特許 7192221 細胞トラップ構造体及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-12

(45)【発行日】2022-12-20

(54)【発明の名称】細胞トラップ構造体及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/26 20060101AFI20221213BHJP

【ＦＩ】

C12M1/26

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2018041100

(22)【出願日】2018-03-07

(65)【公開番号】P2019154241

(43)【公開日】2019-09-19

【審査請求日】2021-01-28

(73)【特許権者】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000110

【氏名又は名称】弁理士法人 快友国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】片平 悟史

(72)【発明者】

【氏名】徳弘 健郎

(72)【発明者】

【氏名】名倉 理紗

【審査官】中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０４０７３４２８（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１４９９８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２８１１２６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】PLOS ONE, 2014 JUN 20, vol. 9, no. 6, article no. e100042 (pp. 1-10)

【文献】J Appl Phys, 2008, vol. 103, article no. 044701 (pp. 1-6)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

所定の方向性で移動する標的細胞を捕捉するためのトラップ構造体であって、
前記所定の方向性における上流側に開口し前記標的細胞を捕捉する凹状のキャビティを構成する細胞捕捉部と、
前記細胞捕捉部の一部において前記キャビティの内部と前記キャビティの外部とを、前記標的細胞が排出されない程度に連通する連通部と、
前記細胞捕捉部の前記上流側に配置されて前記標的細胞を衝突又は接触させて前記標的細胞の移動方向を変化させる障害部と、
を一単位として備え、
前記障害部は、前記キャビティの略中央部の前記上流側に備えられるとともに、前記標的細胞を衝突又は接触させて前記標的細胞の前記キャビティへの進入をガイド又は促進するガイド部をさらに備え、
前記障害部の前記所定の方向性における最も下流側にある端部と、前記細胞捕捉部の最上流側端部との前記所定の方向性に沿う距離が、前記標的細胞の平均的粒径の１倍以上３倍以下である、トラップ構造体。

【請求項2】

前記ガイド部は、前記所定の方向性における下流側に向かってテーパ状となるように構成されている、請求項１に記載のトラップ構造体。

【請求項3】

前記障害部は、前記標的細胞がキャビティの側方側のみから前記キャビティ内に進入するように構成されている、請求項１又は２に記載のトラップ構造体。

【請求項4】

前記障害部は、前記標的細胞が前記キャビティの斜め上流側のみから前記キャビティ内に進入するように構成されている、請求項１～３のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項5】

前記障害部は、一細胞観察が可能な状態で前記標的細胞を前記キャビティに収容可能に構成されている、請求項１～４のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項6】

前記障害部は、前記キャビティに１個以上３個以下の前記標的細胞を収容可能に構成されている、請求項１～５のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項7】

前記障害部は、前記キャビティに１個以上２個以下の前記標的細胞を収容可能に構成されている、請求項１～６のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項8】

前記細胞捕捉部は、前記所定の方向性における下流側に向かって徐々に前記キャビティが狭くなるように第１の傾斜部分を備える、請求項１～７のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項9】

前記細胞捕捉部は、その外側に前記細胞捕捉部の前記上流側の端部から前記所定の方向性における下流側外方に傾斜する第２の傾斜部分を備える、請求項１～８のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項10】

前記細胞捕捉部及び前記連通部は、平坦な表面を備える基材に立設される併せて２個又は３個のブロック体を有し、前記２個又は３個のブロック体の間隙を前記キャビティ及び前記連通部となるように構成されている、請求項１～９のいずれかに記載のトラップ構造体。

【請求項11】

前記障害部は、前記表面に立設されるブロック体である、請求項１０に記載のトラップ構造体。

【請求項12】

所定の方向性で移動する標的細胞を捕捉するためのトラップ領域を備えるデバイスであって、
前記トラップ領域には、
請求項１～１１のいずれかに記載のトラップ構造体を備える、デバイス。

【請求項13】

複数の前記トラップ構造体を配列した複数の列を、前記所定の方向性に略直交する方向に沿って複数個備えており、
前記所定の方向性に沿って隣り合う前記列においては、前記所定の方向性に沿って前記トラップ構造体が重複しないように配列されている、請求項１２に記載のデバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、細胞のトラップ構造体及びその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞をトラップするトラップ構造体を有するマイクロ流路デバイスが知られている。このようなマイクロ流路デバイスは、流路を利用して細胞に培地を供給しつつ、細胞を培養して、単一細胞の分裂、形態、表現型等の状態を観察することを目的とするタイムラプス観察等に用いられる場合がある。また、個々の細胞を観察できることは、細胞を構成要素とするデバイスを適切に構築し、作動させるのにあたっても重要である。

【0003】

例えば、複数の独立したマイクロ流路モジュールを備え、各モジュールが、培地導入部と、培地排出部と、を備えるとともに、これらを連通させる流路（チャネル）と、この流路の途中に細胞をトラップする複数のトラップ構造体をアレイ状に有するチャンバーと、備えるチップ状のデバイスが知られている（特許文献１、非特許文献１）。こうしたデバイスにおけるトラップ構造体は、概して、細胞を捕捉・保持可能に、細胞が到来する方向に向けて開口する凹状の細胞捕捉部を備えるとともに、当該細胞捕捉部の一部には、娘細胞等を排出するために細胞捕捉部外に連通する連通部を備えている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】米国特許公開２０１６／０２８１１２６号明細書

【非特許文献】

【0005】

【文献】PLoS ONE, June 2014, Volume 9, Issue 6, e100042

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、これまで開示されている形状のトラップ構造体では、複数の細胞の積み重なりが生じてしまい、細胞レベルでの経時的観察が困難になる場合が多々あった。また、トラップ構造体による細胞トラップ率が低いため、観察可能なトラップ構造体及び細胞が限定されてしまっていた。こうしたことから、従来のマイクロ流路デバイスでは、一つの細胞を観察するには効率的ではなかった。

【0007】

本明細書は、より実用的なトラップ構造体及びその利用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、トラップ構造体について種々検討したところ、意外にも、あえて、細胞捕捉部の細胞の到来する上流側に、細胞と衝突又は接触して細胞の移動方向を変化させる障壁部を有する障害部（バッフル）を備えるようにすることで、細胞捕捉部への細胞捕捉を促進し、しかも、過剰な細胞を捕捉せず、細胞分裂等が観察可能な状態で細胞を効率的に捕捉できるという知見を得た。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。

