特許 7193082 血管組織機能低下リスクマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-12

(45)【発行日】2022-12-20

(54)【発明の名称】血管組織機能低下リスクマーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/92 20060101AFI20221213BHJP

【ＦＩ】

G01N33/92 A

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2018247329

(22)【出願日】2018-12-28

(65)【公開番号】P2020106474

(43)【公開日】2020-07-09

【審査請求日】2021-10-07

(73)【特許権者】

【識別番号】000106324

【氏名又は名称】サンスター株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504177284

【氏名又は名称】国立大学法人滋賀医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 文昭

(72)【発明者】

【氏名】曽野 陽子

(72)【発明者】

【氏名】松本 元伸

(72)【発明者】

【氏名】森野 勝太郎

(72)【発明者】

【氏名】前川 聡

(72)【発明者】

【氏名】近藤 慶子

【審査官】三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１３－０４０７８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５１５６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－２２７６１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１１４７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００４／０６５９６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１１－２５７１４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００１－０６６３０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－１０６４６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００５／０５５８１０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２６１２５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】本田浩一，慢性腎臓病と酸化HDL,酸化HDLサブフラクションとの関係，Therapeutic Research，2012年08月20日，Vol.33 No.8，Page.1164-1166

【文献】ITO Fumiaki，The Application of a Modified d-ROMs Test for Measurement of Oxidative Stress and Oxidized High-Density Lipoprotein，International Journal of Molecular Sciences，2017年02月21日，Vol.18 No.2，Page.454

【文献】河井貴行，酸化ストレスマーカー「d‐ROMs」と動脈硬化危険因子との関係，医学検査，2012年04月25日，Vol.61 学会特集号(CD-ROM)，Page.ROMBUNNO.10

【文献】矢野 友規，「他領域からのトピックス」 他科における最新の診断方法 －消化器内視鏡検査－，日耳鼻，2014年，Vol.117，Page.881-886

【文献】公文義雄，HDLの多面的作用とその異常－善玉HDLと悪玉HDL HDLの抗酸化作用とPON1,PAF-AH，医学のあゆみ，2013年05月11日，Vol.245 No.6，Page.501-504

【文献】吉田 博，動脈硬化危険因子の低減に寄与する機能性食品成分とリポ蛋白の質的評価に関する研究，日本栄養・食糧学会誌，2022年，Vol.75 No.1，Page.3-10

【文献】浅原哲子，多施設肥満症コホートにおける脳心血管イベント発症予測指標の探索－CAVI・新規酸化LDL－，肥満研究，2014年10月10日，Vol.20 No.Supplement，Page.184

【文献】SHAO Baohai，Methionine oxidation impairs reverse cholesterol transport by apolipoprotein A-I，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008年08月26日，Vol.105 No.34，Page.12224-12229

【文献】宮下洋，ピタバスタチンによるCardio ankle vascular index(CAVI)の改善とそれへの酸化ストレスの関与，日本動脈硬化学会総会・学術集会プログラム・抄録集，2007年06月27日，Vol.39th，Page.262

【文献】Yamaguchi Takashi，Bezafibrate Ameliorates Arterial Stiffness Assessed by Cardio-Ankle Vascular Index in Hypertriglyceridemic Patients with Type 2 Diabetes Mellitus，Journal of Atherosclerosis and Thrombosis，2019年，Vol.26 No.7，Page.659-669

【文献】Wakabayashi Ichiro，Cysteinylated transthyretin as a discriminator of cardiovascular risk in patients with diabetes mellitus，Clinica Chimica Acta，2017年04月20日，Vol.470，Page.46-50

【文献】II．検査編，循環器病の診断と治療に関するガイドライン（2011-2012 年度合同研究班報告） 血管機能の非侵襲的評価法に関するガイドライン Guidelines for non-invasive vascular function test（ JCS 2013），2014年，Page.7-46

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／９２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬの重量若しくは濃度、又は酸化ＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度を、血液試料のＨＤＬの重量若しくは濃度、又は酸化ＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度で除した値を指標として、当該血液試料が血管内皮機能の低下した対象由来かを判別する方法。

【請求項2】

（ｉｉ）血液試料のヒドロペルオキシド量を反映する吸光度若しくは蛍光強度を、血液試料のＨＤＬの重量若しくは濃度、又はＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度で除した値を指標として、当該血液試料が血管内皮機能の低下した対象由来かを判別する方法。

