▶ ルェヤン（スーツォ）バイオロジー サイエンス アンド テクノロジー シーオー．，エルティーディーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-09
(45)【発行日】2022-12-19
(54)【発明の名称】抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20221212BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221212BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20221212BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221212BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221212BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20221212BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221212BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221212BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221212BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221212BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221212BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P9/00
A61P29/00
A61P35/00
C07K16/28
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021508276
(86)(22)【出願日】2019-08-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-09
(86)【国際出願番号】 CN2019101785
(87)【国際公開番号】W WO2020038404
(87)【国際公開日】2020-02-27
【審査請求日】2021-02-17
(31)【優先権主張番号】201810958670.2
(32)【優先日】2018-08-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910767966.0
(32)【優先日】2019-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518338286
【氏名又は名称】ルェヤン（スーツォ）バイオロジー サイエンス アンド テクノロジー シーオー．，エルティーディー
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】呉燕燕
(72)【発明者】
【氏名】崔文俊
(72)【発明者】
【氏名】胡▲チン▼▲フェ▼
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－０３５１５５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／６３
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを有する抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体であって、重鎖の可変領域は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；軽鎖の可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、
重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列であり；
重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列であり；
重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列であり；
軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列であり；
軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるアミノ酸配列であり；
軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列である、
ことを特徴とする、抗体。
【請求項2】
前記重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９であり；前記軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０である、
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
請求項１に記載の抗体をコードする、ことを特徴とする、核酸分子。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項5】
請求項１～２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項３に記載の核酸分子又は請求項４に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項6】
請求項１～２のいずれか一項に記載の抗体を含有するコンジュゲート。
【請求項7】
疾患治療薬又は検出試薬の調製における請求項１～２のいずれか一項に記載の抗体、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、又は請求項６に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項8】
疾患は、悪性腫瘍、心血管疾患または炎症性疾患であることを特徴とする、疾患治療薬又は検出試薬の調製における請求項１～２のいずれか一項に記載の抗体、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、又は請求項６に記載のコンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品分野に関し、特に抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃｌａｕｄｉｎｓファミリーは、上皮細胞間の密着結合の骨格タンパク質であり、密着結合の形成に関わり、密着結合が細胞の極性配列とバリア機能を維持し、これらの発現異常が密着結合の構造と機能の破壊につながり、多くの病気の原因となる症例でもある。様々な上皮由来の腫瘍によりＣｌａｕｄｉｎｓファミリーの発現異常が観察され、これらの腫瘍の発生、進展と密接に関係し、Ｃｌａｕｄｉｎファミリーは、診断、治療及び予後判断などの面において幅広い応用の見通しがあることが研究により示されているため、Ｃｌａｕｄｉｎｓファミリーが腫瘍研究の新しいホットスポットになっている。
【0003】
ヒト由来のＣｌａｕｄｉｎ１８遺伝子には、２つの異なる最初のエクソンがあるため、２つのサブタイプのＣｌａｕｄｉｎ１８．１及びＣｌａｕｄｉｎ１８．２を生成できる。これら２つの分子のＮ末端側の６９アミノ酸の構造は、異なり最初の細胞外領域のリング構造に位置している。Ｃｌａｕｄｉｎ１８の２つのサブタイプは、それぞれ異なる組織で転写・増幅され、この中のＣｌａｕｄｉｎ１８．１は、主に肺組織で発現され、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２が胃組織で特異的に発現されている。
【0004】
２００６年になるとＳａｎａｄａらは、ｃｌａｕｄｉｎ－１８遺伝子の発現が胃癌の５７％でダウンレギュレートされていることを発見した。免疫組織化学的解析によりｃｌａｕｄｉｎ－１８は、正常な胃粘膜及び十二指腸パネート細胞の細胞膜に発現したが、一部の腸上皮化生と胃腺腫の９０％では、ｃｌａｕｄｉｎ－１８の発現が低下しており、同時に、腸型胃癌での発現低下が他のタイプの胃癌よりも一般的であり、早期胃癌の発生に関与している可能性があると推測されている。生存分析は、胃癌におけるｃｌａｕｄｉｎ－１８発現の減少が進行した患者の予後不良に関連していることを示し、ｃｌａｕｄｉｎ－１８発現の減少が胃癌患者の予後不良の要因であると考えられている。
【0005】
