｃＤ３．２－シアノエチル（６－（（４－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８－前駆体）

【0324】

ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の化合物Ｋ－１８－２（６５６ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．３１ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を加えた後、０．５ＭのＮ－メチルモルホリンの溶液及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸（２．１ｍＬ、ホスホロジアミダイト剤に対して１当量のＮ－メチルモルホリン）を滴下した。黄色がかった溶液を室温で２時間撹拌した後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチし、撹拌をさらに１０分間続けた。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中３０％ＥｔＯＡｃ及び１％Ｅｔ３Ｎ）を用いたさらなる精製によって、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８－前駆体（４８０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を透明なオイルとして収率５９％で得た。また、出発物質Ｋ－１８－２（１９３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）が２９％の収率で回収された。

【0325】

実施例２ｄ：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３－前駆体の合成

【0326】

【化49】

【0327】

２ｄＡ．フェノール１の合成

【0328】

フェノール１の合成は、上記のセクション２ｂＡ（２ｂＡ１－２ｂＡ５）で説明した。

【0329】

２ｄＢ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３－前駆体の合成の完了

【0330】

フェノール１は、光延反応条件を使用してＢｏｃ保護されたメチルアミノエタノールにカップリングされ、中程度の収率（４３％）で化合物Ｋ－１３－１が得られた。トルフルオロアセト酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基を除去すると、ＴＦＡ塩としてＫ－１３－２が得られ、それを、還元剤としてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを使用したＫ－５によるその後の還元的アミノ化に使用した。純粋な生成物の収率は、チオールからアミンへの酢酸塩の移動に起因してやや低く、基質の一部がブロックされて所望の生成物とさらに反応する。

【0331】

メタノール中のナトリウムメトキシドをＫ－１３－３及びＫ－６の溶液に加え、Ｋ－１３－３から酢酸塩を除去し、得られたチオールをＫ－６と反応させて所望の硫黄橋を形成した。化合物Ｋ－１３－４を適切なホスホロアミダイト剤と反応させて、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３－前駆体を得た。酸に不安定なホスホロアミダイト生成物の精製は、Ｅｔ３Ｎで前処理したシリカを用いたフラッシュクロマトグラフィーを使用して行った。

【0332】

結論として、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３－前駆体（６２２ｍｇ）は、フェノール１から５ステップで調製された。フェノール１は、エストラジオールから５つの合成ステップによって４５％の全収率で調製された。

【0333】

【化50】

【0334】

２ｄＢ１．ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）カルバメート（Ｋ－１３－１）

【0335】

ＴＨＦ（６００ｍＬ）中のフェノール１（２３．４ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（２６ｇ、１００ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）カルバメート（９．８ｇ、６１ｍｍｏｌ）、及び滴状ＤＩＡＤ（１２ｍＬ、６１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した。黄色がかった溶液を部分的に濃縮し、ヘプタンを加え、溶液をさらに濃縮してすべてのＴＨＦを除去した。得られた沈殿物を濾別し、濾液を濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中５％～７％の勾配のＥｔＯＡｃ）を使用したさらなる精製により、化合物Ｋ－１３－１（１３．０５ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）を黄色がかったオイルとして収率４３％で得た。

【0336】

２ｄＢ２．Ｓ－（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）エタンチオエート（Ｋ－１３－３）

【0337】

化合物Ｋ－１３－１（１３．０５ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）の溶液をジクロロメタン（６５ｍＬ）中で溶解し、トリフルオロ酢酸（４０ｍＬ）を加えた。混合物を２時間撹拌した後、泡立ちは停止した。混合物を濃縮し、そのまま使用した。残渣を１、２－ジクロロエタン（４００ｍＬ）中で溶解し、酢酸（５ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）、アルデヒドＫ－５（６ｇ、３７ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌を続けた。次に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１６ｇ、７５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を１Ｍ ＮａＯＨ及びブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。さらなる精製によって、化合物Ｋ－１３－３（３．０ｇ、４ｍｍｏｌ）が、透明な黄色がかったオイルとして２２％の収率で得られた。

【0338】

２ｄＢ３．Ｓ－（６－ヒドロキシヘキシル）４－メチルベンゼンスルホノチオエート（Ｋ－６）

【0339】

３－クロロヘキサン－１－オール（５．０ｍＬ、３６．６当量）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）中で溶解し、ＫＳＴ（１２．４ｇ、５４．９ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＴＢＡＩ（１．３５ｇ、３．６６ｍｍｏｌ、０．１当量）を加えた。得られた混合物を８０℃で一晩撹拌した。Ｈ_２Ｏ（５００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ／ヘプタン（８００ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）を加えた。層を分離し、有機層をＨ_２Ｏ（３００ｍＬ）及びブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮してＫ－６（９．０ｇ、３１．２ｍｍｏｌ、８５％）を透明なオイルとして得た。

【0340】

２ｄＢ４．６－（（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキサン－１－オール（Ｋ－１３－４）

【0341】

ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の化合物Ｋ－１３－３（１ｇ、１．３４ｍｍｏｌ）及びトシレートＫ－６（７７０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ（２ｍＬ、４ｍｍｏｌ）中の２Ｍ ＮａＯＭｅで処理した。混合物を室温で１６時間撹拌した。濁った懸濁液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中３０％ＥｔＯＡｃ＋１％Ｅｔ３Ｎ）を使用したさらなる精製により、化合物Ｋ－１３－４（６５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を無色のオイルとして５８％の収率で得た。

【0342】

２ｄＢ５．２－シアノエチル（６－（（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３－前駆体）

【0343】

ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の化合物Ｋ－１３－４（６５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）の溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ´－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．３ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を加え、０．５ＭのＮ－メチルモルホリン溶液、及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸を滴下した（２ｍＬ、ホスホロアミダイト剤に対して１当量のＮ－メチルモルホリン）。黄色がかった溶液を室温で２時間撹拌した。次に、反応混合物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチし、撹拌をさらに１０分間続けた。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中３０％ＥｔＯＡｃ及び１％Ｅｔ３Ｎ）を使用してさらに精製することによって、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３（６２２ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）が透明なオイルとして収率７８％で得られた。