【請求項3】

（Ａ１）血液試料の酸化ＨＤＬの重量若しくは濃度、又は酸化ＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度を測定する工程、及び
（Ｂ）血液試料のＨＤＬの重量若しくは濃度、又はＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度を測定する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

（Ａ２）血液試料のヒドロペルオキシド量を反映する吸光度若しくは蛍光強度を測定する工程、及び
（Ｂ）血液試料のＨＤＬの重量若しくは濃度、又はＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度を測定する工程、
を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

酸化ＨＤＬの重量若しくは濃度、又は酸化ＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度、又はヒドロペルオキシド量を反映する吸光度若しくは蛍光強度の測定が、
（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により行われる、
請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

酸化ＨＤＬの重量若しくは濃度、又は酸化ＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度、又はヒドロペルオキシド量を反映する吸光度若しくは蛍光強度の測定が、
さらに、
（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により行われる、
請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ＨＤＬの重量若しくは濃度、又はＨＤＬ量を反映する吸光度若しくは蛍光強度の測定が、ＨＤＬ直接法により行われる、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項8】

前記血管内皮機能の低下が、血管内皮細胞の働きの低下、血管の硬化、血管の詰まり、及び血管壁の厚さの増加からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血管組織機能低下リスクマーカーに関する。

【背景技術】

【0002】

血管は血液を介して、体の隅々にわたって、生命維持に必要な物質等や不必要な物質等を運搬する機能や免疫機能などを担う重要な組織であり、その血管組織の機能の低下は動脈硬化症や高血圧症など様々な疾病の要因の一つであることがわかりつつある。血管組織機能の評価方法としては、血管内皮機能や動脈スティフネスを指標とした評価方法などが挙げられるが、特に血管内皮機能の変動は血管組織の機能低下の初期段階で発生すると考えられている。疾病が発症する前の段階でその事実を把握できれば、効果的な疾病発症の予防策を講じることが可能となるため、血管組織機能の状態を健康診断時に測定するなど定常的に検査し、その変動を把握することは、それら疾病の発症予防の観点において非常に重要である。

【0003】

現在使用されている血管内皮機能の評価方法としては、プレチスモグラフィ、血流介在血管拡張反応（ＦＭＤ）、ＲＨ－ＰＡＴなどが、動脈スティフネスの評価方法としては、頚動脈―大腿動脈間脈波伝播速度（ｃｆＰＷＶ）、上腕―足首間脈波伝播速度（ｂａＰＷＶ）、心臓足首血管指数（ＣＡＶＩ）、スティフネスパラメータβなどが挙げられる（非特許文献１）。しかし、これらの評価方法には、高額な専用機器を必要としたり、測定の間被験者を拘束する必要があったり、１回の測定に時間を要したり、測定時における外的刺激に影響を受けやすいなど多くの課題点が存在するため、たとえば健康診断の検査項目に組み入れることは困難であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１７－２２７６１８号公報

【非特許文献】

【0005】

【文献】循環器病の診断と治療に関するガイドライン２０１３、血管機能の非侵襲的評価法に関するガイドライン、ｐ７－ｐ４５、２０１４年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、血管組織の機能低下を早期に把握できる特定の指標、および特定の指標を用いた血管組織機能の簡便な評価方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の指標を用いることにより、血管組織機能を簡便に評価できることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。

【0008】

本発明は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値を指標として、当該血液試料を採取した対象の血管組織機能を測定する方法。
項２．
（ｉｉ）血液試料の全酸化物量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値を指標として、当該血液試料を採取した対象の血管組織機能を測定する方法。
項３．
（Ａ１）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する工程、及び
（Ｂ）血液試料のＨＤＬ量の反映値を測定する工程、
を含む、項１に記載の方法。
項４．
（Ａ２）血液試料の全酸化物量の反映値を測定する工程、及び
（Ｂ）血液試料のＨＤＬ量の反映値を測定する工程、
を含む、項２に記載の方法。
項５．
酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値の測定が、
（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により行われる、
項３又は４に記載の方法。
項６．
酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値の測定が、
さらに、
（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により行われる、
項５に記載の方法。
項７．
ＨＤＬ量の反映値の測定が、ＨＤＬ直接法により行われる、項３又は４に記載の方法。
項８．
（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した、血管組織機能の評価指標。
項９．
（ｉｉ）血液試料の全酸化物量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した、血管組織機能の評価指標。