２００８年になるとＳａｈｉｎらの研究により、原発性胃腺癌組織の７７％にＣｌａｕｄｉｎ１８．２の発現が存在していることが確認された。極めて重要なことは、５６％の組織の発現量が６０％以上に達していることである。上記の研究結果と一致するのは、腸型胃癌におけるＣｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質の発現はダウンレギュレートされたが、びまん性胃癌におけるＣｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質の発現は、より高かった。しかし膵臓、食道、卵巣等の組織は、通常の状態下でＣｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質の発現がなく、対応する腫瘍組織内でＣｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質を大量に発現することができる。したがってＣｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質は、臨床腫瘍の診断と治療のターゲットとして使用できる。しかしこのタンパク質を標的として開発された抗体は、見られない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、良好な特異性、高い親和性及び安定性を有する抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の目的は、具体的に以下のように、抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体のアミノ酸配列を提供することである。すなわち、
３つの重鎖相補性決定領域（重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３）を有する抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体であって、
重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択される。
３つの重鎖相補性決定領域（重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補性決定領域（軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３）を有する抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体であって、
重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択される。
【0008】
好ましくは、重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、重鎖ＣＤＲ３ はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０であり、重鎖ＣＤＲ３ はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０であり；又は重鎖ＣＤＲ１ は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８である。
【0009】
好ましくは、重鎖の可変領域は、上記の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み；軽鎖の可変領域は、上記の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【0010】
好ましくは、重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のいずれかから選択され；
好ましくは、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のいずれかから選択される。
好ましくは、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のいずれかから選択される。
【0011】
好ましくは、
前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４である。
前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２であり；
又は前記重鎖の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３であり、前記軽鎖の可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４である。
【0012】
好ましくは、重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列ａと少なくとも５０％の相同性を有する類似の配列であり、前記配列ａはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のいずれかである。
【0013】
好ましくは、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列ｂと少なくとも５０％の相同性を有する類似の配列であり、前記配列ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のいずれかである。
【0014】
重鎖のアミノ酸配列は、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３を含み；重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、重鎖ＣＤＲ３ はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０であり、重鎖ＣＤＲ３ はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０であり；又は重鎖ＣＤＲ１ は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２であり；又は重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３であり、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５であり、かつ軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６であり、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７であり、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８である。
【0015】
好ましくは、抗体のアミノ酸配列は、上記の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を含む。
【0016】
本発明の第２の目的は、具体的に以下のように、抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体の核酸配列を提供することである。すなわち、
重鎖ＣＤＲ及び／又は軽鎖ＣＤＲをコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択される。
重鎖ＣＤＲ及び／又は軽鎖ＣＤＲをコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択され；
軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のいずれか、又はこれらの１つと相同性が５０％を超える類似の配列から選択される。
【0017】
核酸分子であって、重鎖の可変領域及び／又は軽鎖の可変領域をコードすることができる核酸配列を含み、重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１ 又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のいずれかから選択され；
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２ 又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のいずれかから選択されることを特徴とする。
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２ 又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のいずれかから選択されることを特徴とする。
【0018】
本発明は、上記のいずれか１つに記載の核酸分子を含有するベクターをさらに提供する。
【0019】
本発明は、上記のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、核酸分子又は上記ベクターを含有する宿主細胞をさらに提供する。
【0020】
本発明は、上記のいずれか１つに記載の抗体を含有するコンジュゲートをさらに提供する。
【0021】
