▶ バイオベンチャーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-12
(45)【発行日】2022-12-20
(54)【発明の名称】多発性骨髄腫のためのＧＥＰ５モデル
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6813 20180101AFI20221213BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221213BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221213BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6813 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/12
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021187779
(22)【出願日】2021-11-18
(62)【分割の表示】P 2019152421の分割
【原出願日】2014-05-19
(65)【公開番号】P2022023238
(43)【公開日】2022-02-07
【審査請求日】2021-11-26
(31)【優先権主張番号】61/825,396
(32)【優先日】2013-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517022555
【氏名又は名称】バイオベンチャーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ， ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バーロギー、バート
(72)【発明者】
【氏名】チュイ、ピンピン
(72)【発明者】
【氏名】ホイク、クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】エプスタイン、ジョシュア
【審査官】千葉 直紀
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１０－５０８８４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０７１２４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】UPPARAHALLIVENKATESHAIAH SATHISHA，BLOOD，2012年11月，V120 N21，P329
【文献】EDMONDSON RICKY D，BLOOD，2012年11月，V120 N21，P197
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性骨髄腫を有すると疑われる対象の予後診断を補助する方法であって、（ａ）多発性骨髄腫の対象から得られた生物試料を処理して、ＣＤ１３８＋発現骨髄腫細胞を含む試料を得る工程、
（ｂ）該試料から核酸を抽出し、単離された核酸試料を得る工程、及び、
（ｃ）エノラーゼ１（ＥＮＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３（ＴＲＩＰ１３）、トランスゲリン２（ＴＡＧＬＮ２）、および複製因子Ｃ（アクチベータ１）４（ＲＦＣ４）の遺伝子発現レベルを、該単離された核酸試料と、検出可能に標識され、それぞれの遺伝子とハイブリダイズする核酸プローブとを接触させ、それぞれの遺伝子とプローブとで形成された複合体を検出することにより測定する工程であって、ここで、それぞれの遺伝子について好適な対照と比較した、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の対数正規化された遺伝子発現レベルの平均の上昇が、該対象の予後不良と関連する工程、
とを含む、方法。
【請求項2】
前記核酸プローブの少なくとも１つが、配列番号１、４、７、１０及び１３の中から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項3】
配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、又は１５の中から選択されるプライマーを含むプライマーセットの使用を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項4】
前記生物試料が、約５０，０００個以下の骨髄腫細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項5】
前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１記載の方法。
【請求項6】
前記遺伝子発現レベルが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴＰＣＲ）、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、配列決定、ノーザンブロッティング、またはサザンブロッティングにより試験される、請求項１記載の方法。
【請求項7】
前記遺伝子発現レベルがｑＲＴＰＣＲにより試験される、請求項６記載の方法。
【請求項8】
前記対象が骨髄腫療法を受けている、請求項１記載の方法。
【請求項9】
ＴＴ２を受けている対象においてＯＳを予後診断することができる、請求項１記載の方法。
【請求項10】
ＴＴ３ａを受けている対象においてＯＳとＰＦＳの両方を予後診断することができる、請求項１記載の方法。
【請求項11】
ＴＴ３ｂを受けている対象においてＰＦＳを予後診断することができる、請求項１記載の方法。
【請求項12】
ＴＴ４またはＴＴ５を受けている対象においてＰＦＳを予後診断することができる、請求項１記載の方法。
【請求項13】
ＴＴ４またはＴＴ５を受けている対象においてＯＳとＰＦＳの両方を予後診断することができる、請求項１記載の方法。
【請求項14】
ＴＴ６を受けている対象においてＯＳを予後診断することができる、請求項１記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１３年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８２５，３９６号の利益を請求する。
本出願は、２０１３年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８２５，３９６号の利益を請求する。
【0002】
上記出願の全教示は、参照により本明細書に組込まれる。
【0003】
政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより付与されたＰ０１ＣＡ０５５８１９の下で政府の支援下で行われたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより付与されたＰ０１ＣＡ０５５８１９の下で政府の支援下で行われたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
多発性骨髄腫は、米国で２番目に最も一般的な血液悪性腫瘍であり、全ての診断されるがんの約１％を占める。多発性骨髄腫は、１年で１００，０００人あたり約１～４人において生じる。患者間の生存期間は様々であり、生存期間中央値は、従来の治療では３～４年であるが、一部の患者では先端治療によって５～７年またはそれ以上に延長することができる。ある特定の先端療法に対する患者の必要性は均一ではないが、先端治療が不適切に適用または保留される場合、全ての罹患した患者にとってさらなる負担となる。
【0005】
患者、その社会的ネットワーク、および医療制度への多発性骨髄腫の莫大な個人的および財政的負担、ならびに様々な生存期間および治療に対する応答を考慮すると、多発性骨髄腫を有するか、またはそれを有すると疑われる対象の予後診断のための方法が必要である。好ましくは、そのような方法は、特に、予後診断のために限られた量の遺伝子材料しか入手できない場合に、遺伝子情報に基づいて対象を階層化することができるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、多発性骨髄腫を有するか、または有すると疑われる対象を予後診断する方法を提供する。有利には、本発明により提供される方法は、限られた量の遺伝子材料を用いて対象を予後診断することができる。本発明は、少なくとも部分的には、発現レベルを用いて、いくつかの実施形態においては、限られた数の細胞を含む生物試料を用いて、多発性骨髄腫を有する対象を階層化することができる小セット（５つ、またはさらにはわずか２つ）の情報遺伝子の出願人の発見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第１の態様において、本発明は、多発性骨髄腫を有すると疑われる対象を予後診断する方法を提供する。前記方法は、対象から単離された生物試料中のエノラーゼ１（ＥＮＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３（ＴＲＩＰ１３）、トランスゲリン２（ＴＡＧＬＮ２）、および複製因子Ｃ（アクチベータ１）４（ＲＦＣ４）の遺伝子発現レベルを、該生物試料が約５０，０００個またはそれ以下の骨髄腫細胞を含む場合に、遺伝子の発現レベルを検出することができる方法を用いて試験するステップと、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４のそれぞれの遺伝子発現レベルを定量するステップとを含み、ここで、好適な対照と比較して異常な遺伝子発現プロファイルは対象の予後不良と関連する。いくつかの実施形態においては、予後不良は、全生存（ＯＳ）の尤度の低下および／または無増悪生存（ＰＦＳ）の尤度の低下である。
【0008】
ある特定の実施形態においては、本発明により提供される方法は、試験される遺伝子発現レベルに基づいて、例えば、異常な遺伝子発現プロファイルの存在または非存在に基づいて、対象に予後を割り当てるステップを含む。
【0009】
いくつかの実施形態においては、遺伝子発現レベルは、タンパク質レベルで試験される。
【0010】
他の実施形態においては、遺伝子発現レベルは、核酸レベルで試験される。より特定の実施形態においては、遺伝子発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴＰＣＲ）、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、配列決定、ノーザンブロッティング、またはサザンブロッティングにより試験される。より特定の実施形態においては、遺伝子発現レベルは、ｑＲＴＰＣＲにより試験される。さらにより特定の実施形態においては、遺伝子発現レベルは、それぞれの遺伝子について３つのプライマーのセットの使用を含むｑＲＴＰＣＲにより試験され、ここで、３つのプライマーのそれぞれのセットについて、少なくとも１つのプライマーは、検出可能に標識され、３つのプライマーのセットの標的鋳型の存在下でポリメラーゼ依存的加水分解、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）にかけられる。さらにより特定の実施形態においては、検出可能な標識は、蛍光標識である。他の特定の実施形態においては、遺伝子発現レベルは、Ｈｓ００３６１４１５＿ｍ１、Ｈｓ０２３３９４３９＿ｇ１、Ｈｓ００１８８５００＿ｍ１、Ｈｓ００７６１２３９＿ｓ１、Ｈｓ００４２７４６９＿ｍ１から選択されるプライマー、表Ｂに列挙されるプライマー、または表Ｂに列挙されるものと実質的に類似するプライマーを用いるｑＲＴＰＣＲにより試験される。