【発明の効果】

【0009】

本発明は、特定の指標を用いることにより、血管組織機能を簡便に評価する方法を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。

【0011】

本発明は、（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値を指標として、当該血液試料を採取した対象の血管組織機能を測定する方法を包含する。

【0012】

また、本発明は（ｉｉ）血液試料の全酸化物量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値を指標として、当該血液試料を採取した対象の血管組織機能を測定する方法を包含する。

【0013】

血液試料としては、対象から採取された血液由来の試料であれば特に制限されず、例えば、全血であってもよいし、あるいは血液の分離物（例えば血清、血漿等）であってもよい。

【0014】

酸化ＨＤＬ量の反映値としては、血液試料に含まれる酸化ＨＤＬ量を反映する値をいい、例えば酸化ＨＤＬの重量（質量）、濃度等が挙げられる。また、例えば、血液試料に含まれる酸化ＨＤＬ量を反映する測定値であってもよく、例えば吸光度、蛍光強度、等を用いることができる。当該測定値は、測定補助試薬を用いて測定された値であってもよい。当該測定補助試薬としては、例えば蛍光色素、酸化ＨＤＬ特異的認識分子（例えば抗体若しくはその断片）、あるいはそれらの２以上組み合わせ等が挙げられる。測定方法も特に制限はされず、公知の測定方法を適宜選択して用いることができる。

【0015】

ＨＤＬ量の反映値としては、血液試料に含まれるＨＤＬ量を反映する値をいい、例えば、ＨＤＬの重量（質量）、濃度等が挙げられる。また、例えば、血液試料に含まれるＨＤＬ量を反映する測定値であってもよく、例えば吸光度、蛍光強度、等を用いることができる。当該測定値は、測定補助試薬を用いて測定された値であってもよい。当該測定補助試薬としては、例えば蛍光色素、ＨＤＬ特異的認識分子（例えば抗体若しくはその断片）、あるいはそれらの２以上組み合わせ等が挙げられる。測定方法も特に制限はされず、公知の測定方法を適宜選択して用いることができる。

【0016】

（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値は、同一の血液試料を用いて測定した反映値により算出してもよく、同一対象から採取した別の血液試料を用いて測定した反映値により算出してもよい。なお、本明細書において（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値を、「指標（ｉ）」と記載する場合がある。

【0017】

両反映値は、同じ測定方法に基づいていてもよく、異なる測定方法に基づいていてもよい。例えば、酸化ＨＤＬ量の反映値を吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）、ＨＤＬ量の反映値を濃度（ｍｇ／ｄＬ）として、指標（ｉ）を算出してもよい。

【0018】

血液試料中の全酸化物とは、特に限定的ではなく、血液試料中に含まれる全ての酸化物を意味する。例えば、酸化ＨＤＬ、酸化ＬＤＬ等が含まれる。

【0019】

全酸化物量の反映値としては、血液試料に含まれる全酸化物量を反映する値をいい、例えば全酸化物の重量（質量）、濃度等が挙げられる。また、例えば、血液試料に含まれる全酸化物量を反映する測定値であってもよく、例えば吸光度、蛍光強度、等を用いることができる。当該測定値は、測定補助試薬を用いて測定された値であってもよい。当該測定補助試薬としては、例えば蛍光色素、酸化物特異的認識分子（例えば抗体若しくはその断片）、あるいはそれらの２以上組み合わせ等が挙げられる。測定方法も特に制限はされず、公知の測定方法を適宜選択して用いることができる。

【0020】

（ｉｉ）血液試料の全酸化物量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値は、同一の血液試料を用いて測定した反映値により算出してもよく、同一対象から採取した別の血液試料を用いて測定した反映値により算出してもよい。なお、本明細書において（ｉｉ）血液試料の全酸化物量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値を、「指標（ｉｉ）」と記載する場合がある。

【0021】

両反映値は、同じ測定方法に基づいていてもよく、異なる測定方法に基づいていてもよい。例えば、全酸化物量の反映値を吸光度（ｍＯＤ／ｍｉｎ）、ＨＤＬ量の反映値を濃度（ｍｇ／ｄＬ）として、指標（ｉｉ）を算出してもよい。