本発明は、主成分及び補助的成分を含有する組成物を提供し、前記主成分は上記のいずれか１つに記載の抗体又は上記のいずれか１つに記載の核酸分子又は上記ベクター、上記宿主細胞或いは上記コンジュゲートのうち１種又は複数種を含有し；前記補助的成分は、薬学的に許容される担体又は賦形剤、及び任意に選択された他の生物活性物質から選択される。
【0022】
前記他の生物活性物質は、他の抗体、融合タンパク質又は薬物（例えば放射線療法及び化学療法薬などの抗腫瘍薬）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0023】
本発明は、疾患治療薬又は検出試薬の調製における上記の抗体、核酸分子、ベクター、宿主細胞、コンジュゲート、及び組成物の使用をさらに提供する。
【0024】
前記疾患は、悪性腫瘍、心血管疾患または炎症性疾患である。
【0025】
本発明は、上記のいずれか１つに記載の抗体を含有する診断試薬又はキットをさらに提供する。前記診断試薬又はキットは、インビトロ（例えば細胞又は組織）或いはインビボ（例えばヒト又は動物モデル）でｃｌａｕｄｉｎ１８．２に関連する疾患を診断する。
【0026】
以下に本発明をさら描写する。本発明において、特段の規定がない限り、本明細書で使用される技術と科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。かつ、本明細書で使用されるタンパク質と核酸化学、分子生物学、細胞と組織培養、微生物学、免疫学に関する用語及び実験室の操作手順はすべて、対応する分野で広く使用される用語及び従来の手順である。同時に、本発明をよりよく理解するため、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。本明細書で言及される用語「抗体」は、完全な抗体及び任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合部位」）又は一本鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって互いに接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部位を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域と重鎖定常領域で構成される。
【0027】
本発明において、「相同性」は、最良アラインメントにおける２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性を意味する。
【0028】
上述の説明は、本発明の技術的解決手段の概要に過ぎず、本発明の技術的手段をより明確に理解し、明細書の内容に従ってそれを実施できるため、本発明の好ましい実施例及び添付の図面を参照しつつ以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】
ヒト化抗体のＡＤＣＣ効果を示すグラフである。
【図2】
ヒト化抗体のＣＤＣ効果を示すグラフである。
【図3】
ヒト化抗体の増殖阻害効果を示すグラフである。
【図4】
ヒト化抗体のエンドサイトーシス効果を示すグラフである。
【図5】
マウスモデルにおける抗体の効果を示すグラフである。
【図6】
マウスモデルにおける抗体の効果のヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明は、モノクローナル抗体及びその使用を開示する。当業者は、本明細書の内容の示唆を介してプロセスパラメータを適切に改善することで実現できる。特に、すべての類似の置換及び修正は当業者にとって自明であり、それらはすべて本発明に含まれると見なされることを指摘すべきである。本発明の方法及び使用は、好ましい実施例を通じて描写されてきた。当業者が、本発明の内容及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び使用に修正又は適切な変更及び組み合わせることで、本発明の技術を実現及び使用することができる。
【0031】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体及びその使用において、用いる原料及び試薬は、いずれも市場で入手できる。
【0032】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
【実施例】
【0033】
１．抗原の準備
ＧＳＴ－ＥＣＤタンパク質の調製
ヒトクローディン１８．２の最初の細胞外ドメインの部分配列をベクターｐＧＥＸ－ＫＧ（抗原配列１）上に構築し、構築した発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１菌株に移入し、ＬＢ培地とＩＰＴＧ誘導法により抗原タンパク質を発現させる。回収したＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１菌体をホモジナイザーで破砕し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ，Ｃａｔ＃１７－５１３２－０１）でアフィニティー精製し、ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｑ（ＧＥ，Ｃａｔ＃１１００１３０２）カラムで二次精製を行うと共にタンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４に透析して、純度＞８５％の抗原タンパク質を得た。
ＧＳＴ－ＥＣＤタンパク質の調製
ヒトクローディン１８．２の最初の細胞外ドメインの部分配列をベクターｐＧＥＸ－ＫＧ（抗原配列１）上に構築し、構築した発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１菌株に移入し、ＬＢ培地とＩＰＴＧ誘導法により抗原タンパク質を発現させる。回収したＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１菌体をホモジナイザーで破砕し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ，Ｃａｔ＃１７－５１３２－０１）でアフィニティー精製し、ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｑ（ＧＥ，Ｃａｔ＃１１００１３０２）カラムで二次精製を行うと共にタンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４に透析して、純度＞８５％の抗原タンパク質を得た。
【0034】
ＤＮＡ免疫原の調製
ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の最初の細胞外ドメインの部分配列又は完全長配列を免疫原（抗原配列２、抗原配列３）としてｐｃＤＮＡ３．１ベクター上に構築した。
ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の最初の細胞外ドメインの部分配列又は完全長配列を免疫原（抗原配列２、抗原配列３）としてｐｃＤＮＡ３．１ベクター上に構築した。
【0035】
Ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の安定細胞系の構築
ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の完全長配列をベクターｐｃＤＮＡ３．１（－）にクローニングし、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ３０００Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｃａｔ＃Ｌ３０００１５０）試薬で構築した発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に移入し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１０１３１－０２７）でスクリーニングし、ＱＰＣＲ及びＦＡＣＳのスクリーニング・検証を経た後、安定発現のＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を得た。
ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の完全長配列をベクターｐｃＤＮＡ３．１（－）にクローニングし、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ３０００Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｃａｔ＃Ｌ３０００１５０）試薬で構築した発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に移入し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１０１３１－０２７）でスクリーニングし、ＱＰＣＲ及びＦＡＣＳのスクリーニング・検証を経た後、安定発現のＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を得た。