【0011】
いくつかの実施形態においては、対象は、骨髄腫療法を受けている。
【0012】
特定の実施形態においては、方法は、ＴＴ２を受けている対象におけるＯＳを予後診断することができる。
【0013】
他の特定の実施形態においては、方法は、ＴＴ３ａを受けている対象におけるＯＳとＰＦＳの両方を予後診断することができる。
【0014】
いくつかの実施形態においては、方法は、ＴＴ３ｂを受けている対象におけるＰＦＳを予後診断することができる。
【0015】
他の実施形態においては、方法は、ＴＴ４またはＴＴ５を受けている対象におけるＰＦＳを予後診断することができる。より特定の実施形態においては、方法は、ＴＴ４またはＴＴ５を受けている対象におけるＯＳとＰＦＳの両方を予後診断することができる。
【0016】
いくつかの実施形態においては、方法は、ＴＴ６を受けている対象におけるＯＳを予後診断することができる。
【0017】
別の態様において、本発明は、トータルセラピー（Ｔｏｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）３ｂ（ＴＴ３ｂ）を受けている多発性骨髄腫を有する対象における無増悪生存（ＰＦＳ）を予後診断する方法を提供する。これらの方法は、対象から単離された生物試料中のエノラーゼ１（ＥＮＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３（ＴＲＩＰ１３）、トランスゲリン２（ＴＡＧＬＮ２）、および複製因子Ｃ（アクチベータ１）４（ＲＦＣ４）の遺伝子発現レベルを試験するステップと、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４のそれぞれの遺伝子発現レベルを定量するステップとを含み、異常な遺伝子発現プロファイルは対象に関するＰＦＳの尤度の低下と関連する。
【0018】
別の態様において、本発明は、対象から単離された生物試料中のエノラーゼ１（ＥＮＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３（ＴＲＩＰ１３）、トランスゲリン２（ＴＡＧＬＮ２）、および複製因子Ｃ（アクチベータ１）４（ＲＦＣ４）の遺伝子発現レベルを試験することと、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４のそれぞれの遺伝子発現レベルを定量することとにより、トータルセラピー４（ＴＴ４）またはトータルセラピー５（ＴＴ５）を受けている多発性骨髄腫を有する対象における無増悪生存（ＰＦＳ）または全生存（ＯＳ）を予後診断する方法であって、異常な遺伝子発現プロファイルが対象に関するＰＦＳまたはＯＳの尤度の低下と関連する、前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記方法は、ＯＳを予後診断するためのものである。他の特定の実施形態においては、異常な遺伝子発現プロファイルは、段階的回帰により評価されるような、ＰＦＳに関する独立した有害（ａｖｅｒｓｅ）因子である。
【0019】
前記態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【0020】
前記態様または実施形態のいずれかの特定の実施形態において、対象は、異常な遺伝子発現プロファイルを示し、それによって、予後不良であると決定され、より頻繁な監視スケジュールに変更される。
【0021】
前記態様または実施形態のいずれかの特定の実施形態において、対象は、異常な遺伝子発現プロファイルを示さず、それによって、予後良好であると決定される。
【0022】
前記態様または実施形態のいずれかの特定の実施形態において、対象は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬、シスプラチン、エトポシド、シクロホスファミド、メルファラン、拡張ＮＫ細胞を用いる細胞療法、Ｔ細胞を用いる細胞療法、抗体療法、デキサメタゾン、またはそれらの組合せを用いる治療を受けている。
【0023】
前記態様または実施形態のいずれかの特定の実施形態において、遺伝子発現レベルは、対数正規化される。
【0024】
前記態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、疾患指数は、遺伝子の対数正規化された遺伝子発現レベルの平均として算出される。
【0025】
前記態様または実施形態のいずれかの特定の実施形態において、方法は、少なくとも１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、または６．０のハザード比でＯＳまたはＰＦＳに関する予後不良と予後良好とを識別する。
【0026】
前記態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、生物試料は、４５，０００；４０，０００；３０，０００；２０，０００；１０，０００；９，０００；８，０００；７，０００；６，０００；５，０００；４，０００；３，０００；２，０００；１，０００；９００；８００；７００；６００；５００；４００；３００；２００；１００；９０；８０；７０；６０；５０；４０；３０；２０；１０；９；８；７；６；５；４；３；または２個より少ない骨髄腫細胞を含む。特定の実施形態においては、骨髄腫細胞は、ＣＤ１３８＋発現、ＣＤ３８＋／ＣＤ４５ｄｉｍ発現、またはＣＤ３８＋／ＣＤ４５ｎｅｇ発現により選択される。
【0027】
別の態様において、本発明は、対象から単離された生物試料から単離された核酸試料中のエノラーゼ１（ＥＮＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３（ＴＲＩＰ１３）、トランスゲリン２（ＴＡＧＬＮ２）、および複製因子Ｃ（アクチベータ１）４（ＲＦＣ４）の核酸遺伝子発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲにより試験することと、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の対数正規化された遺伝子発現レベルの平均を算出することとにより、多発性骨髄腫を有すると疑われる対象を予後診断する方法であって、好適な対照と比較した、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の対数正規化された遺伝子発現レベルの平均の上昇が、対象の予後不良と関連する、前記方法を提供する。
【0028】
さらに別の態様において、本発明は、前記態様および実施形態のいずれか１つの方法による予後診断に基づいて、対象に好適な療法を施すことを含む、対象における多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。
【0029】
別の態様において、本発明は、場合により好適な陽性および／または陰性対照を含む、前記態様および実施形態のいずれかの方法を実施するための試薬を含有するキットを提供する。より特定の実施形態においては、キットは、プライマーＨｓ００３６１４１５＿ｍ１、Ｈｓ０２３３９４３９＿ｇ１、Ｈｓ００１８８５００＿ｍ１、Ｈｓ００７６１２３９＿ｓ１、Ｈｓ００４２７４６９＿ｍ１のいずれか１つ、表Ｂに列挙されるプライマー、または表Ｂに列挙されるものと実質的に類似するプライマーの１つまたは複数を含む。
【0030】
さらに別の態様において、本発明は、プロセッサにより実行された場合、対象から得られた単離された生物試料について決定されたエノラーゼ１（ＥＮＯ１）、脂肪酸結合タンパク質５（ＦＡＢＰ５）、甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３（ＴＲＩＰ１３）、トランスゲリン２（ＴＡＧＬＮ２）、および複製因子Ｃ（アクチベータ１）４（ＲＦＣ４）の遺伝子発現レベルを示すデータを読取るステップ；好適な対照と比較した異常な遺伝子発現プロファイルの存在を決定するためにデータを分析するステップ；ならびにデータ分析に基づいて対象の分類を提供するステップを含み、異常な遺伝子発現プロファイルの存在が対象の予後不良と関連する、操作をプロセッサに実施させる命令を提供する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を提供する。いくつかの実施形態においては、命令は、データ分析に基づいて治療推奨を提供するステップをさらに含む。
【0031】
別の態様において、本発明は、前記態様の記憶媒体と、プロセッサとを含むシステムを提供する。
【0032】
別の態様において、本発明は、異常な遺伝子発現プロファイルの存在が、本発明により提供される記憶媒体またはシステムを用いて決定される、前記態様および実施形態のいずれか１つの方法を提供する。
【0033】
上記のことは、添付の図面に例示される、本発明の実施形態例に関する以下のより詳細な説明から明らかであろう。図面中、同様な参照文字は、種々の図を通して同じ部分を指す。図面は、必ずしも寸法通りではないが、その代わりに本発明の実施形態を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】図１Ａ～１Ｄは、ＴＴ６およびＴＴ３Ａ訓練セットならびにＴＴ３ＢおよびＴＴ２検証セットにおいて、ＧＥＰ５が有意に異なる全生存および無増悪生存で高リスク群と低リスク群とを区別したことを例示するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットである。図１Ａは、ＴＴ６訓練セットの結果を示す。ＧＥＰ５は、ＧＥＰ５低リスクに関するそれぞれ９５％および９１％と比較して、１年推定で６０％のＯＳ（左パネル）および５０％のＰＦＳ（右パネル）を有する高リスクサブセットを同定した。図１Ｂは、ＴＴ３Ａ訓練セットの結果を示す。ＧＥＰ５は、ＧＥＰ５低リスクに関するそれぞれ８１％および７１％と比較して、５年推定で３８％のＯＳ（左パネル）および３３％のＰＦＳ（右パネル）を有する高リスクサブセットを同定した。図１Ｃは、ＴＴ３Ｂ検証セットの結果を示す。ＧＥＰ５は、ＧＥＰ５低リスクに関するそれぞれ８０％および７４％と比較して、５年推定で４５％のＯＳ（左パネル）および３１％のＰＦＳ（右パネル）の高リスクサブセットを同定した。図１Ｄは、ＴＴ２検証セットの結果を示す。ＧＥＰ５は、ＧＥＰ５低リスクに関するそれぞれ７１％および４９％と比較して、５年推定で４０％のＯＳ（左パネル）および２６％のＰＦＳ（右パネル）の高リスクサブセットを同定した。
【0035】
【図2】図２Ａ～２Ｄは、ＴＴ６およびＴＴ３Ａ訓練セットならびにＴＴ３ＢおよびＴＴ２検証セットにおいて、０．６６の公開されたカットオフを用いて、ＧＥＰ７０が有意に異なる全生存および無増悪生存で高リスク群と低リスク群とを区別したことを例示するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットである。図２Ａは、ＴＴ６訓練セットの結果を示す。ＧＥＰ７０低リスクに関する、それぞれ９５％および７２％と比較した、ＧＥＰ７０高リスクに関する１８％のＯＳ（左パネル）および１９％のＰＦＳ（右パネル）の２年推定。図２Ｂは、ＴＴ３Ａ訓練セットの結果を示す。ＧＥＰ７０低リスクに関する、それぞれ８０％および７２％と比較した、ＧＥＰ７高リスクに関する３５％のＯＳ（左パネル）および２５％のＰＦＳ（右パネル）の５年推定。図３Ｃは、ＴＴ３Ｂ検証セットの結果を示す。ＧＥＰ７０低リスクに関する、それぞれ８０％および７０％と比較した、ＧＥＰ７０高リスクに関する３８％のＯＳ（左パネル）および３５％のＰＦＳ（右パネル）の５年推定。図３Ｄは、ＴＴ２検証セットの結果を示す。ＧＥＰ７０低リスクに関する、それぞれ７２％および５０％と比較した、ＧＥＰ７０高リスクに関する２８％のＯＳ（左パネル）および１５％のＰＦＳ（右パネル）の５年推定。