【0344】

実施例２ｅ：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０－前駆体の合成

【0345】

０．５ＭのＮ－メチルモルホリンの溶液、及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸を滴下した

【化51】

【0346】

２ｅＡ．フェノール２の合成

【0347】

フェノール２の合成については、上記のセクション２ａＡ（２ａＡ１－２ａＡ６）で説明した。

【0348】

２ｅＢ．Ｋ－１－７の合成

【0349】

構成要素Ｋ－１－７の合成については、上記のセクション２ａＢ（２ａＡ１－２ａＡ６）で説明した。

【0350】

２ｅＣ．Ｋ－４０－２の合成

【0351】

【化52】

【0352】

２ｅＣ１．２－（６－クロロヘキシル）マロン酸ジエチル（Ｋ－４０－５）

【0353】

ＤＭＦ（３００ｍＬ）中のＮａＨ（２．６ｇ、６６ｍｍｏｌ、１当量）の氷冷懸濁液に、マロン酸ジエチル（２０ｍＬ、１３１ｍｍｏｌ、２当量）を滴下した。添加が完了した後、氷浴を取り除き、混合物を室温まで温めながら１時間撹拌した。混合物は透明な溶液になった。混合物を０℃に冷却し、１－ブロモ－６－クロロヘキサン（９．８ｍＬ、６６ｍｍｏｌ、１当量）を滴下した。得られた混合物を０℃で１時間、室温でさらに３時間撹拌した。濃ＨＣｌ（３ｍＬ）及びＨ_２Ｏ（５００ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、３ｘ４００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中５％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製して、Ｋ－４０－５（９．７ｇ、３５ｍｍｏｌ、５３％）を透明なオイルとして得た。

【0354】

２ｅＣ２．２－（６－クロロヘキシル）プロパン－１、３－ジオール（Ｋ－４０－６）

【0355】

Ｅｔ_２Ｏ（２５０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ_４（２．６ｇ、７０ｍｍｏｌ）の氷冷した懸濁液に、温度を１０℃未満に保ちながら、Ｋ－４０－５（９．７ｇ、３５ｍｍｏｌ）の溶液を３０分かけて滴下した。添加が完了した後、反応混合物を０℃で２時間撹拌した。反応物を、Ｈ_２Ｏ（５ｍＬ）、ＮａＯＨ（水溶液、３０％、２．５ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（１２ｍＬ）の順に反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌した後、不溶性の白色沈殿物が形成された。沈殿物を濾別し、濾液を濃縮して、Ｋ－４０－６（６．１ｇ、３１ｍｍｏｌ、９０％）を無色のオイルとして得た。

【0356】

２ｅＣ３．Ｓ－（８－ヒドロキシ－７－（ヒドロキシメチル）オクチル）４－メチルベンゼンスルホノチオエート（Ｋ－４０－２）

【0357】

塩化物Ｋ－４０－６（６．１ｇ、３１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２００ｍＬ）中で溶解し、チオトシル酸カリウム（１０．７ｇ、４７ｍｍｏｌ、２当量）及びＴＢＡＩ（１．２ｇ、３．１ｍｍｏｌ、０．１当量）を加えた。得られた混合物を８０℃で２４時間撹拌した後、真空中で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（７：３ ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）を使用して粗物質を精製して、主に生成物を含む１つの画分（５．６ ｇ）と、生成物及び出発物質の両方を含む第２の画分（３．３ｇ）とを得た。後者の画分をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解し、チオトシル酸カリウム（４．５ｇ、２０ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＩ（０．３７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８０℃で２４時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（３５０ｍＬ）及びヘプタン（３５０ｍＬ）を加えた。有機物をＨ_２Ｏ（５００ｍＬ）及びブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。粗物質を最初のカラムからの生成物含有画分と組み合わせ、粗物質をカラムクロマトグラフィー（７：３ ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）を用いて精製し、Ｋ－４０－２（８．２ｇ、２４ｍｍｏｌ、７５％）をピンクがかったオイルとして得た。

【0358】

２ｅＤ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０－前駆体の合成の完了

【0359】

フェノール２と構成要素Ｋ－１－７とを光延条件下で結合させて、保護されたチオールＫ－４０－１を得た。フルオレニル基は、Ｋ－４０－２の存在下でＮａＯＭｅによってインサイチュで除去し、ジスルフィドＫ－４０－３を得た。最後に、ＤＭＴ保護基とホスホロアミダイト基とを結合させて、最終化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０－前駆体を得た。

【0360】

【化53】

【0361】

２ｅＤ１．２－（（（１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－３－（３－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル）チオ）－３－メチルブトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル）オキシ）－Ｎ－（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（Ｋ－４０－１）

【0362】

ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のフェノール２（１．４７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、アルコールＫ－１－７（１．４８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．９１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．６ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した。濃縮後、混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃ及び１％Ｅｔ_３Ｎ）を使用してさらに精製し、Ｋ－４０－１（１．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を透明なオイルとして収率６７％で得た。

【0363】

２ｅＤ２．２－（６－（（４－（（（１３Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）プロパン－１、３－ジオール（Ｋ－４０－３）

【0364】

ジクロロメタン中の化合物Ｋ－４０－１（１当量）及びトシレートＫ－４０－２（１．５当量）の溶液をＭｅＯＨ中の２Ｍ ＮａＯＭｅ（４当量）で処理した。混合物を室温で１６時間撹拌した。濁った懸濁液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュを用いたさらなる精製によって、化合物Ｋ－４０－３を得た。

【0365】

２ｅＤ３．２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－８－（（４－（（（１３Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）オクタン－１－オール（Ｋ－４０－４）

【0366】

ピリジン中のＫ－４０－３（１当量）の溶液に、ＤＭＴ－Ｃｌ（２当量）及びＤＭＡＰ（０．１当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した後、混合物を濃縮した。カラムクロマトグラフィーを用いて残渣を精製して、化合物Ｋ－４０－４を得た。

【0367】

２ｅＤ４．２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－８－（（４－（（（１３Ｓ、１７Ｓ）－１７－（２－（（２－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）エトキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）オクチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ４０－前駆体）

【0368】

ジクロロメタン中の化合物Ｋ－４０－４（１当量）の溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３当量）を加えた後、０．５ＭのＮ－メチルモルホリン溶液、及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸を滴下した（ホスホロジアミダイト剤に対して１．３当量のＮ－メチルモルホリン）。得られた混合物を室温で２時間撹拌した後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチし、撹拌をさらに１０分間続けた。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを使用したさらなる精製によって、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４０－前駆体を得た。