【0036】
ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２の完全長配列をアデノウイルスベクターにクローニングし、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｃａｔ＃Ｌ３０００１５０）試薬で構築した発現ベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞に移入し、５μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１０１３１－０２７）でスクリーニングし、Ｑ－ＰＣＲ及びＦＡＣＳのスクリーニング・検証を経た後、安定発現のＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を得た。
【0037】
２．動物の免疫
ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に対する高い親和性と高い特異性の抗体を得るため、この実験では、いくつかのＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫する一連の抗原の組み合わせ（ＤＮＡ免疫、タンパク質免疫及び細胞系全細胞性免疫）を設計した。古典的な免疫スケジュールを使用して免疫することで、マウスの免疫反応を誘発する。マウス血清を採取し、ＧＳＴ－ＥＣＤタンパク質細胞系を抗原として使用し、ＥＬＩＳＡ法又はＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を使用してＦＡＣＳを実行して血清力価を測定し、高力価の対応するマウスを選択して融合に入った。
ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に対する高い親和性と高い特異性の抗体を得るため、この実験では、いくつかのＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫する一連の抗原の組み合わせ（ＤＮＡ免疫、タンパク質免疫及び細胞系全細胞性免疫）を設計した。古典的な免疫スケジュールを使用して免疫することで、マウスの免疫反応を誘発する。マウス血清を採取し、ＧＳＴ－ＥＣＤタンパク質細胞系を抗原として使用し、ＥＬＩＳＡ法又はＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を使用してＦＡＣＳを実行して血清力価を測定し、高力価の対応するマウスを選択して融合に入った。
【0038】
３．ハイブリドーマの融合とスクリーニング
融合する前に、マウス骨髄腫のＳＰ２／０状態を調整して、その増殖密度が１×１０６を超えないようにする。動物は３日前に最終免疫を行い、１日前にＳＰ２／０細胞を培養し、プレーティングの数は２．０×１０４細胞／ウェルであり、電気融合装置を介して融合し、脾細胞又はリンパ節細胞とＳＰ２／０細胞の比率が１０：１～５：１であり、各ウェルの脾細胞の数が１×１０５ を超えないようにする。採取した上清をＥＬＩＳＡ結合法とフローサイトメーターで細胞結合活性を測定し、３回のスクリーニング実験で陽性であったハイブリドーマ細胞株を得た。
融合する前に、マウス骨髄腫のＳＰ２／０状態を調整して、その増殖密度が１×１０６を超えないようにする。動物は３日前に最終免疫を行い、１日前にＳＰ２／０細胞を培養し、プレーティングの数は２．０×１０４細胞／ウェルであり、電気融合装置を介して融合し、脾細胞又はリンパ節細胞とＳＰ２／０細胞の比率が１０：１～５：１であり、各ウェルの脾細胞の数が１×１０５ を超えないようにする。採取した上清をＥＬＩＳＡ結合法とフローサイトメーターで細胞結合活性を測定し、３回のスクリーニング実験で陽性であったハイブリドーマ細胞株を得た。
【0039】
Ａ．ＥＬＩＳＡ結合方法
ＧＳＴ－ＥＣＤをＰＢＳｐＨ７．４コーティング溶液で０．５μｇ／ｍｌに希釈して９６ウェルプレートをコーティングし、各ウェルに１００μｌを加え、ブロッキング後にハイブリドーマ培養上清を加え、洗浄後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎＸ Ｈｕ，Ｂｏｖ，ＨｒｓＳｒＰｒｏｔ）を加え、洗浄後に発色基質を加えてインキュベートし、反応終了後にＯＤ４５０の吸光度値を読み取った。
ＧＳＴ－ＥＣＤをＰＢＳｐＨ７．４コーティング溶液で０．５μｇ／ｍｌに希釈して９６ウェルプレートをコーティングし、各ウェルに１００μｌを加え、ブロッキング後にハイブリドーマ培養上清を加え、洗浄後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎＸ Ｈｕ，Ｂｏｖ，ＨｒｓＳｒＰｒｏｔ）を加え、洗浄後に発色基質を加えてインキュベートし、反応終了後にＯＤ４５０の吸光度値を読み取った。
【0040】
Ｂ．細胞ＥＬＩＳＡ試験
１×１０５細胞／ウェルの９６ウェルプレートをＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系でコーティングし、９６ウェルプレートをブロッキングした後、一次抗体はハイブリドーマ上清、陽性抗体、アイソタイプコントロール及びＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ、Ｂｏｖ、Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後、発色基質を加えてインキュベートし、反応終了後にＯＤ４５０の吸光度値を読み取った。
１×１０５細胞／ウェルの９６ウェルプレートをＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系でコーティングし、９６ウェルプレートをブロッキングした後、一次抗体はハイブリドーマ上清、陽性抗体、アイソタイプコントロール及びＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ、Ｂｏｖ、Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後、発色基質を加えてインキュベートし、反応終了後にＯＤ４５０の吸光度値を読み取った。
【0041】
Ｃ．フローサイトメーターによるハイブリドーマ上清の細胞結合活性の測定
ハイブリドーマ上清を、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系及びＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系でフローサイトメトリー結合実験に供し、標的クローンとしてｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２で特異的にクローニングした。
ハイブリドーマ上清を、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系及びＣＨＯ－Ｋ１＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系でフローサイトメトリー結合実験に供し、標的クローンとしてｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２で特異的にクローニングした。
【0042】
各反応に５０μｌの２．５×１０５細胞を使用し、一次抗体はハイブリドーマ上清、陽性抗体、アイソタイプコントロール及びＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、二次抗体としてＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｉＦｌｏｕｒ６４７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，３μｇ／ｍｌ）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後、フローサイトメーターで蛍光シグナルを読み取った。
【0043】
４．ヒト／マウスキメラ抗体の調製と活性の同定
Ａ．マウス耐性遺伝子の獲得
ハイブリドーマ細胞株をＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ１５５９６－０２６）キットで抽出してハイブリドーマ細胞のトータルＲＮＡを抽出した後、Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットでトータルＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを調製し、縮重プライマーを使用して、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列をそれぞれ増幅した。
Ａ．マウス耐性遺伝子の獲得