【0022】

血液試料を採取する対象としては、特に限定的ではなく、ヒトのみならず、非ヒト哺乳動物であってもよい。対象となるヒトとしては、例えば、健常者、糖尿病患者、動脈硬化患者、心血管患者、酸化ＨＤＬ値や酸化ＬＤＬ値が高いと疑われるヒト、ＢＭＩが２５未満のヒト等が挙げられる。また、非ヒト哺乳動物としては特に限定的ではなく、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が好ましい。このような非ヒト哺乳動物としては、例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。

【0023】

対象から血液試料を採取する方法としては、特に限定的ではなく、公知の器具、機器などを用いて常法に従って行うことができる。なお、血液試料として血清又は血漿を用いる場合には、取り扱い易さ、感染防止等の観点から、血清又は血漿分離剤を含む真空採血管などを用いることが好ましい。また、採取した血液試料は、そのまま使用してもよいし、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して用いてもよい。さらに、採取した血液試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。なお、採取した血液試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。

【0024】

血管組織機能とは、例えば、血液を介した物質運搬機能、血管内皮機能などを意味する。血管組織機能の低下とは、血管内皮細胞の働きが低下すること、血管が硬くなること、血管が詰まること、又は血管壁の厚さが増すこと等を意味する。血管組織機能を評価する指標としては、例えば虚血性反応性充血（Ｆｌｏｗ Ｄｅｂｔ Ｒｅｐａｙｍｅｎｔ：ＦＤＲ）を利用したプレチスモグラフ法、心臓足首血管指数（Ｃａｒｄｉｏ－ａｎｋｌｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｄｅｘ：ＣＡＶＩ）、足関節上腕血圧比（Ａｎｋｌｅ ｂｒａｃｈｉａｌ ｉｎｄｅｘ：ＡＢＩ）、内膜中膜複合体厚（Ｉｎｔｉｍａ－ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ：ＩＭＴ）、プレチスモグラフィ、血流介在血管拡張反応（ｆｌｏｗ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｌａｔｉｏｎ：ＦＭＤ）、ＲＨ－ＰＡＴ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒｅｍｉａ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｉａｌ ｔｏｎｏｍｅｔｒｙ）、頚動脈―大腿動脈間脈波伝播速度（ｃａｒｏｔｉｄ－ｆｅｍｏｒａｌ ｐｕｌｓｅ ｗａｖｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、上腕―足首間脈波伝播速度（ｂｒａｃｈｉａｌ－ａｎｋｌｅ ｐｕｌｓｅ ｗａｖｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）、スティフネスパラメータβ等が挙げられる。

【0025】

指標（ｉ）と、血管組織機能とは、相関関係を示す。また、指標（ｉｉ）と血管組織機能とは、相関関係を示す。よって、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）により血管組織機能を測定するにあたっては、例えば、血管組織機能を評価できる一般的な指標（例えば前述した各指標）について測定し、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）と当該一般的な指標との相関関係を決定することができる。いったん相関を得た後は、当該相関に血管組織機能が未知の対象の指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）を当てはめることで、当該対象の血管組織機能を簡便に測定することができる。

【0026】

また、本発明によれば、同一対象の経時的な血管組織機能の変化を簡便に測定することもできる。例えば、血管組織機能を評価する一般的な指標と、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）について正の相関が得られる場合には、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）が増加すると、血管組織機能が低下し、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）が減少すると、血管組織機能が向上していることを簡便に測定することができる。

【0027】

血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法に従って行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法を使用して酸化ＨＤＬ（マロンジアルデヒド修飾ＨＤＬ）を測定する方法や、質量分析機により、ＨＤＬを構成する蛋白質のＡｐｏ－Ａ１のニトロ化やクロロ化を測定する方法、ｄ－ＲＯＭｓ法（血液試料のヒドロキシペルオキシド濃度を測定する方法）、特開２０１７－２２７６１８に記載の、（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法などが挙げられる。中でも、（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により測定することが好ましい。本明細書において、当該工程を「工程（１）」と記載する場合がある。さらに、（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により測定することが、より好ましい。本明細書において、当該工程を「工程（２）」と記載する場合がある。