【0009】

（１） 所定の方向性で移動する細胞を捕捉するためのトラップ構造体であって、
前記所定の方向性における上流側に開口する凹状のキャビティを構成する細胞捕捉部と、
前記細胞捕捉部の一部において前記キャビティの内部と前記キャビティの外部とを連通する連通部と、
前記細胞捕捉部の前記上流側で、前記細胞を衝突又は接触させて前記細胞の移動方向を変化させる障害部と、
を、備える、トラップ構造体。
（２） 前記障害部は、さらに、前記細胞を衝突又は接触させて前記キャビティへの進入をガイド又は促進するガイド部を備える、（１）に記載のトラップ構造体。
（３） 前記ガイド部は、前記所定の方向性における下流側に向かってテーパ状となるように構成されている、（２）に記載のトラップ構造体。
（４） 前記障害部は、前記キャビティの略中央部の前記上流側に備えられる、（１）～（３）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（５） 前記障害部は、前記細胞がキャビティの側方側のみから前記キャビティ内に進入するように構成されている、（１）～（４）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（６） 前記障害部は、前記細胞が前記キャビティの斜め上流側のみから前記キャビティ内に進入するように構成されている、（１）～（５）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（７） 前記障害部は、前記障害部の前記所定の方向性における最も下流側にある端部と、前記細胞捕捉部の最上流側端部との前記所定の方向性に沿う距離が、前記細胞の平均的粒径の１倍以上３倍以下である、（１）～（６）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（８） 前記障害部は、一細胞観察が可能な状態で前記細胞を前記キャビティに収容可能に構成されている、（１）～（７）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（９） 前記障害部は、前記キャビティに１個以上３個以下の前記細胞を収容可能に構成されている、（１）～（８）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（１０） 前記障害部は、前記キャビティに１個以上２個以下の前記細胞を収容可能に構成されている、（１）～（９）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（１１） 前記細胞捕捉部は、前記所定の方向性における下流側に向かって徐々に前記キャビティが狭くなるように第１の傾斜部分を備える、（１）～（１０）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（１２） 前記細胞捕捉部は、その外側に前記細胞捕捉部の前記上流側の端部から前記所定の方向性における下流側外方に傾斜する第２の傾斜部分を備える、（１）～（１１）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（１３） 前記細胞捕捉部及び前記連通部は、平坦な表面を備える基材に立設される併せて２個又は３個のブロック体を有し、前記２個又は３個のブロック体の間隙を前記キャビティ及び前記連通部となるように構成されている、（１）～（１２）のいずれかに記載のトラップ構造体。
（１４） 前記障害部は、前記表面に立設されるブロック体である、（１３）に記載のトラップ構造体。
（１５） 所定の方向性で移動する細胞を捕捉するためのトラップ領域を備えるデバイスであって、
前記トラップ領域には、
（１）～（１４）のいずれかに記載のトラップ構造体を備える、デバイス。
（１６） 複数の前記トラップ構造体を配列した複数の列を、前記所定の方向性に略直交する方向に沿って複数個備えており、
前記所定の方向性に沿って隣り合う前記列においては、前記所定の方向性に沿って前記トラップ構造体が重複しないように配列されている、（１５）に記載のデバイス。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本明細書が開示するトラップ構造体の一例を示す図である。

【図2】本明細書が開示するトラップ構造体細胞捕捉部の他の例を示す図である。

【図3】本明細書が開示するトラップ構造体を有する細胞トラップ領域の一例を示す図である。

【図4】マイクロ流路デバイスの全体構造及び部分構造を示す図である。

【図5】実施例で作製したマイクロ流路デバイスにおけるトラップ領域を示す図である。

【図6A】実施例で作製したマイクロ流路デバイスにおける他のトラップ領域を示す図である。

【図6B】実施例で作製したマイクロ流路デバイスにおける他のトラップ領域を示す図である。

【図6C】実施例で作製したマイクロ流路デバイスにおける他のトラップ領域を示す図である。

【図7】実施例で評価した各トラップ領域の顕微鏡写真を示す図である。

【図8】実施例で評価した各トラップ領域における充填率を示す図である。

【図9】障害部の効果を評価するために用いたトラップ構造体Ｂ及び同Ｅ（ａ）とその配列状態（ｂ）とを示す図である。

【図10】トラップ構造体Ｂ及び同Ｅを備えるマイクロ流路デバイスの全体構造を示す図である。

【図11】障害部の効果を評価するために用いたトラップ構造体Ｆ及び同Ｇ（ａ）とその配列状態（ｂ）とを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書の開示は、細胞のトラップ構造体及びその利用に関し、より具体的には、所定の方向性が付与されて移動する細胞を捕捉するためのトラップ構造体及びその利用に関する。

【0012】

本明細書に開示されるトラップ構造体（以下、本明細書において、本トラップ構造体ともいう。）は、所定の方向性が付与されて移動する細胞を捕捉するためのトラップ構造体である。本トラップ構造体は、こうした所定の方向性における上流側に開口する凹状のキャビティを構成する細胞捕捉部と、細胞捕捉部の一部においてキャビティとキャビティの外部とを連通する連通部と、を備えることができる。さらに、こうした細胞捕捉部の上流側で、キャビティに進入しようとする細胞を衝突又は接触させて細胞の移動方向を変化させる障害部を備えることができる。障害部を備えることで、追加の細胞がキャビティに進入し堆積することが抑制される。このため、細胞観察に適した状態で細胞をキャビティに充填できるようになる。

【0013】

また、こうした障害部を備えることで、細胞を捕捉するためのキャビティの開口を拡大することができるようになり、その結果、キャビティへの細胞の進入を促進することができ、細胞がキャビティに捕捉される割合を高めることができる。これらの結果、細胞観察に適した状態の細胞のキャビティへの充填率（以下、単に、充填率という。）が向上される。

【0014】

以上のことから、本トラップ構造体を用いることで、細胞タイムラプス観察など、細胞の分離、細胞についての種々の観察や細胞分離を効率的に行うことができる。

【0015】

本明細書において、「トラップ構造体」とは、細胞を捕捉するための１又は２以上の要素からなる構造体を意味している。より好ましくは、一つの標的細胞を捕捉するのに好適な構造体を意味している。

【0016】

また、本明細書において、「細胞の充填率」とは、細胞捕捉部のキャビティに、単一の標的細胞のみ、又は単一の標的細胞と単一の娘細胞とのみが充填（捕捉）されている状態のキャビティ数を分子とし、評価に供した全てのキャビティを分母とした場合の割合（％）をいう。

【0017】

また、本明細書において、「細胞」とは、特に限定するものではなく、動物細胞、植物細胞、これら以外の真核細胞、原核細胞等が挙げられる。なかでも、単一細胞に分離し、捕捉することにより観察等に供することに好適な細胞が挙げられる。かかる細胞としては、その種類や大きさは特に限定されないが、例えば、酵母細胞などの真核微生物、大腸菌、乳酸菌などの細菌、赤血球や白血球などの血球、ＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞）、昆虫細胞などの浮遊細胞等が挙げられる。