ハイブリドーマ細胞株をＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ１５５９６－０２６）キットで抽出してハイブリドーマ細胞のトータルＲＮＡを抽出した後、Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットでトータルＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを調製し、縮重プライマーを使用して、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列をそれぞれ増幅した。
【0044】
Ｂ．ヒト／マウスキメラ抗体の構築
マウス抗の軽鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ ｋａｐｐａ ＣＬ領域配列とスプライシングして、完全長の軽鎖配列を取得し、完全な遺伝子合成により、窒素末端シグナルペプチドを含むベクターｐｃＤＮＡ３．１に構築して軽鎖発現ベクターを得た。
マウス抗の軽鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ ｋａｐｐａ ＣＬ領域配列とスプライシングして、完全長の軽鎖配列を取得し、完全な遺伝子合成により、窒素末端シグナルペプチドを含むベクターｐｃＤＮＡ３．１に構築して軽鎖発現ベクターを得た。
【0045】
マウス抗の重鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８ＰのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域配列とスプライシングして、完全長の重鎖配列を取得し、完全な遺伝子合成により、窒素末端シグナルペプチドを含むベクターｐｃＤＮＡ３．１に構築して重鎖発現ベクターを得た。
【0046】
Ｃ．ヒト／マウスのキメラ抗体の発現と精製
軽鎖・重鎖の発現ベクターをコトランスフェクションによりＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクトした２９３Ｆ細胞を７日間培養し、培養上清を回収した。次に、上清中のキメラ抗体をｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムによって精製し、ＰＢＳｐＨ７．４に透析した。Ａ２８０法で濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
軽鎖・重鎖の発現ベクターをコトランスフェクションによりＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクトした２９３Ｆ細胞を７日間培養し、培養上清を回収した。次に、上清中のキメラ抗体をｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムによって精製し、ＰＢＳｐＨ７．４に透析した。Ａ２８０法で濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
【0047】
Ｄ．フローサイトメーターによるヒト／マウスキメラ抗体と細胞との結合能の測定
ヒト／マウスキメラ抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ 細胞系との結合能の測定
各反応に１００μｌの２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを使用し、一次抗体は、精製されたヒト／マウスキメラ抗体、陽性抗体（ＩＭＡＢ３６２及びＡｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ１８ ａｎｔｉｂｏｄｙ［３４Ｈ１４Ｌ１５］（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ２０３５６３））、アイソタイプコントロール、及び１％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９７２２４）及びヤギＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ１５００７７）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後フローサイトメーターで蛍光シグナルを読み取った。
ヒト／マウスキメラ抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ 細胞系との結合能の測定
各反応に１００μｌの２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを使用し、一次抗体は、精製されたヒト／マウスキメラ抗体、陽性抗体（ＩＭＡＢ３６２及びＡｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ１８ ａｎｔｉｂｏｄｙ［３４Ｈ１４Ｌ１５］（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ２０３５６３））、アイソタイプコントロール、及び１％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９７２２４）及びヤギＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ１５００７７）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後フローサイトメーターで蛍光シグナルを読み取った。
【0048】
Ｆ．フローサイトメーターによるヒト／マウスキメラ抗体と癌細胞系との結合能の測定
各反応に１００μｌの１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを使用し、一次抗体は、ヒト／マウスキメラ抗体、陽性抗体（ＩＭＡＢ３６２）、アイソタイプコントロール及び１％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９７２２４）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後フローサイトメーターで蛍光シグナルを読み取った。
各反応に１００μｌの１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを使用し、一次抗体は、ヒト／マウスキメラ抗体、陽性抗体（ＩＭＡＢ３６２）、アイソタイプコントロール及び１％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳである。一次抗体をインキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９７２２４）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後フローサイトメーターで蛍光シグナルを読み取った。
【0049】
５．マウス由来抗体のヒト化
マウス抗体の可変領域配列を分析し、ヒト生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子とアラインメントし、マウス由来抗体フレームワーク領域配列と相同性の最も高いヒト軽鎖及び重鎖生殖細胞系列遺伝子フレームワーク領域配列を基本フレームワークとして選択するか、フレームワーク領域の特定のアミノ酸を選択して逆突然変異を行い、マウス由来抗体のＣＤＲ領域配列を選択したヒト生殖細胞系列遺伝子のフレームワーク領域配列と移植し、スプライシング後、ヒト化抗体の軽鎖・重鎖可変領域配列が遺伝子合成を通じてそれぞれヒトＩｇＧ４重鎖Ｆｃ及びヒトＩｇＧ ｋａｐｐａ ＣＬを含む発現ベクターに構築された。構築されたヒト化抗体の軽鎖・重鎖ベクターは、１対１のペアのＨＥＫ２９３Ｆの一過性発現を行った。一過性細胞の培養上清中の抗体がアフィニティー精製及び透析された後、Ａ２８０法で濃度を測定し、ＳＤＳＰＡＧＥによって濃度及び純度を分析した後、ＦＡＣＳ法でＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系との親和性を測定した。
マウス抗体の可変領域配列を分析し、ヒト生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子とアラインメントし、マウス由来抗体フレームワーク領域配列と相同性の最も高いヒト軽鎖及び重鎖生殖細胞系列遺伝子フレームワーク領域配列を基本フレームワークとして選択するか、フレームワーク領域の特定のアミノ酸を選択して逆突然変異を行い、マウス由来抗体のＣＤＲ領域配列を選択したヒト生殖細胞系列遺伝子のフレームワーク領域配列と移植し、スプライシング後、ヒト化抗体の軽鎖・重鎖可変領域配列が遺伝子合成を通じてそれぞれヒトＩｇＧ４重鎖Ｆｃ及びヒトＩｇＧ ｋａｐｐａ ＣＬを含む発現ベクターに構築された。構築されたヒト化抗体の軽鎖・重鎖ベクターは、１対１のペアのＨＥＫ２９３Ｆの一過性発現を行った。一過性細胞の培養上清中の抗体がアフィニティー精製及び透析された後、Ａ２８０法で濃度を測定し、ＳＤＳＰＡＧＥによって濃度及び純度を分析した後、ＦＡＣＳ法でＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系との親和性を測定した。