【0369】

実施例２ｆ：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３－前駆体の合成

【0370】

【化54】

【0371】

２ｆＡ．フェノール１の合成

【0372】

フェノール１の合成については、上記のセクション２ａＡ（２ａＡ１－２ａＡ６）で説明した。

【0373】

２ｆＢ．構成要素Ｋ－４３－４の合成

【0374】

【化55】

【0375】

ジエチルマロネートを水素化ナトリウム及びブロモクロロヘキサンと反応させて、アルキル化生成物Ｋ－４３－７を得た。水素化アルミニウムリチウムで処理すると、ジエステルがジオールＫ－４３－８に還元された。化合物Ｋ－４３－８をチオトシル酸カリウムと反応させて、所望の構成要素Ｋ－４３－４を得た。

【0376】

２ｆＢ１．２－（６－クロロヘキシル）マロン酸ジエチル（Ｋ－４３－７）

【0377】

ＤＭＦ（３００ｍＬ）中のＮａＨ（２．６ｇ、６６ｍｍｏｌ、１当量）の氷冷懸濁液に、マロン酸ジエチル（２０ｍＬ、１３１ｍｍｏｌ、２当量）を滴下した。得られた混合物を室温まで温めながら１時間撹拌した。混合物を０℃に冷却し、１、６－ブロモクロロヘキサン（９．８ｍＬ、６６ｍｍｏｌ、１当量）を徐々に加えた。得られた混合物を０℃で１時間、室温で３時間撹拌した。ＨＣｌ（２Ｍ、３ｍＬ）で反応をクエンチし、水（５００ｍＬ）を加えた。混合物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、３×４００ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン中５％ＥｔＯＡｃ）によるさらなる精製によって、化合物Ｋ－４３－７（９．７ｇ、３４．８ｍｍｏｌ、５３％）を透明なオイルとして得た。

【0378】

２ｆＢ２．２－（６－クロロヘキシル）プロパン－１、３－ジオール（Ｋ－４３－８）

【0379】

ジエチルエーテル（２００ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（２．６ｇ、７０ｍｍｏｌ、２当量）の氷冷懸濁液に、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）中のＫ－４３－７（９．７ｇ、３５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、混合物の温度を１０°Ｃ未満に保ちながら、徐々に加えた。得られた混合物を０℃で２時間撹拌した後、水（５ｍＬ）、ＮａＯＨ（３０％水溶液、２．５ｍＬ）、及び水（１２ｍＬ）をこの順序で添加することによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌した後、形成された固体を濾別した。濾液を真空中で濃縮して、化合物Ｋ－４３－８（６．１ｇ、３１ｍｍｏｌ、９０％）を無色のオイルとして得た。

【0380】

２ｆＢ３．Ｓ－（８－ヒドロキシ－７－（ヒドロキシメチル）オクチル）４－メチルベンゼンスルホノチオエート（Ｋ－４３－４）

【0381】

ＤＭＦ（２００ｍＬ）中のＫ－４３－８（６．１ｇ、３１ｍｍｏｌ）の溶液に、チオトシル酸カリウム（１１ｇ、４７ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＴＢＡＩ（１．２ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８０℃で一晩撹拌した後、混合物を濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製によって、Ｋ－４３－４（５．６ｇ、１６ｍｍｏｌ、５２％）をピンクがかったオイルとして得た。

【0382】

２ｆＣ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３－前駆体の合成の完了

【0383】

フェノール１を、光延反応条件を用いて、Ｂｏｃ保護されたメチルアミノエタノールにカップリングし、中程度の収率（４３％）で化合物Ｋ－１３－１を生成した。ＴＦＡを用いたＢｏｃ基の除去により、ＴＦＡ塩としてＫ－１３－２が得られ、それを、還元剤としてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを使用したＫ－５によるその後の還元的アミノ化に使用した。

【0384】

【化56】

【0385】

メタノール中のナトリウムメトキシドをＫ－４３－３及びＫ－４３－４の溶液に加え、Ｋ－４３－３から酢酸塩を除去し、得られたチオールをＫ－４３－４と反応させて、所望の硫黄橋を形成した。化合物Ｋ－４３－５をＤＭＴ－Ｃｌと反応させて、モノ保護ジオールＫ－４３－６を得た。適切なホスホロアミダイト剤との反応によって、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３前駆体（１．６ｇ）が得られた。酸に不安定なホスホロアミダイト生成物の精製は、Ｅｔ_３Ｎで前処理されたシリカを用いたフラッシュクロマトグラフィーを使用して行った。

【0386】

２ｆＣ１．ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）カルバメート（Ｋ－４３－１）

【0387】

ＴＨＦ（６００ｍＬ）中のフェノール１（２３．４ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（２６ｇ、１００ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）カルバメート（９．８ｇ、６１ｍｍｏｌ）、及び滴状ＤＩＡＤ（１２ｍＬ、６１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌した。黄色がかった溶液を部分的に濃縮し、ヘプタンを加え、溶液をさらに濃縮してＴＨＦをすべて除去した。得られた沈殿物を濾別し、濾液を濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の勾配５％～７％のＥｔＯＡｃ）を使用したさらなる精製によって、化合物Ｋ－４３－１（１３．０５ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）を黄色がかったオイルとして収率４３％で得た。

【0388】

２ｆＣ２．ＳＳ－（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）エタンチオエート（Ｋ－４３－３）

【0389】

化合物Ｋ－４３－１（１３．０５ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）の溶液をジクロロメタン（６５ｍＬ）中で溶解し、トリフルオロ酢酸（４０ｍＬ）を加えた。混合物を２時間撹拌した後、泡立ちが止まった。混合物を濃縮し、そのまま使用した。残渣を１、２－ジクロロエタン（４００ｍＬ）中で溶解し、酢酸（５ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）、アルデヒドＫ－５（６ｇ、３７ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌を続けた。次に、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１６ｇ、７５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を１Ｍ ＮａＯＨ及びブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。さらなる精製により、化合物Ｋ－４３－３（３．０ｇ、４ｍｍｏｌ）を透明な黄色がかったオイルとして２２％の収率で得た。

【0390】

２ｆＣ３．２－（６－（（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）ヘキシル）プロパン－１、３－ジオール（Ｋ－４３－５）

【0391】

メタノール（１００ｍＬ）中の化合物Ｋ－４３－３（２．２ｇ、２．９ｍｍｏｌ）及びトシレートＫ－４３－４（１．５ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ（１．６ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）中の５．４Ｍ ＮａＯＭｅで処理した。混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ_３及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中２０－３０％アセトン＋１％Ｅｔ_３Ｎ）を用いてさらに精製することによって、化合物Ｋ－４３－５（１．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を無色のオイルとして５０％の収率で得た。

【0392】

２ｆＣ４．２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－８－（（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）オクタン－１－オール（Ｋ－４３－６）