【0018】

以下、本明細書の実施形態としての、トラップ構造体、トラップ構造体を複数個備える細胞トラップ領域を備えるデバイス等について適宜図面を参照しながら説明する。

【0019】

（トラップ構造体）
本トラップ構造体は、所定の方向性で移動する細胞を捕捉するためのトラップ構造体である。所定の方向性で移動する細胞とは、例えば、培地などの流動性の媒体を伴って、重力、ポンプ等などによる外力（圧送力）等によって移動方向が規定されて移動開始した細胞を意味している。細胞は、移動開始時には一定の方向性が付与されていても、その後、相互にあるいは他の物体等と衝突又は接触して移動方向が変化する場合があるが、このような場合であっても、依然として、移動開始時とは異なる移動のための異なる方向性が別途規定されない限り、所定の方向性で移動する細胞に該当する。以下の説明において、所定の方向性に沿う軸を軸Ａという場合がある。

【0020】

図１には、本トラップ構造体の一例であるトラップ構造体２を示し、図１（ａ）は、トラップ構造体２の平面図であり、図１（ｂ）は、トラップ構造体２の斜視図である。図１に示すように、トラップ構造体２は、例えば、平坦な表面を有する基材上に、細胞捕捉部４と、連通部１６と、障害部２０と、を備えることができる。また、図２には、本トラップ構造体における細胞捕捉部の他の例を示す。本トラップ構造体は、これらの図面に限定されるものではないが、以下の説明では、本開示の理解の容易のために基本的にこれらの図面を参照して図面に開示される部材番号を使用して説明する。なお、これらの図面においては、トラップ構造体２は、いずれも、細胞が移動する所定の方向性に正確に沿って備えられている。

【0021】

（細胞捕捉部）
細胞捕捉部４は、細胞が移動する所定の方向性における上流側（以下、単に、「上流側」ともいい、所定方向性における下流側を単に、「下流側」ともいう。）に開口する凹状のキャビティ６を構成することができる。細胞捕捉部４がかかるキャビティ６を有することで、細胞をキャビティ６に捕捉し、安定して保持することができる。

【0022】

（キャビティ）
キャビティ６は、細胞を捕捉可能に構成していればその材料や形状等は特に限定されない。キャビティ６が備える、上流側に開口する部分は、上流側から細胞が進入する細胞進入部を構成することができる。また、当該開口部分は、同時に、余剰の細胞をキャビティ６から排出する細胞排出部も構成することができる。

【0023】

キャビティ６は、標的とする細胞を捕捉するために適したサイズを有することが好ましい。例えば、その上流側の開口部分は、標的とする細胞の直径よりも大きい開口であることが好ましい。例えば、酵母を標的細胞とする場合、キャビティ６の開口サイズ（幅）は、５μｍ以上１５μｍ以下程度とすることができる。

【0024】

特に限定するものではないが、キャビティ６の開口幅を、後述する障害部２０の幅よりも広くすることが障害部２０による余剰細胞の堆積抑制効果を発揮させつつ、細胞充填率を高めるのに効果的である。この場合、キャビティ６の開口幅は、細胞の種類や障害部２０の幅等によるが、例えば、６μｍ以上１５μｍ以下、また例えば、７μｍ以上１２μｍ以下、また例えば、８μｍ以上１１μｍ以下などとすることができる。

【0025】

また、キャビティ６の奥行き（長さ）も、特に限定するものではないが、標的細胞が堆積しやすい長さであればよく、例えば、酵母細胞を標的細胞とするときには、３μｍ以上１５μｍ以下程度とすることができる。また、キャビティ６の開口サイズ（深さ）も同様の範囲程度とすることができる。こうした開口サイズは、標的細胞の種類や形状等に応じて、また、キャビティ６の形状等に応じて適宜決定することができる。

【0026】

細胞捕捉部４は、連続するキャビティ内面を有する凹状部を有する一体的な部材として構成されてもよいが、２個又は３個のブロック体の間隙をキャビティ６及び後述する連通部１６となるように全体として細胞捕捉部４となるように構成されてもよい。

【0027】

例えば、図１に示すように、２つのブロック体８ａ、８ｂを、その対向する側面によって上流側に開いた凹状のキャビティ６となるように配置するようにしてもよい。このような２個のブロック体８ａ、８ｂで細胞捕捉部４を構成することで、対向する他の側面との間に容易に連通部１６を構築することもできる。図１に示すように、例えば、ブロック体８ａ、８ｂは、いずれも、上流側に凸である上流側断面略三角形部分（上流側部分）と断面長方形状部分（下流側部分）が一体となった柱状体であって、左右対称の一対の柱状体とすることができる。これらのブロック体８ａ、８ｂを対向配置することで、上流側部分でキャビティ６を形成し、下流側部分で連通部１６を形成する。

【0028】

（第１の傾斜部分）
また、図１に示すように、キャビティ６を、キャビティ６の奥側、すなわち、下流側に向かって徐々にキャビティが狭くなるような第１の傾斜部分を有するように構成することで、細胞の捕捉を促進し、過剰な細胞の堆積を回避できる場合がある。キャビティ６の第１の傾斜部分の形態は特に限定しないが、例えば、図１に示すように、ブロック体８ａ、８ｂの対向する側面でもあるキャビティ６の内面１０のように構成することができる。すなわち、キャビティ６の開口を規定する端縁６ａから一定の斜度で傾斜する平坦な斜面部分とすることができる。このような第１の傾斜部分は、図１に示すように、キャビティ６の対向する内面１０の全体であってもよいし、その一部、例えば、開口端縁６ａからの一定範囲であってもよい。また、第１の傾斜部分は、平面視で円弧状となるような凹状面や凸状面であってもよい。第１の傾斜部分は、好ましくは、キャビティ６の左右で略対称である。

【0029】

キャビティ６の内面１０の軸Ａに対する第１の傾斜部分の斜度αは、特に限定するものではないが、例えば、５°以上であり、また例えば、１０°以上であり、また例えば、１５°以上であり、また例えば、２０°以上であり、また例えば、３０°以上であり、また例えば４０°以上である。また、特に限定するものではないが、例えば、６０°以下であり、また例えば、５０°以下である。なお、第１の傾斜部分が平面視円弧状の場合には、キャビティ６の開口を規定する端縁６ａと当該円弧の接線との間の最大角度を斜度αとする。