【0036】
【0037】
【図4】図４Ａ～４Ｂは、ＴＴ２の治療アームによるＧＥＰ５およびＧＥＰ７０モデルの性能を比較するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒのプロットである。図４Ａは、ＴＴ２サリドマイドアーム（ｔｈａｌ＋）の結果を示す。ＧＥＰ５（上パネル；図４Ａ－１）は、ＯＳ（左パネル）およびＰＦＳ（右パネル）に関して、ＴＴ２＋ｔｈａｌアームにおいて高リスク群および低リスク群を同定した。ＴＴ２上で開発された、ＧＥＰ７０（下パネル；図４Ａ－２）は、ＯＳおよびＰＦＳに関してわずかにより良好な性能を示した。図４Ｂは、ＴＴ２非サリドマイドアーム（ｔｈａｌ－）の結果を示す。ＧＥＰ５（上パネル；図４Ｂ－１）は、ＯＳ（左パネル）およびＰＦＳ（右パネル）に関して、ＴＴ２－ｔｈａｌアームにおいて高リスク群および低リスク群を同定することができた。ＴＴ２上で開発された、ＧＥＰ７０（下パネル；図４Ｂ－２）は、ＯＳおよびＰＦＳに関してわずかにより良好な性能を示した。
【発明を実施するための形態】
【0038】
例示的実施形態の説明は以下の通りである。
【0039】
予後診断方法
本発明は、特に、多発性骨髄腫を有するか、または有すると疑われる対象のための、予後診断方法、ならびに該方法を実施するためのキットおよび試薬を提供する。この方法は、いくつかの実施形態においては、表Ａに列挙される遺伝子の任意のサブセットを含む、前記遺伝子を用いる（含む、本質的にからなる、またはからなる）、例えば、２つの遺伝子（例えば、ＥＮＯ１およびＦＡＢＰ５）、３つの遺伝子（例えば、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、およびＴＲＩＰ１３）、４つの遺伝子（例えば、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、およびＴＡＧＬＮ２）、または５つ全部の遺伝子を用いる遺伝子発現プロファイリングに基づく。好ましい実施形態においては、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の５つ全部が用いられる。表Ａに列挙される遺伝子は、ヒト参照配列であり、他の哺乳動物種に由来する相同体は当技術分野で公知であり、特に、表Ａ中の情報を用いて、参照データベース（ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚポータルなど）から容易に取得することができる。
いくつかの実施形態においては、表Ａに記載のもの、ならびにそのサブセットを含む遺伝子の遺伝子発現プロファイリングは、ＧＮＧ１０、ＰＮＰＬＡ４、ＫＩＡＡ１７５４、ＡＨＣＹＬ１、ＭＣＬＣ、ＥＶＩ５、ＡＤ－０２０、ＰＡＲＧ１、ＣＴＢＳ、ＦＵＣＡ１、ＲＦＰ２、ＦＬＪ２０４８９、ＬＴＢＰ１、ＡＩＭ２、ＳＥＬＩ、ＳＬＣ１９Ａ１、ＬＡＲＳ２、ＯＰＮ３、ＡＳＰＭ、ＣＣＴ２、ＵＢＥ２１、ＳＴＫ６、ＦＬＪ１３０５２、ＦＬＪ１２５２５、ＢＩＲＣ５、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＫＡＰｌ、ＭＧＣ５７８２７、ＤＫＦＺｐ７７９０１７５、ＰＦＮ１、ＩＬＦ３、ＩＦＩ１６、ＴＢＲＧ４、ＰＡＰＤｌ、ＥＩＦ２Ｃ２、ＭＧＣ４３０８、ＤＳＧ２、ＥＸＯＳＣ４、ＲＵＶＢＬ１、ＡＬＤＯＡ、ＣＰＳＦ３、ＭＧＣ１５６０６、ＬＧＡＬＳ１、ＲＡＤ１８、ＳＮＸ５、ＰＳＭＤ４、ＲＡＮ、ＫＩＦ１４、ＣＢＸ３、ＴＭＰＯ、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４、ＷＥＥｌ、ＲＯＢ０１、ＴＣＯＦ１、ＹＷＨＡＺ、およびＭＰＨＯＳＰＨ１の少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または５６個全部）を含まない。ある特定の実施形態においては、表Ａに記載のもの、ならびにそのサブセットを含む遺伝子の遺伝子発現プロファイリングは、以下のＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＡｆｆｙＩＤ：１５５５８６４＿ｓ＿ａｔ、２０６５１３＿ａｔ、１５５５２７４＿ａ＿ａｔ、２１１５７６＿ｓ＿ａｔ、２０４０１６＿ａｔ、１５６５９５１＿ｓ＿ａｔ、２１９９１８＿ｓ＿ａｔ、２０１９４７＿ｓ＿ａｔ、２１３５３５＿ｓ＿ａｔ、２０４０９２＿ｓ＿ａｔ、２１３６０７＿ｘ＿ａｔ、２０８１１７＿ｓ＿ａｔ、２１０３３４＿ｘ＿ａｔ、２０１８９７＿ｓ＿ａｔ、２１６１９４＿ｓ＿ａｔ、２２５８３４＿ａｔ、２３８９５２＿ｘ＿ａｔ、２００６３４＿ａｔ、２０８９３１＿ｓ＿ａｔ、２０６３３２＿ｓ＿ａｔ、２２０７８９＿ｓ＿ａｔ、２１８９４７＿ｓ＿ａｔ、２１３３１０＿ａｔ、２２４５２３＿ｓ＿ａｔ、２１７９０１＿ａｔ、２２６９３６＿ａｔ、５８６９６＿ａｔ、２０１６１４＿ｓ＿ａｔ、２００９６６＿ｘ＿ａｔ、２２５０８２＿ａｔ、２４２４８８＿ａｔ、２４３０１１＿ａｔ、２０１１０５＿ａｔ、２２４２００＿ｓ＿ａｔ、２２２４１７＿ｓ＿ａｔ、２１０４６０＿ｓ＿ａｔ、２００７５０＿ｓ＿ａｔ、２０６３６４＿ａｔ、２０１０９１＿ｓ＿ａｔ、２０３４３２＿ａｔ、２２１９７０＿ｓ＿ａｔ、２１２５３３＿ａｔ、２１３１９４＿ａｔ、２４４６８６＿ａｔ、２００６３８＿ｓ＿ａｔ、２０５２３５＿ｓ＿ａｔ、２０１９２１＿ａｔ、２２７２７８＿ａｔ、２０９７４０＿ｓ＿ａｔ、２２７５４７＿ａｔ、２２５５８２＿ａｔ、２００８５０＿ｓ＿ａｔ、２１３６２８＿ａｔ、２０９７１７＿ａｔ、２２２４９５＿ａｔ、１５５７２７７＿ａ＿ａｔ、１５５４７３６＿ａｔ、２１８９２４＿ｓ＿ａｔ、２２６９５４＿ａｔ、２０２８３８＿ａｔ、２３０１９２＿ａｔ、４８１０６＿ａｔ、２３７９６４＿ａｔ、２０２７２９＿ｓ＿ａｔ、および２１２４３５＿ａｔのうちの１つを用いて検出可能な遺伝子の少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５個全部）を含まない。
本発明は、特に、多発性骨髄腫を有するか、または有すると疑われる対象のための、予後診断方法、ならびに該方法を実施するためのキットおよび試薬を提供する。この方法は、いくつかの実施形態においては、表Ａに列挙される遺伝子の任意のサブセットを含む、前記遺伝子を用いる（含む、本質的にからなる、またはからなる）、例えば、２つの遺伝子（例えば、ＥＮＯ１およびＦＡＢＰ５）、３つの遺伝子（例えば、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、およびＴＲＩＰ１３）、４つの遺伝子（例えば、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、およびＴＡＧＬＮ２）、または５つ全部の遺伝子を用いる遺伝子発現プロファイリングに基づく。好ましい実施形態においては、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の５つ全部が用いられる。表Ａに列挙される遺伝子は、ヒト参照配列であり、他の哺乳動物種に由来する相同体は当技術分野で公知であり、特に、表Ａ中の情報を用いて、参照データベース（ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚポータルなど）から容易に取得することができる。
【表1】
【0040】
「予後診断」は、ある臨床指標に関して少なくとも２つの異なるリスク群の１つについて対象にリスク階層を割り当てることである。特定の実施形態において、少なくとも２つのリスク群は、ある臨床指標に関して予後不良および予後良好を含む。臨床指標の例としては、２年全生存（ＯＳ）および２年無増悪生存（ＰＦＳ）が挙げられる。
【0041】
「対象」は、霊長類（例えば、ヒトまたはサル）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、およびマウス、またはその他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類もしくはマウス種などの哺乳動物である。好適な対象の例としては、限定されるものではないが、ヒト患者（例えば、多発性骨髄腫を有するか、または有すると疑われるヒト）が挙げられる。対象は、出産前、周産期、乳児、幼児、小児、若年成人、成人、中年、または高齢者などの、任意の発達段階であり得る。より特定の実施形態においては、対象は、若年成人、成人、中年、または高齢者である。いくつかの実施形態においては、対象は、以下に定義されるような骨髄腫治療を受けている。ある特定の実施形態においては、骨髄腫治療が、本発明により提供される方法の結果に基づいて適応になり得る（または修正され得る）。本発明により提供される方法によって予後診断された対象が、ＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、ＴＴ４、ＴＴ５またはＴＴ６などの骨髄腫療法などの任意の療法を「受けている」場合、生物試料を、その前に、間に、後に、またはそれらの組合せで（すなわち、治療の前、間、または後の１、２、または３つ全部）取得することができる。
【0042】
「多発性骨髄腫」は、ＫｙｌｅおよびＲａｊｋｕｍａｒ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２３：３～９頁（２００９、ＰｕｂＭｅｄＩＤ １８９７１９５１、その全体が参照により本明細書に組込まれる）に定義されたような、症候性骨髄腫、無症候性骨髄腫、および意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ならびにＫｙｌｅおよびＲａｊｋｕｍａｒ ２００９に記載の他の階層および段階を有する対象を含む。特定の実施形態においては、「多発性骨髄腫」は、症候性骨髄腫である。
【0043】
「遺伝子発現」とは、遺伝子の核酸レベル（例えば、ｍＲＮＡまたはそれから誘導されるｃＤＮＡ）とタンパク質レベルの両方の発現を指す。核酸として発現される遺伝子は、タンパク質をコードしてもしなくてもよく、および／またはタンパク質に翻訳されてもされなくてもよい。遺伝子発現の物理的生成物は、「遺伝子発現生成物」である。
【0044】
「発現のレベル」、「発現レベル」、「遺伝子発現レベル」などは、遺伝子発現生成物（例えば、核酸またはタンパク質）の量である。発現レベルを変換（例えば、正規化）しても、または「生のまま」分析してもよい。
【0045】
「発現プロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」は、少なくとも２つの遺伝子発現レベルを意味する。例えば、いくつかの実施形態においては、２つ以上の遺伝子発現レベルは、２つ以上の時点での１つの遺伝子の遺伝子発現レベルまたは同じか、もしくは異なる時点での２つ以上の異なる遺伝子の発現レベルであり得る。例えば、特定の実施形態においては、発現プロファイルは、１つまたは複数の時点でのＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の発現レベルである。
【0046】