【0393】

Ｋ－４３－５（１．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．２ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ、１当量）及びＤＭＡＰ（１７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、０．１当量）を加えた。得られた混合物にＤＭＴ－Ｃｌ（０．４９ｇ、１．５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。得られたオレンジ色の混合物を室温で一晩攪拌すると、黄色に変わった。メタノール（３０ｍＬ）を加え、混合物を１時間攪拌した後、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン中２０％アセトン及び１％Ｅｔ_３Ｎ）による精製によって、化合物Ｋ－４３－６（１．５ｇ、１．３ｍｍｏｌ、８６％）を黄色のオイルとして得た。

【0394】

２ｆＣ５．２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－８－（（４－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナンスレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）－２－メチルブタン－２－イル）ジスルファニル）オクチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３－前駆体）

【0395】

ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の化合物Ｋ－４３－６（１．５ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ´－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．５１ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ、１．３当量）と、０．５ＭのＮ－メチルモルホリン溶液及びジクロロメタン中の０．２５Ｍトリフルオロ酢酸（３．３ｍＬ、ホスホロアミダイト剤に対して１当量のＮ－メチルモルホリン）とを加えた。黄色がかった溶液を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘプタン中２０％アセトン及び１％Ｅｔ３Ｎ）は不完全な変換を示したので、追加の０．５当量の２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ´－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。次に、反応混合物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液でクエンチした。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の１０％アセトン及び１％Ｅｔ_３Ｎ）を用いたさらなる精製によって、化合物Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３－前駆体（１．６ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、わずかに黄色のオイルとして９１％の収率で得た。

【0396】

実施例２ｇ：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－前駆体の合成。化学式（ＰＰ－３）

【0397】

【化57】

【0398】

Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－前駆体の構造は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３－前駆体の構造と非常に類似しているが、唯一の違いは６炭素原子の断片、直鎖炭化水素である。したがって、合成は、実施例２ｆに記載されているＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３－前駆体の合成と非常に類似している。

【0399】

２ｇＡ．フェノール１の合成

【0400】

フェノール１の合成については、上記のセクション２ａＡ（２ａＡ１－２ａＡ６）で説明した。

【0401】

２ｇＢ．構成要素Ｋ－４３－４の合成

【0402】

構成要素Ｋ－４３－４の合成については、上記のセクション２ｆＢ（２ｆＢ１－２ｆＢ３）で説明した。

【0403】

２ｇＣ．直鎖炭化水素断片：１、６－ジブロモヘキサンは市販されている。

【0404】

２ｇＤ．Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－６３－前駆体の合成の完了。化学式（ＰＰ－３）

【0405】

【化58】

【0406】

実施例３：オリゴヌクレオチド鎖内の内部位置での本発明のＥ部分の結合モード

【0407】

化学式（Ｖａ´Ｐ）に示される構造を有するＥ部分の前駆体を例示する。最初に、Ｅ部分は保護された形態で、デオキシリボース部分の３´－位置及び５´－位置に４、４´－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びホスホルアミダイト基をそれぞれ有している。

【0408】

【化59】

【0409】

オリゴヌクレオチド鎖内の統合は、通常のオリゴヌクレオチド合成における任意のヌクレオシド構成要素の組み込みと同様に実行され、図２に記載されているように、結果として生じる配置をもたらす。

【0410】

実施例４：カーゴ薬物（例えばｓｉＲＮＡ）を放出するための、細胞質内のＥ部分の酸化還元媒介の脱離及び除去

【0411】

上記のように、少なくとも１つのＥ、Ｅ´またはＥ´´部分は、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡコンジュゲートの膜貫通に必要であるが、コンジュゲートが細胞質に到達すると、これらの部分を除去し、体から排出することが望ましい。カーゴ薬物がｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡである場合、この切断はｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡと遺伝子サイレンシングタンパク質複合体（Ｄｉｃｅｒ及びＲＩＳＣ）との相互作用における立体的な問題を回避するために有益である。加えて、Ｅ部分からのカーゴ薬物のこのような分離は、細胞リン脂質膜上のコンジュゲートの負担を最小化し、これは安全性の観点から有利である。この目的のために、本発明のＥ部分はジスルフィド部分を含む。細胞外環境に広く見られるような酸化条件下では、ジスルフィドは安定しているので、インビボでの全身投与時に、コンジュゲートが体内に分布し、細胞のリン脂質膜を通過して細胞に到達する。対照的に、細胞質は高度に還元された環境であり、主に、任意の生細胞の細胞質内で連続的に生成される還元グルタチオンが高濃度であるので、細胞質と細胞外空間との間は約４桁の濃度勾配に達する。細胞質内のこれらの顕著な還元条件に起因して、Ｅ部分のジスルフィド基は、細胞質環境において安定した還元を受ける。その結果、細胞質内の標的部位（たとえば、遺伝子サイレンシングのためのダイサーまたはＲＩＳＣタンパク質複合体）で薬理作用を発揮するために、カーゴ薬物（例えば、ｄｓｉＲＮＡ）が放出される。同時に、本発明のＥ部分は、他のステロールベースの分子（例えば、エストロゲン）と同様に、直接または代謝後（例えば、肝臓内のシトクロムＰ－４５０－媒介ヒドロキシル化）のいずれかに、胆汁及び／または尿を介して体から排出される。このレドックス媒介切断は、図２、図３、及び図４に例示されている。図は、化学式（Ｖａ´）、化学式（Ｖｃ´）、または化学式（Ｖｃ´´）によるＥ部分を含むＲＮＡ二本鎖を示している。コンジュゲートは酸化的条件においてインタクトであるが、細胞外空間に存在するもの（図２Ａ）のように、その特徴的な還元条件に起因して細胞質に侵入すると、ジスルフィド結合が切断され（図３、４）、細胞質の標的部位（例えば、ＲＩＳＣ）で薬理活性を発揮するためにカーゴ薬物が放出されるが、Ｅ部分は他のステロールベースの化合物と同様に体から排出される。スルフヒドリル基のｇｅｍ－ジメチル部分によってもたらされる立体障害は、酸化されたジスルフィド形態で血液に安定性を与え、切断後の遊離スルフヒドリル形態を安定化するようにさらに作用する。

【0412】

実施例５：本発明のコンジュゲートの構造の例

【0413】

化学式（Ｃｎ－１４）によるコンジュゲートを例示する。コンジュゲートは、ＲＮＡ二本鎖の５´末端、及びオリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置にある、化学式（Ｖｃ´´´）による、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´部分へのＤ（ｄｓｉＲＮＡ）の結合を含む。