【0030】

（第２の傾斜部分）
また、図１に示すように、キャビティ６からの外面１２に、細胞捕捉部４の上流側端部から下流側外方に傾斜する第２の傾斜部分を備えるようにすることで、キャビティ６への余剰の細胞の進入を抑制及び排出を促進して、細胞の堆積の回避に有利な場合がある。外面１２の第２の傾斜部分は、図１に示すように、キャビティ６の端縁６ａに始まり外面１２の全体であってもよいし、またその一部、例えば、キャビティ６の開口を規定する端縁６ａから一定範囲であってもよい。また、第２の傾斜部分は、平面視で円弧状となるような凹状面や凸状面であってもよい。第２の傾斜部分は、好ましくは、細胞捕捉部４の左右で略対称である。

【0031】

外面１２の第２の傾斜部分の軸Ａに対する斜度βは、特に限定するものではないが、例えば、５°以上であり、また例えば、１０°以上であり、また例えば、１５°以上であり、また例えば、２０°以上であり、また例えば、３０°以上であり、また例えば４０°以上である。また、特に限定するものではないが、例えば、６０°以下であり、また例えば、５０°以下である。なお、外面１２が平面視円弧状の場合には、キャビティ６の開口を規定する端縁６ａと当該円弧の接線との最大角度を斜度βとする。

【0032】

キャビティ６の開口端を構成する細胞捕捉部４の上流側端部の角度、例えば、ブロック体６ａ、６ｂの上流側を指向する２つの面１０、１２によって成される角度は、これらの斜度α、βの合計であり、例えば、１０°以上、また例えば、２０°以上、また例えば、３０°以上、また例えば、４０°以上、また例えば、６０°以上、また例えば、８０°以上であり、また例えば、１２０°以下であり、また例えば、１００°以下である。

【0033】

なお、かかる上流側端部は、例えば、図１に示すブロック体８ａ、８ｂにおける端縁６ａは、必ずしも先鋭なものでなくてもよく、丸みを帯びていたり、例えば、２μｍ以下、また例えば、１μｍ以下、また例えば、０．５μｍ以下程度の幅の面を備えるものであってもよい。

【0034】

細胞捕捉部４は、また、図２（ａ）及び同（ｂ）に示すように、平面視で、下流方向に向かってほぼ同一の大きさを備える凹状のキャビティ６を構成可能な２つのブロック体８ａ’、８ｂ’やブロック体８ａ’’、８ｂ’’を対向状に配置して構成してもよい。これらのブロック体（８ａ’８ｂ’）、（８ａ’’、８ｂ’’）は、例えば、上流側の断面略長方形部分（上流側部分）と下流側の断面略長方形部分（下流側部分）が一体となった柱状体であって左右対称の一対の柱状体とすることができる。これらのブロック体（８ａ’８ｂ’）、（８ａ’’、８ｂ’’）を対向配置することで、上流側部分でキャビティ６を形成し、下流側部分で連通部１６を形成する。

【0035】

ブロック体８ａ’’、８ｂ’’は、その開口端縁から下流側に２０°傾斜する第２の傾斜部分を備えている。こうした第２の傾斜部分は、既述のように、細胞の捕捉を促進し、過剰な細胞の体積を回避できる場合がある。なお、当該第２の傾斜部分の斜度は、既に説明した、外面１２の斜度の態様を同様に適用することができる。

【0036】

さらに、同図（ｃ）に示すように、平面視で、全体として、上流側の左右一対のブロック体９ａ、９ｂ及び下流側の中央のブロック体９ｃでこれらの側面で囲繞される空間を凹状のキャビティ６として備えるように構成することもできる。左右のブロック体９ａ、９ｂは、左右対称の一対の略台形形状の柱状体である。また、ブロック体９ｃもまた、略上流側を短辺とする略台形状の柱状体である。キャビティ６は、ブロック体９ａ、９ｂの対向する短辺を含む側面と、ブロック体９ｃの短辺を含む側面とによって規定される間隙である。この態様では、左右のブロック体９ａ、９ｂと下流側のブロック体９ｃとの間で、後述する連通部１６を容易に２つ備えることができる。すなわち、３個のブロック体９ａ、９ｂ、９ｃで細胞捕捉部４を構成することで、キャビティ６とともに２つの連通部１６を備えるように容易に構成することができる。

【0037】

さらに、図示はしないが、さらに、４個以上のブロック体から細胞捕捉部４を構成し、キャビティ６及び連通部１６を構成することもできる。

【0038】

以上、例示した細胞捕捉部４が備える特徴である、キャビティ６のサイズ、第１の傾斜部分、第２の傾斜部分、キャビティ６の開口部分を規定する細胞捕捉部４の上流側端部の形状などは、適宜組み合わせて単一の細胞捕捉部４や２以上のブロック体から構成される細胞捕捉部４に適宜適用することができる。

【0039】

（連通部）
トラップ構造体２は、細胞捕捉部４の一部においてキャビティ６の内部とキャビティ６の外部とを連通する連通部１６を備えることができる。連通部１６は、細胞の培養液のほか、意図しない細胞をキャビティから排出するための部分である。したがって、連通部１６は、標的とする細胞は通過しないが、意図しない細胞を通過するサイズに構成されることが好ましい。

【0040】

連通部１６の内径は、特に限定するものではないが、例えば、酵母を標的細胞とする場合、意図しない細胞は、標的細胞から出芽した娘細胞であるが、この場合には、連通部の内径（幅）は、２μｍ以上３μｍ以下程度とすることができる。また、連通部の奥行き（長さ）も、特に限定するものではないが、意図しない細胞が堆積しづらい長さであればよく、例えば、酵母細胞の娘細胞等を意図しない細胞とするときには、２μｍ以上５μｍ以下程度とすることができる。さらに、連通部の内径（深さ）は、同様の範囲程度とすることができるが、記述のキャビティと同等程度であってもよい。こうした連通部の内径は、標的細胞や意図しない細胞の種類に応じて、また、連通部の形状等に応じて適宜決定することができる。

【0041】

キャビティ６における連通部１６の形成個所及び個数は特に限定するものではないが、キャビティ６内でもより下流側に１個又は２個程度備えることが好ましい。例えば、キャビティ６の最下流側に１個又は２個備えることができる。

【0042】

例えば、図１に例示するように、単一の連通部１６を、キャビティ６の中央最下流側に備えることもできる。この連通部１６は、２つのブロック体８ａ、８ｂの下流側部分の対向する側面１１の間隙を連通部１６としている。図２（ａ）及び（ｂ）に示す連通部１６も、２つのブロック体（８ａ’、８ｂ’）（８ａ’’、８ｂ’’）の下流側基部の対向する側面を連通部１６としている。

【0043】

また、図２（ｃ）に示すように、３つのブロック体９ａ、９ｂ、９ｃで細胞捕捉部４を構成している場合には、最下流に配置されるブロック体９ｃと上流側の一方のブロック体９ａとの対向する側面１３ｃ、１３ａによって規定される間隙及びブロック体９ｃと上流側の他方のブロック体９ｂとの対向する側面１３ｃ、１３ｂによって規定される間隙をそれぞれ連通部１６ａ、１６ｂとすることができる。