「異常な遺伝子発現プロファイル」とは、好適な対照と比較した、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルにおける統計的に有意な、および／または実際的な逸脱を指す。「好適な対照」は、例えば、単一の患者に由来する試料の対（例えば、多発性骨髄腫を発症する前後に、患者から異なる時点で得られる、例えば、生物試料）ならびに特定の予後（例えば、予後不良または予後良好）を有すると、任意の手段によって決定された試料から以前に蓄積された参照値（特定の予後と関連する範囲を表す参照値のアンサンブルなど）を含む。例えば、１つまたは複数の遺伝子（例えば、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の５つ全部）の参照値を蓄積し、バイナリーまたは確率的分類アルゴリズムを開発するために使用した後、予後良好または予後不良であると患者を分類するために用いることができる。あるいは、予後良好である生存群または予後良好でないもしくは予後不良である生存群に、遺伝子発現プロファイルをクラスター化するか、またはさもなければ割り当てることにより、所与の発現プロファイル（対象に由来する）を評価する。本発明において、好適な対照と比較した、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、またはＲＦＣ４のレベルの上昇は、対象に関する予後不良と関連し、従って、特定の実施形態においては、異常な遺伝子発現プロファイルは、好適な対照と比較した、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の１、２、３、４、または５つ全部のレベルの上昇を含む。例えば、特定の実施形態においては、異常な遺伝子発現プロファイルの存在は、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の対数正規化された（例えば、ｌｏｇ２）遺伝子発現レベルの平均を算出することにより決定され、ここで、所定の閾値（例えば、少なくとも、または約１０．６８）を超える平均は、予後不良を示す。
【0047】
遺伝子発現レベルの「試験」は、生物試料と、遺伝子発現レベル、すなわち、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４の遺伝子発現レベルを検出するための１つまたは複数の単離された試薬とを接触させて、実験室的分析方法により遺伝子発現生成物の量を測定することを必要とする。遺伝子発現生成物のレベルの試験は、実験室的分析方法の過程において直接行うか、またはいくつかの実施形態においては、実験室的分析方法の量的出力を評価することにより行うことができる。
【0048】
「遺伝子発現レベルを検出するための単離された試薬」は、標的分析物の遺伝子発現レベルの検出における使用のために適合された実質的に精製された形態の単離された分析試薬であり、例えば、核酸標的分析物と相補的な単離されたオリゴヌクレオチド、または、いくつかの実施形態においては、タンパク質標的分析物に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態においては、遺伝子発現レベルを検出するための単離された試薬は、自然に存在する化合物とは顕著に異なる人工の生成物である。特定の実施形態においては、遺伝子発現レベルを検出するための単離された試薬は、人工的に、および検出可能に標識される。いくつかの実施形態においては、生物試料は、遺伝子発現レベルを検出するためにいくらか顕著に異なるように変換される、すなわち、生物試料は、直接的に、または、いくつかの実施形態においては、生物試料と、例えば、人工的に、および検出可能に標識された遺伝子発現レベルを検出するための単離された試薬とを複合体化させることによって、人工的に、および検出可能に標識される。
【0049】
「標的分析物」は、試料中に存在し得る他の化合物に由来する分析物を同定するのに十分である、タンパク質または核酸のいずれかの遺伝子発現生成物の全部または一部であり、本出願で用いられる場合、ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、またはＲＦＣ４の遺伝子発現生成物の全部または一部を含む。
【0050】
「標的鋳型」とは、核酸標的分析物を指す。
【0051】
対象に由来する細胞を含有する任意の生物試料を、本発明により提供される方法において用いることができる。ある特定の実施形態においては、生物試料は、約５０，０００個未満の細胞、例えば、４５，０００；４０，０００；３０，０００；２０，０００；１０，０００；９，０００；８，０００；７，０００；６，０００；５，０００；４，０００；３，０００；２，０００；１，０００；９００；８００；７００；６００；５００；４００；３００；２００；１００；９０；８０；７０；６０；５０；４０；３０；２０；１０；９；８；７；６；５；４；３；または２個未満の骨髄腫細胞を含む。特定の実施形態においては、骨髄腫細胞は、ＣＤ１３８＋発現、ＣＤ３８＋／ＣＤ４５ｄｉｍ発現、またはＣＤ３８＋／ＣＤ４５ｎｅｇ発現により選択される（例えば、フローサイトメトリーまたはレーザー捕捉顕微鏡観察による）。
【0052】
検出方法およびキット
遺伝子発現プロファイルを得るために、２つ以上の遺伝子発現レベルを決定する。核酸もしくはタンパク質レベル、またはそれらの組合せで測定および／または試験することにより、ならびに、いくつかの実施形態においては、予め決定されたレベルを分析することにより、発現レベルを決定することができる。本発明により提供される方法を実施する場合、遺伝子発現レベルを決定する任意の手段を用いることができる。特定の実施形態においては、用いられる方法の感度は、約５０，０００個未満の骨髄腫細胞を含有する試料中で遺伝子発現レベルを検出することができるようなものである。
遺伝子発現プロファイルを得るために、２つ以上の遺伝子発現レベルを決定する。核酸もしくはタンパク質レベル、またはそれらの組合せで測定および／または試験することにより、ならびに、いくつかの実施形態においては、予め決定されたレベルを分析することにより、発現レベルを決定することができる。本発明により提供される方法を実施する場合、遺伝子発現レベルを決定する任意の手段を用いることができる。特定の実施形態においては、用いられる方法の感度は、約５０，０００個未満の骨髄腫細胞を含有する試料中で遺伝子発現レベルを検出することができるようなものである。
【0053】
例えば、核酸遺伝子発現生成物のレベルを、逆転写酵素（ｒｔ）ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、リアルタイムおよび定量的ＰＣＲ法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）、分子ビーコン、ＬＩＧＨＴＵＰ（商標）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）、ＳＩＭＰＬＥＰＲＯＢＥＳ（登録商標）を含む；例えば、米国特許第５，５３８，８４８号；第５，９２５，５１７号；第６，１７４，６７０号；第６，３２９，１４４号；第６，３２６，１４５号および第６，６３５，４２７号を参照されたい）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ノーザンブロッティング；逆転写生成物および誘導体のサザンブロッティング；ブロットアレイもしくはｉｎ ｓｉｔｕ合成アレイなどのアレイに基づく方法；ならびに配列決定、例えば、合成による配列決定、ピロシーケンシング、ジデオキシ配列決定、もしくはライゲーションによる配列決定、またはＨＥＬＩＣＯＳ（登録商標）、ＲＯＣＨＥ（登録商標）４５４、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）／ＳＯＬＥＸＡ（登録商標）、ＡＢＩ ＳＯＬｉＤ（登録商標）、およびＰＯＬＯＮＡＴＯＲ（登録商標）配列決定などの特定のプラットフォームを含む、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：３３５～４４頁（２００４）もしくはＮｏｗｒｏｕｓｉａｎ、Ｅｕｋ．Ｃｅｌｌ ９（９）：１３００～１３１０頁（２０１０）に考察されたような、当技術分野で公知の任意の他の方法などのいくつかの方法で決定することができる。特定の実施形態においては、核酸遺伝子発現生成物のレベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定する。さらにより特定の実施形態においては、ｑＲＴ－ＰＣＲは、それぞれの遺伝子について３つの核酸セットを使用し、ここで、３つの核酸は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイとして商業的に公知の、プライマーが結合する標的核酸の領域の間に結合するプローブと一緒にプライマー対を含む。特定の実施形態においては、本発明により提供される方法における使用のためのプライマーは、Ｈｓ００３６１４１５＿ｍ１、Ｈｓ０２３３９４３９＿ｇ１、Ｈｓ００１８８５００＿ｍ１、Ｈｓ００７６１２３９＿ｓ１、およびＨｓ００４２７４６９＿ｍ１、ならびに表Ｂに提供されるもの、および表Ｂに記載のものと実質的に類似するプローブを含む。例えば、いくつかの実施形態においては、表Ｂ中の特定の遺伝子に関して、「プライマー」と標識された対が用いられる。より特定の実施形態においては、表Ｂ中の特定の遺伝子に関して、付随する「プローブ」が同様に用いられ、より特定の実施形態においては、プローブは、蛍光標識などの検出可能な標識を含む。「実質的に類似する」プローブが、本発明により提供される方法において表Ｂ中のものと機能的に置き換わってもよい。いくつかの実施形態においては、実質的に類似する配列は、表Ｂ中の配列と６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、もしくは１００％同一であるか；または、あるいは、もしくはさらに、実質的に類似する配列は、表Ｂ中のもののいずれかの終点の上流もしくは下流の１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、もしくは０ヌクレオチド内に終点を有する。
【表2】
【0054】
核酸遺伝子発現生成物のレベルを、例えば、表Ａに列挙された参照核酸配列、ならびに表Ａに列挙された参照核酸配列の相補体、断片、および類似核酸配列の量を測定および／または試験することにより決定することができる。「類似核酸配列」は、表Ａ中の参照核酸配列に関して、天然に存在する（例えば、対立遺伝子バリアントもしくは他の種に由来する相同配列）か、または操作されたバリアントであってもよく、少なくとも約１０、２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００以上のヌクレオチドの長さにわたって、または表Ａ中の参照核酸配列の全長にわたって、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％以上同一であろう（または表Ａに列挙された核酸配列の相補体に高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするであろう）。表Ａ中の参照核酸配列の断片、または類似核酸配列は、混合物中に存在すると予想される他の配列からその断片を区別するのに十分な任意の長さのもの、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００以上のヌクレオチドまたは表Ａ中の参照核酸配列の長さの少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％であってもよい。
【0055】