【0050】
６．抗体のＡＤＣＣ実験
ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系でＦＰＬＣ精製後の本発明のヒト化抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を測定した。
ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系でＦＰＬＣ精製後の本発明のヒト化抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を測定した。
【0051】
エフェクター細胞ＰＢＭＣ（ＮＫ細胞や単球などのエフェクター細胞を含む）は、健康な献血者から提供された新鮮な血液サンプルに由来する。新鮮な血液は、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１４１９０－１４４）で４倍に希釈され、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ，Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離法でエフェクター細胞ＰＢＭＣを抽出した。ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を標的細胞として使用した。培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１１８３５－０３０）＋１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１００９９－１４１））を使用して、被験抗体と対照抗体の濃度を最終濃度１０ｕｇ／ｍｌに希釈してから８つの勾配で５倍希釈し、９６ウェル細胞のＵ字型培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３７９９）に加えた。あらかじめ希釈した４０μｌ／ウェルの標的細胞（１Ｅ４細胞／ウェル）を９６ウェル培養プレートに加えた。４０μｌ／ウェルの希釈エフェクター細胞（２．５Ｅ５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに加え、エフェクター細胞：標的細胞の比率（２５：１）であった。エフェクター細胞と標的細胞にコントロールとして培地を加え、よく混合し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間インキュベートした。インキュベーション後、１５００ｒｐｍ／ ｍｉｎ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、５８１０Ｒ）で１０分間遠心分離した。７０μｌ／ウェルの上清を９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５９９）にピペットで入れた。ＬＤＨ（Ｒｏｃｈｅ，４７４４９３４００１）キットを使用し、多機能マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ，ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＦＣ）でＯＤ４９２／ＯＤ６２０をテストした。細胞毒性のパーセントは、下式で計算された。
【0052】
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝１００×（ＯＤ ｓａｍｐｌｅ-ＯＤ Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ－ＯＤＰＢＭＣ Ｏｎｌｙ）／（ＯＤ Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ－ＯＤ Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ）×％。
【0053】
７．抗体のＣＤＣテスト
ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞株を標的細胞として使用した。培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１１８３５－０３０）＋１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１００９９－１４１））を使用して、被験抗体と対照抗体の濃度を最終濃度５０ｕｇ／ｍＬに希釈してから８つの勾配で５倍希釈し、補体（Ｑｕｉｄｅｌ、Ａ１１３）を最終濃度１：５０（Ｖ／Ｖ）に希釈した。あらかじめ希釈した抗体４０μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３９１７）に加えた。あらかじめ希釈した４０μｌ／ウェルの標的細胞（１Ｅ４細胞／ウェル）を９６ウェル培養プレートに加えた。９６ウェルプレートに４０μｌ／ウェルの希釈補体を加えた。エフェクター細胞と補体をコントロールとして培地を加え、よく混合し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）で化学発光値をテストし、細胞毒性のパーセントを下式で計算された。
ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞株を標的細胞として使用した。培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１１８３５－０３０）＋１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１００９９－１４１））を使用して、被験抗体と対照抗体の濃度を最終濃度５０ｕｇ／ｍＬに希釈してから８つの勾配で５倍希釈し、補体（Ｑｕｉｄｅｌ、Ａ１１３）を最終濃度１：５０（Ｖ／Ｖ）に希釈した。あらかじめ希釈した抗体４０μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３９１７）に加えた。あらかじめ希釈した４０μｌ／ウェルの標的細胞（１Ｅ４細胞／ウェル）を９６ウェル培養プレートに加えた。９６ウェルプレートに４０μｌ／ウェルの希釈補体を加えた。エフェクター細胞と補体をコントロールとして培地を加え、よく混合し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）で化学発光値をテストし、細胞毒性のパーセントを下式で計算された。
【0054】
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝１００×（１－（ＲＬＵ Ｓａｍｐｌｅ－ＲＬＵＰＮＨＳ）／（ＲＬＵ Ｃｅｌｌ＋ＰＮＨＳ－ＲＬＵＰＮＨＳ））×％。
【0055】
８．抗原性エピトープマッピング
本発明の抗体によって認識される抗原のエピトープマッピング法は、Ｊｏｈａｎ Ｒｏｃｋｂｅｒｇ《分子生物学の方法》（ＩＳＢＮ９７８－１－４９３９－７８３９－７）の「エピトープマッピング法」に従って実施される。
本発明の抗体によって認識される抗原のエピトープマッピング法は、Ｊｏｈａｎ Ｒｏｃｋｂｅｒｇ《分子生物学の方法》（ＩＳＢＮ９７８－１－４９３９－７８３９－７）の「エピトープマッピング法」に従って実施される。
【0056】
要するに、エピトープマッピング用のオーバーラップペプチドライブラリーのペプチドは、抗原配列に基づいて設計され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成され、高親和性ＥＬＩＳＡプレートでペプチドをコーティングし、まずＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．５９のコーティングバッファーでペプチドを希釈すると共に３７℃で約２時間コーティングし、ウェル内のコーティング溶液を廃棄し、次にＰＢＳ，ｐＨ７．４のコーティングバッファーで希釈したペプチドをウェルに加え、３７℃で約２時間コーティングし、ウェル内のコーティング溶液を廃棄し、最後にｄｄＨ２Ｏで希釈したポリペプチドをウェルに加え、４℃で３回目のコーティングを行って一晩静置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳＴで洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴでブロッキングした。本発明の抗体、陽性対照、アイソタイプ及び０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴを一次抗体として０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈し、３７℃で２時間インキュベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳＴで洗浄し；ＨＲＰグループと結合したヤギ抗ヒトＦｃ断片抗体（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ｃａｔ＃ＳＥ１０１）を二次抗体として０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢにより発色（Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ｃａｔ＃ＰＲ１２００）させると共にＯＤ４５０吸光度値を測定した。