【0028】

血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を測定する方法としては、血液試料からＨＤＬを分離する工程が含まれていてもよい。本明細書において、当該工程を「工程（０）」と記載する場合がある。工程（０）により分離されたＨＤＬを工程（１）において血液試料として用いることができる。血液試料からＨＤＬを分離する方法としては、特に限定的ではなく、常法に従って行うことができる。例えば、デキストラン硫酸とマグネシウムイオンを用いたデキストラン硫酸法などの方法が挙げられる。

【0029】

血液試料の全酸化物量の反映値を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法に従って行うことができる。例えば、ｄ－ＲＯＭｓ法（血液試料のヒドロキシペルオキシド濃度を測定する方法）、特開２０１７－２２７６１８に記載の、（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法などが挙げられる。中でも、（１）血液試料と、遷移金属化合物及び酸性緩衝液を含む溶液とを混合する工程を含む方法により測定することが好ましい。さらに、（２）前記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含む方法により測定することが、より好ましい。

【0030】

血液試料のＨＤＬ濃度を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法に従って行うことができる。例えば、ＨＤＬ直接法、ＨＰＬＣ法、沈殿法などが挙げられる。ＨＤＬ直接法は、遊離しているＨＤＬコレステロールを色素存在下でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと反応させることで生じる有色物を、例えば波長５６０ｎｍにて測定することにより、ＨＤＬ濃度を算出する方法である。

【0031】

遷移金属化合物は、混合液中で電離して金属イオンになり得るものであり、かつヒドロキシペルオキシド（Ｒ－ＯＯＨ）と反応してフリーラジカルを産生し得るものであれば特に限定的ではなく、例えば、銅（ＩＩ）化合物、鉄（ＩＩ）化合物、（２価の鉄化合物）、鉄（ＩＩＩ）化合物（３価の鉄化合物）などが挙げられる。これらの中でも、鉄（ＩＩ）化合物、鉄（ＩＩＩ）化合物などの鉄化合物が好ましい。鉄化合物としては、例えば、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物などが挙げられる。工程（１）において遷移金属化合物を用いることにより、１）ヒドロキシペルオキシドと反応する遷移金属イオンが十分量存在することにより少量の血液サンプルで全酸化物および酸化ＨＤＬの測定が可能となる、２）血液に含まれる鉄分の量に影響されることなく全酸化物および酸化ＨＤＬの測定が可能となる、などの有利な効果が奏される。

【0032】

なお、全酸化物および酸化ＨＤＬ量の反映値は、３価の鉄化合物にくらべ、２価の鉄化合物を含む溶液で大きくなる。換言すると、３価の鉄化合物よりも２価の鉄化合物を用いた測定法は、高い感度で全酸化物および酸化ＨＤＬを測定できる。従って、上記した鉄化合物の中でも、２価の鉄化合物が特に好ましい。

【0033】

混合液中における遷移金属化合物の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．１～１５０μＭ程度、好ましくは、１～１００μＭとすることができる。

【0034】

酸性緩衝液としては、ｐＨが酸性であり、かつ緩衝作用を有するものであれば特に制限されず、公知の緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液などが挙げられる。

【0035】

酸性緩衝液のｐＨは、酸性であれば特に限定的ではなく、２～６．９程度であることが好ましく、３～６．５程度であることがより好ましく、４．５～６であることがさらに好ましい。なお、後述する工程（２）において、フリーラジカルを測定する方法として、発色法を採用する場合には、酸性緩衝液のｐＨは３～６．９程度であることが特に好ましい。

【0036】

酸性緩衝液の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．００５～０．５Ｍ、好ましくは、０．０１～０．２Ｍである。

【0037】

工程（１）における反応温度としては、特に限定的ではなく、例えば、２０～４０℃程度とすることができる。

【0038】

上記の通り、工程（１）では、血液試料に含まれる全酸化物および酸化ＨＤＬにおけるヒドロペルオキシド（Ｒ－ＯＯＨ）と遷移金属イオンとが反応することによってペルオキシラジカル（Ｒ－ＯＯ^・）やアルコキシラジカル（Ｒ－Ｏ^・）等のフリーラジカルが産生される。工程（１）において産生されたフリーラジカルを測定することにより、全酸化物および酸化ＨＤＬを測定することができる。

【0039】

従って、酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値の測定方法としては、さらに（２）上記工程（１）により産生されたフリーラジカルを測定する工程を含むことが好ましい。