特定の実施形態においては、表Ａ中の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、同時に測定または試験する。いくつかの実施形態においては、本発明により提供される方法における使用のためにマイクロアレイ（例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）、ＡＧＩＬＥＮＴ（登録商標）およびＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）スタイルのアレイ）を適合化させることができる。他のより特定の実施形態においては、マイクロアレイを使用しない。他の実施形態においては、試料あたりわずか５０，０００個以上の骨髄腫細胞の感度を有する技術またはアッセイは使用しない。
【0056】
別の関連する態様において、本発明は、多発性骨髄腫を有するか、または有すると疑われる対象を予後診断するために表Ａ中の遺伝子の発現レベルを検出する（例えば、測定する、および／または試験する）のに好適であるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、本出願に記載される表Ａ中の遺伝子の任意の組合せについて調製することができる。本発明により提供されるオリゴヌクレオチドプライマーを、分子生物学の技術分野における通常の知識を用いて容易に設計して、表Ａ中の所与の遺伝子（ならびに上記のような、断片およびその類似核酸配列）に特異的であるプライマーを達成することができる。すなわち、前記プライマーは、全トランスクリプトームおよび／または表Ａ中の他の遺伝子に対するプライマーを含む、試料中に存在する（または存在すると予想される）他の核酸から標的核酸を識別することができる。プライマーの長さ（例えば、約１０～１００ヌクレオチド、例えば、約１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド以上）および配列（すなわち、プライマーがハイブリダイズする表Ａ中の遺伝子の特定の部分）を容易に調整して、所望の融点（「Ｔｍ」；例えば、約４５～７２℃、例えば、約４５、５０、５５、６０、６５、７０、７２℃以上）および特異性を達成することができる。当業者であれば、二次構造、プライマー二量体、塩濃度、核酸濃度などの因子を容易に明らかにするであろう。本発明により提供されるオリゴヌクレオチドプライマーは、天然デオキシリボヌクレオチドからなる（もしくは本質的にからなる）か、または場合により、非天然ヌクレオチド、人工骨格（ＰＮＡなど）、および蛍光標識、ビオチン化などの検出可能な標識などの修飾を含んでもよい。
【0057】
本出願を通して記載される任意の特定の組合せを含む、表Ａに列挙された遺伝子に関するタンパク質レベルを、定量的細胞化学または組織化学、ＥＬＩＳＡ（直接、間接、サンドイッチ、競合、多重およびポータブルＥＬＩＳＡ（例えば、米国特許第７，５１０，６８７号を参照されたい）など）、ウェスタンブロッティング（場合により、ペプチド配列決定を含む、一次元、二次元もしくはそれ以上の次元のブロッティングまたは他のクロマトグラフィー手段）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）、核酸に基づく、またはタンパク質に基づくアプタマー技術、ＨＰＬＣ（高精度液体クロマトグラフィー）、ペプチド配列決定（場合により、ＨＰＬＣと組み合わせた、Ｅｄｍａｎ分解配列決定または質量分析（ＭＳ／ＭＳなど））、ならびに前記のいずれかのマイクロアレイ適合（核酸、抗体またはタンパク質－タンパク質（すなわち、非抗体）アレイを含む）により測定または試験することができる。
【0058】
タンパク質技術は、典型的には、必要ではないが、抗体を用いる（例えば、直接配列決定とは対照的である）。本発明により提供される方法における使用のための抗体を、表Ａに列挙された任意の遺伝子、ならびにこれらの配列の断片、類似ペプチド配列、および類似ペプチド配列の断片に対応するペプチド配列に指向させることができる。「類似ペプチド配列」は、天然に存在する（例えば、対立遺伝子バリアントもしくは他の種に由来する相同配列）か、または表Ａ中の遺伝子に対する操作されたバリアントであってもよく、少なくとも約１０、２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００個以上のアミノ酸の長さにわたって、または表Ａ中の遺伝子のタンパク質生成物の全長にわたって、アミノ酸レベルで、実質的に同じ生物学的機能を示す、および／または少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％以上相同である（すなわち、保存的置換（例えば、ＨｅｉｎｋｏｆｆおよびＨｅｉｎｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ ８９（２２）：１０９１５～１０９１９頁（１９９２）ならびにＳｔｙｃｚｙｎｓｋｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６（３）：２７４～２７５頁（ＢＬＯＳＵＭ、例えば、ＢＬＯＳＵＭ ４５、６２もしくは８０）またはＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｖｏｌｕｍｅ ５、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、３４５～３５８頁（ＰＡＭ、例えば、ＰＡＭ ３０または７０）を参照されたい）、もしくは同一である。表Ａ中の遺伝子のタンパク質生成物の断片、または類似ペプチド配列は、混合物中に存在すると予想される他の配列からその断片を区別するのに十分な任意の長さのもの、例えば、少なくとも５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００個以上のアミノ酸または表Ａ中の遺伝子のタンパク質生成物の長さの少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは９５％であってもよい。
【0059】
本明細書で用いられる用語「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその一部を指し、供給源、元の種、生成方法、および特徴とは無関係に抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。非限定例として、用語「抗体」は、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、およびニワトリ抗体を含む。この用語は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、一特異的、多特異的、ヒト化、完全ヒト、ラクダ化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、およびＣＤＲ移植抗体を含む。本発明の目的のために、それはまた、別途記述しない限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨ（ナノボディとも呼ばれる）などの抗体断片、および抗原結合機能を保持する他の抗体断片も含む。抗体はまた、以下にさらに記載されるような、免疫グロブリンに基づかない抗原結合分子も含む。
【0060】
例えば、いくつかの実施形態においては、用語「抗体」は、免疫グロブリン以外の足場に基づく抗原結合分子を含む。例えば、当技術分野で公知の非免疫グロブリン足場は、小モジュラー免疫薬（例えば、それぞれ、２００８年７月３１日および２００８年９月１８日に公開された、米国特許出願公開第２００８／０１８１８９２号および第２００８／０２２７９５８号を参照されたい）、テトラネクチン、フィブロネクチンドメイン（例えば、ＡＤＮＥＣＴＩＮＳ（登録商標）；２００７年４月１２日に公開された米国特許出願公開第２００７／００８２３６５号を参照されたい）、プロテインＡ、リポカリン（例えば、米国特許第７，１１８，９１５号を参照されたい）、アンキリンリピート、およびチオレドキシンを含む。非免疫グロブリン足場に基づく分子は、一般に、ファージディスプレイ（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｍｅｔｈｏｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１～３７頁（２００２）を参照されたい）、リボソームディスプレイ（例えば、Ｈａｎｅｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５０：１０５～１１０頁（１９９９）ならびにＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９７：７３～８２頁（２００５）を参照されたい）、または高親和性結合配列を同定するための当技術分野で公知の他の技術（Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１２５７～１２６８頁（２００５）；Ｒｏｔｈｅら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０：１５９９～１６１０頁（２００６）；および米国特許第７，２７０，９５０号；第６，５１８，０１８号；および第６，２８１，３４４号も参照されたい）によるライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択により生成される。
【0061】
本発明により提供される方法を実施するために、本発明は、本発明により提供される方法のいずれかを実施するための試薬を含むキットをさらに提供する。典型的には、本発明により提供されるキットは、表Ａ中の２つ以上の遺伝子、すなわち、少なくとも２、３、４、または５つ全部の遺伝子の発現レベルを検出、測定および／または試験するための試薬を含む（または本質的にからなる、もしくはからなる）。キットは、例えば、本発明により提供されるオリゴヌクレオチドプライマー、本発明により提供される抗体、またはそれらの組合せを含んでもよい；ある特定の実施形態においては、これらの試薬は、人工的および検出可能に標識される。キットは、典型的には、使用のための説明書を含むものとする。場合により、キットは、表Ａに由来する遺伝子の異常な発現パターンを示す核酸、タンパク質、または核酸およびタンパク質を含む（または本質的にからなる、もしくはからなる）組成物である、「好適な陽性対照」を含んでもよい。例えば、好適な対照は、好ましいか、または好ましくない多発性骨髄腫の予後を有することが知られる臨床起源に由来するものであってもよく、固定もしくは保存されているが、そうでなければ加工されていない生検組織、またはあるいは、核酸（例えば、ｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡ）、タンパク質、およびそれらの組合せ（例えば、少なくとも２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９９乾燥重量％以上の核酸および／もしくはタンパク質）を含む（からなる、または本質的にからなる）画分を含む、そのような生検に由来する単離された画分を含んでもよい。あるいは、ある特定の実施形態においては、好適な陽性対照は、例えば、表Ａに由来する２つ以上の遺伝子の異常な発現パターンに特徴的な割合で組み合わされた、核酸および／またはタンパク質の人工混合物を含んでもよい。
【0062】
分析