【0044】

（障害部）
トラップ構造体２は、細胞捕捉部４の上流側で、キャビティ６に進入しようとする細胞を衝突又は接触させて細胞の移動方向を変化させる障害部２０を備えることができる。障害部２０を備えることにより、キャビティ６における余剰の細胞の堆積を抑制又は回避できる。加えて、本開示を拘束するものではないが、細胞の進行方向を変化させて移動させることができるため、他のキャビティ６への細胞捕捉率を向上させることができると推測される。

【0045】

障害部２０は、例えば、図１に示すように、所定断面形状の柱状体等として平坦な基材表面に立設されることができる。障害部２０は、キャビティ６へ余剰の細胞の進入及び堆積を抑制するが、適切な細胞の進入を抑制しないように構成されることが好ましい。より具体的には、例えば、キャビティ６に１個以上２個以下の標的細胞を収容可能に構成されることが好ましい。このため、障害部２０は、全体として、キャビティ６の開口部分の幅を超えない幅を有し、キャビティ６への細胞の進入を妨げない奥行きに構成され、そのような位置に備えられる。

【0046】

こうしたことから、障害部２０は、例えば、標的細胞を酵母とする場合、その最大幅は、例えば、１μｍ以上８μｍ以下であり、また例えば、２μｍ以上６μｍ以下であり、また例えば、３μｍ以上５μｍ以下である。また、その最大奥行きも３μｍ以上６μｍ以下とされる。また、障害部２０は、その最下流側位置と細胞捕捉部４の最上流側位置との軸Ａに沿う間隔が、例えば、４μｍ以上、また例えば、４．５μｍ以上、また例えば、５μｍ以上となるように配置される。なお、当該間隔は、特に限定するものではないが、例えば、標的細胞の差し渡し径の１倍～３倍程度であることが好ましい。標的細胞が酵母の場合、例えば、約５μｍ以上約１５μｍ以下であり、同大腸菌の場合、約２μｍ以上約６μｍ以下であり、同乳酸菌の場合、約１．５μｍ以上約４．５μｍ以下であり、同赤血球の場合、約７．５μｍ以上約３３μｍ以下であり、同白血球の場合、約１４μｍ以上約４２μｍ以下であり、同ＣＴＣの場合、約２０μｍ以上約６０μｍ以下であり、同昆虫細胞の場合、約１８μｍ以上約５４μｍ以下である。

【0047】

障害部２０は、細胞捕捉部４の上流側に備えられるが、細胞捕捉部４のキャビティ６の開口部分の上流側に備えられることが、余剰の細胞の堆積を抑制できる点において好適である。また、より好適にはキャビティ６の開口部分の略中央部、さらに好適には、図１に示すように、中央部の上流側に備えられる。こうすることで、キャビティ６における余剰の細胞の堆積を効果的に抑制できる。また、障害部２０の両側からキャビティ６へ均等に細胞が進入可能となる。加えて、同時に、キャビティ６の両側から、均等に余剰の細胞の進入の抑制と排出が可能となる。

【0048】

障害部２０によって、細胞がキャビティ６の側方側のみから進入するように構成されていることが好適である。このように構成することで、細胞が所定方向性に従ってその正面からはキャビティ６に進入できなくなるため、キャビティ６における所定方向性に従う細胞の堆積を抑制又は回避するとともに細胞の排出を促進できる。また、障害部２０によって、細胞がキャビティ６の斜め上流側のみから進入するように構成されていることも好ましい。こうすることで、キャビティ６における所定方向性での細胞の堆積をより効果的に抑制又は回避するとともに、細胞の排出をより一層促進できる。こうした構成については、後述する。

【0049】

（障壁部）
障害部２０は、細胞を衝突又は接触させて移動方向を変化させるものであればよく、障害部２０は、その全ての側面部分において、細胞を衝突又は接触させて移動方向を変化させることができる。なかでも、障害部２０の上流側が、所定の方向性で到来する細胞に対するに主要な障壁部２４として機能する。障壁部２４は、少なくとも障害部２０の最も上流側部分の外面２０ａに適用することができる。例えば、図１に示すように、障壁部２４を、所定方向性に対してほぼ直交する平面である障害部２０の外面２０ａとして構成することができる。また例えば、障壁部２４は、上流側に凸状の曲面を有する外面２０ａとして構成してもよいし、上流側に凸状の略三角形を構成する２つの斜面を有する外面２０ａとして構成してもよいし、所定方向性に全体として直交する波線状を描く凹凸面を有する外面２０ａとして構成してもよい。

【0050】

（ガイド部）
障害部２０は、さらに、細胞のキャビティ６への進入をガイド又は促進するガイド部２６を備えることができる。ガイド部２６は、細胞の衝突又は接触によって、細胞をキャビティ６へ誘導することができる。ガイド部２６は、キャビティ６内へ細胞の進入を促進することにより、障害部２０の存在によって細胞のキャビティ６への進入や排出が抑制されすぎないようにすることができる。

【0051】

（第３の傾斜部分）
ガイド部２６は、特に限定するものではないが、例えば、障害部２０の下流側において下流側を指向する外面２０ｂに適用することができる。特に限定するものではないが、例えば、図１に示すように、ガイド部２６の下流側外面２０ｂを、ガイド部２６が下流側に向かって略テーパ状となるように、２つの端縁２０ｃからそれぞれキャビティ６の中心に向かって傾斜する第３の傾斜部分を有するように構成することができる。第３の傾斜部分は、好ましくは、障害部２０の左右で略対称である。

【0052】

第３の傾斜部分の形態は特に限定しないが、例えば、図１に示すように、端縁２０ｃから一定の斜度で傾斜して下流側端部２０ｄにまで至る斜面としてもよいし、端縁２０ｃから一定範囲のみの斜面としてもよいし、平面視で下流側に凸状又は凹状となる円弧状面を有するようにしてもよい。

【0053】

なお、第３の傾斜部分の形態は、細胞捕捉部４のキャビティ６における第１の傾斜部分の形態に概ね倣っていることが好ましい。すなわち、第１の傾斜部分が直線的な斜面を有する場合には、第３の傾斜部分は、第１の傾斜部分に倣った斜度の斜面を有することが好ましく、第１の傾斜部分が凹状である場合には、第３の傾斜部分には、当該凹状に倣う凸状であることが好ましい。