【0040】

フリーラジカルを測定する方法としては、特に限定的ではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、発色法、化学発光法、電子スピン共鳴法（ＥＳＲ法）などが挙げられる。

【0041】

発色法は、フリーラジカルと反応して発色する作用を有する物質（発色性物質）を用い、発色した物質の吸光度を分光光度計などを用いて測定する方法である。

【0042】

発色性物質としては、フリーラジカルやアルコキシラジカルと反応して呈色する作用を有する化合物であれば特に制限されず、公知の化合物を用いることができる。例えば、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩などが挙げられる。

【0043】

【化1】

【0044】

上記一般式（１）中、各Ｒは同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、メチル、又はエチルを示す。特に、各Ｒの少なくとも２つがメチル又はエチルであることが好ましく、同一の窒素原子に置換するＲが共にメチル又はエチルであることがより好ましい。

【0045】

一般式（１）で表される化合物としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｐ－フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）、Ｎ，Ｎ－ジエチル－ｐ－フェニレンジアミン（ＤＰＤ）が好ましい。

【0046】

一般式（１）で表される化合物の塩としては、例えば、硫酸塩、シュウ酸塩、二酢酸塩などが挙げられる。

【0047】

反応工程において用いる一般式（１）で表される化合物又はその塩は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0048】

また、一般式（１）で表される化合物は、必要に応じて、溶媒に溶解して使用することもできる。溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、純水、緩衝液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。溶液とする場合の濃度としては、特に限定的ではなく、例えば、０．１～５０ｍＭ程度、好ましくは１～２０ｍＭ程度とすることができる。

【0049】

発色した物質の吸光度を測定する方法としては、特に限定的ではなく、常法により行うことができる。例えば、フリーラジカルと発色性物質とが反応することによって赤紫色を呈するラジカル陽イオンが生成されることから、公知の機器を用いて吸光度を測定することによってラジカル陽イオンを測定することができる。吸光度を測定する際の波長としては、例えば、４６０～５７０ｎｍ、好ましくは、５００～５６０ｎｍとすることができる。

【0050】

また、吸光度の測定を行う際、定量的に測定するために、測定開始時間と測定終了時間との間の吸光度の時間経過を測定することが好ましい。例えば、フリーラジカルと発色性物質との反応開始時点から２分経過時点を始点とし、反応開始時点から５分経過時点を終点として、吸光度の上昇速度を測定することが好ましい。

【0051】

化学発光法は、フリーラジカルと反応して発光する作用を有する物質（発光性物質）を用い、励起した物質が基底状態に戻る際に放出する光を発光光度計などを用いて測定する方法である。

【0052】

発光物質としては、フリーラジカルと反応して発光する作用を有する化合物であれば特に制限されず、公知の化合物を用いることができる。例えば、ルミノール、Ｄａｎｓｙｌ－ＴＥＭＰＯ、ルシゲニンル、２－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｐ－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｐｙｒａｚｉｎｏｎｅ（ＭＰＥＣ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＰＦ）、Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＡＰＦ）、ウミホタル・ルシフェリン誘導体（ＭＣＬＡ）などが挙げられる。

【0053】

発光した物質の光を測定する方法としては、特に限定的ではなく、用いる発光性物質の種類等に応じて適宜決定することができる。

【0054】

電子スピン共鳴法（ＥＳＲ法）は、不対電子が磁場中に置かれた際に生じる準位間の遷移を観測する分光分析である。電子スピン共鳴法としては、特に限定的ではなく、公知の方法及び機器を用いて行うことができ、フリーラジカルを直接測定する直接法、スピントラップ剤とフリーラジカルとを反応させて行う間接法のいずれであってもよい。間接法を採用する場合、スピントラップ剤としては特に限定されず、公知のスピントラップ剤を用いることができる。スピントラップ剤としては、例えば、５，５－ジメチル－１－ピロリン－Ｎ―オキシド（ＤＭＰＯ）、２，５，５－トリエチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（Ｍ_３ＰＯ）、３，３，５，５－テトラメチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＴＭＰＯ）、Ｎ－ｔｅｒｔ－α－フェニルニトロン（ＰＢＮ）などのニトロン系スピントラップ剤；２－メチル－２－ニトロソプロパン（ＭＮＰ）、ニトロソデュレン（ＮＤ）などのニトロソ系スピントラップ剤などが挙げられる。