遺伝子発現レベルを、当技術分野における任意の手段によって分析することができる。さらなる分析の前に、生の遺伝子発現データを、変換、例えば、対数正規化し、発現比として表し、パーセンタイル順位化するか、または分位点スケーリングなどを行うことができる。データを、任意の非パラメータ的データスケーリング手法によりさらに修正することができる。
遺伝子発現レベルを、当技術分野における任意の手段によって分析することができる。さらなる分析の前に、生の遺伝子発現データを、変換、例えば、対数正規化し、発現比として表し、パーセンタイル順位化するか、または分位点スケーリングなどを行うことができる。データを、任意の非パラメータ的データスケーリング手法によりさらに修正することができる。
【0063】
発現パターンを、一般線形モデル（ＧＬＭ）、ＡＮＯＶＡ、回帰（ロジスティック回帰など）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、ｋ近傍（ｋＮＮ）、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、最近平均／重心（ＮＭ）、およびベイジアン共変量予測因子（ＢＣＰ）などの様々な手段により評価および分類することができる。ＳＶＭなどのモデルを、本発明の教示に基づいて、本明細書に記載の遺伝子の任意のサブセットおよび組合せを用いて開発することができる。より特定の実施形態においては、発現パターンは、対数正規化された遺伝子発現レベルの平均として評価される。
【0064】
発現プロファイルに関する選択される閾値（リスクスコアとしてまとめられる）を設定して、所望の感度もしくは特異度を達成する、および／または階層群間の相対ハザード比に基づいて対象を階層化することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、疾患指標閾値は、例えば、６、１２、１８、もしくは２４ヶ月、または３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０年の期間にわたって、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２．、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０以上の「ハザード比」（２つの階層群、例えば、高リスク予後群および低リスク予後群の間の多発性骨髄腫対象の全生存、無事象生存、または無増悪生存の比）を達成するように設定される。「階層群」は、１つまたは複数の階層化基準、例えば、約６０パーセンタイルより高いか、もしくはそれと等しい疾患指標または約５未満もしくは約５～約１５の間、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５より高い、もしくはそれ以上、例えば、約８、９、または１０より高い、より特定すると１０より高い、例えば、約１０．６８より高い平均対数正規化遺伝子発現プロファイルを有する全群メンバーなどの、疾患指標のパーセンタイル順位を階層化するデータセットのメンバーである。階層群を、年齢、疾患の持続期間、ＯＳ、ＰＦＳなどの任意の臨床パラメータの平均、中央値、最頻値、および／または標準偏差などの任意の統計値により、任意の手段によって比較することができる。
【0065】
治療方法
別の態様において、本発明は、多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。例えば、本発明により提供される任意の方法は、ある特定の実施形態においては、対象に対する好適な骨髄腫療法、例えば、本発明により提供される方法による対象の予後診断に基づくものを提供する（例えば、投与する、処方する、またはそうでなければ、利用可能にする）ステップをさらに含んでもよい。他の関連する実施形態においては、本発明により提供される予後診断方法の結果は、対象に対する骨髄腫療法を提供する（例えば、投与する、処方する、もしくはそうでなければ、利用可能にする）もしくは修正する、および／または対象の監視スケジュールを変更するための新しい指標を提供する。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明により提供される方法による予後不良（高リスク骨髄腫）は、より積極的な骨髄腫療法（レジメンに１つもしくは複数の治療を加える、および／もしくは１つもしくは複数の治療の用量を増加させることによる）を提供する必要性を示す場合があり、またはいくつかの実施形態においては、疾患を除去する代わりに患者の快適性に焦点を合わせた、あまり積極的でない治療が適切であり得る。いくつかの実施形態においては、予後良好（低リスク骨髄腫）は、いくつかの実施形態においては、より積極的な骨髄腫療法を回避する、中止するもしくは修正する（例えば、レジメンから１つもしくは複数の治療を取り除く、および／もしくは１つもしくは複数の治療の用量を減少させる）ことができることを示してもよく、または、いくつかの実施形態においては、より積極的な療法を用いて、疾患を除去するよう試みることができる。他の実施形態においては、本発明により提供される方法による予後診断の後、対象のための監視スケジュールを変更する、例えば、高リスク骨髄腫を有すると予後診断された対象は、より頻繁な監視スケジュールを受けてもよいが、低リスク骨髄腫を有すると診断された対象はより低頻度の監視スケジュールを受けてもよい。多発性骨髄腫を有する対象のための監視方法は当技術分野で周知であり、例えば、細胞遺伝学、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）スキャン、ＭＲＩ（磁気共鳴画像化）、ＤＷＩＰ、骨髄生検、血清または尿電気泳動（β２ミクログロブリンレベル、Ｍタンパク質レベル（ガンマスパイク）、および免疫グロブリンレベル（全Ｉｇ、重鎖、軽鎖を含む）の１つまたは複数のモニタリングを含む）、ならびに前記の任意の組合せを含む。
別の態様において、本発明は、多発性骨髄腫を治療する方法を提供する。例えば、本発明により提供される任意の方法は、ある特定の実施形態においては、対象に対する好適な骨髄腫療法、例えば、本発明により提供される方法による対象の予後診断に基づくものを提供する（例えば、投与する、処方する、またはそうでなければ、利用可能にする）ステップをさらに含んでもよい。他の関連する実施形態においては、本発明により提供される予後診断方法の結果は、対象に対する骨髄腫療法を提供する（例えば、投与する、処方する、もしくはそうでなければ、利用可能にする）もしくは修正する、および／または対象の監視スケジュールを変更するための新しい指標を提供する。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明により提供される方法による予後不良（高リスク骨髄腫）は、より積極的な骨髄腫療法（レジメンに１つもしくは複数の治療を加える、および／もしくは１つもしくは複数の治療の用量を増加させることによる）を提供する必要性を示す場合があり、またはいくつかの実施形態においては、疾患を除去する代わりに患者の快適性に焦点を合わせた、あまり積極的でない治療が適切であり得る。いくつかの実施形態においては、予後良好（低リスク骨髄腫）は、いくつかの実施形態においては、より積極的な骨髄腫療法を回避する、中止するもしくは修正する（例えば、レジメンから１つもしくは複数の治療を取り除く、および／もしくは１つもしくは複数の治療の用量を減少させる）ことができることを示してもよく、または、いくつかの実施形態においては、より積極的な療法を用いて、疾患を除去するよう試みることができる。他の実施形態においては、本発明により提供される方法による予後診断の後、対象のための監視スケジュールを変更する、例えば、高リスク骨髄腫を有すると予後診断された対象は、より頻繁な監視スケジュールを受けてもよいが、低リスク骨髄腫を有すると診断された対象はより低頻度の監視スケジュールを受けてもよい。多発性骨髄腫を有する対象のための監視方法は当技術分野で周知であり、例えば、細胞遺伝学、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）スキャン、ＭＲＩ（磁気共鳴画像化）、ＤＷＩＰ、骨髄生検、血清または尿電気泳動（β２ミクログロブリンレベル、Ｍタンパク質レベル（ガンマスパイク）、および免疫グロブリンレベル（全Ｉｇ、重鎖、軽鎖を含む）の１つまたは複数のモニタリングを含む）、ならびに前記の任意の組合せを含む。
【0066】
「骨髄腫療法」は、ヒトにおける多発性骨髄腫のための確立された治療と実験的治療の両方を含む。ある特定の実施形態においては、骨髄腫療法は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬、シスプラチン（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ８４６９１、４４１２０３を参照されたい）、エトポシド（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ３６４６２を参照されたい）、シクロホスファミド（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ２９０７を参照されたい）、メルファラン（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ４６０６１２を参照されたい）、拡張ＮＫ細胞を用いる細胞療法、Ｔ細胞を用いる細胞療法、抗体療法、デキサメタゾン（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ５７４３を参照されたい）、およびそれらの組合せ（例えば、「組合せ骨髄腫療法」と呼ばれる、前記のいずれかの１、２、３、４、５、６つ以上）から選択される、治療有効量の１つまたは複数の薬剤を用いる治療を含む。
【0067】
例示的なプロテアソーム阻害剤骨髄腫療法としては、ボルテゾミブ（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ４８７４４７を参照されたい）、カルフィルゾミブ（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ １１５５６７１１を参照されたい）、ジスルフィラム（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ３１１７を参照されたい）、エピガロカテキン－３－ガレート（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ６５０６４を参照されたい）、サリノスポラミドＡ（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ １１３４７５３５を参照されたい）、エポキソミシン（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ １６７６０４１２を参照されたい）、ＭＧ１３２（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ４６２３８２を参照されたい）、ＯＮＸ０９１２（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ２５０６７５４７を参照されたい）、ＣＥＰ－１８７７０（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ２４８００５４１を参照されたい）、ＭＬＮ９７０８（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ４９８６７９３６を参照されたい）の１つまたは複数、およびそれらの組合せが挙げられる。より特定の実施形態においては、ボルテゾミブおよび／またはバルフィルゾミブが、骨髄腫療法における使用のためのプロテアソーム阻害剤である。