【0057】
９．ヒト化抗体の種結合特性及び親和性の測定
ヒト化抗体の種結合特性は、実施例４の方法に従ってフローサイトメトリー検査を行った。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを使用して、マウス、ラット、ウサギ及びチンパンジー用のＣＬＤＮ１８Ａ２発現ベクターを構築し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｇｉｂｉｃｏ，Ｃａｔ＃Ａ１４５２４）を使用して、上記の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクションし、トランスフェクション後４８時間サンプリングして測定した。ブランクＨＥＫ２９３Ｆ細胞を陰性対照として使用し、ヒトＣＬＤＮ１８Ａ１及びヒトＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞系を陽性対照としてフローサイトメトリー分析を行った。
ヒト化抗体の種結合特性は、実施例４の方法に従ってフローサイトメトリー検査を行った。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを使用して、マウス、ラット、ウサギ及びチンパンジー用のＣＬＤＮ１８Ａ２発現ベクターを構築し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｇｉｂｉｃｏ，Ｃａｔ＃Ａ１４５２４）を使用して、上記の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクションし、トランスフェクション後４８時間サンプリングして測定した。ブランクＨＥＫ２９３Ｆ細胞を陰性対照として使用し、ヒトＣＬＤＮ１８Ａ１及びヒトＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞系を陽性対照としてフローサイトメトリー分析を行った。
【0058】
各反応は１００μｌの２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌｌ細胞を使用し、一次抗体はＦＰＬＣによって精製された本発明のヒト化抗体、陽性抗体（ＩＭＡＢ３６２及びＡｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ１８ ａｎｔｉｂｏｄｙ［３４Ｈ１４Ｌ１５］（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ２０３５６３））、アイソタイプコントロール及び１％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳである。一次抗体のインキュベーション後、細胞を洗浄し、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ９７２２４）及びヤギＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ＃ａｂ１５００７７）を二次抗体としてインキュベートし、洗浄後にフローサイトメーターで蛍光シグナルを読み取った。
【0059】
１０．増殖阻害
ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を試験細胞として使用した。培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１２３３８－０１８））を使用して、被験抗体とアイソタイプコントロール抗体の濃度を１５ｕｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、次に３．１６倍で８つの勾配に希釈した。あらかじめ希釈した抗体５０μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレートに加えた（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６１０）。あらかじめ希釈した細胞（（５Ｅ３細胞／ウェル／））５０μｌ／ウェルを９６ウェル培養プレートに加えた。よく混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）で化学発光値をテストした。細胞毒性のパーセントは下式で計算された。
ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を試験細胞として使用した。培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１２３３８－０１８））を使用して、被験抗体とアイソタイプコントロール抗体の濃度を１５ｕｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、次に３．１６倍で８つの勾配に希釈した。あらかじめ希釈した抗体５０μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレートに加えた（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６１０）。あらかじめ希釈した細胞（（５Ｅ３細胞／ウェル／））５０μｌ／ウェルを９６ウェル培養プレートに加えた。よく混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）で化学発光値をテストした。細胞毒性のパーセントは下式で計算された。
【0060】
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝１００×（ＲＬＵＣｅｌｌ ｏｎｌｙ－ＲＬＵ Ｓａｍｐｌｅ）／ＲＬＵ Ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ×％。
【0061】
１１．エンドサイトーシス
ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を検出細胞として使用した。培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｇｉｂｃｏ，１２３３８－０１８））を使用して、被験抗体とアイソタイプコントロール抗体の濃度を４０ｎＭ，１２０ ｕｌ Ｆａｂ -ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＴ－５１）＋１２０ｕＬ抗体又はＳａｐｏｒｉｎ （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＲ－１）に希釈してよく混合し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートした後、８つの勾配で２．５倍希釈した。あらかじめ希釈した抗体５０μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレートに加えた（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６１０）。あらかじめ希釈した細胞（５Ｅ３細胞／ウェル／）５０μｌ／ウェルを９６ウェル培養プレートに加えた。よく混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）で化学発光値をテストし、４パラメーター方程式で曲線を適合させ、化学発光値Ｌｕｍを使用して抗体濃度又は細胞毒性のパーセントをプロットし、下式で計算された。
ＣＬＤＮ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系を検出細胞として使用した。培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｇｉｂｃｏ，１２３３８－０１８））を使用して、被験抗体とアイソタイプコントロール抗体の濃度を４０ｎＭ，１２０ ｕｌ Ｆａｂ -ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＴ－５１）＋１２０ｕＬ抗体又はＳａｐｏｒｉｎ （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＲ－１）に希釈してよく混合し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートした後、８つの勾配で２．５倍希釈した。あらかじめ希釈した抗体５０μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養プレートに加えた（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６１０）。あらかじめ希釈した細胞（５Ｅ３細胞／ウェル／）５０μｌ／ウェルを９６ウェル培養プレートに加えた。よく混合した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。インキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を９６ウェル細胞培養プレートに加えた。多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）で化学発光値をテストし、４パラメーター方程式で曲線を適合させ、化学発光値Ｌｕｍを使用して抗体濃度又は細胞毒性のパーセントをプロットし、下式で計算された。