【0055】

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。

【実施例】

【0056】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、本実施例においては、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）を算出するために、酸化ＨＤＬ量の反映値、及び全酸化物量の反映値として、吸光度（単位：ｍＯＤ／ｍｉｎ）を、ＨＤＬ量の反映値として濃度（単位：ｍｇ／ｄＬ）を用いた。また、実施例及び表に記載したｒは相関係数を示す。

【0057】

試験例１
本試験例１では、以下の手順に従って、全酸化物量の反映値、又は酸化ＨＤＬ量の反映値の測定を行った。

【0058】

（１）血液試料の調製
真空採血管を用いて被検体の静脈から血液を採取し、１時間、室温に放置後、４℃、３５００ｒｐｍ（１１００ｇ）の条件で１０分間遠心分離を行い、上清（血清）を血液試料として得た後、－８０℃で保存した。具体的には、２８名の糖尿病患者（２８名のＨｂＡ１ｃの平均値は６．４）の血液を使用した。

【0059】

（２）ＨＤＬの精製
上記（１）で得られた血清４５μｌに、１％デキストラン硫酸塩と０．５Ｍ塩化マグネシウムとの混合液（ｐＨ７．３）を５μｌ加え、室温で混合した。１０分間室温で静置した後、４℃、１５００ｇの条件で３０分間遠心分離を行い、得られた上清を０．４５μｍのＰＶＤＦメンブレンに通し、ろ液をＨＤＬとして得た後、－８０℃で保存した。

【0060】

（３）全酸化物量又は酸化ＨＤＬ量の反映値の測定
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）と１００μＭ硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物との混合液をマイクロプレートの各ｗｅｌｌに加え、３７℃に保温した。次いで、各ｗｅｌｌにＮ，Ｎ－ジエチル－ｐ－フェニレンジアミン硫酸塩溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）を加えた後、上記（１）で得られた血清、又は上記（２）で得られたＨＤＬを加えた。３７℃に設定したマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用い、波長５０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、吸光度の測定は、Ｋｉｎｅｔｉｃｓに設定し、１０秒毎に計３０回（合計５分間）測定し、測定開始２分後から５分後の各値から単位時間あたりの吸光度変化（単位：ｍＯＤ／ｍｉｎ）を算出することにより行った。

【0061】

（４）ＨＤＬ量の反映値の測定
ＨＤＬ直接法により測定した（単位：ｍｇ／ｄＬ）。

【0062】

（５）（ｉ）血液試料の酸化ＨＤＬ量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値の算出方法
上記（３）で算出した酸化ＨＤＬ量の反映値（ｍＯＤ／ｍｉｎ）を、上記（４）で算出したＨＤＬ量の反映値（ｍｇ／ｄＬ）で除することによって、指標（ｉ）（単位：（ｍＯＤ／ｍｉｎ）／（ｍｇ／ｄＬ））を算出した。

【0063】

（６）（ｉｉ）血液試料の全酸化物量の反映値を、血液試料のＨＤＬ量の反映値で除した値の算出方法
上記（３）で算出した全酸化物量の反映値（ｍＯＤ／ｍｉｎ）を、上記（４）で算出したＨＤＬ量の反映値（ｍｇ／ｄＬ）で除することによって、指標（ｉｉ）（単位：（ｍＯＤ／ｍｉｎ）／（ｍｇ／ｄＬ））を算出した。

【0064】

試験例２
本試験例２では、以下の手順に従って、ＣＡＶＩを測定し、試験例１で算出した指標（ｉ）、指標（ｉｉ）、酸化ＨＤＬ量の反映値、全酸化物量の反映値、ＨＤＬ量の反映値、又は尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量との相関を調べた。

【0065】

（１）尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量の測定方法
ＥＬＩＳＡ法により、尿中の８－イソプロスタン量を測定し、クレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量（単位：ｐｇ／ｍｇ・ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）を算出した。なお、クレアチニン量は酵素法（クレアチナーゼ－ザルオキシダーゼ－ＰＯＤ法）により測定した（単位：ｍｇ／ｄＬ）。クレアチナーゼ－ザルオキシダーゼ－ＰＯＤ法は、クレアチニンをクレアチニナーゼによってクレアチンに変換し、さらにクレアチナーゼおよびザルコシンオキシダーゼと反応させることによって生成する過酸化水素を、パーオキシダーゼ存在下で、色素および４－アミノアンチピリンと反応させることで生じる赤紫色キノン色素を吸光度測定により定量し、クレアチニン濃度を算出する方法である。