【0068】
例示的な免疫調節骨髄腫療法としては、例えば、サリドマイド（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ５４２６を参照されたい；特定の実施形態においては、Ｓ－ラセミ体を用いることができる）、レナリドミド（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ ２１６３２６を参照されたい）、ポマリドミド（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ １３４７８０を参照されたい）、アプレミラスト（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ １１５６１６７４を参照されたい）、およびそれらの組合せが挙げられる。
【0069】
抗体骨髄腫療法としては、いくつかの実施形態においては、ＣＤ２０（ヒトＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．９３１）、ＳＬＡＭＦ７（ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ヒトＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．５７８２３（他の別名：ＣＤ３１９、ＣＳ１））、ＣＤ３８（ヒトＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．９５２）、またはＣＤ１３８（ヒトＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．６３８２）に特異的に結合する中和抗体またはＡＤＣＣ活性を有する抗体、ならびにこれらの抗体の組合せを含む抗体（上記で定義されている）が挙げられる。
【0070】
特定の例示的な組合せ骨髄腫療法としては、トータルセラピー（ＴＴ）２、ＴＴ３ａ、ＴＴ３ｂ、ＴＴ４、ＴＴ５、またはＴＴ６と呼ばれる治療レジメンが挙げられる。他の例示的な組合せ骨髄腫療法としては、デキサメタゾンを含む、場合により、メルファランをさらに含むサリドマイドが挙げられる。
【実施例】
【0071】
導入
多発性骨髄腫（ＭＭ）における遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）の予後値は、いくつかのグループによって報告されている。ＧＥＰ７０モデル（Ｂｌｏｏｄ １０９（６）：２２７６～２２８４頁（２００７））は、トータルセラピー２（ＴＴ２）において開発され、無増悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）に関するその判別力は、移植片、非移植片および再発設定においていくつかの公開されたデータセット中で検証されている。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６（２９）：４７９８～４８０５頁（２００８）；Ｂｌｏｏｄ １１５（２１）：４１６８～４１７３頁（２０１０）；Ｂｌｏｏｄ １０９（８）：３１７７～３１８８頁（２００７）；Ｂｌｏｏｄ １１１（２）：９６８～９６９頁（２００８）；およびＬｅｕｋｅｍｉａ ２２（２）：４５９～４６１頁（２００８）を参照されたい。本発明者らは、ＧＥＰ７０モデルを、フロントラインプロトコール（ＴＴ３、ＴＴ４またはＴＴ５）に相応しくない以前に治療されたＭＭのためのタンデム移植（ｔａｎｄｅｍ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）試験であるトータルセラピー６（ＴＴ６）に適用した。ＯＳの２４ヶ月評価はそれぞれ、低リスクおよび高リスクＭＭについて、９５％および１８％であった。
多発性骨髄腫（ＭＭ）における遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）の予後値は、いくつかのグループによって報告されている。ＧＥＰ７０モデル（Ｂｌｏｏｄ １０９（６）：２２７６～２２８４頁（２００７））は、トータルセラピー２（ＴＴ２）において開発され、無増悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）に関するその判別力は、移植片、非移植片および再発設定においていくつかの公開されたデータセット中で検証されている。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６（２９）：４７９８～４８０５頁（２００８）；Ｂｌｏｏｄ １１５（２１）：４１６８～４１７３頁（２０１０）；Ｂｌｏｏｄ １０９（８）：３１７７～３１８８頁（２００７）；Ｂｌｏｏｄ １１１（２）：９６８～９６９頁（２００８）；およびＬｅｕｋｅｍｉａ ２２（２）：４５９～４６１頁（２００８）を参照されたい。本発明者らは、ＧＥＰ７０モデルを、フロントラインプロトコール（ＴＴ３、ＴＴ４またはＴＴ５）に相応しくない以前に治療されたＭＭのためのタンデム移植（ｔａｎｄｅｍ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）試験であるトータルセラピー６（ＴＴ６）に適用した。ＯＳの２４ヶ月評価はそれぞれ、低リスクおよび高リスクＭＭについて、９５％および１８％であった。
【0072】
方法
患者
本発明者らの訓練データは、ＴＴ６上にある５６人のＭＭ患者およびＴＴ３ａ上にある２７５人のＭＭ患者からなり、両方とも生存データおよびＧＥＰデータが利用可能である。さらにＴＴ３ｂ上にある１６６人の患者およびＴＴ２上にある３５１人の患者を、検証のために用いた。ＴＴ２およびＴＴ３の詳細は、以前に他の場所で公開されている。Ｂｌｏｏｄ １１５（２１）：４１６８～４１７３頁（２０１０）；Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５４（１０）：１０２１～１０３０頁（２００６）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８（７）：１２０９～１２１４頁（２０１０）；およびＢｌｏｏｄ １１６（８）：１２２０～１２２７頁（２０１０）を参照されたい。ＴＴ６の詳細は、下記の補足方法に報告される。
患者
本発明者らの訓練データは、ＴＴ６上にある５６人のＭＭ患者およびＴＴ３ａ上にある２７５人のＭＭ患者からなり、両方とも生存データおよびＧＥＰデータが利用可能である。さらにＴＴ３ｂ上にある１６６人の患者およびＴＴ２上にある３５１人の患者を、検証のために用いた。ＴＴ２およびＴＴ３の詳細は、以前に他の場所で公開されている。Ｂｌｏｏｄ １１５（２１）：４１６８～４１７３頁（２０１０）；Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５４（１０）：１０２１～１０３０頁（２００６）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８（７）：１２０９～１２１４頁（２０１０）；およびＢｌｏｏｄ １１６（８）：１２２０～１２２７頁（２０１０）を参照されたい。ＴＴ６の詳細は、下記の補足方法に報告される。
【0073】
遺伝子発現プロファイリング
ＧＥＰ試料の調達およびプロセッシングならびにＧＥＰ７０リスクスコアの算出は、以前に報告されている。Ｂｌｏｏｄ １０９（６）：２２７６～２２８４頁（２００７）を参照されたい。
ＧＥＰ試料の調達およびプロセッシングならびにＧＥＰ７０リスクスコアの算出は、以前に報告されている。Ｂｌｏｏｄ １０９（６）：２２７６～２２８４頁（２００７）を参照されたい。
【0074】
生存推定
ＰＦＳおよびＯＳの期間を、プロトコール療法の開始から測定した；増悪は、再発または前者における任意の原因に由来する死亡および後者における任意の原因に由来する死亡を含んでいた。ＯＳおよびＰＦＳ曲線を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （５３）：４５７～４８１頁（１９５８））を用いて推定し、ログランク検定（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３５（２）：１８５～２０７頁（１７２））により比較した。ハザード比をＣｏｘ回帰モデル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ（３４）：１８７～２２０頁（１９７２））を用いて推定し、段階的Ｃｏｘ回帰分析を行って、最適多変量モデルを選択し、ならびにリスクスコアの独立した予後診断力の証拠を提供した。
ＰＦＳおよびＯＳの期間を、プロトコール療法の開始から測定した；増悪は、再発または前者における任意の原因に由来する死亡および後者における任意の原因に由来する死亡を含んでいた。ＯＳおよびＰＦＳ曲線を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （５３）：４５７～４８１頁（１９５８））を用いて推定し、ログランク検定（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３５（２）：１８５～２０７頁（１７２））により比較した。ハザード比をＣｏｘ回帰モデル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ（３４）：１８７～２２０頁（１９７２））を用いて推定し、段階的Ｃｏｘ回帰分析を行って、最適多変量モデルを選択し、ならびにリスクスコアの独立した予後診断力の証拠を提供した。
【0075】
結果および考察
本発明者らは、ＴＴ６におけるＯＳに関する単変量Ｃｏｘ回帰分析に基づいて、そのｐ値によりＧＥＰ７０リスクモデル中に含まれる全部で７０個のプローブセットを順位付けた（表２）。最小のｐ値を有する上からｎ個のプローブセットを組み合わせて、ＧＥＰ７０モデル開発におけると同様の方法を用いて連続スコアを作出した。
本発明者らは、ＴＴ６におけるＯＳに関する単変量Ｃｏｘ回帰分析に基づいて、そのｐ値によりＧＥＰ７０リスクモデル中に含まれる全部で７０個のプローブセットを順位付けた（表２）。最小のｐ値を有する上からｎ個のプローブセットを組み合わせて、ＧＥＰ７０モデル開発におけると同様の方法を用いて連続スコアを作出した。
【0076】