【0054】

第３の傾斜部分の軸Ａに対する斜度γは、特に限定するものではないが、例えば、Ａ軸に対して５°以上であり、また例えば、１０°以上であり、また例えば、１５°以上であり、また例えば、２０°以上であり、また例えば、３０°以上であり、また例えば４０°以上である。また、特に限定するものではないが、例えば、６０°以下であり、また例えば、５０°以下である。なお、外面２０ｂが平面視円弧状面を有する場合には、端縁２０ｃと当該円弧の接線との最大角度を斜度γとする。

【0055】

なお、２つの第３の傾斜部分を備える外面２０ｂによって構成される障害部２０の下流側端部の角度は、これらの合計であり、例えば、１０°以上、また例えば、２０°以上、また例えば、３０°以上、また例えば、４０°以上、また例えば、６０°以上、また例えば、８０°以上であり、また例えば、１２０°以下であり、また例えば、１００°以下である。

【0056】

なお、障害部２０の下流側端部２０ｄの形状は、図１に示すように、必ずしも先鋭なものでなくてもよく、丸みを帯びていたり、例えば、２μｍ以下、また例えば、１μｍ以下、また例えば、０．５μｍ以下程度の幅の面を備えるものであってもよい。

【0057】

障害部２０がこうした第３の傾斜部分を有するガイド部２６を備えることにより、既述のように、細胞がキャビティ６の斜め上流側のみから進入するように構成して、キャビティ６への細胞の進入を促進するとともに、余剰の細胞の堆積を抑制できる。

【0058】

障害部２０を備えるとき、なかでも、ガイド部２６、さらには、第３の傾斜部分を備えるようなガイド部２６を備えるとき、キャビティ６の内面１０が既述のように第１の傾斜部分を有することで、より一層細胞のキャビティ６への流入方向を規定することができるようになるとともに、キャビティ６からの余剰の細胞を排出しやすくなる。なお、第３の傾斜部分の斜度γとキャビティ６の第１の傾斜部分の斜度αは、同一か又はその差が１０°以内、好ましくは５°以内である。さらに、このとき、細胞捕捉部４が第２の傾斜部分を有していれば、一層、余剰の細胞の排出が容易となる。

【0059】

以上説明した障害部２０は、全体として、図１に示すように、下流側に三角形の頂点を有する略五角形の柱状体として形成できるほか、下流側を指向する断面略三角形状、断面略円形状、軸Ａに沿って長い断面略楕円形状、断面方形状、断面略菱形状、他の断面略多角形形状等の柱状体として構成することができる。

【0060】

トラップ構造体２は、以上説明した細胞捕捉部４、連通部１６及び障害部２０を備えることができる。トラップ構造体２によれば、細胞捕捉部４のみならず、新たに障害部２０を備えることで、より理想的な細胞分離及び捕捉を実現することができる。また、障害部２０を備えることのメリットは、細胞の堆積抑制及び充填促進であって、細胞の種類や細胞の形状等にかかわらず発揮されると考えられる。

【0061】

典型的なトラップ構造体２の細胞捕捉部４及び連通部１６は、平坦な表面を備える基材に立設される併せて２個又は３個のブロック体を有し、２個又は３個のブロック体の間隙をキャビティ６及び前記連通部１６となるように構成されうる。そして、障害部２０もまた、表面に立設されるブロック体として構成されうる。

【0062】

本トラップ構造体２及びこれらの構成要素の高さは、トラップ構造体２を作製するのにあたって、概ね同一の高さとなる。当該高さは、特に限定するものではないが、培養液の流動性や標的細胞の種類に応じて適宜決定される。例えば、酵母細胞を標的細胞とする場合は、４μｍ以上６μｍ以下とすることができる。

【0063】

また、トラップ構造体２の平面サイズ、すなわち、細胞捕捉部４、連通部１６及び障害部２０によって規定される最大幅×最大奥行きは、特に限定するものではなく、捕捉しようとする細胞の大きさに基づいて適宜設定される。例えば、概ね、３０μｍ×３５μｍ以内である。また、複数のトラップ構造体２を配列するときには、各トラップ構造体２は幅方向に１０μｍ以上１５μｍ以下間隔を置いて、また、奥行き方向（所定方向性に沿う方向）にも、１０μｍ以上１５μｍ以下間隔を置いて配置することができる。また例えば、特に限定するものではないが、こうした幅方向及び奥行き方向におけるトラップ構造体構造体２の間隔は、標的細胞の差し渡し径の２倍～３倍程度が好ましい。したがって、標的細胞が酵母細胞の場合、約１０μｍ以上１５μｍ以下であり、同大腸菌の場合、約４μｍ以上約６μｍ以下であり、同乳酸菌の場合、約３μｍ以上約４．５μｍ以下であり、同赤血球の場合、約１５μｍ以上約３３μｍ以下であり、同白血球の場合、約２８μｍ以上約４２μｍ以下であり、同ＣＴＣの場合、約４０μｍ以上約６０μｍ以下であり、同昆虫細胞の場合は、約３６μｍ以上約５４μｍ以下である。

【0064】

さらに、例えば、図３に示すように、複数の本トラップ構造体２をアレイ状に配列することもできる。例えば、複数のトラップ構造体２を配列した列が、軸Ａに対して直交するように複数列配列されるとき、隣り合う列における個々のトラップ構造体２の位置が、軸Ａに沿っては重ならないように配列されることが好ましく、より好ましくは１列おきに（２列毎に）、軸Ａにそってトラップ構造体２の位置が重複するように配列される。

【0065】

また、個々のトラップ構造体２は、キャビティ６の開口部分の中心軸が所定方向性に沿う軸Ａに沿って配置されることが好ましく、より好ましくは、当該中心軸が軸Ａに忠実に沿って配置される。

【0066】

本トラップ構造体２は、特に限定するものではないが、いずれかにポリジメチルシロキサンなどのシリコーンポリマー、ポリメチル（メタ）アクリレートエタノールアミンクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの公知のポリマー、ガラス材料、セラミックス材料等を用いて、これらの要素を備えるように成形することができる。本トラップ構造体２は、概して、後述するマイクロ流路デバイスにおいて細胞トラップ領域内に備えられる。

【0067】

（デバイス）
本明細書に開示されるデバイスは、所定の方向性で移動する細胞を捕捉するためのトラップ領域を備えるデバイスである。かかるデバイスのトラップ領域に、本トラップ構造体を備えることができる。かかるデバイスによれば、本トラップ構造体を備えるために、細胞観察に適した状態で細胞を分離・捕捉でき、また、効率的に細胞を捕捉することができる。このため、細胞タイムラプス観察などに好適に用いることができる。