【0414】

【化60】

【0415】

この例では、Ｒはリン酸基であるが、Ｒ´は水素である。示されているように、ダイサー基質ＲＮＡ二本鎖（ｄｓｉＲＮＡ）のパッセンジャー（センス）鎖の５´末端にあるリン酸基は、ダイサーのＲＮＡ結合部位の正電荷ポケットと相互作用し、その活性と、この酵素によって媒介される、結果として生じる全体的な遺伝子サイレンシングとを促進する（実施例７を参照）。

【0416】

実施例６：無血清（Ｓ－）条件、及び血漿タンパク質の存在（（Ｓ＋）条件）における本発明のコンジュゲートのパフォーマンス

【0417】

目的：この実施例は、ＯＤなどの高分子薬物に結合した化学式（ＩＩ）による重要な化学的部分を含むコンジュゲートが、リン脂質膜を介して細胞に送達され、（Ｓ－）条件及び（Ｓ＋）条件の両方において、遺伝子サイレンシングをそれぞれ行うことができることの実証を目的としている。対照的に、構造が化学式（ＩＩ）にしたがっていない類似の化合物は、膜貫通送達において完全に不活性であるか、無血清条件でのみ遺伝子サイレンシングを誘導する必要がある。

【0418】

方法

【0419】

Ｅ部分：本発明のＥ、Ｅ´またはＥ´´部分：化学式（Ｖｂ´）によるＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８、及び化学式（Ｖｂ´´）によるＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３、化学式（ＩＩ）に記載されているすべての構造的特徴に準拠する。その構造は以下の通りである。

【0420】

【化61】

【0421】

【化62】

【0422】

各Ｅ部分は、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の５´末端に結合していた。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３を、前述の実施例にしたがって合成した。さらに、以下の構造的に関連する部分（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗ、及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇ）がコントロールとして機能し、それらはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３と実質的な構造的類似性を共有しているにもかかわらず、これらの部分は、以下のように、化学式（ＩＩ）のすべての構造的特徴に完全には準拠していない。（ｉ）Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９ではＵ及びＱの両方がヌルではないが、化学式（ＩＩ）はＵまたはＱのいずれかがヌルであることを意味する。（ｉｉ）Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗは、化学式（ＩＩ）の不可欠な部分であるジスルフィド部分を含まない。（ｉｉｉ）Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｇでは、Ｕ及びＱの両方がヌルであるが、化学式（ＩＩ）はＱまたはＵのいずれかがヌル以外であることを意味する。

【0423】

【化63】

【0424】

【化64】

【0425】

【化65】

【0426】

コンジュゲート：１つの２５ヌクレオチド長鎖と１つの２７ヌクレオチド長鎖とでそれぞれ構成されるＲＮＡ二本鎖を、ＥＧＦＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子の発現をサイレンシングすることを目的としたダイサー基質（ｄｓｉＲＮＡ）として設計した。オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりであった。

【0427】

アンチセンス鎖配列

【0428】

５´－Ｅ－ＣＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ－３´（配列番号１）

【0429】

センスＲＮＡ配列

【0430】

５´－Ｅ－ＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧ－３´（配列番号２）

【0431】

Ｅは、本発明のＥ、Ｅ´若しくはＥ´´、またはそれぞれのコントロールを意味する。ｒ＝リボース及びｍ（例えばｍＧ）＝リボース部分の２´－ヒドロキシルでのメチル化。各二本鎖は、本発明のＥ部分（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３）、またはそれぞれの制御部分（Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗ、またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇ）のいずれかである２つの同一のＥ部分に結合していた。

【0432】

したがって、まとめて５つのコンジュゲートが合成され、それぞれがＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするためのｄｓｉＲＮＡを含み、それぞれが２つのＥ部分に結合していた。２つは、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８部分のいずれかを含む本発明のコンジュゲートであるが、３つのコンジュゲートはコントロールコンジュゲートであり、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖はＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇ、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９、またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｗ部分のいずれかに結合していた。各コンジュゲートに、そのＥ部分に応じて名前を付けた。

【0433】

細胞培養

【0434】

ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞株は、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル）、及びブラストサイジン１０μｇ／ｍｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。５％ＣＯ_２加湿空気で、３７°Ｃのインキュベーターで細胞を維持した。

【0435】

トランスフェクションの１日前に、細胞を２４ウェルのガラス底のブラックプレートに播種した（４０，０００細胞／ウェル）。翌日、１０％胎児ウシ血清［ＦＢＳ、血清（＋）条件］の存在下で、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８コンジュゲート若しくはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３コンジュゲート（本発明のコンジュゲート）、またはそれぞれのコントロールと共に細胞をインキュベートした。無血清条件でのインキュベーションのために、培地を吸引し、細胞をハンクスの平衡塩液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、培地を無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に交換した。２４時間後、培地を１０％ＦＣＳ培地に交換した。すべての細胞のインキュベーション期間は７２時間であった。４０～３００ｎＭの用量の範囲で、様々な濃度のコンジュゲートを評価した。

【0436】

遺伝子発現のダウンレギュレーション

【0437】

遺伝子発現のダウンレギュレーションを、トランスフェクションの７２時間後に測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。タンパク質発現を、ＥＧＦＰ蛍光の強度測定によって測定し、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００－Ｐｒｏマルチモードリーダー（Ｔｅｃａｎ社）；励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍによって定量化した。実験を３回繰り返して行い、ＥＧＦＰ蛍光の結果を未処理細胞（すなわち、コンジュゲートで処理していない）の蛍光強度と比較した。結果を、コントロールと比較した蛍光強度の割合として表示した。群間差の有意性は、ｐ＜０．０５を有意と定義して、両側ｔ検定によって評価した。

【0438】

結果

【0439】

本発明のコンジュゲート：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３、及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８

【0440】

無血清条件：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８の両方のコンジュゲートは、細胞による強力な取り込みと、それぞれの効果的な遺伝子サイレンシングとを示した。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３コンジュゲートは、４０ｎＭのコンジュゲートで７５．５＋２．０％のサイレンシングを示した（平均＋標準偏差）。サイレンシングは、１５０ｎＭのコンジュゲートで８６．６＋０．５％に増加した。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８コンジュゲートは、４０ｎＭのコンジュゲートで６８．４＋０．５％（平均＋標準偏差）、１５０ｎＭのコンジュゲートで８４．７＋０．２％サイレンシングに増加した、同様のサイレンシング効果を示した（ｐ＜０．００１、コントロール、すなわち未処理細胞と比較したｔ検定）。