高リスク患者群を同定するために、本発明者らは、ランニングログランク検定を用いて、新しいリスクスコアの最適カットオフを決定し、カットオフよりも高いスコアを有する患者を、高リスクと見なし、そうでなければ低リスクと見なした。本発明者らは、わずか２つの遺伝子に基づくモデルが、ＴＴ６上にあるＭＭを有する患者に関するリスクを確実に予測した（図３）。次に、本発明者らは、上から５つのプローブセット（ＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５、ＴＲＩＰ１３、ＴＡＧＬＮ２、およびＲＦＣ４遺伝子に対応する）を選択して、５プローブスコア（以後、ＧＥＰ５と呼ばれる；図１Ａ）を形成した。５つのプローブセットのそれぞれはＴＴ６において死亡率と明らかな関連を有していたため、ＧＥＰ５スコアは、５つのプローブセットのｌｏｇ２変換された発現レベルの単なる平均であった。ＴＴ６上で治療された患者数は、相対的に短い追跡においては相対的に少なかったため、本発明者らは次に、より長い追跡データと共に均一に治療された患者のより大きいデータセットにおいてＧＥＰ５モデルを確立することを求めた。さらに、本発明者らは、ＧＥＰ５が以前に治療されていない患者にも適用可能であるかどうかを見たかった。従って、本発明者らは、ＴＴ３ａにおけるＧＥＰ５スコアについてランニングログランク検定により最適カットオフを確立した。ＴＴ３ａにおいて、ＧＥＰ５スコアは、ＯＳおよびＰＦＳについて高リスク疾患と低リスク疾患の間で有意差を示し、その確立されたカットオフ０．６６を用いてＧＥＰ７０リスクモデルにより得られるものと同等である（図１Ｂおよび図２Ｂ）。本発明者らは、ＴＴ３ｂにおける新しいカットオフを検証し、ここで、本発明者らは、ＧＥＰ５およびＧＥＰ７０を用いて得られた結果の間の驚くべき類似性も観察した（図１Ｃおよび図２Ｃ）。多変量分析の際に、ＧＥＰ５により定義された高リスクは、３．２９（９５％ＣＩ：１．９２～５．６４）の推定ハザード比を有する劣ったＰＦＳと関連する独立した有害変数として選択されたが、ＯＳについては有意として選択されなかった。ＧＥＰ７０モデルは、対照的に、ＯＳについては選択されたが、ＰＦＳについては選択されなかった（表３）。ＧＥＰ７０モデルが開発されたＴＴ２においては、ＧＥＰ５およびＧＥＰ７０により定義された低リスク群は再度、高度に類似する臨床転帰を示したが、ＧＥＰ５モデルにより定義された高リスク群はＧＥＰ７０モデルによるよりも高い生存推定値を有すると考えられる（５年推定ＯＳは４０％対２８％であり、５年推定ＰＦＳは２６％対１５％である）（図１Ｄ）。これはまた、ＴＴ２データを治療アームで分離した場合にも見られる（図４）。表１は、ＧＥＰ５およびＧＥＰ７０モデル上での単変量生存分析の概要を与える。ＴＴ２、ＴＴ３ａおよびＴＴ３ｂに関するＧＥＰ７０およびＧＥＰ５リスクのクロス集計により、それぞれ、０．９０、０．８９および０．８７の一致率が示された（表３）。
【0077】
ＥＮＯ１は、哺乳動物に見出される３つのエノラーゼイソ酵素の１つであるアルファ－エノラーゼをコードする。この遺伝子の選択的スプライシングは、転写リプレッサーとして、およびおそらく、腫瘍抑制因子として作用するタンパク質であるＭＹＣ結合タンパク質１を生成するより短いアイソフォームをもたらす。ＥＮＯ１は、天然の生物学的薬剤であるブリオスタチン１を用いる治療後にびまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）において誘導され、エンテロウイルス－７１（ＥＶ７１）感染（タンパク質レベルでの）に応答して上方調節される。ＦＡＢＰ５は、脂肪酸結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ＦＡＢＰ５の過剰発現は、トリプルネガティブ乳がんにおける低い生存率および膵管腺がんの前臨床モデルにおけるＡＴＲＡに対する耐性と関連していた。ＴＲＩＰ１３は、ホルモン依存的転写因子としても知られる、甲状腺ホルモン受容体のリガンド結合ドメインと相互作用するタンパク質をコードする。それは、初期非小細胞肺がんにおいて役割を果たすことが示唆されている。ＴＡＧＬＮは腫瘍抑制因子として報告されており、その過少発現は結腸直腸がんおよび前立腺がんにおける予後不良と関連していたが、老化ヒト線維芽細胞中で過剰発現されることがわかった。ＲＦＣ４は、複製因子Ｃ（ＲＦＣ）タンパク質複合体の３７ｋＤのサブユニットをコードする。ＲＦＣおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ＤＮＡ伸長、かくして、細胞の増殖にとって必要である。
【0078】
最近、骨髄腫を有する８５人の患者を対象とする大規模プロテオミクス実験により、短いＯＳと関連する２４のタンパク質のセットのうちのＥＮＯ１、ＦＡＢＰ５およびＴＡＧＬＮが同定された。この８５人の患者のセットは、ＴＴ３ｂで治療された４７人の患者を含んでいた。ｍＲＮＡとタンパク質発現の間のこの相関は、ＧＥＰ５モデルの生物学的関連性を支持する。
【0079】
補足方法
トータルセラピー６は、少なくとも１つの以前の系列の化学療法を用いる症候性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者に関する非盲検フェーズ２プロトコールとして設計される。患者は、以下のように治療される：１）誘導：ＭＥＬ－１０（１０ｍｇ／ｍ２）ＶＴＤ－ＰＡＣＥおよび末梢血幹細胞収集２）１回目の移植：ＭＥＬ－８０（２０ｍｇ／ｍ２／日ｘ４日）＋ＶＲＤ－ＰＡＣＥ３）暫定的療法：ＭＥＬ－２０（５ｍｇ／ｍ２／日ｘ４日）＋ＶＴＤ－ＰＡＣＥ（７５％）２サイクル４）２回目の移植：ＭＥＬ－８０（２０ｍｇ／ｍ２／日ｘ４日）＋ＶＲＤ－ＰＡＣＥ５）維持：ＶＲＤとＶＭＤを交互６）Ｑ １年目に１ヶ月７）Ｑ ２および３年目に２ヶ月。
トータルセラピー６は、少なくとも１つの以前の系列の化学療法を用いる症候性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者に関する非盲検フェーズ２プロトコールとして設計される。患者は、以下のように治療される：１）誘導：ＭＥＬ－１０（１０ｍｇ／ｍ２）ＶＴＤ－ＰＡＣＥおよび末梢血幹細胞収集２）１回目の移植：ＭＥＬ－８０（２０ｍｇ／ｍ２／日ｘ４日）＋ＶＲＤ－ＰＡＣＥ３）暫定的療法：ＭＥＬ－２０（５ｍｇ／ｍ２／日ｘ４日）＋ＶＴＤ－ＰＡＣＥ（７５％）２サイクル４）２回目の移植：ＭＥＬ－８０（２０ｍｇ／ｍ２／日ｘ４日）＋ＶＲＤ－ＰＡＣＥ５）維持：ＶＲＤとＶＭＤを交互６）Ｑ １年目に１ヶ月７）Ｑ ２および３年目に２ヶ月。
【0080】
ＭＥＬ：メルファラン；ＶＴＤ－ＰＡＣＥ：ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、サリドマイド、デキサメタゾン、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド；ＶＲＤ－ＰＡＣＥ：ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、デキサメタゾン、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド；ＶＲＤ：ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、デキサメタゾン；ＶＭＤ：ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、メルファラン、デキサメタゾン。このプロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより認可された。
【表3】
【表4】
【0081】
表２において、行は最小から最大までのｐ値により順位付けられる；偽発見率はＱ値法により見積もられた。列「元のＨＲ≧１」は、ＧＥＰ７０モデル開発のための元のＴＴ２訓練セットにおいて、プローブセットのハザード比が１以上であったかどうかを示す（１＝はい；０＝いいえ）。上から５つのプローブセットを用いて、ＧＥＰ５モデルを作成した。
【表5】
【表6】
【0082】
「約」、「少なくとも」、「未満」および「より多い」などの、本出願においていくつかのパラメータを記述する全ての数的範囲について、その記述は記載された値により境界を示される任意の範囲を必ず包含すると理解されるべきである。従って、例えば、「少なくとも１、２、３、４または５」という記述は、特に、１～２、１～３、１～４、１～５、２～３、２～４、２～５、３～４、３～５、および４～５などの範囲も記述する。
【0083】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、ならびに非特許文献および参照配列または化学的情報などの他の参考文献について、それらはあらゆる目的のために、ならびに引用される意見のためにその全体が参照により本明細書に組込まれることが理解されるべきである。参照により組込まれる文献と、本出願との間に矛盾が存在する場合、本出願が制御するものとする。
【0084】
本出願において用いられた見出しは、便宜上のものに過ぎず、本出願の解釈には影響しない。
【0085】
記載されたコンピュータ可読インプレリメンテーションを、ソフトウェア、ハードウェア、またはハードウェアとソフトウェアの組合せにおいてインプレメントすることができる。ハードウェアの例としては、パーソナルコンピュータ、サーバー、ラップトップ、メインフレーム、およびマイクロプロセッサなどの、コンピューティングまたはプロセッシングシステムが挙げられる。本発明により提供されるコンピュータ可読インプリメンテーションはいずれも、場合により、スクリーンまたは物理的プリントアウト上での視覚的表示などの、ユーザへの視覚的出力を提供するステップを含んでもよい。
【0086】
本発明により提供されるそれぞれの態様の好ましい特徴は、変更すべきところは変更して本発明の他の態様の全てに適用可能であり、限定されるものではないが、独立クレームにより例示され、また、実施例を含む、本発明の特定の実施形態および態様の個々の特徴（例えば、数値範囲および例示的実施形態を含む要素）の組合せおよび順列も包含する。例えば、実施例に例示された特定の実験パラメータを、本発明から逸脱することなく、請求される発明における使用のために漸次適合させることができる。例えば、開示される材料について、これらの化合物のそれぞれ様々な個別的および集合的な組合せおよび順列の特定の参照は明示的に開示されていなくてもよいが、そのような化合物を作製および使用する方法であるため、それぞれは本明細書で特に企図および記載される。かくして、要素Ａ、Ｂ、およびＣのクラスならびに要素Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示され、要素Ａ－Ｄの組合せの例が開示される場合、それぞれが個別に記載されていなくても、それぞれが個別的および集合的に企図される。かくして、この例において、組合せＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆのそれぞれは特に企図され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに組合せ例Ａ～Ｄの開示から開示されると考えるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せもまた、特に企図および開示される。かくして、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、およびＣ－Ｅのサブグループが特に企図され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに組合せ例Ａ－Ｄの開示から開示されると考えるべきである。この概念は、物質の組成物の要素および該組成物を作製または使用する方法のステップを含む、本出願の全ての態様に適用される。
【0087】
本明細書の教示に従って当業者により認識されるような本発明の前記態様を、それらが先行技術に対して新規かつ非自明である程度で任意の組合せまたは順列で請求することができる。かくして、ある要素が当業者には公知の１つまたは複数の参考文献に記載される程度で、特に、特徴または特徴の組合せの負の但し書きまたは免責により請求された発明からそれらを排除することができる。
【0088】
本発明を、その例示的実施形態を参照して特に示し、説明してきたが、形態および詳細における様々な変更を、添付の請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなくその中で行うことができることが、当業者によって理解されるであろう。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A-1】
【図4A-2】
【図4B-1】
【図4B-2】
【配列表】