【0068】

本明細書に開示されるデバイスの一例であるデバイス５０を示し、図４（ａ）は、トラップ領域７０を含むマイクロ流路を備えるデバイス５０の平面図であり、図４（ｂ）は、マイクロ流路６０の拡大図である。図４に示すように、デバイス５０は、例えば、平坦な表面を有する基材５２で被覆された状態で複数のマイクロ流路６０を備えることができる。本デバイスは、これらの図面に限定されるものではないが、以下の説明では、本開示の理解の容易のために基本的にこれらの図面を参照して図面に開示される部材番号を使用して説明する。

【0069】

例えば、図４に示すように、デバイス５０は、マイクロ流路６０を複数備えている。デバイス５０は、基材としてのガラスプレート５２と、シリコーンポリマー等を用いて成形した適度な剛性と可撓性を備える約３ミリ厚程度のシート５４からなる。ガラスプレート５２にシート５４を接着剤等が固定されている。

【0070】

シート５４は、複数のマイクロ流路６０を備えている。マイクロ流路６０は、細胞トラップ領域７０を備えているほか、培養液を導入するための導入ポート６２と、排出ポート６４と、細胞（懸濁液）を導入するポート６６と、これらを連絡する流路群６８と、を備えている。各マイクロ流路６０において、所定の方向性とは、流路群６８の流路６８ａにおいて、細胞導入ポート６６から排出ポート６４に至る経路において細胞トラップ領域７０における細胞の移動方向となる。

【0071】

なお、マイクロ流路６０の流路高さは特に限定するものではないが、例えば、５μｍに設定されている。また、流路群６８及び細胞トラップ領域７０は、いずれもその幅が２１０μｍに設定されている。流路群６８及び細胞トラップ領域７０は、シート５４の最表面に形成されてガラスプレート５２で覆われている。また、各種ポート６２、６４、６６は、シート５４のそれぞれ流路群６８及び細胞トラップ領域７０が形成されている側から、反対側の表面に貫通し、当該反対側において開口するように構成されている。

【0072】

細胞トラップ領域７０には、本トラップ構造体が１個又は２個以上、好ましくは３個以上配置されている。本トラップ構造体は、既に図１～図３を参照して説明した各種形態で、細胞分離、捕捉、観察に適した状態で配列されている。典型的には、本トラップ構造体は、図３に示すように、アレイ状に配列されている。好ましくは、隣りあう列のトラップ構造体は、所定の方向に沿っては重複しないように、各列が配置される。

【0073】

なお、図４（ｂ）に示す形態では、細胞トラップ領域７０は、流路群６８の一部として設けたが、これに限定しないで、流路群６８に連絡するチャンバーを形成し、当該チャンバーを細胞トラップ領域７０とすることもできる。また、細胞トラップ領域７０は、１つのマイクロ流路６０において２個以上備えることもできる。

【0074】

次に、こうしたデバイス５０の使用方法について説明する。例えば、以下には、デバイス５０で酵母をトラップ構造体２に捕捉して、タイムラプス解析等に供する過程について説明する。

【0075】

まず、培養液を培養液導入ポート６２と排出ポート６４のそれぞれにシリコンチューブを接続するとともに、細胞導入ポート６６を封止した状態で、培養液導入ポート６２にマイクロシリンジポンプを用いて培地を導入した。その後、別のシリンジポンプを用いて、封止を解除しシリコンチューブを接続した細胞導入ポート６６から、細胞懸濁液を注入して、細胞を液送する。

【0076】

細胞の液送に伴い、細胞は、細胞トラップ領域７０に到達し、一定の方向性でトラップ構造体２を指向して移動する。細胞の移動に伴い、細胞は、障害部２０に衝突又は接触し、あるいは、キャビティ６に捕捉され、あるいはキャビティ６から排出されながら、下流方向に移動する。

【0077】

キャビティ６に分離され捕捉された細胞、例えば、１つの母親細胞、又は母親細胞と娘細胞は、細胞トラップ領域７０に供給される培地によって培養される。キャビティ６に捕捉された細胞は、単一細胞等として分離されたものとして使用可能であるほか、タイムラプス観察などに供することができる。したがって、デバイス５０は、細胞分離デバイス細胞観察デバイスなどとして使用されうる。また、こうしたデバイス５０は、診断を含む医療用デバイスとして、また、創薬のためのスクリーニングデバイスとしても有用である。

【実施例】

【0078】

以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。

【実施例1】

【0079】

（酵母を捕捉するためのマイクロ流路デバイスの作製）
本実施例で作製したマイクロ流路デバイス（以下、単にＭＦＤという。）の全体図及びマイクロ流路の詳細図を図４（ａ）及び同（ｂ）にそれぞれ示す。図４（ａ）に示すように、ＭＦＤ上に形成する複数のマイクロ流路のそれぞれにおいて、酵母細胞をトラップする領域を１本に設定し、培養液導入ポート、廃液ポート及び細胞懸濁液導入ポートとして、直径１ｍｍの穴を図に示す位置にそれぞれ一ヵ所ずつ設定した。流路幅および流路深さは２１０μｍおよび５μｍに設定した。また、ＭＦＤの基材にはシリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いた。ＭＦＤの基板には、高倍率での顕微鏡観察を可能とするため、カバーグラス（マツナミＣ０２５６０１）を用いた。基板であるカバーグラスの寸法上の制限から、ＰＤＭＳ基材の外形寸法は縦２４ｍｍ×横５９ｍｍとし、ポートへのチューブ接続のため、ＰＤＭＳは厚さ３ｍｍとした。

【0080】

評価に供したトラップ構造体を図５及び図６Ａ～６Ｃに示す。全てのトラップ構造体について、以下の仕様とした。すなわち、各トラップ構造体間の間隔は縦横１２μｍ、流路側壁との間隔は最少１３μｍとし、隣り合う列のトラップが交互に並ぶように配置した。総トラップ数は５２０ユニットとなるようにした。なお、連通部間隔について２．５μｍを設定した。以下に、各トラップ構造体について説明する。

【0081】

＜構造体Ａ＞
図５に示すように、上流側に1つのブロック、下流側に２つのブロックを左右に並べた。酵母細胞は下流部の２つのブロックによって捕捉され、娘細胞は下流側のブロック間のスリットから排出される。下流側のブロックの上部には、左右４５°ずつ傾斜をつけた。