【0441】

血清の存在下：血清の存在下では、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３とＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８の両方のコンジュゲートが有意な遺伝子サイレンシングを提供した。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３コンジュゲートは、３００ｎＭで１５．５＋３．２％、６００ｎＭで４４＋１．５％に増加する遺伝子サイレンシングをもたらしたが、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８コンジュゲートは、３００ｎＭで６５．４＋０．６％の遺伝子サイレンシングをもたらした（平均＋標準偏差）；（コントロール、すなわち未処理細胞と比較、ｐ＜０．００１、ｔ検定）。

【0442】

対照コンジュゲート：Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｇ、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗ

【0443】

無血清条件：無血清条件では、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｇコンジュゲートは細胞による強力な取り込みと、それぞれの効果的な遺伝子サイレンシングとを示した。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｇコンジュゲートは、４０ｎＭで４０．７±２．２％（平均＋標準偏差）、１５０ｎＭで７０．９±１．１％に増加したサイレンシングを示した。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９は、１５０ｎＭで３７．７＋０．８％（平均＋標準偏差）の遺伝子サイレンシングを示した（コントロール、すなわち未処理細胞と比較してｐ＜０．００１）。

【0444】

血清の存在下：コントロールコンジュゲートＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇ、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９、及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｗはいずれも、本発明のコンジュゲートと構造的に類似しているにもかかわらず、血清の存在下で遺伝子サイレンシングを示さなかった。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗコンジュゲートは、無血清条件下でも遺伝子サイレンシングを示さなかった。

【0445】

結果の要約

【0446】

Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８の両方のコンジュゲートは、インビトロで細胞とインキュベートすると、強力な取り込みと、遺伝子サイレンシングとを示した。両方のコンジュゲートによって発揮される遺伝子サイレンシング活性は、培地中の血漿タンパク質の存在下または非存在下のいずれか、すなわち、（Ｓ＋）条件下と（Ｓ－）条件下との両方でそれぞれ明らかであった。

【0447】

本発明のコンジュゲートのこの性能は、コントロールコンジュゲートのパフォーマンスとは明確に対照的であった。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｇ及びＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９コンジュゲートは無血清（Ｓ－）条件下での遺伝子サイレンシングでアクティブであったが、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｗコンジュゲートはアクティブではなかった。コントロールコンジュゲートはいずれも、血漿タンパク質の存在下（（Ｓ＋）条件）での遺伝子サイレンシングにおいてアクティブではなかった。

【0448】

議論

【0449】

この実施例に示されるように、化学式（ＩＩ）に示される構造を有する本発明の重要な化学的部分は、実際に、細胞膜を介した細胞への送達、及び生物学的効果の誘導、すなわちサイレンシングにおいて、関連するコンジュゲートの強力なパフォーマンスを必要とする。このパフォーマンスは、（Ｓ－）条件下と（Ｓ＋）条件下との両方で観察された。重要なことに、本発明のコンジュゲート及びコントロールコンジュゲートのパネルは、化学式（ＩＩ）による本発明の重要な化学的部分に関する重要な構造／機能の観点を提供する：すべてのコンジュゲートのＥ部分、本発明のコンジュゲートとコントロールコンジュゲートとの両方は、ステロール骨格とノナ－フルオロｔｅｒｔ－ブタノール残基とを含む。しかしながら、明らかに、これは無血清条件下でも活性を付与するのに十分ではなかった（例えば、活性を示さなかったコンジュゲートＡｐｏ－Ｓｉ－Ｗの結果に反映されている）。Ｅ部分ごとにジスルフィド基を追加すると、無血清条件下での活性が必要になる（例えば、本発明のコンジュゲートＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３とＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８とのコンジュゲートのパフォーマンス、及び無血清条件下でのコントロールコンジュゲートＡｐｏ－Ｓｉ－Ｇのパフォーマンス）。しかしながら、これは血漿タンパク質の存在下でパフォーマンスを発揮するのに十分ではなかった。

【0450】

対照的に、各Ｅ部分にヌルでないＵまたはＱ部分を１つ追加すると、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３コンジュゲートで観察された効果的な遺伝子サイレンシングによって示されるように、血漿タンパク質の存在下でコンジュゲートの活性が付与された。Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１９によって予期していない観察が行われ、Ｅ部分ごとにＵ及びＱの両方がヌルではない場合、それぞれのコンジュゲートの生物学的パフォーマンスに対して有害であることが示された。

【0451】

まとめると、これらのデータは、化学式（ＩＩ）が、膜貫通送達とその結果としての遺伝子サイレンシングにおけるそれぞれのコンジュゲートの所望のパフォーマンスを累積的かつ相互作用的に必要とする、様々な決定遺伝子間の、ユニークであり、新しく、かつ予測不可能な均衡を実際に表すという理解を支持している。

【0452】

実施例７：本発明のダイサー基板の性能に対する５´－リン酸塩のプラスの影響

【0453】

目的：化学式Ｃｎ－１、Ｃｎ－２、Ｃｎ－３、Ｃｎ－４、Ｃｎ－６、Ｃｎ－７、Ｃｎ－８、またはＣｎ－９のいずれかに記載されている構造を有するダイサー基板は、パッセンジャー（センス）ＲＮＡ鎖の５´末端に、リン酸、硫酸、またはカルボキシル基も含み、ダイサー酵素のＲＮＡアンカー部位に存在する、正に帯電したアミノ酸残基が並んだ結合ポケットと相互作用する。実験は、そのような負に帯電した部分によって発揮される、本発明のダイサー基質のパフォーマンスに対する有益な影響を実証するために実施した。

【0454】

方法：実験では、それぞれが、実施例６に記載されているように、ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制する特定の配列を有している２つのダイサー基質を使用した。ｄｓｉＲＮＡの１つはさらに、パッセンジャー（センス）鎖の５´末端に結合したリン酸基を有していたが［（Ｐ＋）ｄｓｉＲＮＡで示す］、他のｄｓｉＲＮＡは、パッセンジャー（センス）鎖の５´末端は、末端ヌクレオチドの５´－ヒドロキシルであった［（Ｐ－）ｄｓｉＲＮＡで示す］。Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手したＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル）及びブラストサイジン１０μｇ／ｍｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を、５％ＣＯ_２加湿空気で、３７°Ｃのインキュベーターで維持した。トランスフェクションの１日前、完全培地を含む２４ウェルのブラックガラス底プレートに、抗生物質を添加せずに細胞（４０，０００細胞／ウェル）を播種した。翌日、０．１ｎＭ ｄｓｉＲＮＡと１ｕｌのトランスフェクション試薬とを使用して、製造説明書にしたがって、準最適条件下でＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を細胞にトランスフェクトした。次に、細胞をトランスフェクション混合物とともに２４時間インキュベートした後、抗生物質を含まない完全培地を添加した（１ｍｌ／ウェル）。タンパク質のダウンレギュレーションを、トランスフェクションの７２時間後に測定した：この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。ＥＧＦＰ蛍光強度を、４８８ｎｍの励起波長、及び５３５ｎｍの発光波長で、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００－Ｐｒｏマルチモードリーダー（Ｔｅｃａｎ社）によって定量化した。