【0066】

（２）ＣＡＶＩの測定方法
ＣＡＶＩは、大動脈起始部から、下肢、足首までの動脈全体の弾性を表す指標であり、血管弾性を血圧値で補正することにより算出される。仰向けに寝た状態で両腕、両足首の血圧と脈波を測定し、ＣＡＶＩを算出した。測定時間は５分間とした。

【0067】

その後、２８名の指標（ｉ）、指標（ｉｉ）、酸化ＨＤＬ量の反映値、全酸化物量の反映値、ＨＤＬ量の反映値、又は尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量と、ＣＡＶＩとの相関関係を解析した。結果を表１に示す。

【0068】

【表1】

【0069】

解析結果から、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）と、ＣＡＶＩには、正の相関があることが分かった（指標（ｉ）：ｒ＝０．３８９、指標（ｉｉ）：ｒ＝０．４０９）。一方、酸化ＨＤＬ量の反映値、全酸化物量の反映値、ＨＤＬ量の反映値、又は尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量と、ＣＡＶＩには、有意な相関が認められなかった（酸化ＨＤＬ量の反映値：ｒ＝０．１８６、全酸化物量の反映値：ｒ＝０．２６８、ＨＤＬ量の反映値：ｒ＝－０．２８９、尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量：ｒ＝－０．０７３）。この結果から、従来から使用されている酸化ストレスの指標である尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量の他、酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値では、血管組織機能を測定することができないのに対して、酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値をＨＤＬ量の反映値で除した、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）を用いると、血管組織機能を測定できることが明らかとなった。

【0070】

試験例３
本試験例３では、以下の手順に従って、ＢＭＩを測定し、ＢＭＩの測定結果により被検体を中央値２４．１３で２群に分けた後に、ＦＤＲを測定し、試験例１で算出した指標（ｉ）、指標（ｉｉ）、酸化ＨＤＬ量の反映値、全酸化物量の反映値、又は試験例２で算出した尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量との相関を調べた。

【0071】

（１）ＢＭＩの測定方法
体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の２乗で除することによりＢＭＩ（ｋｇ／ｍ^２）を算出した。

【0072】

（２）ＦＤＲの測定方法
水銀やインジウムガリウムを満たした細いシリコーンチューブ（水銀式ストレインゲージなど）を測定部位に巻き付け、静脈還流をカフにて遮断した際に、流入し続ける動脈血流によって拡張する測定部位の周径変化を、シリコーンチューブ（ストレインゲージ）に流れる微量電流の電気抵抗の変化として測定した。周径変化と容積変化は比例するため、周径変化を測定することで容積（血流量）変化として、ＦＤＲ（単位：％）を算出した。

【0073】

その後、ＢＭＩが低値の１４名（１４名のＢＭＩの平均値は２１．８０）の指標（ｉ）、指標（ｉｉ）、酸化ＨＤＬ量の反映値、全酸化物量の反映値、又は尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量と、ＦＤＲとの相関関係を解析した。結果を表２に示す。

【0074】

【表2】

【0075】

解析結果から、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）と、ＦＤＲには、負の相関があることが分かった（指標（ｉ）：ｒ＝－０．５９７、指標（ｉｉ）：ｒ＝－０．５３６）。一方、酸化ＨＤＬ量の反映値、全酸化物量の反映値、又は尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量と、ＦＤＲには、有意な相関が認められなかった（酸化ＨＤＬ量の反映値：ｒ＝０．０６７、全酸化物量の反映値：ｒ＝０．０３７、尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量：ｒ＝０．２４４）。この結果から、従来から使用されている酸化ストレスの指標である尿中のクレアチニン量あたりの８－イソプロスタン量の他、酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値では、血管組織機能を測定することができないのに対して、酸化ＨＤＬ量の反映値、又は全酸化物量の反映値をＨＤＬ量の反映値で除した、指標（ｉ）又は指標（ｉｉ）を用いると、血管組織機能を測定できることが明らかとなった。