【0082】

＜構造体Ｂ＞
図６Ａに示すように、特許文献１記載のブロック構成とした。

【0083】

＜構造体Ｃ＞
図６Ｂに示すように、構造体Ｂについて、左右のブロックの上部に、それぞれ２０°の傾斜をつけ、さらに当該傾斜面に続く外側面にも１０°の傾斜をつけた。

【0084】

＜構造体Ｄ＞
図６Ｃに示すように、上流側に左右２つのブロック、下流側に１つのブロックから構成した。

【0085】

こうしたトラップ構造体のアレイを細胞トラップ領域に備えるマイクロ流路を、ＰＤＭＳを基材として作製し、これをカバーガラスに固定してＭＦＤを作製した。

【実施例2】

【0086】

（マイクロ流路デバイスの評価）
プラスチック製シリンジ（テルモ、５ｍｌ容）に５ｍｌのＹＰＤ培地（ポリペプトン２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ、アデニン１００ｍｇ／ｌ）を入れ、マイクロシリンジポンプ（Ｃｈｅｍｙｘ社、ヒュージョンタッチ２００、ＣＸ０７２００）に装着した。シリンジに濾過滅菌フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ、ポアサイズ０．２２μｍ）を装着し、シリコンチューブ（外径１ｍｍ、内径０．５ｍｍ）をつないでＭＦＤの培養液導入ポートと接続した。ＭＦＤの細胞懸濁液導入ポートには封止用プラグを挿入し、廃液ポートにはシリコンチューブを接続して廃液用チューブに導入した。流速２０μｌ／ｍｉｎでＹＰＤ培地を液送してＭＦＤ流路に培地を充填した。流路への細胞の導入時は、ＹＰＤ培地を用いてＯＤ₆₀₀＝０．４に調整した酵母細胞懸濁液１ｍｌを入れた５ｍｌ容のシリンジを別のマイクロシリンジポンプに装着し、封止用プラグを取り除いたのちシリコンチューブを細胞懸濁液導入ポートに接続して細胞を液送した。なお、酵母菌株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＢＹ４７４１株をＹＰＤ培地で一晩培養して用いた。

【0087】

ＭＦＤへの細胞懸濁液の導入の様子は、顕微鏡ＩＸ５１Ｎ－ＳＰ（オリンパス株式会社製）もしくはＢＺ－９０００（キーエンス株式会社製）を用い、倍率４０倍もしくは６０倍（油浸）の対物レンズを用いてガラス基板側から観察した。結果を図７に示す。

【0088】

図７に示すように、構造体Ｂや構造体Ｃでは空のトラップが複数見られた。また、構造体Ｄでは空のトラップは少ないものの、細胞捕捉部への細胞の積み重なりが見られた。一方、上流側に障害部を設定した構造体Ａでは、細胞捕捉部への細胞の積み重なりはほとんど観察されず、またほとんどのトラップに酵母細胞が捕捉されていた。

【0089】

また、各トラップ構造体において、細胞分裂が観察可能な状態で捕捉されている率（充填率）を算出した。各トラップ形状につき約２００個のトラップを算出に供した。なお、算出条件は以下のとおりとした。結果を図８に示す。

【0090】

＜充填率の算出条件＞
充填率は、母親細胞のみ、もしくは母親細胞と娘細胞が捕捉されている率とした。ただし、３個以上の細胞が捕捉されている場合は除外した。算出に供したトラップ数は、構造体Ａは２３０個、構造体Ｂは２０８個、構造体Ｃは２０８個、構造体Ｄは２０９個であった。

【0091】

図８に示すように、障害部ブロックを有する構造体Ａの充填率は、約９０％に達した。評価に供した構造体中、最も高い充填率であり、構造体Ａが高効率で細胞を捕捉できることがわかった。また、構造体Ｂの充填率は約６０％となり、その改変型である構造体Ｃの充填率は約７４％であり、斜面構造が一定の効果を奏していることがわかった。

【0092】

以上示したように、障害部ブロックを配置した構造体Ａの細胞充填率が最も高くなった。構造体Ａは、上流部にあえて邪魔石となるブロックを設置した。これらが細胞の積み重なりを防ぎ、また捕捉部へと細胞を誘導しているものと考えられる。さらに、構造体Ａは、下流側のブロックも上部の傾斜をつけた設計としている。構造体Ｃの結果を考慮すると、こうした傾斜構造も構造体Ａにおける細胞の堆積抑制及び充填率向上に貢献しているものと考えられる。

【実施例3】

【0093】

（障害部の効果の評価１）
実施例１で作製した構造体Ｂと、当該構造体Ｂの細胞捕捉部の上流側に図９（ａ）に示すサイズの障害ブロック（高さは、構造体Ｂと同一である。）を配置した構造体Ｅと、を、図９（ｂ）に示すように、同一流路内の左右側に配置し、全体として図１０に示すＭＦＤ（マイクロ流路デバイス）を作製した。

【0094】

実施例２と同様の方法で、ＹＰＤ培地をＭＦＤの流路に充填して、ＹＰＤ培地で調製した酵母Ｓ. ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＢＹ４７４１株の細胞懸濁液を導入し、トラップ構造体に細胞が捕捉される様子を顕微鏡ＢＺ－９０００（キーエンス株式会社製）に６０倍（油浸）の対物レンズを装着して観察した。

【0095】

観察された全トラップ数に対する母親細胞のみ、もしくは母親細胞と娘細胞が捕捉されている率を充填率として算出した。算出に供したトラップ数は、構造体Ｂは３００個、構造体Ｅは１８８個であった。障害部のない構造体Ｂの充填率は４８％であり、障害部ブロックを配置した構造体Ｅの充填率は６８％（構造体Ｂにおける充填率に対する％は１４２％）であり、障害部ブロックを配置することが充填率を高める効果を奏していることがわかった。

【実施例4】

【0096】

（障害部の効果の評価２）
実施例１で作製した構造体Ａを、図１１（ａ）に示すように改変して障害部を有しない構造体を構造体Ｆとし、上流側に障害部ブロックを配置したものを構造体Ｇとした。構造体Ｆ及び構造体Ｇを、図１１（ｂ）に示すように、同一流路内の左右に配置したＭＦＤを作製した。ＭＦＤ全体構造は図１０と同様である。

【0097】

実施例３と同様にＹＰＤ培地と酵母細胞懸濁液をＭＦＤに導入し、充填率を算出した。算出に供したトラップ数は、構造体Ｆは２９３個、構造体Ｇは１６３個であった。障害部のない構造体Ｆの充填率は６１％であり、障害部ブロックを配置した構造体Ｇの充填率は７４％（構造体Ｆにおける充填率に対する％は１２１％）であり、障害部ブロックを配置することが充填率を高める効果を奏していることがわかった。

【0098】

１細胞タイムラプス観察においては、一度に計測できる細胞が多いほど実験効率の面で有利である。このため、より多くの細胞が細胞分裂を観察できる状態で捕捉されていることが重要である。トラップへの細胞の積み重なりは流路の目詰まりを引き起こし、また細胞分裂の観察にも障害となることから、構造体Ａのように、障害部を配置することで、タイムラプス観察を初めとして細胞分離や細胞観察等において種々の効果を発揮すると期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】