【0062】
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝１００×（ＲＬＵＣｅｌｌ ｏｎｌｙ－ＲＬＵ Ｓａｍｐｌｅ）／ＲＬＵ Ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ×％
１２．マウスモデルにおける抗体の効果
Ａ．マウスにおける遅発性・高発現のＣＬＤＮ１８Ａ２腫瘍の治療
ヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ－４の右腋窩に５０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを皮下接種し、腫瘍体積が適切なサイズに成長したとき、腫瘍体積が３７．５４～１２４．６４ｍｍ３の３６匹の担癌マウスを選別して１－陰性対照群、２－陽性対照群（０．２ｍｇ／マウス）、３－ＲＢ００１１－ＦＫ－１３群（０．２ｍｇ／マウス）、４－ＲＢ００１１－ＦＫ－１群（０．２ｍｇ／マウス）、５－ＲＢ００１１－ＦＫ－２群（０．２ｍｇ／マウス）及び６－１８６ＣＧ４－ｍｕｔ群（０．２ｍｇ ／マウス）の６群にランダムに分け、１群につき６匹の動物となり、グループ化後に週２回、４週間静脈内投与した。最初の投与後、１日２回一般的な臨床観察を行い、週２回計量及び腫瘍径の測定を行い、Ｄ２９で動物を安楽死させ、腫瘍組織を抽出及び秤量し、腫瘍体積、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）、及び相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）を計算した。
１２．マウスモデルにおける抗体の効果
Ａ．マウスにおける遅発性・高発現のＣＬＤＮ１８Ａ２腫瘍の治療
ヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ－４の右腋窩に５０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを皮下接種し、腫瘍体積が適切なサイズに成長したとき、腫瘍体積が３７．５４～１２４．６４ｍｍ３の３６匹の担癌マウスを選別して１－陰性対照群、２－陽性対照群（０．２ｍｇ／マウス）、３－ＲＢ００１１－ＦＫ－１３群（０．２ｍｇ／マウス）、４－ＲＢ００１１－ＦＫ－１群（０．２ｍｇ／マウス）、５－ＲＢ００１１－ＦＫ－２群（０．２ｍｇ／マウス）及び６－１８６ＣＧ４－ｍｕｔ群（０．２ｍｇ ／マウス）の６群にランダムに分け、１群につき６匹の動物となり、グループ化後に週２回、４週間静脈内投与した。最初の投与後、１日２回一般的な臨床観察を行い、週２回計量及び腫瘍径の測定を行い、Ｄ２９で動物を安楽死させ、腫瘍組織を抽出及び秤量し、腫瘍体積、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）、及び相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）を計算した。
【0063】
結果
１．ヒト／マウスキメラ抗体の調製と活性の同定
ａ．フローサイトメーターによるヒト／マウスのキメラ抗体と細胞との結合能の測定
１つの弱陽性クローン（１７０Ｂ３）及び２つの強陽性クローン（１８０Ｇ８及び１８６Ｆ７）をスクリーニングして、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎクローディン１８．２を特異的に標的とした。
１．ヒト／マウスキメラ抗体の調製と活性の同定
ａ．フローサイトメーターによるヒト／マウスのキメラ抗体と細胞との結合能の測定
１つの弱陽性クローン（１７０Ｂ３）及び２つの強陽性クローン（１８０Ｇ８及び１８６Ｆ７）をスクリーニングして、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎクローディン１８．２を特異的に標的とした。
【0064】
【表1】
【0065】
【表2】
【0066】
ｂ．フローサイトメーターによるヒト／マウスキメラ抗体と癌細胞系との結合能の測定
スクリーニングされた２つの強陽性クローン（１８０Ｇ８及び１８６Ｆ７）は、ＮＵＧＣ－４に結合することができる。
スクリーニングされた２つの強陽性クローン（１８０Ｇ８及び１８６Ｆ７）は、ＮＵＧＣ－４に結合することができる。
【0067】
【表3】
【0068】
ｃ．ＦＡＣＳ法によるヒト／マウスキメラ抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系との親和性の測定
【0069】
【表4】
【0070】
２．ヒト化抗体のＡＤＣＣ効果
２つのヒト化抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系は、ＡＤＣＣ効果を示し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０１９μｇ／ｍｌと０．００３μｇ／ｍｌであった。図１を参照のこと。
２つのヒト化抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系は、ＡＤＣＣ効果を示し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０１９μｇ／ｍｌと０．００３μｇ／ｍｌであった。図１を参照のこと。
【0071】
３．ヒト化抗体のＣＤＣ効果
２つのヒト化抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系は、明らかなＣＤＣ効果を示さなかった。図２を参照のこと。
２つのヒト化抗体とＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系は、明らかなＣＤＣ効果を示さなかった。図２を参照のこと。
【0072】
４．抗原性エピトープマッピング
【0073】
【表5】
【0074】
５． ヒト化抗体の種結合特性及び親和性の測定（ＥＣ５０（ｎＭ））
【0075】
【表6】
【0076】
ｅ．増殖阻害
２つのヒト化抗体は、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系に対して明らかな増殖阻害効果を示さなかった。図３を参照のこと。
２つのヒト化抗体は、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞系に対して明らかな増殖阻害効果を示さなかった。図３を参照のこと。
【0077】
６．増殖阻害
２つのヒト化抗体は、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞株に対して一定のエンドサイトーシス効果を示した。図４を参照のこと。
２つのヒト化抗体は、ＨＥＫ２９３Ｆ＿ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞株に対して一定のエンドサイトーシス効果を示した。図４を参照のこと。
【0078】
７．マウスモデルにおける抗体の効果
ａ．マウスにおける遅発性・高発現のＣＬＤＮ１８Ａ２腫瘍の治療
この実験は、ヒト胃癌ＮＵＧＣ－４のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルの確立に成功した。この実験の条件下で、陽性対照物質、被験物質ＲＢ００１１－ＦＫ－１３、ＲＢ００１１－ＦＫ－１、ＲＢ００１１－ＦＫ－２及び１８６ＣＧ４－ｍｕｔを２ｍｇ／マウスの用量で週２回投与した。合計静脈内投与４週間後、ヒト胃癌ＮＵＧＣ－４のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの増殖を阻害する効果がある。図５及び図６を参照のこと。
ａ．マウスにおける遅発性・高発現のＣＬＤＮ１８Ａ２腫瘍の治療
この実験は、ヒト胃癌ＮＵＧＣ－４のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスモデルの確立に成功した。この実験の条件下で、陽性対照物質、被験物質ＲＢ００１１－ＦＫ－１３、ＲＢ００１１－ＦＫ－１、ＲＢ００１１－ＦＫ－２及び１８６ＣＧ４－ｍｕｔを２ｍｇ／マウスの用量で週２回投与した。合計静脈内投与４週間後、ヒト胃癌ＮＵＧＣ－４のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの増殖を阻害する効果がある。図５及び図６を参照のこと。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】