【0455】

結果：使用した最適ではない低用量（０．１ｎＭ ｄｓｉＲＮＡ）では、（Ｐ－）ｄｓｉＲＮＡはＥＧＦＰレベルを２０＋２％下方制御した（平均＋標準偏差）。対照的に、（Ｐ＋）ｄｓｉＲＮＡは遺伝子発現を６７＋２％抑制した（ｐ＜０．０００１；ｔ検定）。

【0456】

結論：パッセンジャー（センス）鎖の５´末端にリン酸基を含むダイサー基質は、この基を欠いているｄｓｉＲＮＡと比較して、遺伝子サイレンシングにおいて有利な性能を示した。

【0457】

実施例８：ダイサー基質である本発明のコンジュゲートの作用機構

【0458】

図３及び４は、本発明のコンジュゲートの作用機構（ＭＯＡ）を例示している。化学式（Ｃｎ－３）及び（Ｃｎ－９）によるコンジュゲートがそれぞれ例示されており、ＲＮＡ二本鎖は、リン酸基がパッセンジャー鎖の５´末端に結合している２５／２７ヌクレオチド長のダイサー基質である：細胞質に到達すると、著しく還元的な周囲条件に起因して、Ｅ、Ｅ´及びＥ´´部分の切断及び除去が行われ、６炭素の炭化水素鎖に結合したチオール基を含む各Ｅ部分ごとに短い断端（stump）が残る。（図３及び図４ａ）。次に、ＲＮＡ二本鎖は、ダイサーエンドヌクレアーゼと相互作用する。この相互作用は、２ヌクレオチドのオーバーハングから構成されるガイド（アンチセンス）鎖二本鎖の３´末端の、タンパク質の疎水性ポケットへの結合、及びパッセンジャー（センス）鎖のリン酸基の、タンパク室表面の正電荷を有するポケットとの相互作用によって開始される。このアンカーによって、ＲＮＡがタンパク質上に配置され、ＲＮＡ二本鎖の正確な二本鎖切断が可能になり、残りの１つのＥ断端に結合された２１／２１－ヌクレオチドの二重らせんが残る（図３及び図４ｂ）。図３及び図４ｃは、酵素ヘリカーゼ（ＲＮＡ鎖を分離することができる細胞質酵素）によるセンス鎖の除去を示している。この作用により、所望の遺伝子サイレンシングを誘導するために、２番目のＥ残基の断端が除去されて、インタクトのアンチセンス鎖が解放され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入る（図３及び図４ｄ）。

【0459】

実施例９：本発明の化合物を血漿タンパク質とインキュベートすると、アルブミン結合画分及び無アルブミン画分の両方が観察された。

【0460】

目的：本発明の化合物がアルブミンとインキュベートされたときに、アルブミン結合画分及び無アルブミン画分の両方が見られ、したがって血清（＋）条件において観察される活性について潜在的な作用機構を支持するかどうかを評価するために実験を実施した。

【0461】

根拠：本発明のコンジュゲートの主な利点は、血漿タンパク質の非存在下及び存在下の両方で生物学的活性を示す能力である。薬物の血漿タンパク質への結合は、循環中の薬物の半減期の延長や分解からの保護など、さまざまな態様で有利である。しかしながら、アルブミンへの結合親和性が高すぎると、薬物がその標的細胞と相互作用できる可能性が不当に制限される可能性がある。したがって、本発明のコンジュゲートは、アルブミンとの相互作用の際に、血漿タンパク質に結合する画分（アルブミン結合画分）と、細胞外液中に自由に拡散して標的細胞に到達し、相互作用する画分（無アルブミン画分）との両方を有することが望ましい。本実施例は、本発明のコンジュゲートのこれらの特徴を実証するために実施した。

【0462】

方法

【0463】

ゲル電気泳動を使用して、本発明のコンジュゲートがウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にどの程度結合しているかを調べた。遊離画分を検出するために、ＲＮＡサンプルをＴｒｉｓバッファー、ｐＨ＝８で希釈し、ＢＳＡ（１０％）を２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した（レーンＢ）。対照サンプルは水で希釈した（レーンＡ）。

【0464】

各群（ＡまたはＢ）について、レーンを以下の表にしたがって指定した。

【0465】

【表1】

【0466】

すべてのサンプルを２５℃で一晩インキュベートした。次に、すべてのレーンのＲＮＡサンプルを１２％の天然ポリアクリルアミドゲルにロードし（レーンあたり１９ｐｍｏｌ）、５Ｖ／ｃｍの電界で１時間移動させた（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、ｍｉｎｉ－ｐｒｏｔｅａｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、イスラエル所在）。

【0467】

結果

【0468】

図５に示すように、Ｅ部分Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１８を含む本発明のコンジュゲートのインキュベーションにより、２つの画分が生成された：１つはアルブミン結合（矢印＃１）、１つは無アルブミン（矢印＃２）。対照的に、Ａｐｏ－Ｓｉ－ＧのＥ部分を含むコントロールコンジュゲートには画分が１つしかなかった：アルブミン結合画分のみが観察された。

【0469】

結論：これらの発見は、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｋ１８またはＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－１３部分を含む本発明のコンジュゲートが、アルブミンとの接触時に２つの画分：アルブミン結合画分及び無アルブミン画分、を示すことを実証した。血漿タンパク質が存在する場合でも、このコンジュゲートは、自由に拡散して標的細胞と相互作用する非結合画分を示すので、これは、血漿タンパク質の存在下（Ｓ＋）及び非存在下（Ｓ－）の両方で観察される生物学的性能（例えば、遺伝子サイレンシング）を説明することができる。対照的に、Ａｐｏ－Ｓｉ－Ｇコンジュゲートなどのコントロールコンジュゲートは、アルブミンに対して非常に大きな親和性を持っているため、アルブミン結合画分のみを示す。これらのコントロールコンジュゲートは、アルブミンとの相互作用時に、標的細胞との相互作用のために細胞外空間を介した拡散に必要な遊離画分を有していないため、無血清条件においてのみ活性を示す。

【0470】

実施例１０：３つのＥ部分を含む本発明のコンジュゲートは、無血清［（Ｓ－）条件］と血漿タンパク質の存在［（Ｓ＋）条件］との両方で、２つのＥ部分のみを含むコンジュゲートよりも優れている。

【0471】

方法

【0472】

これらの実験で使用されたＥ部分はＡｐｏ－Ｓｉ－Ｋ－４３であり、化学式（Ｖｃ´´）に示されているように、以下の構造を有していた。

【0473】

【化66】

【0474】

前記Ｅ部分を含む２つのコンジュゲートを調べた：１つは２つのＥ部分を含み、１つはオリゴヌクレオチドに結合した３つのＥ部分を含んでいた。各コンジュゲートは、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子の発現をサイレンシングすることを目的とした、１つの２５ヌクレオチド長鎖と１つの２７ヌクレオチド長鎖とを含むダイサーの基質ＲＮＡ二本鎖（ｄｓｉＲＮＡ）を含んでいた。したがって、ＥＧＦＰ遺伝子の発現のサイレンシングは、本発明のＥ部分によって可能にされた、インビトロでの膜貫通送達後に評価される生物学的機能として選択された。前記ｄｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、実施例６で上述したとおりであった。

【0475】

コンジュゲートの１つは、以下の構造を有する（すなわち、２つのＥ部分を有する）コンジュゲート（Ｃｎ－７）であった。

【0476】

【化67】

【0477】

第２のコンジュゲートはコンジュゲート（Ｃｎ－９）であり、以下の構造を有していた（すなわち、３つのＥ部分を有していた）。

【0478】

【化68】

【0479】

両方のコンジュゲートにおいて、すべてのＲ及びＲ´部分はリン酸基であった。

【0480】

細胞培養

【0481】

ＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞株はＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル所在）、及びブラストサイジン１０μｇ／ｍｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。３７°Ｃのインキュベーターで、５％ＣＯ_２加湿空気で細胞を維持した。

【0482】

トランスフェクションの１日前に、ガラス底の２４ウェルブラックプレートに細胞を播種した（４０，０００細胞／ウェル）。翌日、１０％ウシ胎児血清［ＦＢＳ、血清（＋）条件］の存在下で、細胞をコンジュゲート（Ｃｎ－７）またはコンジュゲート（Ｃｎ－９）のいずれかと共にインキュベートした。無血清条件［血清（－）条件］でのインキュベーションでは、培地を吸引し、細胞をハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、培地を無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に交換した。２４時間後、残りのインキュベーション期間（合計７２時間）、培地を１０％ＦＣＳ培地に交換した。細胞をコンジュゲート（Ｃｎ－７）またはコンジュゲート（Ｃｎ－９）のいずれかと共にインキュベートした：血清なしの条件［（Ｓ－）条件］では１５０ｎＭ、血漿タンパク質の存在下［（Ｓ＋）条件］では６００ｎＭの線量。

【0483】

遺伝子発現のダウンレギュレーション

【0484】

遺伝子発現のダウンレギュレーションを、トランスフェクションの７２時間後に測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。タンパク質発現を、ＥＧＦＰ蛍光の強度の測定によって測定し、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００－Ｐｒｏマルチモードリーダー（Ｔｅｃａｎ社）によって定量化した；励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍ。実験を３回繰り返して行い、ＥＧＦＰ蛍光の結果を未処理（すなわち、コンジュゲートで処理していない）細胞の蛍光強度と比較した。結果を、他のコンジュゲートの蛍光強度と比較した蛍光強度のパーセンテージとして提示した。コンジュゲート間の差の有意性は、有意であると定義されたｐ＜０．０５で、両側ｔ検定によって評価した。

【0485】

結果

【0486】

無血清条件：複合体Ｃｎ－７及びＣｎ－９は両方とも、細胞による有意な取り込み、及びそれぞれの効果的な遺伝子サイレンシングを示した。コンジュゲートＣｎ－７は、１５０ｎＭのコンジュゲートで４１．４＋１．０％の遺伝子サイレンシングを示した（平均＋標準偏差）。コンジュゲートＣｎ－９は、１５０ｎＭのコンジュゲートで６１．０＋０．５％の、より高いサイレンシング効果を示した。コンジュゲート間の差は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１、Ｃｎ－７とＣｎ－９コンジュゲートとの間のｔ検定比較）。

【0487】

血清の存在下：コンジュゲートＣｎ－７及びＣｎ－９の両方は、細胞による有意な取り込み、及びそれぞれの効果的な遺伝子サイレンシングを示した。コンジュゲートＣｎ－７は、コンジュゲートの濃度６００ｎＭで１２．３＋１．６％の遺伝子サイレンシングをもたらし、Ｃｎ－９はその濃度で２５．４＋１．０％のより強い遺伝子サイレンシングをもたらした（平均＋標準偏差）、（ｐ＜０．００１、Ｃｎ－７コンジュゲートとＣｎ－９コンジュゲートとの間のｔ検定比較）。

【0488】

コンジュゲートＣｎ－７及びＣｎ－９は両方とも、インビトロで細胞と共にインキュベートすると、有意な取り込み及び遺伝子サイレンシングを示した。両方のコンジュゲートによって発揮される遺伝子サイレンシング活性は、培地中の血漿タンパク質の有無、すなわち、（Ｓ＋）条件と（Ｓ－）条件との両方において明らかであった。サイレンシングは、無血清条件において、より大きな振幅（amplitude）であり、これらの条件でのアルブミンへのコンジュゲートの競合的結合のそれぞれの欠如とおそらく一致する。重要なことに、（Ｓ＋）条件と（Ｓ－）条件との両方で、遺伝子サイレンシングは、２つのＥ部分のみを含むコンジュゲート（Ｃｎ－７）と比較して、３つのＥ部分を含むコンジュゲート（Ｃｎ－９）において統計的に有意であった。

【0489】

結論

【0490】

本発明の２個または３個のＥ部分を含むＤｓｉＲＮＡは、インビトロで有意な遺伝子サイレンシングを示した。前記遺伝子サイレンシングは、培地中の血漿タンパク質の存在下または非存在下のいずれかで発生した。３つのＥ部分を含むコンジュゲートは、有意な遺伝子サイレンシングの提供において、２つのＥ部分のみを含むコンジュゲートよりも有利である。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【配列表】

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